CZ280848B6 - Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech - Google Patents

Abstract

Způsoby aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, postup spočívá v tom, že se reaktivace provádí při pH 9 - 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/l, při koncentraci GSSG 0,01 až 3 mmol/l a při koncentraci denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.ŕ

Description

Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech.

Dosavadní stav techniky

Při expresi heterologních bílkovin v prokaryotických organismech vytváří tyto bílkoviny v cílových buňkách často inaktivní, nesnadno rozpustné agregáty, tzv. refraktivní těliska (refractile bodies), která jsou mimoto znečištěna bílkovinami, vlastními cílovým buňkám. Je pravděpodobné, že tvorba těchto tělísek je důsledkem vysoké koncentrace bílkovin v buňce při expresi. Je známo, že při tvorbě velkých množství enzymů v buňce dojde v důsledku tohoto stavu v buňce ke shlukování enzymů na nerozpustné, vysokomolekulárni a z větší části neúčinné částice. Než je možno tyto bílkoviny užít např. k léčebným účelům, je zapotřebí je čistit a převést z neúčinné formy na formu účinnou.

Podle známých postupů je možno dosáhnout aktivace různým způsobem v několika stupních, jak bylo například popsáno v publikacích B.R.Jaenicko, FEBS Federation of European Biochemical Societies, sv. 52 (1979) 187 až 198, R.Rudolph, Biochemistry 18 (1979) 5572 až 5575.

V prvním stupni se dosáhne rozpustnosti bílkovin přidáním silného denaturačniho prostředku, např. guanidin-hydrochloridu nebo močoviny ve vysoké koncentraci, nebo přidáním silně kyselých činidel, např. směsi glycinu a kyseliny fosforečné. Jako další pomocná látka padají v úvahu reakční činidla, která obsahují skupiny SH-, například dithioerythritol nebo EDTA, zejména při renaturaci LDH. Jakmile je bílkovina znečištěna bílkovinami cílových buněk, je nutno provést v následujícím stupni čištění běžným způsobem, například chromatografií na gelu nebo na iontoměniči. Pak se získaný materiál silně zředí, čímž se sníží koncentrace denaturačního činidla. Při použití guanidinhydrochloridu je nutno vzorec zředit až na hodnoty nižší než 0,5 mol/1. V případě enzymů s volnými SH-skupinami je účelné přidat činidlo, které tyto skupiny chrání, jak bylo popsáno například v publikaci B.R.Jaenicke, Journal Polymer Science, sv. C 16 (1967) 2143 až 2160.

V Evropské patentové přihlášce č. 114 506 je popsán postup pro izolaci, čištění a aktivaci heterologního produktu exprese z bakteriálních kultur. K aktivaci se užije roztoků refraktivních tělísek v silném denaturačním činidle, které se a) přímo převedou na roztoky ve slabším denaturačním činidle a pak se tyto roztoky oxidují k zajištění zpětné tvorby disulfidových můstků, b) bílkovina se podrobí sulfonací, načež se převede do roztoku ve slabším denaturačním činidle a S-sulfonátové skupiny se převedou na redukovanou a oxidovanou formu, například působením GSH/GSSG za vzniku skupin -S-S-, nebo se c) roztok ve slabém denaturačním činidle přímo zpracovává působením reakčního činidla sulfhydrylového typu,

-1CZ 280848 B6 např. směsí GSH/GSSG. Typickým příkladem, u něhož dochází ke svrchu uvedeným problémům, je t-PA.

Hlavní složka bílkovinové matrice krve je polymerní fibrin. Tato bílkovina se rozpouští působením plasminu, který se tvoří z plasminogenu aktivací tzv. aktivátory plasminogenu, například působením t-PA (tkáňový aktivátor plasminogenu, tissue-type plasminogen activator). Enzymatická účinnost přírodního nebo genetickou technologií z eukaryotických organismů získaného t-PA je v nepřítomnosti fibrinu nebo štěpných produktů fibrinu (FSF) velmi nízká, je však možno ji zvýšit přidáním svrchu uvedených stimulátorů, a to více než desetkrát. Tato tzv. stimulovatelnost účinnosti je velkou výhodou t-PA ve srovnání s jinými známými aktivátory plasminogenu, jako je například urokinasa nebo streptokinasa, jak bylo popsáno např. v publikacích M. Heylaerts a další, J. Biol. Chem. 257, (1982) 2912 až 2019, Nieuwenhiuzen a další, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 35.

Zásadně je možno vytvořit neglykosilovaný produkt typu t-PA také v prokaryotických organismech genetickou manipulací při použití c-DNA. Při použití tohoto produktu však nepadá v úvahu stimulovatelnost účinnosti jako v případě t-PA z eukaryotických organismů. Příčinou je patrně ta skutečnost, že různé podmínky, zejména redukce a oxidace, se natolik liší v prokaryotické buňce a v eukaryotické buňce, z níž pochází gen, že se od počátku tvoří neúčinný produkt, což patrné spočívá ve špatné tvorbě můstku SS, které přírodní molekula obsahuje, nebo se tyto můstky vůbec netvoří, popřípadě jsou vázány nevhodným způsobem. Při léčebném použití t-PA však se nepožaduje pouze enzymatická účinnost t-PA, avšak také enzymatická stimulovatelnost tohoto produktu jako taková. Na skutečnost, že buňky prokaryotických organismů obvykle nevytváří účinné bílkoviny, jejichž původem jsou eukaryotické organismy, se poukazuje například také v publikaci The AMBO Journal 4. č. 3 (1985) 755 až 780.

V Evropské patentové přihlášce č. 93 619 se při aktivaci t-PA buněčné pelety, získané z E. coli, uvedou do suspenze v guanidinhydrochloridu o koncentraci 6 mol/1, rozruší se ultrazvukem, získaný materiál se inkubuje a pak se dialysuje 4 hodiny proti roztoku tris-HCL o pH 8,0 ve směsi s chloridem sodným, kyselinou ethylendiamintetraoctovou s prostředkem Tween 80. Po dialýze se materiál odstředí, přičemž v supernatantu je možno prokázat aktivátor plasminogenu. Tímto způsobem získaný t-PA je proteolyticky účinný, není ho však možno stimulovat štěpnými produktý po působeni kyanidu bromu na fibrin (BrCN-FSP), jak bylo popsáno v publikaci J.H.Verheijen, Tromb. Haemostas, 48, (3), 260-269 (1982).

Pro aktivaci denaturovaných bílkovin není v literatuře popsán žádný všeobecně použitelný postup. To platí zejména pro t-PA, protože přírodní bílkovina má velmi složitou stavbu. Obsahuje volnou thielovou skupinu a 17 SS-můstků, které jsou teoreticky spojeny na 2,2 χ 10²⁰ způsoby, přičemž pouze jediná z těchto struktur odpovídá přírodnímu stavu. Způsoby pro aktivaci t-PA, které jsou známé z literatury, vedou k získání proteolyticky účinného t-PA, který však nevykazuje žádnou měřitelnou stimulovatelnost. Není znám žádný postup aktivace, který by vedl k získáni stimulovatelného t-PA.

-2CZ 280848 B6

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob úplné aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, přičemž se v reaktivačním stupni jako denaturační činidlo užije arginin nebo guanidinhydrochlorid v koncentraci v rozmezí 0,1 až 1,0 mol/1, s výhodou v rozmezí 0,25 až 0,8 mol/1 a/nebo alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I

R₂ - CO - NRR₁ (I), kde

R a R-j_ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, a

R₂ znamená atom vodíku, zbytek NHR^ nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku, v koncentraci v rozmezí 0,5 až 4 mol/1, s výhodou 1 až 3,5 mol/1, a reaktivace se provádí při pH 8 až 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/1 a při koncentraci GSSG 0,01 až 3 mmol/1, vyznačený tím, že se v reaktivačním stupni postup provádí v přítomnosti koncentrace denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.

Výhodná provedení podle způsobu budou dále popsána.

Z denaturačních činidel je možno při provádění způsobu podle vynálezu užit činidla, běžné užívaná pro aktivaci za oxidačních podmínek, nebo argininu. Výhodným denaturačním činidlem je guanidinhydrochlorid, močovina nebo deriváty těchto látek. Dalším vhodným činidlem je arginin. Je rovněž možno použit směsi svrchu uvedených denaturačních činidel.

S výhodou se aktivační stupeň provádí také za přítomnosti cizorodé bílkoviny,která není proteolyticky účinná, s výhodou albumin ze séra skotu (BSA), například v množství 1 až 3 mg/ml. Přídavek BSA má za následek malé zvýšeni výtěžku a současné stabilizaci bílkovin (pravděpodobné chrání proti denaturaci povrchu a/nebo proti proteolytickému odbouráváni).

Další podmínky způsobu podle vynálezu odpovídají podmínkám reaktivace, známým z literatury. Aktivace (inkubace) trvá s výhodou 20 až 48 hodin při teplotě místnosti. Poločas aktivace je za přítomnosti 0,5 mmol/1 redukovaného GSH a oxydovaného GSSG glutationu v rozmezí přibližné 10 až 15 hodin při teplotě 20 °C.

Při další inkubaci, například 48 hodin za reoxidačních podmínek obvykle stimulovatelnost klesá v důsledku CNDr-FSP. Akti

-3CZ 280848 B6 vační stupeň se s výhodou provádí za přítomnosti kyseliny ethylendiamintetraoctové, s výhodou v koncentraci 1 mmol/1.

Stupně aktivačního postupu reoxidace a aktivace nebo předcházející a následující stupně, například rozrušení buněk, rozpouštění a popřípadě jeden nebo větší stupeň aktivace a/nebo následující čištění je možno provádět podle známého stavu techniky, tak jak byl popsán například v Evropských patentových přihláškách Č. 114 506 a 93 619.

Z hlediska vysokých výtěžků a dobré aktivace je však účelné provádět jednotlivé stupně nebo všechny stupně s ohledem na svrchu popsané podmínky postupu.

Zvláště je možno provádět stupně způsobu podle vynálezu, spočívající v aktivaci směsi, získané rozrušením buněk bez předchozí denaturace a/nebo redukce, výtěžky jsou však dosti nízké. K expresi se používá prokaryotických organismů, s výhodou P. putida a zejména E. coli, způsob podle vynálezu je však možno provádět i v dalších prokaryotických organismech, jako jsou například Bacilli, v nichž je rovněž možno dosáhnout exprese požadované bílkoviny.

Rozrušení buněk je možno provádět známými způsoby, například působením ultrazvuku, dispergováním za zvýšeného tlaku nebo působením lysozymu. Jako prostředí pro suspenzi se s výhodou použije roztok pufru, který dovoluje nastaveni neutrálního až slabě kyselého pH, například 0,1 mol/1 tris-HCl. Po rozrušení buněk se nerozpustné součásti těchto buněk, tzv. refraktivní tělíska, oddělí libovolným způsobem, s výhodou energickým odstředěním při delší době odstředováni, nebo filtrací. Po promytí látkami, které nerozrušují t-PA, avšak pokud možno rozpouštějí cizorodé buněčné bílkoviny, jako je například voda, popřípadě fosfátový pufr s případným obsahem mírných smáčedel, jako je triton, se sraženina nebo peleta podrobí solubilizaci za redukčních podmínek. Solubilizace se provádí v alkalickém pH, zejména při pH 8,6 ± 0,4 za přítomnosti redukčního činidla ze skupiny merkaptanů a denaturačního činidla.

Jako denaturační činidlo je možno užít činidla, známá z literatury, například z Evropské patentové přihlášky č. 114 506 pro solubilizaci, zejména běží o guanidinhydrochlorid nebo o močovinu. Guanidinhydrochlorid se s výhodou užije v koncentraci 6 mol/1, močovina v koncentraci 8 mol/1. Stejně dobře je možno užít sloučeniny obecného vzorce I,

R₂ - CO - NRR_T (I) , kde

R a Rj_ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, a

R₂ znamená atom vodíku, zbytek NHR-^ nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku.

Jako redukční činidla ze skupiny merkaptanů je možno použít například redukovaný glutathion GSH nebo 2-merkaptoethanol, například koncentraci 50 až 400 mmol/1 dithioethereitonu a/nebo

-4CZ 280848 B6 dithrioerythritol (DTE) nebo dithiothreitol (DTT) například v koncentraci 80 až 400 mmol/1. Solubilizace se s výhodou provádí při teplotě místnosti po dobu jedné nebo většího počtu hodin, s výhodou dvě hodiny. K zábraně oxidace redukčního činidla vzduš- . ným kyslíkem může být účelné přidat k reakční směsi ještě EDTA. Kromě solubilizace a redukce má tento stupeň také čisticí účinek, protože většina materiálu, který není zkřížen imunologicky s t-PA, zejména cizorodých bílkovin, nepřichází do roztoku.

Po solubilizaci a před aktivací je možno zařadit běžné čisticí stupně. Z čisticích postupů přicházejí v úvahu např. sterická chromatografie (SEC) za přítomnosti guanidinhydrochloridu nebo močoviny, nebo iontoměniče za přítomnosti močoviny nebo jejího derivátu. Je možno také užít nespecifickou reoxidaci, které je možno zabránit například 2-merkaptoethanolem nebo nastavením pH na hodnotu 4,5 nebo nižší, jak bylo popsáno v publikaci R.Rudolph, Biochem. Soc. Transactions 13 (1985) 308 až 311. Jakmile je solubilizační stupeň ukončen, je zapotřebí použitý DTE případně odstranit v čisticím stupni.

Čistění je možno provádět například na gelu Sephadex G 100 za přítomnosti guanidinhydrochloridu a redukčního činidla, například glutathions GSH při pH 1 až 4, tímto způsobem je možno oddělit velké množství cizorodé bílkoviny, nebo je možno oddělit denaturační a redukční prostředek odstraněním solí na gelu Sephadex G 25 v 0,01 mol/1 kyselině chlorovodíkové nebo 0,1 mol/1 kyselině octové. Oddělení denaturačního/redukčního činidla je možno uskutečnit také dialýzou.

Další čisticí stupeň může následovat po reaktivačním stupni. Toto čištění se zpravidla provádí dialýzou nebo izolací aktivovaného t-PA, například afinitní chromatografií, např. na Lys-Sepharose.

Způsobem podle vynálezu je tedy možné aktivovat t-PA z prokaryatických organismu tak, že se nejen dosáhne aktivace na obvyklou biologickou účinnost, nýbrž navíc se dosáhne stimulovátelnosti ve svrchu uvedeném významu, a to v množství, které převyšuje daleko stimulovatelnost t-PA při faktoru vyšším než 10, někdy až 50.

Další bílkovinou z eukaryotických organismů, které je možno aktivovat způsobem podle vynálezu po expresi v prokaryatických organismech, je β-interferon.

Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno v následujících příkladech. Není-li uvedeno jinak, vztahují se procentuální údaje na hmotnostní procento a teplotní údaje na stupně Celsia.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a) Příprava refraktilních tělisek

100 g vlhké buněčné hmoty E. coli v 1,5 litrech tris/HCl

-5CZ 280848 B6 o koncentraci 0,1 mol/1, pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA se 10 sekund homogenizuje na zařízení Ultra-Turray a pak se přidá 0,25 mg/ml lysozomu. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se směs znovu homogenizuje a zchladí na teplotu 3 °C. Buňky se rozruší dispergováním za vysokého tlaku 550 kg/cm². Pak se přidá 300 ml tris-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA. Po odstředění (Servali GSA, 2 hodiny při 13 000 otáčkách za min., 21 000 g, 4 °C) se peleta smísí s 1,2 litry tris-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA a 2,5 % Triton-X-100 a pak se homogenizuje. Pak se materiál opakovaně odstředí (Servali GSA, 30 min. při 13 000 ot./min., 27 000 g, 4 °C) peleta se smísí s 1,3 litry tris-HCl o pH 6,5 a koncentraci 0,1 mol/1 a 20 mmol/1 EDTA s 0,5 % Triton-X-100 a materiál se homogenizuje. Pak se materiál ještě jednou odstředí (Servali GSA, 30 min. při 13 000 ot./min., 27 000 g, 4 °C) a pelety se homogenizují v 1 litru tris-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA, toto odstředění se provádí třikrát.

Obsah t-PA v refraktilních tělískách se ve výsledném materiálu zjišťuje při použití SDS-Page, pásy s obsahem t-PA se identifikují způsobem Western-blotting a kvantitativně se stanoví denz itometricky.

Při použití tohoto způsobu je možno prokázat silný pás s obsahem t-PA a molekulovou hmotností přibližně 60 jednotek. Podíl t-PA v celkové bílkovině refraktilních tělísek je přibližně 21 %.

b) Solubilizace/redukce refraktivních tělísek

Refraktivní tělíska s koncentrací bílkovin 1 až 5 mg/ml se inkubují v 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 guanidinchloridu, 0,15 až 0,4 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTA po dobu 2 až 3 hodin při teplotě místnosti. Pak se nerozpustný materiál, například buněčné fragmenty a pod., oddělí odstředěním (například Servali 34, 30 minut při teplotě 4 °C, při 15 000 až 20 000 otáčkách/minutu a při 35 000 až 50 000 g). Hodnota pH supernatantu se upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Denaturační a redukční prostředky se oddělí dialýzou proti 0,01 mol/1 kyseliny chlorovodíkové při teplotě 4 °C.

c) Reoxidace/aktivace

Reoxidace/aktivace se provádí při ředění 1 : 50 až 1 : 200 v roztoku, který obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 mol/1 1-argininu, 2 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG. Po 17 až 24 hodinách aktivace při teplotě přibližné 20 °C se stanoví účinnost ve srovnání s účinností nativního glykosylovaného t-PA z eukaryotických organismů a výtěžek této látky.

Výtěžek, vztažený na celkový obsah bílkoviny v refraktivních tělískách, se pohybuje v rozmezí:

2,5 ± 0,5 % stimulovatelnost je 10 ± 5.

-6CZ 280848 B6

Výtěžek, vztažený na podíl t-PA v refraktivních tělískách, je přibližně 12 %.

d) Reoxidace/aktivace bez oddělení denaturačního/redukčního činidla

Refraktivní tělíska se inkubují při koncentraci bílkovin 1,25 mg/ml ve směsi, která obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 guanidinchloridu, 0,2 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTAS 2 hodiny při teplotě místnosti. Okamžité potom se provádí reoxidace při ředění 1 : 100 v roztoku, který obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 mol/1 1-argininu a takové množství GSSG, jako je uvedeno v následující tabulce. Mimo to se stanoví v aktivační směsi zbytek koncentrace guanidinchloridu, který je 0,06 mol/1 a DTE, s hodnotou 2 mmol/1.

Závislost výtěžku aktivace na koncentraci GSSG při aktivaci bez oddělení denaturačního/redukčního činidla.

GSSG (mmol/1)

Výtěžek (%)

Stimulovatelnost (faktor)

0,2	0
1	0,13
5	1,49
6	1,28
7	1,04
9	0,98
10	1,77
15	0
20	0

4,0

1.4

5.4

5,8

5,2

10,0

Výtěžek s čárkou = výtěžek účinného t-PA, vztaženo na celkový obsah bílkoviny v refraktivních tělískách.

Příklad 2

V následujících tabulkách je shrnut vliv různých parametrů způsobu podle vynálezu na aktivaci a stimulovatelnost t-PA. V těchto reoxidačních pokusech byla solubilizovaná, redukovaná bílkovina užita bez předběžného čištění.

Redukovaná bílkovina v 0,01 mol HC1 byla aktivována zředěním 1 : 10 až 1 : 500 v reoxidačnim pufru. Aktivace byla prokazována při teplotě místnosti po inkubaci 22 až 48 hodin při téže teplotě .

Účinnost reoxidované bílkoviny se vztahuje na standardní reoxidaci, která je pokládána za 100 % v roztoku s obsahem

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-argininu + 1, mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH (redukovaný glutathion) + 0,5 mmol/1 GSSG (glutathionsulfid).

-7CZ 280848 B6

Stimulovátelnost se vypočítává jako ^E+CNBrFSP/^E-CNBrFSP způsobem, popsaným v publikaci W. Nieuwenhuizon a další, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 533. Účinnost v % a stimulovatelnost jako faktor se stanoví způsobem podle publikace J.H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269 (1982).

Výsledky:

1. Závislost výtěžku aktivace na přísadách 1-argininu a guanidinhydrochloridu.

Reakce ve směsi

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5	stimulovátelnost (faktor)
+ 1 mmol/1 EDTA + 1, mg/ml BSA +0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG a) 1-arginin 1-arginin (mol/1)	účinnost (%)
0	4	2,5
0,25	98	7,5
0,5	100	21,9
0,75	27	16,3
1,0	23	3,5

Při tomto pokusu je nutno uvážit, že 1-arginin působí inhibici t-PA. Pokles výtěžku aktivace při vyšší koncentraci této látky je tedy nutno přičíst inhibici.

b) Guanidin-hydrochlorid (Gdn.HCl) (Gdn.HCl) účinnost (mol./l) (%)

0	11
0,25	22
0,5	53
0,75	58
1,0	12

2. Závislost výtěžku aktivace na přidání močoviny nebo jejích derivátů

Reoxidace ve směsi 0,1 mol/1 tris o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, a 0,2 mmol/1 GSSG.

a) Močovina

-8CZ 280848 B6

močovina (mol/1)	účinnost (%)
0,	1 .
0,5	20
1	59
1/5	126
2	162
2,5	141
3	72
4	12
5	0
b) Methylmočovina
methylmočovina	účinnost
(mol/1)	(%)
0,5	22
1	174
1,5	313
2	375
2,5	332
3	215
4	12
5	0
c) Ethylmočovina
ethylmočovina	účinnost
(mol/1)	(%)
0,5	46
1*	212
1,5	323
2	300
2,5	107
3	19
4	0
5	0

d) Dimethylmočovina

dimethylmočovina (mol/1)	účinnost (%)	stimulovatelnost (faktor)
0,5	167	8,8
1	256	8,9
1,5	283	9,4
2	177	7,7
2,5	78	8,9
3	23	9,9
4	4	8,6
5	2	3,5

3. Závislost výtěžku aktivace na přidání amidů alifatických kyselin:

-9CZ 280848 B6

Reoxidace se provádí ve směsi 0,1 mol/1 tris o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG.

a) Formamid	-
formamid (mol/1)	účinnost (%)
0 0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5	42 59 175 245 325 423 444 416 341

b) Methylformamid

methylformamid (mol/1)	účinnost (%)
0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5	100 135 304 389 466 452 425 121

c) Acetamid

acetamid (mol/1)	účinnost (%)
0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5	72 134 207 261 204 237 198 141

d) Propionamid

propionamid (mol/1)	účinnost (%)
0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5	95 99 207 261 204 237 198 141

-10CZ 280848 B6

c) Butyramid butyramid (mol/1) účinnost (%)

0,5	55
1	52
1,5	17
2	0

4. Závislost na výtěžku aktivace na hodnotě pH

Reoxidace se provádí ve směsi + + + + +

0,1 mol/1 tris/HCl mmol/1 EDTA

0,5 mol/1 1-arginin mg/ml BSA

0,5 mmol/1 GSH

0,5 mmol/1 GSSG

PH	účinnost (%)	stimulovatelnost (faktor)
7	1	-
8	22	3,0
9	89	13,6
10	105	20,3
11	95	21,3

Závislost výtěžku na koncentraci GSH/GSSG

5.

Reoxidace se provádí ve směsi

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-arginin + 1 mg/ml BSA

a) + 1 mmol/1 GSH

GSSG (mmol/1)	účinnost (%)	stimulovatelnost (faktor)
0,1	239	14,9
0,2	273	15,3
0,5	193	13,3
1	198	12,5
5	17	2,1
10	0	-
20	0	—
b) + 0,2 mmol/1 GSSG
GSSG	účinnost	stimulovatelnost
(mmol/1)	(%)	(faktor)

-11CZ 280848 B6

0,05	15	2,2
0,1	40		3,8
0,2	112		6,8
0,5	142	*	7,4
1	273		6,8
5	260		7,9
10	143		6,3
20	55		5,1

6. Závislost výtěžku aktivace na koncentraci bílkoviny při reoxidaci (ředění 1 : 20 až 1 : 500)

Reoxidace se provádí ve směsi

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 1 mg/ml BSA + 0,5 mol/1 1-arginin + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG zředění účinnost stimulovatelnost (%) (faktor)

1	10	29	15,3
1	20	45	25,4
1	50	69	37,9
1	100	100	37,9
1	200	79	52,7
1	500	29	28,7

7. Závislost výtěžku aktivace na přidání BSA

Reoxidace se provádí ve směsi

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol 1-argininu +0,5 mmol/1 GSH +0,5 mmol/1 GSSG

BSA (mg/ml)	účinnost (%)
0 0,5 1 3	47 83 100 102

Na obr. 1 a 2 je znázorněna účinnost při přidání a bez přidání CNBr-FSP ve standardním pokusu po 17 hodinách reoxidace při teplotě místnosti, ve směsi 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-argininu + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH +0,5 mmol/1 GSSG.

-12CZ 280848 B6

Na obr. 1 a 2 znamená křivka A účinnost za přítomnosti CNBr-FSP a křivka B účinnost bez CNBr-FSP.

Přiklad 3

Aktivace β-interferonu, získaného genetickým inženýrstvím

Refrakturní tělíska byla získána svrchu uvedeným způsobem. Redukce/solubilizace těchto tělísek byly uskutečněny následujícím způsobem:

peleta byla inkubována 3 hodiny při teplotě 25 °C v 10 ml směsi 9,1 mol tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 Gdn/HCl, 1 mmol/1 EDTA a 0,2 mol/1 DTE a po 30 minutách byla směs odstředěna při teplotě 4 °C a při 48 000 g a pH supernatantu bylo upraveno na hodnotu 3 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Pak byla prováděna filtrace na gelu Sephadex G25 F v 0,01 mol/1 HC1.

Eluát byl sledován při 280 nm koncentrace bílkovin a reaktivita.

a byla stanovena extinace,

Aktivace standardu (100%) se

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1

0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/1 1-argininu.

provádí ve směsi s obsahem mmol/1 GSH,

EDTA,

a) Závislost aktivace na čase

Eluát se zředí v poměru 1 : 50

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol/1

0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/1 1-argininu.

směsi, EDTA, která obsahuje mmol/1 GSH, doba aktivace (h) účinnost (%)

b) závislost výtěžku aktivace na přidání 1-argininu

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a pak se směs aktivuje 20 hodin při teplotě 0 °C.

Závislost aktivace na množství 1-argininu

1-arginin (N)

0,

0,25

0,5

0,75

c) Závislost výtěžku aktivace na množství močoviny

Byl užit roztok z odstavce b), aktivace byla prováděna 17 hodin při teplotě 0 C.

-13CZ 280848 B6

Závislost aktivace	na močovině
močovina (M)	účinnost (%)
0 0,5 1 1,5	13 100 200 100

d) Závislost výtěžku aktivace na množství formamidu

Aktivace se provádí ve stejné směsi jako v odstavci b) , vzorky se sledují po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 °C.

Závislost aktivace	na formamidu
formamid (M)	účinnost (%)
0 1 2 3 4	13 13 13 0 0

e) Závislost výtěžku aktivace na redox-pufru

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol EDTA a 0,25 M 1-argininu a vzorky se sledují po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 °C.

Závislost aktivace na poměru GHS/GSSG

GSH (mM)	GSSG (nM) účinnost (%)
1 5 10 20 5 5 5 5	0,5 6 0,5 13 0,5 25 0,5 25 0,1 13 0,5 13 1,0 13 5 6

f) Závislost výtěžku aktivace na koncentraci bílkoviny až 1

EDTA, 5 provádí

Eluát byl zředěn v poměru 1 : 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mM a 0,25 m 1-argininu, stanovení se při teplotě 0 °C.

: 100 směsí s obsahem mM GSH, 0,5 mM GSSG po aktivaci 17 hodin

Závislost aktivace cp cp (mg/ml) účinnost (%)

0,018

0,036

0,072

0,108

0,180

-14CZ 280848 B6

g) Závislost výtěžku aktivace na přidání BSA

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG a 0,25 M 1-argininu a výsledek se odečítá po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 ”C.

Závislost aktivace na BSA

BSA (mg/ml) účinnost (%)

h) Závislost výtěžku aktivace na pH

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 M tris/HCl, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG a 0,25 M 1-argininu a výsledek se odečítá po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 C.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, přičemž se v reaktivačnim stupni jako denaturační činidlo užije arginin nebo guanidinhydrochlorid v koncentraci v rozmezí 0,1 až 1,0 mol/1, s výhodou v rozmezí 0,25 až 0,8 mol/1 a/nebo alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I

   R₂ - CO - NRR_r (I), kde

   R a R^ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, a

   R₂ znamená atom vodíku, zbytek NHR_X nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku,

   -15CZ 280848 B6 v koncentraci v rozmezí 0,5 až 4 mol/1, s výhodou 1 až 3,5 mol/1, a reaktivace se provádí při pH 8 až 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/1 a při koncentraci GSSG 0,01 až

   3 mmol/1, vyznačující se tím, že se v reaktivačním stupni postup provádí v přítomnosti koncentrace denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se postup provádí v přítomnosti guanidinhydrochloridu a/nebo sloučeniny obecného vzorce I jako denaturačního činidla.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že guanidinhydrochlorid užije v koncentraci 6 mol/1 a sloučenina obecného vzorce I v koncentraci 8 mol/1.
4. 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se postup provádí v přítomnosti DTE, beta-merkaptoethanolu, cysteinu nebo GSH.
5. 5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se čištění a oddělení denaturačního činidla provádí sterickou chromatografií nebo dialýzou.