SK278317B6 - Activation method of by genetic technology gained heterologous proteins with content of disulfidic bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms - Google Patents

Activation method of by genetic technology gained heterologous proteins with content of disulfidic bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms Download PDF

Info

Publication number
SK278317B6
SK278317B6 SK7526-86A SK752686A SK278317B6 SK 278317 B6 SK278317 B6 SK 278317B6 SK 752686 A SK752686 A SK 752686A SK 278317 B6 SK278317 B6 SK 278317B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
activation
concentration
mmol
mol
carried out
Prior art date
Application number
SK7526-86A
Other languages
English (en)
Other versions
SK752686A3 (en
Inventor
Rudolph Rainer
Stephan Fischer
Ralf Mattes
Original Assignee
Rudolph Rainer
Stephan Fischer
Ralf Mattes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rudolph Rainer, Stephan Fischer, Ralf Mattes filed Critical Rudolph Rainer
Publication of SK752686A3 publication Critical patent/SK752686A3/sk
Publication of SK278317B6 publication Critical patent/SK278317B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Lubricants (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu aktivácie genetickou technológiou získaných, heterológnych bielkovín s obsahom disulfidových mostíkov eukaryotického pôvodu po ex- 5 presii v prokaryotických organizmoch.
Doterajší stav techniky
Pri expresii heterológnych bielkovín v prokarvotických organizmoch vytvárajú tieto bielkoviny v cieľových bunkách často inaktívne, ťažko rozpustné agregáty, tzv. refraktívne telieska (refractile bodics), ktoré sú okrem toho znečistené bielkovinami, vlastnými cieľovým bun- 15 kám. Je pravdepodobné, že tvorba týchto teliesok je dôsledkom vysokej koncentrácie bielkovín v bunke pri expresii. Je známe, že pri tvorbe veľkých množstiev enzýmov v bunke dôjde v dôsledku tohto stavu v bunke k zhlukovaniu enzýmov na nerozpustné, vysokomolekulár- 20 ne a z väčšej časti neúčinné častice. Skôr ako je možné tieto bielkoviny použiť napríklad na liečbu, je potrebné ich čistiť a premeniť z neúčinnej formy na formu účinnú.
Podľa známych postupov je možné dosiahnuť akti- 25 váciu rôznym spôsobom v niekoľkých stupňoch, ako bolo opísané napríklad v publikáciách B. R. Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, zv. 52, (1979), 187 až 198, R. Rudolph, Biochemistry 18,(1979), 5572 až 5575. 30
V prvom stupni sa dosiahne rozpustnosť bielkovín pridaním silného denaturovaného prostriedku, napríklad guanidínhydrochloridu alebo močoviny vo vysokej koncentrácii, alebo pridaním silne kyslých činidiel, napríklad zmesi glycínu a kyseliny fosforečnej. Ako ďalšie 35 pomocné látky prichádzajú do úvahy reakčné činidlá, ktoré obsahujú skupiny SH-, napríklad ditioerytritol alebo EDTA, najmä pri renaturácii LDH. Hneď ako je bielkovina znečistená bielkovinami cieľových buniek, je nutné vykonať v nasledujúcom stupni čistenie bežným 40 spôsobom, napríklad chromatografiou na géli alebo na ionomeniči. Potom sa získaný materiál silne zriedi, čím sa zníži koncentrácia denaturačného činidla. Pri použití guanidínhydrochloridu je nutné vzorku zriediť až na hodnotu nižšiu než 0,5 mol/1. V prípade enzýmov s voľ- 45 nými SH-skupinami je účelné pridať činidlo, ktoré tieto skupiny chráni, ako bolo opísané napríklad v publikácii B. R. Jaenicke, Joumal Polymér Science, zv. C 16 (1967), 2143 až 2160.
V európskej patentovej prihláške č. 114 506 je opi- 50 saný postup na izoláciu, čistenie a aktiváciu heterológ- neho produktu expresie z bakteriálnych kultúr. Na aktiváciu sa použijú roztoky refraktívnych teliesok v silnom denaturačnom činidle, ktoré sa a) priamo prevedú na roztoky v slabšom denaturačnom činidle, a potom sa 55 tieto roztoky oxidujú na zaistenie spätnej tvorby disulfidových mostíkov, b) bielkovina sa podrobí sulfonácii, potom sa prevedie do roztoku v slabšom denaturačnom činidle a S-sulfonátové skupiny sa premenia na redukovanú a oxidovanú formu, napríklad pôsobením 60 GSH/GSSG za vzniku skupín -S-S- alebo sa c) roztok v slabom denaturačnom činidle priamo spracováva pôsobením reakčného činidla sulfhydrylového typu, napríklad zmesou GSH/GSSG. Typickým príkladom, pri ktorom dochádza k uvedeným problémom j e t-PA. 65
Hlavná zložka bielkovinovej matrice krvi je polymémy fibrín. Táto bielkovina sa rozpúšťa pôsobením plazmidu, ktorý sa tvorí z plazminogénu aktiváciou tzv. aktivátormi plazminogénu, napríklad pôsobením t-PA (tkanivový aktivátor plazminogénu, tissue-type plasminogen activator). Enzymatická účinnosť prírodného alebo genetickou technológiou z eukaryotického organizmu získaného t-PA je v neprítomnosti fibrínu alebo štiepnych produktov fibrínu (PSF) veľmi nízka, je však možné ju zvýšiť pridaním uvedených stimulátorov, a to viac než desaťkrát. Táto tzv. stimulovateľnosť účinnosti je veľkou výhodou t-PA v porovnaní s inými známymi aktivátormi plazminogénu, ako je napríklad urokináza alebo streptokináza, ako bolo opísané napríklad v publikáciách N. Hoylaerts a ďalší, J. Biol. Chem. 257, (1982), 2912 až 2919, Nieuwenhiuzen a ďalší, Biochemica et Biophysica Acta 755, (1983), 531 až 533. Faktor stimulovateľnosti štiepnymi produktami typu BrCN sa udáva v literatúre a má hodnotu až 35.
Zásadne je možné vytvoriť neglykozylovaný produkt typu t-PA tiež v prokaryotických organizmoch genetickou manipuláciou pri použití c-DNA. Pri použití tohto produktu však neprichádza do úvahy stimulovateľnosť účinnosti ako v prípade t-PA z eukaryotických organizmov. Príčinou je zrejme tá skutočnosť, že rôzne podmienky, najmä redukcia a oxidácia sa natoľko líšia v prokaryotickej bunke a v eukaryotickej bunke, z ktorej pochádza gén, že sa od začiatku tvorí neúčinný produkt, čo zrejme spočíva v zlej tvorbe mostíkov SS, ktoré prírodná molekula obsahuje alebo sa tieto mostíky vôbec netvoria, prípadne sú viazané nevhodným spôsobom. Pri liečebnom použití t-PA však sa nepožaduje len enzymatická účinnosť t-PA, ale tiež samostatná enzymatická stimulovateľnosť tohto produktu. Na skutočnosť, že bunky prokaryotických organizmov zvyčajne nevytvárajú účinné bielkoviny, ktorých pôvodom sú eukaryotické organizmy, sa poukazuje napríklad tiež v publikácii The Joumal 4, č. 3 (1985), 755 až 780.
V európskej patentovej prihláške č. 93 639 sa pri aktivácii t-PA bunkové pelety, získané z E. coli uvedú do suspenzie v guanidínhydrochloride s koncentráciou 6 mol/1, rozrušia sa ultrazvukom, získaný materiál sa inkubuje, a potom sa dialyzuje 4 hodiny proti roztoku tris-HCl s pH 8,0 v zmesi s chloridom sodným, kyselinou etyléndiamíntetraoctovou a prostriedkom Tween 80. Po dialýze sa materiál odstredí, pričom v supematante je možné dokázať aktivátor plazminogénu. Týmto spôsobom získaný t-PA je proteolyticky účinný, nie je možné ho stimulovať štiepnymi produktmi po pôsobení kyanidu brómu na fibrín (BrCN-PSP), ako bolo opísané v publikácii J. H. Verheijen, Thromb Haemostas, 48, (3), 260 až 269, (1982).
Na aktiváciu denaturovaných bielkovín nie je v literatúre opísaný žiadny všeobecne použiteľný postup. To platí najmä pre t-PA, pretože prírodná bielkovina má veľmi zložitú stavbu. Obsahuje voľnú tiolovú skupinu a 17 SS-mostíkov, ktoré sú teoreticky spojené 2,2 x 1O20 spôsobmi, pričom len jediná z týchto štruktúr zodpovedá prírodnému stavu. Spôsoby na aktiváciu t-PA, ktoré sú známe z literatúry vedú k získaniu protcolyticky účinného t-PA, ktorý však nevykazuje žiadnu merateľnú stimulovateľnosť. Nie je známy žiadny postup aktivácie, ktorý by viedol k získaniu stimulovateľného t-PA.
Podstata vynálezu
Vynález si kladie za úlohu navrhnúť spôsob úplnej aktivácie genetickou technológiou získaných, heterológnych bielkovín s obsahom disulfidových mostíkov eukaryotického pôvodu po expresii v prokaryotických organizmoch.
Predmetom vynálezu je teda spôsob aktivácie genetickou technológiou získaných, heterológnych bielkovín s obsahom disulfidových mostíkov eukaryotického pôvodu po expresii v prokaryotických organizmoch rozrušením buniek, solubilizáciou na základe denaturácie a redukčných podmienok a aktiváciou (renaturáciou) v oxidačných podmienkach za prítomnosti GSH/GSSG, ktorého podstatou je, že aktivácia sa vykonáva pri pH 9 až 12, koncentrácii GSH 0,1 až 20 mmol/1, koncentrácii GSSG 0,01 až 3 mmol/1 a za prítomnosti denaturačného činidla v koncentrácii, pri ktorej nedochádza k denaturácii.
Výhodné uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu budú ďalej opísané.
Z denaturačných činidiel je možné pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu použiť činidlá, bežne používané na aktiváciu v oxidačných podmienkach alebo arginín. Výhodným denaturačným činidlom je guanidínhydrochlorid, močovina alebo deriváty týchto látok. Ďalším vhodným činidlom je arginín. Je taktiež možné použiť zmesi uvedených denaturačných činidiel. Výhodne sa aktivačný stupeň vykonáva za prítomnosti cudzorodej bielkoviny, ktorou je výhodne akákoľvek bielkovina, ktorá nie je proteolyticky účinná, výhodne albumín zo séra hovädzieho dobytka (BSA), napríklad v množstve 1 až 3 mg/ml. Prídavok BSA má za následok malé zvýšenie výťažku a súčasne stabilizáciu bielkovín (pravdepodobne chráni proti denaturácii povrchu a/alebo proti proteolytickému odbúravaniu).
Ďalšie podmienky spôsobu podľa vynálezu zodpovedajú podmienkam reaktivácie, známym z literatúry. Aktivácia (inkubácia) trvá výhodne 20 až 48 hodín pri teplote miestnosti. Polčas aktivácie je za prítomnosti 0,5 mmol/1 redukovaného GSH a oxidovaného GSSG glutatiónu v rozmedzí približne 10 až 15 hodín pri teplote 20 °C. Pri ďalšej inkubácii, napríklad 48 hodín v reoxidačných podmienkach, zvyčajne stimulovateľnosť klesá v dôsledku CNBr-FSP. Aktivačný stupeň sa výhodne vykonáva za prítomnosti kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, výhodne v koncentrácii 1 mmol/1.
Stopne aktivačného postupu reoxidácie a aktivácie alebo predchádzajúce a nasledujúce stupne, napríklad rozrušenie buniek, rozpustenie a prípadne jeden alebo väčší počet stupňov aktivácie a/alebo nasledujúceho čistenia je možné vykonávať podľa známeho stavu techniky, tak ako bol opísaný napríklad v európskych patentových prihláškach č. 114 586 a 93 619. Z hľadiska vysokých výťažkov a dobrej aktivácie je však účelné vykonávať jednotlivé stupne alebo všetky stupne s ohľadom na opísané podmienky postupu. Zvlášť je možné vykonávať stupne spôsobu podľa vynálezu, spočívajúce v aktivácii zmesi, získanej rozrušením buniek bez predchádzajúcej denaturácie a/alebo redukcie, výťažky sú dosť nízke. Na expresiu sa používajú prokaryotické organizmy, výhodne P. putida a najmä E. coli, spôsob podľa vynálezu je však možné vykonávať aj v ďalších prokaryotických organizmoch, ako sú napríklad Bacilli, v ktorých je taktiež možné dosiahnuť expresiu požadovanej bielkoviny.
Rozrušenie buniek je možné vykonávať známymi spôsobmi, napríklad pôsobením ultrazvuku, dispergovaním pri zvýšenom tlaku alebo pôsobením lyzozýmu, ako prostredie pre suspenziu sa výhodne použije roztok pu&a, ktorý dovoľuje nastavenie neutrálneho až slabo kyslého pH, napríklad 0,1 mol/1 tris-HCl. Po rozrušení buniek sa nerozpustné súčasti týchto buniek, tzv. refraktívne telieska oddelia ľubovoľným spôsobom, výhodne energickým odstredením pri dlhšom čase odstreďovania alebo filtrácie. Po premytí látkami, ktoré nerozrušujú t-PA, avšak pokiaľ j e to možn,é rozpúšťajú bunkové bielkoviny, ako je napríklad voda, prípadne fosfátový pufer s prípadným obsahom miernych zmáčadiel, ako je tritón, sa zrazenina alebo peleta, podrobí solubilizácii v redukčných podmienkach. Solubilizácia sa vykonáva v alkalickom pH, najmä pri pH 8,6 ± 0,4 za prítomnosti redukčného činidla zo skupiny merkaptánov a denaturačného činidla.
Ako denaturačné činidlo je možné použiť činidlá, známe z literatúry, napríklad z európskej patentovej prihlášky č. 114 506 na solubilizáciu, najmä ide o guanidínhydrochlorid alebo o močovinu. Guanidínhydrochlorid sa výhodne použije s koncentráciou 6 mol/1, močovina s koncentráciou 8 mol/1. Rovnako dobre je možné použiť zlúčeniny všeobecného vzorca (I)
IVCO-NRR1 (I), kde
R a R1 znamenajú atóm vodíka alebo alkylový zvyšok s 1 až 4 atómami uhlíka
R2 znamená atóm vodíka, zvyšok NHR1 alebo alkylovaný zvyšok s 1 až 3 atómami uhlíka.
Ako redukčné činidlá zo skupiny merkaptánov je možné použiť napríklad redukovaný glutatión GSH alebo -merkaptoetanol, napríklad s koncentráciou 50 až 400 mmol/1 ditiotreitónu a/alebo ditioerytritol (DTE) alebo ditiotreitol (DTT) napríklad v koncentrácii 80 až 400 mmol/1. Solubilizácia sa výhodne vykonáva pri teplote miestnosti počas jednej alebo väčšieho počtu hodín, výhodne dve hodiny. Na zabránenie oxidácie redukčného činidla vzdušným kyslíkom je možné účelne pridať k reakčnej zmesi ešte EDTA. Okrem solubilizácie a redukcie má tento stupeň tiež čistiaci účinok, pretože väčšina materiálu, ktorý' nie je skrížený imunologický s t-PA, najmä cudzorodých bielkovín, neprechádza do roztoku.
Po solubilizácii a pred aktiváciou je možné zaradiť bežné čistiace stupne. Z čistiacich postupov prichádzajú do úvahy napríklad stérická chromatografia (SEC) za prítomnosti guanidínhydrochloridu alebo močoviny, alebo ionomeniča za prítomnosti močoviny alebo jej derivátu. Je možné použiť tiež nešpecifickú reoxidáciu, ktorej je možné zabrániť napríklad 2-merkaptanolom alebo nastavením pH na hodnotu 4,5 alebo nižšiu, ako bolo opísané v publikácii R. Rudolph, Biochem, Soc. Transactions 13 (1985), 308 až 311. Hneď ako je solubilizačný stupeň ukončený, je potrebné prípadne použitý DTE odstrániť v čistiacom stupni. Čistenie je možné vykonávať na géli Sephadex G 100 za prítomnosti guanidínhydrochloridu a redukčného činidla, napríklad glutatiónu GSH pri pH 1 až 4, týmto spôsobom je možné oddeliť veľké množstvo cudzorodej bielkoviny alebo je možné oddeliť denaturačný a redukčný prostriedok odstránením solí na géli Sephadex G 25 v 0,01 mol/1 kyseliny chlorovodíkovej alebo 0,1 mol/1 kyseliny octovej. Oddelenie denaturačného/redukčného činidla je možné uskutočniť tiež dialýzou.
Ďalší čistiaci stupeň môže nasledovať po reaktivačnom stupni. Toto čistenie sa spravidla vykonáva dialýzou alebo izoláciou aktivovaného t-PA napríklad afinitnou chromatografiou, napríklad na Lys-Sepharexe.
Ďalšie vykonanie spôsobu podľa vynálezu spočíva v tvorbe zmiešaných disulfidov genetickou technológiou získaných, heterológnych, disulfidových mostíkov, obsahujúcich eukaryotické bielkoviny a glutatión (ďalej t-PASSG). Tento postup je možné uskutočniť oddelením cudzorodej bielkoviny v denaturovanom stave alebo ďalším čistením prírodnej bielkoviny. Cisterne po modifikácii tiolových skupín má tú výhodu, že bielkovina je chránená proti oxidácii pôsobením vzduchu a je preto stála v širokom rozmedzí pH a súčasne sa uľahčuje celé čistenie vzhľadom na to, že sa mení náboj. Izolácia nemodifikovanej bielkoviny sa výhodne vykonáva pôsobením ionomeniča.
Na tvorbu zmiešaných disulfidov sa inkubuje dialyzovaná, redukovaná, od denaturačných a redukčných činidiel vyčistená bielkovina s roztokom, ktorý obsahuje denaturačné činidlo, napríklad 0,2 M roztokom GSSG. Aktiváciu je možné uskutočniť po oddelení denaturačného a oxidačného prostriedku pri pH 7 až 10,5, pri koncentrácii GSH 0,5 až 5 mmold a pri koncentrácii denaturačného prostriedku, pri ktorej ešte nedochádza k denaturácii.
Pri všetkých ostatných reakčných stupňoch zodpovedá aktivácia bielkoviny tvorbe zmesových disulfidov GSSG v rovnakých podmienkach ako pri uvedenom postupe. Pri tejto forme uskutočnenia je optimálne pH 8,5, výťažok je približne dvojnásobný a aktivovaná bielkovina je stála v renaturačnom pufri po dlhší čas.
Spôsobom podľa vynálezu je teda možné aktivovať t-PA z prokaryotických organizmov tak, že sa nielen dosiahne aktivácia na zvyčajnú biologickú účinnosť, ale naviac sa dosiahne stimulovateľnosť v spomínanom význame, a to v množstve, ktoré prevyšuje ďaleko stimulovateľnosť t-PA pri faktore vyššom než 10, niekedy 50.
Ďalšou bielkovinou z eukaryotických organizmov, ktorú je možné aktivovať spôsobom podľa vynálezu po expresii v prokaryotických organizmoch, je β-interferón.
Praktické uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu bude vysvetlené v nasledujúcich príkladoch. Ak nie je uvedenc inak, vzťahujú sa percentuálne údaje na hmotnostné percento a teplotné údaje na stupne Celzia.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 a 2 je znázornená účinnosť pri pridaní a bez pridania CNBr-FSP v štandardnom pokuse po 17 hodinách reoxidácie pri teplote miestnosti v zmesi 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1,0 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-arginínu + 1 mg/ml BSA+ 0,5 mmol/1 GSH + + 0,5 mmol/1 GSSG. Na obr. 1 a 2 znamená krivka A účinnosť prítomnosti CNBr-FSP a krivka B účinnosť bez CNBr-FSP.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
a) Príprava refraktívnych teliesok
100 g vlhkej bunkovej hmoty E. coli v 1,5 1 tris/HCl s koncentráciou 0,1 mol/1, pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA sa 10 sekúnd homogenizuje na zariadení Ultra-Turrax, a potom sa pridá 0,25 mg/ml lyzozýmu. Po 30 minútach inkubácie pri teplote miestnosti sa zmes znova homogenizuje a ochladí na teplotu 3 °C. Bunky sa rozrušia dispergovaním pri vysokom tlaku 550 kg/cm2. Potom sa pridá 300 ml tris-HCl s koncentráciou 0,1 mol/1 pri pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA. Po odstredení 5 (Sorvall GSA, 2 hodiny pri 13 000 otáčkach za minútu,
21000 x g, 4 °C) sa peleta zmieša s 1,2 1 tris-HCl s koncentráciou 0,1 mol/1 pri pH 6,5, 20 mmol/1 EDTA a 2,5 % Triton-X-100, a potom sa homogenizuje. Materiál sa opakovane odstredí (Sorvall GSA, 30 minút pri 10 13 000 otáčkach za minútu, 27 000 x g, 4 °C) sa peleta zmieša s 1,3 1 tris-HCl s pH 6,5 s koncentráciou 0,1 mol/1 a 20 mmol/1 EDTA a 0,5 % Triton-X-100 a materiál sa homogenizuje. Potom sa materiál ešte raz odstredí (Sorvall GSA, 30 minút pri 13 000 ot/min, 15 27 000 x g, 4 °C) a pelety sa homogenizujú v 1 litri tris-HCl s koncentráciou 0,1 mol/1 pri pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA, toto odstredenie sa vykonáva trikrát.
Obsah t-PA v refraktívnych telieskach sa vo výslednom materiáli zaisťuje pri použití SDS-PAGE, pá20 sy s obsahom t-PA sa identifikujú spôsobom Westem-blotting a kvantitatívne sa stanovia denzitometricky. Použitím tohto spôsobu je možné dokázať silný pás s obsahom t-PA s molekulovou hmotnosťou približne 60 k jednotiek. Podiel t-PA v celkovej bielkovine refrak25 tívnych teliesok je približne 21 %.
b) Solubilizácia/redukcia refraktívnych teliesok
Refraktívne telieska s koncentráciou bielkovín 1 až mg/ml sa inkubujú v 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 8,6, 6 mol/1 guanidínhydrochloridu, 0,15 až 0,4 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTA počas 2 až 3 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa nerozpustný materiál, napríklad bunkové fragmenty a podobne oddelia odstredením , (napríklad Sorvall SS 34, 30 minút pri teplote 4 °C, pri 15 000 až 20 000 otáčkach za minútu a pri 35 000 až 50 000 x g). Hodnota pH supematantu sa upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Denaturačné a redukčné prostriedky sa oddelia dialýzou proti 0,01 mol/1 kyseliny chlorovodíkovej pri teplo40 te 4 °C.
c) Reoxidácia/aktivácia
Reoxidácia/aktivácia sa vykonáva pri riedení 1:50 45 až 1: 200 v roztoku, ktorý obsahuje 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 mol/1 1-arginínu, 2 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG. Po 17 až 24 hodinách aktivácie pri teplote približne 20 °C sa stanoví účinnosť porovnaní s účinnosťou natívneho 50 glykozylovaného t-PA z eukaryotických organizmov a výťažok tejto látky. Výťažok vztiahnutý' na celkový obsah bielkoviny v refraktívnych telieskach sa pohybuje v rozmedzí: 2,5 ± 0,5 %, stimulovateľnosť je 10 ± 5.
Výťažok vztiahnutý na podiel t-PA v refraktívnych 5 5 telieskach j e približne 12%.
d) Reoxidácia/aktivácia bez oddelenia denaturačného/redukčného činidla
Refraktívne telieska sa inkubujú pri koncentrácii bielkovín 1,25 mg/ml v zmesi, ktorá obsahuje 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 8,6, 6 mol/1 guanidínhydrochloridu, 0,2 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTA 2 hodiny pri teplote miestnosti. Okamžite potom sa vykonáva reo65 xidácia pri riedení 1:100 v roztoku, ktorý obsahuje 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5,1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml
BSA, 0,3 mol/11-arginínu a také množstvo GSSG, ktoré je uvedené v nasledujúcej tabuľke. Okrem toho sa stanoví v aktivačnej zmesi zvyšok koncentrácie guanidínhydrochloridu, ktorý je 0,06 mol/1 a DTE, s hodnotou 2 mmol/l.
Závislosť výťažku aktivácie na koncentrácii GSSG pri aktivácii bez oddelenia denaturačného/redukčného činidla
GSSG (mmol/l) výťažok (%) stimulovateľnosť (faktor)
0,2 0
1 0,13 4,0
5 1,49 1,4
6 1,28 5,4
7 1,04 5,8
9 0,98 5,2
10 1,77 10,0
15 0
20 0 -
Výťažok s čiarou - výťažok účinného t-PA, vztiahnuté na celkový obsah bielkoviny v refraktívnych telieskach.
Príklad 2
Vzorka refraktívnych. teliesok (450 ODwo/ml) sa inkubuje v zmesi s obsahom 1 ml 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 8,6, 6 mol/1 guanidínhydrochloridu a 0,15 až 0,2 mol/1 DTE, 2 až 3 hodiny pri teplote miestnosti. Nerozpustný materiál, napríklad bunkové fragmenty sa potom oddelia odstreďovaním 20 minút pri 17 000 otáčkach za minútu. Denaturačné a redukčné činidlo sa potom odstráni filtráciou na géli Sephadex G 25 (súperíme) v 0,01 mol/1 HC1. Potom sa vzorka zriedi 5 až 10-krát. Redukovaný materiál sa uschováva pri teplote -20°C v 0,01 mol/1 HC1.
Príklad 3
V nasledujúcich tabuľkách je zhrnutý vplyv rôznych parametrov spôsobu podľa vynálezu na aktiváciu a stimulovateľnosť t-PA. V týchto reoxidačných pokusoch bola solubilizovaná, redukovaná bielkovina použitá bez ďalšieho čistenia.
Redukovaná bielkovina v 0,01 mol HC1 bola aktivovaná riedením 1:10 až 1:500 v reoxidačnom pufri. Aktivácia bola dokazovaná pri teplote miestnosti po inkubácii 22 až 48 hodín pri tej istej teplote. Účinnosť reoxidovanej bielkoviny sa vzťahuje na štandardnú reoxidáciu, ktorá je považovaná za 100 % v roztoku s obsahom
0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1 mmol/l EDTA + 0,5 mol/11-argininu + 1,0 mg/ml BSA + 0,5 mmol/l GSH (redukovaný glutatión) + 0,5 mmol/l GSSG (glutatióndisulfid).
Stimulovateľnosť sa vypočítava ako E+CNBrFSP/E-CNBrFSP spôsobom opísaným v publikácii W. Nieuwenhuizon a ďalší, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 533. Účinnosť v % a stimulovateľnosť ako faktor sa stanoví spôsobom podľa publikácie J. N. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266 až 269 (1982).
Výsledky:
1. Závislosť výťažku aktivácie od prísad 1-arginínu guanidínhydrochloridu
Reakcia sa vykonáva v zmesi
0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1,0 mmol/l EDTA + l,0mg/mlBSA + 0,5 mmol/l GS + 0,5 mmol/l GSSG
a) 1 -arginín
1-arginín (mol/1) účinnosť (%) stimulovateľnosť (faktor)
0 4 2,5
0,25 98 7,5
0,5 100 21,9
0,5 27 16,3
1,0 23 3,5
Pri tomto pokuse je nutné uvážiť, že 1-arginín spôsobuje inhibiciu t-PA. Pokles výťažku aktivácie pri vyššej koncentrácii tejto látky je teda nutné pripočítať inhibícii.
b) Guanidínhydrochlorid (Gdn.HCl)
(Gdn.HCl) (mol/1) účinnosť (%)
0 11
0,25 22
0,5 53
0,75 58
1,0 12
2. Závislosť výťažku aktivácie od pridávania močoviny alebo jej derivátov
Reoxidácia sa vykonáva v zmesi 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5, 1,0 mmol/l EDTA, 1,0 mg/ml BSA, 5 mmol/l GSH, 0,2 mmol/l GSSG.
a) Močovina
močovina (mol/1) účinnosť (%)
0 1
0,5 20
1 59
1,5 126
2 162
2,5 141
3 72
4 12
5 0
b) Metylmočovina
metylmočovina (mol/1) účinnosť (%)
0,5 22
1 174
1,5 313
2 375
2,5 332
3 215
4 12
5 0
c) Etylmočovina
etylmočovina (mol/1) účinnosť (%)
0,5 46
1 212
1,5 323
2 300
2,5 107
3 19
4 0
5 0
c) Acetamid
acetamid (mol/1) účinnosť (%)
5 0,5 72
1 134
1,5 207
2 261
10 2,5 204
3 237
4 198
5 141
d) Dimetylmočovina
dimetylmočovina (mol/1) účinnosť (%) stimulovateľnosť (faktor)
0,5 167 8,8
1 256 8,9
1,5 283 9,4
2 177 7,7
2,5 78 8,9
3 23 9,9
4 4 8,6
5 2 3,5
d) Propiónamid
propiónamid (mol/1) účinnosť (%)
20 0,5 95
1 99
1,5 197
2 150
2,5 101
25 3 39
4 2
5 0
3. Závislosť výťažku aktivácie od pridávania amidov alifatických kyselín
Reoxidácia sa vykonáva v zmesi 0.1 mol A tris-HCl s pH 10,5, 1,0 mmol/1 EDTA, 1,0 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, 0,2 mmol/1 GSSG.
a) Formamid
formamid (mol/1) účinnosť (%)
0 42
0,5 59
1 175
1,5 245
2 325
2,5 423
3 444
4 416
5 341
b) Metylformamid
metylformamid (mol/1) účinnosť (%)
0,5 100
1 135
1,5 304
2 389
2,5 466
3 452
4 425
5 121
e) Butyramid
butyramid účinnosť
(mol/1) (%)
0,5 55
1 52
1,5 17
2 0
4. Závislosť výťažku aktivácie od hodnoty pH
Reoxidácia sa vykonáva v zmesi
0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1,0 mmol/1 EDTA +0,5 mol/11-arginín +1,0 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG.
50 pH účinnosť (%) stimulovateľnosť (faktor)
7 1
8 22 3,0
55 9 89 13,6
10 105 20,3
11 95 21,3
5. Závislosť výťažku aktivácie od koncentrácie
GSII/GSSG
Reoxidácia sa vykonáva v zmesi
0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 +1,0 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/11-arginin +1,0 mg/ml BSA
a) + 1 mmol/1 GSH
GSSG (mmol/1) účinnosť (%) stimulovateľnosť (faktor)
0,1 239 14,9
0,2 273 15,3
0,5 193 13,3
1 198 12,5
5 17 2,1
10 0 -
20 0 -
b) + 0,2 mmolA GSSG
GSH (mmol/1) účinnosť (%) stimulovateľnosť (faktor)
0,05 15 2,2
0,1 40 3,8
0,2 112 6,8
0,5 142 7,4
1 273 6,8
5 260 7,9
10 143 6,3
20 55 5,1
6. Závislosť výťažku aktivácie od koncentrácie bielkoviny pri reoxidácii (riedenie 1:20 až 1:500)
Reoxidácia sa vykonáva v zmesi 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1,0 mmol/1 EDTA + 1,0 mg/ml BSA + 0,5 mol/1 l-arginin + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mtnol/1 GSSG.
zriedenie účinnosť (%) stimulovateľnosť (faktor)
1 : 10 29 15,3
1 : 20 45 25,4
1 : 50 69 37,9
1 : 100 100 37,9
1 : 200 79 52,7
1 : 500 29 28,7
7. Závislosť výťazku aktivácie od pridania BSA
Reoxidácia sa vykonáva v zmesi
0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1,0 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/11-arginín + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG.
BSA (mg/ml) účinnosť (%)
0 47
0,5 83
1 100
3 102
5 52
Na obr. 1 a 2 je znázornená účinnosť pri pridaní a bez pridania CNBr-FSP v štandardnom pokuse po 17 hodinách reoxidácie pri teplote miestnosti v zmesi 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 10,5 + 1,0 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/11-arginínu + 1 mg/ml BSA+ 0,5 mmol/1 GSH + + 0,5 mmol/1 GSSG. Na obr. laž znamená krivka A účinnosť prítomnosti CNBr-FSP a krivka B účinnosť bez CNBr-FSP.
Príklad 4
Aktivácia t-PA pri tvorbe zmesov disulfidov t-PA a GSSG
Refraktívne telieska sa získajú spôsobom podľa niektorého z predchádzajúcich príkladov. Redukcia týchto teliesok sa vykonáva 2 hodiny pri teplote miestnosti v zmesi, ktorá obsahuje 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 8,6 + 1,0 mmol/1 EDTA, 6 mol/1 Gdn/HCl a 0,2 molA DTE pri koncentrácii bielkoviny približne 1 mg/ml.
Bielkovina, redukovaná a dialyzovaná proti 0,01 mol/1 HCI sa zriedi v pomere 1:1 zmesou 0,1 mol/1 tris s pH 9,3, 9 molA močoviny a 0,2 mol/1 GSSG, a potom sa inkubuje 5 hodín pri teplote miestnosti.
Po okyslení koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3, sa zmes dialyzuje proti 0,1 mol/1 HCI pri teplote 4°C. Po dialýze je celková koncentrácia bielkoviny 0,33 mg/ml. Pri použití takto získaného tPASSG je možné stanoviť optimálne podmienky reaktivácie.
a) Optimálne pH na aktiváciu t-PASSG
V nasledujúcom opise 1) nebol použitý žiadny GSSG a 2) aktivácia bola stanovená po 17 hodinách inkubácie pri teplote miestností. Aktivácia prebieha pri zriedení 1 : 100 v zmesi s obsahom 0,1 mol/tris, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 molA-arginínu, 1 mg/ml BSA a 2 mmol/1 GSH, súčasne bolo menené pH.
PH výťažok (%) stimulovateľnosť
6 0,04 3,3
6,5 0,37 9,5
7 1,35 11,4
7,5 5,66 7,1
8 7,32 8,2
8,5 8,65 7,0
9 8,59 8,7
9,5 8,32 11,7
10 6,15 12,5
10,5 3,07 11,2
Výťažok sa stanoví v % aktívneho t-PA, vztiahnuté na použité množstvo bielkoviny.
b) Reprodukovateľnosť výsledkov na aktiváciu t-PASSG
Pri rovnakých podmienkach aktivácie bolo možné pri rôznom meraní pozorovať rozdielne výťažky, čo mohlo byť spôsobené okrem iného zmenami v štandarde t-PA. Aby bolo možné overiť šírku tejto chyby, boli zhrnuté všetky údaje na aktiváciu po zriedení v pomere 1:100 a 1:200 v zmesi s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 8,5,1 mmol/1 EDTA, 0,5 mol/11-arginínu, 1 mg/ml BSA a 2 mmol/1 GSH.
SK 278317 Β6
pokus výťažok (%) stimulovateľnosť
1 8,65 7,0
2 4,47 9,3
3 4,49 9,7
4 8,50 6,5
5 3,45 17,2
6 4,32 8,3
7 3,29 14,0
8 3,54 13,4
9 5,07 16,4
c) Závislosť výťažku aktivácie od množstva močoviny
Bol použitý roztok z odseku b), aktivácia bola vykonávaná 17 hodín pri teplote 0 °C. Závislosť aktivácie od močoviny
močovina (M) účinnosť (%)
0 13
0,5 100
1 200
1,5 100
stredná hodnota 5,1 + 1,9 11,3 + 3,8
c) Stálosť aktivovanej bielkoviny
Aktivácia bola vykonávaná riedením 1:200 v zmesi s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 mol/1 1-arginínu, 1 mg/ml BSA a 2 mmol/1 GSH.
Príklad 5
Aktivácia β-interferónu, získaného genetickým inžinierstvom
Refraktívne telieska boli získané uvedeným spôsobom. Redukcia/solubilizácia týchto teliesok boli uskutočnené nasledujúcim spôsobom: peleta bola inkubovaná 3 hodiny pri teplote 25 °C v 10 ml zmesi, 9,1 mol tris-HCl s pH 8,6, 6 mol/1 Gdn/HCl, 1 mmol/1 EDTA a 0,2 mol/1 DTE a po 30 minútach bola zmes odstredená pri teplote 4 °C a pri 48 000 x g a pH supematantu bolo upravené na hodnotu 3 pridaním koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Potom bola vykonávaná filtrácia na géli Sephadex G25 P v 0,01 mol/1 HC1.
Eluát bol sledovaný pri 280 nm a bola stanovená extinkcia, koncentrácia bielkovín a reaktivita.
Aktivácia štandardu (100 %) sa vykonáva v zmesi s obsahom 0,1 mol tris-HCl s pH 10,5,1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/11-argininu.
a) Závislosť aktivácie od času
Eluát sa zriedi v pomere 1:50 zmesou, ktorá obsahuje 0,1 mol tris-HCl s pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/11-arginínu.
d) Závislosť výťažku aktivácie od množstva formamidu
Aktivácia sa vykonáva v rovnakej zmesi ako v odseku b), vzorky sa sledujú po 17 hodinách aktivácie pri teplote 0 °C.
Závislosť aktivácie od formamidu
formamid (M) účinnosť (%)
0 13
1 13
2 13
3 0
4 0
e) Závislosť výťažku aktivácie od redox-pufra
Eluát sa zriedi v pomere 1:50 zmesou s obsahom 0,1 mol tris-HCl s pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 0,25 mmol/1 1-arginínu a vzorky sa sledujú po 17 hodinách aktivácie pri teplote 0 °C.
čas aktivácie účinnosť
(hod.) (%)
1 15
3 15
20 2
b) Závislosť výťažku aktivácie od pridania 1-arginínu
Eluát sa zriedi v pomere 1:50 zmesou, ktorá obsahuje 0,1 mol tris-HCl s pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a potom sa zmes aktivuje 20 hodín pri teplote 0 °C
Závislosť aktivácie od množstva 1-arginínu
1-arginín účinnosť
(M) (%)
0 8
0,25 8
0,5 15
0,75 15
Závislosť aktivácie od pomeru GSH/GSSG
GSH (mM) GSSH (mM) účinnosť (%)
1 0,5 6
5 0,5 13
10 0,5 25
20 0,5 25
5 0,1 13
5 0,5 13
5 1,0 13
5 5 6
f) Závislosť výťažku aktivácie od koncentrácie bielkoviny
Eluát sa zriedi v pomere 1 : 10 až 1 : 100 zmesou s obsahom 0,1 M tris-HCl s pH 8,5, lmM EDTA, 0,5 mM GSSG, 5 mM GSH a 0,25 mmol/1 1-arginínu, stanovenie sa vykonáva po aktivácii 17 hodín pri teplote 0 °C.
Závislosť aktivácie cp
cp (mg/ml) účinnosť (%)
0,018 13
0,036 13
0,072 13
0,108 8
0,180 10
SK 278317 Β6
g) Závislosť výťažku aktivácie od pridávania BSA
Eluát sa zriedi v pomere 1:5 zmesou s obsahom 0,1 M tris-HCl s pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5 mM GSSG, 5 mM GSH a 0,25 mmol/1 1-arginínu a výsledok sa stanoví po 17 hodinách aktivácie pri teplote 0 °C.
Závislosť aktivácie od BSA
BSA (mg/ml) účinnosť (%)
0 13
1 13
2 25
5 13
h) Závislosť výťažku aktivácie na pH
Eluát sa zriedi v pomere 1:5 zmesou s obsahom 0,1 M tris-HCl s pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5 mM GSSG, 5 mM GSH a 0,25 mmol/1 1-arginínu a výsledok sa stanoví po 17 hodinách atkivácie pri teplote 0 °C.
Závislosť aktivácie od pH
pH účinnosť (%)
6,5 0
7,5 6
8,5 13
9,5 50
10,5 100

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob aktivácie genetickou technológiou získaných, heterológnych bielkovín s obsahom disulfidových mostíkov eukaryotického pôvodu po expresii v prokaryotických organizmoch, po rozrušení buniek solubilizáciou a následnej denaturácii a redukcii, pri aktivácii v oxidačných podmienkach za prítomnosti GSH/GSSG, vyznačujúci sa tým, že sa aktivácia vykonáva pri pH 9 až 12, pri koncentrácii GSH 0,1 až 20 mmol/1, koncentrácii GSSG 0,01 až 3 mmol/1 a pri koncentrácii denaturačného prostriedku, ktorá ešte nevedie k denaturácii bielkoviny.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa aktivácia vykonáva pri pH v rozmedzí 9,5 až 11.
  3. 3. Spôsob podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že sa aktivácia vykonáva pri koncentrácii GSH 0,2 až 10 mmol/1 a/alebo pri koncentrácii GSSG 0,05 až 1 mmol/1.
  4. 4. Spôsob podľa nároku laž3, vyznačujúci sa tým, že sa aktivácia vykonáva bez predchádzajúceho oddelenia denaturačného/redukčného činidla, pričom reakčný roztok sa po denaturácii/redukcii zriedi aktivačným pufrom a pri nasledujúcej aktivácii prevyšuje koncentrácia GSSG zvyškovú koncentráciu DTE,
  5. 5. Spôsob aktivácie podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa redukčné/denaturačné činidlo oddelí, pridaním GSSG v denaturačných podmienkach sa tiolové, skupiny bielkovín premenia na zmesové disulfidy bielkoviny a glutatiónu, aktivácia sa vykonáva pri pH 7 až 10,5, pri koncentrácii GSH 0,5 až
    5 mmol/1 a pri koncentrácii denaturačného činidla, ktoré ešte nevedie k denaturácii bielkovín.
  6. 6. Spôsob podľa nárokov laž5, vyznačujúci sa tým, že sa na expresiu použijú mikroorganizmy E. coli alebo P. putida.
  7. 7. Spôsob podľa nárokov lažô, vyznačujúci sa tým, že sa v aktivačnom stupni ako denaturačné činidlo použije arginín, guanidín-hydrochlorid a/alebo aspoň jedna zlúčenina všeobecného vzorca (I), lÚ-CO-NRR1 (T) kde
    R a R1 znamenajú atóm vodíka alebo alkylový zvyšok s 1 až 4 atómami uhlíka a
    R2 znamená atóm vodíka, zvyšok NHR1 alebo alkylovaný zvyšok s 1 až 3 atómami uhlíka.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia argininu a/alebo guanidínhydrochloridu je 0,1 až 1,8 mol/1, výhodne 0,25 až 0,8 mol/1.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že sa zlúčenina všeobecného vzorca (I) použije v koncentrácii 0,5 až 4 mol/1, výhodne 1 až 3,5 mol/1.
  10. 10. Spôsob podľa nárokov laž9, vyznačujúci sa t ý m , že v aktivačnom stupni sa postup vykonáva za prítomnosti bielkoviny, ktorá nemá proteolytický účinok, najmä za prítomnosti sérového albumínu hovädzieho dobytka.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa rozrušenie buniek vykonáva v zriedenom vodnom roztoku pufŕa, výhodne v 0,1 mol/1 tris-pufra pri neutrálnom alebo slabokyslom pH.
  12. 12. Spôsob podľa nárokov lažll, vyznačujúci sa tým, že sa po rozrušení buniek oddelí nerozpustný podiel.
  13. 13. Spôsob podľa nárokov lažl2, vyznačujúci sa tým, žesav solubilizačnom stupni postup vykonáva pri alkalickom pH za prítomnosti redukčného činidla s obsahom merkaptoskupín za prítomnosti denaturačného činidla.
  14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že sa postup vykonáva za prítomnosti guanidínhydrochloridu a/alebo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) ako denaturačného činidla.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa guanidínhydrochlorid použije v koncentrácii 6 mol/1 a zlúčenina všeobecného vzorca (I) v koncentrácii 8 mmol/1.
  16. 16. Spôsob podľa nárokov 13 až 15, v y z n a čujúci sa tým, že sa postup vykonáva za prítomnosti DTE, β-merkaptoetanolu alebo GSH.
  17. 17. Spôsob podľa nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že sa čistenie a oddelenie redukčného, oxidačného alebo denaturačného činidla vykonáva sférickou chromatografiou alebo dialýzou.
  18. 18. Spôsob podľa nárokov lažl7, vyznačujúci sa tým, že sa po aktivácii zaradí čistiaci stupeň, čistenie sa vykonáva dialýzou.
  19. 19. Spôsob podľa nárokov lažl8, vyznačujúci sa tým, že sa použije genetickým inžinierstvom získaná eukarvotická bielkovina t-PA.
  20. 20. Spôsob podľa nárokov 1 až 19, vyznačujúci sa tým, že sa použije genetickým
    SK 278317 Β6 inžinierstvom získaná eukaryotická bielkovina interferón β·
  21. 21. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa zmesový disulfid bielkoviny a glutatiónu oddelí od nemodifikovanej bielkoviny pôsobením 5 ionomeniča.
SK7526-86A 1985-10-23 1986-10-17 Activation method of by genetic technology gained heterologous proteins with content of disulfidic bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms SK278317B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853537708 DE3537708A1 (de) 1985-10-23 1985-10-23 Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK752686A3 SK752686A3 (en) 1996-10-01
SK278317B6 true SK278317B6 (en) 1996-10-02

Family

ID=6284269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK7526-86A SK278317B6 (en) 1985-10-23 1986-10-17 Activation method of by genetic technology gained heterologous proteins with content of disulfidic bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms

Country Status (26)

Country Link
EP (3) EP0393725B1 (sk)
JP (2) JPH0728745B2 (sk)
KR (1) KR900009139B1 (sk)
AT (2) ATE131489T1 (sk)
AU (2) AU590029B2 (sk)
CA (1) CA1329157C (sk)
CZ (1) CZ280727B6 (sk)
DD (1) DD260517A5 (sk)
DE (3) DE3537708A1 (sk)
DK (2) DK175091B1 (sk)
ES (2) ES2020498T3 (sk)
FI (2) FI94050C (sk)
GR (2) GR920300062T1 (sk)
HK (2) HK153496A (sk)
HR (1) HRP921075B1 (sk)
HU (2) HU204855B (sk)
IE (1) IE62634B1 (sk)
IL (1) IL80325A (sk)
PT (1) PT83609B (sk)
SI (1) SI8611796B (sk)
SK (1) SK278317B6 (sk)
SU (1) SU1607689A3 (sk)
UA (1) UA6023A1 (sk)
WO (1) WO1987002673A2 (sk)
YU (1) YU47185B (sk)
ZA (1) ZA868012B (sk)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
JP2581668B2 (ja) * 1985-11-27 1997-02-12 三井東圧化学株式会社 ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞
US4777043A (en) * 1985-12-17 1988-10-11 Genentech, Inc. Stabilized human tissue plasminogen activator compositions
AU621051B2 (en) 1987-04-28 1992-03-05 Amgen, Inc. Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor
DE3722082A1 (de) * 1987-07-03 1989-01-12 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von serinproteasen oder serinproteaseinhibitoren
CA1340586C (en) * 1988-09-23 1999-06-08 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interferon-beta
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
DE3942143A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh T-pa pro stabilisierung
DE69126434D1 (de) * 1990-08-20 1997-07-10 Novo Nordisk As Prozess für die Herstellung von biologisch aktivem IGF-1 durch Verwendung von amino-terminal verlängertem IGF-1
EP0547102B1 (en) * 1990-09-05 1998-07-08 Southern Cross Biotech Pty.Ltd. Solubilization of proteins in active forms
DE4037196A1 (de) * 1990-11-22 1992-05-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein
DE4113750A1 (de) 1991-04-26 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen
DE4139000A1 (de) * 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf
US5212091A (en) * 1992-03-02 1993-05-18 Monsanto Company Method of producing tissue factor pathway inhibitor
WO1993019084A1 (en) * 1992-03-24 1993-09-30 Synergen, Inc. Refolding and purification of insulin-like growth factor i
DE59305396D1 (de) 1992-12-02 1997-03-20 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
FR2729972B1 (fr) * 1995-01-31 1997-04-18 Sanofi Sa Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine
US5714371A (en) * 1995-05-12 1998-02-03 Schering Corporation Method for refolding insoluble aggregates of hepatitis C virus protease
US5728804A (en) * 1995-06-02 1998-03-17 Research Corporation Technologies, Inc. Use of cyclodextrins for protein renaturation
AU714318B2 (en) * 1996-06-11 2000-01-06 Roche Diagnostics Gmbh Process for the activation of denatured protein
US7153943B2 (en) 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US6653098B1 (en) * 1998-02-23 2003-11-25 G. D. Searle & Co. Method of producing mouse and human endostatin
DE19850429A1 (de) * 1998-10-27 2000-05-04 Andre Schrattenholz Fragmente
EP1048732A1 (de) * 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
EP1077263A1 (de) * 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
ATE367398T1 (de) 2000-05-16 2007-08-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur rückfaltung von proteinen mit freien cysteinresten
DE10105912A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Proteinase K
DE10105911A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium album in Hefe
DE102005033250A1 (de) 2005-07-15 2007-01-18 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von G-CSF
DE202006020194U1 (de) 2006-03-01 2007-12-06 Bioceuticals Arzneimittel Ag G-CSF-Flüssigformulierung
WO2008008975A2 (en) 2006-07-14 2008-01-17 Genentech, Inc. Refolding of recombinant proteins
EP2102355B1 (en) 2006-12-14 2016-03-02 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
EA022821B1 (ru) 2010-03-17 2016-03-31 Ратиофарм Гмбх Способ получения биологически активного рекомбинантного г-ксф человека
CN103168046A (zh) * 2010-10-20 2013-06-19 米迪缪尼有限公司 用于加工包涵体的方法
HUP1200171A1 (hu) 2012-03-19 2013-09-30 Richter Gedeon Nyrt Módszerek polipeptidek elõállítására
HUP1200172A2 (en) 2012-03-19 2013-10-28 Richter Gedeon Nyrt Methods for refolding g-csf from inclusion bodies
CN103852527B (zh) * 2012-12-05 2015-05-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种高通量蛋白质样品预处理装置
US10457716B2 (en) 2014-08-06 2019-10-29 University Of Notre Dame Du Lac Protein folding and methods of using same
EP3562839A4 (en) 2016-12-30 2020-09-02 Biogend Therapeutics Co., Ltd. RECOMBINANT POLYPEPTIDES, ASSOCIATED COMPOSITIONS AND PROCESSES
AU2021399935A1 (en) 2020-12-18 2023-06-29 Richter Gedeon Nyrt. Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5135481A (ja) * 1974-09-18 1976-03-25 Fujiwa Kako Kk Kojundohitorokinaaze no seiho
US4468633A (en) 1982-04-28 1984-08-28 The Bendix Corporation Adjustable microwave power combiner for a plurality of coaxially mounted impatt diodes
AR241654A1 (es) 1982-05-05 1992-10-30 Genentech Inc Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano.
US4432895A (en) * 1982-11-24 1984-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monomeric interferons
GR79124B (sk) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
WO1984003711A1 (en) * 1983-03-25 1984-09-27 Celltech Ltd A process for the production of a protein
JPS6051119A (ja) * 1983-08-30 1985-03-22 Green Cross Corp:The ウロキナ−ゼ乾燥製剤
US4530787A (en) * 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
US4748234A (en) * 1985-06-26 1988-05-31 Cetus Corporation Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
FR2596360B1 (fr) * 1986-04-01 1989-02-17 Sotralentz Sa Conteneur sur palette avec dispositif de protection en treillis plie et renforce
JPH0651119A (ja) * 1992-07-28 1994-02-25 Sekisui Chem Co Ltd 位相差板の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK200001897A (da) 2000-12-18
DD260517A5 (de) 1988-09-28
CZ752686A3 (en) 1996-01-17
DE3537708C2 (sk) 1993-07-08
DK320387D0 (da) 1987-06-23
EP0393725B1 (de) 1995-12-13
SK752686A3 (en) 1996-10-01
FI933868A0 (fi) 1993-09-03
SI8611796A (sl) 1996-10-31
HRP921075B1 (en) 1999-02-28
ES2020498T3 (es) 1996-04-01
FI872753A (fi) 1987-06-22
JPH04218387A (ja) 1992-08-07
FI933868A (fi) 1993-09-03
DK320387A (da) 1987-06-23
AU590029B2 (en) 1989-10-26
FI94050C (fi) 1995-07-10
ATE98648T1 (de) 1994-01-15
DE3537708A1 (de) 1987-04-23
DK175091B1 (da) 2004-05-24
PT83609B (pt) 1988-10-14
IL80325A0 (en) 1987-01-30
EP0219874B1 (de) 1993-12-15
EP0219874A2 (de) 1987-04-29
WO1987002673A3 (fr) 1987-10-22
AU4132189A (en) 1990-01-04
KR900009139B1 (ko) 1990-12-22
HUT43643A (en) 1987-11-30
IE862683L (en) 1987-04-23
ES2020498A4 (es) 1991-08-16
EP0393725A1 (de) 1990-10-24
KR870700601A (ko) 1987-12-30
IL80325A (en) 1992-06-21
AU6599386A (en) 1987-05-19
SI8611796B (sl) 1998-06-30
WO1987002673A2 (en) 1987-05-07
YU47185B (sh) 1995-01-31
GR920300062T1 (en) 1992-08-31
GR3018410T3 (en) 1996-03-31
DE3689404D1 (de) 1994-01-27
CA1329157C (en) 1994-05-03
JPH0824594B2 (ja) 1996-03-13
JPS62502895A (ja) 1987-11-19
HU204855B (en) 1992-02-28
UA6023A1 (uk) 1994-12-29
YU179686A (en) 1988-06-30
IE62634B1 (en) 1995-02-22
JPH0728745B2 (ja) 1995-04-05
FI95578B (fi) 1995-11-15
FI95578C (fi) 1996-02-26
PT83609A (de) 1986-11-01
HK153596A (en) 1996-08-16
DE3650449D1 (de) 1996-01-25
DK175109B1 (da) 2004-06-07
ES2061434T3 (es) 1994-12-16
EP0253823A1 (de) 1988-01-27
ATE131489T1 (de) 1995-12-15
EP0219874A3 (en) 1988-02-10
CZ280727B6 (cs) 1996-04-17
ZA868012B (en) 1987-06-24
HK153496A (en) 1996-08-16
FI94050B (fi) 1995-03-31
AU607083B2 (en) 1991-02-21
FI872753A0 (fi) 1987-06-22
SU1607689A3 (ru) 1990-11-15
HRP921075A2 (en) 1995-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK278317B6 (en) Activation method of by genetic technology gained heterologous proteins with content of disulfidic bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms
US5453363A (en) Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes
JP4383546B2 (ja) 活性化プロテインｃの改良プロセシング方法
US6037452A (en) Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
EP1893632B1 (en) Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
EP0364926B1 (de) Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in Prokaryonten exprimierten Antikörpern
JPH11511759A (ja) 変性タンパク質の活性化方法
EP0331464A2 (en) Method of refolding urokinase precursor-like protein
Martinek et al. Reactivation of enzymes irreversibly denatured at elevated temperature Trypsin and α-chymotrypsin covalently immobilized on sepharose 4B and in polyacrylamide gel
AU620927B2 (en) A preparation of plasminogen activator expressed in prokaryotes
Webster et al. A dye-photosensitized reaction that generates stable protein-protein crosslinks
CZ280848B6 (cs) Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech
Nohara et al. High performance in refolding of Streptomyces griseus trypsin by the aid of a mutant of Streptomyces subtilisin inhibitor designed as trypsin inhibitor
JP2013524799A (ja) 組換えトロンビンの生産方法
Walter Characterization of agarose-bound trypsin
Fountoulakis Resistance of recombinant proteins to proteolysis during folding and in the folded state
Yamamoto et al. Renaturation of irreversibly thermodeactivated invertase
Goldberg et al. Two-Step Sulfate-Enhanced Refolding: Recombinant Pneumocystis carinii Dihydrofolate Reductase
JPS6226298A (ja) ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法