JPS62111688A - プロテインａ様物質の遺伝子，該遺伝子を含有する組み換えプラスミド，および該組み換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞 - Google Patents
プロテインａ様物質の遺伝子，該遺伝子を含有する組み換えプラスミド，および該組み換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞Info
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- JPS62111688A JPS62111688A JP60249878A JP24987885A JPS62111688A JP S62111688 A JPS62111688 A JP S62111688A JP 60249878 A JP60249878 A JP 60249878A JP 24987885 A JP24987885 A JP 24987885A JP S62111688 A JPS62111688 A JP S62111688A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、遺伝子工学の方法により、プロティンＡ様物
質の遺伝子を含有する組み換えプラスミドによって形質
転換された宿主細胞、およびこの形質転換体を用いてプ
ロティンＡ様物質を製造する方法に関する。
質の遺伝子を含有する組み換えプラスミドによって形質
転換された宿主細胞、およびこの形質転換体を用いてプ
ロティンＡ様物質を製造する方法に関する。
（従来の技術）
１ プロティンＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレ
ウス（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）
の細胞壁蛋白である。なかでも、 Ｃｏｗａｎ １株
（ＳＡＣ）はその含有量が特に多いことが知られている
。その１つの型につき２分子量が約４２，０００の糖を
含まないシングル・ポリペプチドであることが報告され
ており。
ウス（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）
の細胞壁蛋白である。なかでも、 Ｃｏｗａｎ １株
（ＳＡＣ）はその含有量が特に多いことが知られている
。その１つの型につき２分子量が約４２，０００の糖を
含まないシングル・ポリペプチドであることが報告され
ており。
全細胞蛋白質の１．７％を占め、細胞壁の主成分の１つ
であることが知られている（Ｂｉｏｒｋ、 ｅｔ ａｌ
。
であることが知られている（Ｂｉｏｒｋ、 ｅｔ ａｌ
。
Ｅｕｒｏ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ２９ 、５７
９ （１９７２）） 、プロティンＡの形状は、一般の
球状蛋白質に比べて摩擦係数が高く、固有粘度が高いこ
とがら、比較的細長く伸びた分子形をしているらしい。
９ （１９７２）） 、プロティンＡの形状は、一般の
球状蛋白質に比べて摩擦係数が高く、固有粘度が高いこ
とがら、比較的細長く伸びた分子形をしているらしい。
その構造は。
４つの相同性の高いサブユニット（Ｎ末端のものから順
にり、Ａ、ＢおよびＣと一般に命名され。
にり、Ａ、ＢおよびＣと一般に命名され。
各サブユニットは約６０個のアミノ酸残基がら構成され
る）とアミノ酸残基約１５０個から構成される、Ｃ末端
サブユニットとからなる。上記４つのサブユニッＩ−Ｄ
、Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ｇ） １分子を３ｉ １ｇ にのＰｃ部分で結合する
能力を有する。このプロティンへの活性部分であるＩｇ
Ｇ結合部分については、アミノ酸配列が決定され、その
詳細な構造が研究されている（Ｓｊ６ｄａｈｌ、 Ｊ、
、 Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ７３＋ ３
４３ （１９７７）および５ｊ５ｄａｈｌ、 Ｊ、、
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ７８．４７１（
１９７７）） 、また、 Ｕｈｌｅｎ等は、スタフィロ
コッカスから抽出したプロティンＡ遺伝子の塩基配列を
決定し、その結果からプロティンＡの構造を求め。
る）とアミノ酸残基約１５０個から構成される、Ｃ末端
サブユニットとからなる。上記４つのサブユニッＩ−Ｄ
、Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ｇ） １分子を３ｉ １ｇ にのＰｃ部分で結合する
能力を有する。このプロティンへの活性部分であるＩｇ
Ｇ結合部分については、アミノ酸配列が決定され、その
詳細な構造が研究されている（Ｓｊ６ｄａｈｌ、 Ｊ、
、 Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ７３＋ ３
４３ （１９７７）および５ｊ５ｄａｈｌ、 Ｊ、、
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ７８．４７１（
１９７７）） 、また、 Ｕｈｌｅｎ等は、スタフィロ
コッカスから抽出したプロティンＡ遺伝子の塩基配列を
決定し、その結果からプロティンＡの構造を求め。
Ｓｊδｄａｈ Ｉ と同様のサブユニット構造およびり
、Ａ。
、Ａ。
Ｂ、Ｃの各サブユニットがＩｇＧのＩ’ｃ部分と結合で
きることを報告している（Ｕｈｌｅｎ、 Ｍ、、 ｅｔ
ａｔ、、 Ｊ。
きることを報告している（Ｕｈｌｅｎ、 Ｍ、、 ｅｔ
ａｔ、、 Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、ユ５９ （３）、 １６９５
（１９８４））。
（１９８４））。
プロティンＡはＩｇＧの抗原に対する親和力を太き（損
なうことなく ＩｇＧに結合する能力を有するため１
種々の診断および基礎研究の試験系における免疫吸着体
として広く用いられている（ ＵＳＰ−４，３２２，２
７４）。特に最近では、治療を目的としたプロティンＡ
の臨床上の応用に興味が集中しつつあり、血友病Ｂにお
ける抗■因子抗体の除去、 ＳＬＨにおける抗核抗体や
免疫複合体の除去などの他に。
なうことなく ＩｇＧに結合する能力を有するため１
種々の診断および基礎研究の試験系における免疫吸着体
として広く用いられている（ ＵＳＰ−４，３２２，２
７４）。特に最近では、治療を目的としたプロティンＡ
の臨床上の応用に興味が集中しつつあり、血友病Ｂにお
ける抗■因子抗体の除去、 ＳＬＨにおける抗核抗体や
免疫複合体の除去などの他に。
乳癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、骨髄腫などの癌治療へ
の利用が研究されている。しかしながら。
の利用が研究されている。しかしながら。
プロティンＡの抗腫瘍剤としての大規模な試験は。
材料が高価であることおよびあるプロティンＡ製品中に
不純物が存在することのために不可能であった。したが
って、純度の高いプロティンＡ製品が低価格で大量に生
産されれば、プロティンＡの抗腫瘍剤としての用途に関
する臨床試験は急速に発展することが期待される。
不純物が存在することのために不可能であった。したが
って、純度の高いプロティンＡ製品が低価格で大量に生
産されれば、プロティンＡの抗腫瘍剤としての用途に関
する臨床試験は急速に発展することが期待される。
プロティンＡの製造法としては、特Ｍ昭５９−１１３，
８９１に、スタフィロコッカス・アウレウスからプロテ
ィンＡ様物質のアミノ酸配列をコードする新規ヌクレオ
チド配列を抽出し、該配列を含む組み換えプラスミドに
よりエセリシア・コリーを形質転換し、該形質転換体に
よりプロティンＡ様物質を生産させることが開示されて
いる。しかしここでは。
８９１に、スタフィロコッカス・アウレウスからプロテ
ィンＡ様物質のアミノ酸配列をコードする新規ヌクレオ
チド配列を抽出し、該配列を含む組み換えプラスミドに
よりエセリシア・コリーを形質転換し、該形質転換体に
よりプロティンＡ様物質を生産させることが開示されて
いる。しかしここでは。
プロティンＡ様物質の遺伝子を得るための原料としてス
タフィロコッカスのような病原性を有する危険な微生物
を用いていること、また生産されたプロティンＡ様物質
はＩｇＧとの結合能力のない不活性部分を含んだりある
いはカラム処理のための不活性担体に結合しに（いなど
製品としての有用性に劣る可能性があること２などの問
題がある。
タフィロコッカスのような病原性を有する危険な微生物
を用いていること、また生産されたプロティンＡ様物質
はＩｇＧとの結合能力のない不活性部分を含んだりある
いはカラム処理のための不活性担体に結合しに（いなど
製品としての有用性に劣る可能性があること２などの問
題がある。
さらに、スタフィロコッカスの遺伝子をエセリシア・コ
リーに発現させるにあたって、プロモーターとしてエセ
リシアとは異なる群に属するスタフィロコッカス由来の
プロモーターをそのまま用いているため２発現の効率が
悪り、シたがってプロティンＡ様物質の量産には不適当
と考えられる。
リーに発現させるにあたって、プロモーターとしてエセ
リシアとは異なる群に属するスタフィロコッカス由来の
プロモーターをそのまま用いているため２発現の効率が
悪り、シたがってプロティンＡ様物質の量産には不適当
と考えられる。
） （発明が解決しようとする問題点）本発明は、上
述したような従来のプロティンＡ様物質の製造法および
それにより生産されたプロティンＡ様物質の問題点を解
決するために、スタフィロコッカスのような病原性を有
する危険な微生物を原料とすることなく、担体に結合し
やすい高純度のプロティンＡ様物質を量産することを意
図して完成されたものである。
述したような従来のプロティンＡ様物質の製造法および
それにより生産されたプロティンＡ様物質の問題点を解
決するために、スタフィロコッカスのような病原性を有
する危険な微生物を原料とすることなく、担体に結合し
やすい高純度のプロティンＡ様物質を量産することを意
図して完成されたものである。
本発明の目的は、プロティンＡ様物質を不活性担体に穏
和な条件で結合固定して用いることを想定して、プロテ
ィンＡ様物質のＩｇＧ結合領域のＮ末端あるいはＣ末端
にシスティンを付加せしめたすることにある。
和な条件で結合固定して用いることを想定して、プロテ
ィンＡ様物質のＩｇＧ結合領域のＮ末端あるいはＣ末端
にシスティンを付加せしめたすることにある。
本発明の他の目的は、化学合成した上記ポリデオキシリ
ボヌクレオチドを発現効率の良いλｐｌａｃ ５のプロ
モーター制御下で発現できるように組み込んだ組み換え
プラスミド、およびこの組み換えプラスミドにより形質
転換された宿主細胞を提供することにある。
ボヌクレオチドを発現効率の良いλｐｌａｃ ５のプロ
モーター制御下で発現できるように組み込んだ組み換え
プラスミド、およびこの組み換えプラスミドにより形質
転換された宿主細胞を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、この形質転換された宿主細
胞を培養して、培養物中にプロティンＡ様物質を含む蛋
白を生成せしめ、これを採取１分解してプロティンＡ様
物質を分離精製することにより、その活性部分のみを、
不活性担体に結合させやすい状態で、安全にかつ効率良
く量産できる。
胞を培養して、培養物中にプロティンＡ様物質を含む蛋
白を生成せしめ、これを採取１分解してプロティンＡ様
物質を分離精製することにより、その活性部分のみを、
不活性担体に結合させやすい状態で、安全にかつ効率良
く量産できる。
プロティンＡ様物質の製造方法を提供することにある。
（問題点を解決するための手段）
本発明のプロティンＡ様物質の遺伝子は、プロティンＡ
様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−結合能力を有する部
分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸にシスティンを
付加せしめたことを特徴とする。
様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−結合能力を有する部
分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸にシスティンを
付加せしめたことを特徴とする。
前記プロティンＡ様物質の遺伝子が２次のポリアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列を有する。 八ＤＮ
ＸＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＩＩＬＰＮＬＮＥＥＱＲ
ＮＧＩ？ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬ
ＮＤＡＱＡＰＫにこで、Ａ；アラニン、Ｃ；システィン
、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニ
ルアラニン＋Ｇｉグリシン、Ｈ；ヒスチジン、■；イソ
ロイシンＩＫＩリジン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン
、Ｎ；アスパラギン。
配列をコードするヌクレオチド配列を有する。 八ＤＮ
ＸＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＩＩＬＰＮＬＮＥＥＱＲ
ＮＧＩ？ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬ
ＮＤＡＱＡＰＫにこで、Ａ；アラニン、Ｃ；システィン
、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニ
ルアラニン＋Ｇｉグリシン、Ｈ；ヒスチジン、■；イソ
ロイシンＩＫＩリジン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン
、Ｎ；アスパラギン。
Ｐ；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン。
Ｓ；セリン Ｙ 、チロシンを意味する。前記プロティ
ンＡ様物質の遺伝子が１次のヌクレオチド配列を有する
。ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＸＧＡＹＡＡＹＡＡＲＴＴＹＡ
ＡＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴＴＹＴＡ
ＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡＹＪＪＪ
ＡＡＹＧＡ［？ＧＡＲＣＡＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＹ
ＡＴＹＣＡＲＬＬＬＪＪＪＡＡＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬ
ＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣＸＡＡＹＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧＡ
ＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲ
ＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＣコ、
：、で、Ａ：アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、
Ｔ；チミン、Ｒ； Ａ／Ｇ、Ｙ ； Ｃ／Ｔ、Ｚ ；
Ａ／Ｃ／Ｔ。
ンＡ様物質の遺伝子が１次のヌクレオチド配列を有する
。ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＸＧＡＹＡＡＹＡＡＲＴＴＹＡ
ＡＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴＴＹＴＡ
ＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡＹＪＪＪ
ＡＡＹＧＡ［？ＧＡＲＣＡＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＹ
ＡＴＹＣＡＲＬＬＬＪＪＪＡＡＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬ
ＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣＸＡＡＹＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧＡ
ＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲ
ＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＣコ、
：、で、Ａ：アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、
Ｔ；チミン、Ｒ； Ａ／Ｇ、Ｙ ； Ｃ／Ｔ、Ｚ ；
Ａ／Ｃ／Ｔ。
Ｘ ；Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、ＪＪＪ ； Ｌｅｕに対応する
コドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。
コドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。
本発明の組み換えプラスミドは、プロティンＡ様物質の
遺伝子を含有する組み換えプラスミドであって、（ａ）
ベクター、（ｂ）λｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペ
ロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、
および（Ｃ）該プロモーターの制御下にあるプロティン
Ａ様物質の遺伝子、を有する。
遺伝子を含有する組み換えプラスミドであって、（ａ）
ベクター、（ｂ）λｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペ
ロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、
および（Ｃ）該プロモーターの制御下にあるプロティン
Ａ様物質の遺伝子、を有する。
前記ベクターがρＢＲ３２２である。前記プロティンＡ
様物質の遺伝子を組み込むためのプラスミドベクターが
、前記ｐＢＲ３２２と前記λｐｌａｃ５との各ＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲｒで分解して得た消化物を連結して構
築したプラスミドにおいて、２つのＥｃｏＲ１切断部位
のうち１つを除去したものである。前記プロティンＡ様
物質の遺伝子が７プロテインＡ様物質の活性部分（Ｉｇ
ＧのＦｃ−結合能力を有する部分）のＮ末端あるいはＣ
末端のアミノ酸にシスティンを付加せしめたことを特徴
とする。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が１次のポリ
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。
様物質の遺伝子を組み込むためのプラスミドベクターが
、前記ｐＢＲ３２２と前記λｐｌａｃ５との各ＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲｒで分解して得た消化物を連結して構
築したプラスミドにおいて、２つのＥｃｏＲ１切断部位
のうち１つを除去したものである。前記プロティンＡ様
物質の遺伝子が７プロテインＡ様物質の活性部分（Ｉｇ
ＧのＦｃ−結合能力を有する部分）のＮ末端あるいはＣ
末端のアミノ酸にシスティンを付加せしめたことを特徴
とする。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が１次のポリ
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥ
ΩＲＮＧＦＩ口５ＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡにＫ
ＬＮＤＡＱＡＰＫにこで、Ａ；アラニン、Ｃ；システィ
ン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸。
ΩＲＮＧＦＩ口５ＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡにＫ
ＬＮＤＡＱＡＰＫにこで、Ａ；アラニン、Ｃ；システィ
ン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸。
Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシン、Ｈ；ヒスチジン
、■；イソロイシン、に；リジン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；
メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グ
ルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セリン、Ｙ；チロシン
を意味する。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が２次の
ヌクレオチド配列を有する。、 ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ
ＣχＧＡＶ八八Ｙ八八ＲＴＴＹＡＡＹ八へへＧへへＣＡ
ＲＣＡＲＡへへＧＣＸＴＴＹＴＡＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪ
ＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡＹＪＪＪＡＡＹＧＡＲＧＡＲＣ
ＡＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＹＡＴＹＣＡｌ？ＬＬＬＪ
ＪＪＡＡＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣ
ＸＡＡＹＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧＡＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲ
ＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴ
ＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＣココテ、 Ａ ； ７デ
ニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン、Ｒ；
Ａ／Ｇ、Ｙ ； Ｃ／Ｔ、Ｚ ； Ａ／Ｃ／Ｔ。
、■；イソロイシン、に；リジン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；
メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グ
ルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セリン、Ｙ；チロシン
を意味する。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が２次の
ヌクレオチド配列を有する。、 ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ
ＣχＧＡＶ八八Ｙ八八ＲＴＴＹＡＡＹ八へへＧへへＣＡ
ＲＣＡＲＡへへＧＣＸＴＴＹＴＡＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪ
ＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡＹＪＪＪＡＡＹＧＡＲＧＡＲＣ
ＡＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＹＡＴＹＣＡｌ？ＬＬＬＪ
ＪＪＡＡＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣ
ＸＡＡＹＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧＡＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲ
ＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴ
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Ａ／Ｇ、Ｙ ； Ｃ／Ｔ、Ｚ ； Ａ／Ｃ／Ｔ。
Ｘ；Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、ＪＪＪ ；Ｌｅｕに対応するコド
ン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。
ン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。
本発明の形質転換された宿主細胞は、（ａ）ベクター、
（ｂ）λｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペｏ７のプロ
モーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、および（Ｃ
）該プロモーターの制御下にあるプロティンＡ様物質の
遺伝子、を有する組み換えプラスミドにより形質転換さ
れた。前記宿主細胞が細菌類。
（ｂ）λｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペｏ７のプロ
モーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、および（Ｃ
）該プロモーターの制御下にあるプロティンＡ様物質の
遺伝子、を有する組み換えプラスミドにより形質転換さ
れた。前記宿主細胞が細菌類。
酵母およびその他の真菌類、ヒトおよびその他の動物の
培養細胞または植物の培養細胞である。前記宿主細胞が
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 、 シュードモナ
ス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する種である。前
記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）に属する菌株である。前記宿主細胞が
エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ） Ｋ−１２株ＩＩ ８１０１である。
培養細胞または植物の培養細胞である。前記宿主細胞が
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 、 シュードモナ
ス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する種である。前
記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）に属する菌株である。前記宿主細胞が
エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ） Ｋ−１２株ＩＩ ８１０１である。
前記形質転換された宿主細胞が、エセリシア・コリー（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ１２５ＰＡ−
Ｆｃである。前記ベクターがｐＢＩ？３２２である。前
記プロティンＡ様物質の遺伝子を組み込むためのプラス
ミドベクターが、前記ｐＢＲ３２２と前記λｐｌａｃ５
との各ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ旧で分解して得た消化物
を連結して構築したプラスミドにおいて、２つのＥｃｏ
ＲＩ切断部位のうち１つを除去したものである。前記プ
ロティンＡ様物質の遺伝子が、プロティンＡ様物質の活
性部分（ＩｇＧのＰｃ−結合能力を有する部分）のＮ末
端あるいはＣ末端のアミノ酸にシスティンを付加せしめ
たことを特徴とする。前記プロティンＡ様物質の遺伝子
が１次のポリアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を有する。ＡＤＮＫＦＮＫＥＱ１１ＮＡＦＹＨＩＬＩ
ＩＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡ
ＮＬＬ八Ｅ八ＫＫＬＮＤ八〇八ＰＫにこで、Ａｉアラニ
ン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタ
ミン酸。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ１２５ＰＡ−
Ｆｃである。前記ベクターがｐＢＩ？３２２である。前
記プロティンＡ様物質の遺伝子を組み込むためのプラス
ミドベクターが、前記ｐＢＲ３２２と前記λｐｌａｃ５
との各ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ旧で分解して得た消化物
を連結して構築したプラスミドにおいて、２つのＥｃｏ
ＲＩ切断部位のうち１つを除去したものである。前記プ
ロティンＡ様物質の遺伝子が、プロティンＡ様物質の活
性部分（ＩｇＧのＰｃ−結合能力を有する部分）のＮ末
端あるいはＣ末端のアミノ酸にシスティンを付加せしめ
たことを特徴とする。前記プロティンＡ様物質の遺伝子
が１次のポリアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を有する。ＡＤＮＫＦＮＫＥＱ１１ＮＡＦＹＨＩＬＩ
ＩＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡ
ＮＬＬ八Ｅ八ＫＫＬＮＤ八〇八ＰＫにこで、Ａｉアラニ
ン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタ
ミン酸。
Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシン、Ｈ；ヒスチジン
、Ｉ；イソロイシン、に；リジン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；
メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グ
ルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セリン、Ｙ；チロシン
を意味する。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が２次の
ヌクレオチド配列を有する。 ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣ
ＸＧＡＹＡＡＹＡＡＲＴＴＹＡＡＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲ
ＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴＴＹＴＡＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣ
ＡＹＪＪＪＣＣＸへへＹＪＪＪへへＹＧへＲＧＡＲＣＡ
ＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＹＡＴＹＣＡＲＬＬＬＪＪＪ
ＡＡＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣＸＡ
ＡＹＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧＡＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲＪＪ
ＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴＧＹ
ＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴにこで、Ａ；アデニン、Ｇ；グア
ニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン、Ｒ、Ａ／Ｇ、Ｙ 、
Ｃ／Ｔ、Ｚ ｉ Ａ／Ｃ／Ｔ。
、Ｉ；イソロイシン、に；リジン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；
メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グ
ルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セリン、Ｙ；チロシン
を意味する。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が２次の
ヌクレオチド配列を有する。 ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣ
ＸＧＡＹＡＡＹＡＡＲＴＴＹＡＡＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲ
ＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴＴＹＴＡＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣ
ＡＹＪＪＪＣＣＸへへＹＪＪＪへへＹＧへＲＧＡＲＣＡ
ＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＹＡＴＹＣＡＲＬＬＬＪＪＪ
ＡＡＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣＸＡ
ＡＹＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧＡＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲＪＪ
ＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴＧＹ
ＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴにこで、Ａ；アデニン、Ｇ；グア
ニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン、Ｒ、Ａ／Ｇ、Ｙ 、
Ｃ／Ｔ、Ｚ ｉ Ａ／Ｃ／Ｔ。
Ｘ ； Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、 Ｊ Ｊ Ｊ ； Ｌ ｅ
ｕに対応するコドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコド
ンを意味する。
ｕに対応するコドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコド
ンを意味する。
本発明の、プロティンＡ様物質の活性部分（ＩｇＧのＦ
ｃ−結合能力を有する部分）の遺伝子を組み込んだ組み
換えプラスミドを用いてプロティンＡ様物質を製造する
方法は、下記の工程、（ａ）該プロティンＡ様物質の遺
伝子を化学合成すること、（ｂ）該プロティンＡ様物質
の遺伝子を組み込むためのプラスミドベクターを構築す
ること、（Ｃ）該プロティンＡ様物質の遺伝子と該プラ
スミドベクターとを連結して組み換えプラスミドを構築
すること、（ｄ）該組み換えプラスミドを用いて宿主細
胞を形質転換すること、（ｅ）得られた形質転換体を栄
養媒体中で培養して、培養物中にプロティンＡ様物質を
含む蛋白を生成させること、を包含する。前記工程（ｅ
）の後にさらに以下の工程、（ｆ）産生されたプロティ
ンＡ様物質を含む該蛋白を採取２分解し９分解物からプ
ロティンＡ様物質を分離精製すること。
ｃ−結合能力を有する部分）の遺伝子を組み込んだ組み
換えプラスミドを用いてプロティンＡ様物質を製造する
方法は、下記の工程、（ａ）該プロティンＡ様物質の遺
伝子を化学合成すること、（ｂ）該プロティンＡ様物質
の遺伝子を組み込むためのプラスミドベクターを構築す
ること、（Ｃ）該プロティンＡ様物質の遺伝子と該プラ
スミドベクターとを連結して組み換えプラスミドを構築
すること、（ｄ）該組み換えプラスミドを用いて宿主細
胞を形質転換すること、（ｅ）得られた形質転換体を栄
養媒体中で培養して、培養物中にプロティンＡ様物質を
含む蛋白を生成させること、を包含する。前記工程（ｅ
）の後にさらに以下の工程、（ｆ）産生されたプロティ
ンＡ様物質を含む該蛋白を採取２分解し９分解物からプ
ロティンＡ様物質を分離精製すること。
を包含する。前記プロティンＡ様物質の遺伝子が。
プロティンＡ様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−結合能
力を有する部分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸に
システィンを付加せしめたことを特徴とする。前記プロ
ティンＡ様物質の遺伝子が１次のポリアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有する。ＡｏＮＫｐｏｎｑ
ＮＡｐｙＥＴｔ、ｒ＋ｔｐＮｕＥＥｑＲＮｃＦｘｑｓｔ
。
力を有する部分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸に
システィンを付加せしめたことを特徴とする。前記プロ
ティンＡ様物質の遺伝子が１次のポリアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有する。ＡｏＮＫｐｏｎｑ
ＮＡｐｙＥＴｔ、ｒ＋ｔｐＮｕＥＥｑＲＮｃＦｘｑｓｔ
。
ＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤ八〇八ＰＫに
こで、Ａ；アラニン、Ｃへシへティン、Ｄ；アスパラギ
ン酸、Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；
グリシン、Ｈ；ヒスチジン、１；イソロイシン、に；リ
ジン、Ｌ；ロイシン、 Ｍ ；メチオニン、Ｎ；アスパ
ラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニ
ン、Ｓ；セリン、Ｙ；チロシンヲ、ｔ 味する。前記プ
ロティンＡ様物質の遺伝子が１次のヌクレオチド配列を
有する。八ＡＴＴＣＡＴＧＧＣＸＧＡＹＡＡＹＡＡ１？
ＴＴＹＡＡＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴ
ＴＹＴＡＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡ
ＹＪＪＪＡＡＹＧＡＲＧＡＲＣＡＲＣＧＸへへＹ Ｇ
Ｇ Ｘ Ｔ Ｔ Ｙ Ａ Ｔ Ｙ ＣＡ ＲＬ Ｌ Ｌ
ＪＪＪＡＡ ＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬＬＬＣＡＲＬＬＬ
ＧＣＸＡＡＹＪＪ、ＩＪＪＪＧＣＸＧＡｌ？ＧｃＸＡＡ
ＲＡＡＲＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲＧＣＸＣＣＸ
ＡＡＲＴＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴにこで、Ａ；アデニ
ン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン、Ｒ、Ａ
／Ｇ、Ｙ ｉ Ｃ／Ｔ。
こで、Ａ；アラニン、Ｃへシへティン、Ｄ；アスパラギ
ン酸、Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；
グリシン、Ｈ；ヒスチジン、１；イソロイシン、に；リ
ジン、Ｌ；ロイシン、 Ｍ ；メチオニン、Ｎ；アスパ
ラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニ
ン、Ｓ；セリン、Ｙ；チロシンヲ、ｔ 味する。前記プ
ロティンＡ様物質の遺伝子が１次のヌクレオチド配列を
有する。八ＡＴＴＣＡＴＧＧＣＸＧＡＹＡＡＹＡＡ１？
ＴＴＹＡＡＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴ
ＴＹＴＡＹＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡ
ＹＪＪＪＡＡＹＧＡＲＧＡＲＣＡＲＣＧＸへへＹ Ｇ
Ｇ Ｘ Ｔ Ｔ Ｙ Ａ Ｔ Ｙ ＣＡ ＲＬ Ｌ Ｌ
ＪＪＪＡＡ ＲＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬＬＬＣＡＲＬＬＬ
ＧＣＸＡＡＹＪＪ、ＩＪＪＪＧＣＸＧＡｌ？ＧｃＸＡＡ
ＲＡＡＲＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡＲＧＣＸＣＣＸ
ＡＡＲＴＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴにこで、Ａ；アデニ
ン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミン、Ｒ、Ａ
／Ｇ、Ｙ ｉ Ｃ／Ｔ。
Ｚ ； Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｘ ； Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、Ｊ Ｊ
Ｊ ；Ｌｅｕに対応するコドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対
応するコドンを意味する。前記プロティンＡ様物質の遺
伝子を組み込むための前記プラスミドベクターが、
ｐＢＲ３２２ＤＮＡとλｐｌａｃ５ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで分解して得た消化物を連結して構築したプラ
スミドにおいて、２つのＥｃｏＲＩ切断部位のうち１つ
を除去したものであり、該λｐｌａｃ５ＤＮへのラクト
ースオペロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダー
ゼ領域を含有し、かつ該プロモーターと該β−ガラクト
シダーゼ領域の方向性が望ましいものである。前記宿主
細胞が細菌類、酵母およびその他の真菌類、ヒトおよび
その他の動物の培養細胞または植物の培養細胞である。
Ｊ ；Ｌｅｕに対応するコドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対
応するコドンを意味する。前記プロティンＡ様物質の遺
伝子を組み込むための前記プラスミドベクターが、
ｐＢＲ３２２ＤＮＡとλｐｌａｃ５ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで分解して得た消化物を連結して構築したプラ
スミドにおいて、２つのＥｃｏＲＩ切断部位のうち１つ
を除去したものであり、該λｐｌａｃ５ＤＮへのラクト
ースオペロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダー
ゼ領域を含有し、かつ該プロモーターと該β−ガラクト
シダーゼ領域の方向性が望ましいものである。前記宿主
細胞が細菌類、酵母およびその他の真菌類、ヒトおよび
その他の動物の培養細胞または植物の培養細胞である。
前記宿主細胞がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ＞ 、
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属す
る種である。前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｈｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する閑株である。
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属す
る種である。前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｈｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する閑株である。
前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉ−
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ−１２株ＩＩ ８１０１であ
る。前記形質転換体が、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈ
ｅｒ ｉ −ｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ１２５ＰＡ−Ｆ
ｃである。
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ−１２株ＩＩ ８１０１であ
る。前記形質転換体が、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈ
ｅｒ ｉ −ｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ１２５ＰＡ−Ｆ
ｃである。
以下に上記工程の順に本発明の詳細な説明する。
レオチド配列の設計
本発明のプロティンＡ様物質のＦｃ結合活性を有する領
域は次のアミノ酸配列で代表される。
域は次のアミノ酸配列で代表される。
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＩＩＬＰＮＬＮＥ
ＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥΔに
ＫＬＮＤ八口ＡへＫ ここで。
ＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥΔに
ＫＬＮＤ八口ＡへＫ ここで。
Ａ；アラニン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸
、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシン。
、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシン。
Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、に；リジン。
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｙ；チロシンを意味スる。
；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｙ；チロシンを意味スる。
この配列はプロティンＡにおけるＩｇＧのＦｃ結合領域
の代表的な配列の１つであり２本発明は必ずしもこの配
列に限定されるものではなく、同様の活性を有する類似
の配列をも含むことは勿論のことである。
の代表的な配列の１つであり２本発明は必ずしもこの配
列に限定されるものではなく、同様の活性を有する類似
の配列をも含むことは勿論のことである。
ここで、プロティンＡ様物質の遺伝子を組み込んだ組み
換えプラスミドにより形質転換された菌株を培養すると
、プロティンＡ様物質は培養物中に雑種蛋白として発現
する。この雑種蛋白からプロティンＡ様物質を分離する
ためには、プロティンＡ様物質がメチオニンを含有しな
いポリペプチドであることを利用して２例えばシアノゲ
ンブロマイド（ＣＮＢｒ）処理により分離できるように
上記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニン（Ｍ）を付加す
るのが好ましい。
換えプラスミドにより形質転換された菌株を培養すると
、プロティンＡ様物質は培養物中に雑種蛋白として発現
する。この雑種蛋白からプロティンＡ様物質を分離する
ためには、プロティンＡ様物質がメチオニンを含有しな
いポリペプチドであることを利用して２例えばシアノゲ
ンブロマイド（ＣＮＢｒ）処理により分離できるように
上記アミノ酸配列のＮ末端にメチオニン（Ｍ）を付加す
るのが好ましい。
また、プロティンＡ様物質を固相担体等に結合して用い
る際、穏和な条件で結合せしめ易くするため、 Ｆｃ結
合活性部位以外の場所に１例えばＮ末端部またはＣ末端
部にシスティン（Ｃ）のような活性水素をもつアミノ酸
を付与しておくのが好ましい。なぜなら、プロティンＡ
のＦｃ結合領域にはシスティンが含まれないため、シス
ティンを新たに付加しても分子内架橋を生じず、その立
体構造には影響を及ぼさないと推定されるからである。
る際、穏和な条件で結合せしめ易くするため、 Ｆｃ結
合活性部位以外の場所に１例えばＮ末端部またはＣ末端
部にシスティン（Ｃ）のような活性水素をもつアミノ酸
を付与しておくのが好ましい。なぜなら、プロティンＡ
のＦｃ結合領域にはシスティンが含まれないため、シス
ティンを新たに付加しても分子内架橋を生じず、その立
体構造には影響を及ぼさないと推定されるからである。
したがって１本発明のプロティンＡ様物質の活性部分の
アミノ酸配列としては次のようなものを設計した。
アミノ酸配列としては次のようなものを設計した。
ＭＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＩＩＬＰＮＬＮ
ＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡ
ＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫに のようなアミノ酸の配列に対応するデオキシリホヌクレ
オチドのトリプレットコドンとしては。
ＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡ
ＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫに のようなアミノ酸の配列に対応するデオキシリホヌクレ
オチドのトリプレットコドンとしては。
宿主となる微生物が好むコドンが望ましいことは言うま
でもないが、特にそれに限定されない。このデオキシリ
ボヌクレオチド配列の特徴としては。
でもないが、特にそれに限定されない。このデオキシリ
ボヌクレオチド配列の特徴としては。
５゛末端部にメチオニンのコドン（ＡＴＧ）が、３゛末
端部にシスティンのコドン（ＴＧＹ）が付加されている
ことである。次いで、３゛末端に転写終止コドン（Ｔへ
へおよび／あるいはＴＡＧ）をイ寸カロする。
端部にシスティンのコドン（ＴＧＹ）が付加されている
ことである。次いで、３゛末端に転写終止コドン（Ｔへ
へおよび／あるいはＴＡＧ）をイ寸カロする。
さらに、このようにして得られたプロティンＡ様物質の
遺伝子をプラスミドヘクターに組み込めるように、ヌク
レオチド配列の５“末端（上記メチオニンのコドンのさ
らに上流側）および３゛末端（上記転写終止コドンのさ
らに下流側）に制限酵素の認識部位を形成せしめる。例
えば５′側に八ＡＴＴＣのようなＥｃｏＲＩの認識部位
を、また３゛側にはＣＣＴＡＧのようなりａｍｌｌｌの
認識部位を付加する。
遺伝子をプラスミドヘクターに組み込めるように、ヌク
レオチド配列の５“末端（上記メチオニンのコドンのさ
らに上流側）および３゛末端（上記転写終止コドンのさ
らに下流側）に制限酵素の認識部位を形成せしめる。例
えば５′側に八ＡＴＴＣのようなＥｃｏＲＩの認識部位
を、また３゛側にはＣＣＴＡＧのようなりａｍｌｌｌの
認識部位を付加する。
したがって１本発明のプロティンＡ様物質の活性部分の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列としては次
のようなものを設計した。
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列としては次
のようなものを設計した。
ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＸＧＡＹＡＡＹＡＡＲＴＴＹＡＡ
ＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴＴＹＴＡＹ
ＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡＹＪＪＪ＾
へＹＧＡＲＧＡＲＣＡＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＴＡＴ
ＹＣＡＲＬＬＬＪＪＪＡＡＩＩＩＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬ
ＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣＸＡＡＹＪＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧ
ＡＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡ
ＲＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴにこ
で。
ＹＡＡＲＧＡＲＣＡＲＣＡＲＡＡＹＧＣＸＴＴＹＴＡＹ
ＧＡＲＡＴＺＪＪＪＣＡＹＪＪＪＣＣＸＡＡＹＪＪＪ＾
へＹＧＡＲＧＡＲＣＡＲＣＧＸＡＡＹＧＧＸＴＴＴＡＴ
ＹＣＡＲＬＬＬＪＪＪＡＡＩＩＩＧＡＹＧＡＹＣＣＸＬ
ＬＬＣＡＲＬＬＬＧＣＸＡＡＹＪＪＪＪＪＪＪＧＣＸＧ
ＡＲＧＣＸＡＡＲＡＡＲＪＪＪＡＡＴＧＡＸＧＣＸＣＡ
ＲＧＣＸＣＣＸＡＡＲＴＧＹＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴにこ
で。
Ａ：アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン５Ｔ；チミ
ン、Ｒ；Ａ／Ｇ、Ｙ；Ｃ／Ｔ、Ｚ；Ａ／Ｃ／Ｔ、 Ｘ
； Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、 Ｊ Ｊ Ｊ ； Ｌ ｅ ｕに
対応するコドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコドンを意
味する。
ン、Ｒ；Ａ／Ｇ、Ｙ；Ｃ／Ｔ、Ｚ；Ａ／Ｃ／Ｔ、 Ｘ
； Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ、 Ｊ Ｊ Ｊ ； Ｌ ｅ ｕに
対応するコドン、ＬＬＬ；Ｓｅｒに対応するコドンを意
味する。
（以下余白）
−１ユ迂Ａ］勺箇Ｖ別πｑｎ」計色耶分９ｊ、Ｌ（ｋ五
α化学合成 」二記のように設計されたポリヌクレオチドを合成する
にあたり、まず第１図に示したような、上方ストランド
１３本および下方ストランド１２本の計２５本のオリゴ
ヌクレオチドを文献上公知の方法（固相法）により合成
した。ここでオリゴヌクレオチドの大きさは、精製が容
易な様に一般に１０−２０数量体程度の大きさで合成し
た。また各オリゴマーは１次のような注意を払って設計
した。
α化学合成 」二記のように設計されたポリヌクレオチドを合成する
にあたり、まず第１図に示したような、上方ストランド
１３本および下方ストランド１２本の計２５本のオリゴ
ヌクレオチドを文献上公知の方法（固相法）により合成
した。ここでオリゴヌクレオチドの大きさは、精製が容
易な様に一般に１０−２０数量体程度の大きさで合成し
た。また各オリゴマーは１次のような注意を払って設計
した。
Ａ）宿主としてエセリシア・コリーを想定して。
エセリシア・コリーのコドン使用表から最も使用頻度の
高いコドンを優先して用いた。
高いコドンを優先して用いた。
Ｂ）合成の際、３゛末端がＡ（アデニン）の場合にはデ
ブリネーションが生じ易いので、３゛末端はなるべくＡ
以外となる様にした。
ブリネーションが生じ易いので、３゛末端はなるべくＡ
以外となる様にした。
Ｃ）オリゴマーを結合するときに望ましくない結合が起
こらない様に、充分にコンピューター解析による配列分
析をおこなった。
こらない様に、充分にコンピューター解析による配列分
析をおこなった。
このようにして合成されたオリゴヌクレオチドの各断片
についてその塩基配列を確認し１次いで第２図に示した
ように、各断片をプロティンＡ様物質の活性部分の塩基
配列に従って、リガーゼを用いて結合させ、２本鎖を形
成させることにより。
についてその塩基配列を確認し１次いで第２図に示した
ように、各断片をプロティンＡ様物質の活性部分の塩基
配列に従って、リガーゼを用いて結合させ、２本鎖を形
成させることにより。
本発明のプロティンＡ様物質のＩｇＧ結合部分の遺伝子
を化学合成することができた。
を化学合成することができた。
則み換えプラスミドの構築
本発明の組み換えプラスミドは、前記の方法で化学合成
されたプロティンＡ様物質の遺伝子を。
されたプロティンＡ様物質の遺伝子を。
λｐｌａｃ５ Ｄ Ｎ Ａラクトースオペロンのプロモ
ーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプラス
ミドベクターに導入して得られる。
ーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプラス
ミドベクターに導入して得られる。
まずプロティンＡ様物質の遺伝子を組み込むためのプラ
スミドベクターを次のようにして構築した。
スミドベクターを次のようにして構築した。
ｐＢＲ３２２Ｄ Ｎ Ａとλｐｌａｃ５ＤＮＡの各々を
制限酵素で分解し、得られた消化物をライゲーション反
応により連結する。制限酵素としては例えばＥｃｏＲＩ
を用いるのがよく、また、ライゲーション反応に使用す
る酵素としてはＴ、ＤＮＡリガーゼが好ましい。このよ
うにして得られたプラスミドＤＮＡを用いてエセリシア
・コリーに形質転換する。好ましい株は１例えばに−１
２株 ＨＢ １０１である。次いで。
制限酵素で分解し、得られた消化物をライゲーション反
応により連結する。制限酵素としては例えばＥｃｏＲＩ
を用いるのがよく、また、ライゲーション反応に使用す
る酵素としてはＴ、ＤＮＡリガーゼが好ましい。このよ
うにして得られたプラスミドＤＮＡを用いてエセリシア
・コリーに形質転換する。好ましい株は１例えばに−１
２株 ＨＢ １０１である。次いで。
形質転換体からプラスミドを分離し、 ＨｉｎｄＩＩＩ
により消化した後、アガロースゲル電気泳動法でプロモ
ーター、β−ガラクトシダーゼ領域の方向性を調べ２望
ましい方向性を有するプラスミドを選別する。
により消化した後、アガロースゲル電気泳動法でプロモ
ーター、β−ガラクトシダーゼ領域の方向性を調べ２望
ましい方向性を有するプラスミドを選別する。
このプラスミドにはＥｃｏＲＩにより切断される部位が
２ケ所あるので、そのうちβ−ガラクトシダーゼプロモ
ーターに近い部位を除去する。そのためには、プラスミ
ドをＥｃｏＲＩで部分消化し、消化物からアガロースゲ
ル電気泳動法で目的とするＤＮＡ断片を分離する。この
断片は末端にＩＥｃｏＲ［による切断によって生した１
本鎖部分を有するので。
２ケ所あるので、そのうちβ−ガラクトシダーゼプロモ
ーターに近い部位を除去する。そのためには、プラスミ
ドをＥｃｏＲＩで部分消化し、消化物からアガロースゲ
ル電気泳動法で目的とするＤＮＡ断片を分離する。この
断片は末端にＩＥｃｏＲ［による切断によって生した１
本鎖部分を有するので。
これにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させてその１本鎖
部分を２本鎖として平滑末端を作り２次いでＴ、ＤＮＡ
リガーゼを作用させて閉環し、 ＥｃｏＲ［による切断
部位が１ケ所のプラスミドを得る。このプラスミドを用
いて前記のようにエセリシア・コリーに形質転換し、テ
トラサイクリン耐性株を選び、その株のコロニーからプ
ラスミ）” Ｄ Ｎ Ａを分離し、 ＥｃｏＲＩ と１
ｌｉｎｄＩＩＩで消化し、生成するＤＮＡ断片の大きさ
をアガロースゲル電気泳動法で調べて、２ケ所あったＥ
ｃｏＲＩ切断部位のどちらが消失しているかを決定し、
所望の１ケ所、すなわちβ−ガラクトシダーゼプロモー
ターに近い切断部位が消失したプラスミドを選択する。
部分を２本鎖として平滑末端を作り２次いでＴ、ＤＮＡ
リガーゼを作用させて閉環し、 ＥｃｏＲ［による切断
部位が１ケ所のプラスミドを得る。このプラスミドを用
いて前記のようにエセリシア・コリーに形質転換し、テ
トラサイクリン耐性株を選び、その株のコロニーからプ
ラスミ）” Ｄ Ｎ Ａを分離し、 ＥｃｏＲＩ と１
ｌｉｎｄＩＩＩで消化し、生成するＤＮＡ断片の大きさ
をアガロースゲル電気泳動法で調べて、２ケ所あったＥ
ｃｏＲＩ切断部位のどちらが消失しているかを決定し、
所望の１ケ所、すなわちβ−ガラクトシダーゼプロモー
ターに近い切断部位が消失したプラスミドを選択する。
このようにして得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ とＢ
ａｍ ＩＩＩとで完全に消化し、アガロースゲル電気泳
動法で大きい方のＤＮＡ断片を分取して１本発明のプロ
ティンＡ様物質の遺伝子を組み込むためのプラスミドベ
クターとする。
ａｍ ＩＩＩとで完全に消化し、アガロースゲル電気泳
動法で大きい方のＤＮＡ断片を分取して１本発明のプロ
ティンＡ様物質の遺伝子を組み込むためのプラスミドベ
クターとする。
次に、前記の方法で化学合成されたプロティンＡ様物質
の遺伝子を、このプラスミドベクターにライゲーション
反応により結合して組み込ませることにより２本発明の
組み換えプラスミドを構築した。ライゲーション反応は
、Ｔ、ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを用いて行うのが好
ましい。
の遺伝子を、このプラスミドベクターにライゲーション
反応により結合して組み込ませることにより２本発明の
組み換えプラスミドを構築した。ライゲーション反応は
、Ｔ、ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを用いて行うのが好
ましい。
組み換えプラスミドによる。宿主細胞の形質転換本発明
の形質転換体は、前記の方法で構築された、プロテイン
Ａ様物質の活性部分の遺伝子が組み込まれた組み換えプ
ラスミドを２例えばエセリシア・コリーに一１２株ＨＢ
ＩＯＩのようなエセリシア属の菌株を宿主として形質転
換して得られる。宿主細胞としては特にエセリシア属の
菌株に限定されず１例えばバチルス属やシュードモナス
属の菌株、酵母およびその他の真菌類、ヒトおよびその
他の動物の培養細胞あるいは植物の培養細胞を宿主とし
てもよい。
の形質転換体は、前記の方法で構築された、プロテイン
Ａ様物質の活性部分の遺伝子が組み込まれた組み換えプ
ラスミドを２例えばエセリシア・コリーに一１２株ＨＢ
ＩＯＩのようなエセリシア属の菌株を宿主として形質転
換して得られる。宿主細胞としては特にエセリシア属の
菌株に限定されず１例えばバチルス属やシュードモナス
属の菌株、酵母およびその他の真菌類、ヒトおよびその
他の動物の培養細胞あるいは植物の培養細胞を宿主とし
てもよい。
まず２本発明の組み換えプラスミドを、あらかじめＣａ
Ｃ１ｚ処理したエセリシア・コリーへ入れる。
Ｃ１ｚ処理したエセリシア・コリーへ入れる。
ここで１本発明の組み換えプラスミドにおいてはそのテ
トラサイクリン耐性遺伝子中にプロティンＡ様物質の遺
伝子が組み込まれているため、このプラスミドで形質転
換された菌株は、テトラサイクリン感受性（Ｔｃ” ）
となる。但し、アンピシリン耐性遺伝子は外来遺伝子に
より分割されていないので、形質転換株はアンピシリン
耐性（Ａｐ’ ）である。従って、プロティンＡ様物質
の活性部分の遺伝子を発現する形質転換株を、アンピシ
リン含有培地１次いでテトラサイクリン含有培地を用い
てスクリーニングし、Ａｐ ｒでかつＴｃ’のコロニー
を選択する。これらのコロニーを幾つか任意に選んでそ
れらから得られたプラスミ）” Ｄ Ｎ ＡをεｃｏＲ
ｒとＢａｍ旧とで消化し、生成したＤＮＡ断片の大きさ
と塩基配列を調べ、試験した全てについてプロティンＡ
様物質の遺伝子に一致することを確認した。そして得ら
れた形質転換株はエセリシア・コ本発明の形質転換株を
培養すればプロティンＡ様物質が菌体内に生成する。し
かしながら、プロティンＡ様物質はその遺伝子がβ−ガ
ラクトシダーゼの構造遺伝子内に挿入されているために
、プロティンＡ様物質はβ−ガラクトシダーゼとの雑種
蛋白として発現する。ここで９本発明のプロティンＡ様
物質のＩｇＧ結合部分のヌクレオチド配列は５”末端に
メチオニンのコドン（ＡＴＧ ）が付加されているため
２発現されたプロティンＡ様物質のＩｇＧ結合部分のＮ
末端にはメチオニンが挿入されており、従ってこの雑種
蛋白を９例えばシアノゲンブロマイド（ＣＮＢ、 ）で
処理してプロティンＡ様物質を分離できる。すなわち本
発明の形質転換株を１例えばアンピシリンを答有するし
一ブロス中で培養し、培養物から遠心分離された菌体に
シアノゲンブロマイドを作用させ１反応液の凍結乾燥物
をＩｇＧ固定化アフィニティ力ラムで精製することによ
りプロティンＡ様物質を分離精製することが出来る。
トラサイクリン耐性遺伝子中にプロティンＡ様物質の遺
伝子が組み込まれているため、このプラスミドで形質転
換された菌株は、テトラサイクリン感受性（Ｔｃ” ）
となる。但し、アンピシリン耐性遺伝子は外来遺伝子に
より分割されていないので、形質転換株はアンピシリン
耐性（Ａｐ’ ）である。従って、プロティンＡ様物質
の活性部分の遺伝子を発現する形質転換株を、アンピシ
リン含有培地１次いでテトラサイクリン含有培地を用い
てスクリーニングし、Ａｐ ｒでかつＴｃ’のコロニー
を選択する。これらのコロニーを幾つか任意に選んでそ
れらから得られたプラスミ）” Ｄ Ｎ ＡをεｃｏＲ
ｒとＢａｍ旧とで消化し、生成したＤＮＡ断片の大きさ
と塩基配列を調べ、試験した全てについてプロティンＡ
様物質の遺伝子に一致することを確認した。そして得ら
れた形質転換株はエセリシア・コ本発明の形質転換株を
培養すればプロティンＡ様物質が菌体内に生成する。し
かしながら、プロティンＡ様物質はその遺伝子がβ−ガ
ラクトシダーゼの構造遺伝子内に挿入されているために
、プロティンＡ様物質はβ−ガラクトシダーゼとの雑種
蛋白として発現する。ここで９本発明のプロティンＡ様
物質のＩｇＧ結合部分のヌクレオチド配列は５”末端に
メチオニンのコドン（ＡＴＧ ）が付加されているため
２発現されたプロティンＡ様物質のＩｇＧ結合部分のＮ
末端にはメチオニンが挿入されており、従ってこの雑種
蛋白を９例えばシアノゲンブロマイド（ＣＮＢ、 ）で
処理してプロティンＡ様物質を分離できる。すなわち本
発明の形質転換株を１例えばアンピシリンを答有するし
一ブロス中で培養し、培養物から遠心分離された菌体に
シアノゲンブロマイドを作用させ１反応液の凍結乾燥物
をＩｇＧ固定化アフィニティ力ラムで精製することによ
りプロティンＡ様物質を分離精製することが出来る。
により分子量は約７．０００であること、マウスの血清
中のＩｇＧ結合能力、アミノ酸組成の分析、およびアミ
ノ酸配列の解析において、全て理論値と一致するデータ
を示し、またその収率は細胞−個当たり３Ｘ１０５分子
生成しており、従来遺伝子工学的方法の分野で報告され
ているものに比べて格段に優れている。
中のＩｇＧ結合能力、アミノ酸組成の分析、およびアミ
ノ酸配列の解析において、全て理論値と一致するデータ
を示し、またその収率は細胞−個当たり３Ｘ１０５分子
生成しており、従来遺伝子工学的方法の分野で報告され
ているものに比べて格段に優れている。
本発明の方法で得られるプロティンＡ様物質は。
そのアミノ酸配列のＮ末端側あるいはＣ末端側にシステ
ィンが挿入されているため、そのチオール基の反応性を
利用して温和かつ容易な条件で担体に固定化できる。更
に、チオール基の交換反応を利用する事により、カラム
の再生も容易であり。
ィンが挿入されているため、そのチオール基の反応性を
利用して温和かつ容易な条件で担体に固定化できる。更
に、チオール基の交換反応を利用する事により、カラム
の再生も容易であり。
大きなメリットを有する。
またチオール基を利用して担体に固定した場合（実施例
１１）と比べ、シアノゲンブロマイドで活性化された担
体に、チオール基以外の基１例えば。
１１）と比べ、シアノゲンブロマイドで活性化された担
体に、チオール基以外の基１例えば。
リジンのアミノ基などを用いて結合せしめた場合（実施
例１２）にはプロティンＡ様物質のＩｇＧ結合活性は大
幅に低下することも判明した。
例１２）にはプロティンＡ様物質のＩｇＧ結合活性は大
幅に低下することも判明した。
以上から９本発明によれば、従来のプロティンＡ製品よ
りも高いＩｇＧ結合活性を有する状態で担体に安定に固
定することが可能なプロティンＡ様物質を効率よく製造
することができる。
りも高いＩｇＧ結合活性を有する状態で担体に安定に固
定することが可能なプロティンＡ様物質を効率よく製造
することができる。
（実施例）
実施例１ニブロチインＡ箕物質の遺伝子断片の化学金戊
各断片が第１図に示したような塩基配列を有する２５本
（上方ストランド１３本（［１−０１３） 、下方スト
ランド１２本（Ｌｌ−Ｌｌ２） ）よりなる各オリゴヌ
クレオチドは、固相法により合成した。縮合方法として
は、トリエステル法又はホスファイト法どちらで行われ
てもよいが、今回はトリエステル法によりおこなった。
（上方ストランド１３本（［１−０１３） 、下方スト
ランド１２本（Ｌｌ−Ｌｌ２） ）よりなる各オリゴヌ
クレオチドは、固相法により合成した。縮合方法として
は、トリエステル法又はホスファイト法どちらで行われ
てもよいが、今回はトリエステル法によりおこなった。
固相法の担体としては、１％ジビニルベンゼンを含むポ
リスチレン樹脂（Ｍｉｙｏｓｈｉに、 ｅｔ ａｌ、。
リスチレン樹脂（Ｍｉｙｏｓｈｉに、 ｅｔ ａｌ、。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ８，５５０７
（１９８０） ）或いはシリカゲル（Ｍａｔｔｅｕｃｃ
ｉ Ｍ、Ｄ、、 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ、Ｈ，、Ｊ
、Ａ＋＊。
（１９８０） ）或いはシリカゲル（Ｍａｔｔｅｕｃｃ
ｉ Ｍ、Ｄ、、 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ、Ｈ，、Ｊ
、Ａ＋＊。
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３．３１８５（１９８１）
）が好ましい。
）が好ましい。
４種類のデオキシヌクレオシド、すなわち、デオキシシ
チジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チ
ミジンを、常法によりそれぞれ３°−コハク酸エステル
とする（Ｂｒｏｋａ Ｃ，ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕ−ｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ８．５４６１ （１９
８０） ） 、これを前記担体のアミノ基と結合したも
の（ヌクレオシド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの
３“末端に用いる。次いで２ これらの３′末端ヌクレ
オシド担体に３種々の組合せのジヌクレオチドを、縮合
剤を用いて順次５″方向に結合させる。縮合剤としては
、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（Ｍ
ＳＮＴ）、２，４．６−１−リイソプロビルヘンゼンス
ルホニル−３−ニトロトリアゾリド（ＴＰＳＮＴ）、メ
シチチレンスルホニルーテトラゾリド（ＭＳＴｅ）、２
，４．６−トリイソプロビルベンゼンスルホニルーテト
ラゾリド（ＴＰＳＴｅ）等が適当である。
チジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チ
ミジンを、常法によりそれぞれ３°−コハク酸エステル
とする（Ｂｒｏｋａ Ｃ，ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕ−ｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ８．５４６１ （１９
８０） ） 、これを前記担体のアミノ基と結合したも
の（ヌクレオシド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの
３“末端に用いる。次いで２ これらの３′末端ヌクレ
オシド担体に３種々の組合せのジヌクレオチドを、縮合
剤を用いて順次５″方向に結合させる。縮合剤としては
、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（Ｍ
ＳＮＴ）、２，４．６−１−リイソプロビルヘンゼンス
ルホニル−３−ニトロトリアゾリド（ＴＰＳＮＴ）、メ
シチチレンスルホニルーテトラゾリド（ＭＳＴｅ）、２
，４．６−トリイソプロビルベンゼンスルホニルーテト
ラゾリド（ＴＰＳＴｅ）等が適当である。
上記ジヌクレオチドは、４種類のヌクレオシドの順列に
より１６種類が必要であるが、その合成法は２例えば第
３図に示す方法によることができる。
より１６種類が必要であるが、その合成法は２例えば第
３図に示す方法によることができる。
１第３図において、ＤＭＴｒは＜’ 、 ４゛−’、
；メトキシトリチル基を示す。ＢおよびＢ′は６−Ｎ−
ベンゾイルアデニン−９−イル基、４−Ｎ−ベンゾイル
シトシン−１−イル基、２−Ｎ−イソ−ブチリルグアニ
ン−９−イル基、チミン−１−イル基から選ばれ、同一
または異なってもよい。ＭＳＮＴはメシチレンスルホニ
ル−３−ニトロトリアゾリドを示す。
；メトキシトリチル基を示す。ＢおよびＢ′は６−Ｎ−
ベンゾイルアデニン−９−イル基、４−Ｎ−ベンゾイル
シトシン−１−イル基、２−Ｎ−イソ−ブチリルグアニ
ン−９−イル基、チミン−１−イル基から選ばれ、同一
または異なってもよい。ＭＳＮＴはメシチレンスルホニ
ル−３−ニトロトリアゾリドを示す。
得られた３′末端ヌクレオシド７８体と各種ジヌクレオ
チドを出発物質として、前記オリゴヌクレオチドを合成
するが、ここでは、オリゴヌクレオチドＬｌ １ （５
’ ＣＴＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＧＴＴ３
’ ）−の場合を例にして具体的に述べる。
チドを出発物質として、前記オリゴヌクレオチドを合成
するが、ここでは、オリゴヌクレオチドＬｌ １ （５
’ ＣＴＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＧＴＴ３
’ ）−の場合を例にして具体的に述べる。
デオキシシチジン爪体く前記ポリスチレン樹脂に担持し
たもの）をピリジン中室温で放置後１次の操作により反
応を行う。
たもの）をピリジン中室温で放置後１次の操作により反
応を行う。
（１）デオキシシチジン担体をジクロロメタン−メタノ
ールで洗浄する。
ールで洗浄する。
（２）２％ヘンゼンスルホン酸くジクロロメタン−メタ
ノール）溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し。
ノール）溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し。
操作をくり返して発色の消えるまで行う。
（３）ピリジンで洗浄後、ジヌクレオチドのピリジン溶
液を加え、減圧溶媒留去し、さらにメシチレンスルホニ
ル−３−二トロトリアゾリド（縮合剤）のビ４リジン溶
液を加え放置した後、ピリジンで洗浄する。
液を加え、減圧溶媒留去し、さらにメシチレンスルホニ
ル−３−二トロトリアゾリド（縮合剤）のビ４リジン溶
液を加え放置した後、ピリジンで洗浄する。
（４１０，１Ｍジメチルアミノピリジン溶液および無水
酢酸を加えて放置後ピリジンにより洗浄する。
酢酸を加えて放置後ピリジンにより洗浄する。
このような操作を、各ジヌクレオチドについて順次繰り
返して１０回行なった後、樹脂を０．５Ｍトリメチルシ
リルグアニジウム−ピリジン−２−アルドオキシメート
（Ｒｅｅｒｅ Ｃ，Ｂ、 ｅｔ ａｔ、、 Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、 ２７２７ （１９７８
） ）のジオキサン−水の溶液中で振とうする。樹脂を
ピリジン−水で洗浄し。
返して１０回行なった後、樹脂を０．５Ｍトリメチルシ
リルグアニジウム−ピリジン−２−アルドオキシメート
（Ｒｅｅｒｅ Ｃ，Ｂ、 ｅｔ ａｔ、、 Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、 ２７２７ （１９７８
） ）のジオキサン−水の溶液中で振とうする。樹脂を
ピリジン−水で洗浄し。
濾液と洗液を合わせて減圧′ｅ、縮し、残渣に濃アンモ
ニア水を加え、加温する。アンモニアを留去し。
ニア水を加え、加温する。アンモニアを留去し。
Ｄｏｗｅｘ ５０などのピリジニウム型樹脂を加え、樹
脂をピリジン−水により洗浄し、濾液と洗液を合わせて
濃縮する。濃縮液に少量の水を加え酢酸エチルでオキシ
ムを抽出除去する。水層を一定贋に稀釈し、その１部を
用いてジメトキシメチルトリチル基の定量を行って全体
量を推定する。
脂をピリジン−水により洗浄し、濾液と洗液を合わせて
濃縮する。濃縮液に少量の水を加え酢酸エチルでオキシ
ムを抽出除去する。水層を一定贋に稀釈し、その１部を
用いてジメトキシメチルトリチル基の定量を行って全体
量を推定する。
次いで、水層を減圧乾固し、残渣に８０％酢酸を加えた
後、溶媒留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、ＤＥＡＥ−トヨバール（Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ）等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行な
う。
後、溶媒留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、ＤＥＡＥ−トヨバール（Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ）等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行な
う。
適当な緩衝液中、リン酸塩の濃度勾配で溶出し。
Ｕ、 Ｖ、吸収によりオリゴヌクレオチドを検出した
後、セファデックスＧ２５カラムクロマトグラフイーに
より脱塩する。Ｉ（ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ
ー：０１８シリ力ゲル担体）および−次元ホモクロマト
グラフィーで単一であることにより純度を判定する。
後、セファデックスＧ２５カラムクロマトグラフイーに
より脱塩する。Ｉ（ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ
ー：０１８シリ力ゲル担体）および−次元ホモクロマト
グラフィーで単一であることにより純度を判定する。
同様の操作を行なって、 Ｕ １−Ｕｌ３． Ｌ
１−ＬｌｏおよびＬ１２の各オリゴヌクレオチドを合成
する。
１−ＬｌｏおよびＬ１２の各オリゴヌクレオチドを合成
する。
実施例１で得られた各オリゴヌクレオチドの配列分析は
、二次元ホモクロマトグラフィーにより９基本的には、
バムパラらの方法により行なった。
、二次元ホモクロマトグラフィーにより９基本的には、
バムパラらの方法により行なった。
（Ｂａｍｂａｒａ、Ｊ、Ｅ、、ｅｔ ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋ １＋３３Ｈ
１９７４） ）例えば、オリゴヌクレオチドＬｌｌの二
次元ホモクロマトグラフィーの結果を第４図に示す。
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋ １＋３３Ｈ
１９７４） ）例えば、オリゴヌクレオチドＬｌｌの二
次元ホモクロマトグラフィーの結果を第４図に示す。
実施例３ニブロチインＡ４＋−物質の゛伝子 片の結合
実施例２で塩基配列の確認されたオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの各断片を第２図に従って。
クレオチドの各断片を第２図に従って。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて以下の方法に〜より結合さ
せた。
せた。
ＵｌおよびＬ１２以外の各断片についてその５゛−０１
１末端を各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで別々にリ
ン酸化した。
１末端を各々Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで別々にリ
ン酸化した。
ＤＮＡオリゴマ。−断片１ ｎｍｏ＋を、 Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ１単位および〔γ−”Ｐ ） ＡＴ
Ｐ（７４００Ｃ４／ｍＭ） ２０μＣｉと、全量ＬＯμ
ｌの５０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）、
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、 １０ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ ）中で３０分間３７℃で反応した。次にすべ
ての５°−０１１末端をリン酸化するために前記反応液
に５０ｎｍｏｌとなるようにＡＴＰを添加し、３７℃で
１時間さらに反応させ２次いで、９０℃で５分間加熱す
ることにより反応を停止した。リン酸化の遂行は、−次
元ホモクロマトグラフィー後、ラジオオートグラフィー
で確認した。ＵｌおよびＬ１２断片は次のライゲーショ
ン反応の過程で目的の遺伝子からの５°末端粘着部位（
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ ＩＩＩ）で２個以上結合しな
いように５’−ＯＨ末端のリン酸化は行わなかった。か
くして得られたリン酸化されたオリゴヌクレオチドＵ２
〜［１３，ＬＬ〜Ｌｌｌ。
クレオチドキナーゼ１単位および〔γ−”Ｐ ） ＡＴ
Ｐ（７４００Ｃ４／ｍＭ） ２０μＣｉと、全量ＬＯμ
ｌの５０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）、
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、 １０ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ ）中で３０分間３７℃で反応した。次にすべ
ての５°−０１１末端をリン酸化するために前記反応液
に５０ｎｍｏｌとなるようにＡＴＰを添加し、３７℃で
１時間さらに反応させ２次いで、９０℃で５分間加熱す
ることにより反応を停止した。リン酸化の遂行は、−次
元ホモクロマトグラフィー後、ラジオオートグラフィー
で確認した。ＵｌおよびＬ１２断片は次のライゲーショ
ン反応の過程で目的の遺伝子からの５°末端粘着部位（
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ ＩＩＩ）で２個以上結合しな
いように５’−ＯＨ末端のリン酸化は行わなかった。か
くして得られたリン酸化されたオリゴヌクレオチドＵ２
〜［１３，ＬＬ〜Ｌｌｌ。
およびＵｌ、、Ｌ１２を、適当な群３例えば次の様な３
群に分け、下記のライゲーション反応を行なった（第５
図）。
群に分け、下記のライゲーション反応を行なった（第５
図）。
第１群 第２群 第３群
上記条件で得られたオリゴヌクレオチド各５μｅずつ（
０，５ｎｍｏｌずつ）を加え、ライゲース緩衝液を加え
て７０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
７ｍ１１ＭｇＣ１ｚ、 １０ｍＭ ＤＴＴ、 ７０７４
Ｍ ＡＴＰに調製し、Ｔ、ＤＮＡＩ）ガーゼ２単位を用
いて、全量５０μｌとし。
０，５ｎｍｏｌずつ）を加え、ライゲース緩衝液を加え
て７０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
７ｍ１１ＭｇＣ１ｚ、 １０ｍＭ ＤＴＴ、 ７０７４
Ｍ ＡＴＰに調製し、Ｔ、ＤＮＡＩ）ガーゼ２単位を用
いて、全量５０μｌとし。
１５℃で１晩インキユベートして行なった。反応液を６
５°Ｃで５分間加熱して反応停止後、エタノールで沈澱
させ、ゲル電気泳動を行なって精製する。
５°Ｃで５分間加熱して反応停止後、エタノールで沈澱
させ、ゲル電気泳動を行なって精製する。
かくして第１群から第３群の断片を同様の方法でリガー
ゼにより結合し、プロティンＡ様物質をコードする構造
遺伝子（１９９１体ヌクレオチド）を得た。収壇は約５
０ｐｍｏ＋であり、始めの仕込量から約１０％の収率で
得られた。
ゼにより結合し、プロティンＡ様物質をコードする構造
遺伝子（１９９１体ヌクレオチド）を得た。収壇は約５
０ｐｍｏ＋であり、始めの仕込量から約１０％の収率で
得られた。
Ｘａプラスミドヘクターのが築
プロティンＡ様物質の遺伝子を組み込むための。
λｐｌａｃ５ Ｄ Ｎ Ａラクトースオペロンのプロモ
ーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプラス
ミドヘクターを以下のようにして構築した。
ーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプラス
ミドヘクターを以下のようにして構築した。
ｐＢＲ３２２Ｄ Ｎ Ａ Ｏ，５ｐ ｇとλｐｌａｃ５
ＤＮＡ１．０ μｇを各々３０μｌの１００ ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐｔ＋７．３）。
ＤＮＡ１．０ μｇを各々３０μｌの１００ ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐｔ＋７．３）。
５ｍＭ ＭｇＣ１ｚおよび５０ｍＭ ＮａＣ１溶液中で
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ ４ ＠位を用い
、３７℃で６０分間消化した。反応液を６５°Ｃで３０
分間加熱して醇素を不活性化し、各反応液に２．５倍容
量のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。各々の沈
澱をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２０ｍＭ ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）、 ＬＯｍＭ ＭｇＣ１ｚ） ２
０μρに溶解した後１各々の溶解液を混ぜ合わせＡＴＩ
’とＤＴＴをそれぞれ最終濃度０．４ ｍＭ、 １０ｍ
Ｍ！こなるように加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を用
いて、１４℃で２０時間反応した。次いで２．５倍容量
のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、得られたＤＮ
Ａ沈澱を１００ ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，３
）、 ５０ｍＭ ＮａＣ１、５ｍＭ ＭｇＣ１ｚよりな
る溶液１０２μｌに溶解したのち、その溶液１００μｌ
を菌株１（８１０１への形質転換（註）に用いた。形質
転換はテトラサイクリン１０μｇ７ｍｌを含有する聞Ｂ
−ラクトース培地（ポリペプトン８ｇ、酵母エキス１．
０ｇ、 ＮａＣｌ ５ｇ 、 ＫｚｌｌＰＯ４２，５ｇ
、 エオシン３６０ｍｇ 。
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ ４ ＠位を用い
、３７℃で６０分間消化した。反応液を６５°Ｃで３０
分間加熱して醇素を不活性化し、各反応液に２．５倍容
量のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。各々の沈
澱をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２０ｍＭ ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）、 ＬＯｍＭ ＭｇＣ１ｚ） ２
０μρに溶解した後１各々の溶解液を混ぜ合わせＡＴＩ
’とＤＴＴをそれぞれ最終濃度０．４ ｍＭ、 １０ｍ
Ｍ！こなるように加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を用
いて、１４℃で２０時間反応した。次いで２．５倍容量
のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、得られたＤＮ
Ａ沈澱を１００ ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，３
）、 ５０ｍＭ ＮａＣ１、５ｍＭ ＭｇＣ１ｚよりな
る溶液１０２μｌに溶解したのち、その溶液１００μｌ
を菌株１（８１０１への形質転換（註）に用いた。形質
転換はテトラサイクリン１０μｇ７ｍｌを含有する聞Ｂ
−ラクトース培地（ポリペプトン８ｇ、酵母エキス１．
０ｇ、 ＮａＣｌ ５ｇ 、 ＫｚｌｌＰＯ４２，５ｇ
、 エオシン３６０ｍｇ 。
メチレンブルー６０ｍｇ、 ラクトース１０ｇ、水１０
００１００Ｏ上で培養し、濃い金属色のコロニーを選び
、これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを分離し、プ
ロモーターとβ−ガラクトシダーゼ領域の方向性を調べ
た。すなわち、約０．５ μｇのプラスミドＤＮＡを１
０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）、 ５０ｍＭ
ＮａＣｌ。
００１００Ｏ上で培養し、濃い金属色のコロニーを選び
、これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを分離し、プ
ロモーターとβ−ガラクトシダーゼ領域の方向性を調べ
た。すなわち、約０．５ μｇのプラスミドＤＮＡを１
０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）、 ５０ｍＭ
ＮａＣｌ。
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚを含有する水溶液、２０μｎに溶
解し。
解し。
制限酵素１１ｉｎｄｌｌＩを５単位加えＤＮＡを消化し
た。
た。
得られたＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲル電気泳動
法で解析することによりｐＢＲ３２２プラスミドのＥｃ
ｏＲ１部位に挿入されたλｐｌａｃ５のプロモーターと
β−ガラクトシダーゼ領域の方向性を調べた。
法で解析することによりｐＢＲ３２２プラスミドのＥｃ
ｏＲ１部位に挿入されたλｐｌａｃ５のプロモーターと
β−ガラクトシダーゼ領域の方向性を調べた。
その結果、望まれる方向性すなわちβ−ガラクトシダー
ゼ領域の転写がテトラサイクリン耐性遺伝子方向へ進む
ものを以後の実験に用いた。
ゼ領域の転写がテトラサイクリン耐性遺伝子方向へ進む
ものを以後の実験に用いた。
（註）形質転換の方法
エセリシア・コリーの菌株をＬ−ブロス（ポリペプトン
１０ｇ 、酵母エキス５ｇ、 ＮａＣ１５ｇ 、グルコ
ース５ ｇ、水１０００ ｍｌ、 ｐＨ７，２） ３０
＋ｎｊ！に接種し。
１０ｇ 、酵母エキス５ｇ、 ＮａＣ１５ｇ 、グルコ
ース５ ｇ、水１０００ ｍｌ、 ｐＨ７，２） ３０
＋ｎｊ！に接種し。
３７゛Ｃで０Ｄｂｏｏ ＝０．７まで培養し、 ６．０
０Ｏｒｐｍ、１０分間Ｏ℃で遠心集菌した。菌体を０．
１Ｍ ＭｇＣ１，３０ｎ１７！に懸濁し、 ６．００Ｏ
ｒｐｍ、１０分間Ｏ℃でさらに遠心し。
０Ｏｒｐｍ、１０分間Ｏ℃で遠心集菌した。菌体を０．
１Ｍ ＭｇＣ１，３０ｎ１７！に懸濁し、 ６．００Ｏ
ｒｐｍ、１０分間Ｏ℃でさらに遠心し。
集めた菌体をＯｏＬＭ ＣａＣ１ｚ １５ ｍｌに懸濁
し水中に１時間放置した。その後、 ６０００ｒｐｍ、
１０分間０°Ｃで遠心を行い、集めた菌体を０．ＩＭ
ＣａＣ１□１゜５ｍｌに懸濁した。このＣａＣｌ２処
理菌液０．２ｎ／！に適当量のＤＮＡを加えたＥｃｏＲ
ｒ反応緩衝液（１００ｍＭ ｌ−リス−塩酸、 ５０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，５ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、 ｐＨ７，３）１
００ ＩＩ Ｒを加え、０℃で６０分間放置した。この
ＣａＣＩ ｚ処理菌体とＤＮＡを含有する混合物０．３
ｍｄを前記のｌ、−ブロス２．５ｍ１２に加え、３７℃
で、９０分分間上う培養を行なった。得られた培養物を
稀釈して選択培地上にプレコーティングし、３７°Ｃ，
１日間培養を行い形質転換コロニーを得た。
し水中に１時間放置した。その後、 ６０００ｒｐｍ、
１０分間０°Ｃで遠心を行い、集めた菌体を０．ＩＭ
ＣａＣ１□１゜５ｍｌに懸濁した。このＣａＣｌ２処
理菌液０．２ｎ／！に適当量のＤＮＡを加えたＥｃｏＲ
ｒ反応緩衝液（１００ｍＭ ｌ−リス−塩酸、 ５０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，５ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、 ｐＨ７，３）１
００ ＩＩ Ｒを加え、０℃で６０分間放置した。この
ＣａＣＩ ｚ処理菌体とＤＮＡを含有する混合物０．３
ｍｄを前記のｌ、−ブロス２．５ｍ１２に加え、３７℃
で、９０分分間上う培養を行なった。得られた培養物を
稀釈して選択培地上にプレコーティングし、３７°Ｃ，
１日間培養を行い形質転換コロニーを得た。
選択培地は、特に記載しない限り、Ｌ−ブロス栄養寒天
培地１．５％にアンピシリンおよびテトラサイクリンを
最終濃度がそれぞれ４０μｇ／ｎ／！および１０μｇ／
ｍＡとなるように加えたものを用い、アンピシリン耐性
株、テトラサイクリン耐性株を選択した。
培地１．５％にアンピシリンおよびテトラサイクリンを
最終濃度がそれぞれ４０μｇ／ｎ／！および１０μｇ／
ｍＡとなるように加えたものを用い、アンピシリン耐性
株、テトラサイクリン耐性株を選択した。
上記の方法で得られたプラスミドにはＩＥｃｏＲＩ切断
部位が２ケ所あるので、そのうちβ−ガラクトシダーゼ
プロモーターに近い部位を以下のようにして除去した。
部位が２ケ所あるので、そのうちβ−ガラクトシダーゼ
プロモーターに近い部位を以下のようにして除去した。
プラスミドＤＮＡｌ０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ １．
６単位を用いて部分消化した後２反応液を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動を用いて部分消化したＤＮＡ断片を
分離した。ＤＮＡ断片はエチジウムブロマイド（０，５
μｇ／ｍｊりで染色することにより確認した。ゲルから
目的とするＤＮＡ断片を電気泳動法で溶出し、フェノー
ルを用いてエチジウムブロマイドを抽出除去した。水相
よりエタノール沈澱法を用いて目的とするＤＮＡ断片を
沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱にＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（１００ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐｌ＋
８．８） 、 １０ｍＭＭｇＣ１ｚ、 ２５ ｍＭ
（Ｎｌ１４）ｚ ＳＯ４，ｌ０ｍＭ ＥＤＴＡ
２５．Ｏｐｇ／ｍβ牛血清アルブミン〕４０μｅを加
えて溶解させたのち、 ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、各々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつと、
１００ ｍＭβ−メルカプトエタノール５μｌを加え
た後Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ１単位を用いて、３７°Ｃ
３０分間反応させた。次いで反応液を６５℃で１０分間
加熱し、２，５倍容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈
澱させた。得られたＤＮＡ沈澱をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩
衝液（２０ｍＭ ｈリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ）４０μｍに溶解し。
６単位を用いて部分消化した後２反応液を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動を用いて部分消化したＤＮＡ断片を
分離した。ＤＮＡ断片はエチジウムブロマイド（０，５
μｇ／ｍｊりで染色することにより確認した。ゲルから
目的とするＤＮＡ断片を電気泳動法で溶出し、フェノー
ルを用いてエチジウムブロマイドを抽出除去した。水相
よりエタノール沈澱法を用いて目的とするＤＮＡ断片を
沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱にＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（１００ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐｌ＋
８．８） 、 １０ｍＭＭｇＣ１ｚ、 ２５ ｍＭ
（Ｎｌ１４）ｚ ＳＯ４，ｌ０ｍＭ ＥＤＴＡ
２５．Ｏｐｇ／ｍβ牛血清アルブミン〕４０μｅを加
えて溶解させたのち、 ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、各々４ｍＭ溶液より各々５μｌずつと、
１００ ｍＭβ−メルカプトエタノール５μｌを加え
た後Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ１単位を用いて、３７°Ｃ
３０分間反応させた。次いで反応液を６５℃で１０分間
加熱し、２，５倍容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈
澱させた。得られたＤＮＡ沈澱をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩
衝液（２０ｍＭ ｈリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ）４０μｍに溶解し。
ＡＴＰ 、 ＤＴＴを各々最終濃度０．４ ｍＭ、 １
０ｍＭ、になるよう添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位
を加え１４°Ｃで２０時間反応した。エタノールでＤＮ
Ａを沈澱さ１せた後菌株ＨＢ １０１への形質転換に用
いた。テトラサイクリン１０μｇ／ｍｆｆを加えた栄養
寒天培地で培養してテトラサイクリン耐性コロニーを選
択した。
０ｍＭ、になるよう添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位
を加え１４°Ｃで２０時間反応した。エタノールでＤＮ
Ａを沈澱さ１せた後菌株ＨＢ １０１への形質転換に用
いた。テトラサイクリン１０μｇ／ｍｆｆを加えた栄養
寒天培地で培養してテトラサイクリン耐性コロニーを選
択した。
出現したコロニーからプラスミドＤＮＡを分離し。
制限酵素ＥｃｏＲｆ と旧ｎｄｌｌｌで消化した後、得
られたＤＮＡ断片の大きさをアガロースゲル電気泳動法
で調べることにより、断片中２ケ所あったＥｃｏＲ１部
位のどちらの部位が消失しているかを明らかにすること
ができた。その結果２期待するＥｃｏＲ１部位すなわち
β−ガラクトシダーゼプロモーターに近接するＥｃｏＲ
Ｔ部位が１ケ所消失していることが確認されたプラスミ
ドを１次のプロティンＡ様物質の遺伝子のクローニング
用プラスミドベクターとした。すなわちこのプラスミド
ベクターは、 ＥｃｏＲＩ。
られたＤＮＡ断片の大きさをアガロースゲル電気泳動法
で調べることにより、断片中２ケ所あったＥｃｏＲ１部
位のどちらの部位が消失しているかを明らかにすること
ができた。その結果２期待するＥｃｏＲ１部位すなわち
β−ガラクトシダーゼプロモーターに近接するＥｃｏＲ
Ｔ部位が１ケ所消失していることが確認されたプラスミ
ドを１次のプロティンＡ様物質の遺伝子のクローニング
用プラスミドベクターとした。すなわちこのプラスミド
ベクターは、 ＥｃｏＲＩ。
Ｂａｍ ＩＩＩ制限酵素切断部位をそれぞれ１ケ所所有
しており、化学的にまたは、プラスミドより得たＥｃｏ
ＲＩ。
しており、化学的にまたは、プラスミドより得たＥｃｏ
ＲＩ。
Ｂａｍ ＩＩＩの粘着末端をもつ遺伝子をライゲーショ
ン反応を用いてこのプラスミドベクターに容易に導入す
ることができる。さらにこの組み換えプラスミドをエセ
リシア・コリーに一１２株Ｉｔ ８１０１に形質転換す
ると、目的とするクローンを４ｐｒかつＴｃ’のコロニ
ーを選択することにより容易に得ることができる。
ン反応を用いてこのプラスミドベクターに容易に導入す
ることができる。さらにこの組み換えプラスミドをエセ
リシア・コリーに一１２株Ｉｔ ８１０１に形質転換す
ると、目的とするクローンを４ｐｒかつＴｃ’のコロニ
ーを選択することにより容易に得ることができる。
実施例４で得られたプラスミドベクターに実施例３で得
られたプロティンＡ様物質のＤＮＡ配列を組み込んだ組
み換えプラスミドを以下のようにして構築した（第６図
）。
られたプロティンＡ様物質のＤＮＡ配列を組み込んだ組
み換えプラスミドを以下のようにして構築した（第６図
）。
実施例３で得られたプロティンＡ様物質のＤＮＡ１．０
μｇを２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
、 １０℃ＭＭｇＣＩ□、からなる溶液２３μβ中で９
５℃、２分間加熱し、氷水中で冷却後、 ＡＴＰ １．
２ ｎｍｏＬ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位、
ＤＴＴ １０ｍＭを加え、３７℃で２０分間反応させ
てＤＮＡの５′−ＯＨ末端をリン酸化した。すべての５
’−０１１末端をリン酸化するために１反応液を９５℃
で２分間再度加熱し、水中で冷却後１反応液量の１／１
０容量の１００ ｍＭ ＤＴＴおよび５単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で２０分間さらに
反応させ１次いで９５℃で２分間加熱した後ゆっくりと
室温にもどした。
μｇを２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
、 １０℃ＭＭｇＣＩ□、からなる溶液２３μβ中で９
５℃、２分間加熱し、氷水中で冷却後、 ＡＴＰ １．
２ ｎｍｏＬ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位、
ＤＴＴ １０ｍＭを加え、３７℃で２０分間反応させ
てＤＮＡの５′−ＯＨ末端をリン酸化した。すべての５
’−０１１末端をリン酸化するために１反応液を９５℃
で２分間再度加熱し、水中で冷却後１反応液量の１／１
０容量の１００ ｍＭ ＤＴＴおよび５単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で２０分間さらに
反応させ１次いで９５℃で２分間加熱した後ゆっくりと
室温にもどした。
次に実施例４で得られたプラスミドベクターＤＮＡ５＃
ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ とＢａｍ ＩＩＩ各々１０単
位を用いて完全に消化したものを０．７％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、大きいＤＮＡ断片を電気泳動法に
より回収した。
ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ とＢａｍ ＩＩＩ各々１０単
位を用いて完全に消化したものを０．７％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、大きいＤＮＡ断片を電気泳動法に
より回収した。
このようにして得たプラスミドベクターのＥｃｏＲＩ／
Ｂａｍ ＩＩＩの断片ＤＮＡＩμｇと先に得た５’−０
１１末端をリン酸化したプロティンＡ様物質のＤ Ｎ
Ａ ２５℃ｇを２０１トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
、 １．０ｍＭ ＭｇＣｈ＋１０ｍＭ ＤＴＴ、
０．４ｍＭ ＡＴＰからなる溶液３０μβに溶かし、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を用いて５℃で１６時間反応
させた。反応液に２倍容量のエタノールを加え組み換え
プラスミドＤＮＡを沈澱として得た。
Ｂａｍ ＩＩＩの断片ＤＮＡＩμｇと先に得た５’−０
１１末端をリン酸化したプロティンＡ様物質のＤ Ｎ
Ａ ２５℃ｇを２０１トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）
、 １．０ｍＭ ＭｇＣｈ＋１０ｍＭ ＤＴＴ、
０．４ｍＭ ＡＴＰからなる溶液３０μβに溶かし、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を用いて５℃で１６時間反応
させた。反応液に２倍容量のエタノールを加え組み換え
プラスミドＤＮＡを沈澱として得た。
実施例５で得られた組み換えプラスミドＤＮＡの沈澱を
１００ ｍＭ ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６） 、
６ ｍＭＭｇＣＩ□、 ６６ｍＭ ＮａＣｌよりな
る溶液１００μｎに溶解した。
１００ ｍＭ ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６） 、
６ ｍＭＭｇＣＩ□、 ６６ｍＭ ＮａＣｌよりな
る溶液１００μｎに溶解した。
一方、エセリシア・コリーに一１２株１１ＢＩＯＩの新
鮮な一夜培養菌液をり、ブロスで１：１００に稀釈し。
鮮な一夜培養菌液をり、ブロスで１：１００に稀釈し。
３７℃で振とう培養して００ｂＯ０＝０．１−０．１５
まで増殖させた。菌体をペレット状に集め（日立ＣＲ２
６１１遠心機のＲＰＩ？Ｗ９０−ターにより５℃で５分
間、 ５０００ｒｐｍの遠心による）、もとの半容量の
水冷５０ｍＭＭｇＣＩｚ ｉ １０ｍＭＮａＣｚＨ３
ｏｚ、 ｐｌ＋５．６中に再懸濁させ。
まで増殖させた。菌体をペレット状に集め（日立ＣＲ２
６１１遠心機のＲＰＩ？Ｗ９０−ターにより５℃で５分
間、 ５０００ｒｐｍの遠心による）、もとの半容量の
水冷５０ｍＭＭｇＣＩｚ ｉ １０ｍＭＮａＣｚＨ３
ｏｚ、 ｐｌ＋５．６中に再懸濁させ。
そして０℃にて２０分間静置した。前記同様にペレット
状に集め、水冷１００ｍＭ ＭｇＣ１，； ７５ｍＭ
ＣａＣ＋２；１０ｍＭ ＮａＣｚｌ＋３０ｚ、 ｐＨ５
，６中に再懸濁させた。
状に集め、水冷１００ｍＭ ＭｇＣ１，； ７５ｍＭ
ＣａＣ＋２；１０ｍＭ ＮａＣｚｌ＋３０ｚ、 ｐＨ５
，６中に再懸濁させた。
このようにしてＣａＣ１ｇ処理されたエセリシア・コリ
ーに一１２株１１８１０１と先に得た組み換えプラスミ
ドＤＮＡの溶液とを０℃にて混合後（トータルで２００
μＮ）、０℃にて１０分間放置し２次いで４２℃で１
分間ヒートショックし、更に２５℃にて２０分間放置後
、ｌ ｍｌのし一ブロス（１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔ
ｏｎｅ。
ーに一１２株１１８１０１と先に得た組み換えプラスミ
ドＤＮＡの溶液とを０℃にて混合後（トータルで２００
μＮ）、０℃にて１０分間放置し２次いで４２℃で１
分間ヒートショックし、更に２５℃にて２０分間放置後
、ｌ ｍｌのし一ブロス（１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔ
ｏｎｅ。
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣＩ ）を加えて、１時
間振とうした。この溶液を５０μＢ７ｍｌのアンピシリ
ンを含む１．５％寒天−し−ブロス上に接種し、３７℃
で１夜インキユベートした。５ｘｔｏ’コロニ一／μｇ
ＤＮＡの形質転換効率が恒常的に観察された。
間振とうした。この溶液を５０μＢ７ｍｌのアンピシリ
ンを含む１．５％寒天−し−ブロス上に接種し、３７℃
で１夜インキユベートした。５ｘｔｏ’コロニ一／μｇ
ＤＮＡの形質転換効率が恒常的に観察された。
以上の方法で得られた形質転換株は、アンピシリン４０
μｇ７ｍ！！およびグルコース０．５％を含む栄養寒天
培地に３７℃で一夜培養後生じたコロニーを。
μｇ７ｍ！！およびグルコース０．５％を含む栄養寒天
培地に３７℃で一夜培養後生じたコロニーを。
１５μｇ ／ｍβのテトラサイクリンを含む栄養寒天培
地にレプリカして、 Ｔｃ’のコロニーを選択した。
地にレプリカして、 Ｔｃ’のコロニーを選択した。
１００個のＡｐ′コロニーのうち８５個のコロニーがＴ
ｃ”であった・ １２例８：、み えプラスミドＤＮＡの ８゜製ｌＯ
μｇ／ＬＩ１１のアンピシリンを含むし一ブロス中で一
夜プレカルチャーした培養菌液をＭ−９培地に１％とな
るように加え、ロータリー・インキュベーター（２５Ｏ
ｒｐｍ）により３７℃で、 ００６０Ｇが０．６に達す
るまで増殖させた。次いでクロラムフェニコールを２５
０■／ｌ添加し、さらに培養液を３７℃で一夜振とうし
、培養を続けた。菌体は遠心分離（５，００Ｏｒｐｍ、
１０分、４°Ｃ９日立ＣＲ２６１１） ｌＪて収穫し
。
ｃ”であった・ １２例８：、み えプラスミドＤＮＡの ８゜製ｌＯ
μｇ／ＬＩ１１のアンピシリンを含むし一ブロス中で一
夜プレカルチャーした培養菌液をＭ−９培地に１％とな
るように加え、ロータリー・インキュベーター（２５Ｏ
ｒｐｍ）により３７℃で、 ００６０Ｇが０．６に達す
るまで増殖させた。次いでクロラムフェニコールを２５
０■／ｌ添加し、さらに培養液を３７℃で一夜振とうし
、培養を続けた。菌体は遠心分離（５，００Ｏｒｐｍ、
１０分、４°Ｃ９日立ＣＲ２６１１） ｌＪて収穫し
。
このペレットを氷冷したＴＥ緩衝液にて洗浄した後再び
遠心分離した（５．００Ｏｒｐｍ、 １０分、４℃２日
立ＣＲ２６Ｈ）。このペレットを水冷下、溶菌緩衝液（
２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、 ２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ 、 ２５％しょ糖）２０ｎ／！に懸濁し
、これに２０■７ｍｌのりゾチームを’ｌ ｍｌ加え、
水冷下１０分間溶菌しせめた。次いで、 ５００ ｍＭ
ＥＤＴＡをｌ ｍｊ！加え、 １０分間放置した後、１
％トリトンＸ−１００を１ ｔｓｌ加え更に氷冷下一時
間溶菌せしめた。このライゼートを４０．ＯＯＯｒｐｍ
、 ４°Ｃで１時間超遠心分離し、この上澄み液をメス
シリンダーにデカンテーションした。
遠心分離した（５．００Ｏｒｐｍ、 １０分、４℃２日
立ＣＲ２６Ｈ）。このペレットを水冷下、溶菌緩衝液（
２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、 ２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ 、 ２５％しょ糖）２０ｎ／！に懸濁し
、これに２０■７ｍｌのりゾチームを’ｌ ｍｌ加え、
水冷下１０分間溶菌しせめた。次いで、 ５００ ｍＭ
ＥＤＴＡをｌ ｍｊ！加え、 １０分間放置した後、１
％トリトンＸ−１００を１ ｔｓｌ加え更に氷冷下一時
間溶菌せしめた。このライゼートを４０．ＯＯＯｒｐｍ
、 ４°Ｃで１時間超遠心分離し、この上澄み液をメス
シリンダーにデカンテーションした。
これにエチジウムブロマイド１００μｇ ／ ｍ７！お
よびＣ３Ｃ１２を０．９５ｇ／ ｍ ｅとなるように加
え、２５°Ｃで４０．００Ｏｒｐｍで１６時間超遠心分
離し、プラスミド分画を採取した。エチジウムブロマイ
ドの除去はイソアミルアルコールで３回抽出して行なっ
た。このプラスミドは、−夜ＴＥ緩衝液で透析し、エタ
ノール沈澱することによって回収した。
よびＣ３Ｃ１２を０．９５ｇ／ ｍ ｅとなるように加
え、２５°Ｃで４０．００Ｏｒｐｍで１６時間超遠心分
離し、プラスミド分画を採取した。エチジウムブロマイ
ドの除去はイソアミルアルコールで３回抽出して行なっ
た。このプラスミドは、−夜ＴＥ緩衝液で透析し、エタ
ノール沈澱することによって回収した。
、雄側９ ： ＤＮＡ配置の°定
ＤＮＡ配列の決定はマキサム−ギルバート等の方法（Ｍ
ａｘａｍ、 Ａ、Ｍ、、 ｅｔ ａｌ。Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ’ １．Ａｃａｄ。
ａｘａｍ、 Ａ、Ｍ、、 ｅｔ ａｌ。Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ’ １．Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ｌＪ、ｓ、Ａ、、 ７４．５６０（１９７７
））で行なった。
））で行なった。
ＡｐゝでかつＴｃ’のコロニーを幾つか任意に選んでそ
れらから得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＢａ
ｍ旧とで消化し、生成した小さい方のＥｃｏＲ１／Ｂａ
ｍ ＨＩ Ｄ Ｎ Ａ断片の大きさと塩基配列を調べ。
れらから得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＢａ
ｍ旧とで消化し、生成した小さい方のＥｃｏＲ１／Ｂａ
ｍ ＨＩ Ｄ Ｎ Ａ断片の大きさと塩基配列を調べ。
試験した全てについてプロティンＡ様物質ＤＮＡに一致
することを確認した。そして得られた形質転換株はエセ
リシア・コリーに１２５ＰＡ−Ｆｃと命名した。
することを確認した。そして得られた形質転換株はエセ
リシア・コリーに１２５ＰＡ−Ｆｃと命名した。
プロティンＡ様物質ＤＮＡが組み込まれた組み換えプラ
スミドを保有するエセリシア・コリーに１２ｓｐ八−Ｆ
ｃを、グルコースを除き、５０μｇ７ｍ（ｌのアンピシ
リンを含むＬ−ブロスで５Ｘ１０１′細胞／ｍｌ迄増殖
させた。次にイソプロピルβ−ローチオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭになるように加え。
スミドを保有するエセリシア・コリーに１２ｓｐ八−Ｆ
ｃを、グルコースを除き、５０μｇ７ｍ（ｌのアンピシ
リンを含むＬ−ブロスで５Ｘ１０１′細胞／ｍｌ迄増殖
させた。次にイソプロピルβ−ローチオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭになるように加え。
更に増殖を２時間ｍ続した。遠心分ｍ （５，ＯＯＯｒ
ｐｍ。
ｐｍ。
４℃で１０分間）して得られた菌体を、シアノゲンプロ
マイド５■／ｍｌおよび０．１Ｍのメルカプトエタノー
ルを含む７０％ギ酸に懸濁し、室温で２４時間暗所に放
置した。
マイド５■／ｍｌおよび０．１Ｍのメルカプトエタノー
ルを含む７０％ギ酸に懸濁し、室温で２４時間暗所に放
置した。
反応液を凍結乾燥後、 ２５ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）を加えて残渣を溶解せしめ、この溶液を１０ｍ
Ｍのメルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にて透析した。得られた溶液をＩｇＧ−
セファロースカラム（蛋白質 １ｎｗ当たりベッドボリ
ューム ２０ｍ１）に導入し、カラムをＡｚｂ。で測定
したときカラムからもはや蛋白質が流出しなくなるまで
Ｏ，ＬＭリン酸緩衝？ｆＬ（ｐｌ＋７．０）で洗浄した
。
７，０）を加えて残渣を溶解せしめ、この溶液を１０ｍ
Ｍのメルカプトエタノールを含む２５ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にて透析した。得られた溶液をＩｇＧ−
セファロースカラム（蛋白質 １ｎｗ当たりベッドボリ
ューム ２０ｍ１）に導入し、カラムをＡｚｂ。で測定
したときカラムからもはや蛋白質が流出しなくなるまで
Ｏ，ＬＭリン酸緩衝？ｆＬ（ｐｌ＋７．０）で洗浄した
。
プロティンＡ様物質は０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液で
溶出した。回収された蛋白質は８０％飽和硫酸アンモニ
ウムで沈澱濃縮し、 ｌ０ｍＭのメルカプトエタノール
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）で透析し
１次いで凍結乾燥した。
溶出した。回収された蛋白質は８０％飽和硫酸アンモニ
ウムで沈澱濃縮し、 ｌ０ｍＭのメルカプトエタノール
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）で透析し
１次いで凍結乾燥した。
表１に、か（して得られたプロティンＡ様物質の各精製
段階での収率を示す。この結果より計算すると、エセリ
シア・コリーに−１２５ＰＡ−Ｐｃは少なくとも細胞１
個あたり３ＸＩＯ’分子のプロティンＡ様物質を生成し
ていることがわかった。
段階での収率を示す。この結果より計算すると、エセリ
シア・コリーに−１２５ＰＡ−Ｐｃは少なくとも細胞１
個あたり３ＸＩＯ’分子のプロティンＡ様物質を生成し
ていることがわかった。
（以下余白）
表１
Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／５ＰＡ−Ｆｃからのプロ
ティンＡ様物質の精製さらに、かくして得られたプロテ
ィンＡ様物質はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（Ｓ
Ｄ Ｓ −ＰＡＧＥ）により分子量は約７ 、０００
であること。
ティンＡ様物質の精製さらに、かくして得られたプロテ
ィンＡ様物質はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（Ｓ
Ｄ Ｓ −ＰＡＧＥ）により分子量は約７ 、０００
であること。
マウスの血清中のＩｇＧ結合能力、アミノ酸組成の分析
、およびアミノ酸配列の解析において、全て理論値と一
致するデータを示した。
、およびアミノ酸配列の解析において、全て理論値と一
致するデータを示した。
凍結乾燥粉末の活性チオールセファロース４Ｂｌｏｇを
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５，０）２００ｍ Ｉｌ
を用いて１時間膨潤させる。活性化された活性チオール
セファロース４Ｂを２０■のプロティンＡ様物質を含む
カップリング緩衝液（０，５Ｍ ＮａＣ１，０，１Ｍ炭
酸水素ナトリウム）中に４°Ｃにて一夜懸濁させ、プロ
ティンＡ様物質を結合せしめた。次いでこのゲルをカッ
プリング緩衝液５００ｃａ ｌおよび０．５Ｍ ＮａＣ
１を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）） ５００
ｍＪで洗浄することによりプロティンＡ様物質固定化不
活性担体を得た。
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５，０）２００ｍ Ｉｌ
を用いて１時間膨潤させる。活性化された活性チオール
セファロース４Ｂを２０■のプロティンＡ様物質を含む
カップリング緩衝液（０，５Ｍ ＮａＣ１，０，１Ｍ炭
酸水素ナトリウム）中に４°Ｃにて一夜懸濁させ、プロ
ティンＡ様物質を結合せしめた。次いでこのゲルをカッ
プリング緩衝液５００ｃａ ｌおよび０．５Ｍ ＮａＣ
１を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）） ５００
ｍＪで洗浄することによりプロティンＡ様物質固定化不
活性担体を得た。
例１２ニブロチインＡ様物質固定化不活性担体の」ｌト
ニｌ 凍結乾燥粉末のＣＮＢｒ結合セファロースＣＬ−４Ｂ
１５ｇを１ｍＭの塩酸２００ｍ ｌを用いて１時間膨潤
させる。
ニｌ 凍結乾燥粉末のＣＮＢｒ結合セファロースＣＬ−４Ｂ
１５ｇを１ｍＭの塩酸２００ｍ ｌを用いて１時間膨潤
させる。
活性化されたＣＮＢｒセファロースＣＬ−４Ｂ 全５０
■ノフロテインＡ様物質を含むカップリング緩衝液（０
，５ＭＮａＣ！、 ０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム）
中に４℃にて一夜懸濁させ、プロティンＡ様物質を結合
せしめた。次いで残有する活性基を除くために、１Ｍエ
タノ−アミンＬｏｏｍ ｌを加え４時間処理した。次い
でこのゲルをカップリング緩衝液５００ｍ Ｉｌおよび
０．５ＭＮａＣ＋を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
０）） ５００ｍ １２で洗浄することによりプロティ
ンＡ様物質固定化不活性担体を得た。
■ノフロテインＡ様物質を含むカップリング緩衝液（０
，５ＭＮａＣ！、 ０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム）
中に４℃にて一夜懸濁させ、プロティンＡ様物質を結合
せしめた。次いで残有する活性基を除くために、１Ｍエ
タノ−アミンＬｏｏｍ ｌを加え４時間処理した。次い
でこのゲルをカップリング緩衝液５００ｍ Ｉｌおよび
０．５ＭＮａＣ＋を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
０）） ５００ｍ １２で洗浄することによりプロティ
ンＡ様物質固定化不活性担体を得た。
実施例１１で得られたカラムをｐＨ８，０のリン酸緩衝
液で平衡化し、これに、２倍に稀釈されたマウス血清を
チャージした。ＩｇＭ、 ＩｇＡおよびＩｇＥは溶出液
中に定量的に回収された。ＩｇＧ＋、 ＩｇＧｚａ、［
ｇＧｚｂはそれぞれｐｌ＋６．０−７．０．４．５−５
．帆３．５−４−．０で順に溶出され、プロティンＡを
固定化したカラムとほぼ同様の挙動を示した。しかしな
がら、実施例１１で得られたプロティンＡ様物質固定化
不活性カラムの吸着容量は約３０〜４０■７ｍ１ｌであ
り、市販品のプロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ
（ファルマシア製）のヒ） ＩｇＧに対する吸着容量
が約１２〜１５ｍｇ／ｍｌであるのに比べ、約３倍の吸
着容量を有していた。
液で平衡化し、これに、２倍に稀釈されたマウス血清を
チャージした。ＩｇＭ、 ＩｇＡおよびＩｇＥは溶出液
中に定量的に回収された。ＩｇＧ＋、 ＩｇＧｚａ、［
ｇＧｚｂはそれぞれｐｌ＋６．０−７．０．４．５−５
．帆３．５−４−．０で順に溶出され、プロティンＡを
固定化したカラムとほぼ同様の挙動を示した。しかしな
がら、実施例１１で得られたプロティンＡ様物質固定化
不活性カラムの吸着容量は約３０〜４０■７ｍ１ｌであ
り、市販品のプロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ
（ファルマシア製）のヒ） ＩｇＧに対する吸着容量
が約１２〜１５ｍｇ／ｍｌであるのに比べ、約３倍の吸
着容量を有していた。
実施例１２で得られたカラムをＩ））Ｉ ｓ、ｏのリン
酸復衝液で平衡化し、これに、２倍に稀釈されたマウス
血清をチャージした。ＩｇＭ、 ＩｇＡおよびＩｇＥは
溶出液中に定量的に回収された。ＩｇＧ、、 ＩｇＧ２
ａ、ＩｇＧｚｂはそれぞれｐＨ１６，０−７，０，４，
５−５，０，３，５−４，０で順に溶出され、実施例１
３で得られたカラムとほぼ同様の溶出挙動を示した。し
かしながら、実施例１２で得られたプロティンＡ様物質
固定化不活性カラムの吸着容量は約５〜７■／ｍａｌで
あり、実施例１１で得られたものと比べ約１／６倍の吸
着容量になっていた。これは、 Ｐｃ結合活性部位に近
いアミノ酸などが固相担体との結合に使われたため、活
性なプロティンＡ様物質の見かけの含有量が減少したた
めと考えられる。
酸復衝液で平衡化し、これに、２倍に稀釈されたマウス
血清をチャージした。ＩｇＭ、 ＩｇＡおよびＩｇＥは
溶出液中に定量的に回収された。ＩｇＧ、、 ＩｇＧ２
ａ、ＩｇＧｚｂはそれぞれｐＨ１６，０−７，０，４，
５−５，０，３，５−４，０で順に溶出され、実施例１
３で得られたカラムとほぼ同様の溶出挙動を示した。し
かしながら、実施例１２で得られたプロティンＡ様物質
固定化不活性カラムの吸着容量は約５〜７■／ｍａｌで
あり、実施例１１で得られたものと比べ約１／６倍の吸
着容量になっていた。これは、 Ｐｃ結合活性部位に近
いアミノ酸などが固相担体との結合に使われたため、活
性なプロティンＡ様物質の見かけの含有量が減少したた
めと考えられる。
（発明の効果）
上述したように本発明によれば、従来のプロティンＡ製
品よりも高いＩｇＧ結合活性を有するプロティンＡ様物
質を、担体に安定に固定化できる状態で、安全にかつ効
率よく量産することができ。
品よりも高いＩｇＧ結合活性を有するプロティンＡ様物
質を、担体に安定に固定化できる状態で、安全にかつ効
率よく量産することができ。
従って、免疫化学領域における診断および基礎研究、あ
るいはその抗腫瘍剤としての大規模な臨床試験に大きく
貢献すると思われる。
るいはその抗腫瘍剤としての大規模な臨床試験に大きく
貢献すると思われる。
４、図面の間車なｉ′日
第１図は本発明のプロティンＡ様物質のＩｇＧ結合部分
の遺伝子を化学合成するときに用いられるオリゴヌクレ
オチド（上方ストランド１３本（Ｕｌ−Ｕｌ３）、下方
ストランド１２本（Ｌ Ｌ −Ｌ１２） ）の塩基配列
を示す。
の遺伝子を化学合成するときに用いられるオリゴヌクレ
オチド（上方ストランド１３本（Ｕｌ−Ｕｌ３）、下方
ストランド１２本（Ｌ Ｌ −Ｌ１２） ）の塩基配列
を示す。
第２図は本発明において設計された、プロテインＡ様物
質のＩｇＧ結合部分の遺伝子を含む２本鎖ポリヌクレオ
チドの塩基配列を示す。
質のＩｇＧ結合部分の遺伝子を含む２本鎖ポリヌクレオ
チドの塩基配列を示す。
第３図はジヌクレオチドの合成反応式を示す。
第４図はオリゴヌクレオチドＬｌｌの二次元ホモクロマ
トグラフィーの結果を示す。
トグラフィーの結果を示す。
第５図は各オリゴヌクレオチドを結合してプロティンＡ
様物質をコードする構造遺伝子を得る方法を示す。
様物質をコードする構造遺伝子を得る方法を示す。
第６図はプロティンＡ様物質の遺伝子を含む組み換えプ
ラスミドの構築法を示す。
ラスミドの構築法を示す。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、プロテインＡ様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ結合
能力を有する部分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸
にシステインを付加せしめたことを特徴とする、プロテ
インＡ様物質の遺伝子。 ２、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のポリアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する特許請
求の範囲第１項に記載のプロテインＡ様物質の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
ン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リジン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｙ；チロシンを意味する。 ３、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のヌクレオ
チド配列を有する特許請求の範囲第２項に記載のプロテ
インＡ様物質の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミ
ン、Ｒ；Ａ／Ｇ、Ｙ；Ｃ／Ｔ、Ｚ；Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｘ；Ａ
／Ｇ／Ｃ／Ｔ、ＪＪＪ；Ｌｅｕに対応するコドン、ＬＬ
Ｌ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。 ４、プロテインＡ様物質の遺伝子を含有する組み換えプ
ラスミドであって、 （ａ）ベクター、 （ｂ）λｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペロンのプロ
モーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、および （ｃ）該プロモーターの制御下にあるプロテインＡ様物
質の遺伝子、 を有する組み換えプラスミド。 ５、前記ベクターがｐＢＲ３２２である特許請求の範囲
第４項に記載の組み換えプラスミド。 ６、前記プロテインＡ様物質の遺伝子を組み込むための
プラスミドベクターが、前記ｐＢＲ３２２と前記λｐｌ
ａｃ５との各ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで分解して得
た消化物を連結して構築したプラスミドにおいて、２つ
のＥｃｏＲＩ切断部位のうち１つを除去したものである
特許請求の範囲第５項に記載の組み換えプラスミド。 ７、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、プロテインＡ
様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−結合能力を有する部
分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸にシステインを
付加せしめたことを特徴とする特許請求の範囲第４項に
記載の組み換えプラスミド。 ８、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のポリアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する特許請
求の範囲第７項に記載の組み換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
ン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リジン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
：プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｙ；チロシンを意味する。 ９、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のヌクレオ
チド配列を有する特許請求の範囲第８項に記載の組み換
えプラスミド。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミ
ン、Ｒ；Ａ／Ｇ、Ｙ；Ｃ／Ｔ、Ｚ；Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｘ；Ａ
／Ｇ／Ｃ／Ｔ、ＪＪＪ；Ｌｅｕに対応するコドン、ＬＬ
Ｌ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。 １０、（ａ）ベクター、 （ｂ）λｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペロンのプロ
モーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、および （ｃ）該プロモーターの制御下にあるプロテインＡ様物
質の遺伝子、 を有する組み換えプラスミドにより形質転換された宿主
細胞。 １１、前記宿主細胞が細菌類、酵母およびその他の真菌
類、ヒトおよびその他の動物の培養細胞または植物の培
養細胞である、特許請求の範囲第１０項に記載の宿主細
胞。 １２、前記宿主細胞がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属す
る種である特許請求の範囲第１０項に記載の宿主細胞。 １３、前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する菌株である特許請
求の範囲第１０項に記載の宿主細胞。 １４、前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＨＢ１０１であ
る特許請求の範囲第１３項に記載の宿主細胞。 １５、前記形質転換された宿主細胞が、エセリシア・コ
リー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ Ｓ
ＰＡ−Ｆｃである特許請求の範囲第１４項に記載の宿主
細胞。 １６、前記ベクターがｐＢＲ３２２である特許請求の範
囲第１０項に記載の宿主細胞。 １７、前記プロテインＡ様物質の遺伝子を組み込むため
のプラスミドベクターが、前記ｐＢＲ３２２と前記λｐ
ｌａｃ５との各ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ I で分解し
て得た消化物を連結して構築したプラスミドにおいて、
２つのＥｃｏＲ I 切断部位のうち１つを除去したもの
である特許請求の範囲第１６項に記載の宿主細胞。 １８、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、プロテイン
Ａ様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−結合能力を有する
部分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸にシステイン
を付加せしめたことを特徴とする特許請求の範囲第１０
項に記載の宿主細胞。 １９、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のポリア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する特許
請求の範囲第１８項に記載の宿主細胞。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
ン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リジン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
；プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｙ；チロシンを意味する。 ２０、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のヌクレ
オチド配列を有する特許請求の範囲第１９項に記載の宿
主細胞。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミ
ン、Ｒ；Ａ／Ｇ、Ｙ；Ｃ／Ｔ、Ｚ；Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｘ；Ａ
／Ｇ／Ｃ／Ｔ、ＪＪＪ；Ｌｅｕに対応するコドン、ＬＬ
Ｌ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。 ２１、プロテインＡ様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−
結合能力を有する部分）の遺伝子を組み込んだ組み換え
プラスミドを用いてプロテインＡ様物質を製造する方法
であって、下記の工程、 （ａ）該プロテインＡ様物質の遺伝子を化学合成するこ
と、 （ｂ）該プロテインＡ様物質の遺伝子を組み込むための
プラスミドベクターを構築すること、（ｃ）該プロテイ
ンＡ様物質の遺伝子と該プラスミドベクターとを連結し
て組み換えプラスミドを構築すること、 （ｄ）該組み換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質転
換すること、 （ｅ）得られた形質転換体を栄養媒体中で培養して、培
養物中にプロテインＡ様物質を含む蛋白を生成させるこ
と、 を包含する方法。 ２２、工程（ｅ）の後にさらに以下の工程、（ｆ）産生
されたプロテインＡ様物質を含む該蛋白を採取、分解し
、分解物からプロテインＡ様物質を分離精製すること、 を包含する特許請求の範囲第２１項に記載のプロテイン
Ａ様物質の製造方法。 ２３、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、プロテイン
Ａ様物質の活性部分（ＩｇＧのＦｃ−結合能力を有する
部分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸にシステイン
を付加せしめたことを特徴とする特許請求の範囲第２１
項あるいは第２２項に記載のプロテインＡ様物質の製造
方法。 ２４、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のポリア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する特許
請求の範囲第２３項に記載のプロテインＡ様物質の製造
方法。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ：グリシ
ン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リジン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ
；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セ
リン、Ｙ；チロシンを意味する。 ２５、前記プロテインＡ様物質の遺伝子が、次のヌクレ
オチド配列を有する特許請求の範囲第２４項に記載のプ
ロテインＡ様物質の製造方法。 【遺伝子配列があります】 ここで、 Ａ；アデニン、Ｇ；グアニン、Ｃ；シトシン、Ｔ；チミ
ン、Ｒ；Ａ／Ｇ、Ｙ；Ｃ／Ｔ、Ｚ；Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｘ；Ａ
／Ｇ／Ｃ／Ｙ、ＪＪＪ；Ｌｅｕに対応するコドン、ＬＬ
Ｌ；Ｓｅｒに対応するコドンを意味する。 ２６、プロテインＡ様物質の遺伝子を組み込むための前
記プラスミドベクターが、ｐＢＲ３２２ＤＮＡとλｐｌ
ａｃ５ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで分解して得た消化
物を連結して構築したプラスミドにおいて、２つのＥｃ
ｏＲＩ切断部位のうち１つを除去したものであり、該λ
ｐｌａｃ５ＤＮＡのラクトースオペロンのプロモーター
およびβ−ガラクトシダーゼ領域を含有し、かつ該プロ
モーターと該β−ガラクトシダーゼ領域の方向性が望ま
しいものである特許請求の範囲第２１項あるいは第２２
項に記載のプロテインＡ様物質の製造方法。 ２７、前記宿主細胞が細菌類、酵母およびその他の真菌
類、ヒトおよびその他の動物の培養細胞または植物の培
養細胞である、特許請求の範囲第２１項あるいは第２２
項に記載のプロテインＡ様物質の製造方法。 ２８、前記宿主細胞がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属す
る種である特許請求の範囲第２１項あるいは第２２項に
記載のプロテインＡ様物質の製造方法。 ２９、前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する菌株である特許請
求の範囲第２１項あるいは第２２項に記載のプロテイン
Ａ様物質の製造方法。 ３０、前記宿主細胞がエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＨＢ１０１であ
る特許請求の範囲第２９項に記載のプロテインＡ様物質
の製造方法。 ３１、前記形質転換体が、エセリシア・コリー（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＳＰＡ−Ｆｃで
ある特許請求の範囲第３０項に記載のプロテインＡ様物
質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60249878A JPS62111688A (ja) | 1985-11-07 | 1985-11-07 | プロテインａ様物質の遺伝子，該遺伝子を含有する組み換えプラスミド，および該組み換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60249878A JPS62111688A (ja) | 1985-11-07 | 1985-11-07 | プロテインａ様物質の遺伝子，該遺伝子を含有する組み換えプラスミド，および該組み換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62111688A true JPS62111688A (ja) | 1987-05-22 |
Family
ID=17199539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60249878A Pending JPS62111688A (ja) | 1985-11-07 | 1985-11-07 | プロテインａ様物質の遺伝子，該遺伝子を含有する組み換えプラスミド，および該組み換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62111688A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2008-04-24 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
-
1985
- 1985-11-07 JP JP60249878A patent/JPS62111688A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2008-04-24 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| JP2010246569A (ja) * | 2004-07-06 | 2010-11-04 | Kaneka Corp | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JP2014064589A (ja) * | 2004-07-06 | 2014-04-17 | Kaneka Corp | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| US8889389B2 (en) | 2004-07-06 | 2014-11-18 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
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