JP2002527107A

JP2002527107A - アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド

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Publication number: JP2002527107A
Application number: JP2000577291A
Authority: JP
Inventors: ユーレン、マーチアス; ホバー、ソフィア
Original assignee: アフィボディ・テクノロジー・スウェーデン・アーベー
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2002-08-27
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: EP1123389B1; US6831161B1; NO20011969D0; DE69927598D1; ATE305970T1; CA2347960A1; JP4801258B2; NO323994B1; CA2633345C; GB9823071D0; NO20011969L; CA2347960C; DE69927598T2; AU773368B2; EP1672068A1; AU6353299A; CA2633345A1; WO2000023580A1; US20050100970A1; DK1123389T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、アフィニティ分離の方法であって、アフィニティリガンドが、タンパク質様リガンドのアスパラギン（Ａｓｎ）残基の１つ以上が修飾されている固定化タンパク質様リガンドである方法に関する。アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性を高めるための、タンパク質分子中のＡｓｎ残基の修飾工程、及びｂ）タンパク質の結合特性を修飾するための、タンパク質分子のランダム化工程を含む、安定化されたコンビナトリアルタンパク質を作る方法、及び、ランダム化工程とは別個のある工程において、タンパク質のＡｓｎ残基の１つ以上を修飾することにより、アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性が高められているコンビナトリアルタンパク質も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アフィニティ分離及びそれに用いるリガンドに関する。

【０００２】アフィニティ分離は、一般にアフィニティクロマトグラフィカラム上で起こり
、生体分子、特にタンパク質が関与する相互作用の潜在的に高度に特異的な性質
を利用する。他の可能な分離方法としては、膜分離、二相抽出、流動床、発泡床
（ｅｘｐａｎｄｅｄｂｅｄｓ）及び磁性粒子による分離が挙げられる（Ｓｃｏ
ｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、「ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ」、第３版、ＩＳＢＮ０−３８
７−９４０７２−３）。相互作用としては、タンパク質−タンパク質、タンパク
質−核酸、酵素−基質、レセプター−リガンド（例えばホルモン）、タンパク質
−炭水化物及びタンパク質−金属の相互作用が挙げられる。一般に、アフィニテ
ィ分離は、酵素とその基質との間、核酸とＤＮＡ結合タンパク質との間、又は抗
原と抗体との間のような、タンパク質表面で起こる生物学的に重要な結合相互作
用に基づいている。一対の結合相手のいずれか一方を、その結合相手をアッセイ
又は精製するために、例えばアフィニティカラム中の不溶性マトリックスへの共
有結合によって、固定化することができる。アフィニティ結合分子（特にタンパ
ク質）間の又はアフィニティ結合分子（特にタンパク質）が関与する相互作用の
非常に選択的な性質により、それらは、精製／分離技術について理想的なものと
なり、そして、多くの用途について、固定化タンパク質リガンドが関与するアフ
ィニティクロマトグラフィは、イオン交換クロマトグラフィ又はゲルろ過クロマ
トグラフィよりも好ましい。

【０００３】固体マトリックス上に固定化されている、ある試料中の標的分子に対する特異
的結合相手を有するカラムに、その試料を添加する場合、その標的分子は、カラ
ム中に保持され、一方、非標的分子の大部分は、単に通過するであろう。溶液、
典型的には次第に低減するｐＨを含む溶液をカラムに加えて、まず最初に非特異
的結合分子を洗い流し、最後に標的分子を溶出するために洗い流すことができる
。標的分子は、固定化リガンドに対して最も高いアフィニティを有し、カラムか
ら洗い落とされる最後の分子となり、従って、標的分子を最も高い濃度で含むの
は最後の画分であり、その最後の画分を、次に、さらなる精製／濃縮工程に用い
たり、又は標的分子の存在について直接又は間接にアッセイすることができる。

【０００４】生化学及び生物工学の分野一般における研究及び医学は、常により純粋な有機
及び生物学的分子の試料に対する要求を生み出しており、従って、可能な限り迅
速かつ安価に、純度が高い試料を提供することができる戦略に対する要求を生み
出してきている。

【０００５】タンパク質及び他の分子の純粋な試料を得る必要性を満足することと同様に、
アフィニティ分離は、試料を標的分子について定量的及び定性的にアッセイする
ことにおいても重要である。これは、例えば、血液又は尿試料を、代謝不全のよ
うな疾患の指標となる分子又は非天然物質、麻薬、ステロイド誘導体等の存在に
ついてアッセイする場合に重要であるかもしれない。

【０００６】固体アフィニティマトリックスを完備したアフィニティクロマトグラフィカラ
ムは、高価であり得、そして、明らかに、カラムを数回再使用することができる
こと、即ち、標的分子を結合する固定化リガンドの能力の低減により、又は結合
特異性の低減により、カラムを廃棄しなければならなくなる前に、多数回の使用
を完了できることが望ましい。直接比較できる結果のセットを達成するために、
及び別の使用を行う前に非特異的及び特異的結合分子をカラムから排除するため
に、カラムを洗浄することが必要である。分離媒体及び系を洗浄及び消毒するた
めの認知された標準は、ＮａＯＨ（しばしばＮａＣｌとの組み合わせで用いられ
る）である。使用される０．１〜１．０ＭのＮａＯＨ溶液は、ウイルス、細菌、
核酸、タンパク質、酵母、菌体外毒素、プリオン及び他の夾雑因子を除去するこ
とができる。ＮａＯＨ接触時間は、様々であってよく、３０分〜１時間が典型的
であり、系からの除去は、簡便なインラインでのｐＨ及び導電率の測定により監
視される。

【０００７】しかし、分離媒体の、これらのむしろ苛酷な消毒条件に耐える能力は、付着し
たリガンド（結合相手）の官能基、付着の化学、及びアルカリ条件に対する基材
マトリックスの安定性に依存する。タンパク質は、ＮａＯＨ洗浄の間に経験され
るような極端なｐＨに対して感受性であり、一般的に言って、これは、タンパク
質に基づくアフィニティ媒体の有効性に対して不利に影響するであろう。従って
、タンパク質に基づくアフィニティ分離は、その良好な特異性のためにイオン交
換及びゲルろ過クロマトグラフィよりも有利であるが、これらの他の特異性のよ
り低い技術は、標準的洗浄法によって不利に影響されない。

【０００８】アルカリ性ｐＨに対するタンパク質の感受性は、主に、アスパラギン残基及び
グルタミン残基、特にアスパラギン残基の脱アミド反応のためである。アスパラ
ギンの脱アミド反応は、環状イミド中間体を介して、通常３：１〜４：１の比率
でイソアスパルテート及びアスパルテートの形成をもたらす。この反応は、生理
学的ｐＨで起こるが、ＮａＯＨ溶液で洗浄されているクロマトグラフィカラムに
存在するようなアルカリ性ｐＨでは、はるかに速い。イソアスパルチル形態は、
アスパルテートのβ−カルボキシルとＣ−隣接アミノ酸のα−窒素との間の異常
なアミド結合によって特徴付けられる。これは、タンパク質骨格中に余分の−Ｃ
Ｈ_２−及び遊離のα−カルボキシル基をもたらす。脱アミド反応の結果としてペ
プチド骨格の切断が起こり得、タンパク質は、タンパク質全体の構造的変化によ
って、又は単なる活性又は結合部位のような感受性領域中の小さい変化によって
、その活性を失い得る。アスパラギン残基の脱アミド反応の生じ易さは、配列及
びコンフォメーションに依存性であり、Ａｓｎ−Ｇｌｙ及びＡｓｎ−Ｓｅｒ部位
のＡｓｎ残基は特に攻撃され易い。

【０００９】それは、アフィニティクロマトグラフィカラムがその中に不溶性支持体上に固
定化されたタンパク質を用いて組み立てられている場合、深刻な問題であり、使
用と使用との間の必要な洗浄プロセスは、系の効率の低下をもたらす。カラムの
絶対的な有用寿命の終わりを早めることと共に、連続的な洗浄が固定化タンパク
質の試料からその結合相手を捕捉する能力を低減させる場合、一連の試料中の分
析対象物の濃度を測定する使用と使用との間の比較が無意味となる。従って、固
定化タンパク質が標準的洗浄方法、特にアルカリ性ｐＨに対してより影響を受け
難いアフィニティ分離の方法に対する需要がある。

【００１０】従って、１つの側面においては、本発明は、アフィニティ分離の方法であって
、アフィニティリガンドが固定化タンパク質様リガンドであり、そのタンパク質
様リガンドのアスパラギン（Ａｓｎ）残基の１つ以上が修飾されている方法を提
供する。

【００１１】「修飾（された）」という用語は、アスパラギン残基の欠失又はアルカリ感受
性がより低いアミノ酸によるアスパラギン残基の置換、あるいは、アスパラギン
残基が置換（即ち１以上の基の化学的置換）又は他の化学誘導体化により（例え
ば保護基によって）修飾されている場合を含む。アルカリ感受性がより低いアミ
ノ酸による１つ以上のアスパラギン残基の置換が好ましい。

【００１２】「アフィニティ分離」によって、標的分析対象物を含む試料の、その分析対象
物に対する特異的結合相手をその上に担持する固体への添加を含む、任意の精製
又はアッセイ技術が意味される。重力又は他の手段は、試料が固体を通って又は
横切って通過するのを可能にし、分析対象物と固体上に固定化された特異的結合
相手との間の相互作用は、その分析対象物が固体上に保持され、一方、試料の残
り又は残りのほとんどが系を通過することを意味する。分離は、アフィニティク
ロマトグラフィカラム上で好都合に行うことができる。固体は、好ましくは、カ
ラム中に、その上部に試料を添加することができ、試料の非標的部分が流出する
ことができるように、配置される。塩溶液のような溶出液又はｐＨ変化を用いて
、特異的に結合した分析対象物をはずすことができ、その後、その分析対象物を
、制御された方式で多数のアリコート中に集めることができる。

【００１３】「アフィニティリガンド」は、従ってアフィニティ分離プロセスにおいて使用
することができる標的特異的結合相手である。

【００１４】「分析対象物」は、固定化されたリガンドに特異的に結合することができる、
試料中の、タンパク質様又はそれ以外の、あらゆる分子又は分子の断片を指すの
に用いられる。

【００１５】「特異的結合相手」という用語は、分子又は関連する分子の一群を含むことが
でき、これらの分子のいずれであっても、１つ以上の他の分子に「特異的に」結
合することができる。従って、この用語は、任意のある固定化リガンド又は分析
対象物が、唯一の結合相手しか有さないことを意味せず、むしろ、結合が、ほと
んどの他の分子が同じアフィニティ（親和性）で又は同じストリンジェンシー（
厳格性）では結合しないであろう、特に、所定の試料中の他の非標的分子がはる
かに低いアフィニティを有するであろう程度まで特異的であることを意味する。
アフィニティ分離による精製は、生物学的に特異的な結合相手同士の間の高いア
フィニティのために、しばしば数千倍のオーダーである。

【００１６】固定化タンパク質様リガンドを含むすべてのタイプのアフィニティ分離を、本
発明の方法において使用することができ、特定のリガンドとの使用について公知
の好適なマトリックス（即ち、固体支持体）は、典型的にはアガロース、ポリア
クリルアミド、シリカ、ポリビニルスチレン、デキストラン又は他のポリマーを
用いるクロマトグラフィに基いて、当該技術分野で公知である。分離又は固定化
プロセスについて当該技術分野で公知の任意の固体支持体を用いることができ、
実際、固体支持体へのアフィニティリガンドのような分子の付着のための、当該
技術分野で公知の方法のいずれであってもよいのと同じである。タンパク質様リ
ガンドは、通常、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、ビソキシラン、ジ
ビニルスルホン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、
トシル／トレシルクロリド、エピクロロヒドリン、カルボジイミド、グルタール
アルデヒド、ヒドラジン、オキシランのようなカップリング剤、そしてまたカル
ボキシル又はチオール活性化マトリックスによって、マトリックスに付着され、
ここでもまた、このようなカップリング剤及びカップリングの化学は、当該技術
分野において周知であり、文献に広く記載されている（Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．
Ｃ．及びＲｙｄｅｎ，Ｌ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」
、第２版、３７５−４４２頁、ＩＳＢＮ０−４７１−１８６２６−０）。簡単な
固定化を可能にするマトリックスの種々の誘導体としては、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ、ＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ及びＣＨ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ４Ｂ、並びにエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６８（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）が挙げられる。

【００１７】タンパク質様アフィニティリガンドは、上で定義した「特異的結合相手」とし
て機能することができるタンパク成分を有する分子であってもよい。従って、糖
タンパク質又はタンパク質−脂質複合体、あるいは実際、補欠分子団を有するタ
ンパク質を、本発明に従って修飾されたアフィニティリガンドとして用いること
ができる。しかし、タンパク質分子が好ましい。本明細書において、「タンパク
質」という用語は、ポリペプチド又はペプチド構造を有するあらゆる分子を含む
ものとして、広く用いる。言い換えれば、本明細書において用いる場合、「タン
パク質」は、アミノ酸の鎖から構成されており、この用語は、いかなる特定の構
造上の（即ち、三次元構造）又は他の要件を意味しない。

【００１８】アスパラギンを置き換えるために好適なアミノ酸としては、他の１９種類の標
準的な天然アミノ酸のいずれもが含まれるが、システイン及びグルタミンは好ま
しくないであろう。好ましい置換アミノ酸としては、リジン、アスパラギン酸及
びロイシンが挙げられる。当業者に周知の非天然アミノ酸及びアミノ酸誘導体も
また、アスパラギン残基を置き換えるために用いることができよう。固定化され
たタンパク質の安定性及びそれゆえ洗浄後のカラムの効率の有意な改良は、たっ
た１個のアスパラギンをアルカリ感受性がより低い残基で置換する場合に観察す
ることができるが、好ましくはアスパラギン残基の２個、３個又はそれを越える
数、あるいはすべてでさえも、置換される。

【００１９】「アルカリ感受性がより低いアミノ酸」は、当該技術分野で公知の技術、方法
及び条件を用いて比較した場合、Ａｓｎよりも、アルカリ性条件下で分解を受け
難いものである。このような条件としては、例えば、上述のカラム洗浄条件、又
は上述の脱アミド反応のようなタンパク質の分解又は安定性を研究するために当
該技術分野で用いられる任意の他のアルカリ性条件を挙げることができる。従っ
て、「アルカリ感受性がより低い」アミノ酸は、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸で
あることができ、より好ましくはＧｌｎ及びＣｙｓでもない他のものである。好
都合には、アルカリ感受性は、タンパク質分子中の所定のＡｓｎ残基を置換アミ
ノ酸で置き換えることによって、又はそのＡｓｎ残基を化学的に修飾もしくは誘
導体化することによって、そして次に修飾されていないタンパク質とアルカリ性
条件（例えばカラム洗浄条件）における安定性を比較することによって、比較す
ることができる。

【００２０】上述したように、特定のアスパラギン残基の脱アミド化に対する感受性は、タ
ンパク質の構造（Ｃｏｎｆｉｇｒａｔｉｏｎ）に依存し、タンパク質の三次元構
造の表面に存在し、従ってアルカリ性条件に特にさらされるそれらの残基を置換
することは、特に重要である。最も重要であるのはリガンドの全体的な安定性で
あり、固定化リガンドとその結合相手との間の相互作用の特異性を維持すること
が望ましく、従って、置換されるのは、リガンド−分析対象物相互作用に関与し
ないアスパラギン残基である。

【００２１】「アスパラギンが修飾された」タンパク質様のアフィニティリガンド(以下、
「修飾されたタンパク質」)は、当業者に公知のいずれかの方法により生成する
ことができる。核酸の部位特異的突然変異誘発についての標準技術は、例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇという題名の実験室マニュアルに記載されている。好まし
い技術は、望ましい突然変異を起こすために必要なミスマッチ塩基対を組み込む
プライマーがＰＣＲの第一ラウンドにおいて用いられる、ＰＣＲの突然変異誘発
を含む。二番目の反応において、一回目の反応に由来する断片を混合し、ポリメ
ラーゼに鎖を充填することができる。得られた二本鎖断片をプラスミドに連結す
ることができ、これを、次に大腸菌を形質転換するのに用いる。タンパク質を、
生物学的宿主を用いることなくインビトロで合成することができ、その場合、非
天然アミノ酸を導入することができる。

【００２２】先に示したアフィニティ分離の多くの一般的な使用と同様に、本発明において
特に重要なことは、新規で、修飾された又は高められた結合特性を有するリガン
ドを生成するための特定のタンパク質のランダム化(ランダム突然変異誘発)によ
り生成されたリガンドを用いるアフィニティ分離の使用である。それらのタンパ
ク質をコンビナトリアルタンパク質という。そのような技術は、典型的には、標
的タンパク質のランダム突然変異誘発、例えば線状バクテリオファージ表面にお
ける、それらの変異体の完全（ｆｕｌｌ）ライブラリーの発現と、それに続く望
ましい結合特性を示すタンパク質の選択を含み、その選択は、典型的には、変異
体タンパク質と固定化リガンド(結合相手)、即ち、そのタンパク質についての標
的分子、例えば標的分析対象物、との間の結合反応に関与する。突然変異誘発は
ランダムであり、特定コドンによりコードされた結果として得られるアミノ酸は
一般的には予め決定されていないが、突然変異が導入されるべき位置は一般的に
前もって同定されている。突然変異誘発は、アミノ酸の置換、欠失又は付加(例え
ば挿入)に関与することができる。

【００２３】ファージにおける表面ディスプレイのような発現系の使用により、遺伝子型と
表現型との間に決定的なつながりが提供される。その特異的結合相互作用に基づ
いて選択されることができ、観察された結合特性の原因であるタンパク質をコー
ドする核酸も保持する、必要なものが全てそろった単位が存在する。このことは
、その結合特性のために選択された有用な量のタンパク質の発現を可能にし、そ
のような発現は、典型的には形質転換された細菌宿主中において生じる。

【００２４】従って、固定化されたリガンド［例えば、望ましい標的分子(分析対象物)］に
結合する能力により選択されたタンパク質は、アフィニティ分離においてそれ自
体が(即ち、アフィニティ−リガンドとして)用いられる。固定化され、試料中の
標的分子を精製する又は分析するのに用いられるのは、まず第一に、典型的には
タンパク質を選択するのに用いられたものと同じリガンドである。このように、
変異体のライブラリーからのタンパク質は、例えば、カラム中においてマトリッ
クスに固定化されたインシュリンを有するカラムを用いてインシュリンを結合す
る能力のために選択されることができ、次に、その選択されたタンパク質は、イ
ンシュリンの存在について試料を試験するのに用いることができる。

【００２５】標的分子の存在を試験するのと同様に、本発明のアフィニティ分離方法は、優
れた精製方法を提供し、それは良好な純度を有する標的分子の試料を与える。特
に、本発明の方法は、分離系を多数回反復した後、例えばカラムの洗浄を伴う多
数回の実施の後に、なおまだ純粋な試料を生じる。本発明の方法により生成され
たそのような試料は、本発明のさらなる側面を構成する。

【００２６】前記したランダム化工程及び選択工程の前に、アルカリ感受性がより低いアミ
ノ酸でタンパク質のアスパラギン残基の１つ以上を置換することによりタンパク
質が安定化されるならば、アフィニティーカラムを実施と実施との間に洗浄する
ときに遭遇する高ｐＨのような過酷な条件に耐える能力のゆえに、アフィニティ
リガンドの有用な寿命は延びる。

【００２７】従って、本発明のさらなる側面は、ランダム化工程(即ち、「起源」又は「供
給源」又は「出発タンパク質」のランダム化によりコンビナトリアルタンパク質
を生成するのに用いられる工程)とは別の工程において、タンパク質のアスパラ
ギン残基の１つ以上を修飾することにより(好ましくは、タンパク質のアスパラ
ギン残基の１つ以上をアルカリ感受性のより低いアミノ酸で置換することにより
)、アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性が高められたコンビナトリアル
タンパク質を含む。

【００２８】そのようなタンパク質を発現する細胞と同様に、そのようなタンパク質をコー
ドする核酸分子は、本発明のさらなる側面を構成する。

【００２９】ランダム化は、それ自体、アスパラギン残基の置換をもたらし得るが、本発明
のこの側面は、安定性を高めるために１つ以上のアスパラギン残基を置換するた
めに特異的に修飾されてもいるタンパク質に関する。タンパク質は、ランダム化
の前に又は後に又はランダム化と同時に安定化され得るが、好ましくは、安定化
のための修飾は、ランダム化が行われる前に導入される。その安定化がランダム
化の前に行われる場合、それは、一回のみ行われること、並びに多くのリガンド
に対してランダム化された変異体のライブラリーから選択されることにより行わ
れることを必要とし、異なる結合特性を有するいくつかの安定化タンパク質が得
られる。安定化が、特定の結合アフィニティ（親和性）のための選択の後に行わ
れる場合、安定化のための置換の結果としてアフィニティがいくらか喪失する危
険がある。

【００３０】タンパク質分子のコンビナトリアルライブラリーの構築及びその後の、望まし
い結合特性を有するタンパク質様リガンドを得るための選択のための技術は、本
技術分野において知られている（Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．及びＵｈｌｅｎ，Ｍ．
、「ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌ
ｏｇｙ」、１９９７年、第７巻、４６３−４６９頁）。一般的に、恐らくは温度
非感受性又はｐＨ非感受性のような固有の有利な性質を有するタンパク質分子が
、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として用いられる。その後、異なる結合特性を有す
る分子のライブラリーを生成するために、コンビナトリアルライブラリーが、そ
のタンパク質分子のランダムであるが目的とするアミノ酸置換(又は他の突然変
異)により構築される。表面残基は、一般的にランダム突然変異誘発のための標
的とされる。

【００３１】適するタンパク質の足場は、単純に線状ペプチドであることができるが、好ま
しくは、その足場は、より高いアフィニティについての潜在能力を有し、タンパ
ク質分解に対してより低い感受性を有する折りたたまれた三次元構造を有する。
初めから足場を設計するよりも、通常は、天然に存在するタンパク質又はドメイ
ンを、さらにうまく処理するために選択する。疑問を回避するために、本明細書
中での「タンパク質」という用語は、タンパク質分子全体及びそのドメインもし
くは断片、ポリペプチド又はペプチドをいうのに用いられることに注意して下さ
い。

【００３２】ランダム化タンパク質が線状ファージコートタンパク質との融合タンパク質と
して表されることとなっている場合、タンパク質の足場の選択は、望ましい宿主
有機体、例えば大腸菌において効率よく発現される能力を含むいくつかの要素に
依存する。そのタンパク質は又、全体としての三次元構造を失うことなく、その
表面に置換(又は挿入又は欠失等)に耐える十分に大きな領域を含むべきである。
そのライブラリーが合成により生成されることとなっている場合、小さい全体と
してのサイズが予め不可欠である。選択された足場タンパク質が結合機能を有す
る場合、その相互作用に関与するアミノ酸残基は、ランダム化の標的であり得る
。公知の結合特性を高めるために又は新しい特異性を有するリガンドを開発する
ために、ランダム化が行われ得る。

【００３３】好適な足場となる分子は、Ｎｙｇｒｅｎら（１９９７年）によって議論されて
おり、それは、拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）配列中に４０以上の残基を有す
る環状ペプチド、Ｆｖ又は単鎖（ｓｃＦｖ）ドメインを含む免疫グロブリン様足
場、５８残基の１ドメインのブドウ球菌のタンパク質Ａ（ＳＰＡ）アナログＺ（
Ｚドメインは、ＳＰＡのＢドメインの誘導体である）あるいはＳＰＡの他のドメ
イン又はアナログのような細菌レセプター、ＤＮＡ結合タンパク質（特に、亜鉛
フィンガー及びタンパク質分解酵素阻害剤）を含む。これらの分子すべては、前
もって安定化されたタンパク質のコンビナトリアルライブラリーを構築する前に
、１つ以上の固有のアスパラギン残基をアルカリ感受性がより低いアミノ酸で置
換することにより、安定化され得る。

【００３４】特に重要であるのは、細菌レセプタードメインＺである（Ｎｏｒｄ，Ｋ、Ｎ
ｉｌｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．、Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．及びＮｙ
ｇｒｅｎ，Ｐ、「ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｅｒｉｎｇ」、１９９５年
、第８巻、第６号、６０１−６０８頁）。Ｎｏｒｄらによるこの論文は、ある範
囲の足場となる分子に適用できるタンパク質分子の、コンビナトリアルライブラ
リーの適切な構築方法を記載している。記載された方法は、固相に補助されてい
て、ランダム化された一本鎖オリゴヌクレオチドの段階的組み立て（ａｓｓｅｍ
ｂｌｙ）に基づく。

【００３５】形成されたタンパク質ライブラリーからの選択は、ビーズ固定化ライブラリー
（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｊ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．、Ｄｏｍｉｎｇｏ，
Ｇ．Ｊ．及びＬｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，Ｒ．Ｊ．、「Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．」、１９９６年、第２５９巻、８１９−８２７頁）、ＤＮＡ結合
タンパク質への融合（Ｓｃｈａｔｚ，Ｐ．Ｊ．、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ」、１９９３年、第１１巻、１１３８−１１４３頁）、及び細菌（Ｌｕ，
Ｚ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｋ．Ｓ．、ＶａｎＣｌｅａｖｅ，Ｖ．、ＬａＶａｌ
ｌｉｅ，Ｅ．Ｒ．、Ｓｔａｈｌ，Ｍ．Ｌ．及びＭｃＣｏｙ，Ｊ．Ｍ
．、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９５年、第１３巻、３６６−３７２
頁）又はファージ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．及びＷｅｌｌｓ，Ｊ．、「ＴＩ
ＢＴＥＣＨ」、１９９４年、第１２巻、１７３−１８３頁）上で、並びに酵母細
胞上（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．及びＷｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、「Ｎａｔ
ｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９７年、第１５巻、５５３−５５
７頁）及びウイルス系中（Ｅｒｎｓｔ，Ｗ．、Ｇｒａｂｈｅｒ，Ｒ．、Ｗｅ
ｇｎｅｒ，Ｄ．、Ｂｏｒｔｈ，Ｎ．、Ｇｒａｕｓｓａｕｅｒ，Ａ．及びＫａ
ｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．、「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ」、
１９９８年、第２６巻、１７１８−１７２３頁及びＧｒａｂｈｅｒ，Ｒ．、Ｅ
ｒｎｓｔ，Ｗ．、Ｄｏｂｌｈｏｆｆ−Ｄｉｅｒ，Ｏ．、Ｓａｒａ，Ｍ．及
びＫａｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．、「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１９９７年、
第２２巻、７３０−７３５頁）でディスプレイされた場合を含む、この技術分野
において公知の多くの異なる方法によって行うことができる。

【００３６】国際特許出願公報番号ＷＯ９５／１９３７４は、Ｚ−変異体のコンビナトリア
ルライブラリーの構築を記載する（特に実施例４を参照されたい）。この出願は
、１２頁において、組換えタンパク質の精製におけるＺドメインのアフィニティ
リガンドとしての利点を、洗浄の間、アフィニティカラムの厳しい環境において
比較的安定であるとして、論じている。本発明は、アスパラギン残基の置換によ
り、Ｚドメインがアルカリ性ｐＨに対して安定化され得るというさらなる利益を
提供する。本発明により、コンビナトリアルライブラリーを調製する前に、固有
のＺドメインを安定化することが提案される。

【００３７】従って、更なる側面において、本発明は、タンパク質分子のコンビナトリアル
ライブラリーを調製する方法であって、タンパク質がランダム化される前に、タ
ンパク質のアスパラギン残基の１つ以上を修飾することにより（好ましくはタン
パク質のアスパラギン残基の１つ以上の置換により）、当該タンパク質がアルカ
リ性のｐＨにより低い感受性を示すように変えられている方法を提供する。

【００３８】本発明のなお更なる側面においては、ファージディスプレイの方法であって、
ファージ表面上で発現したタンパク質が、タンパク質の結合特性を修飾するため
に導入された修飾とは別個の、ある工程において（好ましくはアルカリ感受性が
より低い残基での置換により）修飾された１つ以上のアスパラギン残基を有して
いる方法が提供される。

【００３９】本発明の更なる側面は、安定化されたコンビナトリアルタンパク質を作る方法
であって、ａ）アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性を高めるための、タンパク
質分子中のアスパラギン残基の修飾工程、及びｂ）タンパク質の結合特性を修飾するための、タンパク質分子のランダム化
工程を含む方法、を包含する。

【００４０】工程ａ）における修飾は、好ましくは、アスパラギン残基のアルカリ感受性が
より低い他のアミノ酸による置換を含み、工程ａ）は、好ましくは工程ｂ）の前
に行う。

【００４１】ランダム化及び安定化がされているタンパク質分子と同様に、本発明は、安定
化された部分とランダム化された部分とを含む融合タンパク質にも関し、そのよ
うなタンパク質は、ある用途において有用である。特に、この技術は、特異的結
合特性を有する様々な領域を付着できる安定なフレームワーク（構造）の開発を
可能にする。上で論じたランダム化技術により、様々な領域を調製することがで
き、所望の結合特性を有するタンパク質分子を、例えばファージディスプレイ及
びアフィニティクロマトグラフィにより、変異体のライブラリーから選択するこ
とができる。このランダム化されたタンパク質は、その後、例えば大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）中で、そのアスパラギン残基の１つ以上を他のアルカリ感受性がより
低い残基で置換することにより、アルカリ性条件に対するその安定性を改良する
ために既にうまく処理されているタンパク質分子と共に、融合タンパク質として
発現され得る。

【００４２】融合タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィにおいて、ランダム化され
た部分によって提供された前もって選択された結合アフィニティと共に、フレー
ムワーク部分によって提供された一般に安定な分子の利益を与えて、固定化リガ
ンドとして使用することができる。そのような系は、重要なタンパク質様の特徴
（ペプチドの特徴と対比して）が、安定化部分によって提供されるので、ランダ
ム化及び選択化工程の間、小さなタンパク質分子の使用を可能にすることができ
る。同様の安定化部分を、様々な異なるランダム化分子と共に使用することがで
き、その逆もまた同様である。融合ペプチドの安定化フレームワーク部分として
機能する好適なタンパク質分子として、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）が
挙げられ、細菌レセプタードメインＺは、これに関連して、ランダム化に好適な
分子である。

【００４３】従って、本発明は、また、１つ以上の天然のアスパラギン残基が修飾されてい
る（好ましくは、高いｐＨに対して感受性がより低いアミノ酸残基によって置換
されている）第一の部分と、その特異的結合特性のために選択されたランダム化
されたタンパク質分子である第二の部分を含む融合タンパク質を提供する。

【００４４】そのようなタンパク質をコードする核酸分子も、そのタンパク質を発現する細
胞も、本発明の更なる側面を構成する。

【００４５】本発明の更なる側面は、アフィニティリガンドのアスパラギン残基の１つ以上
を修飾することによる、アフィニティリガンドを安定化する方法を含む（好まし
くは、そのアフィニティリガンドは、そのアスパラギン残基の１つ以上をアルカ
リ性ｐＨに対する感受性がより低いアミノ酸残基で置換することによって安定化
される）。

【００４６】なお更なる側面は、タンパク質のアスパラギン残基の１つ以上の修飾によって
安定化されたタンパク質分子の、表面ディスプレイ又はアフィニティクロマトグ
ラフィにおける使用を含む。

【００４７】「表面ディスプレイ」という用語は、タンパク質の結合特性に基づき、タンパ
ク質分子間の識別を可能にする方法で提供される（ディスプレイされる）分子の
ライブラリーからのタンパク質の選択に関与する技術を意味する。表面ディスプ
レイは、典型的には、線状バクテリオファージの表面で行われる（ファージディ
スプレイ）。しかし、ディスプレイは、細菌、酵母細胞上で、あるいはウイルス
系を用いて行うこともできる。当該技術分野で公知又は推奨されているすべての
「表面ディスプレイ」を、本発明で使用することができる。

【００４８】本発明の方法での使用のための好ましいアフィニティリガンドは、アルブミン
結合タンパク質（ＡＢＤ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するアフィニテ
ィを有するタンパク質ドメインである。それは、細胞壁に固着した（ａｎｃｈｏ
ｒｅｄ）ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＧ１４８に由来する細菌レセプタータン
パク質に由来する。その具体的用途は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の精製の
ためのアフィニティリガンドとしてというものである。このタンパク質の野生型
配列は、４つのアスパラギン残基を有し、これらの残基の１つのみが置換される
場合に、高い安定性が観察される。しかし、好ましくは、すべての４つの残基を
、アルカリ感受性がより低い残基で置換する。ＡＢＤの野生型アミノ酸配列は、
以下の通りである：

【００４９】

【化１】アスパラギン残基は、ボールド体で示されている。ハイフン（−）は、同じファ
ミリーの他の分子がこの部分に追加のアミノ酸を有することを、わかり易く示す
ものである。この配列は、図３に示す１９アミノ酸のＮ末端テールを除外してい
る。本文全体を通して、ＡＢＤの具体的アミノ酸は、図３に示した全配列（１９
アミノ酸の「テール」を含む）中の位置で同定される。従って、ＡＢＤｗｔの第
一のアスパラギン残基を、第２８位置（Ａｓｎ_２８）にて安定化することができ
る。本発明の方法における使用のためのＡＢＤの安定化物は、１９アミノ酸のＮ
末端テールの一部又はすべてを含むことができ、あるいはそのようなテールを全
く含まなくてもよい。

【００５０】安定化されたＡＢＤは、上で論じたように、さらにランダム化に供され、例え
ばＨＳＡに対する修飾された結合特性を有する、及び／又は、何らかの選択の標
的に結合することができ、また、ＨＳＡに対する親和性も保持するタンパク質（
即ち、コンビナトリアルタンパク質）を作ることができる。ランダム化は、安定
化工程で修飾された同じ又は、好ましくは異なる、残基の突然変異誘発を含むこ
とができる。そのようなＡＢＤの誘導体（例えば、ランダム又は特異的突然変異
誘発によって作られた突然変異体）もまた、本発明の範囲に包含される。

【００５１】従って、本発明の更なる側面は、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）、ある
いはその断片又は誘導体であって、１つ以上の固有のアスパラギン残基が、アル
カリ感受性がより低いアミノ酸によって置換されているものである。そのような
タンパク質をコードする核酸分子も、そのタンパク質を発現する細胞も、本発明
の更なる側面を構成する。

【００５２】特に好ましい態様においては、Ａｓｎ_２８はロイシンで置換され、Ａｓｎ_４２はアスパラギン酸で置換され、Ａｓｎ_４５はアスパラギン酸で置換され、そして
Ａｓｎ_４６はリジンで置換される（本明細書では、ＡＢＤ_ｍｕｔと呼称する）。
「ＡＢＤ_ｍｕｔ」は、１９アミノ酸のＮ末端テールの一部又はすべてを含む、あ
るいはそのようなテールを全く含まないタンパク質を意味するために使用される
。典型的には、ＡＢＤ_ｍｕｔが、例えばドメインＺを有する、融合タンパク質の
一部であるならば、Ｎ末端テールの一部のみが存在するか、あるいはそのような
テールはないであろう。アスパラギンは、アルカリ感受性が最も強いアミノ酸で
あり、従って、それを置換するために、他の任意のアミノ酸残基を使用すること
ができ、安定性の向上が期待されるであろう。置換に用いるのに好適なアミノ酸
を同定するために、他の種で見出される又は同じ役割を担う他の相同タンパク質
の配列を比較することが、役に立ち得る。

【００５３】他のアフィニティリガンドの安定化に好適な方法においては、ＰＣＲ突然変異
誘発により、修飾が導入された。初めに、突然変異を導入するために、ミスマッ
チプライマーを用いる。次に、一回目のＰＣＲ反応で得られた断片を混合し、ポ
リメラーゼに鎖を充填させる。修飾を含むＡＢＤの二本鎖の断片を制限酵素で切
断し、同じ酵素で制限されたプラスミドに連結する。これを、その後、そのタン
パク質の発現系である大腸菌を形質変換するために使用する。

【００５４】好ましくは、本発明の方法によって精製された（即ち、得られた）アフィニテ
ィリガンドは、０．５ＭのＮａＯＨでの２０回の処理の後において、その正常な
結合能力の８０％超、好ましくは９５％超を保持する。

【００５５】本発明は、以下の非制限的な実施例において、更に説明されるであろう。

【００５６】実施例を通して、ＡＢＤｓｔａｂ及びＡＢＤｍｕｔは、同義的に使用する。

【００５７】実施例１クローニングＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として、ｐＴｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２を用いた（Ｋｒａ
ｕｌｉｓ等、１９９６年、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、第３７８巻、１９０−１９４
頁）。プラスミドは、トリプトファン・プロモーターの制御下、ＡＢＤｗｔの遺
伝子をコードする。ＰＣＲ突然変異誘発は２段階で行われる。１回目のＰＣＲで
、突然変異を導入し、ＰＣＲの第２ラウンドで、１回目の反応からの断片を混合
して、ポリメラーゼに鎖を充填させた（図１）。最初のＰＣＲで用いたプライマ
ーは、

【００５８】

【化２】であった。

【００５９】二本鎖の断片をＸｂａＩとＰｓｔＩで切断し、同じ酵素で制限されたｐＴ
ｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２に連結した。連結反応混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ、ＲＲＩ
ΔＭ１５株を形質転換した。ＰＣＲにより挿入のサイズを確認した後、配列をサ
イクル・シーケンシングで確かめた（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。その結果得られたプラスミ
ドを、ｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２と名付けた。

【００６０】実施例２発現及び精製ＡＢＤｍｕｔ及び参照として野生型ＡＢＤをもコードするプラスミドを含むＥ
．ｃｏｌｉ細胞を、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）（５ｇ／ｌ）及びカナマ
イシン一硫酸塩（５０ｍｇ／ｌ）を添加した５００ｍｌのトリプティック・ソイ
・ブロス（ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔｈ）（３０ｇ／ｌ）を含む振動フ
ラスコ中で一晩培養した。ＡＢＤ遺伝子はトリプトファン・プロモーターの制御
下にあるので、そのアミノ酸が生育培地中に欠けているときにメッセンジャーＲ
ＮＡの生成が始まる。細胞を、２０時間後、遠心分離（４０００×ｇ、１０分間
）によって採集した。細胞を３０ｍｌのＴＳＴ（２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７
．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中に再懸濁させた
後、それらを超音波処理によって粉砕した。その後、遠心分離工程（約４０，０
００×ｇ、２０分間）を行った。上清をろ過（０．４９μｍ）した。可溶性タン
パク質を、Ｓｔａｈｌ等（１９８９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、
第１２４巻、４３−５２頁）により記載されたようにヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）セファロース上のアフィニティクロマトグラフィーで単離した。流出画分中
のタンパク質含量を２８０ｎｍにおける吸光度によって測定し、関連のある画分
を集めて凍結乾燥した。両方のタンパク質は第一工程精製後で高純度であり、そ
の分子の大きさに従って移動する。

【００６１】実施例３ＮａＯＨ処理前後の結合特性ＡＢＤｗｔ及びＡＢＤｍｕｔの安定性を調べるため、室温で、２４時間の０．
５ＭＮａＯＨ処理前後で、結合特性を調べた。ＡＢＤｗｔ及びＡＢＤｍｕｔの
両者を、１ｘＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＰ２０）中に濃度が８００ｎＭにな
るまで溶解し、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓａ
ｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で分析した。非常にアルカリ性の環境にさらした後の活性
変化を決定するため、これらのタンパク質を０．５ＭＮａＯＨに溶解した。Ｎ
ａＯＨ中で２４時間インキュベートした後、試料を、３０ｍＭ酢酸アンモニウム
で平衡化されたＮＡＰ−１０カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に通した。タンパク質含有試
料を凍結乾燥し、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００中で分析するため、１ｘＨＢＳ中に
濃度が８００ｎＭになるまで再溶解した。

【００６２】ＢＩＡｃｏｒｅ分析ＢＩＡｃｏｒｅ２０００の器械（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を、リアルタイム
アフィニティ分析のために用いた。ＨＳＡ及びＩｇＧを、カルボキシル化された
デキストラン層へのアミン・カップリングにより、ＣＭ５センサー・チップの２
つの異なった表面に固定化した。このカップリングは、製造業者の推奨（Ｂｉａ
ｃｏｒｅＡＢ）に従って行った。ＩｇＧ表面を対照として用いた。試料を、０
．４５μｍフィルターを通して、流速５μｌ／分でランダムな順序で表面に注入
した。結果は、明らかに、ＡＢＤｗｔはアルカリ性溶液にさらされている間にＨ
ＳＡに対する親和性を失い、一方、４つのアスパラギン残基を欠いた突然変異体
は親和性を保っていることを示す。センサーグラムを図５に示す。

【００６３】また、まだ活性を保っているタンパク質に対して速度パラメーターの解析を行
った。これは、異なる濃度での結合挙動の解析、及びその後のＢＩＡｅｖａｌｕ
ａｔｉｏｎ２．１ソフトウエア（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を用いた結合定数の
計算によって行った。用いた濃度は、ＡＢＤｗｔについては４０〜２００ｎＭ、
ＡＢＤｍｕｔについては２００〜６００ｍＭで、ＮａＯＨ処理したＡＢＤｍｕｔ
については８００〜１２５０ｍＭであった。結果を、以下の表１に示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】実施例４アフィニティマトリックスの製造安定化したＨＳＡ結合タンパク質のバイオテクノロジーにおける有用性を評価
するため、２つのアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを製造した。即
ち、１つは対照としての突然変異をさせていないタンパク質（ＡＢＤｗｔ）で、
もう１つは突然変異させたＡＢＤ（ＡＢＤｍｕｔ）である。用いたマトリックス
は、カップリング剤としてカルボジイミドＣＭＣ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃ
ｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）のついたセファロース４Ｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒ
ｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）であった。ＡＢ
Ｄｗｔ（４．５ｍｇ）とＡＢＤｍｕｔ（８．５ｍｇ）を、別々に９ｍｌの水に溶
解させた。３．５ｍｌと５．０ｍｌのゲルを、ＡＢＤｗｔとＡＢＤｍｕｔ溶液に
それぞれ添加した。最後に、０．３８ｇのＣＭＣを溶液に加え、それらを室温で
一晩インキュベートした。ゲルを、ＨＲカラム（ｄ＝５ｍｍ、ｈ＝４３ｍｍ）に
詰め、マトリックスを不活性にするためには０．５Ｍのエタノールアミン、０．
５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．３でパルスし、結合していないタンパク質を洗
い流すためには０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ４
でパルスした。この後に、カラムはＨＳＡのアフィニティ精製に用いる準備がで
きた。

【００６６】実施例５保持された選択性突然変異させたタンパク質のＨＳＡに対する選択性が４つのアミノ酸の交換後
に保持されているかを調べるため、捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）の実験を行った。一
晩生育させたＥ．ｃｏｌｉ細胞の培養物を、超音波処理で壊し、４０，０００×
ｇで遠心分離し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。Ｅ．ｃｏｌｉライセー
ト（溶解物）の可溶性画分を精製されたＨＳＡと混合し、この混合物をＡＢＤｍ
ｕｔアフィニティカラムにかけた。カラムを洗浄後、結合物を、Ｓｔａｈｌ等（
１９８９年、前出）により記載されたように、ｐＨを２．８まで下げることで溶
出した。図４に見られるように、ＡＢＤの突然変異体において選択性は保持され
ている。

【００６７】実施例６耐アルカリ性アフィニティカラムＡＢＤｗｔカラムとＡＢＤｍｕｔカラムとのアルカリ処理に対する安定性に関
しての相違を調べるため、両方のカラムを０．５Ｍの水酸化ナトリウムで繰り返
し洗浄した。ＡＫＴＡエクスプロラ（ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、カラムにＨ
ＳＡを充填し、タンパク質をｐＨを下げることで溶出し（Ｓｔａｈｌ等、１９８
９年、前出）、最後に両方のカラムを水酸化ナトリウムで洗浄した。このサイク
ルを１５回繰り返した。総暴露時間は６時間を越えた。用いた流速は６０ｃｍ／
時間であり、溶出物を集め、各回毎に分析した。図６には、能力の低下が水酸化
ナトリウム暴露時間に対してプロットされている。この図に見られるように、Ａ
ＢＤｗｔは活性をかなり速く失い、一方、突然変異体は実験を通して活性を維持
している。これらの結果は、ＢＩＡＣｏｒｅのデータを裏付けており、突然変異
体は、クリーニング・イン・プレース（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）
処理に対し、野生型分子よりもはるかに安定である。

【００６８】実施例７Ｚ−ＡＢＤｓｔａｂの製造及び精製凍結させたＥ．ｃｏｌｉＲＲＩΔＭ１５培地（発現ベクターｐＴＲＰＺＡＢ
ＤｓｔａｂＴ１Ｔ２を宿している）を、５ｇ／ｌ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）と５
０ｍｇ／ｌのカナマイシン一硫酸塩（Ｌａｂｋｅｍｉ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、
Ｓｗｅｄｅｎ）でを添加した２０ｍｌのトリプティック・ソイ・ブロス（３０ｇ
／ｌ）を接種するために用いた。１０ｍｌの一晩培養物を用いて５００ｍｌの新
鮮な培地を接種した。細胞を、３７℃で生育させ、タンパク質の発現を、３−β
−インドールアクリル酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、
Ｓｗｅｄｅｎ）を最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌとなるまで添加することにより、対
数増殖中期（Ａ_{６００ｎｍ}＝１）で誘導した。２４時間後、細胞を、約５０００
ｇで１０分間の遠心分離、それに続くＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭのトリス塩酸、ｐ
Ｈ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％
のＴｗｅｅｎ２０）への再懸濁により採集した。細胞を、超音波処理（Ｖｉｂｒ
ａｃｅｌｌ、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ、
ＵＳＡ）により分解し、３００００ｇ、２０分間で遠心分離した。上清を、０．
４５μｍフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ
、ＵＳＡ）でろ過し、ＨＳＡアフィニティクロマトグラフィ（Ｎｙｇｒｅｎ等、
１９８８年）にかけた。溶出したタンパク質量を、比吸光度係数、ａ（Ｌ／ｇ^＊ｃｍ）を用いて吸光度測定により見積り、関連のある画分を凍結乾燥した。

【００６９】実施例８融合タンパク質Ｚ−ＡＢＤｓｔａｂの遺伝子構築プラスミドｐＴＲＰＺＡＢＤｓｔａｂＴ１Ｔ２を、ｐＴＲＺＡＢＤｍｕｔＴ１
Ｔ２から構築した。Ｚドメインをコードする２３３塩基対の遺伝子断片を、Ｘｂ
ａＩ−ＥｃｏＲＩ消化によりｐＲＩＴ４５（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、１９９４年、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２２４巻、１０３８−１０８）から分離し
、ｐＴＲＰＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２（これは前もって同じ制限エンドヌクレアーゼ
を用いて切断されている）に連結した。連結反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＲＩΔＭ１５株を形質転換した。その結果得られたプラスミドは、融合タン
パク質Ｚ−ＡＢＤｓｔａｂをコードする遺伝子を含み、ｐＴＲＰＺＡＢＤｓｔａ
ｂＴ１Ｔ２と名付けられた。

【００７０】ＡＢＤｓｔａｂ及びＺ−ＡＢＤｓｔａｂ（１９アミノ酸のＮ末端のテールをコ
ードする領域を含む）のＤＮＡ配列は、以下のとおりである。

【００７１】

【化３】

【００７２】実施例９ＡＢＤｍｕｔドメインの３つの三重突然変異体の遺伝子構築実施例９と１０は、既に安定化されたＡＢＤ分子上の表面（例えば、ＨＳＡ結
合に加わっていない表面）をランダム化させ、それによって選択された任意の標
的と結合でき、またＨＳＡへのアフィニティをも保持している分子を作り出すこ
とが可能であることを示す。

【００７３】ＨＳＡへの結合部位をマッピングするためのアラニン・スキャン実験からの結
果を基にして、追加のアラニン置換を含むＡＢＤｍｕｔ（実施例１を参照）ドメ
インをコードする遺伝子構築体を作製した。これらを、同定されたＨＳＡ結合モ
チーフ（これは第１及び第２へリックス及びその間のループに位置していた）か
ら離れたドメイン中の位置に導入した。３つの異なるプラスミド遺伝子構築体を
、ＰＣＲに基づく突然変異誘発によって組立てたが、各々は３つのアラニン置換
を含むＡＢＤｍｕｔタンパク質変異体をコードしている。即ち、ＡＢＤｍｕｔドメインの２２、２５、２６の位置にアラニン置換を含むｐＴｒｐ
ＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、ＡＢＤｍｕｔドメインの２９、３０、３３の位置にアラニン置換を含むｐＴｒｐ
ＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３、及びＡＢＤｍｕｔドメインの５４、５７、５８の位置にアラニン置換を含むｐＴｒｐ
ＡＢＤｍｕｔ５４−５７−５８である。ＰＣＲ突然異変誘発のための鋳型として
、プラスミドｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２を用いた（実施例１を参照）。その
プラスミドは、トリプトファン・プロモーターの転写制御下にＡＢＤｍｕｔの遺
伝子をコードする。２２、２５、２６のアミノ酸のアラニンへの交換は、プライ
マーＴ１Ｔ２（実施例１を参照）とＬＩＭＡ１２を用いて通常のＰＣＲ突然変異
誘発によって行った。

【００７４】

【化４】

【００７５】他の２つの構築体についてのＰＣＲ突然変異誘発を２段階で行った。１回目の
ＰＣＲ増幅では、突然変異を導入し、２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ増幅
からの断片を混合して、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに補佐された二本鎖ＤＮＡ
合成に供し（図１と同じ戦略）、続いて隣接プライマー（ＳＯＨＯ８とＴ１Ｔ２
（実施例１を参照））を用いて増幅した。２９、３０及び３３のアミノ酸のアラ
ニン交換のためのＰＣＲに用いたプライマーは、

【００７６】

【化５】であった。５４、５７及び５８のアミノ酸の交換のために、ＬＩＭＡ１５及びＬ
ＩＭＡ１６を用いた。

【００７７】

【化６】

【００７８】プラスミドｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６の構築のため、二本鎖ＰＣ
Ｒ生成物を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、他の２つ
の変異体についてはＸｂａＩとＰｓｔＩを用いた。異なる断片を、同じ酵素で制
限されたｐＴｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２に連結し、これは、３つの異なったＡＢＤｍｕ
ｔ三重変異体での野生型ＡＢＤドメイン遺伝子の置替えをもたらした。それぞれ
の混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩΔＭ１５株を形質転換した。挿入物の
サイズを確認した後、配列を、サイクルＤＮＡシーケンシングで制御した（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅ
ｄｅｎ）。その結果得られたプラスミドを、それぞれｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２２
−２５−２６、ｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３、及びｐＴｒｐＡＢＤｍ
ｕｔ５４−５７−５８と名付けた。

【００７９】３つの三重変異体のＤＮＡ配列は以下のとおりである。

【００８０】

【化７】

【００８１】実施例１０ＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、ＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３
及びＡＢＤｍｕｔ５４−５７−５８タンパク質のＨＳＡ結合の分析ＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、ＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３、及びＡＢＤ
ｍｕｔ５４−５７−５８タンパク質を、実施例２で記載した通りに製造し、精製
した。異なった三重変異体の結合挙動を分析するため、ＢＩｃｏｒｅ２００
０装置を用いた。ＨＳＡを、カルボキシル化されたデキストラン層へのアミン・
カップリングによりＣＭ５センサー・チップのセンサー・チップ表面に固定化し
た。対照として、ＩｇＧを含むセンサー・チップ表面を用いた。このカップリン
グは、製造業者の推奨（ＢｉｏｃｏｒｅＡＢ）に従って行った。３つのタンパ
ク質の試料を０．４５μｍフィルターに通し、流速２０μｌ／分でランダムな順
序で表面に注入した。用いた濃度は２００ｎＭで、全ての試料を３回分析した。
その結果得られたセンサーグラムは、３つの三重変異体の全てがＨＳＡへの結合
能力を保持していることを示す（図７）。これらの結果は、この研究で調べられ
た９つの位置（２２、２５、２６、２９、３０、３３、５４、５７、５８）が、
同時に又は異なった組み合わで、結合、触媒又は基質としての働きのような第２
の活性を有する新しいＨＳＡ結合ＡＢＤｗｔ又はＡＢＤｍｕｔドメインを同定す
るために、部位特異性又はランダム突然変異誘発に供することが可能であるべき
ことを示す。加えて、残基６２も置換のために用いられ得る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるＰＣＲ突然変異誘発工程の図による説明である。

【図２】図２は、遺伝子構築のクローニングを示す。

【図３】図３は、野生型ＡＢＤとその突然変異によるアルカリ耐性変異体のアミノ酸配
列である。突然変異による変異体の全配列を、本明細書においては、配列番号１
と名付ける。

【図４】図４は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）を示す。レーン１及
び２は、それぞれ、精製されたＡＢＤ及びＡＢＤ_ｓｔａｂを示す。第三のレーン
は、分子量マーカー（上からそれぞれ９４、６７、４３、４０、２０．２及び１
４．４ｋＤａ）を示す。突然変異されたＡＢＤの選択性を確かめるために、大腸
菌分解物を、ＨＳＡ（レーン４）でスパイクし、カラムに載せた。レーン５、６
及び７は、２、８及び１５回のＮａＯＨでの処理後に溶出された物質を示す。レ
ーン８は、ＨＳＡ対照を示す。

【図５】図５は、０．５ＭのＮａＯＨでの２４時間の処理の前後における、（Ａ）ＡＢ
Ｄｗｔと（Ｂ）ＡＢＤｍｕｔの結合特性を示すＢＩＡＣｏｒｅに由来するセンサ
ーグラムを示す。

【図６】図６は、０．５ＭのＮａＯＨでの数回の処理後における、２つのアフィニティ
マトリックス（それぞれＡＢＤｗｔとＡＢＤｍｕｔ）の能力を示すダイアグラム
である。

【図７】図７は、ＡＢＤｍｕｔ及びその３種の異なる三重変異体の結合特性を示す、実
施例１０に記載されたＢＩＡＣｏｒｅ実験に由来するセンサーグラムを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/01 ＸＧ０１Ｎ 30/48 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA63 CA06 CA07 DA06 EA04 FA02 GA11 HA03 HA06 4B065 AA01X AA26X AA57X AA72X AA87X AB01 BA02 CA24 CA60 4D017 AA09 BA07 CA12 DA03 4G066 AC02C AC03B CA20 CA54 DA07 EA02 GA11 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA11 DA50 EA61 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アフィニティ分離の方法であって、アフィニティリガンドが
固定化タンパク質様リガンドであり、そのタンパク質様リガンドのアスパラギン
（Ａｓｎ）残基の１つ以上が修飾されている、方法。
【請求項２】アフィニティリガンドのＡｓｎ残基の１つ以上を修飾するこ
とによる、アフィニティリガンドを安定化する方法。
【請求項３】タンパク質分子のコンビナトリアルライブラリーを調製する
方法であって、タンパク質がランダム化される前に、タンパク質のＡｓｎ残基の
１つ以上を修飾することにより、当該タンパク質がアルカリ性のｐＨにより低い
感受性を示すように変えられている、方法。
【請求項４】ファージディスプレイの方法であって、ファージ表面上で発
現したタンパク質が、タンパク質の結合特性を修飾するために導入された修飾と
は別個の、ある工程において修飾された１つ以上のＡｓｎ残基を有している、方
法。
【請求項５】安定化されたコンビナトリアルタンパク質を作る方法であっ
て、ａ）アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性を高めるための、タンパク
質分子中のＡｓｎ残基の修飾工程、及びｂ）タンパク質の結合特性を修飾するための、タンパク質分子のランダム化
工程を含む、方法。
【請求項６】ランダム化工程とは別個のある工程において、タンパク質の
Ａｓｎ残基の１つ以上を修飾することにより、アルカリ性条件におけるタンパク
質の安定性が高められている、コンビナトリアルタンパク質。
【請求項７】１つ以上の天然のＡｓｎ残基が修飾されている第一の部分と
、その特異的結合特性のために選択されたランダム化されたタンパク質分子であ
る第二の部分とを含む、融合タンパク質。
【請求項８】タンパク質のＡｓｎ残基の１つ以上の修飾によって安定化さ
れたタンパク質分子の、表面ディスプレイ又はアフィニティクロマトグラフィに
おける使用。
【請求項９】前記リガンド又は前記タンパク質中の１つ以上のＡｓｎ残基
が、アルカリ感受性がより低いアミノ酸によって置換されている、請求項１乃至
８のいずれか一請求項において請求された方法又はタンパク質又は使用。
【請求項１０】２つ以上のＡｓｎ残基が修飾されている、請求項１乃至９
のいずれか一請求項において請求された方法又はタンパク質又は使用。
【請求項１１】Ａｓｎ残基すべてが修飾されている、請求項１乃至１０の
いずれか一請求項において請求された方法又はタンパク質又は使用。
【請求項１２】リガンド又はタンパク質の三次元構造の表面のＡｓｎ残基
が修飾されている、請求項１乃至１１のいずれか一請求項において請求された方
法又はタンパク質又は使用。
【請求項１３】前記Ａｓｎ残基が、リジン、アスパラギン酸及びロイシン
から選択されたアミノ酸で置換されている、請求項１乃至１２のいずれか一請求
項において請求された方法又はタンパク質又は使用。
【請求項１４】前記アフィニティリガンドがコンビナトリアルタンパク質
である、請求項１、２又は９乃至１３のいずれか一請求項において請求された方
法。
【請求項１５】前記アフィニティリガンドが、表面ディスプレイライブラ
リーにおける発現によって選択されたランダム化タンパク質である、請求項１４
で請求された方法。
【請求項１６】前記コンビナトリアルタンパク質が、免疫グロブリン分子
あるいはその断片又は誘導体、ブドウ球菌のタンパク質Ａ（ＳＰＡ）あるいはそ
の断片、ドメイン又は誘導体、又は、ＤＮＡ結合タンパク質あるいはその断片又
はドメインに由来する、請求項６、７、１４又は１５のいずれか一請求項におい
て請求された方法又はタンパク質。
【請求項１７】前記コンビナトリアルタンパク質が、ドメインＺ又はその
誘導体である、請求項１６で請求された方法又はタンパク質。
【請求項１８】前記アフィニティリガンド又はタンパク質が、アルブミン
結合タンパク質（ＡＢＤ）あるいはその断片又は誘導体である、請求項１乃至１
７のいずれか一請求項において請求された方法又はタンパク質又は使用。
【請求項１９】１つ以上の固有のＡｓｎ残基が、アルカリ感受性がより低
いアミノ酸で置換されている、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）あるいはそ
の断片又は誘導体。
【請求項２０】請求項６、７、９乃至１３又は１６乃至１９のいずれか一
請求項において定義されたタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２１】請求項６、７、９乃至１３又は１６乃至１９のいずれか一
請求項において定義されたタンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項２２】第一の部分がＡＢＤであり、第二の部分がドメインＺ又は
その誘導体である、請求項７で請求された融合タンパク質。