JPH03501856A - 新規なソマトトロピン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
新規なソマトトロピン
この発明はソマトトロピン(成長ホルモン)に間し、特に安定性が高められたソ
マトトロピンの変異体に関する。
1且立11
ソマトトロピンは動物により産生されるタンパク質(以下、タンパクという)で
あって、動物の成長への効果のゆえに一般に「成長ホルモン」と称されている。
歴史的には、成長ホルモン(ソマトトロピン)は脳下蚕体抽出物から回収され精
製されてきた。今では、組換えDNA技術の出現に伴いソマトトロピンは他の天
然起源のクンバク質がいかほどの量も混ざらずに産生できる。
ンは一般にホストセルのサイトプラスム中の不溶性の耐菌性体中に蓄積する。こ
のソマトトロピンを活性な状態で回収するには、そのクンバクを可溶化し、折畳
み(fold)、酸化してその天然の形態にするという、再生が必要である。
再生プロセスの例はヨーロッパ特許(以下、EPという)出願公開114.50
6A及び192.629A号に詳細に記載されている。これらのプロセス及び続
く精製プロセスは通常高いpHで実施される。ソマトトロピンこれらの条件では
不安定また温度が、4℃(通常のプロセス温度)より悪(なことがある室温に依
存することであるが、もし安定性の間層がなければ、室温操作は処理の観点から
は好ましい。
今回、これらの条件下におけるソマトトロピンの2つの主な分解生成物が以下の
(1)、(2)であることが分った。
(1)タンパク鎖の中程(95−101位(pos i t i on))に位
置するアスパラギンから形成されるベータ結合アスパラギン酸を伴ったソマトト
ロピンの異(iso)型(form(2)そのタンパクの中程、即ち95−10
1位に位置するアスパラギンで起こるポリペプチド鎖の切断に起因する分子の2
本鎖型、である。
切断はこのアスパラギンがスクシニミジルモイエテイに転換した結果である。こ
れらのフオームはしばしばプロセス中に離脱して収率を減らしてしまう。
λ豆二l刀
今回哨乳類のソマトトロピンの変異型が発見された。その型においては、95−
101位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに入替わり、高いpHで高温
における高い安定性を示し、かつ変異していないソマトトロピンに匹敵する生物
学的活性を維持している。
哨乳類のソマトトロピンであればなんでも多分、本発明に従い、95−101領
域に位置するアスパラギンをグルタミンに入れ賛えることにより変異させること
ができよう、95−101領域に実質的に対応するアミノ酸のシーケンスを持っ
ている唖乳類のソマトトロピンであればなんでも大抵、この領域でアスパラギン
をグルタミンに転換することによって安定化しようトトロビン、ブタソマトトロ
ピン、ヒツジソマトトロピン、ウマソマトトロピン、ラットソマトトロピンそし
てモンキーソマトトロピンである。
□ の詳細な!
嗜乳類のソマトトロピンは相同であると認識されているのであるから、晴乳類の
ソマトトロピンはなんでもこの発明の実施に適している。公知のソマトトロピン
アミノ酸シーケンスの例としては、EP出願192,629号、1986年8月
27日出@ : S e e b u r gら、DNA、vol、2.No、
1. p、37−45.1983;そしてAbde 1−Mequi dら、P
roc、Natl、Ac1d、Sci、、USA、vol、84.pp、643
4−6437.1987年9月を参照されたい、シーケンスはここに参考文献と
して編入される。この発明のソマトトロピンとしてはウシ及びブタソマトトロピ
ンが好ましい。
この発明の変異ソマトトロピンの目的の領域のアミノ酸シーケンスを表示した例
を表1に示す、アンダーラインをしたグルタミンは、変異していないソマトトロ
ピンにおいてはアスパラギンである0番号は、フェニルアラニンである表示のホ
ルモンの番号lのポジションにアミノ酸があるクンバクのアミノ末端から数えた
アミノ酸のポジションを表わす、略号は、ウシソマトトロピン(B’GH):ブ
タソマトトロピン(PGH):ヒツジソマトトロビン(OGH):ウマソマトト
ロビン(EGH):ラットソマトトロビン(RGH):ヒトソマトトロビン(H
GH):そしてモンキーソマトトロピン(MGH)である。
目的領域のアミノ酸シーケンス
毀 蝕 紅 匹 柱 亜 血
この発明の変異体、即ちクンバクであってその95−101領域においてアスパ
ラギンがグルタミンに転換されたものは。
天然のソマトトロピンに限定されるものではな(相同体、変異体、(即ち別のア
ミノ酸を95−101領域のアスパラギン以外に含むソマトトロピン)対立遺伝
子型、及びその他のソマトトピンの延長や欠失を含む変異体で、その変異体が、
この発明の変異により与えられた、ソマトトロピンの生物学的活性を示し、加え
て、高いpH及び温度での高い安定性が示されるものを含む0例えば、満足すべ
き変異体には、ロイシン126がバリンに入れ替えられたBG)(及びPGHの
対立遺伝子型が含まれる。
この発明のソマトトロピンは化学合成で調製できる。しかし、ソマトトロピン分
子のサイズが大きいのでそれを組換えDNA技術で調製することが好ましい、こ
れは通常の手段で95−101領域にアスパラギンの替りにグルタミンを持つ所
望の変異ソマトトロピンをエンコードする遺伝子を作成することによって実施で
きる。変異ソマトトロピン遺伝子を作成する便利な方法は、通常の、出発遺伝子
のオリゴヌクレオチド−指示(dsis)による。
変異した遺伝子はついで適当なベクター中にクローン化導入(cloned 1
nto)され、そのベクターは次に適切な発現ホスト、例えば細菌(例えば、E
、Co11又はシュードモナス)、イースト(例えば、S、cerevisae
)、ffi!i乳類細胞(例えば、C127又はcHo)などを形質転換するの
に使用される。変異したソマトトロピンがそして発現し通常の方法で回収される
。
本発明の1つの実施態様は、晴乳類のソマトトロピンをコードする新規なりNA
シーケンスを目的とし、そこではもともとの嗜乳類ソマトトロピンの95−10
1位の間に位置するアスパラギンのためのコドンがグルタミンのためのコドン、
即ちCAA又はCAGに入り替わっている。
このDNAシーケンスは通常の化学的方法又は酵素の手段、例えば、遺伝子機械
による合成又はソマトトロピン遺伝子+7)、2クレオチド−指示、サイト特異
性変異誘発により調製される。
この発明の別の実施態様は哺乳動物の成長を促進する方法であって、牛と豚に好
ましく、その方法はこの発明の嗜乳類ソマトトロピンの効果的な量による哨乳動
物の処置(treatment)を含む。
この発明の他の実施態様はメスの哺乳動物の、例えば授乳期の雌動物体好ましく
は酪農乳牛の乳の出を良(する方法であって、この方法はこの発明のソマトトロ
ピンの効果的な量の投与を含む。
この発明のソマトトロピンは実質的に対応するアスパラギン含有ソマトトロピン
と同じ効能を示す、したがって、この発明のソマトトロピンのための効果的な投
与の量と方式は、公知の成長ホルモンのためのものと同様である。しかし実際は
内因性のソマトトロピンを、源種の哺乳動物の治療のために使用することが好ま
しい。
一般に効果的な用量の幅は1動物体1日当たり1か6200mgである。効能は
動物のサイズ及び成熟の程度、投与されたソマトトロピンの量及び使用された投
与システムのタイプにより変動する。典型的には、与えられるソマトトロピンの
量が大きいと成長、餌料効率、やせ−太り比、乳汁分泌、又は乳房組繊細胞増殖
が増大する結果となる。好ましくは用量は1動物体1日当たり10から50mg
の間で変動させるべきである。
この発明のソマトトロピンは、動物に対する所望の用量を投与するために効果的
な公知の技術で投与できる。これらには乳房内、筋肉内、又は皮下注射投与、又
はコントロールされたリリース(release)移植組織片の使用による投与
が含まれる。この発明のソマトトロピンは公知のソマトトロピンと同じ方法で調
剤できる。このような調剤物には通常緩衝剤及び不活性な担体が含まれる。
ましい 態 のt
来J11上
BGHび PGHGLNの 1
!1」U1王
BGH及びPGH構造遺伝子(Seeburg、P、H,ら、1983、DNA
2:37−45に記載)の98位にあるアスパラギン残基をオリゴヌクレオチ
ド−指示、サイト特異性変異誘発によりグルタミンに転換する。オリゴヌクレオ
チド遺伝子変異のプライマはアプライドバイオシステム(AppliCA)アプ
ライドバイオシステムDNA合成装置により、製造元の手引き書に添って合成す
る。変異誘発プライマのシーケンGACTCT−3゜
PGH5°−AGGGTCTTCACCCAGAGCCTGGTGTTT−3’
下線は野生型のアスパラギンをグルタミンに転換するコドンを示す。
テンプレート(鋳型)DNAとして使用されるBGM遺伝子は、Seeburg
らに記載されたBGM遺伝子からなり、EcoRI/HindIII断片として
、M13mp18ベクター(Bethseda Re5earch Labor
atory、Gaithersburg、MD)中にクローン化導入される。や
はり鋳型として使用するBGM遺伝子は、N−アラニル、バリン(126)BG
H遺伝子で(EP出廓193.515号、1986年9月3日公開)、EcoR
I/HindIIl断片として、Ml 3mp 18中にクローン化導入される
。鋳型DNAとして使用されるPGH遺伝子はEP出1i193.515号に記
載されたN−アラニルPG)(遺伝子で、E c o RI / Hindnl
断片として、Ml 3mp 19ベクター(BRL)にクローン化導入される。
この、98位のN−アラニルPGH遺伝子を変異誘発する前に、後の発現プラス
ミドへのサブクローニングを容易にするために、その遺伝子の5°端を変異して
NcOエサイトを作成する。この変異誘発のために使用されるプライマは上記の
ように合成されたが、以下の構造を有している。
5°−CAGTGAATTCTCCATGGCCTTCCCAGC−3゜
このNcoIサイト付加のための変異誘発手順は、Kunkel、Proc、N
atl、Acad、Sci、USA、82.422−499 (1985)に記
載されている。全ての制限酵素及び修飾酵素(T、DNAリガーゼ及びポリヌク
レオチドキナーゼ)はNew England Biolabs (Bever
ly、MA)から購入し製造元の指示書に従って使用した。
変異誘発は、Amersham(Arlington Heights、IL)
オリゴヌクレオチド−指示インビトロ変異誘発システムを使用して製造元の指示
通りに実施した。変異誘発に続いて、正の(positive)変異遺伝子を、
米国Biochemical Corporation(C1eave l a
nd、Oh i o)のSequenaseTMDNAシーケンスシステムによ
り製造元の指示に従ってDNAシーケンス分析することにより同定した。
変異した遺伝子は次いでEcoRI/HindIIT断片として、BGH及びN
−アラニルBGH遺伝子についてはE、coli発現ペククーpMON2534
中に、又N−アラニルPGH遺伝子については、p M ON 5585中に、
クローン化導入される。プラスミドpMON5585は、双頚の1acUV5ブ
ロモークが転写ターミネータとしてp B G H−−−+のHindIHサイ
トに挿入されたp B G H* −+誘導体である。
EcoRI断片としての双EilacUV5プロモークのシーケンスは、Bog
osianらによるNucleic Ac1d Re5earch、15.71
85に記載されている。そのEcoRI断片は、そのEcoRIのオーバハング
に充填しHindIIlリンカ−を付着させることによりHindIII断片に
転換される。
これらの操作により、Hindm断片の端に見られるシーケンスを作り出す、上
手の端では、充填されたEcoRIの端に結合したH i nciInリンカ−
(AAGCTT)はシーケンスAAGCTTAATTCT、、、を作り:11お
よび12位にあるこのCTはもともとの1acUV5プロモータからのAluエ
サイトの右半分を表わす、下手の端では、できたシーケンスは1.、、AGAA
TTAAGCTTであってニー11位および一12位にあるこのAGはもともと
のl actJV5ブロモークからのAluIサイトの左半分を表わす。
それに加えてpMON2534はp B G H−x−+のptrp断片の5°
末端にあるEcoRIを及び双頭1acLJV5プロモ一タ/オペレータ断片の
3°末端にHindlI+サイトを有し。
それらは、S1ヌクレアーゼを使用してオーバハングEcoR■及びHi n
d III Mを消化することにより除去され、またT4DNAリガーゼにより
プラント末端化される。
ブ52ミ)’pMON5585は、EP出11241.446号(1987年1
0月14日公開)に記載のように、E、coli recAプロモータ、GIO
Lシーケンス、及び丁フ転写終結シーケンスを含むpBR327ブラスミドであ
る。
それぞれの発現プラスミドにクローン化導入された、変異体のBG)(、N−ア
ラニルBGH及びN−アラニルPGH遺伝子は、それぞれ、pMON3050.
pMON3066及びpMON3299と称する。このpMON3050とpM
ON3066プラスミドはE、coli株W3110 (ATC(、:3993
6)に挿入される。pMON3299は、fhuA遺伝子の欠失により修飾され
たE、coli株W3110に挿入される。その修飾はm準法(Maniati
sら、eds、1982、Mo1ecular C1onin :A Labo
rat o r M a n u aユ、Co1d Spring Harbo
rLaboratory、cold Spring Harbor、New Y
ork)による。
11亘ユ
BGHびPGHGLNの
支l久ヱムl
pMON3050.pMON306B又はPMON3299発現プラスミドを持
っているE、coli細胞は、変異したBGH又はPGHをコードするシーケン
スを発現させる条件下で培養され、従って形質転換されたE、coliにより、
変異したBGM又はPGHタンパクが産生される。E、coliのための成長培
地及びアンピリジン耐性(amp’)マーカを含む細菌細胞の選択の条件はMa
niatisら、(1982)に記載されている。E、coliは、クンバク発
現に使用されるとLuria Broth (LB)又はM9最少培地(Man
iatisら、1982)に100μg / m 1のアンピリジンを添加した
ものの中で成長する。
pMON3299中のrecAプロモータからの転写の誘導を以下のように行な
った。
発現プラスミドを持つE、coliホスト細胞を1晩培養したものを、0.25
%(W/V)グルコース及び1%(w/v)CaSアミノ酸及び0.25%μg
/ m 1チアミンを添加したM9最少培地中で2O−25Klettユニツ
ト(K 1 e tt−Summersonメータにより、グリーンフィルタを
用いて測定する、Klett Mfg、Co、、New York、New Y
ork)に希釈し、細胞密度150−180Klettにまで成長させる。これ
らの細胞は次いでナリジキシン酸を成長培地に添加することにより、最終濃度を
50μg/m1まで誘導される。成長を37℃で数時間続行させ、非対応タンパ
クの分析のための誘導の2又は3時間後にアリコートを採取する。成長の間を通
じて所望の遺伝子産生物の産生な最大にする目的で通気のレベルを高く維持する
。pMON3050及びpMON3066中のptrpブロモークからの転写の
誘導はSeeburgた、1983及びCa1cottら、1988、Deve
lo ments inIndustrialMicrobiolo 29.2
57−266に記載の通りである。
E、coli中の産主に続いて、変異体BGM及びPGHタンパクは、断りのな
い限りS i gma社(St、Louis。
MO)から購入される試薬により以下のように精製される0組換えE、coli
細胞が、Ul tra−turrax (Tekmar CO,、C1ncin
nati、OH)を使用してホモジナイズされる。細胞は、次いで予備冷却され
たMant。
n gaulin(APV Gaulin、Everett。
MA)の経路に、258.263−332,053二ニートン/rrfで3回通
すことにより溶解され、4℃で25.000rpmで20分間遠心される。
単離されたベレットは洗浄され、前記と同様にホモジナイズされ、尿素を添加し
、最終濃度4.5M尿素とする。
PGH混合物はまた90mMのトリス塩基を含む、PHはそれからNaOHで1
1.3に調整され、BGM及びPGHタンパクは4℃で撹拌しながら約2172
日間折畳まれ(f Ol d)る、その混合物は、4℃で30分間遠心され残留
するいかなる沈殿をも除去される。そのBGH及びPGHタンパクは次いで、D
E−52クロマトグラフを使用してE、coli汚染物から分離される。そのG
Hタンパクは塩酸伝導率勾配350及び1000μS e m e n s /
c m間でカラムから溶離される。精製された変異BGH及びPGHクンバク
(HPLC,Al 1 tech As5oc、、Deerfield、ILに
より同定され、0.1%[v/v]TFAを含む勾配50−65%のアセトニト
リルで溶離される)を含む断片は、貯蔵され、撹拌されているセル装置(Ami
con、Danvers、MA)中のYMloliを通して81給される。
二〇BGHGin変異タンパクは25 m M N a HCOs、pH10を
4回取り賛^、次いで水を4回取り替えて透析され、Virtis Freez
emobile 24(Gardiner、NY)で凍結乾燥される。
このPGHGin変異クンバクは5mMNaHCO−1pHIOを4回取り替え
て透析された後凍結乾燥される。211結乾燥されたクンバクは分析まで一20
℃で貯蔵される。
分析は、特L Ha rOら、Mo1.Cel 1.Endocrinol、、
38.109−116 (1984)(7)方法を使用するインビトロ肝臓ラジ
オレセブクアッセイによる。そしてインシュリン刺激されたC14−グルコース
の脂質への組み込み阻害を測定するためのGlennら、J、Cel 1.Bi
och。
em、37.371−383 (198B)の方法によるインビトロアッセイは
、この発明のこのG1n98ソマトトロピンが、対応する変異していないソマト
トロピンに実質的に匹敵する生物学的活性を呈することを示している。
ラットにおける重量増加アッセイを使用するインビトロ試験でも、この発明のこ
のG1n98ソマトトロピンについて、実施的に同等の生物学的活性を呈してい
る。
11皿ユ
Gln−1クンバクの
ソマトトロピンの溶液安定性が3日間と7日間との期間についてpH10とpH
IIとにおいて評価される。試料は、試験ソマトトロピン2mg/mlを22℃
で所定のpHの5mMNaHCO−中に溶解して調製する。pHは25mola
r NaOHを添加して10又は11に調整する。試料を22℃に保ち、サンプ
ルを、初めと3日後と7日後に、逆相高性能液体クロマトグラフで分析する。p
H10及びpH11で得られたデータをそれぞれ表2及び3に示す、データは面
積パーセントで報告されている。検出不能の量はndで示される。ビーク1はア
スパラギン98で切断されたソマトトロピンの2本鎖型の量を示す、ビーク2は
残基98におけるベータ結合したアスパラギン酸ソマトトロピンの量を示す、ビ
ーク3は不明の化合物を示す、BGH及びBGH−G1n98ソマトトロピンは
いずれも一1位にメチオニンを有している。PG)!及びPGH−G In98
ソマトトロピンはいずれも一1位にアラニンを有L ティる。
艮ス
pH10での安定性
BC;HOnd nd nd
表]。
pH1lでの安定性
一!−ビーク1 ビーク2 ビーク3
(日) 3 剋 旦
データは、正常なソマトトロピンは、高pHにおいて著しい量の2本鎖及びベー
タ結合の副生成物を経時的に形成して、不安定であり、これに対し、このG1n
98ソマトトロピンは2本鎖又はベータ結合のいずれの副生成物も、検出できる
量を形成せず、安定であることを示す。
この発明を典型的な例により説明したが、それはこれに限定されない、この発明
の開示の目的で選択された例は、この発明の精神及び範囲を離れないような変更
及び修飾を行なうことができる。
国際調査報告 8,8.。364゜
Claims (25)
- 1.変異ソマトトロビンであって、哺乳類のソマトトロピンの95−101位の 間に位置するアスパラギンがグルタミンに入れ替えられているソマトトロビン。
- 2.請求項1に記載のソマトトロピンであって、ソマトトロピンがウシソマトト ロピンであるソマトトロピン。
- 3.請求項2に記載のソマトトロピンであって、98位にあるアスパラギンがグ ルタミンに入れ替えられているソマトトロピン。
- 4.請求項3に記載のソマトトロピンであって、メチオニン及びフェニルアラニ ンをマイナス1位及び1位にそれぞれ有するソマトトロピン。
- 5.請求項3に記載のソマトトロピンであって、アラニン及びフェニルアラニン をマイナス1位及び1位にそれぞれ有するソマトトロピン。
- 6.請求項5に記載のソマトトロピンであって、バリンを126位に有するソマ トトロピン。
- 7.請求項1に記載のソマトトロピンであって、ソマトトロピンがブタソマトト ロピンであるソマトトロビン。
- 8.請求項7に記載のソマトトロピンであって、98位のアスパラギンがグルタ ミンに入れ替えられているソマトトロピン。
- 9.請求項8に記載のソマトトロピンであって、アラニン及びフェニルアラニン をマイナス1位及び1位にそれぞれ有するソマトトロピン。
- 10.哺乳動物の成長を促進する方法であって、哺乳動物を、哺乳類のソマトト ロピンであってその95−101位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに 入れ替えられているソマトトロピンの有効量で処置することを含む方法。
- 11.請求項10に記載の方法であって、ソマトトロピンがブタソマトトロピン であり、哺乳動物がブタである方法。
- 12.請求項11に記載の方法であって、ソマトトロピンがウシソマトトロピン であり、哺乳動物がウシである方法。
- 13.哺乳動物の乳産生を増加する方法であって、哺乳類のソマトトロピンであ ってその95−101位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに入れ替えら れているソマトトロピンの有効量を投与することを含む方法。
- 14.請求項13に記載の方法であって、ソマトトロピンがウシソマトトロピン であって哺乳動物が酪農乳牛である方法。
- 15.哺乳類のソマトトロピンをコードするDNAシーケンスであって、ソマト トロピンの95−101位の間に位置するアスパラギンのためのコドンがグルタ ミンのためのコドンに入れ替えられているDNAシーケンス。
- 16.請求項15に記載のDNAシーケンスであって、ソマトトロピンがウシソ マトトロピンであるDNAシーケンス。
- 17.請求項16に記載のDNAシーケンスであって、98位においてグルタミ ンをコードするDNAシーケンス。
- 18.請求項17に記載のDNAシーケンスであって、メチオニン及びフェニル アラニンをそれぞれマイナス1位及び1位においてコードするDNAシーケンス 。
- 19.請求項18に記載のDNAシーケンスであって、アラニン及びをフェニル アラニンをそれぞれマイナス1位及び1位においてコードするDNAシーケンス 。
- 20.請求項19に記載のDNAシーケンスであって、バリンを126位におい てコードするDNAシーケンス。
- 21.請求項15に記載のDNAシーケンスであって、ソマトトロピンがブタソ マトトロピンであるDNAシーケンス。
- 22.請求項21に記載のDNAシーケンスであって、グルタミンを98位にお いてコードするDNAシーケンス。
- 23.請求項22に記載のDNAシーケンスであって、アラニン及びフェニルア ラニンをそれぞれマイナス1位及び1位においてコードするDNAシーケンス。
- 24.請求項15に記載のDNAシーケンスであって、グルタミンをコードする コドンがCAAであるDNAシーケンス。
- 25.請求項15に記載のDNAシーケンスであって、グルタミンをコードする コドンがCAGであるDNAシーケンス。
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