JP2784232B2 - 新規なソマトトロピン - Google Patents

新規なソマトトロピン

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明はソマトトロピン（成長ホルモン）に関し、
特に安定性が高められたソマトトロピンの変異体に関す
る。
発明の背景 ソマトトロピンは動物により産生されるタンパク質
（以下、タンパクという）であって、動物の成長への効
果ゆえに一般に「成長ホルモン」と称されている。
歴史的には、成長ホルモン（ソマトトロピン）は脳下
垂体抽出物から回収され精製されてきた。今では、組換
えDNA技術の出現に伴いソマトトロピンは他の天然起源
のタンパク質がいかほどの量も混ざらずに産生できる。
組換えDNAの技術により細菌中で産生されるソマトト
ロピンは一般にホストセルのサイトプラスム中の不溶性
の耐菌性体中に蓄積する。このソマトトロピンを活性な
状態で回収するには、そのタンパク質を可溶化し、折畳
み（fold）、酸化してその天然の形態にするという、再
生が必要である。
再生プロセスの例はヨーロッパ特許（以下、EPとい
う）出願公開114、506A及び192、629A号に詳細に記載さ
れている。これらのプロセス及び続く精製プロセスは通
常高いpHで実施される。ソマトトロピンこれらの条件で
は不安定であって収率が低く、特に長期間実施された時
に悪い。欠点はまた温度が、４℃（通常のプロセス温
度）より悪くなることがある室温に依存することである
が、もし安定性の問題がなければ、室温操作は処理の観
点からは好ましい。
今回、これらの条件下におけるソマトトロピンの２つ
の主な分解生成物が以下の（１）、（２）であることが
分った。
（１）タンパク鎖の中程（95−101位（position））に
位置するアスパラギンから形成されるベータ結合アスパ
ラギン酸を伴ったソマトトロピンの異（iso）型（for
m）及び、 （２）そのタンパクの中程、即ち95−101に、位置する
アスパラギンで起こるポリペプチド鎖の切断に起因する
分子の２本鎖型、である。
切断はこのアスパラギンがスクシニミジルモイエテイ
に転換した結果である。これらのフォームはしばしばプ
ロセス中に離脱して収率を減らしてしまう。
発明の要約 今回哺乳類のソマトトロピンの変異型が発見された。
その型においては、95−101位の間に位置するアスパラ
ギンがグルタミンに入替わり、高いpHで高温における高
い安定性を示し、かつ変異していないソマトトロピンに
匹敵する生物学的活性を維持している。
哺乳類のソマトトロピンであればなんでも多分、本発
明に従い、95−101領域に位置するアスパラギンをグル
タミンに入れ替えることにより変異させることができよ
う。95−101領域に実質的に対応するアミノ酸のシーケ
ンスを持っている哺乳類のソマトトロピンであればなん
でも大抵、この領域でアスパラギンをグルタミンに転換
することによって安定化しよう。ソマトトロピンの適当
な例はヒトソマトトロピン、ウシソマトトロピン、ブタ
ソマトトロピン、ヒツジソマトトロピン、ウマソマトト
ロピン、ラットソマトトロピンそしてモンキーソマトト
ロピンである。
発明の詳細の説明 哺乳類のソマトトロピンは相同であると認識されてい
るのであるから、哺乳類のソマトトロピンはなんでもこ
の発明の実施に適している。公知のソマトトロピンアミ
ノ酸シーケンスの例としてはEP出願192、629号、1986年
８月27日出願;Seeburgら、DNA、vol.2、No.1、p.37−4
5、1983;そしてAbdel−Mequidら、Proc.Natl.Acid.Sc
i.,USA,vol.84,pp.6434−6437,1987年９月を参照された
い。シーケンスはここに参考文献として編入される。こ
の発明のソマトトロピンとしてはウシ及びブタソマトト
ロピンが好ましい。
この発明の変異ソマトトロピンの目的の領域のアミノ
酸シーケンスを表示した例を表１に示す。アンダーライ
ンをしたグルタミンは、変異していないソマトトロピン
においてはアスパラギンである。番号は、フェニルアラ
ニンである表示のホルモンの番号１のポジションにアミ
ノ酸があるタンパクのアミノ末端から数えたアミノ酸の
ポジションを表わす。略号は、ウシソマトトロピン（BG
H）；ブタソマトトロピン（PGH）；ヒツジソマトトロピ
ン（OGH）；ウマソマトトロピン（EGH）；ラットソマト
トロピン（RGH）；ヒトソマトトロピン（HGH）；そして
モンキーソマトトロピン（MGH）である。
この発明の変異体、即ちタンパクであってその95−10
1領域においてアスパラギンがグルタミンに転換された
ものは、天然のソマトトロピンに限定されるものではな
く相同体、変異体，（即ち別のアミノ酸を95−101領域
のアスパラギン以外に含むソマトトロピン）対立遺伝子
型、及びその他のソマトトロピンの延長や欠失を含む変
異体で、その変異体が、この発明の変異により与えられ
た、ソマトトロピンの生物学的活性を示し、加えて、高
いpH及び温度での高い安定性が示されるものを含む。例
えば、満足すべき変異体には、ロイシン126がバリンに
入れ替えられたBGH及びPGHの対立遺伝子型が含まれる。
この発明のソマトトロピンは化学合成で調製できる。
しかし、ソマトトロピン分子のサイズが大きいのでそれ
を組換えDNA技術で調製することが好ましい。これは通
常の手段で95−101領域にアスパラギンの替りにグルタ
ミンを持つ所望の変異ソマトトロピンをエンコードする
遺伝子を作成することによって実施できる。変異ソマト
トロピン遺伝子を作成する便利な方法は、通常の、出発
遺伝子のオリゴヌクレオチド−指示（directed）、サイ
ト特異性変異誘発（mutagenesis）による。
変異した遺伝子はついで適当なベクター中にクローン
化導入（cloned into）され、そのベクターは次に適切
な発現ホスト、例えば細菌（例えば、E.Coli又はシュー
ドモナス）、イースト（例えば、S.cerevisae）、哺乳
類細菌（例えば、（C127又はCHO）などを形質転換する
のに使用される。変異したソマトトロピンがそして発現
し通常の方法で回収される。
本発明の１つの実施態様は、哺乳類のソマトトロピン
をコードする新規なDNAシーケンスを目的とし、そこで
はもともとの哺乳類ソマトトロピンの95−101位の間に
位置するアスパラギンのためのコドンがグルタミンのた
めのコドン、即ちCAA又はCAGに入れ替わっている。
このDNAシーケンスは通常の化学的方法又は酵素の手
段、例えば遺伝子機械による合成又はソマトトロピン遺
伝子のヌクレオチド−指示、サイト特異性変異誘発によ
り調製される。
この発明の別の実施態様は哺乳動物の成長を促進する
方法であって、牛と豚に好ましく、その方法はこの発明
の哺乳類ソマトトロピンの効果的な量による哺乳動物の
処置（treatment）を含む。
この発明の他の実施態様はメスの哺乳動物の、例えば
授乳期の雌動物体好ましくは酪農乳牛の乳の出を良くす
る方法であって、この方法はこの発明のソマトトロピン
の効果的な量の投与を含む。
この発明のソマトトロピンは実質的に対応するアスパ
ラギン含有ソマトトロピンと同じ効能を示す。したがっ
て、この発明のソマトトロピンのための効果的な投与の
量と方式は、公知の成長ホルモンのためのものと同様で
ある。しかし実際は内因性のソマトトロピンを、源種の
哺乳動物の治療のために使用することが好ましい。
一般に効果的な用量の幅は１動物体１日当たり１から
200mgである。効能は動物サイズ及び成熟の程度、投与
されたソマトトロピンの量及び使用された投与システム
のタイプにより変動する。典型的には、与えられるソマ
トトロピンの量が大きいと成長、飼料効率、やせ−太り
比、乳汁分泌，又は乳房組織細胞増殖が増大する結果と
なる。好ましくは用量は１動物体１日当たり10から50mg
の間で変動させるべきである。
この発明のソマトトロピンは、動物に対する所望の用
量を投与するために効果的な公知の技術で投与できる。
これらには乳房内、筋肉内、又は皮下注射投与、又はコ
ントロールされたリリース（release）移植組織片の使
用による投与が含まれる。この発明のソマトトロピンは
公知のソマトトロピンと同じ方法で調剤できる。このよ
うな調剤物には通常緩衝剤及び不活性な担体が含まれ
る。
好ましい実施態様の説明 実施例１ BGH及び PGH GLNの調製 変異遺伝子 BGH及びPGH構造遺伝子（Seeburg.P.H.ら、1983、DNA
2:37−45に記載）の98位にあるアスパラギン残基をオリ
ゴヌクレオチド−指示、サイト特異性変異誘発によりグ
ルタミンに転換する。オリゴヌクレオチド遺伝子変異の
プライマはアプライドバイオシステム（Applied Biosys
tems）社（Foster City,CA）アプライドバイオシステム
DNA合成装置により、製造元の手引き書に添って合成す
る。変異誘発プライマのシーケンスは： 下線は野生型のアスパラギンをグルタミンに転換する
コドンを示す。
テンプレート（鋳型）DNAとして使用されるBGH遺伝子
は、Seeburgらに記載されたBGH遺伝子からなり、EcoR I
/Hind III断片として、M13mp18ベクター（Bethseda Res
earch Laboratory、Gaithersburg、MD）中にクローン化
導入される。やはり鋳型として使用するBGH遺伝子は、
Ｎ−アラニル、バリン（126）BGH遺伝子で（EP出願19
3、515号、1986年９月３日公開）、EcoR I/Hind III断
片として、M13mp18中にクローン化導入される。鋳型DNA
として使用されるPGH遺伝子はEP出願193、515号に記載
されたＮ−アラニルPGH遺伝子で、Eco RI/Hind III断片
として、M13mp19ベクター（BRL）にクローン化導入され
る。この、98位のＮ−アラニルPGH遺伝子を変異誘発す
る前に、後の発現プラスミドへのサブクローニングを容
易にするために、その遺伝子の５′端を変異してNco I
サイトを作成する。この変異誘発のために使用されるプ
ライマは上記のように合成されたが、以下の構造を有し
ている。
このNco Iサイト付加のための変異誘発手順は、Kunke
l.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,422−499（1985）に記載
されている。全ての制限酵素及び修飾酵素（T4DNAリガ
ーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼ）はNew England Bi
olabs（Beverly,MA）から購入し製造元の指示書に従っ
て使用した。
変異誘発は、Amersham（Arlington Heights,IL）オリ
ゴヌクレオチド−指示インビトロ変異誘発システムを使
用して製造元の指示通りに実施した。変異誘発に続い
て、正の（positive）変異遺伝子を、米国Biochemical
Corporation（Cleaveland,Ohio）のSequenaseTMDNAシー
ケンスシステムにより製造元の指示に従ってDNAシーケ
ンス分析することにより同定した。
変異した遺伝子は次いでEcoR I/Hind III断片とし
て、BGH及びＮ−アラニルBGH遺伝子についてはE.coli発
現ベクターpMON2534中に、又Ｎ−アラニルPGH遺伝子に
ついては、pMON5585中に、クローン化導入される。プラ
スミドpMON5585は、タンデムの1acUV5プロモータが転写
ターミネータとしてpBGHex−１のHind IIIサイトに挿入
されたpBGHex−１誘導体である。
EcoR I断片としてのタンデムlacUV5プロモータのシー
ケンスは、BogosianらによるNucleic Acid Research,1
5,7185に記載されている。そのEcoR I断片は、そのEcoR
Iのオーバハングに充填しHind IIIリンカーを付着させ
ることによりHind III断片に転換される。
これらの操作により、Hind III断片の端に見られるシ
ーケンスを作り出す。上手の端では、充填されたEcoR I
の端に結合したHind IIIリンカー（AAGCTT）はシーケン
スAAGCTTAATTCT...を作り;11および12位にあるこのCTは
もともとのlacUV5プロモータからのAlu Iサイトの右半
分を表わす。下手の端では、できたシーケンスは、...A
GAATTAAGCTTであって；−11位および−12位にあるこのA
GはもともとlacUV5プロモータからのAlu Iサイトの左半
分を表わす。
それに加えてpMON2534はpBGHex−１のptrp断片の５′
末端にあるEcoR Iを及びタンデムlacUV5プロモータ／オ
ペレータ断片の３′末端にHind IIIサイトを有し、それ
らは、S1ヌクレアーゼを使用してオーバハングEcoR I及
びHind III端を消化することにより除去され、またT4DN
Aリガーゼによりブランド末端化される。
プラスミドpMON5585は、EP出願241、446号（1987年10
月14日公開）に記載のように、E.coli recAプロモー
タ、G10Lシーケンス、及びT7転写終結シーケンスを含む
pBR327プラスミドである。
それぞれの発現プラスミドにクローン化導入された、
変異体のBGH,N−アラニルBGH及びＮ−アラニルPGH遺伝
子は、それそれ、pMON3050,pMON3066及びpMON3299と称
する。このpMON3050とpMON3066プラスミドはE.coli株W3
110（ATCC＃39936）に挿入される。pMON3299は、fhuA遺
伝子の欠失により修飾されたE.coli株W3110に挿入され
る。その修飾は標準法（Maniatisら、eds,1982、Molecu
lar Cloning;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor
Laboratory,Cold Spring Harbor,New York）による。
実施例２ BGH及びPGH GLNの産生 変異タンパク pMON3050,pMON3066又はpMON3299発現プラスミドを持
っているE.coli細胞は、変異したBGH又はPGHをコードす
るシーケンスを発現させる条件下で培養され、従って形
質転換されたE.coliにより、変異したBGH又はPGHタンパ
クが産生される。E.coliのための成長培地及びアンピリ
シン耐性（ampr）マーカを含む細菌細胞の選択の条件は
Maniatisら、（1982）に記載されている。E.coliは、タ
ンパク発現に使用されるとLuria Broth（LB）又はM9最
少培地（Maniatisら、1982）に100μg/mlのアンピリシ
ンを添加したものの中で成長する。
pMON3299中のrecAプロモータからの転写の誘導を以下
のように行った。
発現プラスミドを持つE.coliホスト細菌を１晩培養し
たものを、0.25％（w/v）グルコース及び１％（w/v）ca
sアミノ酸及び0.25％μg/mlチアミンを添加したM9最少
培地中で、20−25Klettユニット（Klett−Summersonメ
ータにより、グリーンフィルタを用いて測定する、Klet
t Mfg.Co.,New York,New York）に希釈し、細胞密度150
−180Klettにまで成長させる。これらの細胞は次いでナ
リジキシン酸を成長培地に添加することにより、最終濃
度を50μg/mlまで誘導される。成長を37℃で数時間続行
させ、非対応タンパクの分析のための誘導の２又は３時
間後にアリコートを採取する。成長の間を通じて所望の
遺伝子産生物の産生を最大にする目的で通気のレベルを
高く維持する。pMON3050及びpMON3066中のptrpプロモー
タからの転写の誘導はSeeburgた、1983及びCalcottら、
1988、Developments inIndustrial Microbiology 29,25
7−266に記載の通りである。
E.coli中の産生に続いて、変異体BGH及びPGHタンパク
は、断りのない限りSigma社（St.Louis,MO）から購入さ
れる試薬により以下のように精製される。組換えE.coli
細胞が、Ultra−turrax（Tekmar Co.,Cincinnati,OH）
を使用してホモジナイズされる。細胞は、次いで予備冷
却されたManton gaulin（APV Gaulin,Everett,MA）の経
路に、258、263−332、053ニュートン/m2で３回通すこ
とにより溶解され、４℃で25、000rpmで20分間遠心され
る。
単離されたペレットは洗浄され、前記と同様にホモジ
ナイズされ、尿素を添加し、最終濃度4.5M尿素とする。
PGH混合物はまた90mMのトリス塩基を含む。pHはそれ
からNaOHで11.3に調整され、BGH及びPGHタンパクは４℃
で撹拌しながら約2 1/2日間折畳まれ（fold）る。その
混合物は、４℃で30分間遠心され残留するいかなる沈殿
をも除去される。そのBGH及びPGHタンパクは次いで、DE
−52クロマトグラフを使用してE.coli汚染物から分離さ
れる。そのGHタンパクは塩酸伝導率勾配350及び1000μS
emens/cm間でカラムから溶離される。精製された変異BG
H及びPGHタンパク（HPLC,Alltech Assoc.,Deerfield,IL
により同定され、0.1％［v/v］TFAを含む勾配50−65％
のアセトニトリルで溶離される）を含む断片は、貯蔵さ
れ、撹拌されているセル装置（Amicon,Danvers,MA）中
のYM10膜を通して濃縮される。
このBGH Gln変異タンパクは25mMNaHCO3、pH10を４回
取り替え、次いで水を４回取り替えて透析され、Virtis
Freezemobile 24（Gardiner,NY）で凍結乾燥される。
このPGH Gln変異タンパクは5mMNaHCO3、pH10を４回取
り替えて透析された後凍結乾燥される。凍結乾燥された
タンパクは分析まで−20℃で貯蔵される。
分析は、特にHaroら、Mol.Cell.Endocrinol.、38,109
−116（1984）の方法を使用するインビトロ肝臓ラジオ
レセプタアッセイ及びインシュリン刺激されたC14−グ
ルコースの脂質への組み込み阻害を測定するためのGlen
nら、J.Cell。Biochem.37,371−383（1988）の方法によ
るインビトロアッセイは、この発明のこのGln98ソマト
トロピンが、対応する変異していないソマトトロピンに
実質的に匹敵する生物学的活性を呈することを示してい
る。
ラットにおける重量増加アッセイを使用するインビト
ロ試験でも、この発明のこのGln98ソマトトロピンにつ
いて、実質的に同等の生物学的活性を呈している。
実施例３ Gln変異タンパクの安定性 ソマトトロピンの溶液安定性が３日間と７日間との期
間についてpH10とpH11とにおいて評価される。試料は、
試験ソマトトロピン2mg/mlを22℃で所定のpHの5mMNaHCO
3中に溶解して調製する。pHは25molar NaOHを添加して1
0又は11に調整する。試料を22℃に保ち、サンプルを、
初めと３日後と７日後に、逆相高性能液体クロマトグラ
フで分析する。pH10及びpH11で得られたデータをそれぞ
れ表２及び３に示す。データは面積パーセントで報告さ
れている。検出不能の量はndで示される。ピーク１はア
スパラギン98で切断されたソマトトロピンの２本鎖型の
量を示す。ピーク２は残基98におけるベータ結合したア
スパラギン酸ソマトトロピンの量を示す。ピーク３は不
明の化合物を示す。BGH及びBGH−Gln98ソマトトロピン
はいずれも−１位にメチオニンを有している。PGH及びP
GH−Gln98ソマトトロピンはいずれも−１位にアラニン
を有している。
データは、正常なソマトトロピンは、高pHにおいて著
しい量の２本鎖及びベータ結合の副生成物を経時的に形
成して、不安定であり、これに対し、このGln98ソマト
トロピンは２本鎖又はベータ結合のいずれの副生成物
も、検出できる量を形成せず、安定であることを示す。
この発明を典型的な例により説明したが、それはこれ
に限定されない。この発明の開示の目的で選択された例
は、この発明の精神及び範囲を離れないような変更及び
修飾を行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＥＸ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ビオランド，バーナード ノーマン アメリカ合衆国 63038 ミズーリ州 グレンコウ，ウッズ ベンド レーン 1710 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/18 C12P 21/02 C07K 14/61 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】変異ソマトトロピンであって、哺乳類のソ
    マトトロピンの95−101位の間に位置するアスパラギン
    がグルタミンに入れ替えられているソマトトロピン。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のソマトトロピンであっ
    て、ソマトトロピンがウシソマトトロピンであるソマト
    トロピン。
  3. 【請求項３】請求項２に記載のソマトトロピンであっ
    て、98位にあるアスパラギンがグルタミンに入れ替えら
    れているソマトトロピン。
  4. 【請求項４】請求項３に記載のソマトトロピンであっ
    て、メチオニン及びフェニルアラニンをマイナス１位及
    び１位にそれぞれ有するソマトトロピン。
  5. 【請求項５】請求項３に記載のソマトトロピンであっ
    て、アラニン及びフェニルアラニンをマイナス１位及び
    １位にそれぞれ有するソマトトロピン。
  6. 【請求項６】請求項５に記載のソマトトロピンであっ
    て、バリンを126位に有するソマトトロピン。
  7. 【請求項７】請求項１に記載のソマトトロピンであっ
    て、ソマトトロピンがブタソマトトロピンであるソマト
    トロピン。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のソマトトロピンであっ
    て、98位のアスパラギンがグルタミンに入れ替えられて
    いるソマトトロピン。
  9. 【請求項９】請求項８に記載のソマトトロピンであっ
    て、アラニン及びフェニルアラニンをマイナス１位及び
    １位にそれぞれ有するソマトトロピン。
  10. 【請求項１０】ヒト以外の哺乳動物の成長を促進する方
    法であって、ヒト以外の哺乳動物を、哺乳類のソマトト
    ロピンであってその95−101位の間に位置するアスパラ
    ギンがグルタミンに入れ替えられているソマトトロピン
    の有効量で処置することを含む方法。
  11. 【請求項１１】請求項10に記載の方法であって、ソマト
    トロピンがブタソマトトロピンであり、哺乳動物がブタ
    である方法。
  12. 【請求項１２】請求項10に記載の方法であって、ソマト
    トロピンがウシソマトトロピンであり、哺乳動物がウシ
    である方法。
  13. 【請求項１３】ヒト以外の哺乳動物の乳産生を増加する
    方法であって、哺乳類のソマトトロピンであってその95
    −101位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに入
    れ替えられているソマトトロピンの有効量を投与するこ
    とを含む方法。
  14. 【請求項１４】請求項13に記載の方法であって、ソマト
    トロピンがウシソマトトロピンであって哺乳動物が酪農
    乳牛である方法。
  15. 【請求項１５】哺乳類のソマトトロピンをコードするDN
    Aシーケンスであって、ソマトトロピンの95−101位の間
    に位置するアスパラギンのためのコドンがグルタミンの
    ためのコドンに入れ替えられているDNAシーケンス。
  16. 【請求項１６】請求項15に記載のDNAシーケンスであっ
    て、ソマトトロピンがウシソマトトロピンであるDNAシ
    ーケンス。
  17. 【請求項１７】請求項16に記載のDNAシーケンスであっ
    て、98位においてグルタミンをコードするDNAシーケン
    ス。
  18. 【請求項１８】請求項17に記載のDNAシーケンスであっ
    て、メチオニン及びフェニルアラニンをそれぞれマイナ
    ス１位及び１位においてコードするDNAシーケンス。
  19. 【請求項１９】請求項18に記載のDNAシーケンスであっ
    て、アラニン及びフェニルアラニンをそれぞれマイナス
    １位及び１位においてコードするDNAシーケンス。
  20. 【請求項２０】請求項19に記載のDNAシーケンスであっ
    て、バリンを126位においてコードするDNAシーケンス。
  21. 【請求項２１】請求項15に記載のDNAシーケンスであっ
    て、ソマトトロピンがブタソマトトロピンであるDNAシ
    ーケンス。
  22. 【請求項２２】請求項21に記載のDNAシーケンスであっ
    て、グルタミンを98位においてコードするDNAシーケン
    ス。
  23. 【請求項２３】請求項22に記載のDNAシーケンスであっ
    て、アラニン及びフェニルアラニンをそれぞれマイナス
    １位及び１位においてコードするDNAシーケンス。
  24. 【請求項２４】請求項15に記載のDNAシーケンスであっ
    て、グルタミンをコードするコドンがCAAであるDNAシー
    ケンス。
  25. 【請求項２５】請求項15に記載のDNAシーケンスであっ
    て、グルタミンをコードするコドンがCAGであるDNAシー
    ケンス。
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