JP2677795B2 - 二つのイオン形式から成るソマトメジンｃの精製および単離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は二つの異なつたイオン形式から成るポリペプ
チドホルモンソマトメジンＣを精製および単離する方法
ならびに純粋なイオン形式のそれぞれを含有する配合物
に関する。 ソマトメジンは成長ホルモンの作用を仲介するポリペ
プチドホルモンの一つの科に属し、そしてこれらはまた
インシユリン様の生物学的作用を示すものである。血漿
から同種性に関し精製すべきこの科における第一のポリ
ペプチドはインシユリン様成長因子１および２（IGF−
１およびIGF−２）と称された。 血漿から単離されたIGF−１の完全なアミノ酸配列順
序はリンダークネヒト（Rinderknecht）およびハンベル
（Humbel）により報告され、そしてプロインシユリンに
相応するものであることが示された（J.Biol.Chem.,25
3:2769〔1980年〕）。血漿から単離されたソマトメジン
Ｃ（SmC）はIGF−１に対するアミノ酸配列順序において
同一であることが示された〔クラツパー他（Klapper et
al.）の「内分泌学（Endocrinology）」112:6,2215〔1
983年〕）。 SmC/IGF−１は位置６−48、18−61および47−52にお
いてジスルフイド架橋を有する長さ（length）における
ポリペプチド70アミノ酸残基である。そのアミノ酸配列
順序に基づくSmC/IGF−１の予測pIは約8.6である。 スボボダ（Svoboda）およびその共同研究者はヒト血
漿のコーン（Cohn）フラクシヨンIVからSmCを精製する
手順を報告した（「生化学（Biochemistry）」19:790−
797〔1980年〕。この手順は、酸−抽出;0.2M NaCl、0.4
M NaClおよび最終的なpH値5.0、6.0および9.0を有するp
H段階勾配（step gradient）を伴う「SP−セフアデツク
スＣ−25」に対するカチオン−交換クロマトグラフイ
ー；「セフアデツクスＧ−50」カラムに対するサイズ排
除クロマトグラフイー；フラツトベツド・アイソフオー
カシング（flatbed isofocusing）ならびに逆相液体ク
ロマトグラフイーを包含していた。この方法により調製
されたSmCはpI8.1−8.5を有するものと報告された。 コーネル（Cornell）およびバウダデイ（Boughdady）
は血漿からIGF−１およびIGF−２を精製するための各種
手順の結果について報告した（Prep.Biochem.,12
（１）:57〔1982年〕:Prep.Biochem.,14（２）:123〔19
84年〕）。これら方法の数種のものは「SP−セフアデツ
クスＣ−25」に対するカチオン−交換クロマトグラフイ
ー工程を用いていた。カラムからの溶離は、pH6.8の0.5
M酢酸アンモニウム緩衝液を、引き続いて0.12M NH₃（pH
9.6）を含有する0.06M酢酸アンモニウムを用いる段階的
勾配によつて行われた。活性物質はpH9.6のフラクシヨ
ン中に溶離していると報告された。 前述のいずれの文書も、SmC/IGF−１の異なつたイオ
ン形式が得られたということを示した「SP−セフアデツ
クスＣ−25」クロマトグラフフイー工程を用いる精製手
順を報告するものではなかつた。 エンベルグおよび共同研究者は、「CM−アフイゲル・
ブル（Affigel blue）」に対する親和クロマトグラフイ
ー；「セフアデツクスＧ−50」に対するサイズ排除クロ
マトグラフイー；「SP−セフアデツクスＧ−25」に対す
るカチオン−交換クロマトグラフイー；および逆相液体
クロマトグラフイーを包含した手順によるSmAの精製を
報告した（Eur.J.Biochem.,143:117〔1984年〕。カチオ
ン−交換クロマトグラフイー工程において、カラムから
の溶離はpH/モル濃度4.9/0.14、5.3/0.17および7.8/0.2
0を伴う三工程において酢酸ナトリウムの組合わせpH/塩
勾配を用いて行われた。この方法により得られたSmAは
位置40におけるアミド分解グルタミン残基についての例
外を伴うこともあるが、IGF−１と同一であることが報
告された。 最近、二つのグループがヒトSmCについて合成遺伝子
コーデイング（synthetic genes coding）を伴う微生物
形質転換細胞におけるSmCの合成を報告している〔ビユ
エル他（Buell et al.）Nuc.Acids Res.,13（６）:1923
〔1985年〕；欧州特許公告番号0 123 228号〕。いずれ
の刊行物もSmCの異なつたイオン形式の単離については
報告していない。 本発明は二つのイオン形式を有するソマトメジンＣを
分離および単離する方法を提供するものである。本発明
の教示によれば、精製または部分的に精製されたソマト
メジンＣの水溶液をSmCが安定であるpHにおいて強力カ
チオン−交換カラムに適用する。次いで、このSmCはカ
ラムに対し塩水勾配を付することにより一定のpHにおい
てカラムから溶離される。次に、この二種類のイオン形
式のもの（pIの8.3−8.6および6.7−7.0）は異なつた溶
離剤フラクシヨン中で回収される。 更に本発明によつてpI約8.3−8.6を有するソマトメジ
ンＣを含み、本質的にアミノ酸位置26において脱アミド
残基を伴わない成長促進組成物と、薬学的に受容可能な
担体ビヒクルとを含んで成る組成物が提供される。 本発明の他の実施態様においては、pI約6.7−7.0を有
し、かつ位置26においてアスパラギン酸残基を有し、ま
た位置26におけるアスパラギン残基を有するソマトメジ
ンＣを本質的に含まないソマトメジンＣと、薬学的に受
容可能な担体物質とを含んで構成される成長促進組成物
が提供される。 本発明は、ソマトメジンＣが二つの明瞭なイオン形
式、すなわち一方はpI約8.3乃至8.6を有するもの、そし
て他方はpI約6.7乃至7.0を有するものにおいて単離可能
であるという発見に基づいている。この二つのイオン形
式のものは天然供給源、すなわち血漿から得られたSmC
からも単離可能であり、あるいはそれらはSmCに関する
発現可能な組換え体遺伝子コーデイングを伴う微生物形
質転換細胞中で合成されたSmCからも単離することがで
きる。本発明の単離工程にかけるに先立つて、SmCはそ
の供給源物質から少なくとも部分的に、好ましくは略同
質性となるように精製するものとする。本明細書中で用
いられるように、用語「SmC」はその意味においてIGF−
１と同一であるものと考えられる。 本発明方法において出発原料として有用なSmCは、既
知の蛋白質精製手順を用いてヒト血漿のコーン・フラク
シヨンIVから精製することができる（たとえば、スボボ
ダ他の「生化学（Biochemistry）」19:790〔1980年〕；
コーネル、エツチ、ジエー、およびバウダデイ、エヌ、
エム、のPrep.Biochem.,14（２）:123〔1983年〕参
照）。 本発明の方法はまた、SmCについて発現可能な遺伝子
コーデイングを伴う発現ベクターにより形質転換された
微生物宿主内で合成されたSmCと関連して実施すること
も可能である。以下に説明する作業は、ヒトSmC（rhSm
C）であつて、pGB725により形質転換されたE.coli HB10
1細胞、ソマトメジンＣの正確な70−アミノ酸配列に関
してコーデイングする合成遺伝子（210−b.p.）を伴う
プラスミドベクター、および付加的なメチオニン残基に
関してコーデイングする５′端におけるATG出発コドン
から合成されたものと共に実施した。この合成遺伝子は
変性５′端を有しており、ここにおいて天然DNAのコド
ン以外のコドンがE.coli.における有効な発現に関して
選択された。このプラスミドはビユエル他のNuc.Acids
Res.,13（６）:1923〔1985年〕により説明される方法に
よつて構成された。この遺伝子はバクテリオフアージλ
の強力な左方向ブロモーター（P_L）の制御下にあり、か
つバクテリオフアージmuのner遺伝子から誘導されたリ
ボソーム結合部位（binding site）を含んでいる。宿主
細胞はまたプラスミドpCI857であつて、温度感受性リプ
レツサー蛋白質についてコーデイングするものを有して
いるので、遺伝子発現は培養基の温度を約42℃以上に高
めることにより誘導することができ、それによつてリプ
レツサーを不活性化する。 pGB725中の合成SmC遺伝子インサートのDNA配列および
rhSmCのエンコードしたアミノ酸配列は第１図中に示さ
れている。pGB725の部分的制限マツプは第２図中に示さ
れている。pGB725およびpCI857により形質転換されたE.
coli HB 101〔hsd,recA,ara,proA,lacY,galK,rpsL,xyL,
mtl,supE〕は受入No.ATCC 33694をもつてメリーランド
州、ロツクヴイルのアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（American Type Culture Collection）に
寄託された。 このrhSmCはE.coli.細胞から回収可能であり、かつそ
れを本発明方法に適用する前に、従来の蛋白質精製方法
のいずれかによつて精製することができる。 好ましい方法において、それらの細胞を含有する発酵
ブイヨンは遠心分離され、そして細胞は湿潤細胞ペース
トとして回収される。次に、これらの細胞は細胞切断用
の適切な緩衝液、たとえばリゾチーム緩衝液（0.1Mトリ
ス−HCl、5mMβ−メルカプトエタノール、10mM EDTA、5
mMベンズアミジン−HCl、0.2mg/ml、リゾチーム、pH7.
5）中に再懸濁させる。次いで、再懸濁させた細胞を機
械的に、たとえばマントン−ゴーリン（Manton−Gauli
n）ホモジナイザー内で溶解させる。溶解させた細胞は
遠心分離され、そしてrhSmCを含む封入ペレツトが回収
される。この封入ペレツトはpH7.5の0.1Mトリス−HCl、
5mMβ−メルカプトエタノール、10mM EDTA中で一度洗浄
する。次に、このrhSmCは6Mのグアニジンヒドロクロリ
ド内に抽出され、かつ溶解（変性）される。 次いで、このグアニジン溶液を冷緩衝液中で10倍に稀
釈すると、溶解rhSmCは可溶性の天然の配置のものに再
生される。この溶液を遠心分離し、かつ沈殿したペレツ
トは廃棄する。このrhSmCは硫酸アンモニウム沈殿によ
り回収される。非塩含有緩衝液に対する透析による塩除
去の後、rhSmCはDEAE−「セフアロース（Sepharose）CL
6B」カラムに対するアニオン交換クロマトグラフイーお
よび引き続く「セフアデツクスＧ−50」カラムに対する
ゲル濾過クロマトグラフイーにより精製される。ゲル濾
過カラムから得られた精製rhSmCは本発明方法による二
つのイオン形式に再溶解させるのに適している。しかし
ながら、精製の式型は本発明の単離手順に対し予備的な
ものであること、またその代わりに各種の他の精製式型
のいずれもが使用可能であることを理解すべきである。 本発明の方法によれば、精製SmCの水溶液は強力なカ
チオン−交換カラムに適用される。強力カチオン−交換
カラムは一般に固体サポートに結合されているものであ
り、配位子は２よりも小さいが、あるいは略２に等しい
pKa値を有している。本発明の実施に際して利用するの
に好ましいカチオン−交換カラムは、配位子上の官能基
がスルホン酸基であるものである。特に好ましいカチオ
ン−交換カラムは、「SP−セフアデツクスＣ−25」とし
て知られており、かつニユージヤージー州ピスキヤタウ
エイのフアーマシア・インコーポレーテツド（Pharmaci
a,Inc.,）より市販されている。「SP−セフアデツクス
Ｃ−25」はデキストラン・サポートに結合されたスルホ
プロピル基を含んでいる。 このSmCは緩衝液中で、蛋白質が安定なpH、すなわちp
H約4.5乃至6.5においてカチオン−交換カラムに対し充
填される。次に、このカラムに対し結合することになる
SmCは、カラムに対し塩水勾配（aqueous salt gradien
t）を適用することにより、本質的に一定のpHにおいて
カラムから溶離される。「本質的に一定」とは、そのpH
が溶離中に約0.2を超えて変動することを許容しないこ
とを意味するものとする。溶離pHは、カラムに充填され
るSmC溶液のpHと同一、すなわち4.5乃至6.5が好まし
く、最も好ましいのは約5.5である。 溶離緩衝液中で使用するのに好ましい塩は酢酸アンモ
ニウムであり、それは酢酸アンモニウムがSmCからの除
去に関して容易に揮発するからである。しかし、限定さ
れるものではないが、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、
ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウムおよびギ酸カリウム
を含む他の塩類を用いてもよい。 濃度勾配は溶離緩衝液塩濃度の連続的な漸次的変化ま
たは段階的な漸次的変化によつて得ることができる。好
ましいのは濃度約10mMで開始され、かつ約200mMで終結
する塩濃度勾配を適用することによりSmCがカラムから
溶離されることである。溶離剤は、それがカラムを去る
ときフラクシヨン中で収集される。各種溶離フラクシヨ
ン中のSmC活性は如何なる便利な方法、たとえばラジオ
イムノアツセイまたはラジオレセプターアツセイにより
決定することができる。 SmCの二種類のイオン形式は異なつた溶離剤フラクシ
ヨンで溶離する。カラムを酢酸アンモニウム（pH5.5）
で溶離したとき、SmCの第一イオン形式のものは約50mM
乃至約60mMの酢酸アンモニウム濃度を有する溶離剤フラ
クシヨン中に回収され、一方SmCの第二イオン形式のも
のは約90mM乃至110mMの酢酸アンモニウム濃度を有する
溶離剤フラクシヨン中に回収される。前者のイオン形式
はpI6.7−7.0を有し、また後者はpI8.3−8.6を有してい
た。各イオン形式のものは従来の手段、たとえば透析を
利用する塩除去によりそれらの各溶離緩衝液フラクシヨ
ンから回収することができる。酢酸アンモニウムの場
合、溶離緩衝液塩は揮発により容易に回収可能である。
所望により、二種のイオン形式のいずれをも使用時の再
構成のための従来方法により凍結乾燥させることもでき
る。 pI8.3−8.6のSmCであつて、本発明方法により他のイ
オン形式を含まないで回収されるものは天然の配列SmC
（予測pI8.6）に対応する。低級（lower）−pI形式は、
生体内の天然配列物質から生成されたものか、あるいは
精製の人工物として生成されたものか確認されていな
い。低級−pI物質は、通常存在するアスパラギン残基を
アスパラギン酸残基に変換するアミノ酸位置26における
脱アミドにより、高級（higher）−pI（天然配列）物質
とは異なつているものと考えられる。この低級−pI物質
は、有り得べき脱アミド形式であつて、エンベルグおよ
び共同研究者（上記参照）により同定され、グルタミン
の位置40における推定上の脱アミド部位を含んでいたも
のから区別される。 位置26におけるアスパラギン残基のアミド基はより不
安定な量のオーダーであり、従つて位置27におけるリジ
ン残基のε−アミノ基の並列に起因する位置15および40
におけるグルタミン残基の対応グループよりも脱アミド
しがちである。 本発明方法により単離された両イオン形式のものは胎
盤ラジオレセプターおよび繊維芽細胞成長アツセイにお
いて生体内の生物学的活性を示す。しかし、成長促進剤
として投与されることになる特定のイオン形式は特定の
適用または投与のモードに依存してもよい。Asn（26）
において脱アミドが生体内で生ずること、およびこの事
象はその会合担体蛋白質からのSmCの解放に関連するも
のであることが考えられる。SmCは担体蛋白質に関連し
て血漿中に運搬され、かつその標的細胞のその部位にお
ける担体蛋白質から解放されねばならない。 従つて、もしSmCが、血管系を経由する運搬を必要と
する投与のモードによつて投与すべきである場合には、
本質的に脱アミド形式を含まない天然配列（高級pI）物
質を投与することが好ましいかも知れない。また、SmC
を標的組織の部位に直接投与すべき場合は、脱アミド形
式の低級pIであつて、位置26にアスパラギンを有する天
然配列物質を本質的に含まないものが好ましいかも知れ
ない。 二種類のイオン形式のSmCは成長促進剤として、たと
えば下垂体前葉侏儒の処置または創傷の治癒を容易にす
るために投与することができる。獣医学の用途において
は、SmCをウシ類の成長速度および飼料の利用を増加さ
せるために投与することもできる。このSmCは単独また
は他の成長促進物質、たとえばヒト成長ホルモン、上皮
成長因子等と関連させて投与することも可能である。 SmCは動物またはヒト被験者への投与のために凡ゆる
適切な形式において、成長促進量をもつて投与される。 本発明の一実施態様において、pI約8.3−8.6を有し、
アミノ酸位置26において脱アミド残基を有するソマトメ
ジンＣを本質的に含まないソマトメジンＣの成長促進量
と、薬学的に受容可能な担体ビヒクルとを含んで構成さ
れる成長促進組成物が提供される。この薬学的担体は、
たとえばpH約4.5乃至6.5を有する滅菌緩衝水溶液であ
る。担体物質はまた、局所施用に関しては従来のクリー
ムまたは軟膏ベースのものであつてもよい。 本発明の他の実施態様において、pI約6.7−7.0を有
し、かつアミノ酸位置26において脱アミド残基を有する
天然配列のソマトメジンＣを本質的に含まないソマトメ
ジンＣの成長促進量と、薬学的に受容可能な担体物質と
を含んで構成される成長促進組成物が提供される。薬学
的担体は、たとえばpH約4.5乃至6.5を有する滅菌緩衝水
溶液であればよい。その担体物質はまた、局所施用に関
しては従来のクリームまたは軟膏ベースのものであれば
よい。 以下の実施例は本発明の別の実施を例示するものであ
るが、どのような形においてもその範囲の限定を意図す
るものではない。 実施例 １ E.coli HB101（pGB725およびpCI857）、ATCC 33694を
４％グリセロール、２％カサミノ酸（casamino acid
s）、0.3％酵母エキストラクトおよび塩（pH7.0）なら
びに30％飽和とする酸素を含む培地における10−リツト
ル発酵槽内で培養した。接種に引き続き、細胞を24時間
28℃で発酵させ、その間にrhSmC遺伝子の時間発現（tim
e expression）を、プラスミドpCI857についてコード化
したリプレツサー蛋白質によつて抑制した。次いで、温
度を42℃に上昇させて、リプレツサー蛋白質を不活性化
し、それによりpGB725に対するrhSmC遺伝子の発現を誘
導した。誘導には増殖培地の10％添加を伴つた。42℃に
おける培養３時間後に、これらの細胞を遠心分離により
採取した。 湿潤細胞ペースト（280g）をリゾチーム緩衝液（pH7.
5、1200ml）中に再懸濁させた。次いで、細胞をしてマ
ントン−ゴーリン・ホモジナイザーを通過することによ
り溶解し、そして6000xgで遠心分離した。ペレツト（30
g）をpH7.5の0.1Mトリス−HCl中で洗浄し、そして6Mの
グアニジン−HCl（pH7.5）300ml中に抽出した。60分
後、変性蛋白質は、グアニジン−HClにpH7.5の0.1Mトリ
スHCl、10mMのβ−メルカプトエタノール、50g/L（N
H₄）₂SO₄緩衝液（０℃）の3500mlを添加することによつ
て再生させた。再生蛋白質の溶液を5000xgで遠心分離
し、そして析出物を廃棄した。このrhSmCは3.0mMの硫酸
アンモニウムを用いる沈殿によつて回収された。回収さ
れた蛋白質（0.42g）は10容量の0.1Mトリス−HCl、5mM
のβ−メルカプトエタノール、6Mの尿素（8.4）に対し2
x透析した。次に、この蛋白質を25cm×100cmの「DEAE−
セフアロースCL6B」アニオン−交換カラムに充填した。 これに「セフアデツクスＧ−50」５×100cmに対する
ゲル濾過クロマトグラフイーが引き続いた。これらのカ
ラムはpH5.5の0.85M酢酸アンモニウムによつて溶離され
た。ピーク・フラクシヨンが収集され、かつ２リツトル
の水に対し2x透析し、次いで凍結乾燥した。 次に、このrhSmCについて蛋白質前処理した0.7cm×10
cm「SP−セフアデツクスＣ−25」カラム上でクロマトグ
ラフを行つた。 このrhSmC（1.08mg）をpH5.56の10mM酢酸アンモニウ
ム中に溶解して1mg/mlとし、そしてカラム上に充填し
た。次いで、速度0.34mM/分における酢酸アンモニウム1
0mMから200mMの線状勾配を適用することによつてrhSmC
をカラムから溶離させた。そのpHは溶離工程の間中一定
のままであつた。11分のフラクシヨン（3.96ml）を収集
した。溶離は最終緩衝液濃度、酢酸アンモニウム200m
M、pH5.5において一晩中全てに平等に継続した。第３図
は４個の明白なピークを示すクロマトグラフである。下
記のフラクシヨンを分析のためにプールし、かつ濃縮し
た。 プールしたフラクシヨンのSDS−ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動はNo.1および７を除き、全てのフラクシ
ヨンがrhSmCに対応する主バンドを含むことを示した。
各プール・フラクシヨンからのアリコートはアミノ酸分
析のために24時間加水分解した。SmC中のアミノ酸の理
論モル比と、これらの結果の比較は主要プール・フラク
シヨンNo.4、５および６が期待値と非常に一致している
こと、そしてプール・フラクシヨンNo.3は残基±１−３
の僅かな変動値を伴うが、SmCとは一致することを示し
た。プール・フラクシヨンNo.1、２および７に関するデ
ータは、これらのフラクシヨンがrhSmCではない主要ペ
プチド含んでいることを示した。 プール・フラクシヨンNo.3乃至７は、胎盤SmCレセプ
ターアツセイに関するラジオレセプター・アツセイによ
りSmC活性を検定した〔マーシヤル、アール、エヌ、他
（Marshall,R.N.et al.）1974年「ヒト胎盤細胞膜内の
インシユリンおよびソマトメジンＣレセプターの特性
（Characterization of the Insulin and Somatomedin
−C Receptors in Human Placental Cell Membrane
s）」、J.Clin.Endoc.and Mitab.,39:283−292〕。結果
はプール・フラクシヨンNo.3乃至６が高い緩和性をもつ
て、全て胎盤レセプターに結合することを示した。 全ての溶離されたフラクシヨン中のSmC種についてのp
I値は、プールされたピーク・フラクシヨンのIFE分析に
より確認された。プールNo.3はSmCを構成し、pIは6.7−
7.0であり、またプールNo.4−６はSmCであつて、pIは8.
3−8.6である。

【図面の簡単な説明】 第１図はpGB725における合成SmC遺伝子インサートのDNA
配列およびそのエンコードしたアミノ酸配列を示す図、
第２図はpGB725の部分的制限マツプ図、そして第３図は
「SP−セフアデツクスＣ−25」に対するSmCのクロマト
グラフイーにより得られたクロマトグラフ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/65 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＡ

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．pH約4.5乃至約6.5において、精製もしくは部分的に
   精製したソマトメジンＣの水溶液を、固体サポートであ
   って、配位子がpka２を有するイオン化基を含むもの
   に結合されているカチオン−交換カラムに適用する工程
   と、塩水勾配を前記カラムに施用することにより本質的
   に一定のpHにおいて該カラムからソマトメジンＣを溶離
   する工程と、異なつた溶離剤フラクシヨンにおいてソマ
   トメジンＣの二種類のイオン形式のものを回収する工程
   を備えた、二つのイオン形式のソマトメジンＣを分離及
   び単離する方法。 ２．配位子のイオン化基がスルホン酸である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３．カチオン−交換カラムがデキストラン・サポートに
   スルホプロピル基が結合しているものである特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ４．精製ソマトメジンＣの水溶液がpH約5.5においてカ
   チオン−交換カラムに適用される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ５．カラムに対し、酢酸アンモニウム水溶液の濃度勾配
   を適用することにより前記カラムからソマトメジンＣが
   溶離される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６．濃度勾配がカラムに対し連続的に適用される特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 ７．濃度勾配がカラムに対し段階的方法により適用され
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８．酢酸アンモニウムの濃度勾配が10mMから200mMであ
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９．第一のイオン形式のソマトメジンＣが酢酸アンモニ
   ウム濃度約50mM乃至約60mMを有する溶離剤フラクシヨン
   から回収され、また第二のイオン形式のソマトメジンＣ
   が酢酸アンモニウム濃度約90mM乃至約110mMを有する溶
   離剤フラクシヨンから回収される特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 １０．pI約6.7−7.0を有し、かつアミノ酸位置26におい
   て脱アミド残基を有し、また位置26におけるアスパラギ
   ン残基を有するソマトメジンＣを本質的に伴わないソマ
   トメジンＣと、薬学的に受容可能な担体物質とを含んで
   構成される成長促進組成物。 １１．pI約6.7−7.0を有するソマトメジンＣは、酢酸ア
   ンモニウム約50mM乃至約60mMを含んでいる水溶液である
   特許請求の範囲第10項記載の成長促進組成物。