JPH05252936A - 大腸菌及びシュードモナスに於ける正確に処理されたヒト成長ホルモンの分泌 - Google Patents

大腸菌及びシュードモナスに於ける正確に処理されたヒト成長ホルモンの分泌

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JPH05252936A
JPH05252936A JP4276348A JP27634892A JPH05252936A JP H05252936 A JPH05252936 A JP H05252936A JP 4276348 A JP4276348 A JP 4276348A JP 27634892 A JP27634892 A JP 27634892A JP H05252936 A JPH05252936 A JP H05252936A
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グレゴリイ・ローレンス・グレイ
Herbert L Heyneker
ヘルベルト・ルイス・ヒンケル
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、シグナルペプチドを有するヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ，プレヒト成長ホルモン）の大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びシュードモナス（Pseudomonas ）
内での産生、並びにシグナル配列をタンパクのｈＧＨ部
分から開裂して成熟ｈＧＨを生成するための細菌宿主に
よる未処理（プレ）タンパクのプロセッシングに係る。 【構成】 ヒト成長ホルモンを含有する組換え原核生物
宿主細胞であって、前記ホルモンのアミノ酸配列が天然
に存在するヒト成長ホルモンのアミノ酸配列から成り、
前記ホルモンはその天然環境で付随する他のタンパクを
含んでおらず、かつ外来のＮ−末端メチオニンを有する
成熟ヒト成長ホルモンも含んでおらず、前記ホルモンは
前記原核生物宿主によって産生されたものであることを
特徴とする組換え原核生物宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、シグナルペプチドを有するヒト
成長ホルモン（ｈＧＨ，プレヒト成長ホルモン）の大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びシュードモナス（Pseudomonas
）内での産生、並びにシグナル配列をタンパクのｈＧ
Ｈ部分から開裂して成熟ｈＧＨを生成するための細菌宿
主による未処理（プレ）タンパクのプロセッシングに係
る。
【０００２】ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）はヒト下垂体
で分泌される。ｈＧＨは成熟形態では１９１個のアミノ
酸からなり、分子量が約２１，５００であり、従ってイ
ンシュリンの３倍以上も大きい。組換ＤＮＡ技術が出現
する前のｈＧＨは限られた入手源、即ちヒトの死体の下
垂体からやっかいな抽出によってしか得られなかった。
ｈＧＨはやけど、創傷の癒合、ジストロフィー，骨の癒
着，胃の散在性出血及び偽関節症の処置に有効であるこ
とが提案されていたにもかかわらず、前記のようにこの
物質は少量でしか得られないためその応用は下垂体機能
低下小人の治療に限られていた。実際、手に入り得るデ
ータから見積ると、組織から得られるｈＧＨは下垂体機
能低下小人患者の約５０％に対処する量でしかない。こ
のようにｈＧＨを他の用途に利用することは不可能であ
る。
【０００３】近年、組換宿主細胞，特にＥ．ｃｏｌｉに
よって下垂体機能低下小人及びｈＧＨが有効な他の症状
の処置に充分な量でｈＧＨを産生し得ることが開示され
た。例えば米国特許第４，３４２，８３２号参照。この
ような技術の進歩は後述の理由でｈＧＨによって改善さ
れる見込みのある病状等に悩む人々にとっては恵みとな
るが、米国特許第４，３４２，８３２号の方法を使用し
て得られるｈＧＨは、天然のｈＧＨには見られないアミ
ノ酸メチオニンがタンパクのＮ−末端に付いたｈＧＨを
少なくとも実質的な量で含有する。この多少異なるｈＧ
Ｈが感受性の個体に対する何らかの重大で望ましくない
副作用を生ずるかどうか証拠はないが、ともかくその構
造は「成熟」ｈＧＨとは異なるものである。ヒトの体内
で産生されるホルモンとは多少異なるホルモン，例えば
牛や他の動物の組織から抽出して得られた種々のインシ
ュリンが多年に亘りヒトの病気の治療に有効に使用され
てきた。それにもかかわらず、組換ＤＮＡ技術の出現に
よって、体内で産生されるインシュリンと正しく同じア
ミノ酸配列を有するインシュリンを得ることが可能にな
った。これによって科学的のみならず医学的にも大きく
進歩した。即ち、ヒトインシュリンの製造方法を利用す
ることによって、動物のインシュリンを摂取した糖尿病
患者に起こる有害な副作用の危険が低下するからであ
る。従って、天然に存在するものとは少しだけ異なる活
性形態のｈＧＨが利用できるにもかかわらず、アミノ酸
含量に於いて下垂体が産生するｈＧＨの１９１個のアミ
ノ酸だけから成るｈＧＨを有利に取得する必要性があ
る。更に、本発明はｍｅｔのないｈＧＨを産業上利用し
得る量で産生する方法を開示する。
【０００４】形質転換した微生物宿主中で異種ｈＧＨを
発現するためのベクターを得るのに組換ＤＮＡ技術を使
用することは今では充分に確立された科学である。この
分野での最初の成功は、グラム陰性菌Ｅ．ｃｏｌｉの菌
株，例えばＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株２９４を用いて達成
された。
【０００５】しかしながら、複雑な異種ポリペプチドを
得るために微生物宿主としてＥ．ｃｏｌｉを使用するこ
とには制限がある。比較的小さいポリペプチドは、宿主
によって減成分解されるのを防ぐため、標的ポリペプチ
ドが大きいポリペプチドの１部として産生される融合タ
ンパクとして得なければならない。多くの場合、融合タ
ンパクとして産生された小タンパクは大きい分子から何
らかの方法で開裂して有用な産物を得なければならな
い。
【０００６】大きい異種タンパクは細胞によって減成さ
れることがなく、適切に配置された開始コドンを含む直
接発現用遺伝子が適切なプロモーター遺伝子，例えば良
く知られたｌａｃプロモーターに結合されていれば直接
に産生することができる。ｍＲＮＡのコード配列の翻訳
開始シグナルは、アミノ酸メチオニン（Ｍｅｔ）をコー
ドしているＡＴＧ遺伝子コドンから生成したＡＵＧであ
る。原核生物のあるものは得られるタンパクのＮ−末端
Ｍｅｔを除去しないので、細菌宿主中細菌のプロモータ
ーの制御下で異種ＤＮＡを発現させると時々第一アミノ
酸がメチオニンであるようなタンパクが得られる。例え
ばＥ．ｃｏｌｉでのｈＧＨ産生に関する今日までの結果
が示しているところでは、宿主細胞は細胞内でメチオニ
ンを開裂するという限られた能力しか有していない。
又、細胞外で開裂する便利な方法もない。従って、前記
したように、米国特許第４，３４２，８３２号の方法に
よって微生物内で発現したｈＧＨは、少なくとも実質的
な部分はメチオニン残基が付いている産物であり、この
メチオニンは、ある種の環境では、このタンパク産物を
治療用途に用いた場合異種タンパクとして認識させ得
る。
【０００７】天然に存在する多くのタンパクは通常の環
境では最初付加的なペプチド配列が付いた形で発現され
る。この付加的ペプチド配列により、タンパクはそれが
製造された細胞の細胞膜を通過し得るようになる。この
ようにして開裂されるこの付加的ペプチドは「シグナ
ル」ペプチドと称される。シグナル配列の遺伝子を含有
する異種遺伝子が細菌プロモーターの制御下に配置され
且つ細菌が細胞内でシグナル配列を開裂すると、メチオ
ニンの付いていない成熟タンパクが得られるであろう。
しかし、宿主によって開裂されないと、シグナル配列は
細胞外では容易に開裂できないので成熟タンパクの単離
が複雑になる。
【０００８】「未成熟」タンパク，即ちシグナル配列と
結合した所望のタンパクをＥ．ｃｏｌｉで産生しようと
いう努力が払われたが、Ｅ．ｃｏｌｉの如きグラム陰性
菌はこのタンパクのシグナル配列を有効に開裂処理しな
いことが示唆されている。小さいタンパクであるプレプ
ロインシュリンはＥ．ｃｏｌｉ中で部分的にプロセッシ
ングを受けてシグナルペプチドが除去されることが示さ
れた。しかしながら、線維芽細胞インターフェロン及び
白血球インターフェロンのような大きな分子ではうまく
いった例はない。線維芽細胞インターフェロンの場合
は、生物学的に活性な物質は産生されなかった（Tanigu
chi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 7
7, 5230〜5233 (1980) ）。白血球インターフェロンの
場合は、生物学的に活性な物質が産生されたが、輸送さ
れず又適格なプロセッシングもされなかった。
【０００９】予期に反し本発明者等は、プレ−ｈＧＨの
遺伝子、即ち成熟タンパクの１９１個のアミノ酸及びそ
のシグナルペプチドの２６個のアミノ酸をコードしてい
る遺伝子がグラム陰性菌中で発現されてプレｈＧＨが得
られ、このプレｈＧＨは次に細胞内でプロセッシングを
受けて成熟タンパクからシグナルペプチドが開裂される
ことを発見した（プレｈＧＨ又はプレタンパクとは、天
然環境下で所望タンパクを分泌させるシグナル配列を含
有する所望のタンパクを意味する）。その結果としてｈ
ＧＨが成熟形態で、天然環境では関連結合している他の
タンパクを含まない状態で得られる。即ち、本発明方法
を使用すると、ヒト由来のタンパクを含まないｈＧＨ
を、天然に存在するタンパクのアミノ酸配列に加えて余
分なメチオニンを含まない形態で産業上有用な量で得る
ことが可能になる。
【００１０】又、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉとＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓの両方及び他の原核生物細菌種で使用する
ことができる、未成熟タンパクの遺伝子の発現用複製可
能ベクターをも提供する。更に本発明は、このようなベ
クターで形質転換された原核生物宿主を提供する。
【００１１】従って本発明の目的は、組換ＤＮＡ技術に
よってｈＧＨを得るための改良方法である。
【００１２】他の目的は、天然の形態には見られない付
加的アミノ酸を含有しないｈＧＨを取得することであ
る。
【００１３】これらの目的及びその他の目的の達成は、
以下に記載する好ましい態様から明らかになるであろ
う。
【００１４】本発明の一般的手順は、宿主原核細胞内で
複製可能であり且つ発現を司どるＤＮＡに有効に（発現
するように）連結されている未成熟ｈＧＨの発現をコー
ドしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクター又はクロ
ーニングベヒクルの調製である。本明細書中で使用する
「原核生物」という用語は、核を含有せず従ってその染
色体が細胞質から分離されていない細胞を意味する。原
核生物は例えば細菌を包含するが酵母の如き有核微生物
は包含しない。
【００１５】特定的には、プラスミドは、プレｈＧＨを
発現し且つプレｈＧＨからシグナル配列を開裂処理する
という細菌宿主の能力を示すべくＥ．ｃｏｌｉ及びＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌株の双方を形質転換するために使
用し得る発現ベクターとして構築した。
【００１６】既に示されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ中
で異種ＤＮＡを発現すべく改良された基本的プラスミド
であるＥ．ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２は、広範囲
の宿主でクローン化されると、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
（Ｐｓ．）ａｅｒｕｇｅｎｏｓａ（ａ．）中に安定に維
持でき、同様にＥ．ｃｏｌｉプラスミドであるスルホン
アミド耐性（ＳｕR ），ストレプトマイシン耐性（Ｓｍ
R ）のプラスミドｐＲＳＦ１０１０も同じである。 Woo
d et al., J. Bacteriol., 14, 1448 (1981)及び Saka
gouchi, Current Topics in Microbiology and Immun
ology, 96, 31(1982) 参照。従ってｈＧＨをコードして
おり且つＥ．ｃｏｌｉとＰｓ．双方の菌株を形質転換す
るのに使用し得るプラスミドを得るために、タンパクの
発現用遺伝子を含有するハイブリッドプラスミドをｐＢ
Ｒ３２２及びｐＲＳＦ１０１０から調製した。
【００１７】未成熟ｈＧＨ，即ちシグナル配列の２６個
のアミノ酸に結合したｈＧＨの１９１個のアミノ酸の発
現をコードするプラスミドの構築を図１Ｂに示す。この
構築には、de Boer, H. et al., Promoters ： Structu
re and Function, eds. Rodriguez, R. and Chamberli
n, M. J. (Praeger, New York), 462-481 (1982) に記
載されているｐＢＲ３２２誘導体、即ちｐＨＧＨ２０７
−１を使用する。
【００１８】図１Ｂに示したｐＨＧＨ２０７−１をＥｃ
ｏＲＩで部分消化し、最大断片をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で精製した。この断片からＤＮＡポリメラー
ゼＫｌｅｎｏｗ断片を用いて第２鎖を合成（second str
and synthesis ）し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
して、ｔｒｐプロモーター‐リボゾーム結合部位とｈＧ
Ｈ構造遺伝子との接合部に唯一のＥｃｏＲＩ部位を有す
るプラスミドｐＨＧＨ２０７−１* を形成した。ｐＨＧ
Ｈ２０７−１* をＰｓｔＩで部分的に開裂し、最大断片
をポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。この断
片からＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片を用いて第
２鎖合成し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合して、ｈ
ＧＨ構造遺伝子中に唯一のＰｓｔＩ部位を有するプラス
ミドｐＨＧＨ２０７−１* −ＡＰＳを作成した。ｐＨＧ
Ｈ２０７−１* −ＡＰＳをＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで完
全に消化し、最大断片をポリアクリルアミドゲルを用い
るゲル電気泳動によって精製した。この断片はｔｒｐプ
ロモーターと成熟ｈＧＨ遺伝子の５′端を含有してい
る。
【００１９】図１Ｂに示した第２のプラスミドｐＨＧＨ
ｃＤＮＡを Martial et al., Science , 205, 602-
606 (1979)に記載の如く調製し、ＨｐａIIで処理してｈ
ＧＨのシグナルペプチドＤＮＡ配列と成熟ｈＧＨのアミ
ノ末端部分との大部分をコードしている４６２塩基対
（ｂｐ）断片を切除した。この断片をポリアクリルアミ
ドゲルを用いるゲル電気泳動で精製した。この断片をＰ
ｓｔＩで消化してｈＧＨのシグナルペプチドＤＮＡ配列
と成熟ｈＧＨのアミノ−末端部分との大部分をコードし
ている１９２ｂｐ断片を切除した。この断片をポリアク
リルアミドゲルを用いるゲル電気泳動によって精製し
た。
【００２０】図１Ａに未成熟ｈＧＨのシグナルポリペプ
チドのアミノ酸配列とｍＲＮＡ配列とを示す。この配列
は細菌中での翻訳開始シグナルとなるｆ−Ｍｅｔのコド
ンＡＵＧを有しており、更に５′端近くにＨｐａII部位
を有している。シグナル配列の遺伝子を完全にすると共
にＥｃｏＲＩ及びＨｐａII部位を形成するために、図１
Ｂに示す２個の合成オリゴヌクレオチドをCrea, Proc.
Nat′l . Acad. Sci ., USA , 75, 5765 (1978)
の改良トリエステル法で合成した。２個の合成オリゴヌ
クレオチドの各５μｇの試料をGoeddel et al., Proc.
Nat′l . Acad. Sci. USA, 76, 106 (1979)に記載の如
くＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［γ−32Ｐ］ＡＴ
Ｐ（ＮＥＮ）を用いてリン酸化した。次にこれら反応生
成物を混合し、９０℃で５分間加熱し、次いで２２℃に
冷却することで２個の分子をアニールした。
【００２１】断片ｐＨＧＨ２０７−１及びｐＨＧＨｃＤ
ＮＡ並びに合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４リガーゼを
用いる３断片結合法（three way ligation）によって結
合して図１Ｂに示すプラスミドｐＰｒｅＨＧＨ２０７−
１を得た。このプラスミドｐＰｒｅＨＧＨ２０７−１を
Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株２９４（Ｅ．ｃｏｌｉ２９４）
中でクローン化した。このＥ．ｃｏｌｉ２９４は１９７
６年１０月２８日にAmerican Type Culture Collection
に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号は３１４４６であ
る。このプラスミドをＴｃR のコロニーから単離した。
ｔｒｐプロモーター並びにｈＧＨシグナルポリペプチド
及びアミノ末端アミノ酸のコドンを含有する領域のヌク
レオチド配列はジデオキシチェインターミネーション法
で確認した。Messing, J., Crea, R., and Seeburg, P.
H., Nucleic Acids Res ., 9,309-321 (1981)参照。
【００２２】ｐＰｒｅＨＧＨ２０７−１及びｐＨＧＨ２
０７−１をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＰｒ
ｅＨＧＨ２０７−１の小さい方の断片をゲル電気泳動で
精製した。この断片はプレｈＧＨ遺伝子全体を含有す
る。ｐＨＧＨ２０７−１の大きい方の断片をゲル電気泳
動で精製した。この断片はｔｒｐプロモーターを含んで
いる。これら２個の断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で処理するとプラスミドｐＰｒｅＨＧＨ２０７−２が得
られた。このプラスミドはｔｒｐプロモーターとプレｈ
ＧＨ遺伝子を含有する。ｐＰｒｅＨＧＨ２０７−２及び
ｐＲＳＦ１０１０をＥｃｏＲＩで処理し、Ｔ４リガーゼ
で結合してプラスミドｐＲＰＨ−２を得た。このプラス
ミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ２９４を形質転換した。ｐ
ＲＰＨ−２をＴｃR 及びＳｍR を示すコロニーから得
た。
【００２３】発現ベクターｐＲＰＨ−２を使用してＰ
ｓ．ａ．株ＰＡＯ２００３を形質転換した。Chandler e
t al., Mutat. Res., 23, 15 (1974) 参照。ｐＲＰＨ
−２で形質転換した細胞を、５０μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを含むＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）中３７℃で一
晩対数期まで増殖させた。セルペレットを３０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ， ｐＨ８．０， ２０△ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）に再懸濁し超音波処理した。細胞抽出物
を、Phaedabas hGH PRIST キット（Pharmacia ）を用い
るラジオイムノアッセイによって分析するため順次希釈
した。実質的レベルのｈＧＨが確認された（４×１０2
ｎｇ／ｍｌ／Ａ550 ）。細胞抽出物をポリアクリルアミ
ドゲル上１２．５％ＳＤＳ中で電気泳動した。抗−ｈＧ
Ｈウサギ抗−血清（Ｋａｂｉ社製）と 125Ｉ−標識Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａを用いる免疫ブロット技術（immunoblot
ting technique）でｈＧＨを可視化した。オートラジオ
グラフィーにより、細胞抽出物が抗−ｈＧＨと反応し真
正下垂体ｈＧＨと同じ電気泳動度を有する１種の主成分
を含有していることが判明した。いくらか泳動度の低い
小さいバンドも検出されたが、これは恐らく未処理のプ
レｈＧＨであろう。
【００２４】細胞抽出物の主要な反応性成分を精製して
免疫親和力クロマトグラフィー（immunoaffinity chrom
atography ）及び高速液体クロマトグラフィーによる均
一成分を得た。アミノ−末端のアミノ酸配列はＥｄｍａ
ｎの減成法（degradotion method）によって決定した。
Edman et al, European J. Biochem ., 1, 80 (1967)
参照。その結果均質であり、配列Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａで始まることが判明した。これは下垂体ｈＧ
Ｈの配列に完全に相当する。
【００２５】Ｅ．ｃｏｌｉとＰｓ．ｐｕｔｉｄａのｐＲ
ＰＨ−２による形質転換体を用いてプレｈＧＨを発現さ
せ原核生物の開裂によって成熟ｈＧＨを得る実験を同様
に行なったところ、Ｅ．ｃｏｌｉがシグナルペプチドを
有するインターフェロンのプロセッシングをしないとい
う過去の知見に反して、グラム陰性菌のプレｈＧＨを首
尾よくプロセッシングする能力は普遍的な現象であるこ
とが示された。
【００２６】本発明の精神を逸脱することなく好ましい
具体例に種々の改良を加えることができるということ
は、以上の記載から当業者には自明であろう。例えば、
使用する組換宿主がＥ．ｃｏｌｉであればプラスミドｐ
ＲＳＦ１０１０を使用する必要は必ずしもない。即ち、
例えば図１Ａ及び図１ＢのｐＰｒｅＨＧＨ２０７−１又
はｐＰｒｅＨＧＨ２０７−２を使用してＥ．ｃｏｌｉ中
で発現させることもできる。従って、本発明は請求項に
記載した法的範囲にのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは天然ｈＧＨに結合しているシグナルポ
リペプチドのアミノ酸配列及びｍＲＮＡ配列を示す図で
ある。
【図２】図１ＢはｈＧＨ発現プラスミドｐＲＰＨ２の構
築を示す図である。
【図３】図１ＢはｈＧＨ発現プラスミドｐＲＰＨ２の構
築を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 35/74 Ｄ 7431−4Ｃ 37/36 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） 7804−4Ｂ

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト成長ホルモンを含有する組換え原核
    生物宿主細胞であって、前記ホルモンのアミノ酸配列が
    天然に存在するヒト成長ホルモンのアミノ酸配列から成
    り、前記ホルモンはその天然環境で付随する他のタンパ
    クを含んでおらず、かつ外来のＮ−末端メチオニンを有
    する成熟ヒト成長ホルモンも含んでおらず、前記ホルモ
    ンは前記原核生物宿主によって産生されたものであるこ
    とを特徴とする組換え原核生物宿主細胞。
  2. 【請求項２】 グラム陰性菌であることを特徴とする請
    求項１に記載の宿主細胞。
  3. 【請求項３】 大腸菌（Ｅ．coli）菌株であることを特
    徴とする請求項２に記載の宿主細胞。
  4. 【請求項４】 菌株が大腸菌（Ｅ．coli）Ｋ−12株 294
    であることを特徴とする請求項３に記載の宿主細胞。
  5. 【請求項５】 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の
    菌株であることを特徴とする請求項２に記載の宿主細
    胞。
  6. 【請求項６】 菌株ＰＡ 02003であることを特徴とする
    請求項５に記載の宿主細胞。
  7. 【請求項７】 シュードモナス・ピュチダ（Pseudomo
    nas putida）の菌株であることを特徴とする請求項２
    に記載の宿主細胞。
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