BRPI0810622A2 - polipeptídeos de interferon beta modificados e seus usos - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS DE INTERFERON BETA MODIFICADOS E SEUS USOS Polipeptídeos de interferon beta modificados e usos dos mesmos são fornecidos.

Description

“POLIPEPTÍDEOS DE INTERFERON BETA MODIFICADOS E SEUS USOS” CAMPO DA INVENÇÃO" Esta invenção refere-se a polipeptídeos de interferon beta opcionalmente õ modificados com pelo menos um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Interferons (IFNs) são uma família bem conhecida de citocinas secretadas por uma ampla variedade de células eucarióticas. Interferons têm uma variedade de atividades biológicas, incluindo propriedades antivirais, imunomodulatórias, imunorregulatórias, neoplásicas e antiproliferativas, e foram utilizados como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças, tais como câncer e várias doenças virais. Interferons demonstraram utilidade no tratamento de uma variedade de doenças e estão em uso muito difundido para o tratamento de esclerose múltipla e hepatite viral; as aplicações terapêuticas mais comuns são correntemente o tratamento de hepatite C e esclerose múltipla. Interferons são membros da família do supergene do hormônio de crescimento (GH) (Bazan, F. Immunology —Today11:350-354 (1990); Mott, H. R. e Campbell, |. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Sivennoinen, O. e lhle, J. N. (1996) SINALIZAÇÃO PELOS RECEPTORES DE CITOCINA HEMATOPOÉTICOS) que representa um conjunto de à. proteínas com características estruturais similares. Cada membro desta família de proteínas compreende um feixe de quatro hélices. Embora ainda existam mais membros da família a “20 serem identificados, alguns membros da família incluem o seguinte: hormônio do crescimento, prolactina, lactogênio placentário, eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO), interleucina-2 (IL-2), 1L-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 1L-9, IL-10, 11-11, I1L-12 (subunidade p35), IL- 13, 11-15, oncostatina M, fator neurotrófico ciliar, fator inibitório da leucemia, alfa interferon, beta interferon, gama interferon, ômega interferon, tau interferon, epsílon interferon, fator estimulador da colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulador da colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulador da colônia de macrófagos (M-CSF) e cardiotrofina-1 (CT-1) (“a família do supergene do GH”). Membros da família do supergene do GH têm estruturas secundárias e terciárias similares, não obstante o fato de que eles geralmente têm identidade de sequência de aminoácidos ou DNA limitada. As — características estruturais compartilhadas permitem que novos membros da família do gene sejam facilmente identificados. O feixe de quatro hélices e polipeptídeos de interferon são descritos no WO 2005/074650 intitulado “Modified Human Four Helical Bundle Polipeptides and Their Uses”, WO 2005/074524 intitulado “Modified Human Interferon Polipeptides and Their Uses”, WO 2006/133089 e WO 2006/133088 intitulados “Improved Human Interferon —Polipeptides and Their Uses”, os quais são integralmente incorporados como referência neste relatório. Interferons incluem várias proteínas relacionadas, tais como interferon-alfa (IFN-0),

interferon-beta (IFN-6), interferon-gama IFN-y) interferon-capa (IFN-x, também conhecido . como interferon-epsílon ou IFN-e), interferon-tau (IFN-7), e interferon-ômega (IFN-w). Estas proteínas de interferon são produzidas em uma variedade de tipos celulares: IFN-a ã (leucócitos), IFN-6 (fibroblastos), IFN-y (linfócitos), IFN-e ou K (queratinócitos), IFN-w (leucócitos) elFN-r (trofoblastos). IFN-a, IFN-6, IFN-e ou k, IFN-w, e IFN-7 são classificados como interferons do tipo |, enquanto IFN-y é classificado como um interferon do tipo Il. O interferon alfa é codificado por uma família de genes múltiplos, enquanto os outros interferons parecem ser codificados por um gene único no genoma humano. Além disso, existe alguma variação alélica nas sequências de interferon entre membros diferentes da —populaçãohumana.

Os interferons são glicoproteínas relativamente pequenas, de cadeia única, liberadas por células invadidas por vírus ou expostas a outras substâncias. Interferons estão presentemente agrupados em três classes principais, designadas: 1) interferon de leucócito (interferon-alfa, a-interferon, IFN-a), 2) interferon de fibroblasto (interferon-beta, B-interferon, IFN-B), e 3) interferon imune (interferon-gama, y-interferon, IFN-y). Em resposta à infecção viral, linfócitos sintetizam primeiramente a-interferon (com ômega interferon, IFN-w), enquanto a infecção de fibroblastos usualmente induz a produção de B-interferon. IFNa e | IFNB compartilham cerca de 20 a 30 por cento de homologia de sequência de aminoácidos. O gene para IFN-8 humano carece de íntrons, e codifica uma proteína que possui 29 % de “20 identidadede sequência de aminoácidos com IFN-a humano, sugerindo que os genes IFN-a e IFN-B foram envolvidos a partir de um ascendente comum (Taniguchi et a/., Nature 285 547-549 (1980)). Ao contrário, IFN-y é sintetizado por linfócitos em resposta aos mitógenos. Pestka et al. em Annu. Rev. Immunol. (2004) 22:929-79, o qual é integralmente incorporado como referência neste relatório, descrevem citocinas a-helicoidais da classe 2, incluindo interferons (IFN-a, -B, -e, -K, -wW, -ó, -r, e -y), assim como moléculas do tipo interferon, tais como limitina, I11L-28A, I1L-28B e 1L-29, assim como os ligantes, receptores e vias de transdução de sinal utilizados por estas moléculas. Os interferons têm espécies diferentes e muitas variantes alélicas. Além disso, interferons com novas atividades e sequências de mutantes foram isolados de células a partir de pacientes com várias doenças.

Interferons foram originalmente derivados de fontes que ocorrem naturalmente, tais como camadas leucocitárias e células de fibroblastos, opcionalmente usando agentes indutores para aumentar a produção de interferon. Interferons também foram produzidos por tecnologia do DNA recombinante. A clonagem e expréssão de IFN6 maduro são descritas por Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).

Interferons do tipo | se ligam a um receptor comum, IFN-R do tipo |, composto de subunidades IFNAR1 e IFNAR2. O modo de ligação exato e as cascatas de transdução de sinal a jusante diferem de certa forma entre os interferons do tipo |. Entretanto, no geral, a via de transdução de sinal JAK/STAT é ativada após a ligação do interferon ao receptor de . interferon. Os fatores de transcrição de STAT depois se deslocam ao núcleo, levando à expressão de várias proteinas com atividades antivirais, antineoplásicas e á imunomodulatórias.

As propriedades das proteínas de interferon do tipo | que ocorrem naturalmente não são ideais para o uso terapêutico. Interferons do tipo | induzem as reações do sítio de injeção e vários outros efeitos colaterais. Eles são altamente imunogênicos, obtendo anticorpos neutralizantes e não neutralizantes em uma fração significante de pacientes. Interferons são deficientemente absorvidos a partir do sítio de injeção subcutâneo e têm —meias-vidas no soro insuficientes. Finalmente, interferons do tipo | não se expressam soluvelmente em hospedeiros procarióticos, assim necessitando de protocolos de expressão com redobra ou de mamíferos mais caros e difíceis.

Exemplos específicos de produtos de IFN comercialmente disponíveis incluem IFNy-Ib (Actimmuneº), IFN8-1a (Avonexº e Rebifº), IFNS- 1b (Betaseronº), alfacon-1 de IFN — (Infergenº), IFNa-2 (Intron Aº), IFNa-2a (Roferon-Aº), Peginterferon alfa-2a (PEGASYSº) e Peginterferon alfa-2b (PEG-Intronº). Alguns dos problemas associados com a produção de versões PEGiladas de proteínas de IFN são descritos em Wang et a/. (2002) Adv. Drug ' Deliv. Rev. 54:547-570; e Pedder, S.C. Semin Liver Dis. 2003;23 Supl 1:19-22. Wang et al.

isômeros posicionais caracterizados de PEG-Intronº, e Pedder et al. em comparação a “ 20 PEGASYSº com PEG-Intron descrevendo a labilidade das químicas de PEGilação usadas e efeitos sob formulação. PEGASYSº é compreendido de nove isoformas identificáveis, que especificam isoformas diferindo da atividade antiviral (Foser et al., Pharmacogenomics J 2003; 3:312). Não obstante o número de produtos de IFN correntemente disponíveis no mercado, existe ainda uma necessidade não satisfeita quanto a produtos terapêuticos de interferon. A presente invenção é dirigida à identificação de proteínas de interferon com propriedades aperfeiçoadas. Vários grupos têm gerado interferons modificados com propriedades aperfeiçoadas; as referências abaixo são todas expressamente incorporadas como referência em sua totalidade.

Variantes depletadas por cisteina foram geradas para minimizar a formação de ligações dissulfeto inter ou intramoleculares não desejadas (Patentes U.S. Nº 4.518.584;

4.588.585; e 4.959.314, as quais são incorporadas integralmente como referência).

Variantes depletadas por metionina foram geradas para minimizar a suscetibilidade à oxidação (EPO 260350, o qual é incorporado como referência neste relatório). f Interferons com atividade modificada foram gerados (Patentes U.S. Nº 6.514.729;

4.738.844; 4.738.845; 4.753.795; 4.766.106; WO 00/78266, os quais são incorporados como referência neste relatório). As Patentes U.S. Nº 5.545.723 e 6.127.332, as quais são incorporadas como referência neste relatório, divulgam mutantes de substituição de interferon beta na posição 101. Interferons quiméricos compreendendo sequências de um . ou mais interferons foram preparados (Chang et al. Nature Biotech. 17: 793-797 (1999), Patentes U.S. Nº 4.758.428; 4.885.166; 5.382.657; 5.738.846, os quais são incorporados : como referência). As mutações de substituição do interferon beta nas posições 49 e 51 também foram descritas (Patente U.S. Nº 6.531.122, a qual é incorporada como referência).

A expressão e geração de variantes e conjugados de IFN beta foram debatidas nas Patentes U.S. Nº 7.144.574 e 6.531.111, as quais são integralmente incorporadas como referência neste relatório. As modificações debatidas incluíram sítios de glicosilação que foram introduzidos no IFN beta ou removidos do polipeptídeo, substituições próximas aos sítios de glicosilação, conjugação aos resíduos de lisina ou cisteína e introdução ou remoção de aminoácidos.

Variantes de interferon beta com estabilidade realçada foram debatidas, nas quais o núcleo hidrofóbico foi otimizado usando métodos de projeto racionais (WO 00/68387, o qual é incorporado como referência). Formulações alternadas que promovem estabilidade ou — solubilidade do interferon também foram divulgadas (Patente U.S. Nº 4.675.483; 5.730.969;

5.766.582; WO 02/38170, os quais são incorporados como referência).

Muteínas do interferon beta com solubilidade realçada foram debatidas, nas quais É vários resíduos de leucina e fenilalanina são substituídos com resíduos de serina, treonina ou tirosina (WO 98/48018, o qual é incorporado como referência). Outras modificações para aperfeiçoar a solubilidade são debatidas no US 2005/0054053, o qual é integralmente incorporado como referência neste relatório.

Variantes de interferon alfa e interferon beta com imunogenicidade reduzida foram debatidas (Veja, WO 02/085941 e WO 02/074783, os quais são incorporados como referência).

A imunogenicidade é uma limitação principal dos produtos terapêuticos de interferon correntes (incluindo, mas não limitados ao interferon beta). Embora as respostas imunes sejam tipicamente as mais severas para as proteínas não humanas, produtos terapêuticos com base em proteínas humanas, tais como interferon beta, são frequentemente observados como imunogênicos. A imunogenicidade é uma série complexa —derespostasa uma substância que é percebida como estranha e pode incluir a produção de anticorpos neutralizantes e não neutralizantes, formação de complexos imunes, ativação de complemento, ativação de mastócito, inflamação e anafilaxia. Vários pacientes desenvolvem anticorpos neutralizantes para IFN beta (Int. Arch. Allfergy Immunol. 118:368-371, 1999). Foi ' mostrado que o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes para IFN beta diminui a resposta biológica ao IFN beta, e causa uma tendência em relação ao efeito do tratamento diminuído (Neurol. 50:1266-1272, 1998). Anticorpos neutralizantes provavelmente também impedirão a utilidade terapêutica de IFN beta em relação ao tratamento de outras doenças

(Immunol. Immuther. 39:263-268, 1994). - Vários fatores podem contribuir para a imunogenicidade da proteína, incluindo mas não limitados à sequência da proteína, a via e frequência de administração e a população de f pacientes. A agregação foi ligada à imunogenicidade de uma proteína terapêutica 5 relacionada, interferon alfa [Braun et al. Pharm. Res. 1997 14: 1472-1478]. Um outro estudo sugere que a presença dos alelos DRI 5 do MHC aumenta a suscetibilidade à formação de anticorpo neutralizante; curiosamente, os mesmos alelos também conferem suscetibilidade à esclerose múltipla [Stickler et al. Genes Immun. 2004 5: 1-7]. À medida que a agregação pode contribuir para a imunogenicidade de interferons (particularmente interferon beta), variantes engendradas para aperfeiçoar a solubilidade também podem possuir imunogenicidade reduzida. Variantes depletadas por cisteína foram geradas para minimizar a formação de ligações dissulfeto inter ou intramoleculares não desejadas (Patentes U.S. Nº 4.518.584; 4.588.585; 4.959.314, as quais são incorporadas como referência); tais variantes mostram uma propensão reduzida à agregação. Variantes de interferon beta com estabilidade realçada foram preparadas, nas quais o núcleo hidrofóbico foi otimizado usando métodos de projeto racionais (WO 00/68387, o qual é incorporado como referência); em alguns casos, a solubilidade pode ser realçada através de ' melhoramentos na estabilidade. Formulações alternadas que promovem a estabilidade e solubilidade do interferon também foram divulgadas (Patentes U.S. Nº 4.675.483;

5.730.969; 5.766.582; WO 02/38170, os quais são incorporados como referência). Muteínas do interferon beta com solubilidade realçada foram debatidas, nas quais vários resíduos de leucina e fenilalanina são substituídos com resíduos de serina, treonina ou tirosina (WO 98/48018, o qual é incorporado como referência). Interferons foram modificados pela adição de polietilenoglicol (“PEG”) (veja, Patentes U.S. Nº 4.917.888; 5.382.657; e 6.962.978, WO 99/55377; WO 02/09766; WO 00/23114, os quais são incorporados integralmente como referência). A adição de PEG pode aperfeiçoar a meia-vida e solubilidade no soro. Em alguns casos, a PEGilação foi observada reduzindo a fração de pacientes que têm anticorpos neutralizantes elevados através de acesso estericamente bloqueador aos agretopos de anticorpos (veja, por exemplo, Hershfield et al. PNAS 1991 88:7185-7189 (1991); Bailon. et al. Bioconjug. Chem. 12: 195-202(2001); He et al. Life Sci. 65: 355-368 (1999)). Variantes de interferon beta também foram geradas, as quais são prognosticadas para ligar alelos da classe ||! do MHC com afinidade diminuída em relação à proteína do tipo f selvagem; em ambos os exemplos, primeiramente, as mutações da alanina foram usadas para conferir ligação diminuída [WO 02/074783, o qual é incorporado como referência; Stickler supral. A imunorreatividade de anticorpos contra peptídeos sintéticos correspondentes às porções de IFN beta foi debatida em Redlich et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

(1991) 88:4040-4044. - Vários métodos foram desenvolvidos para modular a imunogenicidade de proteínas; um método preferido é interromper a ativação de células T removendo-se agretopos de : ligação ao MHC. Este método é mais tratável do que evadir a ligação do receptor ou anticorpo de células T, à medida que a diversidade de moléculas do MHC compreende apenas —-10º alelos, enquanto o repertório de anticorpos é estimado ser de aproximadamente 10º e o repertório do receptor de células T é ainda maior. Através da identificação e remoção ou modificação de peptídeos de ligação ao MHC da classe 1! dentro de uma sequência da proteína, a base molecular de imunogenicidade pode ser evadida. À eliminação de tais agretopos para o propósito de gerar menos proteínas imunogênicas foi previamente divulgada; veja, por exemplo WO 98/52976 e WO 02/079232, os quais são incorporados como referência.

Embora um grande número de mutações nos agretopos de ligação ao MHC possa ser identificado, o qual é prognosticado para conferir imunogenicidade reduzida, a maioria destas substituições de aminoácidos será energeticamente desfavorável. Como um resultado, a vasta maioria das sequências de imunogenicidade reduzida identificada usando os métodos descritos acima será incompatível com a estrutura e/ou função da proteína. De f modo que a remoção do agretopo-MHC é um método viável para reduzir a imunogenicidade, é crucial que esforços simultâneos sejam feitos para manter uma estrutura, estabilidade e “20 atividade biológica da proteína.

A imunogenicidade pode limitar a eficácia e segurança de produtos terapêuticos de interferon em múltiplas maneiras. A eficácia terapêutica pode ser diretamente reduzida pela formação de anticorpos neutralizantes. A eficácia também pode ser indiretamente reduzida, como a ligação a anticorpos neutralizantes ou não neutralizantes pode alterar a meia-vida no soro. Respostas imunes não desejadas podem tomar a forma de reações do sítio de injeção, incluindo, mas não limitadas às reações de hipersensibilidade do tipo retardadas. Também é possível que anticorpos neutralizantes anti-interferon beta possam reagir reticuladamente com o interferon beta endógeno e bloquear sua função.

Permanece uma necessidade quanto a novas proteínas de interferon tendo —imunogenicidade reduzida. Variantes de interferon com imunogenicidade reduzida podem encontrar uso no tratamento de várias condições responsivas ao interferon. A publicação da Patente U.S. Nº 2005/0054053, a qual é incorporada como referência neste relatório, descreve proteínas de IFN beta variantes com imunogenicidade moduladá em comparação Ê ao IFN beta do tipo selvagem.

Como um resultado, existe uma necessidade quanto ao desenvolvimento e descoberta de proteínas de interferon com propriedades aperfeiçoadas, incluindo, mas não limitadas à eficácia aumentada, efeitos colaterais diminuídos, imunogenicidade diminuída,

solubilidade aumentada e expressão procariótica solúvel realçada.

Existe uma necessidade - quanto a polipeptídeos de interferon que exigem menos injeção e/ou resultados frequentes de risco diminuído para o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes.

Produtos fr terapêuticos de interferon aperfeiçoados podem ser úteis para o tratamento de uma variedade de doenças e condições, incluindo doenças autoimunes, infecções virais e doenças inflamatórias, doenças com proliferação celular, infecções bacterianas, fertilidade realçadora e câncer, entre outros, e rejeição ao transplante.

Além disso, interferons podem ser usados para promover o estabelecimento da gestação em certos mamíferos.

O uso de interferon beta humano, um membro da família interferon, é melhor estabelecido no tratamento de esclerose múltipla.

Duas formas de interferon beta recombinante foram recentemente licenciadas na Europa e nos Estados Unidos para o tratamento desta doença.

Uma forma é interferon-beta-la (registrado e vendido como AVONEXº, mfg.

Biogen, Inc., Cambridge, Massa.; ou como REB SEº, mfg.

Merck Serono) e em seguida, “interferon-beta-1a" ou “IFN-beta-1a" ou “|FN-B-1a" ou “interferon-B-1a9", ou em várias formas hifenizadas e não hifenizadas, permutavelmente usadas.

Uma formulação correntemente comercializada de AVONEX tem 30 ug/dosagem (200 MIU/mg) e provê IFN- beta 1a derivado de CHO (Ovário de Hamster Chinês) fornecido intramuscularmente quatro vezes por semana.

Uma formulação correntemente comercializada de REBIF tem TIW subcutaneamente fornecido de 44 ugidosagem (270 MIU/mg) e também provê IFN beta 1a “20 derivado de CHO.

A outra forma é interferon-beta-1b (registrado e vendido como BETASERONSº Berlex, Richmond, Calif.), em seguida, “interferon-beta-1b"”. Uma formulação correntemente comercializada de BETASERON tem 250 uvg/dosagem (32 MIU/mg) e provê IFN-beta 1b derivado de E.

Coli fornecido subcutaneamente a cada dia ou três vezes por dia.

Interferon beta-1a é produzido em células de mamíferos usando a sequência de gene humano natural e é glicosilado, ao passo que interferon beta-1b é produzido nas bactérias E.

Coli usando uma sequência de gene humano modificada que contém uma substituição de cisteína/serina geneticamente engendrada na posição do aminoácido 17 (C 178) e é não glicosilado.

Efeitos colaterais comuns incluem, mas não são limitados à febre, dores de cabeça, fadiga, ansiedade, depressão, distúrbios do fígado e reações do sítio de injeção.

Yongetal Neurology (1998) 51:682-689 debatem o uso de interferon beta no tratamento de esclerose múltipla e indicam que a taxa de acúmulo de incapacidade a partir de MS é reduzida.

A estrutura cristalina de interferon beta humano glicosilado foi descrita por ã Karpusas et al. em Proc Natl Acad Sci 1997 94:11813-11818. Esta proteína é glicosilada em um sítio único (Asn80). A proteína tem uma tendência de se agregar quando produzida em E.

Coli (Mitsui et al.

Pharmacol Ther 1993 58:93-132). Karpusas et al. descrevem a produção de interferon beta humano em células de ovário de hamster chinês (CHO) e a

Purificação da proteína secretada usando blue Sepharose e SP-Sepharose (troca iônica). . Interferons alfa e beta tem sido usados no tratamento da doença viral aguda herpes zoster (T. C. Merigan et al., N. Engl. J. Med. 298, 981-987 (1978); E. Heidemann et al., r Onkologie 7, 210-212 (1984)), infecções virais crônicas, por exemplo, infecções por hepatite Cehepatite B(R.L. Knobler et al., Neurology 34(10): 1273-9 (1984); M. A. Faerkkilae et al, Act. Neurol. Sci. 69, 184-185 (1985)). IFNB humano é um polipeptídeo regulatório com um peso molecular de cerca de 22 kDa que consiste de 166 resíduos de aminoácidos. Ele pode ser produzido pela maioria das células no corpo, em particular fibroblastos, em resposta à infecção viral ou exposição a outros agentes. Ele se liga a um receptor de superfície celular muiltimérico, e a ligação do receptor produtiva resulta em uma cascata de eventos intracelulares levando à expressão de genes induzíveis por IFNB, que por sua vez produz efeitos que podem ser classificados como antivirais, antiproliferativos e imunomodulatórios. A sequência de aminoácidos do IFN8 humano é conhecida (Taniguchi, Gene 10:11- 15,1980,eno EP 83069, EP 41313 e Pat. U.S. Nº 4.686.191, os quais são incorporados como referência neste relatório). Estruturas cristalinas de IFNB humano e murino foram descritas em Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818, 1997; J. Mol. Biol. 253:187-207, 1995; Patentes U.S. Nº: 5.602.232; 5.460.956; 5.441.734; 4.672.108; os quais são incorporados como referência neste relatório e debatidos em Cell Mol. Life Sci. 54:1203- “ 20 1206,1998. Variantes de IFNS foram relatadas (WO 95/25170, WO 98/48018, Patente U.S. Nº 6.572.853, Pat. U.S. Nº 5.545.723, Pat. U.S. Nº 4.914.033, EP 260350, Pat. U.S. Nº

4.588.585, Pat. U.S. Nº 4.769.233, Stewart et al., DNA Vol. 6 nº 2 1987 páginas 119-128, Runkel et a/., 1998, J. Biol. Chem. 273, Nº 14, páginas 8003-8008, os quais são incorporados como referência neste relatório). A Patente U.S. Nº 4.966.843, Patente U.S. Nº

5.376.567, Patente US. Nº 5.795.779, Patente U.S. Nº 7.144.574, as quais são incorporadas como referência neste relatório, descrevem a expressão de IFN6 em células de CHO. Moléculas de IFN8 com um padrão de glicosilação particular e métodos para sua preparação foram relatados (EP 287075 e EP 529300). A estrutura e a função de IFN81a e B1b foram comparadas em Pharmaceut. Res. 15:641-649, 1998. A progressão da esclerose múltipla mostrou-se retardada com IFN beta. A esclerose múltipla é uma doença degenerativa inflamatória, passível de recaída e depois progressão, do sistema nervoso central. Outros efeitos que IFNS pode ter incluem, mas não são limitados aos efeitos inibitórios na proliferação de leucócitos e apresentação de antígeno, modulação do perfil da produção de citocina dirigida a um fenótipo anti- inflamatório, e redução de migração de células T inibindo-se a atividade das metaloproteases da matriz de células T responsável pelo mecanismo de IFNB8 em MS (Neurol. 51:682-689, 1998).

IFN beta pode ser usado no tratamento de várias doenças incluindo, mas não - limitadas ao osteossarcoma, carcinoma das células basais, displasia cervical, glioma, leucemia mielóide aguda, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, carcinoma da mama, aí melanoma e infecções virais, incluindo mas não limitadas ao papilomavírus, hepatite viral, — herpes genital, herpes zoster, ceratite herpética, herpes simples, encefalite viral, pneumonia por citomegalovirus e rinovírus.

Efeitos colaterais de produtos terapêuticos de IFNE correntes incluem reações do sítio de injeção, febre, calafrios, mialgias, artralgias e outros sintomas comuns da gripe (Clin.

Therapeutics, 19:883-893, 1997). Uma molécula do tipo IFN$ aperfeiçoada é necessária, considerando a grande quantidade de efeitos colaterais com produtos de IFNB correntes, sua associação com injeção frequente, o risco de desenvolvimento de anticorpos neutralizantes que impedem o efeito terapêutico desejado de IFNB, e o potencial para obter níveis de IFNB terapêuticos mais ideais com efeito terapêutico concomitante realçado.

As potências relativas in vitro de interferon-beta-1a e interferon-beta-1b em ensaios funcionais foram comparadas, e foi mostrado que a atividade específica de interferon-beta- 1a é de aproximadamente 10 vezes maior do que a atividade específica de interferon-beta- 1b (Runkel et a/., 1998, Pharm.

Res. 15: 641-649). A partir de estudos designados para í identificar a base estrutural destas diferenças de atividade, a glicosilação foi identificada como a única das diferenças estruturais conhecidas entre os produtos que afetaram a “20 atividade específica.

O efeito do carboidrato foi amplamente manifestado através de seu papel estabilizante na estrutura.

O efeito estabilizante do carboidrato foi evidente nos experimentos de desnaturação térmica e análise SEC.

A falta de glicosilação também foi correlacionada com um aumento na agregação e uma sensibilidade aumentada à desnaturação térmica.

A remoção enzimática do carboidrato a partir de interferon-beta-1a com PNGase FF causou precipitação extensiva do produto desglicosilado.

Moléculas de interferon-beta da invenção podem reter toda ou a maioria de suas atividades biológicas e as propriedades seguintes podem resultar em: farmacocinética e farmacodinâmica alteradas levando à meia-vida aumentada e alterações na distribuição do tecido (por exemplo, capacidade de permanecer na vasculatura durante longos períodos de tempo), estabilidade aumentada na solução, imunogenicidade reduzida, proteção da digestão proteolítica e subsequente abolição da atividade.

Tais moléculas seriam um avanço substancial nas técnicas farmacêuticas e médicas e trariam uma contribuição significante f para a administração de várias doenças nas quais interferon tem alguma utilidade, tais como —* esclerose múltipla, fibrose e outras doenças inflamatórias ou autoimunes, cânceres, hepatite e outras doenças virais.

Em particular, a capacidade de permanecer durante longos períodos de tempo na vasculatura permite que o interferon beta seja usado para inibir a angiogênese e potencialmente cruzar a barreira sanguínea-cerebral.

Conjugados formados entre interferon beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente - codificado e uma outra molécula, incluindo, mas não limitada a um polímero, podem resultar em estabilidade térmica modulada do conjugado. Tal estabilidade térmica modulada pode á ser uma vantagem quando se formula interferon-beta na forma de pó para o uso em administração subsequente por intermédio de inalação.

A ligação covalente do polímero poli(etilenoglico!) hidrofílico, abreviação PEG, é um método de aumentar a solubilidade em água, biodisponibilidade, aumentar a meia-vida no soro, aumentar a meia-vida terapêutica, modular a imunogenicidade, modular a atividade biológica, ou prolongar o tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, peptídeos e particularmente moléculas hidrofóbicas. PEG foi extensivamente usado em produtos farmacêuticos, em implantes artificiais e em outras aplicações onde a biocompatibiidade, ausência de toxicidade e ausência de imunogenicidade são de grande importância. De modo a maximizar as propriedades desejadas de PEG, o peso molecular total e o estado da hidratação do polímero ou polímeros PEG ligados à molécula biologicamente ativa devem ser suficientemente altos para comunicar as características vantajosas tipicamente associadas com a ligação do polímero PEG, tais como solubilidade aumentada na água e meia-vida circulante, enquanto A não adversamente impactando a bioatividade da molécula precursora. Derivados de PEG estão frequentemente ligados às moléculas biologicamente “20 ativas através das funcionalidades químicas reativas, tais como resíduos de lisina, cisteína e histidina, o N-terminal e as porções carboidrato. Proteínas e outras moléculas frequentemente têm um número limitado de sítios reativos disponíveis para a ligação do polímero. Frequentemente, os sítios mais adequados para a modificação, por intermédio da ligação do polímero, desempenham um Papel significante na ligação do receptor e são necessários para a retenção da atividade biológica da molécula. Como um resultado, a ligação indiscriminada de cadeias de polímero a tais sítios reativos em uma molécula biologicamente ativa, frequentemente leva a uma redução significante ou ainda total perda da atividade biológica da molécula modificada pelo polímero. R. Clark et a/., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para formar conjugados tendo peso molecular do polímero — suficiente para comunicar as vantagens desejadas a uma molécula alvo, métodos da técnica anterior tipicamente envolveram ligação aleatória de numerosos ramos poliméricos à molécula, desse modo aumentando o risco de uma redução ou ainda total perda na f bioatividade da molécula precursora. á Sítios reativos que formam o loco para a ligação de derivados de PEG às proteínas são definidos pela estrutura da proteína. Proteínas, incluindo enzimas, são compostas de várias sequências de alfa-aminoácidos, que têm a estrutura geral HN-CHR-COOH. A porção alfa-amino (H/N-) de um aminoácido se une à porção carboxila -COOH) de um aminoácido adjacente para formar ligações amida, que podem ser representadas como - a (NH-CHR-CO),-, onde o subscrito “nº” pode ser igual a centenas ou milhares. O fragmento f representado por R pode conter sítios reativos para a atividade biológica da proteína e para a ligação de derivados de PEG.

Por exemplo, no caso do aminoácido lisina, existe uma porção -NH7 na posição epsílon, assim como na posição alfa. A -NH, epsílon é livre para a reação sob condições de pH básico. Muitas técnicas no campo da derivatização da proteína com PEG foram dirigidas para desenvolver derivados de PEG para a ligação à porção -NH, epsílon de resíduos de lisina presentes nas proteínas. Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced —PEGVylation, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, páginas 1-17. Estes derivados de PEG têm a limitação comum, entretanto, eles não podem ser instalados seletivamente entre os resíduos de lisina frequentemente numerosos, presentes nas superfícies das proteínas. Isto pode ser uma limitação significante nos exemplos onde um resíduo de lisina é importante para a atividade da proteína, existindo em um sítio ativo da enzima, por exemplo, ouem casos onde um resíduo de lisina desempenha um papel na mediação da interação da proteína com outras moléculas biológicas, como no caso de sítios de ligação ao receptor.

Uma segunda e complicação igualmente importante de métodos existentes para a E PEGilação da proteina é que os derivados de PEG podem sofrer reações laterais indesejadas com resíduos, exceto aquelas desejadas. A histidina contém uma porção imino 2 20 reativa, representada estruturalmente como -N(H)-, porém muitas espécies quimicamente reativas que reagem com -NH, epsílon também podem reagir com -N(H)-. Similarmente, a cadeia lateral do aminoácido cisteíina carrega um grupo sulfidrila livre, representado estruturalmente como -SH. Em alguns exemplos, os derivados de PEG dirigidos no grupo - NH; epsílon de lisina também reagem com cisteína, histidina ou outros resíduos. Isto pode criar misturas complexas e heterogêneas de moléculas bioativas derivatizadas de PEG e riscos que podem destruir a atividade da molécula bioativa sendo alvejada. Seria desejável desenvolver derivados de PEG que permitam que um grupo químico funcional seja introduzido em um sítio único dentro da proteína, a qual depois estaria apta à ligação seletiva de um ou mais polímeros PEG à molécula bioativa nos sítios específicos na — superfície da proteina que são bem definidos e prognosticáveis. Além de resíduos de lisina, esforços consideráveis na técnica foram dirigidos em relação ao desenvolvimento dos reagentes de PEG ativados que alvejam outras cadeias f laterais de aminoácidos, incluindo cisteína, histidina e o N-terminal. Veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 6.610.281, a qual é incorporada como referência neste relatório, e Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, páginas 1-17. Um resíduo de cisteína pode ser seletivamente introduzido no sítio na estrutura de proteínas usando mutagênese dirigida ao sítio e outras técnicas conhecidas no ramo, e a porção sulfidrila livre resultante pode ser reagida com derivados de PEG que - carregam grupos funcionais reativos em tiol. Este método é complicado, entretanto, a introdução de um grupo sulfidrila livre pode complicar a expressão, redobra e estabilidade ' da proteína resultante. Assim, seria desejável ter um meio de introduzir um grupo químico funcional nas moléculas bioativas que possibilitem a ligação seletiva de um ou mais polímeros PEG à proteína, enquanto simultaneamente é compatível com (isto é, não se encaixando em reações laterais indesejadas com) sulfidrilas e outros grupos químicos funcionais tipicamente encontrados nas proteínas. Conforme pode ser observado a partir de uma amostragem da técnica, muitos destes derivados que foram desenvolvidos para a ligação com as cadeias laterais das proteínas, em particular, a porção -NH, na cadeia lateral do aminoácido lisina e a porção - SH na cadeia lateral da cisteína, têm comprovado alguns problemas em sua síntese e uso. Algumas formas de ligações instáveis com a proteína estão sujeitas à hidrólise e, em consequência disso, decomposição, degradação, ou são de outro modo instáveis em ambientes aquosos, tais como na corrente sanguínea. Algumas formas de ligações são mais estáveis, porém são submetidas à hidrólise antes que a ligação seja formada, o que significa que o grupo reativo no derivado de PEG pode ser inativado antes que a proteína possa ser ligada. Algumas formas são, de certa forma, tóxicas e, portanto, são menos adequadas para o uso in vivo. Algumas formas são muito lentas à reação para se tornarem praticamente úteis. Algumas formas resultam em uma perda de atividade da proteína através da ligação aos sítios responsáveis pela atividade da proteína. Algumas formas não são específicas nos sítios aos quais elas se ligarão, as quais também podem resultar em uma perda de atividade desejável e em uma ausência de reprodutibilidade de resultados. De modo a superar os desafios associados com a modificação de proteínas com porções poli(etilenoglico!), derivados de PEG foram desenvolvidos, os quais são mais estáveis (por exemplo, Patente U.S. 6.602.498, a qual é incorporada como referência neste relatório) ou que reagem seletivamente com porções tiol em moléculas e superfícies (por exemplo, Patente U.S.

6.610.281, a qual é incorporada como referência neste relatório). Claramente, existe uma necessidade na técnica quanto a derivados de PEG que são quimicamente inertes em meios fisiológicos até que sejam designados a reagir seletivamente para formar ligações químicas estáveis. Recentemente, uma tecnologia completamente nova na ciência de proteínas foi í relatada, a qual promete superar muitas das limitações associadas com modificações específicas do sítio de proteínas. Especificamente, novos componentes foram adicionados ao mecanismo biossintético da proteina de Escherichia coli procarionte (E. Coli) (por exemplo, L. Wang, et al, (2001), Science 292:498-500) e Sacchromyces cerevisiae eucarionte (S. cerevisiae) (por exemplo, J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), os quais tornaram possível a incorporação de aminoácidos não geneticamente codificados às proteínas in vivo. Vários novos aminoácidos com novas propriedades químicas, físicas ou à biológicas, incluindo marcações por fotoafinidade e aminoácidos fotoisomerizáveis, À aminoácidos fotorreticulantes (veja, por exemplo, Chin, J. W., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 99:11020-11024; e, Chin, J. W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026- 9027), ceto-aminoácidos, átomo pesado contendo aminoácidos e aminoácidos glicosilados foram eficazmente incorporados e com alta fidelidade nas proteínas em E. Coli e em leveduras, em resposta ao códon âmbar, TAG, usando esta metodologia. Veja, por exemplo, J. W. Chin et a/., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin &P.G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137; J. W. Chin, et al, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; e, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Todas as referências são incorporadas integralmente como referência. Estes estudos demonstraram que é possível seletiva e rotineiramente introduzir grupos químicos funcionais, tais como grupos cetona, grupos alcino e porções azida, que não são encontrados em proteínas, que são quimicamente inertes a todos os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos geneticamente codificados e comuns e que podem ser usados para reagir eficaz e seletivamente para formar ligações covalentes i estáveis. A capacidade de incorporar aminoácidos não geneticamente codificados em 2 20 proteínas permite a introdução de grupos químicos funcionais que podem fornecer alternativas valiosas aos grupos funcionais que ocorrem naturalmente, tais como o -NH, epsílon de lisina, o sulfidrila -SH de cisteína, o grupo imino de histidina, etc. Certos grupos químicos funcionais são inertes aos grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos geneticamente codificados e comuns, porém reagem clara e eficazmente para formar ligações estáveis. Grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos na técnica, os quais sofrem uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen em condições aquosas na presença de uma quantidade catalítica de cobre. Veja, por exemplo, Tornoe, et a/., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovisev, et al, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-

2599. Através da introdução de uma porção azida em uma estrutura da proteína, por exemplo, esta é capaz de incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte às aminas, sulfidrilas, ácidos carboxílicos, grupos hidroxila encontrados nas proteínas, porém esta também reage fácil e eficazmente com uma porção acetileno para formar um produto de cicloadição. Significantemente, na ausência da porção acêtileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais da proteína e sob — condições fisiológicas. A presente invenção abrange, entre outras coisas, problemas associados com a atividade e produção de polipeptídeos de IFN beta, e também abrange a produção de um polipeptídeo de IFN beta com propriedades biológicas ou farmacológicas aperfeiçoadas, tais Fr como atividade antiviral realçada e/ou meia-vida terapêutica aperfeiçoada. 2 SUMÁRIO DA INVENÇÃO " Esta invenção fornece polipeptídeos de IFN beta compreendendo um ou mais — aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais modificações pós-tradução. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta é ligado a um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta é ligado a um polímero bifuncional, ligador bifuncional ou pelo menos um polipeptídeo de IFN beta adicional. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais modificações pós-tradução à forma mutante C17S de IFN beta.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado ao polímero solúvel em água com um ligador ou é ligado ao polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um polímero bifuncional. Em algumas modalidades, o polímero bifuncional é ligado a um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo de IFN beta. A presente invenção também inclui cada uma das modalidades acima, além da mutação C178 no IFN beta.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende pelo menos dois amincácidos ligados a um polímero solúvel em água compreendendo uma porção poli(etilenoglico!). Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido é um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreendendo pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero solúvel em água compreendendo uma porção poli(fetilenoglicol) inclui a mutação C17S, em outras modalidades, qualquer mutação na posição 17 é incluída além de um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados em um polipeptídeo de IFN beta.

Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes no IFN beta: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, f 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42; 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, —68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78, 79,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,

130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, ” 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, - 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína), e qualquer combinação das mesmas ' (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas —modalidades uma destas incorporações ocorre na posição 17.

Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em qualquer posição em uma ou mais das regiões correspondentes seguintes às estruturas secundárias no interferon beta como segue: Hélice A (2 a 22); Hélice B (51 a 71); Hélice C (80 a 107); Hélice D (118 a 136); Hélice E (139 a 162); “loop” AB: AB1 (23 a 35); AB2 (36 a 40), AB3 (41 a 50) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4. Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 25 a 35, 80 a 100 e 121 a 135 do interferon beta (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3, 4). Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 41 a 49 do interferon beta da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes das SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, um ' ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma : ou mais das posições seguintes do IFN beta: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, Ê 20 46,48,49,80,108,111,113,155e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e4 Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados — são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do !FN beta: 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são “incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 36 e 111 da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido natural. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma substituição C17S (serina por uma cisteina na posição 17) da SEQ ID NO: 1 ou os - aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, o á polipeptídeo da invenção compreende uma substituição C17S (serina por uma cisteína na t posição 17) e uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido natural.

Em algumas modalidades, o polipeptíideo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado na sequência sinal.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado na sequência sinal da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que ocorre naturalmente codificado na sequência sinal da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados na sequência líder ou sinal da SEQ ID NOs: 4 ou outra sequência de IFN beta.

À presente invenção também inclui cada uma das modalidades acima, além da mutação C17S no IFN beta.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ] 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, E 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, | 20 61,62,63,64,65, 66,67, 68,69, 70,71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína), e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4 ou os aminoácidos correspondentes em uma outra sequência do IFN beta). Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas a: —Hélice A(2a22); Hélice B(51a71); Hélice C (80 a 107); Hélice D (118 a 136); Hélice E (139 a 162); “loop” AB: AB1 (23 a 35); AB2 (36 a 40); AB3 (41 a 50) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4. Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitados aos resíduos 25 a 35, 80 a 100 e 121 a 135 do interferon beta (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4). Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitados aos resíduos

41 a 49 do interferon beta da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, S 111,113,155, e qualquer combinação da mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs:3e4 Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas ã modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições j é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 36 e 111 e 20 daSEQIDNO:1ouos aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente na sequência sinal ou líder é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 4 ou outra sequência de IFN beta). A presente invenção também inclui cada uma das modalidades acima, além da mutação C17S no IFN beta.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a afinidade do polipeptídeo de IFN beta para um receptor ou par de ligação do polipeptídeo de IFN, incluindo mas não limitado a uma proteína, polipeptídeo, molécula pequena ou ácido nucléico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a — estabilidade do polipeptídeo de IFN beta quando comparada com a estabilidade do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. A estabilidade e/ou solubilidade podem ser medidas usando vários ensaios diferentes conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Tais ensaios incluem, mas não são limitados a SE-HPLC e RP-HPLC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição —oudeleçãoque modula a imunogenicidade do polipeptídeo de IFN beta quando comparada com a imunogenicidade do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a meia-vida no soro ou tempo de circulação do polipeptídeo de IFN beta quando comparada com a meia-vida no soro ou tempo de circulação do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptideo de IFN beta compreende uma — substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade aquosa do polipeptídeo de IFN beta quando comparada à solubildade aquosa do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade do polipeptídeo de IFN beta produzido em uma célula hospedeira quando comparada à "solubilidade do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a expressão do polipeptídeo de IFN beta em uma célula hospedeira ou aumenta a síntese in vitro quando comparadas à expressão ou síntese do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. O polipeptídeo de IFN beta compreendendo esta substituição retém atividade agonista e retém ou aumenta os níveis de expressão em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a resistência à protease do polipeptídeo de IFN beta quando comparada à resistência à protease do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o h 20 —polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a atividade de transdução de sinal do receptor de IFN quando comparada com a atividade do receptor sob interação com o polipeptídeo de IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que modula sua ligação a uma outra molécula, tal como um receptor, quando comparada à ligação do polipeptídeo de IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que modula sua atividade antiviral comparada à atividade antiviral do polipeptíideo de IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta “compreende uma substituição, adição ou deleção que realça sua atividade antiviral comparada à atividade antiviral do polipeptíideo de IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção.

Em algumas modalidades, o polipeptíideo de IFN beta compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a compatibilidade do polipeptídeo de IFN beta com preservantes farmacêuticos (por exemplo, w-cresol, fenol, álcool benzílico) quando comparada à compatibilidade do IFN beta correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Esta compatibilidade aumentada possibilitaria a preparação de uma formulação farmacêutica preservada que mantém as propriedades fisico-químicas e a atividade biológica da proteína durante a armazenagem.

Em algumas modalidades, uma ou mais ligações engendradas são criadas com um ou mais aminoácidos não naturais. A ligação intramolecular pode ser criada de várias maneiras, incluindo, mas não limitadas a uma reação entre dois aminoácidos na proteína sob condições adequadas (um ou ambos os aminoácidos podem ser um aminoácido não natural); uma reação com dois aminoácidos, cada um dos quais pode ser naturalmente codificado ou não naturalmente codificado com um ligador, polímero ou outra molécula sob condições adequadas; etc.

Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos no polipeptídeo de IFN beta pode ser com um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos no polipeptídeo de IFN beta podem ser com aminoácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente, contanto que pelo menos uma substituição seja com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos no polipeptídeo de IFN beta podem ser com um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente, e adicionalmente pelo i menos uma substituição é com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

: Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado h 20 — compreende um grupo carbonila, um grupo acetila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado tem a estrutura: (CHIRICOR? cor, em que n é 0 a 10; R, é um alquila, arila, alguila substituído ou arila substituído; Ro é H, um alquila, arila, alquila substituído e arila substituído; e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino; e R, é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado —compreende um grupo aminoóxi. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo hidrazida. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo hidrazina. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo semicarbazida.

Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo azida. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado tem a estrutura: (CH), RX(CH>)nmN3 o em que n é 0 a 10; R, é um alquila, arila, alquila substituído, arila substituído ou não presente; X é O, N, S ou não presente; m é 0 a 10; R é H, um aminoácido, um polipeptídeo ouum grupo de modificação no terminal amino; e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo alcino. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado tem a estrutura: (CHIRX(CH2) JA CCH ato em que n é 0 a 10; R, é um alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído; X é O, N, S ou não presente; m é 0 a 10, R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo f de modificação no terminal carbóxi. Em algumas modalidades, o polipeptideo é um agonista, agonista parcial, h 15 antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso do polipeptídeo de IFN beta. Em algumas modalidades, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso do polipeptídeo de IFN beta compreende um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(fetilenoglicol). Em algumas modalidades, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso do polipeptídeo de IFN beta compreende um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e uma ou mais entre modificação pós-tradução, ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa. A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados compreendendo um —polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas para a SEQ ID NO: 2 ou ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos da SEQ ID NOs: 3 e 4. A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas para a SEQ ID NO: 2 ou polinucleotides que hibridizam sob condições ' severas para os polinucleotides que codificam polipeptídeos mostrados como SEQ ID NOs: 3ed4 em que o polinucleotideo compreende pelo menos um códon seletor. A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos mostrados como SEQ ID NOs.: 1, 3 e 4. À presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos mostrados como SEQ ID NOs.: 1, 3 e 4, com um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados. É facilmente evidente àqueles de habilidade comum na técnica que vários polinucleotídeos diferentes podem codificar qualquer polipeptídeo da presente invenção.

Em algumas modalidades, o códon seletor é selecionado do grupo que consiste de um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon único, um códon raro, um códon de cinco bases e um códon de quatro bases.

A presente invenção também fornece métodos de preparar um polipeptídeo de IFN beta ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o método compreende contatar um polipeptídeo de IFN beta isolado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado com um polímero solúvel em água compreendendo uma porção que reage com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta é reativo em relação a um polímero solúvel em água que é, de outro modo, não reativo em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta é reativo em relação a um ligador, polímero ou molécula f biologicamente ativa que é, de outro modo, não reativa em relação a qualquer um dos 20 é aminoácidos comuns.

É 20 Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta ligado ao polímero solúvel em água é preparado reagindo-se um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo carbonila com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado à molécula de poli(etilenoglico!) através de uma ligação amida. Em algumas modalidades, o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado à molécula de poli(etilenoglicol) através de uma ligação carbamato.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta ligado ao polímero solúvel em água é preparado reagindo-se uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo carbonila com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que compreende um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta ligado ao polímero solúvel L em água é preparado reagindo-se um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo alcino com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo uma porção azida. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alcino é ligado à molécula de poli(etilenoglico!l) através de uma ligação amida.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta ligado ao polímero solúvel em água é preparado reagindo-se um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo azida com uma molécula de poli(etilenoglico!) compreendendo uma - porção alcino. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alcino é ligado à molécula de polifetilenoglicol) através de uma ligação amida.

- Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre 0,1 kDa e 50 kDa.

Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglico!) é um polímero ramificado. Em algumas modalidades, cada ramo do polímero poli(etilenoglicol) ramificado tem um peso molecular entre 1 kDa e 100 kDa ou entre 1 kDa e 50 kDa. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água ligado ao polipeptídeo de IFN beta compreende uma porção polialquilenogilcol. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta compreende uma porção carbonila e o polímero solúvel em água compreende uma porção aminoóxi, hidrazida, hidrazina ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta compreende uma porção alcino e o polímero solúvel em água compreende uma porção azida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta compreende uma porção azida e o polímero solúvel em água compreende uma porção alcino. A presente invenção também fornece composições que compreendem um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente - codificado e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado a um polímero solúvel em 7 30 água A presente invenção também fornece células compreendendo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de IFN beta compreendendo um códon seletor. Em algumas modalidades, as células compreendem uma RNA sintetase ortogonal e/ou um tRNA ortogonal para substituir um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado no polipeptídeodelFN beta.

A presente invenção também fornece métodos de preparar um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em algumas modalidades, os métodos compreendem cultivar células compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de IFN beta, uma RNA sintetase ortogonal e/ou um tRNA ortogonal sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo : de IFN beta; e purificar o polipeptídeo de IFN beta a partir das células e/ou meio de cultura. A presente invenção também fornece métodos de aumentar a meia-vida - terapêutica, meia-vida no soro ou tempo de circulação de polipeptídeos de IFN beta. À presente invenção também fornece métodos de modular a imunogenicidade de polipeptídeos de IFN beta. Em algumas modalidades, os métodos compreendem substituir um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado por qualquer um ou mais aminoácidos em que polipeptídeos de IFN beta ocorrem naturalmente e/ou ligar o polipeptídeo de IFN beta a um ligador, um polímero, um polímero solúvel em água ou uma molécula biologicamente ativa.

A presente invenção também fornece métodos de tratar um paciente em necessidade de tal tratamento com uma quantidade eficaz de uma molécula de IFN beta da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de I!FN beta é glicosilado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta é não glicosilado.

A presente invenção também fornece polipeptídeos de IFN beta compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 3 e 4 ou qualquer outra sequência de polipeptídeo de IFN beta, exceto que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. A presente invenção também fornece polipeptídeos de IFN beta compreendendo uma sequência mostrada como SEQ ID NO: 1, 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é D ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido - 30 que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.

A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de IFN beta compreendendo a — sequênciamostradana SEQ ID NO: 1, 3 e 4 ou qualquer outra sequência de polipeptídeo de IFN beta, em que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de IFN beta compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende uma . porção sacarídeo. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água é ligado ao polipeptídeo por intermédio de uma porção sacarídeo. Em algumas modalidades, um . ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa é ligado ao polipeptídeo de IFN beta por intermédio de uma porção sacarídeo.

A presente invenção também fornece um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente ao polipeptídeo de IFN beta em um amincácido único. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido covalentemente ligado ao polímero solúvel em água é um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado presente no polipeptídeo.

A presente invenção fornece um polipeptídeo de IFN beta compreendendo pelo menos um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa, em que o dito ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa é ligado ao polipeptídeo através de um grupo funcional de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ribossomicamente incorporado no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é monoPEGilado. À presente invenção também fornece um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa que é ligado a um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados, em que o dito aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ribossomicamente incorporado no polipeptídeo nos sítios pré- selecionados.

Incluída dentro do escopo desta invenção está a sequência líder ou sinal de IFN beta unida a uma região codificante de IFN beta, assim como uma sequência sinal heteróloga unida a uma região codificante de IFN beta. A sequência líder ou sinal heteróloga selecionada deve ser aquela que é reconhecida e processada, por exemplo, pelo sistema de - secreção da célula hospedeira, e possivelmente clivada por uma peptidase sinal, pela célula hospedeira. Um método de tratar uma condição ou distúrbio com o IFN beta da presente - 30 invenção implica tratar com IFN beta, com ou sem um peptídeo sinal ou líder.

A presente invenção também fornece métodos de induzir um aumento na atividade antiviral em células, o dito método compreendendo administrar IFN beta às ditas células em uma quantidade eficaz para induzir um aumento na atividade antiviral.

Em uma outra modalidade, a conjugação do polipeptídeo de IFN beta compreendendo um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente a uma outra molécula, incluindo, mas não limitada a PEG, fornece IFN beta substancialmente purificado devido à única reação química utilizada para a conjugação ao aminoácido não natural. À conjugação do IFN beta compreendendo um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados a uma outra molécula, tal como PEG, pode ser realizada com outras técnicas de purificação realizadas antes ou depois da etapa de conjugação para fornecer IFN beta substancialmente puro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 — Um modelo da estrutura cristalina do IFN beta é mostrado. Cada um dos sítios mostrados foi substituído com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

Figura 2 — Um modelo da estrutura cristalina do IFN beta é mostrado. Sítios selecionados para a substituição com um aminoácido que não ocorre naturalmente —codificadosão mostrados.

Figura 3 — A análise por SDS PAGE da expressão de polipeptídeos de IFN beta da presente invenção é mostrada.

Figura 4 — A análise por SDS PAGE da expressão de polipeptídeos de IFN beta da presente invenção é mostrada.

Figura 5 — Os polipeptídeos de IFN beta antes e depois da PEGilação da presente invenção são mostrados.

Figura 6A — Um gráfico dos dados farmacocinéticos do Exemplo 27, grupo do nível à de dosagem de 3 yug/kg, mostrando a concentração de IFN beta no soro medida em ng/ml com o passar do tempo transcorrido em horas.

. 20 Figura 6B — Um gráfico de dados farmacocinéticos do Exemplo 27, grupo do nível de dosagem de 15 yug/Kkg, mostrando a concentração de IFN beta no soro medida em ng/ml com o passar do tempo transcorrido em horas.

Figura 7A — Um gráfico de dados farmacocinéticos do Exemplo 27, grupo do nível de dosagem de 50 ug/Kkg, mostrando a concentração de IFN beta no soro medida em nao/mL como passar do tempo transcorrido em horas.

Figura 7B — Um gráfico de dados farmacocinéticos do Exemplo 27 a partir dos animais tratados com M36-30K e os controles Rebif, mostrando a concentração de IFN beta no soro medida em ng/mL com o passar do tempo transcorrido em horas.

Figura 8A — Um gráfico de dados farmacocinéticos do Exemplo 27 a partir dos animais tratados com M36-40K e os controles Rebif, mostrando a concentração de IFN beta no soro medida em ng/mL com o passar do tempo transcorrido em horas.

Figura 8B - Um gráfico de dados farmacocinéticos do Exemplo 27 a partir dos animais tratados com F111-30K e os controles Rebif, mostrando a concentração de IFN beta f no soro medida em ng/mL com o passar do tempo transcorrido em horas.

Figura 9A — Um gráfico de dados farmacocinéticos do Exemplo 27 a partir dos animais tratados com F111-40K e os controles Rebif, mostrando a concentração de IFN beta no soro medida em ng/mL com o passar do tempo transcorrido em horas.

Figura 9B - Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando Cmáx de algumas variantes de IFN beta da presente invenção contra um controle (Cmáx de IFNbeta no Soro/Dosagem).

Figura 10A - Um gráfico da área sob os dados da curva (AUC) do Exemplo 27 S —mostrando AUC de algumas variantes de IFN beta da presente invenção contra um controle (AUC do IFN no Soro/Dosagem).

Figura 10B - Um gráfico de barras de dados do Exemplo 27 mostrando concentrações de IFN beta no soro em 168 horas após a dosagem com duas variantes de IFN beta diferentes da presente invenção em níveis de dosagem diferentes e um controle.

Figura 11A — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a resposta à Neopterina de algumas variantes de IFN beta da presente invenção no grupo de dosagem de 3 ug/kg contra o placebo e um controle (Neopterina no Soro/Tempo).

Figura 11B — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a resposta à Neopterina de algumas variantes de IFN beta da presente invenção no grupo de dosagem de15/ug/kg contra o placebo e um controle (Neopterina no Soro/Tempo).

Figura 12A -— Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a resposta à Neopterina de algumas variantes de IFN beta da presente invenção no grupo de dosagem á de 50 yg/Kkg contra o placebo e um controle (Neopterina no Soro/Tempo). Figura 128 — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a área sob as : 20 medições da curva para Neopterina no soro versus dosagem para algumas variantes de IFN beta da presente invenção contra o placebo e um controle (AUC de Neopterina no Soro/Dosagem).

Figura 13A — Dados do nível de Neopterina no Soro do Exemplo 27 são mostrados em 168 horas pós-dosagem com placebo, controle e três níveis de dosagem diferentes de —M36-30K.

Figura 13B — Dados do nível de Neopterina no Soro do Exemplo 27 são mostrados em 168 horas pós-dosagem com placebo, controle e três níveis de dosagem diferentes de M36-40K.

Figura 13C — Dados do nível de Neopterina no Soro do Exemplo 27 são mostrados em168 horas pós-dosagem com placebo, controle e três níveis de dosagem diferentes de F111-30K.

Figura 13D — Dados do nível de Neopterina no Soro do Exemplo 27 são mostrados em 168 horas pós-dosagem com placebo, controle e três níveis de dosagem diferentes de F111-40K.

Figura 14 — Um gráfico mostrando a AUC/dosagem de Neopterina de Rebif a partir do protocolo divulgado no Exemplo 27 e BLA.

Figura 15A — Um gráfico mostrando níveis de IFN beta 1a no soro, conforme medidos pela atividade antiviral (símbolos preenchidos e linhas cheias no gráfico) e concentrações de Neopterina (símbolos abertos e linhas tracejadas no gráfico) em macacos- resos após a administração intravenosa. Figura 15B — Um gráfico mostrando níveis de IFN beta 1a no soro, conforme S medidos pela atividade antiviral (simbolos preenchidos e linhas cheias no gráfico) e concentrações de Neopterina (símbolos abertos e linhas tracejadas no gráfico) em macacos- resos após a administração subcutânea. Figura 15C — Um gráfico mostrando a atividade antiviral de IFN beta 1a não modificado e pegilado avaliada em ensaios antivirais usando células de carcinoma de — pulmão humano (A549) provadas com vírus da EMC. Após 2 dias de incubação com o vírus, células viáveis foram pigmentadas com XTT, as placas foram lidas em 450 nn e a absorvância, que é refletiva da viabilidade celular, é mostrada no eixo y. As amostras foram analisadas em duplicata. Figura 16A — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a quantidade de indução versus pré-dosagem com veículo, Rebif e quatro variantes de IFN beta diferentes no nível de dosagem de 3 ug/kg da presente invenção da expressão do gene OAS1 contra o tempo. . Figura 16B -— Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a quantidade de " indução versus pré-dosagem com veículo, Rebif e uma média dos três níveis de dosagem h 20 diferentes de quatro variantes de IFN beta da presente invenção da expressão do gene OAS1 contra o tempo.

Figura 17A — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a quantidade de indução versus pré-dosagem com veículo, Rebif e quatro variantes de IFN beta diferentes no nível de dosagem de 15 ug/kg da presente invenção da expressão do gene OAS1 contra otempo.

Figura 17B — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a quantidade de indução versus pré-dosagem com veículo, Rebif e quatro variantes de IFN beta diferentes no nível de dosagem de 50 y9/kg da presente invenção da expressão do gene OAS1 contra o tempo.

Figura 18 — Um gráfico de dados do Exemplo 27 mostrando a área sob a curva da quantidade de indução da expressão do gene OAS1 contra o nível de dosagem para um veículo, um controle e quatro variantes de IFN beta 1a diferentes da presente invenção.

Figura 19 — Um gráfico de barras da porcentagem de reações do sítio de injeção durante as primeiras vinte e quatro horas depois da administração da dosagem.

Figura 20 — Uma tabela de dados coletados no Exemplo 27 para cada grupo de tratamento diferente — N. S. indica não significante.

Figura 21 — Uma tabela de dados coletados no Exemplo 27 para cada grupo de tratamento diferente — N. S. indica não significante.

Figura 22 — Um modelo da estrutura cristalina do IFN beta com sítios potenciais para a oxidação de metionina é mostrado. M36 e 117 estão suscetíveis à oxidação, M1 é uma parte suscetível, entretanto, quando produzido em E. Coli, o M1 deve ser clivado (entretanto, pode não ser completamente processado) e M62 é um sítio que não é suscetível à oxidação.

Figura 23 — Um modelo da estrutura cristalina do IFN beta com sítios potenciais para desamidação é mostrado. M36 e N25 são sítios potenciais — N25 é um sítio conhecido para desamidação.

Figura 24 — Cromatograma de M36pAF de IFN analisado usando métodos descritos no Exemplo 28.

Figura 25 — Cromatograma de PEG40-M36pAF analisado usando métodos descritos no Exemplo 28.

Figura 26 — Cromatograma sobreposto de M36pAF e PEG40-M36pAF de IFN usando métodos descritos no Exemplo 28.

Figura 27 — Ligação dissulfeto reduzida de IFN-M36pAF e analisada usando o método descrito no Exemplo 28. . Figura 28 — Ligação dissulfeto reduzida de PEGA40-IFN36pAF e analisada usando o : método descrito no Exemplo 28. FF - 20 DEFINIÇÕES Deve ser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, constructos e reagentes particulares descritos neste relatório e, como tal, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste relatório é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. Conforme usado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o”, “a”, incluem a referência no plural, a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Assim, por exemplo, referência a um “IFN beta”, “IFNS” ou —“polipeptídeo de IFN beta” e várias formas hifenizadas e não hifenizadas é uma referência a uma ou mais proteínas e inclui equivalentes das mesmas conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, e assim por diante. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado, conforme comumente entendido por uma pessoa — de habilidade comum na técnica a qual! esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório possam ser usados na prática ou testes da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos serão agora descritos. Todas as publicações e patentes mencionadas neste relatório são incorporadas como referência para o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, os constructos e metodologias que são descritos nas publicações, as quais podem ser usadas em relação à invenção presentemente descrita. As publicações debatidas neste relatório são fornecidas somente para sua divulgação antes da data do depósito do presente pedido. Nada neste relatório deve ser interpretado como uma admissão da qual os inventores não são intitulados a preceder tal divulgação, em virtude da invenção anterior ou por qualquer outra razão.

O termo “substancialmente purificado” refere-se a um polipeptídeo de IFN beta que pode ser substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína, conforme encontrada em seu ambiente que ocorre naturalmente, isto é, uma célula nativa ou célula hospedeira, no caso de polipeptídeos de IFN beta recombinantemente produzidos. O polipeptídeo de IFN beta que pode ser substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30 %, menos do que cerca de 25 %, menos do que cerca de 20 %, menos do que cerca de 15 %, menos do que cerca de 10 %, menos do que cerca de 5 %, E menos do que cerca de 4 %, menos do que cerca de 3 %, menos do que cerca de 2 % ou menos do que cerca de 1 % (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o : 20 —polipeptídeo de IFN beta ou variante do mesmo é recombinantemente produzido pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente em cerca de 30 %, cerca de 25 %, cerca de 20 %, cerca de 15 %, cerca de 10 %, cerca de 5 %, cerca de 4 %, cerca de 3 %, cerca de 2 % ou cerca de 1 % ou menos do peso seco das células. Quando o polipeptídeo de IFN beta ou variante do mesmo é recombinantemente produzido pelas células — hospedeiras, a proteína pode estar presente no meio de cultura em cerca de 5 g/L, cerca de 4 g/L, cerca de 3 g/L, cerca de 2 g/L, cerca de 1 9/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 10 mg/L ou cerca de 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Assim, o polipeptídeo de IFN beta “substancialmente purificado”, conforme produzido pelos métodos da presente invenção, — podem ter um nível de pureza de pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, especificamente, um nível de pureza de pelo mehos cerca de 75 %, 80 %, 85 %, e mais especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 90 %, um nível — de pureza de pelomenos cerca de 95 %, um nível de pureza de pelo menos cerca de 99 % ou mais, conforme determinado pelos métodos apropriados, tais como análise por SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC e eletroforese capilar.

Uma “célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira" refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, não obstante o método usado para inserção, por exemplo, absorção direta, transdução, f-conjugação ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleotídeo exógeno pode ser S —mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo, ou alternativamente pode ser integrado no genoma hospedeiro.

Conforme usado neste relatório, o termo “meio” ou “meios” inclui qualquer meio de cultura, solução, suporte sólido, semissólido ou rígido que pode suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras de planta, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamífero, células de CHO, células hospedeiras procarióticas, células hospedeiras de E. Coli ou Pseudomonas e teores celulares. Assim, o termo pode abranger o meio em que a célula hospedeira foi cultivada, por exemplo, o meio em que o polipeptídeo de IFN beta foi secretado, incluindo o meio antes ou depois de uma etapa de proliferação. O termo também pode abranger tampões ou reagentes que contêm Os lisatos de célula hospedeira, tais como no caso onde o polipeptídeo de IFN beta é intracelularmente produzido e as células hospedeiras são lisadas ou divididas para liberar o é polipeptídeo de IFN beta.

: “Agente redutor”, conforme usado neste relatório com respeito à redobra da > 20 proteína, é definido como qualquer composto ou material que mantém grupos sulfidrila no estado reduzido e reduz ligações dissulfeto intra ou intermoleculares. Agentes redutores adequados incluem, mas não são limitados ao ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteina, cisteamina (2-aminoetanotiol) e glutationa reduzida. É facilmente evidente àqueles de habilidade comum na técnica que uma ampla variedade de agentes redutores é adequada para o uso nos métodos e composições da presente invenção.

“Agente oxidante”, conforme usado neste relatório com respeito à redobra da proteína, é definido como qualquer composto ou material que é capaz de remover um elétron de um composto sendo oxidado. Agentes oxidantes adequados incluem, mas não são limitados à glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado e oxigênio. É facilmente evidente àqueles de habilidade comum na técnica que uma ampla variedade de agentes oxidantes é adequada para o uso nos métodos da presente invenção.

“Agente desnaturante” ou “desnaturante”, conforme usado neste relatório, é definido f como qualquer composto ou material que causará uma não redobra reversível de uma proteína. A resistência de um agente desnaturante ou desnaturante será determinada tanto pelas propriedades quanto pela concentração do agente desnaturante ou desnaturante particular. Agentes desnaturantes ou desnaturantes adequados podem ser caotrópicos, detergentes, solventes orgânicos, solventes miscíveis em água, fosfolipídeos ou uma combinação de dois ou mais dos tais agentes. Caotrópicos adequados incluem, mas não são limitados à ureia, guanidina e tiocianato de sódio. Detergentes úteis podem incluir, mas não são limitados aos detergentes fortes, tais como dodecil sulfato de sódio ou éteres de polioxietileno (por exemplo, detergentes Tween ou Triton), Sarcosil, detergentes não iônicos — suaves (por exemplo, digitonina), detergentes catiônicos suaves, tais como N-2,3-(Dioleióxi)- propil-N,N N-trimetilamônio, detergentes iônicos suaves (por exemplo, colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwitteriônicos incluindo, mas não limitados às sulfobetaínas (Zwittergente), sulfato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamônio-1-propano (CHAPS) e sulfonato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamônio-2-hidróxi-1-propano (CHAPSO).

Solventes miscíveis em água e orgânicos, tais como acetonitrila, alcanóis inferiores (especialmente alcanóis Cx-C,, tais como etanol ou isopropanol) ou alcanodióis inferiores (especialmente alcanodióis C3-C,, tais como etilenogilcol) podem ser usados como desnaturantes. Fosfolipídeos úteis na presente invenção podem ser fosfolipídeos que ocorrem naturalmente, tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina e fosfatidilinositol ou derivados ou variantes de fosfolipídeos sintéticos, tais como di- hexanoilfosfatidilcolina ou di-heptanoilfosfatidilcolina.

“Redobra”, conforme usado neste relatório, descreve qualquer processo, reação ou R método que transforma a ligação dissulfeto contendo polipeptídeos a partir de um estado impropriadamente redobrado ou não redobrado a uma conformação nativa ou propiamente - 20 redobrada com respeito às ligações dissulfeto.

“Corredobra”, conforme usado neste relatório, refere-se especificamente aos processos, reações ou métodos de redobra que utilizam pelo menos dois polipeptídeos que interagem entre si e resultam na transformação de polipeptídeos não redobrados ou impropriadamente redobrados a polipeptídeos nativos, propiamente redobrados.

Conforme usado neste relatório, “polipeptídeo de IFN beta”, “IFN beta” ou “IFNf” e formas hifenizadas e não hifenizadas do mesmo devem incluir aqueles polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de um IFN beta, assim como as formas 1a e 1b, formas a e b, análogos de IFN beta, isoformas de IFN beta, miméticos de IFN beta, fragmentos de IFN beta, proteínas de IFN beta híbridas, proteínas de fusão, —oligômeros e multímeros, homológos, variantes padrão de glicosilação, variantes, variantes de encaixe e muteínas dos mesmos, não obstante a atividade biológica dos mesmos, e ainda não obstante o método de síntese ou fabricação dos mesmos, incluindo, mas não : limitado ao método recombinante (se produzidos a partir do CDONA, DNA genômico, DNA sintético ou outra forma de ácido nucléico), in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácido nucléico, sintético, transgênico e métodos do gene ativado. O termo “polipeptídeo de IFN beta”, “IFN$” e “IFN beta” abrange polipeptídeos de IFN beta compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos.

Conforme usado neste relatório, “interferon” ou “IFNº deve incluir aqueles polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de um interferon, incluindo, mas não limitado a IFNa, IFNB, IFNy, IFNo, IFNe ou IFNr ou citocinas do tipo interferon, tais como limitina (tais como aquelas descritas nas Patentes U.S. 4.414,150;

4.456.748; 4.727.138; 4.762.791, 4.929.554; 5.096.705; 4.695.623; 4.614.651; 4.678.751;

4.925.793; 5.460.811; 5.120.832; 4.780.530; 4.908.432; 4.970.161; 4.973.479; 4.975.276;

5.098.703; 5.278.286; 5.661.009; 6.372.206; 6.433.144; 6.472.512; 6.572.853; 6.703.225;

6.200.780; 6.299.869; 6.300.475; 6.323.006; 6.350.589; 5.705.363; 5.738.845; 5.789.551;

6.117.423; 6.174.996; 5.540.923; 5.541.293; 5.541.312; 5.554.513; 5.593.667, as quais são incorporadas como referência neste relatório), assim como análogos de IFN, isoformas de IFN, miméticos de IFN, fragmentos de IFN, proteínas de IFN híbridas, proteínas de fusão, oligêmeros e multímeros, homológos, variantes padrão de glicosilação, variantes, variantes de encaixe e muteínas dos mesmos, não obstante a atividade biológica dos mesmos, e ainda não obstante o método de síntese ou fabricação dos mesmos, incluindo, mas não limitado ao método recombinante (se produzidos a partir do CDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outra forma de ácido nucléico), in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácido nucléico, sintético, transgênico e métodos do gene ativado. Exemplos específicos de h IFN incluem, mas não são limitados a IFNy-1b (Actimmune?), IFN6-1a (Avonexº e Rebifº), E IFN6-1b (Betaseronº), IFN de consenso, IFN alfacon-1 (Infergenº), IFNa-2 (Intron Aº), IFNa- 2a (Roferon-Aº), Peginterferon alfa-2a (PEGASYS”), Peginterferon alfa-2b (PEG-Intron), análogo de IFN, mutantes de IFN, IFN humano glicosilado alterado e análogos de IFN conjugados a PEG. Exemplos específicos de células modificadas para a expressão de IFN humano endógeno são descritos em Devlin et a/., J. Leukoc. Biol. 41:306 (1987); Patentes U.S. Nº 6.610.830; 6.482.613; 6.489.144; 6.159.712; 5.814.485; 5.710.027; 5.595.888;

4.966.843; os quais são incorporados como referência neste relatório. Veja, também, Patentes U.S. Nº 6.716.606; 6.379.661; 6.004.548; 5.830.705; 5.582.823; 4.810.643; e

6.242.218, as quais são incorporadas como referência neste relatório, para a expressão dos membros da família do GH. Substituições em uma ampla variedade de posições de aminoácido no IFN beta foram descritas. Substituições incluem, mas não são limitadas àquelas que modulam a estabilidade farmacêutica, aumentam a atividade agonista, aumentam a resistência à protease, convertem o polipeptídeo em um antagonista, etc. e são abrangidas pelo termo “polipeptídeo de IFN beta” ou “IFN 6”. Polipeptídeos de IFN beta compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos foram descritos na Publicação da Patente U.S. Nº 2005/0054053. Variantes de IFN-P que exibem imunogenicidade modificada compreendendo pelo menos uma modificação em uma posição selecionada do grupo que consiste de 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 8, 9, 12, 15, 16, 22, 28, 30, 32, 36, 42, 43 e 46, 47, 48, 49, 51,

92, 93, 96, 100, 101, 104, 111, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 130, 148 e 155 foram descritas. As modificações nos resíduos 5, 8, 15, 47, 111, 116 e 120 podem ser mutações de substituição que são selecionadas do grupo que consiste de alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina e lisina. Modificações — nos resíduos 22, 28, 30, 32, 36, 92, 130, 148 e 155 podem ser selecionadas do grupo que inclui alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, serina, treonina e lisina. Estas variantes foram descritas para ter solubilidade aumentada levando à imunogenicidade reduzida. Uma modificação selecionada do grupo que consiste de: L5A, LSD, L5SE, L5K, L5N, LSQ, LSR, LSS, LST, F8A, F8D, F8E, F8K, F8N, —F8Q, F8R, F8S, S12E, S12K, S12Q, S12R, W22E, L28Q, Y30H, L32A, E43K, E43R, L47K, Y92Q, E104R, E104K, E104H, E104Q, E104A, F111N, R113D, R113E, R113Q, R113A, L116D, L116E, L116N, L116Q, L116R, M117R, L120D, L120R, L130R, V148A e Y1558S pode estar presente em um polipeptídeo da invenção. Um polipeptídeo de IFN beta da invenção pode compreender uma ou mais substituições de aminoácidos naturais. A substituição C178S foi descrita previamente. A Patente U.S. Nº 2005/0054053 descreve variantes de IFN beta com uma substituição LSQ além da substituição C17S (SEQ ID NO:19 da Patente U.S. Nº 2005/0054053), com uma substituição LSQ e F8E além da substituição a C178 (SEQ ID NO:20 da Patente U.S. Nº 2005/0054053), com uma substituição L5Q, F8E e F111N além da substituição C178 (SEQ ID NO:21 da Patente U.S. Nº 2005/0054053), com > 20 uma substituição LSQ, F8E e L116E além da substituição C17S (SEQ ID NO:22 da Patente U.S. Nº 2005/0054053), com uma substituição FB8E, F111N e L116E além da substituição C178 (SEQ ID NO:23 da Patente U.S. Nº 2005/0054053), com uma substituição LSQ, F8E, F11IN e L116E além da substituição C17S (SEQ ID NO:24 da Patentes U.S. Nº 2005/0054053) e com uma substituição LSQ, F8E, L47K, F111N, L116E e L120R além da — substituição C17S (SEQ ID NO: 25 da Patente U.S. Nº 2005/0054053.

Em um aspecto adicional, IFN beta variante e proteínas com imunogenicidade reduzida exibem ligação reduzida em pelo menos um alelo do MHC da classe Il humano. Nesta modalidade (assim como para outras variantes modificadas por imunogenicidade), pelo menos uma modificação de aminoácido pode ser feita em pelo menos uma das posições seguintes: agretopo 1: resíduos 3 a 11; agretopo 2: resíduos 5 a 13; agretopo 3: resíduos 8 a 16; agretopo 4: resíduos 9 a 17; agretopo 5: resíduos 15 a 23; agretopo 6: resíduos 22 a 30; agretopo 7: resíduos 30 a 38; agretopo 8: resíduos 36 a 44; agretopo 9: í resíduos 47 a 55; agretopo 10: resíduos 57 a 65; agretopo 11: resíduos 60 a 68; agretopo 12: resíduos 63 a 71; agretopo 13: resíduos 70 a 78; agretopo 14: resíduos 79 a 87; —agretopo 15: resíduos 95 a 103; agretopo 16: resíduos 122 a 130; agretopo 17: resíduos 125 a 133; agretopo 18: resíduos 129 a 137; agretopo 19: resíduos 130 a 138; agretopo 20: resíduos 143 a 151; agretopo 21: resíduos 145 a 153; agretopo 22: resíduos 146 a 154;

agretopo 23: resíduos 148 a 156; agretopo 24: resíduos 151 a 159; agretopo 25: resíduos 154 a 162; agretopo 26: resíduos 156 a 164; agretopo 27: resíduos 157 a 165. Variantes também incluem modificações de aminoácido em dois ou mais destes agretopos. Em um aspecto adicional, a invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes que codificam as proteínas variantes, vetores de expressão contendo os ácidos nucléicos variantes, células hospedeiras compreendendo os ácidos nucléicos variantes e/ou vetores de expressão e métodos para produzir as proteínas variantes. Em um aspecto adicional, a invenção fornece tratar um distúrbio responsivo ao interferon, administrando-se a um paciente uma proteína variante, usualmente com um portador farmacêutico, em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos para modular a imunogenicidade (particularmente reduzir a imunogenicidade) de interferons (particularmente IFN beta) alterando-se epítopos do MHC da Classe |. Mutantes de IFN beta debatidos na Patente U.S. Nº 7.144.574, a qual é integralmente incorporada como referência, incluem polipeptídeos compreendendo uma ou —maisdas modificações seguintes: D110F; C17S; Q49N; Q51T; F111N; R113T; K19R; K33R; K45R; Q51S; R113S; Q48F; Q48V; Q48W; Q48Y; D110V; D110W; D110Y, as quais são glicosiladas ou não glicosiladas. O WO 2005/016371, o qual é incorporado como referência t neste relatório, descreve um polipeptídeo de IFN beta-1b que é seletivamente oxidado. Outros mutantes incluem, mas não são limitados a um análogo compreendendo interferon- > 20 beta nativo em que a asparagina na posição 25 é desamidada (veja, WO 2006/053134) e aqueles com glicosilação diferente, conforme descrito no WO 2006/049423, ambos os quais são incorporados como referência neste relatório. A otimização do códon para a expressão de E. Coli do IFN beta é descrita no WO 2006/015165, o qual é incorporado como referência neste relatório. Para sequências do IFN beta que carecem de uma sequência líder, veja, SEQ ID NO: 1 e 3 neste relatório. Para uma sequência do IFN beta com uma sequência líder, veja, SEQ ID NO: 4 neste relatório. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta da invenção são substancialmente idênticos à SEQ ID NOs: 1, 3 e 4 ou qualquer outra sequência de um polipeptídeo de IFN beta. Moléculas de ácido nucléico que codificam —polipeptídeos de IFN beta incluindo mutantes e métodos para expressar e purificar polipeptídeos de IFN beta são bem conhecidas e incluem, mas não são limitadas àquelas divulgadas na Patente U.S. Nº 4.462,940; Patente U.S. Nº 4.518.584; Patente U.S. Nº

5.702.699; Patente U.S. Nº 6.962.978; Patente U.S. Nº 5.814.485; Patente U.S. Nº

6.887.462; Patente U.S. Nº 6.800.735; Patente U.S. Nº 6.514.729; Publicação U.S. Nº US2002/0137895, US2004/0115169 e US2005/0054053, as quais são incorporadas integralmente como referência neste relatório. O termo “polipeptídeo de IFN beta" também inclui os sais e pró-medicamentos farmaceuticamente aceitáveis e pró-medicamentos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisômeros do IFN beta que ocorre naturalmente, assim como agonistas, miméticos e variantes antagonistas do IFN beta que ocorre naturalmente e fusões de polipeptideo dos mesmos.

Fusões

— compreendendo aminoácidos adicionais no terminal amino, terminal carboxila ou ambos, são abrangidas pelo termo “polipeptídeo de IFN beta”. Fusões exemplares incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, IFN beta metionila, em que uma metionina é ligada ao N- terminal do IFN beta resultante da expressão recombinante da forma madura do IFN beta carecendo do peptídeo ou porção líder ou sinal do mesmo (uma metionina é ligada ao N-

terminal do IFN beta resultante da expressão recombinante), fusões para o propósito de purificação (incluindo, mas não limitadas à poli-histidina ou epítopos de afinidade), fusões com peptídeos de ligação à albumina sérica e fusões com proteínas do soro, tais como albumina sérica.

A Patente U.S.

Nº 5.750.373, a qual é incorporada como referência neste relatório, descreve um método para selecionar novas proteínas, tais como hormônio do crescimento e variantes do fragmento do anticorpo tendo propriedades de ligação alteradas quanto as suas moléculas receptoras respectivas.

O método compreende a fusão de um gene que codifica uma proteína de interesse ao domínio do terminal carbóxi da proteína de cobertura do gene Ill do fago M13 filamentoso.

Moléculas quiméricas compreendem IFN : beta e uma ou mais outras moléculas.

A molécula quimérica pode conter regiões ou - 20 fragmentos específicos de um ou ambos os IFN beta e outra(s) molécula(s). Quaisquer tais fragmentos podem ser preparados a partir das proteínas por métodos bioquímicos padrão ou expressando-se um polinucleotídeo que codifica o fragmento.

IFN beta ou um fragmento do mesmo, pode ser produzido como uma proteína de fusão compreendendo albumina sérica humana (HSA), Fc ou uma porção do mesmo.

Tais constructos de fusão são

— adequados para realçar a expressão do IFN beta ou fragmento do mesmo, em uma célula hospedeira eucariótica.

Porções de HSA exemplares incluem o polipeptídeo N-terminal (aminoácidos 1 a 369, 1 a 419 e os comprimentos intermediários iniciando com o aminoácido 1), conforme divulgado na Pat.

US.

Nº 5.766.883 e publicação do WO 97/24445, as quais são incorporadas como referência neste relatório.

Outros polipeptídeos

—quiméricos podem incluir uma proteína de HSA com IFN beta ou fragmentos do mesmo, ligados a cada uma das extremidades C-terminais e N-terminais da HSA.

Tais constructos de HSA são divulgados na Pat.

U.S.

Nº 5.876.969, a qual é incorporada como referência neste relatório.

Outras fusões podem ser criadas pela fusão de interferon beta com aja porção Fc de uma imunoglobulina; b) um análogo da porção Fc de uma imunoglobulina; e c)

fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina.

À publicação da Patente U.S.

Nº 2005/0054053 descreve o interferon beta circularmente permutado e fusões do IFN beta com uma imunoglobulina ou uma região de uma imunoglobulina.

Várias referências divulgam a modificação de polipeptídeos por conjugação ou glicosilação do polímero. O termo “polipeptídeo de IFN beta” inclui polipeptídeos conjugados a um polímero, tal como PEG, e pode ser compreendido de uma ou mais derivatizações adicionais de cisteína, lisina ou outros resíduos. Além disso, o polipeptídeo de IFN beta pode compreender um ligador ou polímero, em que o aminoácido ao qual o ligador ou polímero é conjugado pode ser um aminoácido não natural, de acordo com a presente invenção, ou pode ser conjugado a um aminoácido que ocorre naturalmente codificado utilizando técnicas conhecidas no ramo, tais como ligação à lisina ou cisteína. A modificação do polímero de IFNS nativo ou uma variante C178 do mesmo foi relatada (EP 229108, Pat. U.S. Nº 5.382.657; EP 593868; Pat. U.S. Nº 4.917.888 e WO 99/55377, os quais são incorporados como referência neste relatório). Conjugados poliméricos de interferon-beta-1a também foram descritos na Patente U.S. Nº 6.962.978, a qual é incorporada como referência neste relatório. Interferons compreendendo um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados foram descritos na Publicação da Patente U.S. Nº US 2005/0220762; WO 2006/133089; e WO 2006/133088, os quais são integralmente incorporados como referência neste relatório. Basu et al. em Bioconjugate Chem 2006 17:618-630 avaliaram a estabilidade, solubilidade, agregação, imunogenicidade À e propriedades farmacocinéticas de mais de 20 polipeptídeos de interferon-beta-1b mono- : PEGilados ou multi-PEGilados seletivos ao sítio. Os conjugados foram formados nos > 20 resíduos de lisina ou no N-terminal.

Exemplos de moléculas de IFN PEGiladas incluem aqueles divulgados nas Patentes U.S. Nº: 6.524.570; 6.250.469; 6.180.096; 6.177.074; 6.042.822; 5.981.709;

5.951.974; 5.908.621; 5.738.846; 5.711.944; 5.382.657, as quais são incorporadas como referência neste relatório. IFNB é mencionado como um exemplo de um polipeptídeo pertencente à superfamília do hormônio do crescimento. O WO 00/23114 divulga IFN6 glicosilado e pegilado. O WO 00/23472 divulga proteínas de fusão de IFN£. A Pat. U.S. Nº

4.904.584 divulga polipeptídeos depletados por lisina PEGilados, em que pelo menos um resíduo de lisina foi suprimido ou substituído com qualquer outro resíduo de aminoácido. O WO 99/67291 divulga um processo para conjugar uma proteína com PEG, em que pelo —menos um resíduo de aminoácido na proteína é suprimido e a proteína é contatada com PEG sob condições suficientes para obter a conjugação com a proteína. O WO 99/03887 divulga variantes PEGiladas de polipeptídeos pertencentes à superfamília do hormônio do crescimento, em que um resíduo de cisteina foi substituído com um resíduo de aminoácido não essencial localizado em uma região especificada do polipeptídeo. O WO 00/26354 —divulgaum método de produzir uma variante de polipeptídeo glicosilada com alergenicidade reduzida, que em comparação a um polipeptídeo precursor correspondente, compreende pelo menos um sítio de glicosilação adicional. IFN6 é divulgado como um exemplo entre muitos polipeptídeos que podem ser modificados, de acordo com a tecnologia descrita na Pat. U.S. Nº 5.218.092, a qual é incorporada como referência neste relatório. A Pat. U.S. Nº

5.218.092, a qual é incorporada como referência neste relatório, divulga a modificação do fator estimulador da colônia de granulócitos (G-CSF) e outros polipeptídeos, de modo a S introduzir pelo menos uma cadeia de carboidrato adicional em comparação ao polipeptídeo nativo. O termo “polipeptídeo de IFN beta” também inclui IFN beta glicosilado, tal como, mas não limitado aos polipeptídeos glicosilados em qualquer posição do aminoácido e formas glicosiladas N-ligadas ou O-ligadas do polipeptídeo. Variantes contendo mudanças de nucleotídeo únicas também são consideradas como variantes biologicamente ativas do polipeptídeo de IFN beta. Além disso, variantes de encaixe também são incluídas. O termo “polipeptídeo de IFN beta” também inclui heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros ou homomultímeros do polipeptídeo de IFN beta de qualquer um ou mais polipeptídeos de IFN beta ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, polímero, molécula pequena, ligador, ligante ou outra molécula biologicamente ativa de qualquer tipo, ligado por meios químicos ou expressado como uma proteína de fusão, assim como análogos do polipeptídeo contendo, por exemplo, deleções específicas ou outras modificações mantendo ainda a k atividade biológica. E Todas as referências às posições de aminoácido no IFN beta descrito neste - 20 relatório são fundamentadas na posição na SEQ ID NO: 1, a menos que de outro modo especificado (isto é, quando é estabelecido que a comparação é fundamentada na SEQ ID NO: 3 e 4 ou outra sequência de IFN beta). Por exemplo, o aminoácido na posição 1 da SEQ ID NO: 1, é uma metionina e a metionina correspondente está localizada na SEQ ID NO: 4 na posição 22. Aqueles de habilidade na técnica avaliarão que as posições de aminoácido correspondentes às posições na SEQ ID NO: 1 podem ser facilmente identificadas em qualquer outra molécula de IFN beta, tal como a SEQ ID NO: 3 e 4. Aqueles de habilidade na técnica avaliarão que as posições de aminoácido correspondentes às posições na SEQ ID NO: 1, 3 e 4 ou qualquer outra sequência de IFN beta podem ser facilmente identificadas em qualquer outra molécula de IFN beta, tal como fusões, variantes, fragmentos de IFN beta, etc. Por exemplo, os programas de alinhamento de sequência, tais como BLAST, podem ser usados para alinhar e identificar uma posição particular em uma proteína que corresponde a uma posição na SEQ ID NO: 1, 3 e 4 ou outra sequência de IFN beta. Substituições, deleções ou adições de aminoácidos, descritas neste relatório em referência à SEQ ID NO: 1, 3 e 4 ou outra sequência de IFN beta, também se referem às — substituições, deleções ou adições em posições correspondentes nas fusões, variantes, fragmentos de IFN beta, etc. descritos neste relatório ou conhecidos na técnica e são expressamente abrangidas pela presente invenção.

O termo “polipeptídeo de IFN beta” ou “IFN beta” abrange polipeptídeos de IFN beta compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Os polipeptídeos de IFN beta da presente invenção podem ser compreendidos de modificações com um ou mais aminoácidos naturais em combinação com uma ou mais modificações de — aminoácidos não naturais. Substituições exemplares em uma ampla variedade de posições de aminoácido em polipeptídeos de IFN beta que ocorrem naturalmente foram descritas, incluindo mas não limitadas às substituições que modulam a estabilidade farmacêutica, que modulam uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de IFN beta, tais como mas não limitadas ao aumento da atividade agonista, aumentam a solubilidade do polipeptídeo, diminuem a suscetibilidade à protease, convertem o polipeptídeo em um antagonista, etc. e são abrangidas pelo termo “polipeptídeo de IFN beta”. Em algumas modalidades, o antagonista de IFN beta compreende um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação ao receptor da molécula de IFN beta.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta compreendem ainda uma adição, substituição ou deleção que modula a atividade biológica do polipeptídeo de IFN beta. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta compreendem ainda uma fe adição, substituição ou deleção que modula a atividade antiviral do polipeptídeo de IFN beta. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta compreendem ainda uma adição, - 20 substituição ou deleção que realça a atividade antiviral do polipeptídeo de IFN beta. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular uma ou mais propriedades ou atividades do IFN beta. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para o receptor de IFN, modular a meia-vida circulante, modular a meia- vida terapêutica, modular a estabilidade do polipeptídeo, modular a clivagem através de —proteases, modular a dosagem, modular a liberação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação ou aperfeiçoar ou alterar uma via particular de administração. Similarmente, os polipeptídeos de IFN beta podem compreender sequências de clivagem da protease, grupos reativos, domínios de ligação ao anticorpo (incluindo mas não limitados a FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base na afinidade (incluindo mas não limitadas a FLAG, poli-His, —GST, etc) ou moléculas ligadas (incluindo mas não limitadas à biotina) que aperfeiçoam a detecção (incluindo mas não limitadas a GFP), purificação ou outros traços do polipeptídeo.

O termo “polipeptídeo de IFN beta” também abrange homodímeros, heterodímeros, homomultímeros e heteromultímeros que são ligados, incluindo mas não limitados àqueles & ligados diretamente por intermédio de cadeias laterais de aminoácido que não ocorre — naturalmente codificado, dos mesmos ou diferentes cadeias laterais de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados, às cadeias laterais de aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados ou indiretamente por intermédio de um ligador. Ligadores exemplares incluem, mas não são limitados aos compostos orgânicos pequenos, polímeros solúveis em água de uma variedade de comprimentos, tais como poli(etilenoglico!l) ou polidextrano ou polipeptídeos de vários comprimentos.

Um “aminoácido que não ocorre naturalmente codificado” refere-se a um aminoácido que não é aquele dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína.

Outros termos que podem ser usados sinonimicamente com o termo “aminoácido que não ocorre naturalmente codificado” são “aminoácido não natural”, “aminoácido que não ocorre naturalmente" e várias versões hifenizadas e não hifenizadas dos mesmos.

O termo “aminoácido que não ocorre naturalmente codificado” também inclui, mas não é limitado aos aminoácidos que ocorrem por modificação (por exemplo, modificações pós-tradução) de um aminoácido que ocorre naturalmente codificado (incluindo mas não limitado aos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), porém não são por si só naturalmente incorporados em uma cadeia de polipeptídeo crescente pelo complexo de tradução.

Exemplos de tais aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, mas não são limitados a N-acetilglicosaminil-L-serina, N-acetilglicosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina.

Um “grupo de modificação no terminal amino" refere-se a qualquer molécula que pode ser ligada ao terminal amino de um polipeptídeo.

Similarmente, um “grupo de E modificação no terminal carbóxi” refere-se a qualquer molécula que pode ser ligada ao terminal carbóxi de um polipeptídeo.

Grupos de modificação terminal incluem, mas não são - 20 limitados aos vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas, tais como albumina sérica ou outras porções que aumentam a meia-vida no soro de peptídeos.

Os termos “grupo funcional”, “porção ativa”, “grupo de ativação”, “grupo de partida”, “sítio reativo”, “grupo quimicamente reativo” e “porção quimicamente reativa” são usados na técnica e neste relatório com referência às porções ou unidades distintas e definíveis de uma molécula.

Os termos são, de certa forma, sinônimos nas técnicas químicas e são usados neste relatório para indicar as porções de moléculas que realizam alguma função ou atividade e são reativas com outras moléculas.

O termo “ligação” ou “ligador” é usado neste relatório com referência aos grupos ou ligações que normalmente são formados como o resultado de uma reação química e tipicamente são ligações covalentes.

Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo mas não limitadas às condições fisiológicas durante um período de tempo prolongado, talvez até indefinido.

Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis ã significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, por exemplo, no sangue.

Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas.

Conforme entendido na técnica, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal do polímero ou no grupo ligador entre a cadeia principal do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula do polímero. Por exemplo, ligações éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo geralmente hidrolizam sob condições fisiológicas para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não são limitadas às ligações carbonato; ligações imina que resultaram da reação de uma amina e um aldeído; ligações éster de fosfato formadas reagindo-se um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são o produto de reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o — produto de reação de um formiato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo mas não limitadas em uma extremidade de um polímero, tal como PEG e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo mas não limitadas na extremidade de um polímero e um grupo hidroxila 5' de um oligonucleotídeo.

O termo “molécula biologicamente ativa”, “porção biologicamente ativa” ou “agente biologicamente ativo”, quando usado neste relatório, significa qualquer substância que pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula À ou interação e referem-se a um organismo, incluindo mas não limitado aos vírus, bactérias, . bacteriófago, transposons, príon, insetos, fungos, plantas, animais e seres humanos. Em * 20 particular, conforme usado neste relatório, moléculas biologicamente ativas incluem, mas não são limitadas a qualquer substância intencionada para diagnose, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais ou, de outro modo, intensificar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não são limitados aos peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequena, vacinas, imunogenes, fármacos pesados, fármacos leves, carboidratos, átomos ou moléculas inorgânicos, corantes, lipídeos, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonucleotídeos, toxóides, toxinas, células procarióticas e eucarióticas, vírus, polissacarídeos, ácidos nucléicos e porções dos mesmos obtidas ou derivados de vírus, bactérias, insetos, animais ou qualquer outra célula ou tipo celular, —lipossomos, micropartículas e micelas. Os polipeptídeos de IFN beta podem ser adicionados em uma formulação micelular; veja, Pat. U.S. Nº 5.833.948, a qual é integralmente incorporada como referência neste relatório. Classes de agentes biologicamente ativos que são adequados para o uso com a invenção incluem, mas não são limitados aos fármacos, pró-fármacos, radionuclídeos, agentes de imageamento, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumor, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedade, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteroidais, toxinas microbianamente derivadas e semelhantes.

Um “polímero bifuncional" refere-se a um polímero compreendendo dois grupos funcionais distintos que são capazes de reagir especificamente com outras porções (incluindo mas não limitadas aos grupos laterais de aminoácido) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um ligador bifuncional tendo um grupo funcional reativo com S um grupoem um componente biologicamente ativo particular e um outro grupo reativo com um grupo em um segundo componente biológico, pode ser usado para formar um conjugado que inclui o primeiro componente biologicamente ativo, o ligador bifuncional e o segundo componente biologicamente ativo. Muitos procedimentos e moléculas ligadoras para a ligação de vários compostos aos peptídeos são conhecidos. Veja, por exemplo, Pedido de Patente Europeu Nº 188.256; Patentes U.S. Nº 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784,

4.680.338 e 4.569.789, os quais são incorporados como referência neste relatório. Um “polímero multifuncional” refere-se a um polímero compreendendo dois ou mais grupos funcionais distintos que são capazes de reagir especificamente com outras porções (incluindo mas não limitadas aos grupos laterais de aminoácido) para formar ligações —covalentes ou não covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode ter qualquer comprimento ou peso molecular desejado e pode ser selecionado para fornecer um espaçamento ou conformação desejado particular entre uma ou mais moléculas ligadas : ao IFN beta e seu receptor ou IFN beta. Onde grupos substituintes são especificados pelas suas fórmulas químicas * 20 convencionais, escritas da esquerda para a direita, eles abrangem igualmente os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da escrita da estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, a estrutura -CH,O- é equivalente à estrutura -OCH,-. O termo “substituintes” inclui, mas não é limitado aos “substituintes não interferentes”. “Substituintes não interferentes"” são aqueles grupos que produzem compostos estáveis. Substituintes ou radicais não interferentes adequados incluem, mas não são limitados a halo, alquila Cy-Cio, alquenila C2-Cio, alquinila Cz-Cio, alcóxi Cr-Cio, aralquila Cr-Cy, alcarila Cy-Ci2, cicloalquila Ca-Cio, cicloalquenila C3-C12, fenila, fenila substituído, toluoíla, xilenila, bifenila, alcoxialquila C2a-C12, alcoxiarila Ca-Ci2, ariloxialquila C;- C12, oxoarila C7-C12, alquilsulfinilta C1-Cs, alquilsulfonila C1-Cro, -(CHo)m -O-(alquila C-C,) em quem é de 1 a 8, arila, arila substituído, alcóxi substituído, fluoroalquila, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquila, -NO,, -CN, -NRC(O)-(alquila C,1- Cio), -C(O)-(alquila C1-Cro), alquiltioalquila Ca-Cio, -C(0)O-(alquita C1-C1o), -OH, -SO,, =S, - COOH, -NR>, carbonila, -C(O)-(alquila C1-C10)-CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR>, -(arila C1-C15)-S- h (arila Cs-Cr1o), -C(O)-(arila C;-Cro), -(CH2)Jm-O-(-(CH2).n-O-(alquila C1-Cxo), em que cada m é de1a8 -C(O)INR>2 -C(S)INR2, -SO2NR>2, -NRC(O) NR2, -NRC(S) NR, sais dos mesmos e semelhantes. Cada R, conforme usado neste relatório, é H, alquila ou alquila substituído, arila ou arila substituído, aralquila ou alcarila.

O termo “halogênio” inclui flúor, cloro, iodo e bromo.

O termo “alquila”, por si só, ou como parte de um outro substituinte, significa, a menos que de outro modo estabelecido, um radical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramiíficada ou cíclico ou combinação dos mesmos, o qual pode ser completamente saturado, —monooupoli-insaturado e pode incluir radicais di e multivalentes, tendo o número de átomos de carbono designado (isto é, C;-C;, significa um a dez carbonos). Exemplos de radicais hidrocarboneto saturados incluem, mas não são limitados aos grupos, tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclo-hexila, (ciclo- hexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros, por exemplo, de n-pentila, n-hexila, n- heptila, n-octila e semelhantes. Um grupo alquila insaturado é aquele tendo uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupos alquila insaturados incluem, mas não são limitados a vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4- pentadienila, 3-(1,4-pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila e os homólogos e isômeros superiores. O termo “alquila”, a menos que de outro modo observado, também inclui aqueles derivados de alquila definidos em mais detalhes abaixo, tais como “heteroalquila”. Grupos alqguila que são limitados aos grupos hidrocarboneto são denominados “homoalquila”.

O termo “alquileno”, por si só, ou como parte de um outro substituinte, significa um : derivado do radical divalente de um alcano, conforme exemplificado, mas não limitado pelas > 20 estruturas -CHCH7 e -CH;CH;CH,CH7 e inclui ainda aqueles grupos descritos abaixo como “heteroalquileno”. Tipicamente, um grupo alquila (ou alquileno) terá de 1 a 24 átomos de carbono, com aqueles grupos tendo 10 ou menos átomos de carbono sendo uma modalidade particular dos métodos e composições descritos neste relatório. Um “alquila inferior” ou “alquileno inferior” é um grupo alquila ou alquileno com cadeia mais curta, geralmente tendo oito ou menos átomos de carbono.

Os termos “alcóxi”, “alguilamino” e “alquiltio” (ou tioalcóxi) são usados em seu sentido convencional e referem-se àqueles grupos alquila ligados ao restante da molécula por intermédio de um átomo de oxigênio, um grupo amino ou um átomo de enxofre, respectivamente.

O termo “heteroalquila”, por si só, ou em combinação com um outro termo, significa, a menos que de outro modo estabelecido, um radical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada ou cíclico estável ou combinações dos mesmos, consistindo do número estabelecido de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo ' que consiste de O, N, Si e S e, em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem — opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo nitrogênio pode opcionalmente ser quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si pode(m) ser colocado(s) em qualquer posição interior do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila é ligado ao restante da molécula. Exemplos incluem, mas não são limitados a -CH,-CH7-O0-CH;3, -CH,7- CH-NH-CH3, -CH7-CH3-N(CH3;)-CH3, -CH7-S-CH2-CH3, -CH2-CH>2, -S(0)-CH3, -CH2-CH72- S(0).-CH3, -CH=CH-O-CH;3, -Si(CH3)s, -CH7-CH=N-OCH;3 e -CH=CH-N(CH;3)-CH;. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, tais como, por exemplo, -CH>-NH-OCH; e -CH7-O- Si(CH;); Similarmente, o termo “heteroalquileno”, por si só, ou como parte de um outro substituinte, significa um radical divalente derivado de heteroalquila, conforme exemplificado, mas não limitado por -CH;-CH7-S-CH3;-CH3- e -CH3-S-CH2-CH7-NH-CH;>-. Para grupos heteroalquileno, os mesmos ou diferentes heteroátomos também podem ocupar qualquer um ou ambos os terminais da cadeia (incluindo mas não limitados a alquilencóxi, alquilenodióxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialguileno e semelhantes). Além disso, para grupos de ligação de alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação é implicada pela direção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula -C(O)R'- representa tanto -C(O),R'- quanto — R'C(O)z.

Os termos “cicloalquila" e “heterocicloalquila”, por si só, ou em combinação com outros termos, representa, a menos que de outro modo estabelecido, versões cíclicas de “alquila” e “heteroalquila”, respectivamente. Assim, um cicloalquila ou heterocicloalquila " inclui ligações no anel saturadas, parcialmente insaturadas e completamente insaturadas. Adicionalmente, para heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o * 20 heterocicloé ligado ao restante da molécula. Exemplos de cicloalquila incluem, mas não são limitados a ciclopentila, ciclo-hexila, 1-ciclo-hexenila, 3-ciclo-hexenila, ciclo-heptila e semelhantes. Exemplos de heterocicloalquila incluem, mas não são limitados a 1-(1,2,5,6- tetra-hidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetraidrofurano-2-ila, tetraidrofurano-3-ila, — tetra-hidrotien-2-ila, - tetra-hidrotien-3-ila, — 1- piperazinila, 2-piperazinila e semelhantes. Adicionalmente, o termo abrange estruturas no anel bicíclicas e tricíclicas. Similarmente, o termo “heterocicloalquileno”, por si só, ou como parte de um outro substituinte, significa um radical divalente derivado de heterocicloalquila e o termo “cicloalquileno”, por si só, ou como parte de um outro substituinte, significa um radical divalente derivado de cicloalquila.

Conforme usado neste relatório, o termo “polímero solúvel em água” refere-se a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água aos polipeptídeos de IFN beta pode resultar em mudanças incluindo, mas não limitadas à meia-vida no soro aumentada ou modulada ou meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogenicidade modulada, características de associação física moduladas, tais como agregação e formação de multímero, ligação ao receptor alterada, ligação alterada a um ou mais pares de ligação e dimerização ou multimerização do receptor alterada. O polímero solúvel em água pode, ou não, ter sua própria atividade biológica e pode ser utilizado como um ligador para ligar IFN beta a outras substâncias, incluindo mas não limitadas a um ou mais polipeptídeos de IFN beta ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas.

Polímeros adequados incluem, mas não são limitados a polietilenoglicol, polietilenoglicol propionaldeído, mono derivados de alcóxiou arilóxi C-Ci dos mesmos (descritos na Patente U.S.

Nº 5.252.714, a qual é incorporada como referência neste relatório), monometóxi-polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, anidrido maléico de diviniléter, N-(2- hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropilenogilcol, copolimero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol —polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, Oligossacarídeos, glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo mas não limitados à metilcelulose e carboximetilcelulose, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquilenogilcol e derivados dos mesmos, copolímeros de polialquilenoglicóis e derivados dos mesmos, éteres poliviniletílicos e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)- DL-aspartamida e semelhantes, ou misturas dos mesmos.

Exemplos de tais polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados a polietilenoglico! e albumina sérica.

Conforme usado neste relatório, o termo “polialquilenogilcol” ou “poli(alcenogilco!)” refere-se a polietilenoglicol (poli(etilenoglico!)), polipropilenogilco|, polibutilenogilcol e h derivados dos mesmos.

O termo “polialquilenogilcol” abrange tanto os polímeros lineares 7 20 quanto ramificados e os pesos moleculares médios entre 0,1 kDa e 100 kDa.

Outras modalidades exemplares são listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, tals como Shearwater Corporation's catalog “Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications” (2001). O termo “arila” significa, a menos que de outro modo estabelecido, um substituinte —hidrocarboneto poli-insaturado e aromático que pode ser um anel único ou anéis múltiplos (incluindo mas não limitado de 1 a 3 anéis), os quais são fundidos juntos ou covalentemente ligados.

O termo “heteroarila” refere-se aos grupos arila (ou anéis) que contêm de um a quatro heteroátomos selecionados de N, O e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados e o(s) átomo(s) de nitrogênio é(são) opcionalmente —quaternizado(s) Um grupo heteroarila pode ser ligado ao restante da molécula através de um heteroátomo.

Exemplos não limitantes de grupos arila e heteroarila incluem fenila, 1- naítila, 2-naftila, 4-bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2-imidazolila, 4- E imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5-oxazolila, 3-isoxazolila, 4- isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2- benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5-isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3- quinolila e 6-quinolila.

Substituintes para cada um dos sistemas de anel de arila e heteroarila observados acima são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis descritos abaixo. Abreviando, o termo “arila” quando usado em combinação com outros termos (incluindo mas não limitados a arilóxi, ariltióxi, arilalquila) inclui tanto os anéis de arila quanto de heteroarila, conforme definido acima. Assim, o termo “arilalquila” inclui aqueles radicais em que um grupo arila é ligado a um grupo alquila (incluindo, mas não limitado a benzila, fenetila, piridilmetila e semelhantes) incluindo aqueles grupos alquila em que um átomo de carbono (incluindo mas não limitado a um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (incluindo mas não limitado a fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1- naftilóxi)propila e semelhantes).

Cada um dos termos acima (incluindo, mas não limitado a “alquila”, “heteroalquila”, “arila” e “heteroarila”) inclui tanto as formas substituídas quanto não substituídas do radical indicado. Substituintes exemplares para cada tipo de radical são fornecidos abaixo.

Substituintes para os radicais alquila e heteroalquila (incluindo aqueles grupos frequentemente referidos como alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, —alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenila) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados de, mas não limitados a: -OR', =O, =NR', =N-OR' -NR'R”, -SR', -halogênio, -SIRR'R”, -OC(OJ)JR', -C(OJR', -COR', -CONRR”, - - OC(OINR'R", -NR"C(OJR', -NR-C(O)NR'R"', -NR"C(O)R' -NR-C(NR'R'R")=NR"", -NR- . CINR'R)=NR”', -S(O)R', -S(O).R', -S(OLNR'R", -NRSO.R', -OCN e -NO; em um número - 20 variando de zero a (2m' + 1), onde m' é o número total de átomos de carbono em um tal radical. R, R", Rº e R”' independentemente referem-se ao hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, incluindo mas não limitado a arila substituído com 1 a 3 halogênios, alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado, conforme são os grupos R', Rº, R” e R"”, quando mais do que um destes grupos está presente. Quando R' e R” são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" inclui, mas não é limitado a 1-pirrolidinila e 4-morfolinila. A —partirdodebate acima com respeito aos substituintes, uma pessoa de habilidade na técnica entenderá que o termo “alquila” inclui grupos, incluindo, átomos de carbono ligados aos grupos, exceto grupos hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo mas não limitado a -CF; e -CH2CF3) e acila (incluindo mas não limitado a -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH,OCH;3 e semelhantes).

Similares aos substituintes descritos para o radical alquila, substituintes para os grupos arila e heteroarila são variados e são selecionados de, mas não são limitados a: halogênio, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R”, -SR', -halogênio, -SiRR'R””, -OC(OJ)R', -C(OJ)R',

-COR, -CONRR', -OC(OINRR', -NR'C(OJR, -NR-C(OINR'R”, -NR'C(O)R, -NR- CINR R'R”)=NR"", -NR-C(NR'Rº)=NR”", -S(OJ)R', -S(O)LLR', -S(OLNR'R", -NRSO2R', -CN e - NO;, -R', -N3, -CH(Ph), fluoroalcóxi (C1-C4) e fluoroalquila (C;-C4), em um número variando de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e onde R', R”, R”ekR'”;sãoindependentemente selecionados de hidrogênio, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila.

Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado, conforme são os grupos R', R”, R"' e R"" quando mais do que um destes grupos está presente.

Conforme usado neste relatório, o termo “meia-vida no soro modulada” significa a “mudança positiva ou negativa na meia-vida circulante de um IFN beta modificado em relação a sua forma não modificada.

A meia-vida no soro é medida tomando-se amostras de sangue em vários pontos no tempo depois da administração do IFN beta e determinando-se a concentração dessa molécula em cada amostra.

A correlação da concentração do soro com o tempo possibilita o cálculo da meia-vida no soro.

A meia-vida no soro aumentada —desejavelmente tem pelo menos cerca de duas vezes de aumento, porém um aumento menor pode ser útil, por exemplo onde este permite um regime de dosagem satisfatório ou evita um efeito tóxico.

Em algumas modalidades, o aumento é de pelo menos cerca de três F vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes.

F O termo “meia-vida terapêutica modulada”, conforme usado neste relatório, significa 7 20 amudança positiva ou negativa na meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz do IFN beta, em relação a sua forma não modificada.

A meia-vida terapêutica é medida através da medição das propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários pontos no tempo depois da administração.

A meia-vida terapêutica aumentada desejavelmente possibilita um regime de dosagem benéfico particular, uma dosagem total — benéfica particular ou evita um efeito indesejado.

Em algumas modalidades, a meia-vida terapêutica aumentada resulta da potência aumentada, ligação aumentada ou diminuída da molécula modificada ao seu alvo, quebra aumentada ou diminuída da molécula por enzimas, tais como proteases ou um aumento ou diminuição em um outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou um aumento ou diminuição na separação da —moléculamediada pelo receptor.

O termo “isolado”, quando aplicado a um ácido nucléico ou proteína, denota que o ácido nucléico ou proteína é livre de pelo menos alguns dos componentes celulares com os : quais ele está associado no estado natural ou com os quais o ácido nucléico ou proteína foi concentrado em um nível maior do que a concentração de sua produção in vivo ou in vitro. —Elepode estarem um estado homogêneo.

Substâncias isoladas podem estar em um estado seco ou semisseco ou em solução, incluindo mas não limitada a uma solução aquosa.

Ele pode ser um componente de uma composição farmacêutica que compreende portadores

€/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Em — particular, um gene isolado é separado dos quadros abertos de leitura que flanqueiam o gene e codificam uma proteína, exceto o gene de interesse. O termo “purificado” denota que um ácido nucléico ou proteína dá origem substancialmente a uma banda em um gel eletroforético. Particularmente, isto pode significar que o ácido nucléico ou proteína é pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 99 % ou mais puro.

o termo — “ácido nucléico” refere-se a desoxirribonucleotídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleosídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos, na forma de filamento único ou duplo. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucléicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucléico de referência e são metabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos que ocorrem naturalmente. A menos que de outro modo especificamente limitado, o termo também refere-se a análogos de oligonucleotídeo " incluindo PNA (ácido peptidonucléico), análogos de DNA usados na tecnologia antissentido (fosforoticatos, fosforoamidatos e semelhantes). A menos que de outro modo indicado, uma * 20 sequência de ácido nucléico particular implicitamente também abrange variantes conservativamente modificadas da mesma (incluindo mas não limitadas às substituições de códon degenerado) e sequências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser obtidas gerando-se sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxiinosina (Batzer et al. Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et a/., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados permutavelmente neste relatório com referência a um polímero dos resíduos de aminoácidos. Isto é, uma — descrição dirigida a um polipeptídeo aplica-se igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína e vice-versa. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente, assim como polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

Conforme usado neste relatório, os termos abrangem cadeias de aminoácido de qualquer — comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações peptídicas covalentes.

O termo “aminoácido” refere-se aos aminoácidos que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente, assim como análogos do aminoácido e miméticos do aminoácido que funcionam em uma maneira similar aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirrolisina e selenocisteina. Análogos do aminoácido referem- se aos compostos que têm a mesma estrutura química básica como a de um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um carbono a que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, tal como, homosserina, norleucina, sulfóxido de “metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (tais como, norleucina) ou cadeias principais de peptídeo modificadas, porém retêm a mesma estrutura química básica como a de um aminoácido que ocorre naturalmente. Referência a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogênicos que ocorrem naturalmente; D- aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados, tais como variantes e derivados de aminoácido; aminoácidos não proteogênicos que ocorrem naturalmente, tais como B- alanina, ornitina, etc; e compostos quimicamente sintetizados tendo propriedades conhecidas na técnica características de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, mas não são limitados a a-metil aminoácidos (por exemplo, a-metil alanina), D-aminoácidos, aminoácidos do tipo histidina (por exemplo, 2-amino- “20 histidina, B-hidróxi-histidina, homo-histidina, a-fluorometil-histidina e a-metil-histidina), aminoácidos tendo um metileno extra na cadeia lateral (“homo” aminoácidos) e aminoácidos em que um grupo ácido carboxílico funcional na cadeia lateral é substituído com um grupo ácido sulfônico (por exemplo, ácido cistéico). A incorporação de aminoácidos não naturais, incluindo aminoácidos não nativos sintéticos, aminoácidos substituídos ou um ou mais D- — aminoácidos nas proteínas da presente invenção pode ser vantajosa em várias maneiras diferentes. Peptídeos contendo D-aminoácidos, etc., exibem estabilidade aumentada in vitro ou in vivo comparada às contrapartes contendo L-aminoácido. Assim, a construção de peptídeos, etc., que incorporam D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando uma estabilidade intracelular maior é desejada ou necessária. Mais especificamente, D- peptídeos, etc., são resistentes às peptidases e proteases endógenas, desse modo fornecendo biodisponibilidade aperfeiçoada da molécula e vidas prolongadas in vivo quando tais propriedades são desejáveis. Adicionalmente, D-peptídeos, etc., não podem ser processados eficazmente quanto à apresentação restrita à classe 1! do complexo maior da histocompatibilidade às células T auxiliares e, portanto, provavelmente induzem menos respostas imunes humorais em todo o organismo.

Aminoácidos podem ser referidos neste relatório por seus três símbolos comumente conhecidos ou pelo símbolo recomendado pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica

IUPAC-IUB. Nucleotídeos, do mesmo modo, podem ser referidos por seus códigos únicos comumente aceitos.

O termo “variantes conservativamente modificadas” aplicam-se tanto à sequência de aminoácidos quanto de ácidos nucléicos. Com respeito às sequências de ácido nucléico particulares, “variantes conservativamente modificadas” referem-se àqueles ácidos nucléicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou onde o ácido nucléico não codifica uma sequência de aminoácidos para sequências essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína fornecida. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado a qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácido nucléico neste relatório — que codifica um polipeptídeo, também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucléico. Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é comumente o único códon para metionina e TGG, que é ã comumente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucléico * 20 quecodificaum polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

De acordo com as sequências de aminoácidos, uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência da proteína que altera, adiciona ou deleta um aminoácido único ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma “variante conservativamente modificada” onde a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido ou substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas vão além de, e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção.

Tabelas de substituição conservativa fornecendo aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica. Os oito grupos seguintes ' contêm aminoácidos que são substituições conservativas entre si: k 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); e

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(veja, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2º edição (Dezembro de 1993)

Os termos “idêntico” ou porcentagem de “identidade”, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas.

Sequências são “substancialmente idênticas” se elas têm uma porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que é a mesma (isto é, cerca de 60 % de identidade, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 % ou cerca de 95 % de identidade sobre uma região especificada), quando comparada e alinhada para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação ou região designada, conforme medida usando um dos algoritmos de comparação de sequência seguintes (ou outros algoritmos disponíveis para as pessoas de habilidade comum na técnica) ou por alinhamento manual e inspeção visual.

Esta definição também refere-se ao complemento de uma sequência de teste.

A identidade pode existir

: sobre uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos no F comprimento ou sobre uma região que tem 75 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento ou, onde não especificada, através da sequência total de um polinucleotídeo ou polipeptídeo.

Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção, incluindo homólogos da espécie, exceto a humana, pode ser obtido por um processo compreendendo as etapas de triar uma biblioteca sob condições de hibridização severas com uma sonda marcada tendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção ou um fragmento da mesma e isolar o CDNA de comprimento total e clones genômicos contendo a dita sequência de polinucleotídeo.

Tais técnicas de hibridização são bem conhecidas pelos técnicos habilitados.

Para a sequência de comparação, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, para que as sequências de teste sejam comparadas.

Quando se faz uso de um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são introduzidas em um computador, as coordenadas da subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados.

Os parâmetros do programa padrão podem ser usados ou os parâmetros alternativos podem ser designados.

O algoritno de comparação de sequência depois calcula a porcentagem das identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma “janela de comparação”, conforme usado neste relatório, inclui referência a um segmento de qualquer um dos números de posições contíguas selecionadas do grupo que consiste de 20 a 600, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências são idealmente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, incluindo mas não limitado pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa ao método de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e inspeção visual (veja, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995, suplemento)).

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST

2.0, que são descritos em Altschul et a/. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O software para realizar as análises ' por BLAST encontra-se publicamente disponível através do National Center for * 20 Biotechnology Information disponível na rede mundial de computadores no site ncbi.nlm.nih.gov. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento da palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N= -4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento da palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e a matriz de escore BLOSUMG6?2 (veja, Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5 N=-4e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo BLAST é tipicamente realizado com o filtro de “baixa complexidade” desligado.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Uma medição de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual í uma combinação entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma sequência de referência, se a probabilidade da menor soma em uma comparação do ácido nucléico de teste ao ácido nucléico de referência for menor do que cerca de 0,2 ou menor do que cerca de 0,01 ou menor do que cerca de 0,001.

A frase “seletivamente (ou especificamente) hibridiza em” refere-se à ligação, dualidade ou hibridização de uma molécula única em uma sequência de nucleotídeo particular sob condições de hibridização severas quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (incluindo mas não limitada ao total celular ou biblioteca de DNA ou RNA).

A frase “condições de hibridização severas” refere-se à hibridização de sequências de DNA, RNA, PNA ou outras imitações de ácido nucléico ou combinações das mesmas, sob condições de baixa resistência iônica e alta temperatura, conforme é conhecido na técnica. Tipicamente, sob condições severas, uma sonda hibridizará em sua subsequência alvo em uma mistura complexa de ácido nucléico (incluindo mas não limitada ao total celular ou biblioteca de DNA ou RNA), porém não hibridiza em outras sequências na mistura complexa. Condições severas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Un manual extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijlssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of ã nucleic acid assays” (1993). Geralmente, condições severas são selecionados de cerca de 5 : a 10 ºC abaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em um pH com 7 20 resistência iônica definida. O T,, é a temperatura (sob resistência iônica, pH e concentração nucléica definidos) em que 50 % das sondas complementares ao alvo hibridizam na sequência alvo em equilíbrio (conforme as sequências alvo estão presentes em excesso, no Tm, 50 % das sondas são ocupadas em equilíbrio). Condições severas podem ser aquelas em que a concentração de sal é menor do que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente —cercade0,01a1,0M da concentração de íon sódio (ou outros sais) no pH 7,0a 83 ea temperatura é pelo menos cerca de 30 ºC para sondas curtas (incluindo, mas não limitadas a 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 ºC para sondas longas (incluindo, mas não limitadas a mais do que 50 nucleotídeos). Condições severas também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes, tais como formamida. Para hibridização — seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser pelo menos a hibridização de dois pontos, opcionalmente 10 pontos. Condições de hibridização severas exemplares podem ser como segue: 50 % de formamida, 5 X SSC e 1 % de SDS, incubação a 42 ºC ou 5 X SSC, 1 % de SDS, incubação a 65 ºC, com lavagem em 0,2 X SSC e 0,1 % de SDS a 65 ºC. Tais fi lavagens podem ser realizadas durante 5, 15, 30, 60, 120 ou mais minutos.

Conforme usado neste relatório, o termo “eucarionte” refere-se a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya, tal como animais (incluindo mas não limitados a mamíferos, insetos, répteis, aves, etc.), ciliados, plantas (incluindo mas não limitadas a monocotiledôneas, dicotiledôneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporídios, protistas, etc.

Conforme usado neste relatório, o termo “não eucarionte” refere-se a organismos não eucarióticos.

Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (incluindo mas não limitado a Escherichia coli Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.) ou o domínio filogenético Archaea (incluindo mas não limitado a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, tal como Haloferax volcanii e NRC-I da espécie Halobacterium, — Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococecus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.). O termo “paciente”, conforme usado neste relatório, refere-se a um animal, em algumas modalidades um mamífero e em outras modalidades um ser humano, que é o objeto do tratamento, observação ou experimento.

Um animal pode ser um animal doméstico (por exemplo, cães, gatos e semelhantes), animal de criação (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos e semelhantes) ou um animal de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia e semelhantes). ft O termo “quantidade eficaz”, conforme usado neste relatório, refere-se àquela E quantidade do polipeptídeo de aminoácido que não ocorre naturalmente modificado sendo 7 20 administrado, que de certa forma atenuará um ou mais dos sintomas da doença, condição ou distúrbio sendo tratado.

Composições contendo o polipeptídeo de aminoácido que não ocorre naturalmente modificado descrito neste relatório podem ser administradas para tratamentos profiláticos, realçadores e/ou terapêuticos.

Os termos “realçar” ou “realce” significam aumentar ou prolongar a potência ou duração de um efeito desejado.

Assim, em relação ao realce do efeito de agentes terapêuticos, o termo “realce” refere-se à capacidade de aumentar ou prolongar a potência ou duração do efeito de outros agentes terapêuticos em um sistema.

Uma “quantidade eficaz realçadora”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma quantidade adequada para realçar o efeito de um outro agente terapêutico em um sistema desejado.

Quando usadasem um paciente, quantidades eficazes para este uso dependerão da severidade e curso da doença, do distúrbio ou condição, da terapia prévia, do estado de saúde do paciente e da resposta aos fármacos e julgamento do médico atendente.

O termo “modificado”, conforme usado neste relatório, refere-se a quaisquer E mudanças feitas em um polipeptídeo fornecido, tais como mudanças no comprimento do —polipeptídeo, sequência de aminoácidos, estrutura química, modificação da cotradução ou modificação pós-tradução de um polipeptídeo.

O termo forma “(modificada)” significa que os polipeptídeos sendo debatidos são opcionalmente modificados, isto é, os polipeptídeos sob o debate podem ser modificados ou não modificados.

O termo “modificado pós-tradução” refere-se a qualquer modificação de um aminoácido que ocorre natural ou não naturalmente em um tal aminoácido depois que ele for incorporado em uma cadeia de polipeptídeo. O termo abrange, por via de exemplo apenas, modificações da cotradução in vivo, modificações da cotradução in vitro (tais como em uma sistema de tradução livre de célula), modificações pós-tradução in vivo e modificações pós-tradução in vitro.

Em aplicações profiláticas, composições contendo o polipeptídeo de IFN beta são administradas a um paciente suscetível a, ou de outro modo, em risco de uma doença, distúrbio ou condição particular. Uma tal quantidade é definida como uma “quantidade profilaticamente eficaz”. Neste uso, as quantidades precisas também dependem do estado de saúde, peso do paciente e semelhantes. É considerado dentro da técnica, por uma pessoa habilitada, determinar tais quantidades profilaticamente eficazes pela experimentação de rotina (por exemplo, um experimento clínico de escalação de dosagem).

O termo “protegido” refere-se à presença de um “grupo de proteção” ou porção que previne a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições de reação. O grupo de proteção variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo sendo protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonila (t-Boc) e 9- 7 20 fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo for um tiol, o grupo de proteção pode ser ortopiridildissulíeto. Se o grupo quimicamente reativo é um ácido carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiônico ou um grupo hidroxila, o grupo de proteção pode ser um grupo benzila ou alquila, tal como metila, etila ou terc-butila. Outros grupos de proteção conhecidos na técnica também podem ser usados nos, ou com os — métodos e composições descritos neste relatório, incluindo grupos fotolábeis, tais como Nvoc e MeNvoc. Outros grupos de proteção conhecidos na técnica também podem ser usados nos, ou com os métodos e composições descritos neste relatório.

Por via de exemplo apenas, grupos de bloqueio/proteção podem ser selecionados de: mm no k PA o > SE EX Ne am Bon coz atos Me nel Mem tee AO ' ' e rom TeDMS tece s A É. o o eme TO e enero ph És Boc MBA tim ace Emo

LEGENDA DAS FIGURAS ACIMA - alila — aloc — t-butila — tritila — acetila Outros grupos de proteção são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3º Ed., John Wiley & Sons, Nova lorque, NY, 1999, o qual é integralmente incorporado como referência neste relatório.

Em aplicações terapêuticas, composições contendo o polipeptídeo de aminoácido que não ocorre naturalmente modificado são administradas a um paciente já sofrendo de uma doença, condição ou distúrbio, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente paralisar os sintomas da doença, distúrbio ou condição. Uma tal quantidade é definida como uma “quantidade terapeuticamente eficaz” e dependerá da severidade e curso da doença, distúrbio ou condição, terapia prévia, do estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos e julgamento do médico atendente. É considerado dentro da técnica, por uma pessoa habilitada, determinar tais quantidades terapeuticamente eficazes por experimentação de rotina (por exemplo, um experimento clínico de escalação de dosagem).

O termo “tratamento” é usado com referência aos tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.

Polipeptideos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados apresentados neste relatório podem incluir compostos isotopicamente marcados com um ou b mais átomos substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa . diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza. * 20 Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos presentes compostos incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor e cloro, tais como ?H, ?*H, "ºC, 14C, SN, Oo, To, *s, **F, *Cl, respectivamente. Certos compostos isotopicamente marcados descritos neste relatório, por exemplo aqueles em que os isótopos radioativos, tais como *H e *C são incorporados, podem ser úteis nos ensaios de distribuição do fármaco e/ou tecido do substrato. Além disso, a substituição com isótopos, tais como deutério, isto é, ?H, pode fornecer certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas.

Todos os isômeros, incluindo mas não limitados aos diastereômeros, enantiômeros e misturasdos mesmos, são considerados como parte das composições descritas neste relatório. Além disso, ou em modalidades adicionais, os polipeptídeos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são metabolizados sob a administração a um : organismo em necessidade de produzir um metabólito que depois é usado para produzir um * efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Além disso, ou em modalidades adicionais, são metabólitos ativos de polipeptíideos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados.

Em algumas situações, polipeptideos de aminoácidos que não ocorrem s6 naturalmente codificados podem existir como tautômeros. Além disso, os polipeptídeos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados descritos neste relatório podem existir nas formas não solvatadas e solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, etanol e semelhantes. As formas solvatadas também são divulgadas neste relatório. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que alguns dos compostos neste relatório podem existir em várias formas tautoméricas. Todas as tais formas tautoméricas são consideradas como parte das composições descritas neste relatório. A menos que de outro modo indicado, métodos convencionais de espectroscopia de massas, RMN, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da habilidade da técnica, são utilizados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

1. Introdução As moléculas de IFN beta compreendendo pelo menos um aminoácido não natural são fornecidas na invenção. Em certas modalidades da invenção, o polipeptídeo de IFN beta com pelo menos um aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós- tradução. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação pós-tradução compreende a ligação de uma molécula, incluindo mas não limitada a uma marcação, um corante, um L polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietilenoglicol, um E fotorreticulador, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, uma marcação por * 20 afinidade, uma marcação por fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antissentido, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucléico inibitório, um —biomaterial, uma nanopartícula, uma marcação spin, um fluoróforo, uma porção contendo metal, uma porção radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma porção fotodelimitada, uma porção excitável por radiação actínica, uma porção fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma porção que incorpora um átomo pesado, um grupo — quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral prolongada, um açúcar ligado ao carbono, um agente redox-ativo, um aminoticácido, uma porção tóxica, uma porção isotopicamente marcada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo í quimioluminescente, um grupo elétron-denso, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, uma — marcação detectável, uma molécula pequena, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleotídeo, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons ou qualquer combinação dos mesmos acima ou qualquer outro composto ou substância desejável,

compreendendo um segundo grupo reativo a pelo menos um aminoácido não natural compreendendo um primeiro grupo reativo utilizando metodologia química que é conhecida a uma pessoa de habilidade comum na técnica como adequada aos grupos reativos particulares. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é uma porção alquinila (incluindo mas não limitada no aminoácido não natural p-propargiloxifenilalanina, onde o grupo propargila também é, algumas vezes, referido como uma porção acetileno) e o segundo grupo reativo é uma porção azido e as metodologias químicas de cicloadição [3+2] são utilizadas. Em um outro exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção azido (incluindo mas não limitada no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção alquinila. Em certas modalidades do polipeptíideo de IFN beta modificado da presente invenção, pelo menos um aminoácido não natural (incluindo mas não limitado ao aminoácido não natural contendo um grupo ceto funcional) compreendendo pelo menos uma modificação pós-tradução, é usado onde pelo menos uma modificação pós-tradução compreende uma porção sacarídeo. Em certas modalidades, a modificação pós-tradução é preparada in vivo em uma célula eucariótica ou em uma célula não eucariótica. Um ligador, polímero, polímero solúvel em água ou outra molécula pode fixar a molécula ao polipeptídeo. A molécula pode ser ligada diretamente ao polipeptídeo.

EP Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós- " tradução que é preparada in vivo por uma célula hospedeira, onde a modificação pós- 7 20 tradução não é normalmente feita por um outro tipo de célula hospedeira. Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-tradução que é preparada in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós-tradução não é normalmente feita por uma célula não eucariótica. Exemplos de modificações pós-tradução incluem, mas não são limitados à glicosilação, acetilação, acilação, modificação por lipídeo, palmitoilação, —adiçãode palmitato, fosforilação, modificação de ligação do glicolipídeo e semelhantes.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados para glicosilação, acetilação, acilação, modificação por lipídeo, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação ou modificação de ligação do glicolipídeo do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptíideo de IFN beta compreende um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados para glicosilação do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados para glicosilação, acetilação, acilação, modificação por lipídeo, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação ou modificação de ligação do glicolipídeo do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados para glicosilação do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre deleções que realçam a glicosilação do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptideo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre deleções que realçam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptíideo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação em um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado no polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação em um aminoácido que ocorre naturalmente codificado no polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o : polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação em um * 20 aminoácido que ocorre naturalmente codificado no polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre adições e/ou substituições do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que realçam a glicosilação em um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado no polipeptídeo.

Em uma modalidade, a modificação pós-tradução compreende a ligação de um —oligossacarídeo a uma asparagina através de uma ligação GlcNAc-asparagina (incluindo mas não limitada onde o oligossacarideo compreende (GIcNAc-Man)>-Man-GleNAc-GIcNAc e semelhantes). Em uma outra modalidade, a modificação pós-tradução compreende a ligação de um oligossacarídeo (incluindo mas não limitado a Gal-GalNAc, Gal-GIcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina ou GlcNAc-treonina.

Em certas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo da invenção pode compreender uma sequência de secreção ou localização, uma “tag” de epítopo, uma “tag” de FLAG, uma “tag” de poli-histidina, uma fusão GST e/ou semelhantes.

Exemplos de ' sequências sinais de secreção incluem, mas não são limitados a uma sequência sinal de secreção procariótica, uma sequência sinal de secreção eucariótica, uma sequência sinal de — secreção eucariótica otimizada em 5' quanto à expressão bacteriana, uma nova sequência sinal de secreção, sequência sinal de secreção de pectato liase, sequência sinal de secreção de Omp A e uma sequência sinal de secreção de fago.

Exemplos de sequências sinais de secreção, incluem, mas não são limitadas a STII (procariótica), Fd GIll e M13 (fago), Bal2 (levedura) e a sequência sinal bla derivada de um transposon. Qualquer tal sequência pode ser modificada para fornecer um resultado desejado com o polipeptídeo, incluindo mas não limitado a substituir uma sequência sinal com uma sequência sinal diferente, substituir uma sequência líder com uma sequência líder diferente, etc.

A proteína ou polipeptídeo de interesse pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos ou diferentes, por exemplo, pode haver 1, 2,3e4,5,6,7,8,9,10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreendem 1,2, 3 e 4, 5,6, 7,8, 9, 10 ou mais aminoácidos não naturais diferentes. Em certas modalidades, pelo menos um, porém nem todos, aminoácido particular presente em uma versão da proteína que ocorre naturalmente é substituído com um aminoácido não natural.

A presente invenção fornece métodos e composições com base em IFN beta compreendendo pelo menos um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. À introdução de pelo menos um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado em IFN beta pode incluir a aplicação de químicas de conjugação que envolvem reação químicas E específicas, incluindo, mas não limitadas com um ou mais aminoácidos que não ocorrem - naturalmente codificados enquanto não reagindo com os 20 aminoácidos comuns que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, IFN beta compreendendo o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado a um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglico! (PEG), por intermédio da cadeia lateral do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Esta invenção fornece um método altamente eficaz para a modificação seletiva de proteínas com derivados de PEG, o qual envolve a incorporação seletiva de aminoácidos não geneticamente codificados, incluindo mas não limitados àqueles aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados nos 20 aminoácidos naturalmente incorporados, incluindo mas não limitados a uma porção cetona, azida ou acetileno nas proteínas, em resposta a um códon seletor e a modificação subsequente desses aminoácidos com um derivado de PEG adequadamente reativo. Uma vez incorporadas, as cadeias laterais de aminoácidos depois podem ser modificadas utilizando-se metodologias químicas conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica sendo adequadas para os grupos funcionais ou substituintes particulares presentes no aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Metodologias químicas conhecidas de uma ampla variedade são adequadas para o uso na presente invenção para incorporar um — polímero solúvel em água na proteína. Tais metodologias incluem, mas não são limitadas a uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen (veja, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p.

1069-1109; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nova lorque, p. 1-176) com, incluindo mas não limitados aos derivados de acetileno ou azida, respectivamente.

Pelo fato de o método de cicloadição [3+2] de Huisgen envolver uma cicloadição ao invésde uma reação de substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com seletividade extremamente alta. A reação pode ser realizada na temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(l) à mistura de reação. Veja, por exemplo, Tornoe, ef a/l., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et a/l., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596- 2599;eWO 03/101972. Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3+2] inclui virtualmente qualquer molécula com um grupo funcional ou substituinte adequado incluindo, mas não limitado a um derivado de azido ou acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo acetileno, incluindo mas não limitado a p-propargiloxifenilalanina ou grupo azido, incluindo mas não limitado a p-azido-fenilalanina, respectivamente.

O anel de cinco membros que resulta da cicloadição [3+2] de Huisgen é geralmente não reversível em meios redutores e é estável contra hidrólise durante períodos prolongados em ambientes aquosos. Consequentemente, as características físicas e químicas de uma . ampla variedade de substâncias podem ser modificadas sob a demanda de condições * 20 aquosas com os derivados de PEG ativos da presente invenção. Ainda mais significantemente, porque as porções azida e acetileno são específicas entre si (e, por exemplo, não reagem com qualquer um dos 20 aminoácidos geneticamente codificados e comuns), as proteínas podem ser modificadas em um ou mais sítios específicos com seletividade extremamente alta.

A invenção também fornece derivados solúveis em água e hidroliticamente estáveis de derivados de PEG e polímeros hidrofílicos relacionados tendo uma ou mais porções acetileno ou azida. Os derivados do polímero PEG que contêm porções acetileno são altamente seletivos para a ligação com porções azida que foram seletivamente introduzidas nas proteínas, em resposta a um códon seletor. Similarmente, derivados do polímero PEG que contêm porções azida são altamente seletivos para a ligação com porções acetileno que foram seletivamente introduzidas nas proteínas, em resposta a um códon seletor.

Mais especificamente, as porções azida compreendem, mas não são limitadas a É alquilazidas, arilazidas e derivados destas azidas. Os derivados de alquil e arilazidas podem incluir outros substituintes, contanto que a reatividade específica do acetileno seja mantida.

As porções acetileno compreendem alquil e arilacetilenos e derivados dos mesmos. Os derivados de alquil e arilacetilenos podem incluir outros substituintes, contanto que a reatividade específica da azida seja mantida.

A presente invenção fornece conjugados de substâncias tendo uma ampla variedade de grupos funcionais, substituintes ou porções, com outras substâncias incluindo, mas não limitadas a uma marcação; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; um fotorreticulador; um radionuclídeo; um composto —citotóxico; um fármaco; uma marcação por afinidade; uma marcação por fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um cofator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo antissentido; um sacarídeo; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina; um ácido ribonucléico inibitório; um biomaterial; uma nanopartícula, uma marcação spin; um fluoróforo, uma porção contendo metal; uma porção radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que interage covalente ou não covalentemente com outras moléculas; uma porção fotodelimitada; uma porção excitável por radiação actínica; uma porção fotoisomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma porção que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral prolongada; um açúcar ligado ao carbono; um agente redox-ativo; um aminoticácido; uma porção tóxica; uma porção isotopicamente marcada; uma sonda biofísica; um grupo k fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo elétron-denso; um grupo magnético; k um grupo intercalante; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente * 20 biologicamente ativo; uma marcação detectável; uma molécula pequena; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleotídeo; um radiotransmissor; um agente de captura de nêutrons; ou qualquer combinação dos mesmos acima ou qualquer outro composto ou substância desejável.

A presente invenção também inclui conjugados de substâncias tendo porções azida ou acetileno com derivados do polímero PEG tendo as porções acetileno ou —azida correspondentes.

Por exemplo, um polímero PEG contendo uma porção azida pode ser ligado a uma molécula biologicamente ativa em uma posição na proteína que contém um aminoácido não geneticamente codificado portando uma funcionalidade acetileno.

A ligação pela qual o PEG e a molécula biologicamente ativa são ligados inclui, mas não é limitada ao produto da cicloadição [3+2] de Huisgen.

Está bem estabelecido na técnica que PEG pode ser usado para modificar as superfícies de biomaterials (veja, por exemplo, Patente U.S. 6.610.281; Mehvar, R., J.

Pharm Sci, 3(1):125-136 (2000), os quais são incorporados como referência neste Í relatório). A invenção também inclui biomateriais compreendendo uma superfície terido um ou mais sítios azida ou acetileno reativos e um ou mais polímeros contendo azida ou —acetilenoda invenção ligados à superfície por intermédio da ligação da cicloadição [3+2] de Huisgen.

Biomateriais e outras substâncias também podem ser ligados aos derivados do polímero ativados azida ou acetileno através de uma ligação, exceto a ligação azida ou acetileno, tal como através de uma ligação compreendendo uma porção ácido carboxílico, amina, álcool ou tiol, para deixar a porção azida ou acetileno disponível para reações subsequentes.

A invenção inclui um método de sintetizar os polímeros contendo azida e acetileno da invenção.

No caso do derivado de PEG contendo azida, a azida pode ser ligada diretamente a um átomo de carbono do polímero.

Alternativamente, o derivado de PEG contendo azida pode ser preparado fixando-se um agente de ligação que tem a porção azida em um terminal a um polímero ativado convencional, de modo que o polímero resultante tenha a porção azida em seu terminal.

No caso do derivado de PEG contendo —acetileno, o acetileno pode ser ligado diretamente a um átomo de carbono do polímero.

Alternativamente, o derivado de PEG contendo acetileno pode ser preparado fixando-se um agente de ligação que tem a porção acetileno em um terminal a um polímero ativado convencional, de modo que o polímero resultante tenha a porção acetileno em seu terminal.

Mais especificamente, no caso do derivado de PEG contendo azida, um polímero solúvel em água tendo pelo menos uma porção hidroxila ativa sofre uma reação para produzir um polímero substituído tendo uma porção mais reativa, tal como um grupo de partida mesilato, tresilato, tosilato ou halogênio no mesmo.

A preparação e uso de derivados t de PEG contendo haletos de sulfonilácido, átomos de halogênio e outros grupos de partida . são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

O polímero substituído resultante * 20 depois sofre uma reação para substituir a porção mais reativa por uma porção azida no terminal do polímero.

Alternativamente, um polímero solúvel em água tendo pelo menos uma porção nucleofílica ou eletrofílica ativa sofre uma reação com um agente de ligação que tem uma azida em um terminal, de modo que uma ligação covalente é formada entre o polímero PEG e o agente de ligação e a porção azida é posicionada no terminal do — polímero.

Porções nucleofílicas e eletrofílicas, incluindo aminas, tióis, hidrazidas, hidrazinas, álcoois, carboxilatos, aldeídos, cetonas, tioésteres e semelhantes, são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

Mais especificamente, no caso do derivado de PEG contendo acetileno, um polímero solúvel em água tendo pelo menos uma porção hidroxila ativa sofre uma reação para substituir um halogênio ou outro grupo de partida ativado a partir de um precursor que contém uma porção acetileno.

Alternativamente, um polímero solúvel em água tendo pelo menos uma porção nucleofílica ou eletrofílica ativa sofre uma reação com um agente de ligação que tem um acetileno em um terminal, de modo que uma ligação covalente é formada entre o polímero PEG e o agente de ligação e a porção acetileno é posicionada no terminal do polímero.

O uso de porções halogênio, grupo de partida ativado, porções nucleofílicas e eletrofílicas no contexto da síntese orgânica e na preparação e uso de derivados de PEG está bem estabelecido aos praticantes na técnica.

A invenção também fornece um método para a modificação seletiva de proteínas para adicionar outras substâncias à proteína modificada, incluindo mas não limitadas a polímeros solúveis em água, tais como PEG e derivados de PEG, contendo uma porção azida ou acetileno. Os derivados de PEG contendo azida e acetileno podem ser usados para modificar as propriedades de superfícies e moléculas onde a biocompatibilidade, estabilidade, solubilidade e ausência de imunogenicidade são importantes, enquanto ao mesmo tempo fornecem um meio mais seletivo de fixar os derivados de PEG às proteínas, do que foi previamente conhecido na técnica.

11. Interferon Beta Preparações comerciais de IFNR mostraram-se eficazes na redução da taxa de exacerbação de esclerose múltipla e mais pacientes permanecem livres da exacerbação durante períodos de tempo prolongados em comparação aos pacientes tratados com placebo. Além disso, a taxa de acúmulo de incapacidade é reduzida (Neurol. 51:682-689, 1998). Três dos produtos correntes são vendidos sob os nomes Betaseronº (interferon 81b, não glicosilado, produzido usando células bacterianas recombinantes, tem uma deleção do resíduo metionina N-terminal e a mutação C178) e Avonexº e Rebifº (interferon Bla, glicosilado, produzido usando células de mamíferos recombinantes). ; Membros adicionais da família do IFN provavelmente serão descobertos no futuro. . Novos membros da família do IFN podem ser identificados através de análises de estrutura - 20 secundária e terciária, auxiliadas por computador, das sequências da proteína prognosticadas e por técnicas de seleção designadas para identificar moléculas que se ligam a um alvo particular. Assim, a descrição da família do IFN é fornecida para propósitos ilustrativos e por via de exemplo apenas, e não como uma limitação do escopo dos métodos, composições, estratégias e técnicas descritos neste relatório. Além disso, referência ao IFN beta neste pedido é intencionada a usar o termo genérico como um exemplo de qualquer membro da família do IFN. Assim, é entendido que as modificações e químicas descritas neste relatório, com referência aos polipeptídeos ou proteína de IFN beta, podem ser igualmente aplicadas a qualquer membro da família do IFN, incluindo aqueles especificamente listados neste relatório.

111. Métodos Gerais do Ácido Nucléico Recombinante Para o Uso Com A invenção Em numerosas modalidades da presente invenção, ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de IFN beta de interesse serão isolados, clonados e frequentemente alterados usando métodos recombinantes. Tais modalidades são usadas, incluindo, mas —não limitadas para a expressão da proteína ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão ou outras sequências derivadas de um polipeptídeo de IFN beta. Em algumas modalidades, as sequências que codificam os polipeptídeos da invenção são, de maneira operável, ligadas a um promotor heterólogo.

Uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado pode ser sintetizada com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo precursor, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, 3 e 4 e depois modificando a sequência de nucleotídeos, de modo a efetuar a introdução (isto é, incorporação ou substituição) ou remoção (isto é, deleção ou substituição) do resíduo relevante do(s) aminoácido(s). A sequência de nucleotídeos pode ser convenientemente modificada por mutagênese dirigida ao sítio, de acordo com os métodos convencionais. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, incluindo, mas não limitada pelo uso de um sintetizador de oligonucleotídeo, em que oligonucleotídeos são designados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e preferivelmente selecionando aqueles códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante será produzido. Por exemplo, vários oligonucleotídeos pequenos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e agregados por PCR, ligação ou reação da cadeia de ligação. Veja, por exemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); Patente U.S. 6.521.427, os quais são E incorporados como referência neste relatório. , Esta invenção utiliza técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Textos básicos que divulgam os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3º ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning — A Laboratory Manual (2º Ed.), Vol. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989 (“Sambrook”) e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing — Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 1999) (“Ausubel”)). Estes textos descrevem a mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados a, incluindo mas não limitados à geração de genes ou polinucleotídeos que incluem códons seletores para a produção de proteínas que incluem aminoácidos não naturais, tRNAs ortogonais, sintetases ortogonais e pares dos mesmos. Vários tipos de mutagênese são usados na invenção para uma variedade de propósitos, incluindo, mas não limitados a produzir novas sintetases ou tRNAs, modificar moléculas de tRNA, modificar os polinucleotídeos que codificam as sintetases, produzir bibliotecas de tRNAs, produzir bibliotecas de sintetases, produzir códons seletores, inserir códons seletores que codificam aminoácidos não naturais em uma proteína ou polipeptídeo de interesse.

Eles incluem, mas não são limitados aos métodos de mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese aleatória, recombinação homóloga, embaralhamento do DNA (DNA shuffing) ou outros métodos de mutagênese recorrentes, construção quimérica, mutagênese usando moldes contendo uracila, mutagênese dirigida ao oligonucleotídeo, mutagênese do DNA modificada por fosforoticato, mutagênese usando DNA duplo aberto ou semelhantes, mutagênese mediada por PCT ou qualquer combinação dos mesmos.

Métodos adequados adicionais incluem o reparo de pareamento errôneo, mutagênese usando cepas hospedeiras deficientes de reparo, restrição-seleção e restrição-purificação, mutagênese por deleção, mutagênese por síntese total do gene, reparo da quebra de filamento duplo e semelhantes.

A mutagênese, incluinda, mas não limitada a envolver constructos quiméricos, também está incluída na presente invenção.

Em uma modalidade, a mutagênese pode ser guiada por informação conhecida da molécula que ocorre naturalmente ou molécula que ocorre naturalmente alterada ou modificada, incluindo, mas não limitada à sequência, comparações de sequência, propriedades físicas, estrutura secundária, terciária ou quaternária, estrutura cristalina ou semelhantes. ; Os textos e exemplos encontrados neste relatório descrevem estes procedimentos. . Informação adicional é encontrada nas publicações e referências seguintes citadas em: Ling * 20 etal, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol.

Biol. 57:369-374 (1996) Smith, /n vitro mutagenesis, Ann.

Rev.

Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter, Site-directed —mutagenesis, Biochem.

J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. e Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlim) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987), Bass et al, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specifícities, Science 242:240-245 (1988); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-deríved vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-

modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, /nhibition of restriction endonuclease Nci | cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl.

Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., 5-3' Exonucleases in phosphorothioate- based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide- directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350- 367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et a/., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the " metil-directed DNA mismatch-repair system of E. Coli, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., . Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: * 20 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucieotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hidrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil.

Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar e Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpfa-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide- directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305- 3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of : Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion : in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et a/., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W.P.C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); e, |. A. Lorimer, |. Pastan, Nucleic Acids Res.

23, 3067-8 (1995). Detalhes adicionais em muitos dos métodos acima podem ser encontrados em Methodos in Enzymology Volume 154, que também descreve controles úteis para “trouble-shooting" com vários métodos de mutagênese.

Oligonucleotídeos, por exemplo, para o uso na mutagênese da presente invenção, por exemplo, modificam as bibliotecas de sintetases ou alteran tRNAs, são tipicamente sintetizados quimicamente, de acordo com o método de triéster de fosforamidita em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, (1981) por exemplo, usando um sintetizador automático, conforme descrito em Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984). A invenção também refere-se a células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido não natural por intermédio dos pares tRNA/RS ortogonais. Células hospedeiras são geneticamente engendradas (incluindo mas não limitadas às células transformadas, traduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos da invenção ou constructos que incluem um polinucleotídeo da invenção, incluindo, mas não limitado a um vetor da invenção, que pode ser, por exemplo, um vetor clonado ou um vetor de expressão. Por exemplo, as regiões codificantes para o tRNA ortogonal, a tRNA sintetase ortogonal e a proteína a ser derivatizada são, de maneira operável, ligadas aos elementos de controle da expressão do gene que são funcionais na célula hospedeira desejada. O vetor pode estar, : por exemplo, na forma de um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, uma bactéria, um vírus, . um polinucleotídeo desprotegido ou um polinucleotíideo conjugado. Os vetores são * 20 introduzidos em células e/ou microorganismos por métodos padrão incluindo eletroporação (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infecção por vetores virais, penetração de balística de alta velocidade por pequenas partículas com o ácido nucléico dentro da matriz de pequenas pérolas ou partículas, ou na superfície (Klein et al!., Nature 327, 70-73 (1987)), e/ou semelhantes. Técnicas adequadas para a transferência de ácido —nucléicoem células in vitro incluem o uso de lipossomas, microinjeção, fusão celular, DEAE- dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Técnicas de transferência de gene in vivo incluem, mas não são limitadas à transfecção com vetores virais (tipicamente retrovirais) e transfecção mediada proteína de cobertura-lipossoma viral [Dzau et a/., Trends in Biotechnology 11:205-210 (1993)]. Em algumas situações, pode ser desejável fornecer a fonte de ácido nucléico com um agente que alveja as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteina de membrana de superfície celular ou a célula alvo, um ligante para um receptor na célula alvo, etc. Onde os lipossomas são utilizados, proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celular associada com endocitose podem É ser usadas para alvejar e/ou facilitar a absorção, por exemplo, proteínas de capsídeo ou fragmentos das mesmas, trópicas para um tipo celular particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização, proteínas que alvejam a localização intracelular e realçam a meia-vida intracelular.

As células hospedeiras engendradas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados, conforme apropriado para tais atividades como, por exemplo, triando as etapas, ativando os promotores ou selecionando os transformadores.

Estas células podem opcionalmente ser cultivadas em organismos transgênicos.

Outras referências úteis, incluindo, mas não limitadas para isolamento e cultura celular (por exemplo, para isolamento do ácido nucléico subsequente) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, terceira edição, Wiley-Liss, Nova lorque e as referências citadas neste; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc.

Nova lorque, NY; Gamborg e Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlim Heidelberg Nova lorque) e Atlas e Parks (eds) The Handbook of

Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

Vários métodos bem conhecidos de introduzir ácidos nucléicos alvo em células estão disponíveis, qualquer um dos quais pode ser usado na invenção.

Estes incluem: fusão das células recipientes com protoplastos bacterianos contendo o DNA, eletroporação, bombardeamento com projétil e infecção com vetores virais (debatidos abaixo), etc.

Células bacterianas podem ser usadas para amplificar o número de plasmídeos contendo os É constructos de DNA desta invenção.

As bactérias são cultivadas na fase log e os h: plasmídeos dentro das bactérias podem ser isolados por uma variedade de métodos * 20 conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Sambrook). Além disso, kits estão comercialmente disponíveis para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias, (veja, por exemplo, EasyPrep'", FlexiPrep"", ambos da Pharmacia Biotech; StrataClean'" da Stratagene; e, QlAprep"" da Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados depois são manipulados para produzir outros plasmídeos, usados para transfectar células ou incorporados em vetores relacionados para infectar organismos.

Vetores típicos contêm terminadores de transcrição e tradução, sequências de iniciação de transcrição e tradução e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucléico alvo particular.

Os vetores opcionalmente compreendem cassetes de expressão genéricos contendo pelo menos uma sequência terminadora independente, sequências que permitem replicação do casseteem eucariontes ou procariontes ou ambos, (incluindo mas não limitados aos vetores “shuttle”) e marcadores de seleção para os sistemas procarióticos e eucarióticos.

Vetores são adequados para replicação e integração em procariontes, eucariontes ou ambos.

Veja, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al/.; Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr.

Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra). Um — catálogo de bactérias e bacteriófagos úteis para clonagem é fornecido, por exemplo, pelo ATCC, por exemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado pelo ATCC.

Procedimentos básicos adicionais para sequenciamento,

clonagem e outros aspectos de biologia molecular e considerações teóricas fundamentais também são encontrados em Watson et a/. (1992) Recombinant DNA, Segunda Edição, Scientific American Books, NY. Além disso, qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico marcado, se padrão ou não padrão) pode ser essencialmente customizado ou padrão, encomendado de qualquer uma de uma variedade de fontes comerciais, tais como a Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponível na rede mundial de computadores no site merc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponível na rede mundial de computadores no site genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponível na rede mundial de computadores no site expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.

CÓDONS SELETORES Códons seletores da invenção prolongam a estrutura genética do códon do mecanismo biossintético da proteína. Por exemplo, um códon seletor inclui, mas não é limitado a um códon de três bases único, um códon contrassentido, tal como um códon de parada, incluindo mas não limitado a um códon âmbar (UAG), um códon ocre ou um códon opala (UGA), um códon não natural, um códon de quatro ou mais bases, um códon raro ou semelhantes. É facilmente evidente àqueles de habilidade comum na técnica que existe . uma faixa ampla no número de códons seletores que podem ser introduzidos em um gene e ou polinucleotídeo desejado, incluindo mas não limitada a, um ou mais, dois ou mais, três ou “ 20 mais,4,5,6,7,8,9,10oumais em um polinucleotídeo único que codifica pelo menos uma porção do polipeptídeo de IFN beta.

Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor que é um códon de parada para a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais in vivo. Por exemplo, um O-tRNA é produzido, o qual reconhece o códon de parada, incluindo mas não limitado a UAG e é aminoacilado por um O-RS com um aminoácido não natural desejado. Este O-tRNA não é reconhecido pela aminoacil-tRNA sintetases dos hospedeiros que ocorrem naturalmente. A mutagênese dirigida ao sítio convencional pode ser usada para introduzir o códon de parada, incluindo mas não limitado a “TAG”, no sítio de interesse em um polipeptídeo de interesse. Veja, por exemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5-3' —Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802. Quando o O-RS, O+RNA e o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse são combinados in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao códon UAG para fornecer um polipeptídeo contendo o aminoácido não Í natural na posição especificada.

A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser feita sem perturbação significante da célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, pelo fato de a eficiência da supressão para o códon UAG depender da competição entre o O-tRNA, incluindo mas não limitado ao tRNA supressor âmbar e um fator de liberação eucariótico (incluindo mas não limitado a eRF) (que se liga a um códon de parada e inicia a liberação do peptídeo de crescimento a partir do ribossomo), a eficiência da supressão pode ser modulada aumentando-se o nível de expressão de O-tRNA e/ou do tRNA supressor.

Aminoácidos não naturais também podem ser codificados com códon raros. Por exemplo, quando a concentração de arginina em uma reação de síntese da proteína in vitro é reduzida, o códon arginina raro, AGG, se mostrou eficaz para a inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com alanina. Veja, por exemplo, Ma et al., Biochemistry. 32:7939 (1993). Neste caso, o tRNA sintético compete com o tRNAArg que ocorre naturalmente, que existe como uma espécie inferior em Escheríchia coli. Alguns organismos não usam todos os códons tripletos. Um códon AGA não determinado em Micrococcus luteus foi utilizado para a inserção de aminoácidos em um extrato da transcrição/tradução in vitro. Veja, por exemplo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Componentes da presente invenção podem ser gerados para usar estes códons raros in vivo.

Códons seletores também compreendem códons prolongados, incluindo mas não limitados aos códons de quatro ou mais bases, tais como códons de quatro, cinco, seis ou mais bases. Exemplos de códons de quatro bases incluem, mas não são limitados a AGGA, : CUAG, UAGA, CCCU e semelhantes. Exemplos de códons de cinco bases incluem, mas não são limitados a AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e semelhantes. * 20 Uma característica da invenção inclui usar códons prolongados com base na supressão “frameshift”. Códons de quatro ou mais bases podem inserir um ou múltiplos aminoácidos não naturais na mesma proteína. Por exemplo, na presença de O-t*RNAs mutantes, incluindo mas não limitados a tRNAs supressores “frameshift' especiais, com “loops” anticódon, por exemplo, com pelo menos 8 a10 nt “loops” anticódon, o códon de quatro ou mais bases é lido como aminoácido único. Em outras modalidades, os “loops” anticódon podem decodificar, incluindo mas não limitados a pelo menos um códon de quatro bases, pelo menos um códon de cinco bases ou pelo menos um códon de seis bases ou mais. Visto que existem 256 códons de quatro bases possíveis, aminoácidos não naturais múltiplos podem ser codificados na mesma célula usando um códon de quatro ou mais bases. Veja, — Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty"” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307:755-769. ' ' Por exemplo, códons de quatro bases foram usados para incorporar aminoácidos — não naturais em proteínas usando métodos biossintéticos in vitro. Veja, por exemplo, Ma et al., (1993) Biochemistry. 32:7939; e Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34. CGGG e AGGU foram usados para simultaneamente incorporar 2-naftilalanina e um

Ti derivado NBD de lisina em estreptavidina in vitro com dois tRNAs supressores “frameshift” quimicamente acilados. Veja, por exemplo, Hohsaka et a/., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194. Em um estudo in vivo, Moore et al. examinaram a capacidade de derivados de tRNALeu com anticódons NCUA suprimirem os códons UAGN (N pode ser U, A, Gou C) e — descobriram que o quadrupleto UAGA pode ser decodificado por um tRNALeu com um anticódon UCUA com uma eficiência de 13 a 26 % com pouca decodificação no quadro 0 ou -1. Veja, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. Em uma modalidade, códons prolongados com base em códons raros ou códons contrassentido podem ser usados na presente invenção, os quais podem reduzir “readthrough” missentido e supressão “frameshift' em outros sítios não desejados.

Para um sistema fornecido, um códon seletor também pode incluir um dos códons de três bases naturais, onde o sistema endógeno não usa (ou raramente usa) o códon de base natural. Por exemplo, isto inclui um sistema que é desprovido de um tRNA que reconhece o códon de três bases naturais, e/ou um sistema onde o códon de três bases é um códonraro. Códons seletores opcionalmente incluem pares de base não naturais. Estes pares de base não naturais prolongam ainda a existência do alfabeto genético. Um par de base : extra aumenta o número de códons tripletos de 64 a 125. Propriedades de pares da terceira base incluem pareamento de base estável e seletivo, incorporação enzimática eficaz no * 20 DNA com alta fidelidade através de uma polimerase e a extensão do iniciador continuada eficaz depois da síntese do par de base não natural nascente. Descrições de pares de base não naturais que podem ser adaptados para os métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182. Veja, também, Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc.124:14626-14630. Outras publicações relevantes são listadas abaixo.

Para a utilização preferencial in vivo, o nucleosídeo não natural é permeável à membrana e é fosforilado para formar o trifosfato correspondente. Além disso, a informação genética aumentada é estável e não destruída por enzimas celulares. Esforços prévios de Benner e outros mostraram a vantagem de padrões de união de hidrogênio que são diferentes daqueles nos pares de Watson-Crick canônicos, o exemplo mais notável é o par iso-C:iso-G. Veja, por exemplo, Switzer et a/., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322; e Piccirilli et al., (1990) Nature. 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases, no geral, são mispareadas em algum grau com bases naturais e não podem ser enzimaticamente replicadas. Kool e colaboradores demonstraram que as interações de empacotamento hidrofóbicas entre bases podem substituir a união de hidrogênio para conduzir a formação do par de base. Veja, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; e Guckian e Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. Em um esforço para desenvolver um par de base não natural satisfazendo todas as exigências acima, Schultz, Romesberg e colaboradores sistematicamente sintetizaram e estudaram uma série de bases hidrofóbicas não naturais. Um autopar PICS:PICS é descoberto ser mais estável do que os pares de base naturais e pode ser eficazmente incorporado no DNA pelo fragmento Klenow —da DNA polimerase | de Escherichia coli (KF). Veja, por exemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:11585-6; e Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274. Um autopar 3MN:3MN pode ser sintetizado por KF com eficiência e seletividade suficientes para a função biológica. Veja, por exemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803. Entretanto, ambas as bases atuam como um terminador de cadeia para outra replicação. Uma DNA polimerase mutante foi recentemente envolvida, a qual pode ser usada para replicar o autopar PICS. Além disso, um autopar 7AI pode ser replicado. Veja, por exemplo, Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439. Um novo par de metalobase, DipicPy, também foi desenvolvido, o qual forma um par estável sob a ligação Cu(l!). Veja, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:10714. Pelo fato de que os códons prolongados e códons não naturais são intrinsecamente ortogonais aos códons naturais, os métodos da invenção pode tomar vantagem desta propriedade para gerar tRNAs ortogonais para os mesmos.

Um sistema “bypassing” de tradução também pode ser usado para incorporar um : aminoácido não natural em um polipeptídeo desejado. Em um sistema “bypassing" de tradução, uma ampla sequência é incorporada em um gene, porém não é traduzida em * 20 proteina. A sequência contém uma estrutura que serve como um sinal para induzir o ribossomo ao lúpulo sobre a sequência e resume a tradução a jusante da inserção.

Em certas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou porção dos mesmos) nos métodos e/ou composições da invenção é codificado por um ácido nucléico. Tipicamente, o ácido nucléico compreende pelo menos um códon seletor, pelo menos dois —códons seletores, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro códons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo menos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores, pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons seletores, dez ou mais códons seletores.

Genes que codificam proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser —mutagenizados usando métodos conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica e descritos neste relatório para incluir, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido não natural. Por exemplo, um ácido nucléico para uma ' proteína de interesse é mutagenizado para incluir um ou mais códons seletores, ' considerando a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. A invenção inclui — qualquer tal variante, incluindo mas não limitada ao mutante, versões de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natural. Similarmente, a invenção também inclui ácidos nucléicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nucléico com um ou mais códons seletores que codificam um ou mais aminoácidos não naturais.

Moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína de interesse, tal como um polipeptídeo de IFN beta, podem ser facilmente modificadas para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipeptídeo. A cisteina é amplamente usada para introduzir — moléculas reativas, polímeros solúveis em água, proteínas ou uma ampla variedade de outras moléculas, em uma proteína de interesse. Métodos adequados para a incorporação de cisteina em uma posição desejada de um polipeptídeo são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, tais como aqueles descritos na Patente U.S. Nº 6.608.183, a qual é incorporada como referência neste relatório e técnicas de mutagênese padrão.

1V. Aminoácidos Que Não Ocorrem Naturalmente Codificados Uma variedade muito ampla de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são adequados para o uso na presente invenção. Qualquer número de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados pode ser introduzido em um polipeptídeo de IFN beta. No geral, os aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados introduzidos são substancial e quimicamente inertes em relação aos 20 aminoácidos geneticamente codificados e comuns (isto é, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina). Em algumas modalidades, os aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados incluem “ 20 grupos funcionais de cadeia lateral que reagem eficaz e seletivamente com grupos funcionais não encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo mas não limitados aos grupos azido, cetona, aldeído e aminoóxi) para formar conjugados estáveis. Por exemplo, um polipeptídeo de IFN beta que inclui um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo um grupo funcional azido pode ser reagido com um polímero (incluindo mas não limitado a poli(fetilenoglicol) ou, alternativamente, um segundo polipeptídeo contendo uma porção alcino para formar um conjugado estável resultante para a reação seletiva dos grupos funcionais azida e alcino para formar um produto de cicloadição [3+2] de Huisgen.

A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada como segue (Fórmula |): 1

R St ' Um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é tipicamente qualquer estrutura tendo a fórmula representada acima, em que o grupo R é qualquer substituinte, exceto aquele usado nos vinte aminoácidos naturais, e pode ser adequado para o uso na presente invenção. Pelo fato de os aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados da invenção tipicamente se apresentarem diferentes dos aminoácidos naturais apenas na estrutura da cadeia lateral, os aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados formam ligações amida com outros aminoácidos, incluindo mas não limitados aos aminoácidos natural ou não naturalmente codificados, da mesma maneira em que eles são formados em polipeptídeos que ocorrem naturalmente. Entretanto, os aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados têm grupos na cadeia lateral que distinguem dos mesmos a partir dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R opcionalmente compreende um grupo alquil-, aril-, acil-, ceto-, azido-, hidroxila-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenila, alquinila, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, ticácido, hidroxilamina, amino ou semelhantes ou qualquer “combinação dos mesmos. Outros aminoácidos que não ocorrem naturalmente de interesse que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitados aos aminoácidos compreendendo um reticulador fotoativável, aminoácidos spin-marcados, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação metálica, aminoácidos contendo metal, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que covalente ou não covalentemente interagem com outras moléculas, aminoácidos fotodelimitados e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos compreendendo biotina ou um análogo de biotina, aminoácidos glicosilados, tais como uma serina substituída por açúcar, outros : aminoácidos modificados por carboidrato, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos compreendendo polietilenoglico! ou poliéter, aminoácidos substituídos com átomo pesado, “ 20 aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com uma cadeia lateral prolongada em comparação aos aminoácidos naturais, incluindo mas não limitados aos poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo mas não limitada a mais do que cerca de 5 ou mais do que cerca de 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligado ao carbono, aminoácidos redox-ativos, aminotioácido contendo aminoácidos e aminoácidos compreendendo uma ou mais porções tóxicas.

Aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados exemplares que podem ser adequados para o uso na presente invenção e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados àqueles com grupos carbonila, aminoóxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e alcino reativos. Em algumas modalidades, aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados compreendem uma porção sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N-acetil-L-glicosaminil-L-serina, N-acetil- L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glicosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glicosaminil-L- asparagina e O-manosaminil-L-serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos onde a ligação N ou O que não ocorre naturalmente entre o aminoácido e o —sacarídeo é substituída por uma ligação covalente comumente não encontrada na natureza, incluindo mas não limitada a um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas que ocorrem naturalmente, tais como 2-desoxiglicose, 2- desoxigalactose e semelhantes. Muitos dos aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados fornecidos neste relatório estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (uma divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha) ou Peptech (Burlington, MA, USA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados, conforme fornecido neste relatório, ou usando métodos padrão conhecido àqueles de habilidade comum na técnica. Para as técnicas de síntese orgânica, veja, por exemplo, Organic Chemistry de Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Massa.); Advanced Organic Chemistry, Março (Terceira Edição, 1985, Wiley e Sons, Nova lorque); e Advanced Organic Chemistry, de Carey e Sundberg (Terceira Edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova Iorque). Veja, também, Patentes U.S. Nº 7.045.337 e 7.083.970, as quais são incorporadas como referência neste relatório. Além dos aminoácidos não naturais que contêm novas cadeias laterais, aminoácidos não naturais que podem ser adequados para O uso na presente invenção opcionalmente também compreendem estruturas de cadeia principal modificadas, conforme ilustrado pelas estruturas da Fórmula Il e Ill: : "

R NE Í UI R R

EA em que Z tipicamente compreende OH, NH, SH, NH-R' ou S-R'; Xe Y, que podem ser os mesmos ou diferentes, tipicamente compreendem S ou O e Re R, que são opcionalmente os mesmos ou diferentes, são tipicamente selecionados da mesma lista de constituintes para o grupo R descrito acima para os aminoácidos não naturais tendo a Fórmula |, assim como o hidrogênio. Por exemplo, aminoácidos não naturais da invenção — opcionalmente compreendem substituições no grupo amino ou carboxila, conforme ilustrado pelas Fórmulas Il e Ill. Aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas não são limitados aos a-hidroxiácidos, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluindo mas não limitados com cadeias laterais correspondentes aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais não naturais, Além disso, substituições no a-carbono opcionalmente incluem, mas não são limitadas aos aminoácidos L, D ou a-a-dissubstituídos, tais como D-glutamato, D-alanina, D- metil-O-tirosina, ácido aminobutírico e semelhantes. Outras alternativas estruturais incluem

* aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina, assim como análogos de prolina no anel de 3, 4, 6, 7, 8 e 9 membros, aminoácidos 8 e y, tais como f&-alanina substituída e ácido " y-amino butírico.

Muitos aminoácidos não naturais são fundamentados em aminoácidos naturais, tais como tirosina, glutamina, fenilalanina e semelhantes e são adequados para o uso na presente invenção.

Análogos de tirosina incluem, mas não são limitados às tirosinas para- substituídas, tirosinas orto-substituídas e tirosinas meta-substituídas, onde a tirosina substituída compreende um grupo ceto (incluindo mas não limitado a um grupo acetila), um grupo benzoila, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo —carbóxi, um grupo isopropila, um grupo metila, um hidrocarboneto Cs-C2, de cadeia reta ou ramíficada, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metila, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alquinila ou semelhantes.

Além disso, a multiplicação dos anéis de arila substituídos também é considerada.

Análogos de glutamina que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitados aos derivados de a-hidróxi, derivados y-substituídos, derivados cíclicos e derivados de glutamina substituídos em amida.

Exemplos de análogos de fenilalanina que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitados às fenilalaninas para- & substituídas, fenilalaninas orto-substituídas e fenilalaninas meta-substituídas, onde o substituinte compreende um grupo hidróxi, um grupo metóxi, um grupo metila, um grupo “ 20 alla, um grupo aldeído, azido, iodo, bromo, ceto (incluindo mas não limitado a um grupo acetila), um grupo benzoila e alquinila ou semelhantes.

Exemplos específicos de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitados a p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, L-3-(2- naftila)>alanina, 3-metil-fenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, — tri-O-acetil- —GlcNAcB-serina, L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L- fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirosina, p-iodo-fenilalanina, p-bromo-fenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L- fenilalanina e p-propargolóxi-fenilalanina e semelhantes.

Exemplos de estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção são fornecidos, por exemplo, no WO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation : of unnatural aminon acids”. Veja, também Kiick et al, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS o. 99:19-24, o qual é incorporado como referência neste relatório; para análogos de metionina adicionais.

O Pedido Internacional PCT U.S.

Nº 06/47822 intitulado “Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides”, o qual é incorporado como referência neste relatório, descreve a alquilação redutiva de porções amina aromáticas, incluindo mas não limitadas a p-amino-fenilalanina e aminação dá redutiva.

Em uma modalidade, composições de um polipeptídeo de IFN beta que incluem um , aminoácido não natural (tal como P-(propargilóxi)-fenilalanina) são fornecidas.

Várias composições compreendendo p-(propargilóxi)-fenilalanina e, incluindo mas não limitadas às proteínas e/ou células, também são fornecidas.

Em um aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não natural p-(propargilóxi)-fenilalanina, inclui ainda um tRNA ortogonal.

O aminoácido não natural pode ser ligado covalentemente ao tRNA ortogonal, incluindo mas não limitado a, covalentemente ligado ao tRNA ortogonal através de uma ligação amino- acila, covalentemente ligado a um OH 3' ou um OH 2' de um açúcar ribose terminal do tRNA —ortogonal, etc.

As porções químicas por intermédio dos aminoácidos não naturais que podem ser incorporados em proteínas oferecem uma variedade de vantagens e manipulações da proteína.

Por exemplo, a única reatividade de um grupo ceto funcional possibilita a modificação seletiva de proteínas com qualquer um de vários reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina in vitro e in vivo.

Um aminoácido não natural com átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para o faseamento dos dados da estrutura de raios X.

À introdução específica do sítio de átomos pesados usando aminoácidos não naturais também fornece : seletividade e flexibilidade na escolha de posições para átomos pesados.

Aminoácidos não naturais fotorreativos (incluindo mas não limitados a aminoácidos com cadeias laterais de “ 20 benzofenona e arilazidas (incluindo mas não limitada à fenilazida)), por exemplo, incluem fotorreticulação in vivo e in vitro eficaz da proteina.

Exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, mas não são limitados a p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina.

A proteína com os aminoácidos não naturais fotorreativos depois pode ser reticulada à vontade por excitação do controle temporal fornecendo o grupo fotorreativo.

Em um exemplo, o grupo metila de um amino não natural pode ser substituído com um grupo isotopicamente marcado, incluindo mas não limitado ao grupo metila, como uma sonda de estrutura e dinâmica local, incluindo mas não limitadas ao uso de ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional.

Grupos alquinila ou azido funcionais, por exemplo, possibilitam a modificação seletiva de proteínas com moléculas através de uma reação de — cicloadição[3+2]. . Um aminoácido não natural incorporado em um polipeptídeo no terminal amino pode ser composto de um grupo R que é qualquer substituinte, exceto aquele usado nos Dos vinte aminoácidos naturais, e um segundo grupo reativo diferente do grupo ' NH, normalmente presente em a-aminoácidos (veja, Fórmula |). Um aminoácido não natural similar pode ser incorporado no terminal carboxila com um segundo grupo reativo diferente do grupo COOH normalmente presente em a-aminoácidos (veja, Fórmula |). Os aminoácidos não naturais da invenção podem ser selecionados ou designados

: para fornecer características adicionais não disponíveis nos vinte aminoácidos naturais. Por exemplo, o aminoácido não natural pode ser opcionalmente designado ou selecionado para , modificar as propriedades biológicas de uma proteína, por exemplo, na qual eles são incorporados. Por exemplo, as propriedades seguintes podem ser opcionalmente modificadas pela inclusão de um aminoácido não natural em uma proteína: toxicidade, biodistribuição, solubilidade, estabilidade, por exemplo, térmica, hidrolítica, oxidativa, resistência à degradação enzimática e semelhantes, facilidade de purificação e processamento, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, atividade catalítica, potencial redox, meia-vida, capacidade de reagir com outras moléculas, por exemplo, covalente ou não covalentemente e semelhantes.

ESTRUTURA E SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS: GRUPOS CARBONILA, DO TIPO CARBONILA, CARBONILA MASCARADO, CARBONILA

PROTEGIDO E GRUPOS HIDROXILAMINA Em algumas modalidades, a presente invenção fornece IFN beta ligado a um — polímero solúvel em água, por exemplo, um PEG, por uma ligação oxima. Muitos tipos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são adequados para a formação de ligações oxima. Estes incluem, mas não são limitados a E amincácidos que não ocorrem naturalmente codificados contendo um grupo carbonila, dicarbonila ou hidroxilamina. Tais aminoácidos são descritos na Publicação de Patentes “20 US Nº 2006/0194256, 2006/0217532 e 2006/0217289 e WO 2006/069246 intitulado “Compositions containing, methods involving and uses of non-natural amino acids and polypeptides”, os quais são integralmente incorporados neste relatório como referência. Aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados também são descritos na Patente U.S. Nº 7.083.970 e Patente U.S. Nº 7.045.337, as quais são integralmente incorporadas comoreferência neste relatório.

Algumas modalidades da invenção utilizam polipeptídeos de IFN beta que são substituídos em uma ou mais posições com um aminoácido para-acetilfenilalanina. A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al. Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorporado como referência. Outros aminoácidos — contendo carbonila ou dicarbonila podem ser similarmente preparados por uma pessoa de - habilidade comum na técnica. Além disso, sínteses não limitantes examplares de aminoácido não natural que são incluídas neste relatório estão representadas nas FIGS. 4, - 24 a 34 e 36 a 39 da Patente U.S. Nº 7.083.970, a qual é integralmente incorporada como referência neste relatório.

Amincácidos com um grupo eletrofílico reativo incluem uma variedade de reações às moléculas de ligação por intermédio de reações de adição nucleofílica, entre outros. Tais grupos eletrofílicos reativos incluem um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um

- grupo dicarbonila), um grupo do tipo carbonila que tem reatividade similar a um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila e é estruturalmente similar a um . grupo carbonila), um grupo carbonila mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila) ou um grupo carbonila protegido (que tem reatividade similar a um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila) sob desproteção. Tais aminoácidos incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (IV): R3 Ra Ng NR Ri Ra

NOR o (V), em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquiteno inferior substituído, —cicloalguileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alguenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, L heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, . aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente, é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alguenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alguileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído), -S(O).- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)(alguileno ou alquileno substituído)-, -C(O0)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno —substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alqguileno ou alquileno substituído)-, — -N(R)C(0)O-, — -S(OLN(R), — -N(RY)C(O)N(R')-, -N(R)C(SN(R)-, N(IRIS(OLN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R)=N- N(R')-, -C(R)=N-N=, -C(R')-N=N- e - C(R)-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; « o . R . õ " ae ah ua se A RS O O ONO We

E < f R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; cada R" é independentemente H, alquila, alquita substituído ou um grupo de proteção ou quando mais do que um grupo R” está presente, dois R" opcionalmente formam um heterocicloalquila; R; é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R; e R, é independentemente H, halogênio, alquila inferior ou alquila inferior substituído ou R3 e R, ou dois grupos R; opcionalmente formam um cicloalquila ou um heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R juntos formam um cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclico ou tricíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protegido, incluindo um grupo dicarbonila protegido ou grupo carbonila — mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; Ou os grupos -J-R juntos formam um cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclico ou bicíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, E grupo carbonila protegido, incluindo um grupo dicarbonila protegido ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; “20 com a condição de que quando A é fenileno e cada R; é H, B está presente; e que quando A é -(CH>),- e cada R; é H, B não é -NHC(O)(CH;CH72)-; e que quando A e B estão ausentes e cada R; é H, R não é metila.

Além disso, tendo a estrutura da Fórmula (V), são incluídos: o Papa ta lo o (V), em que: A é opcional e, quando presente. é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno " inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno A substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, —aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente, é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, algueniteno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou

Tr alquileno substituído)-, -S-, -S-(alguileno ou alquileno substituído)-, -S(O),- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno f substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alguileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - —CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R)C(0)O-, — -S(O)N(R')-, “N(R)C(OIN(R')-), — -N(R)C(S)N(R')-, - N(RIS(OLN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, FC(R')=N-N(R')-, -C(R)=N-N=, -C(R')-N=N- e - C(R')a-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R; é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; com a condição de que quando A é fenileno, B está presente; e que quando A é - (CH), B não é -NHC(O)(CH;CH2)-; e que quando A e B estão ausentes, R não é metila.

Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (VI), são incluídos: " Ra x o Ra a : Ra o (V), em que: B é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquileno inferior, alqguileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alguileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído), “N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, “N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, - A S(OLN(R')-, -N(RJC(OIN(IR')-, -N(RJICISIN(R')-, -N(R)S(OLN(R'), -N(R')-N=, -C(RY=N-, - CIRIAN-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')-N=N- e -C(R')-N(R)-N(R')-, onde cada R é Ê independentemente H, alquila ou alquila substituído; Ré H, alquila, alguila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R: é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina,

ã aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, halogênio, ai alquila, alquila substituído, -N(R'), -C(O)R' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R')2, -OR' e -S(O).R”, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído.

Além disso, os aminoácidos seguintes são incluídos: o o A o SÃ E E na a H2 ú , HoN ;OOH y y , A Us E NA RA ado HAN” H2N Han mn HAN” >cooH ' h e , em que tais compostos são opcionalmente grupos amino protegido, carboxila protegido ou um sal dos mesmos.

Além disso, qualquer um dos aminoácidos não naturais seguintes pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.

E Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (VII) são ' incluídos: o - Cro, o (VI), em que, B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que consiste de —alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O).- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alguileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno ou alguileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - . CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído), — -N(R)C(0)O-, —-S(OLN(R'), — -N(R)C(OINIR'), — -N(RJC(SIN(R)-, - Í N(RIS(OLN(R')-, -N(R')-Na, -C(R')=N-, -C(R)=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')-N=N- e - CIR')a-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alguila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e

E R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; á cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R'), -C(OkR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R')a, -OR' e -S(O)R', —ondecadaR' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; e né 0 a 8; com a condição de que quando A é -(CH>2)4-, B não é -NHC(O)(CH,CH>)-. Além disso, os aminoácidos seguintes são incluídos: AA ço too no" HoN' o HH no Hon A Ho " & : " e Hon " e Õ , em que tais compostos são amino opcionalmente protegido, carboxila opcionalmente protegido, amino opcionalmente protegido e carboxila protegido ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos aminoácidos não naturais seguintes podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (VIII) são incluídos:

DD a, Ri Ra

H ' o (VI), em que A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior f substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, —aralquileno ou aralquileno substituído;

Li B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquiteno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior ' substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O),- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R'), -CON(R')-(alguileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, — -N(RY)C(0)O-, — -S(O)kN(R)-, — -N(R)C(O)N(R')-, -“N(R)C(S)N(R')-, - N(RIS(OLN(R)-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R)=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')-N=N- e - CIR')a-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.

Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (IX) são incluídos: - x Ra E o 3 Ra Ra "x R2 o (IX), B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior — substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alguileno ou alquileno substituído)-, -S(O),- onde k é 1,2 ou 3, -S(O)(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alguileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno ã substituído)- — -N(R)C(0)O-, — -S(O)N(R)-, — -N(RJ)C(OIN(R')-, — -N(RJ)C(SIN(R))-, - : N(RIS(OLN(IR')-, -N(R')-Na, -C(R')=N-, -C(R)=N-N(R')-, -C(R)=N-N=, -C(R')-N=N- e - . C(R')a-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquita substituído; Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina,

: aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, ' halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)R' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R'),, -OR' e -S(O)R', onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído.

Além disso, os aminoácidos seguintes são incluídos: A? y 5 e , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegido, opcionalmente amino protegido e carboxila protegidos ou um sal dos mesmos.

Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos aminoácidos não naturais seguintes podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural. ] Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (X) são incluídos: - o ERA ao eh o X), em que B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno ou alquileno substituído), -C(ON(R')-, -CON(R')-(alguileno ou alquileno « 15 substituído), -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)O-, -S(O)N(R))-, -N(R)C(OJN(R')-, -N(R)C(S)N(R')-, - * NIRIS(OLN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R)=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')-N=N- e - C(R')L-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R; é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e

. R> é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; . cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, halogênio, alquila, alqguila substituído, -N(R')a, -C(O),R' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R')», -OR' e -S(O)R', —ondecadaR'éindependentemente H, alquila ou alquila substituído; e né 0 a 8. Além disso, os aminoácidos seguintes são incluídos:

PS HoN H a e" Ha a NET ANNA À qo ê , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegido, opcionalmente amino protegido e carboxila protegido ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos aminoácidos não f naturais seguintes podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural. Além das estruturas monocarbonila, os aminoácidos não naturais descritos neste relatório podem incluir grupos, tais como dicarbonila, do tipo dicarbonila, grupos dicarbonila mascarado e dicarbonila protegido. Por exemplo, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XI) são incluídos: o ao eh õ o (XI), em que A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno : 15 substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcariteno substituído, . aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alqguileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O).(alguileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno

" substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - g CSN(R')-, -CSN(R')-(alguileno ou alguileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído). — -N(R)C(0)O-, — -S(OLN(R)-, — -N(R)C(O)N(R'))-, -N(RJ)C(S)N(R')-, - N(RIS(OLN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R)=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R').-N=N- e - CIR)-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R; é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.

Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XII) são incluídos: Ra x À : Y R Ra à. f a Ra o (XI), . B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que consiste de —alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O).- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno ou alqguileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(alguileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alguileno ou alquileno substituído). — -N(R)C(0)O-, —-S(OLkN(R)-, — -N(RJC(OINIR), -N(R)C(SIN(R), - NIRIS(OLN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R)=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')-N=N- e - C(R')-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alqguila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; " R: é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e ; É R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O).R' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R'), -OR' e -S(OLR', onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído.

E Além disso, os aminoácidos seguintes são incluídos: no o . N. E vor MaN GOO e HNTTCOOH — em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegido, opcionalmente amino protegido e carboxila protegido ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos aminoácidos não naturais seguintes podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XIII) são incluídos: o

CR MN SO o o (XI), em que B é opcional e, quando presente é um ligador selecionado do grupo que - 5 consiste de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alguenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O).(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR' - (alguileno ou alquileno substituído). -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)N(R')-, -N(R)C(OJN(R')-, -N(RY)C(S)N(R')-, - N(RIS(OLkN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R)=N- N(R')-, -C(R)=N-Na, -C(R')-N=N- e - C(R')-N(R'-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alguila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, . aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, halogênio, ' alquila, alquila substituído, -N(R'), -C(OkR' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R')2, -OR' e -S(O)R”, É onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído; e né 0 a 8. Além disso, os aminoácidos seguintes são incluídos:

nho Da. .

NH HoN AN m nah on Hz! sá e Ha " sd HoN H

H q Sã. e HoN " Se A e e A o e e , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegido, opcionalmente amino protegido e carboxila protegido ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos aminoácidos não naturais seguintes podem ser incorporados em um polipeptídeo de Í aminoácido não natural. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XIV) são . incluídos: o o

EA Am R AL: XIV), em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, —cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alguenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, á aralquileno ou aralquileno substituído; 21o R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R' é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X, é C, S ou S(O0); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R'Xalquileno) ou m N(R')alquileno substituído), onde R' é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído. : Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XKIV-A) são incluídos: 0 o

EA

ON R NS (XIV-A), em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alguenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno — substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; É R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; r R; é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e Na E) R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R' é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído.

Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XKXIV-B) são incluídos: o SN ? À

DÓ OR or. (XIV-B), - em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, F cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenilêno inferior, alquenileno * inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, —heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído;

" R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R' é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alguileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R'Xalquileno substituído), onde R' é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XV) são incluídos: o o x A

O R * (ERR), RN C(O)R, (XV), em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno - inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno “ 15 substituído, heteroarileno, heteroarieno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X, é C, S ou S(0); e né 0, 1,2, 3 e 4 ou 5; e cada Rº e Rº em cada grupo CRºRº é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, alcóxi, alquilamina, halogênio, alquila, arila ou qualquer Rº e Rº podem juntos formar =O ou um cicloalquila ou quaisquer —gruposRº adjacentes podem juntos formar um cicloalquila. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XV-A) são incluídos: : ”. o " ;

A À A Ne RIR) RH (0)R, (XV-A),

f em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alguenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloaiquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; né 0O,1,2,3e40ous5; e cada Rº e Rº em cada grupo CRºRº é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, alcóxi, alguilamina, halogênio, alquila, arila ou qualquer Rº e Rº podem juntos formar =O ou um cicloalquila ou quaisquer grupos Rº adjacentes podem juntos formar um cicloalquila.

Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XV-B) são incluídos: | NA À AúÚN R ES (CRºRº), RN C(0)R, (XV-B), em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarieno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, —aralguileno ou aralquileno substituído; E R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R: é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, . aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e f R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, — aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; né 0O,1,2,3e4ous5;e cada Rº e Rº em cada grupo CRºRº é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, alcóxi, alguilamina, halogênio, alquila, arila ou qualquer Rº e Rº podem juntos formar =O ou um cicloalquila ou quaisquer grupos Rº

P adjacentes podem juntos formar um cicloalquila. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XVI) são : incluídos:

A NH

SE R,HN C(0)R, XV), em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarieno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, —aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alguita substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, “15 aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X, é C, S ou S(O0); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R (alquileno substituído), onde R' é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XVI-A) são incluídos:

A IE R

E RH C(O0)R, (XVI-A), E em que: A é opcional e, quando presente é alquiteno inferior, alquileno inferior substituído, E cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, —heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído;

P R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e :; R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R' é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo a estrutura da Fórmula (XVI-B) são incluídos: s, 7 2 Im R

SS RH C(0)R, (XVI-B), em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, “15 aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R'(alquileno substituído), onde R' é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído. Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVII) são incluídos: à fo Ry À PAO A, SP R? : o (XVI), em que: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alguenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído,

f heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; o o) o) vw Rh e me dito da do o) CATA! vv A & USA M é -C(R3), (a) Ra Ra ; (a) R, . (a) R i O O) o) () Rs o seo 7 RE e o DZ fazenda — brdbm s— Cs (D) dot a TA A | | | x OR Vs 8 ve nm am O Ra b [CN (a) ' a) ou (a) , onde (a) indica a união ao grupo A e (b) indica a união aos grupos carbonila respectivos, R; e Ra são independentemente escolhidos de H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído ou R; e R, ou dois grupos R3 ou dois grupos R, opcionalmente formam um cicloalquila ou um heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; Tg é uma ligação, C(RKR), O ou S e R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R, é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, i aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVI!!) são incluídos:

RO nO Or Ta Ra DR

R xy R2 o (XVI), em que: O) O) &) o) i TOO TT TT TF 8 (b) — —Oo—S (b) ——ç—— CA SR SO) s ÃO DAS o $ O ES Ss o E M é -C(R3)-, (& RR O Re oO Re , a) Ra . O) b) o o) G so ANNA Ss Pr 1 Pa=ç— (b) bd () S—ç—S (0) RARO | | | SR NM EK amo Ad &w&., (a) : (a) ou (a) , onde (a) indica a união f ao grupo A e (b) indica a união aos grupos carbonila respectivos, R; e R, são independentemente escolhidos de H, halogênio, alquila, alguila substituído, cicloalquila ou f cicloalquila substituído ou R; e R, ou dois grupos R;3 ou dois grupos R, opcionalmente formam um cicloalquila ou um heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alguila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; T;3 é uma ligação, C(RXR), O ou S e R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R: é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada R, é independentemente selecionado do grupo que consiste de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')., -C(O)R' onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R'), -OR' e -S(O)R', onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído. Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XIX) são incluídos: R 0 o

EX : ty R? o (XX), em que: R é H, halogênio, alquila, alguila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; e T;é OouS. Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XX) são incluídos:

RO

R ty Ro É EX), em que: R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído. Além disso, os aminoácidos seguintes tendo as estruturas da Fórmula (XXI) são incluídos:

Rr R; Rj. R Y o e 4 o .

Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural é quimicamente modificado para gerar um grupo funcional carbonila ou dicarbonila reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxila adjacentes. Onde a — molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, uma serina ou treonina N- terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta por intermédio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade aldeído sob condições de clivagem oxidativa suaves usando periodato. Veja, por exemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem.

3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Entretanto, métodos conhecidos na técnica são restritos ao aminoácido no N-terminal do peptídeo ou proteína.

Na presente invenção, um aminoácido não natural portando grupos hidroxila e . amino adjacentes pode ser incorporado no polipeptídeo como uma funcionalidade aldeído “mascarada”. Por exemplo, 5-hidroxilisina porta um grupo hidroxila adjacente ao epsílon .- 15 amina. Condições de reação para gerar o aldeído tipicamente envolvem a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves para evitar a oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é tipicamente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 de excesso molar de metaperiodato de sódio a uma solução do polipeptídeo tamponada, seguido por incubação durante cerca de 10minutos no escuro. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nº 6.423.685. A funcionalidade carbonila ou dicarbonila pode ser reagida seletivamente com um reagente contendo hidroxilamina sob condições suaves em solução aquosa para formar a ligação oxima correspondente que é estável sob condições fisiológicas. Veja, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc 117:3893-3899 (1995). Além disso, a única reatividade do grupo carbonila ou dicarbonila inclui a modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de É aminoácidos. Veja, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997). Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não Naturais: Aminoácidos Contendo Hidroxilamina O Pedido de Patente Provisório U.S. Nº 60/638.418 é integralmente incorporado como referência. Assim, as divulgações fornecidas na Seção V (intitulada “Non-Natural í Amino Acids”), Parte B (intitulada “Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine-Containing Amino Acids”), no Pedido de Patente Provisório U.S. Nº Ô 60/638,418 aplicam-se completamente aos métodos, composições (incluindo as Fórmulas | a XXXV), técnicas e estratégias para fabricar, purificar, caracterizar e usar aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos não naturais e polipeptídeos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente modificados descritos neste relatório da mesma forma como se tais divulgações fossem completamente apresentadas neste relatório. A Publicação das Patentes U.S. Nº 2006/0194256, 2006/0217532 e 2006/0217289 e WO 2006/069246 intitulado “Compositions containing, methods involving and uses of non-natural amino acids and polipeptides”, também são integralmente incorporados neste relatório como referência.

SÍNTESE QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS Muitos dos aminoácidos não naturais adequados para o uso na presente invenção estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Sigma (USA) ou Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados, conforme fornecido neste relatório ou conforme fornecido em várias publicações ou usando métodos padrão conhecido àqueles de habilidade comum na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, veja, por exemplo, Organic Chemistry de Fessendon e Fessendon, (1982, k' Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Massa.); Organic Chemistry Advanced de March (Terceira Edição, 1985, Wiley e Sons, Nova lorque); e Organic Chemistry Advanced de Careye Sundberg (Terceira Edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova lorque). Publicações adicionais que descrevem a síntese de aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, o WO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;” Matsoukas et a/., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthilated Intermediates. J. Chem. Soc, 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4- [[4-(diethylamino)-1-methylbutylJamino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167- 1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine Analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) . Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically . Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium lon Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239- 1246; Barton et al, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsatured Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; e, Subasinghe et

3 al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their actívity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Í Veja, também, Publicação da Patente U.S. Nº US 2004/0198637 intitulada “Protein Arrays”, a qual é incorporada como referência neste relatório. A. Grupos carbonila reativos Aminoácidos com um grupo carbonila reativo incluem uma variedade de reações às moléculas de ligação (incluindo mas não limitada a PEG ou outras moléculas solúveis em água) por intermédio de reações de adição nucleofílica ou condensação de aldol, entre outras.

Aminoácidos contendo carbonila exemplares podem ser representados, como segue: (CHI,RICOR?

A A em que n é 0 a 10; R, é um alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído; R, é H, alquila, arila, alquila substituído e arila substituído; e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino e R, é H, um aminoácido, um —polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi. Em algumas modalidades, n é Ô 1, R, é fenila e R2 é um alquila simples (isto é, metila, etila ou propila) e a porção cetona é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquila. Em algumas modalidades, n é 1, R, é fenila e R> é um alquila simples (isto é, metila, etila ou propila) e a porção cetona é posicionada na posição meta em relação à cadeia lateral de alquila.

A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), o qual é incorporado como referência neste relatório. Outros aminoácidos contendo carbonila podem ser similarmente preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é quimicamente modificado para gerar um grupo carbonila funcional reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxila adjacentes. Onde a molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, uma ' serina ou treonina N-terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta por intermédio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma f funcionalidade aldeído sob condições de clivagem oxidativa suaves usando periodato. Veja, por exemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol Chem. 269:7224-7230 (1994). Entretanto, métodos conhecidos na técnica são restritos ao aminoácido no N-terminal do peptídeo ou proteína.

f Na presente invenção, um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado portando grupos hidroxila e amino adjacentes pode ser incorporado no polipeptídeo como : uma funcionalidade aldeído “mascarada”. Por exemplo, 5-hidroxilisina porta um grupo hidroxila adjacente ao epsílon amina. Condições de reação para gerar o aldeído tipicamente envolvem a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves para evitar a oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é de tipicamente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 de excesso molar de metaperiodato de sódio a uma solução do polipeptídeo tamponada, seguido por incubação durante cerca de 10 minutos no escuro. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nº

6.423.685, a qual é incorporada como referência neste relatório.

A funcionalidade carbonila pode ser reagida seletivamente com um reagente contendo hidrazina, hidrazida, hidroxilamina ou semicarbazida sob condições suaves em solução aquosa para formar as ligações hidrazona,y oxima ou semicarbazona correspondentes, respectivamente, que são estáveis sob condições fisiológicas. Veja, por exemplo, Jencks, W. P., J Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a única reatividade do grupo carbonila possibilita a modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de aminoácidos.

É Veja, por exemplo, Cornish, V. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., “20 Science276:1125-1128 (1997).

B. Grupos hidrazina, hidrazida ou semicarbazida reativos Aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados contendo um grupo nucleofílico, tal como uma hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, incluem reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, mas não limitados a —PEG ououtros polímeros solúveis em água). Aminoácidos contendo hidrazina, hidrazida ou semicarbazida exemplares podem ser representados, como segue: (CHa)) R1X-C(O)-NH-HN, as. ii em que n é 0 a 10; R; é um alquila, arila, alguila substituído ou arila substituído ou não presente; X, é O, N ou S ou não presente; R, é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou “30 um grupode modificação no terminal amino e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou i um grupo de modificação no terminal carbóxi.

Em algumas modalidades, n é 4, R, é não presente e X é N. Em algumas modalidades, n é 2, R, é não presente e X é não presente. Em algumas modalidades, n é 1, R, é fenila, Xé O e o átomo de oxigênio é para posicionado ao grupo alifático no anel de

Ai arila.

Aminoácidos contendo hidrazida, hidrazina e semicarbazida estão disponíveis a | partir de fontes comerciais.

Por exemplo, L-glutamato-y-hidrazida está disponível da Sigma Chemical (St.

Louis, MO). Outros aminoácidos não disponíveis comercialmente podem ser preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

Veja, por exemplo, Pat.

U.S.

Nº 6.281.211, a qual é incorporada como referência neste relatório.

Polipeptídeos contendo aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados que portam funcionalidades hidrazida, hidrazina ou semicarbazida podem ser eficaz e seletivamente reagidos com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química similar.

Veja, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J.

Am.

Chem.

Soc. 117:3893-3899 (1995). A única reatividade dos grupos hidrazida, hidrazina e semicarbazida funcionais os torna significantemente mais reativos em relação aos aldeídos, cetonas e outros grupos eletrofílicos em comparação aos grupos nucleofílicos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo mas não limitados ao grupo hidroxila de —serina ou treonina ou os grupos amino de lisina e o N-terminal). C.

Aminoácidos contendo aminoóxi Aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados contendo um grupo í aminoóxi (também chamado uma hidroxilamina) incluem a reação com uma variedade de : grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo mas não limitados a PEG ou outros polímeros solúveis em água). Semelhante às hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade realçada do grupo aminoóxi permite que ele reaja eficaz e seletivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química similar.

Veja, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J.

Am.

Chem.

Soc. 117:3893-3899 (1995); H.

Hang e C.

Bertozzi, Acc.

Chem.

Res. 34: 727-736 (2001). Ao passo que o resultado da reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, entretanto, uma oxima geralmente resulta da reação de um grupo aminoóxi com um grupo contendo carbonila, tal como uma cetona.

Aminoácidos exemplares contendo grupos aminoóxi podem ser representados, como segue: (CHa))R1-X-(CH2)Jn-Y-O-NH? : Era em que n é 0 a 10; R, é um alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído ou : não presente; X é O, N, S ou não presente; m é 0 a 10; Y = C(O) ou não presente; R, é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino e R; éH, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

Em algumas modalidades, n é 1, R, é fenila, Xé O, mé 1e Y está presente.

Em algumas — modalidades, né2,R,eXnão estão presentes, m é O e Y não está presente.

e: Aminoácidos contendo aminoóxi podem ser preparados a partir de precursores de aminoácidos facilmente disponíveis (homoserina, serina e treonina). Veja, por exemplo, M. : Carrasco e R.

Brown, J.

Org.

Chem. 68: 8853-8858 (2003). Certos aminoácidos contendo aminoóxi, tais como ácido L-2-amino-4-(aminoóxi)butírico, foram isolados de fontes naturais —(Rosenthal, G,, Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Outros aminoácidos contendo aminoóxi podem ser preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

D.

Grupos azida e alcino reativos A única reatividade dos grupos azida e alcinos funcionais os torna extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas.

Azidas orgânicas, particularmente azidas e alcinos alifáticos, são geralmente estáveis em relação às condições de química reativas comuns.

Em particular, os grupos funcionais azida e alcino são inertes em relação às cadeias laterais (isto é, grupos R) dos 20 aminoácidos comuns encontrados em polipeptídeos que ocorrem naturalmente.

Quando levados em proximidade, entretanto, a natureza “spring-carregada” dos grupos azida e alcino é revelada e eles reagem seletiva e eficazmente por intermédio da reação de cicloadição [3+2] de Huisgen para gerar o triazol correspondente.

Veja, por exemplo, Chin J., ef a/., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q,, et al., J.

Am.

Chem.

Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J.

W., et al.

J.

E Am.

Chem.

Soc. 124:9026-9027 (2002). Pelo fato de a reação de cicloadição de Huisgen envolver uma reação de cicloadição seletiva (veja, por exemplo, Padwa, A., em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (ed.

Trost, B.

M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. em 1.3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (ed.

Padwa, A., 1984), p. 1-176) ao invés de uma substituição nucleofílica, a incorporação de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados portando cadeias laterais contendo azida e alcino permite que os polipeptídeos resultantes sejam seletivamente modificados na posição do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

A reação de cicloadição que envolve polipeptídeo de IFN beta contendo azida ou alcino pode ser realizada na temperatura ambiente sob condições aquosas pela adição de Cu(ll) (incluindo mas não limitado na forma de uma quantidade catalítica de CuSO,) na presença de um agente redutor para reduzir Cu(ll) a Cu(l), in situ, em quantidade catalítica.

Veja, por exemplo, Wang, Q., et al., J.

Am.

Chem.

Soc. 125, 31 92-3193 (2003); Tornoe, C. k W,, et al., J.

Org.

Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovisev, et al., Angew.

Chem.

Int.

Ed. 41:2596-2599 (2002). Agentes redutores exemplares incluem, incluindo mas não limitados a io ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe?, co? e um potencial elétrico aplicado.

Em alguns casos, onde uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen entre uma azida e um alcino é desejada, o polipeptídeo de IFN beta compreende um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreendendo uma porção alcino e o polímero solúvel ã em água ligado ao aminoácido compreende uma porção azida.

Alternativamente, a reação conversa (isto é, com a porção azida no aminoácido e a porção alcino presente no polímero t solúvel em água) também pode ser realizada.

O grupo azida funcional também pode ser seletivamente reagido com um polímero solúvel em água contendo um ariléster e apropriadamente funcionalizado com uma porção arilfosfina para gerar uma ligação amida.

O grupo arilfosfina reduz a azida in situ e a amina resultante depois reage eficazmente com uma ligação éster próxima para gerar a amida correspondente.

Veja, por exemplo, E.

Saxon e C.

Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). O aminoácido contendo azida pode ser um alquilazida (incluindo mas não limitado a ácido 2- amino-6-azido-1-hexanóico) ou um arilazida (p-azido-fenilalanina). Polímeros solúveis em água exemplares contendo um ariléster e uma porção fosfina podem ser representados, como segue: O.

X. "ES PPhz em que X pode ser O, N, S ou não presente, Ph é fenila, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H e grupos alquila, arila, alguila substituído e arila substituído.

Grupos — 15 R exemplares incluem, mas não são limitados a -CH2, -C(CH3)3a, -OR', -NR'R”, -SR, - halogênio, -C(O)R', -CONR'R”, -S(OLR', -S(O)LNRR", -CN e -NO2 R', R', Rº e R” bi independentemente referem-se a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, incluindo mas não limitado ao arila substituído com 1 a 3 halogênios, alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos —arilalquila.

Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são os grupos R', Rº, R' e R”” quando mais do que um destes grupos está presente.

Quando R' e R" são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros.

Por exemplo, -NR'Rº inclui, mas não é limitado a 1- pirrolidinita e 4-morfolinila.

À partir do debate de substituintes acima, uma pessoa de habilidade na técnica entenderá que o termo “alquila” inclui grupos incluindo átomos de carbono ligados aos grupos, exceto grupos hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo mas não limitado a -CF, e -CH2CF3) e acila (incluindo mas não limitado a -C(O)CHs, -C(O)CF3, - R C(O)JCH;OCH; e semelhantes). O grupo azida funcional também pode ser seletivamente reagido com um polímero à solúvel em água contendo um tioéster e apropriadamente funcionalizado com uma porção arilfosfina para gerar uma ligação amida.

O grupo arilfosfina reduz a azida in situ e a amina resultante depois reage eficazmente com a ligação tioéster para gerar a amida correspondente.

Polímeros solúveis em água exemplares contendo um ticéster e uma — porção fosfinapodem ser representados como segue:

á 28X, PhoP(HC) Yv w á em que n é 1 a 10; X pode ser O, N, S ou não presente, Ph é fenila e W é um polímero solúvel em água.

Aminoácidos exemplares contendo alcinos podem ser representados, como segue: (CHI),R,X(CH2) .CCH ros em que n é 0 a 10; R; é um alquila, arila, alquila substituído ou arila substituído ou não presente; X é O, N, S ou não presente; m é 0 a 10, R é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

Em algumas modalidades, n é 1, R, é fenila, X não está presente, m é O e a porção acetileno é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquila.

Em algumas modalidades, n é 1, R; é fenila, X é O, mé1eo grupo propargilóxi é posicionado na posição para em relação à cadeia lateral de alquila (isto é, O-propargil-tirosina). Em algumas modalidades, n é 1, R, e X não estão presentes e m é O (isto é, propargilglicina). - Aminoácidos contendo alcino estão comercialmente disponíveis.

Por exemplo, propargilglicina — está “comercialmente disponível! da Peptech (Burlington, MA). - 15 Alternativamente, aminoácidos contendo alcino podem ser preparados, de acordo com métodos padrão.

Por exemplo, p-propargiloxifenilalanina pode ser sintetizado, por exemplo, conforme descrito em Deiters, A., et al, J.

Am.

Chem.

Soc. 125: 11782-11783 (2003) e 4- alquinil-L-fenilalanina pode ser sintetizado, conforme descrito em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos contendo alcino podem ser preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

Aminoácidos contendo azida exemplares podem ser representados, como segue: (CH), RIKX(CH2)mNs os em que n é 0 a 10; R, é um alquila, arila, alquila substituído, arila substituído ou não presente; X é O, N, S ou não presente; m é 0 a 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo . ou um grupo de modificação no terminal amino e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ouum grupo de modificação no terminal carbóxi.

Em algumas modalidades, n é 1, Ré aaa. fenila, X não está presente, m é 0 e a porção azida é para posicionada na cadeia lateral de alquila.

Em algumas modalidades, n é 0 a 4e R, e X não estão presentes e m = O.

Em algumas modalidades, n é 1, R: é fenila, Xé O, mé 2 e a porção B-azidoetóxi é posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquila.

Aminoácidos contendo azida estão disponíveis a partir de fontes comerciais.

Por á exemplo, 4-azidofenilalanina pode ser obtido da Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). Para estes aminoácidos contendo azida que não estão comercialmente disponíveis, o f grupo azida pode ser facilmente preparado usando métodos padrão conhecido àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo mas não limitado por intermédio de deslocamento —deum grupo de partida adequado (incluindo, mas não limitado ao haleto, mesilato, tosilato) ou por intermédio da abertura de uma lactona adequadamente protegida.

Veja, por exemplo, Advanced Organic Chemistry de March (Terceira Edição, 1985, Wiley e Sons, Nova lorque). E.

Grupos aminotiol reativos A única reatividade de grupos aminotio! beta-substituídos funcionais os torna extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas que contêm grupos aldeído por intermédio da formação da tiazolidina.

Veja, por exemplo, J.

Shao e J.

Tamn, J.

Am.

Chem.

Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. Em algumas modalidades, aminoácidos de aminotiol beta-substituído podem ser incorporados em polipeptídeos de IFN beta e depois reagidos com polímeros solúveis em água compreendendo uma funcionalidade aldeído.

Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água, fármaco conjugado ou outra carga útil podem ser ligados a um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido de aminotio! beta-substituído por intermédio da formação da tiazolidina.

F.

Grupos reativos adicionais Grupos reativos adicionais e aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados, incluindo mas não limitados a para-amino-fenilalanina, que podem ser incorporados em polipeptídeos de IFN beta da invenção, são descritos nos pedidos de patente seguintes, os quais são todos integralmente incorporados como referência neste relatório: Publicação da Patente U.S.

Nº 2006/0194256, Publicação da Patente U.S.

Nº 2006/0217532, Publicação da Patente U.S.

Nº 2006/0217289, Patente Provisória U.S.

Nº 60/755.338; Patente Provisória U.S.

Nº 60/755.711; Patente Provisória U.S.

Nº 60/755.018; Pedido de Patente Internacional PCT Nº US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória U.S.

Nº 60/743.041; Patente Provisória U.S.

Nº 60/743.040; Pedido de Patente Internacional PCT Nº USO06/47822; Patente Provisória U.S.

Nº 60/882.819; Patente Provisória U.S.

Nº 60/882.500; e Patente Provisória U.S.

Nº 60/870.594. Estes pedidos também debatem ' grupos reativos que podem estar presentes em PEG ou outros polímeros, incluindo mas não limitados a grupos hidroxilamina (aminoóxi) para conjugação. ' E ABSORÇÃO CELULAR DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS A absorção do aminoácido não natural por uma célula é um problema que é tipicamente considerado quando se designa e seleciona aminoácidos não naturais para a incorporação em uma proteína.

Por exemplo, a alta densidade de carga de a-aminoácidos sugere que estes compostos provavelmente não sejam permeáveis à célula.

Aminoácidos á naturais são absorvidos na célula eucariótica por intermédio de um coleção de sistemas de transporte com base na proteína. Uma triagem rápida pode ser feita, a qual avalia quais À aminoácidos não naturais, se algum, são absorvidos por células. Veja, por exemplo, os ensaios de toxicidade, por exemplo, na Publicação da Patentes U.S. Nº US 2004/0198637 intitulada “Protein Arrays” a qual é incorporada como referência neste relatório; e Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Embora a absorção seja facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativa para designar aminoácidos não naturais que são acessíveis às vias de absorção celular é fornecer vias biossintéticas para criar aminoácidos in vivo.

BIOSSÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS Muitas vias biossintéticas já existem em células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Embora um método biossintético para um aminoácido não natural particular possa não existir na natureza, incluindo mas não limitado em uma célula, a invenção fornece tais métodos. Por exemplo, vias biossintéticas para aminoácidos não naturais são opcionalmente geradas em células hospedeiras adicionando-se novas enzimas ou modificando-se as vias de células hospedeiras existentes. Novas enzimas adicionais são f opcionalmente enzimas que ocorrem naturalmente ou enzimas artificialmente envolvidas. Por exemplo, a biossíntese de p-aminofenilalanina (conforme apresentado em um exemplo noWoO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation of unnatural amino acids”) depende da adição de uma combinação de enzimas conhecidas a partir de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos em uma célula eucariótica transformando-se a célula com um plasmídeo compreendendo os genes. Os genes, quando expressados na célula, fornecem uma via enzimática para sintetizar o composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionadas são fornecidos nos exemplos abaixo. Sequências de enzimas adicionais são encontradas, por exemplo, em Genbank. Enzimas artificialmente envolvidas também são opcionalmente adicionadas em uma célula da mesma maneira. Deste modo, o mecanismo e fontes celulares de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos não naturais. Uma variedade de métodos estão disponíveis para produzir novas enzimas para o . uso em vias biossintéticas ou para a evolução de vias existentes. Por exemplo, recombinação recursiva, incluindo mas não limitada àquela desenvolvida por Maxygen, Inc. . (disponível na rede mundial de computadores no site maxygen.com), é opcionalmente usada para desenvolver novas enzimas e vias. Veja, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid — evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. Similarmente, DesignPath”“,

Ê desenvolvido pela Genencor (disponível na rede mundial de computadores no site genencor.com) é opcionalmente usado para engenharia de vias metabólicas, incluindo mas í não limitado a engendrar uma via para criar O-metil-L-tirosina em uma célula. Esta tecnologia reconstrói vias existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de novos genes, incluindo mas não limitados àqueles identificados através de genômica e evolução e projeto molecular funcionais. Diversa Corporation (disponível na rede mundial de computadores no site diversa.com) também fornece tecnologia para triar rapidamente as bibliotecas de genes e vias de genes, incluindo mas não limitada à criação de novas vias. Tipicamente, o aminoácido não natural produzido com um via biossintética engendrada da invenção é produzido em uma concentração suficiente para a biossíntese eficaz da proteína, incluindo mas não limitado a uma quantidade celular natural, porém não a um tal grau que possa afetar a concentração dos outros aminoácidos ou esgotar as fontes celulares. Concentrações típicas produzidas in vivo, deste modo, são de cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM. Uma vez que uma célula é transformada com um plasmídeo compreendendo os genes usados para produzir enzimas desejadas para uma via específica e um aminoácido não natural é gerado, seleções in vivo são opcionalmente usadas para otimizar ainda a produção do aminoácido não natural para síntese ribossômica da proteína e Ú crescimento celular.

POLIPEPTÍDEOS COM AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS A incorporação de um aminoácido não natural pode ser feita para uma variedade de propósitos, incluindo mas não limitados a adaptar mudanças na estrutura da e/ou função proteína, tamanho mutável, acidez, nucleofilicidade, união de hidrogênio, hidrofobicidade, acessibilidade dos sítios alvo da protease, alvejar uma porção (incluindo, mas não limitada para um arranjo de proteína), adicionar uma molécula biologicamente ativa, fixar um — polímero, fixar um radionuclídeo, modular a meia-vida no soro, modular a penetração no tecido (por exemplo, tumores), modular o transporte ativo, modular a especificidade ou distribuição do tecido, célula ou órgão, modular a imunogenicidade, modular a resistência à protease, etc. Proteínas que incluem um aminoácido não natural podem ter novas propriedades catalíticas ou biofísicas realçadas. Por exemplo, as propriedades seguintes são opcionalmente modificadas por inclusão de um aminoácido não natural em uma À proteína: toxicidade, biodistribuição, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, meia- . vida (incluindo mas não limitado à meia-vida no soro), capacidade de reagir com outras moléculas covalente ou não covalentemente e semelhantes. As composições incluindo proteinas que incluem pelo menos um aminoácido não natural são úteis para novos produtos terapêuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo mas não limitadas aos anticorpos) e incluindo mas não limitadas ao

: estudo da estrutura e função da proteína.

Veja, por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural f Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical : Biology, 4:645-652. Em um aspecto da invenção, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelomenos um, incluindo mas não limitado a, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez ou mais aminoácidos não naturais.

Os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos ou diferentes, incluindo mas não limitados a 1,2, 3e4,5,6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreende 1, 2, 3 e 4, 5,6,7,8,9 ou10oumais aminoácidos não naturais diferentes.

Em um outro aspecto, uma composição inclui uma proteína com pelo menos um aminoácido particular presente na proteína substituído com o aminoácido não natural.

Para um proteína fornecida com mais do que um aminoácido não natural, os aminoácidos não naturais podem ser idênticos ou diferente (a proteína pode incluir dois ou mais tipos diferentes de aminoácidos não naturais ou pode incluir dois dos mesmos aminoácidos não naturais). Para um proteína fornecida com mais do que dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos não naturais pode ser os mesmos, diferentes ou uma combinação de um aminoácido não natural múltiplo do mesmo tipo com 1 pelo menos um aminoácido não natural diferente.

Proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido não á 20 natural são uma característica da invenção.

A invenção também inclui polipeptídeos ou proteínas com pelo menos um aminoácido não natural produzido usando as composições e métodos da invenção.

Um excipiente (incluindo mas não limitado a um excipiente farmaceuticamente aceitável) também pode estar presente com a proteína.

Através da produção de proteínas ou polipeptídeos de interesse, com pelo menos um aminoácido não natural em células eucarióticas, proteínas ou polipeptídeos tipicamente incluirão modificações pós-tradução eucarióticas.

Em certas modalidades, uma proteína inclui pelo menos um aminoácido não natural e pelo menos uma modificação pós-tradução que é preparada in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós-tradução não é feita por uma célula procariótica.

Por exemplo, a modificação pós-tradução inclui, mas não é limitada à acetilação, acilação, modificação por lipídeo, palmitoilação, adição de palmiítato, . fosforilação, modificação de ligação do glicolipídeo, glicosilação e semelhantes.

Em um aspecto, a modificação pós-tradução inclui a ligação de um oligossacarídeo (incluindo mas - não limitado a (GIcNAc-Man)2-Man-GIcNAc-GIcNAc)) a uma asparagina por uma ligação de asparagina a GlcNAc.

Veja, Tabela 1 que lista alguns exemplos de oligossacarídeos N- ligados de proteínas eucarióticas (resíduos adicionais também podem estar presentes, os quais não são mostrados). Em um outro aspecto, a modificação pós-tradução inclui a ligação de um oligossacarídeo (incluindo mas não limitado a Gal-GalNAc, Gal-GIcNAc, etc.)

h a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina ou GalNAc-treonina ou uma " ligação GlcNAc-serina ou GlcNAc-treonina. É TABELA 1: EXEMPLOS DE OLIGOSSACARÍDEOS ATRAVÉS DA LIGAÇÃO DE GlcNAc Mana 1-6. Mana1-3. ' Mana 1-6. > Mang1-4GIcNACR1-4GICNACB1-Asn [o e ED TA a RITA Complexo > Mang1-4GIcNAcRB1-4GIcNACR1-Asn GIcNACB1-2—— Mana 1-3: a SS Aa e ram Xilose > Mang1-4GIcNAcB1-4GICNACB1-Asn XyIB1-2- Ainda em um outro aspecto, a modificação pós-tradução inclui o processamento proteolítico de precursores (incluindo mas não limitados a precursor da calcitonina, ' precursor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, hormônio da pré-pró-paratireóide, pré-pró-insulina, — pró-insulina, pré-pró-opiomelanocortina, pró-opiomelanocortina — e - semelhantes), construção em uma proteína de multissubunidades ou construção macromolecular, tradução a um outro sítio na célula (incluindo mas não limitada às organelas, tais como o retículo endoplasmático, o complexo de Golgi, o núcleo, lisossomos, peroxissomos, mitocôndria, cloroplastos, vacúolos, etc. ou através da via secretória). Em certas modalidades, a proteína compreende uma sequência de secreção ou localização, uma “tag” de epítopo, uma “tag” de FLAG, uma “tag” de poli-histidina, uma fusão GST ou semelhantes.

Uma vantagem de um aminoácido não natural é que ele apresenta porções químicas adicionais que podem ser usadas para adicionar moléculas adicionais. Estas modificações podem ser feitas in vivo em uma célula eucariótica ou não eucariótica ou in vitro. Assim, em certas modalidades, a modificação pós-tradução é através do aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós-tradução pode ser através de uma reação * nucleofilica-eletrofílica. A maioria das reações correntemente usadas para a modificação seletiva de proteínas envolve a formação de ligação covalente entre pares de reação Í nucleofílicos e eletrofílicos, incluindo mas não limitada à reação de a-halocetonas com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A seletividade, nestes casos, é determinada pelo número e acessibilidade dos resíduos nucleofílicos na proteína. Em proteínas da invenção, outras reações mais seletivas podem ser usadas, tais como a reação de um ceto- aminoácido não natural com compostos de hidrazida ou aminoóxi, in vitro e in vivo. Veja, por i exemplo, Cornish, et al., (1996) J.

Am.

Chem.

Soc. 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et a/., (2001) Science 292:498-500; Chin, et a/., (2002) J.

P Am.

Chem.

Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc.

Natl.

Acad.

Sci., 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc.

Natl.

Acad.

Sci., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746; e, Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7, todos os quais são incorporados como referência neste relatório.

Isto possibilita a marcação seletiva virtual de qualquer proteína com um hospedeiro de reagentes incluindo fluoróforos, agentes reticulantes, derivados de sacarídeo e moléculas citotóxicas.

Veja, também, Patente U.S.

Nº 6.927.042 intitulada “Glycoprotein synthesis”, a qual é incorporada como referência neste relatório.

Modificações pós-tradução através de um aminoácido de azido, também podem ser feitas através da ligação de Staudinger (incluindo mas não limitada com reagentes de triaritfosfina). Veja, por exemplo, Kiick et a/., (2002) Incorporation of azides in recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24. Esta invenção fornece um outro método altamente eficaz para a modificação seletiva de proteínas, o qual envolve a incorporação genética de aminoácidos não naturais, contendo uma porção azida ou alquinila nas proteínas, em resposta a um códon seletor.

Estas cadeias laterais de aminoácidos depois podem ser modificadas, incluindo mas não É limitadas por uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen (veja, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis.

Vol. 4. (1991) Ed.

Trost, B.

M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed.

Padwa, A., Wiley, Nova lorque, p. 1-176) com derivados de alquinila ou azida, respectivamente.

Pelo fato deste método envolver uma cicloadição ao invés de uma substituição nucleofílica, proteínas podem ser modificadas com seletividade extremamente alta.

Esta reação pode ser realizada na temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4>1,5)pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(l) à mistura de reação.

Veja, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) J.

Org.

Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew.

Chem.

Int.

Ed. 41:2596-2599. Um outro método que pode ser usado é a troca de ligante em um composto bisarsênico com um motivo de tetracisteína, veja, por exemplo, Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272. Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3+2] inclui virtualmente qualquer molécula com um derivado de azida ou alquinila.

Moléculas incluem, mas não são limitadas aos corantes, fluoróforos, agentes . reticulantes, derivados de sacarídeo, polímeros (incluindo mas não limitados aos derivados de polietilenoglico!), fotorreticuladores, compostos citotóxicos, marcações por afinidade, — derivados de biotina, resinas, pérolas, uma segunda proteína ou polipeptídeo (ou mais), polinucleotídeo(s) (incluindo mas não limitado(s) a DNA, RNA, etc.), quelantes de metal, cofatores, ácidos graxos, carboidratos e semelhantes.

Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo alquinila, incluindo mas não : limitados a p-propargiloxifenilalanina ou grupo azido, incluindo mas não limitado a p-azido- fenilalanina, respectivamente.

V.

Geração in vivo de polipeptídeos de IFN beta compreendendo aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados Os polipeptídeos de IFN beta da invenção podem ser gerados in vivo usando tRNA e tRNA sintetases modificados para adicionar a, ou substituir aminoácidos que não são codificados em sistemas que ocorrem naturalmente.

Métodos para gerar tRNAs e tRNA sintetases que usam aminoácidos, os quais não são codificados em sistemas que ocorrem naturalmente são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S.

Nº 7.045.337 e 7.083.970, as quais são incorporadas como referência neste relatório.

Estes métodos envolvem generar um mecanismo de tradução que funciona independentemente das sintetases e tRNAs endógenos ao sistema de tradução (e, portanto, algumas vezes são referidos como “ortogonais”). Tipicamente, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e um aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS). Tipicamente, a ORS preferencialmente aminoacila o O+tRNA com pelo menos um aminoácido que não ocorre naturalmente no sistema de tradução e o O-tRNA reconhece pelo menos um códon seletor que não é reconhecido por outros tRNAs no sistema.

Assim, o sistema de tradução insere o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado em uma | 20 proteína produzida no sistema, em resposta à um códon seletor codificado, desse modo “substituindo” um aminoácido em uma posição no polipeptídeo codificado.

Uma ampla variedade de tRNAs e aminoacil tRNA sintetases ortogonais foi descrita na técnica para inserir aminoácidos sintéticos particulares em polipeptídeos e, geralmente, é adequada para o uso na presente invenção.

Por exemplo, O-t'RNA específico em —ceto/aminoacil-RNA sintetases são descritos em Wang, L., et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 100:56-61 (2003) e Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003). O-RS exemplar ou porções da mesma, são codificadas pela sequência de polinucleotídeos e incluem sequências de aminoácidos divulgadas nas Patentes U.S.

Nº 7.045.337 e 7.083.970, as quais são incorporadas neste relatório como referência.

Moléculas de ORNA — correspondente para o uso com as O-RSs também são descritas nas Patentes U.S.

Nº h 7.045.337 e 7.083.970 as quais são incorporadas como referência neste relatório.

Exemplos adicionais de pares de OHRNA/aminoacil-'RNA sintetase são descritos no WO - 2005/007870, WO 2005/007624 e WO 2005/019415. f í Um exemplo de um sistema OHIRNA/aminoacil-tRNA sintetase específico da azida é descrito em Chin, J.

W,,etal,J.

Am.

Chem.

Soc. 124:9026-9027 (2002). Sequências de O- RS exemplares para p-azido-L-Phe incluem, mas não são limitadas a sequências de nucleotídeos da SEQ ID NOs: 14 a 16 e 29 a 32 e sequências de aminoácidos da SEQ ID ft NOs: 46 a 48 e 61 a 64, conforme divulgado na Patente U.S. Nº 7.083.970, a qual é E incorporada como referência neste relatório. Sequências de O-tRNA exemplares adequadas para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a sequências de nucleotídeos da SEQ ID NOs: 1 a 3, conforme divulgado na Patente U.S. Nº 7.083.970, a qual é incorporada como referência neste relatório. Outros exemplos de pares de O- tRNA/aminoacil-tRNA sintetase específicos a aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados particulares são descritos na Patente U.S. Nº 7.045.337, a qual é incorporada como referência neste relatório. O-RS e O-t*RNA que incorporam aminoácidos contendo ceto e azida em S. cerevisiae são descritos em Chin, J. W., et a/., Science 301:964-967 (2003).

Vários outros pares ortogonais foram relatados. Sistemas de glutaminila (veja, por exemplo, Liu, D.R. e Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4780-4785), aspartila (veja, por exemplo, Pastrnak, M., et a/., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286) e tirosila (veja, por exemplo, Ohno, S., et a/., (1998) J. Biochem. (Tóquio, Japão) 124:1065- 1068; e, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:2268-2273) derivados de tRNA's e sintetases de S. cerevisiae foram descritos para a incorporação potencial de aminoácidos não naturais em sistemas de E. Coli. derivados de sintetases de glutaminila (veja, por exemplo, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:2268-2273) e ' tirosila de E. Coli (veja, por exemplo, Edwards, H. e Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. : 10:1633-1641) foram descritos para o uso em S. cerevisiae. O sistema tirosila de E. Coli foi usado para a incorporação de 3-iodo-L-tirosina in vivo, em células de mamíferos. Veja, Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acid Res. 30:4692-4699.

O uso de O-tRNA/aminoacil- (RNA sintetases envolve a seleção de um códon específico que codifica o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Embora qualquer códon possa ser usado, geralmente é desejável selecionar um códon que é raramente ou nunca usado na célula em que o O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase é expressado. Por exemplo, códons exemplares incluem códon contrassentido, tal como códons de parada (âmbar, ocre e opala), códons de quatro ou mais bases e outros códons de três bases naturais que são raramente ou nunca usados.

Códon(s) seletor(es) especiífico(s) pode(m) ser introduzido(s) em posições apropriadas no polinucleotídeo de IFN beta codificando a sequência usando métodos de , mutagênese conhecidos na técnica (incluindo mas não limitados à mutagênese específica do sítio, mutagênese de cassete, mutagênese de restrição e seleção, etc.).

. Métodos para gerar componentes do mecanismo biossintético da proteína, tal como pares de O-RSs, O-RNAs e O-IRNA/O-RS ortogonais que podem ser usados para incorporar um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado são descritos em Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W,, et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Métodos e composições para a ii incorporação in vivo de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são É descritos na Patente U.S. Nº 7.045.337, a qual é incorporada como referência neste relatório. Métodos para selecionar um par de tRNA-(RNA sintetase ortogonal para o uso no sistema de tradução in vivo de um organismo também são descritos nas Patentes U.S. Nº

7.045.337 e 7.083.970, as quais são incorporadas como referência neste relatório. A Publicação WO PCT Nº 04/035743 intitulada “Site Specífic Incorporation of Keto-Amino Acids in Proteins”, a qual é integralmente incorporada como referência neste relatório, descreve pares de RS e tRNA ortogonais para a incorporação de ceto-aminoácidos. À Publicação PCT Nº WO 04/094593 intitulada “Expanding the Eukariotic Genetic Code”, a qualé integralmente incorporada como referência neste relatório, descreve pares de RS e tRNA ortogonais para a incorporação de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados em células hospedeiras eucarióticas. Métodos para produzir pelo menos uma aminoacil-*RNA sintetase ortogonal (O-RS) recombinante compreendem: (a) gerar uma biblioteca de (opcionalmente mutante) RSs derivada de pelo menos uma aminoacil-t'RNA sintetase (RS) a partir de um primeiro organismo, incluindo mas não limitado a um organismo procariótico, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, — Halobacterium, f Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus ou E semelhantes ou uma organismo eucariótico; (b) selecionar (e/ou triar) a biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) quanto a membros que aminoacilam um tRNA ortogonal (O- tRNA) na presença de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e um aminoácido natural, desse modo fornecendo um “pool” de RSs ativas (opcionalmente mutantes); e/ou, (c) selecionar (opcionalmente através de seleção negativa) o “pool” para RSs ativas (incluindo mas não limitadas a RSs mutantes) que preferencialmente —aminoacilamo O-tRNA na ausência do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, desse modo fornecendo pelo menos uma O-RS recombinante; em que pelo menos uma O- RS recombinante preferencialmente aminoacila o O-t*RNA com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em uma modalidade, a RS é uma RS inativa. A RS inativa pode ser gerada —modificando-se uma RS ativa. Por exemplo, a RS inativa pode ser gerada modificando-se . pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6 ou pelo menos cerca de 10 ou mais . aminoácidos em aminoácido diferentes, incluindo mas não limitados à alanina. Bibliotecas de RSs mutantes podem ser geradas usando várias técnicas — conhecidas no ramo, incluindo mas não limitadas ao projeto racional com base na estrutura de RS tridimensional da proteína ou mutagênese de nucleotídeos de RS em uma técnica aleatória ou de projeto racional. Por exemplo, as RSs mutantes podem ser geradas por

Í mutações específicas do sítio, mutações aleatórias, diversidade gerando mutações de k recombinação, constructos quiméricos, projeto racional e por outro métodos descritos neste relatório ou conhecidos na técnica. Em uma modalidade, selecionar (e/ou triar) a biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) quanto a membros que são ativos, incluindo mas não limitados àqueles que amincacilam um tRNA ortogonal (O-tRNA) na presença de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e um aminoácido natural, inclui: introduzir uma seleção positiva ou triar o marcador, incluindo mas não limitado a um gene resistente ao antibiótico ou semelhantes e a biblioteca de RSs (opcionalmente mutante) em uma pluralidade de células, emquea seleção positiva e/ou marcador da triagem compreendem pelo menos um códon seletor, incluindo mas não limitado a um códon âmbar, ocre ou opala; cultivar a pluralidade de células na presença de um agente de seleção; identificar as células que sobrevivem (ou mostram uma resposta específica) na presença do agente de seleção e/ou triagem suprimindo-se pelo menos um códon seletor na seleção positiva ou marcador da triagem, —dessemodo fornecendo um subconjunto de células positivamente selecionadas que contém o “pool” de RSs ativas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, a concentração do agente de seleção e/ou triagem pode ser variada.

É Em um aspecto, o marcador de seleção positiva é um gene de cloranfenicol : acetiltransferase (CAT) e o códon seletor é um códon de parada âmbar no gene CAT.

—Opcionalmente, o marcador de seleção positiva é um gene de B-lactamase e o códon seletor é um códon de parada âmbar no gene de £-lactamase. Em um outro aspecto, a marcador de triagem positivo compreende um marcador da triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de triagem com base na afinidade (incluindo mas não limitado a um marcador de superfície celular).

Em uma modalidade, selecionar ou triar negativamente o “pool” para RSs ativas (opcionalmente mutantes) que preferencialmente aminoacilam o O-tRNA na ausência do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado inclui: introduzir um marcador de seleção ou triagem negativo com o “pool” de RSs ativas (opcionalmente mutantes) a partir da seleção ou triagem positiva em uma pluralidade de células de um segundo organismo, em que o marcador de seleção ou triagem negativo compreende pelo menos um códon a seletor (incluindo mas não limitado a um gene resistente ao antibiótico, incluindo mas não limitado a um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT)); e, identificar células que - sobrevivem ou mostram uma resposta à triagem específica em um primeiro meio M suplementado com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e um agente de triagem ou seleção, porém naô sobrevivem ou mostram a resposta específica em um segundo meio não suplementado com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e o agente de seleção ou triagem, desse modo fornecendo células sobreviventes ou células

 triadas com pelo menos uma O-RS recombinante. Por exemplo, um protocolo de Y identificação de CAT opcionalmente atua como uma seleção positiva e/ou uma triagem negativa na determinação de O-RSs recombinantes apropriadas. Por exemplo, um “pool” de clones é opcionalmente replicado em placas de crescimento contendo CAT (que compreende pelo menos um códon seletor) com ou sem um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados. Colônias que crescem exclusivamente nas placas contendo aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são, assim, consideradas como contendo O-RS recombinante. Em um aspecto, a concentração do agente de seleção (e/ou triagem) é variada. Em alguns aspectos, o primeiro e segundo organismos são diferentes. Assim, o primeiro e/ou segundo organismo opcionalmente compreende: um procarionte, um eucarionte, um mamífero, um Escherichia coli, fungos, leveduras, archaebactéria, eubactéria, planta, inseto, protista, etc. Em outras modalidades, o marcador da triagem compreende um marcador da triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de triagem com base na afinidade.

Em uma outra modalidade, triar ou selecionar (incluindo mas não limitadas a selecionar negativamente) o “pool” para RSs ativas (opcionalmente mutantes) inclui: isolar o “pool” de RSs mutantes ativas da etapa de seleção positiva (b); introduzir um marcador de seleção ou triagem negativo, em que o marcador de seleção ou triagem negativo . compreende pelo menos um códon seletor (incluindo mas não limitado a um gene marcador tóxico, incluindo mas não limitado a um gene de ribonuclease barnase, compreendendo pelo menos um códon seletor) e o “pool” de RSs ativas (opcionalmente mutantes) em uma Pluralidade de células de um segundo organismo; e identificar as células que sobrevivem ou mostram um resposta à triagem específica em um primeiro meio não suplementado com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, porém não sobrevivem ou mostram uma resposta à triagem específica em um segundo meio suplementado com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, desse modo fornecendo células sobreviventes ou triadas com pelo menos uma O-RS recombinante, em que pelo menos uma O-RS recombinante é específica para o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em um aspecto, pelo menos um códon seletor compreende cerca de dois ou mais códons seletores. Tais modalidades opcionalmente podem incluir pelo menos um códon seletor F compreendendo dois ou mais códons seletores e em que o primeiro e segundo organismo são diferentes (incluindo mas não limitados ao organismo opcionalmente incluindo um . procarionte, eucarionte, mamífero, Escherichia coli, fungos, leveduras, archaebactéria, h eubactéria, planta, inseto, protista, etc). Além disso, alguns aspectos incluem o marcador de seleção negativo compreendendo um gene de ribonuclease barnase (que compreende pelo menos um códon seletor). Outros aspectos incluem o marcador de triagem opcionalmente compreendendo um marcador da triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de o triagem com base na afinidade. Nas modalidades neste relatório, as triagens e/ou seleções f opcionalmente incluem a variação da estringência de triagem e/ou seleção. Em uma modalidade, os métodos para produzir pelo menos uma aminoacil-*RNA sintetase (O-RS) ortogonal recombinante podem compreender ainda: (d) isolar pelo menos uma O-RS recombinante; (e) gerar um segundo conjunto de O-RS (opcionalmente modificada) derivado de pelo menos uma O-RS recombinante; e, (f) repetir as etapas (b) e (c) até que uma O-RS modificada seja obtida, a qual compreende um capacidade de preferencialmente aminoacilar a O-tRNA. Opcionalmente, as etapas (d) a (f) são repetidas, incluindo mas não limitadas a pelo menos cerca de duas vezes. Em um aspecto, o segundo conjunto de derivado de O-RS modificado de pelo menos uma O-RS recombinante pode ser gerado por mutagênese, incluindo mas não limitado à mutagênese aleatória, mutagênese específica do sítio, recombinação ou uma combinação das mesmas.

A estringência das etapas de seleção/triagem, incluindo mas não limitadas à etapa de seleção/triagem positiva (b), a etapa de seleção/triagem negativa (c) ou ambas as etapas de seleção/triagem positivas e negativas (b) e (c)) nos métodos descritos acima, opcionalmente inclui variar a estringência de seleção/triagem. Em uma outra modalidade, a etapa de seleção/triagem positiva (b), etapa de seleção/triagem negativa (c) ou ambas as etapas de seleção/triagem positivas e negativas (b) e (c) compreendem usar um repórter, . em que o repórter é detectado por seleção celular ativada por fluorescência (FACS) ou em queo repórter é detectado por luminescência. Opcionalmente, o repórter é exibido em uma superfície celular, em uma exibição do fago ou semelhantes e selecionado com base na afinidade ou atividade catalítica envolvendo o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ou um análogo. Em uma modalidade, a sintetase modificada é exibida em uma superfície celular, em uma exibição do fago ou semelhantes.

Métodos para produzir um tRNA ortogonal (OtRNA) recombinante incluem: (a) gerar uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA, incluindo mas não limitado a um tRNA supressor, a partir de um primeiro organismo; (b) selecionar (incluindo mas não limitado a selecionar negativamente) ou triar a biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) a partirdeum segundo organismo na ausência de uma RS a partir do primeiro organismo, DP desse modo fornecendo um “pool” de tRNAs (opcionalmente mutantes); e, (c) selecionar ou triar o “pool” de tRNAs (opcionalmente mutantes) quanto a membros que são aminoacilados . por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, desse modo fornecendo pelo menos um O-(RNA/=— recombinante; em que pelo menos um O-tRNA recombinante reconhece um códon seletor e não é eficazmente reconhecido pela RS a partir do segundo organismo e é preferencialmente aminoacilado pela O-RS. Em algumas modalidades, pelo menos um tRNA é um tRNA supressor e/ou compreende um códon de três bases único de bases

É naturais e/ou não naturais ou é um códon contrassentido, um códon raro, um códon não . natural, um códon compreendendo pelo menos 4 bases, um códon âmbar, um códon ocre ou um códon de parada opala. Em uma modalidade, o O-tRNA recombinante possui um aperfeiçoamento da ortogonalidade. Será avaliado que em algumas modalidades, O-tRNA é — opcionalmente importado em um primeiro organismo a partir de um segundo organismo sem a necessidade de modificação. Em várias modalidades, o primeiro e segundo organismos são os mesmos ou diferentes e são opcionalmente escolhidos de, incluindo mas não limitados a procariontes (incluindo mas não limitados a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium, etc.), eucariontes, “mamíferos, fungos, leveduras, archaebactériaa, eubactériaa, plantas, insetos, protistas, etc. Adicionalmente, o tRNA recombinante é opcionalmente aminoacilado por um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, em que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é biossintetizado in vivo naturalmente ou através da manipulação de genética. O aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é opcionalmente adicionado a um meio de crescimento pelo menos no primeiro ou segundo organismo.

Em um aspecto, selecionar (incluindo mas não limitado a selecionar negativamente) ou triar a biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma é aminoacil-t(RNA sintetase (etapa (b)) inclui: introduzir um gene marcador tóxico, em que o gene marcador tóxico compreende pelo menos um dos códons seletores (ou um gene que leva à produção de um agente tóxico ou estático ou um gene essencial ao organismo, em que tal gene marcador compreende pelo menos um códon seletor) e a biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células a partir do segundo organismo; e, selecionar células sobreviventes, em que as células sobreviventes contêm o “pool” de tRNAs (opcionalmente mutantes) compreendendo pelo menos um tRNA ortogonal ou tRNA — não funcional. Por exemplo, células sobreviventes podem ser selecionadas usando-se um ensaio de densidade celular com razão de comparação.

Em um outro aspecto, o gene marcador tóxico pode incluir dois ou mais códons seletores. Em uma outra modalidade dos métodos, o gene marcador tóxico é um gene de ribonuclease barnase, onde o gene de ribonuclease barnase compreende pelo menos um —códon âmbar. Opcionalmente, o gene de ribonuclease barnase pode incluir dois ou mais . códons âmbar.

Em uma modalidade, selecionar ou triar o “pool” de tRNAs (opcionalmente CENA mutantes) quanto a membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida pode incluir: introduzir um gene marcador de seleção ou triagem positivo, em queo gene marcador positivo compreende um gene resistente ao fármaco (incluindo mas não limitado ao gene de f£-lactamase, compreendendo pelo menos um dos códons seletores, tais como pelo menos um códon de parada âmbar) ou um gene essencial ao organismo ou um gene que leva à desentoxicação de um agente tóxico, junto com a O-RS e o “pool” de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células a partir do segundo organismo; e, identificar as células sobreviventes ou triadas cultivadas na presença de um agente de seleção ou triagem, incluindo mas não limitado a um antibiótico, desse — modo fornecendo um “pool” de células que possui pelo menos um tRNA recombinante, onde pelo menos um tRNA recombinante é aminoacilado pela O-RS e insere um aminoácido em um produto de tradução codificado pelo gene marcador positivo, em resposta a pelo menos um códon seletor. Em uma outra modalidade, a concentração do agente de seleção e/ou triagem é variada.

Métodos para gerar pares de O-tRNA/O-RS específicos são fornecidos. Os métodos incluem: (a) gerar uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA a partir de um primeiro organismo; (b) selecionar ou triar negativamente a biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil--RNA sintetase (RS) a partir de um segundo organismo na ausência de uma R$ a partir do primeiro organismo, desse modo fornecendo um “pool” de tRNAs (opcionalmente mutantes); (c) selecionar ou triar o “pool” de tRNAs (opcionalmente mutantes) quanto a membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, desse modo fornecendo pelo ii menos um O-tRNA recombinante. Pelo menos um O-tRNA recombinante reconhece um j códon seletor e não é eficazmente reconhecido pela RS a partir do segundo organismo e é preferencialmente aminoacilado pela O-RS. O método também inclui (d) gerar uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de pelo menos uma aminoacil--IRNA sintetase (RS) a partir de um terceiro organismo; (e) selecionar ou triar a biblioteca de RSs mutantes quanto a membros que preferencialmente aminoacilam pelo menos um O-tRNA recombinante na presença de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e um aminoácido natural, desse modo fornecendo um “pool” de RSs ativas (opcionalmente mutantes); e, (f) selecionar ou triar negativamente o “pool” para RSs ativas (opcionalmente mutantes) que preferencialmente aminoacilam pelo menos um O-tRNA recombinante na ausência do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, desse modo fornecendo pelo menos um par de O-t'RNA/O-RS específico, em que pelo menos um par de O-tRNA/O- RS específico compreende pelo menos uma O-RS recombinante que é específica para o : aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e pelo menos um O-tRNA recombinante. Pares de O-RNA/O-RS específicos produzidos pelos métodos são incluídos.

há Por exemplo, o par de O-(*RNA/O-RS específico pode incluir, incluindo mas não limitado a * um par mutRNATyr-mutTyrRS, tal como um par MUtRNATyr-SS12TyrRS, um par —muUutRNALeu-mutLeuRS, um par mutRNAThr-mutThrRS, um par mutRNAGIu-mutGluRS ou semelhantes. Adicionalmente, tais métodos incluem os mesmos primeiro e terceiro organismos (incluindo mas não limitados a Methanococcus jannaschii).

Métodos para selecionar um par de tRNA-tRNA sintetase ortogonal para o uso em um sistema de tradução in vivo de um segundo organismo também são incluídos na presente invenção. O métodos incluem: introduzir um gene marcador, um tRNA e uma aminoacil-t*RNA sintetase (RS) isolados ou derivados de um primeiro organismo em um 85 primeiro conjunto de células a partir do segundo organismo; introduzir o gene marcador e o tRNA em um conjunto de células duplicadas a partir de um segundo organismo; e, selecionar as células sobreviventes no primeiro conjunto que não sobrevivem no conjunto de células duplicadas ou triagem de células mostrando uma resposta à triagem específica que não fornece tal resposta no conjunto de células duplicadas, em que o primeiro conjunto e o conjunto de células duplicadas são cultivados na presença de um agente de seleção ou triagem, em que as células sobreviventes ou triadas compreendem o par de tRNA-tRNA sintetase ortogonal para o uso no sistema de tradução in vivo do segundo organismo. Em uma modalidade, comparar e selecionar ou triar inclui um ensaio de complementação in vivo. A concentração do agente de seleção ou triagem pode ser variada.

Os organismos da presente invenção compreendem uma variedade de organismos e uma variedade de combinações. Por exemplo, o primeiro e segundo organismos dos métodos da presente invenção podem ser os mesmos ou diferentes. Em uma modalidade, : os organismos são opcionalmente um organismo procariótico, incluindo mas não limitado a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, = Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus ou semelhantes. Alternativamente, os organismos opcionalmente compreendem um organismo eucariótico, incluindo mas não limitado a plantas (incluindo mas não limitadas às plantas complexas, tais como monocotiledôneas ou dicotiledôneas), algas, protistas, fungos (incluindo mas não limitados à levedura, etc), animais (incluindo mas não limitados a mamíferos, insetos, artrópodes, etc.) ou semelhantes. Em uma outra modalidade, o segundo organismo é um organismo procariótico, incluindo mas não limitado a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus ou semelhantes. Alternativamente, o segundo organismo pode ser um organismo eucariótico, incluindo mas não limitado a uma levedura, uma célula animal, uma célula de planta, um ã fungo, uma célula de mamíferos ou semelhantes. Em várias modalidades, o primeiro e segundo organismos são diferentes. Ci VI. Localização de aminoácidos que não ocorrem naturalmente em polipeptídeos de IFN beta A presente invenção considera a incorporação de um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente em polipeptídeos de IFN beta. Um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente podem ser incorporados em uma posição particular que não interrompe a atividade do polipeptídeo. Isto pode ser obtido realizando-se substituições “conservativas”, incluindo mas não limitadas à substituição de aminoácidos hidrofóbicos com aminoácidos — hidrofóbicos, aminoácidos volumosos por aminoácidos volumosos, aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofílicos e/ou inserindo-se o aminoácido que —não ocorre naturalmente em uma localização que não é necessária para a atividade.

Uma variedade de métodos bioquímicos e estruturais podem ser utilizados para selecionar os sítios desejados para a substituição com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado dentro do polipeptídeo de IFN beta. É facilmente evidente àqueles de habilidade comum na técnica que qualquer posição da cadeia de polipeptídeo é adequada para a seleção para incorporar um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e a seleção pode ser com base no projeto racional ou por seleção aleatória para o propósito particular desejado ou não. A seleção de sítios desejados pode ser para produzir uma molécula de IFN beta tendo qualquer propriedade ou atividade desejada, incluindo mas não limitado a agonistas, superagonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores da ligação do receptor, moduladores da atividade do receptor, formação de dímero ou multímero, nenhuma mudança na atividade ou propriedade comparada à molécula nativa ou manipulando qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo, tal como solubilidade, ó agregação ou estabilidade. Por exemplo, localizações no polipeptídeo necessárias para a atividade biológica dos polipeptídeos de IFN beta podem ser identificadas usando análise de “mutação de ponto, varredura de alanina, mutagênese por saturação e triagem quanto à atividade biológica ou métodos de varredura homólogos conhecidos na técnica. Outros métodos que podem ser usados para identificar resíduos para a modificação de polipeptídeos de IFN beta incluem, mas não são limitados ao perfil da sequência (Bowie e Eisenberg, Science 253(5016): 164-70, (1991)), seleções de biblioteca de rotâmeros (Dahiyate Mayo, Protein Sci 5(5): 895-903 (1996); Dahiyat e Mayo, Science 278(5335): 82-7 (1997); Desjarlais e Handel, Protein Science 4: 2006-2018 (1995); Harbury et al, PNAS USA 92(18): 8408-8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244- 255 (1994); Hellinga e Richards, PNAS USA 91: 5803-5807 (1994)); e potentiais de pares de resíduos (Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)) e projeto racional usando a tecnologia Protein Design Automationº. (Veja, Pat. U.S. Nº 6.188.965; 6.269.312; 6.403.312; " WO98/47089, os quais são incorporados como referência). Resíduos que são críticos para a bioatividade de IFN beta, resíduos que estão envolvidos com a estabilidade farmacêutica, f epítopos do anticorpo ou resíduos e ligação do receptor pódem ser modificados. As Patentes U.S. Nº 5.580.723; 5.834.250; 6.013.478; 6.428.954; e 6.451,561, as quais são incorporadas como referência neste relatório, descrevem métodos para a análise sistemática da estrutura e função de polipeptídeos, tais como IFN beta, identificando-se os domínios ativos que influenciam na atividade do polipeptídeo com uma substância alvo.

Runkel et al. Biochemistry (2000) 39:2538-2551 e Journal of Interferon and Cytokine Research (2001) 21:931-941 descrevem análise do anticorpo mutável e monoclonal de IFN beta 1a humano para identificar regiões envolvidas na atividade de ligação e biológica do receptor. A clonagem, expressão, purificação, análise por BlAcore e avaliação por ensaios —antivirais e antiproliferativos de mutantes de IFN beta foram descritas. Basu et al. Bioconjugate Chem (2006) 17:618-630 descrevem mutagênese dirigida ao sítio do IFN beta e conjugados diferentes preparados com polímeros PEG. Os resíduos, exceto aqueles identificados como críticos para a atividade biológica por mutagênese de varredura de alanina ou homólogos, podem ser bons candidatos para a substituição com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado dependendo da atividade desejada buscada no polipeptídeo. Alternativamente, os sítios identificados como críticos à atividade biológica, também podem ser bons candidatos para a substituição com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, novamente dependendo da atividade desejada buscada no polipeptídeo. Um outra alternativa seria simplesmente preparar substituições em série em cada posição na cadeia de polipeptídeo com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e observar o efeito nas atividades do polipeptídeo. É facilmente evidente àqueles de habilidade comum na técnica que qualquer meio, técnica ou método para selecionar uma posição para a substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipeptídeo é : adequado para o uso na presente invenção.

A estrutura e atividade de mutantes dos polipeptídeos de IFN beta que contêm deleções também podem ser examinadas para determinar regiões da proteína que provavelmente são tolerantes à substituição com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Em uma maneira similar, a digestão da protease e os anticorpos monoclonais podem ser usados para identificar regiões do IFN beta que são responsáveis pela ligação ao receptor de IFN. Uma vez que os resíduos intolerantes à substituição com aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados foram eliminados, o impacto das substituições propostas em cada um das posições remanescentes pode ser examinado. Modelos podem ser gerados a partir das estruturas cristalinas tridimensionais de outros membros da família do IFN e receptores de IFN. O Banco de Dados de Proteínas (PDB, disponível na rede mundial de computadores no site resb.org) é um banco de dados " centralizado contendo dados estruturais tridimensionais de grandes moléculas de proteínas e ácidos nucléicos. Modelos podem ser preparados investigando-se a estrutura secundária e EAR terciária de polipeptídeos, se os dados estruturais tridimensionais não estiverem disponíveis. Assim, aqueles de habilidade comum na técnica podem facilmente identificar posições de aminoácidos que podem ser substituídas com aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta da invenção compreendem um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente posicionados em uma região da proteína que interompem a estrutura do polipeptídeo.

Resíduos exemplares de incorporação de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado podem ser aqueles que são excluídos das regiões de ligação ao S receptor potenciais, podem ser completa ou parcialmente expostos ao solvente, podem ter mínima ou nenhuma interação de união ao hidrogênio com resíduos próximos, podem ser minimamente expostos aos resíduos reativos próximos, podem estar em uma ou mais das faces expostas, podem ser um sítio ou sítios que estão justaposicionados em um segundo IFN beta ou outra molécula ou fragmento do mesmo, podem estar em regiões que são altamente flexíveis ou estruturalmente rígidas, conforme prognosticado pela estrutura tridimensional, secundária, terciária ou quaternária do IFN beta, ligado ou não ligado a seu receptor ou ligado ou não ligado a uma outra molécula biologicamente ativa ou podem modular a conformação do IFN beta por si só ou um dímero ou multimero compreendendo um ou mais IFN beta, alterando-se a flexibilidade ou rigidez da estrutura completa, conforme desejado.

Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhece que tal análise do IFN beta possibilita a determinação de quais resíduos de aminoácidos são expostos à superfície É em comparação aos resíduos de aminoácidos que são encobertos dentro da estrutura E: terciária da proteína.

Portanto, é uma modalidade da presente invenção substituir um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado por um aminoácido que é um resíduo exposto à superfície.

Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes em IFN beta: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19,20,21,22,23, 24,25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, —129,130,131,132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, - 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, . 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação das mesmas " (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em qualquer posição em uma ou mais das regiões correspondentes seguintes às estruturas secundárias no interferon beta, como segue: Hélice A (2 a 22); Hélice B (51 a 71); Hélice C (80 a 107); Hélice D (118 a 136); Hélice E (1389 a

162); “loop” AB: AB1 (23 a 35); AB2 (36 a 40); AB3 (41 a 50) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4. Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 25 a 35, 80 a 100 e 121 a 135 do interferon beta (SEQ ID NO: 1 ouos aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4). Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 41 a 49 do interferon beta da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 15, 42, 80, 108, Á 111, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos . correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido natural.

Em algumas modalidades, o polipeptideo da invenção compreende uma substituição C17S (serina por uma cisteina na posição 17) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma substituição C17S (serina por uma cisteína na —posição17)euma ou rmais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido natural.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado na sequência sinal.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que não ocorre naturalmente — codificado na sequência sinal da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo sl da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido * que ocorre naturalmente codificado na sequência sinal da SEQ ID NO: 4. Em algumas É PP. modalidades, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados na sequência líder ou sinal da SEQ ID NOs: 4 ou outra sequência de IFN beta.

Um exame da estrutura cristalina do IFN beta ou membro(s) da família do IFN e sua interação com o receptor de IFN podem incicar que certos resíduos de aminoácidos têm cadeias laterais que são completa ou parcialmente acessíveos ao solvente.

A cadeia lateral de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado nestas posições podem aparecer fora da superfície da proteína e fora do solvente.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8O, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107,108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs:3ed4ouos aminoácidos correspondentes em uma outra sequência do IFN beta).

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas a: ] Hélice A (2 a 22); Hélice B (51 a 71); Hélice C (80 a 107); Hélice D (118 a 136); Hélice E . (139 a 162); “loop” AB: AB1 (23 a 35); AB2 (36 a 40); AB3 (41 a 50) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4. Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas aos resíduos 25 a 35, 80 a 100 e 121 a 135 do interferon beta (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4).

Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas aos resíduos 41 a 49 do interferon beta da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação das mesmas da —SEQIDNO:1o0ouos aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas À 35 — modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente na sequência sinal ou líder é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 4 ou outra sequência de IFN beta). Uma ampla variedade de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados pode ser substituída no lugar de, ou incorporada em, uma posição fornecida em um polipeptídeo de IFN beta.

No geral, um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado particular é selecionado para incorporação com base em um exame da estrutura cristalina tridimensional de um polipeptídeo de IFN beta ou outro membro da família do IFN com seu receptor, uma preferência por substituições conservativas (isto é, aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados com base em arila, tais como p-acetilfenilalanina ou O- pPropargiltirosina substituindo por Phe, Tyr ou Trp) e a conjugação química específico, a qual é desejada para introduzir no polipeptídeo de IFN beta (por exemplo, a introdução de 4- azidofenilalanina se esta desejat efetuar uma cicloadição [3+2] de Huisgen com um polímero solúvel em água portando uma porção alcino ou uma formação de ligação amida com um — polímero solúvel em água que porta um ariléster que, por sua vez, incorpora uma porção fosfina). Em uma modalidade, o método inclui ainda incorporar na proteína o aminoácido não natural, onde o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo reativo; e " contatar a proteína com uma molécula (incluindo mas não limitada a uma marcação, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietilenoglico|, um fotorreticulador, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, uma marcação por afinidade, uma marcação por fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofator, um ácido graxo, um carboidrato, um —polinucleotideo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antissentido, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucléico inibitório, um biomaterial, uma nanopartícula, uma marcação spin, um fluoróforo, uma porção contendo metal, uma porção radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma porção fotodelimitada, uma porção excitável por radiação actínica, uma porção fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma porção que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral prolongada, um açúcar ligado ao carbono, um agente redox-ativo, um aminotioácido, uma porção tóxica, uma porção isotopicamente marcada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo —quimioluminescente, um grupo elétron-denso, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, uma marcação detectável, uma molécula pequena, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleotídeo, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons ou qualquer combinação dos mesmos acima ou qualquer outro composto ou substância desejável) que compreende um segundo grupo reativo. O primeiro grupo reativo reage com o segundo grupo reativo para fixar a molécula ao aminoácido não natural através de uma cicloadição [3+2] Em uma modalidade, o primeiro grupo reativo é uma porção alquinila ou azido e o segundo grupo reativo é uma porção azido ou alquinila. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção alquinila (incluindo mas não limitada no aminoácido não natural p- propargiloxifenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção azido. Em um outro exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção azido (incluindo mas não limitada no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção alquinila.

Em alguns casos, as substituição(s) do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado serão combinadas com outras adições, substituições ou deleções dentro do polipeptídeo de IFN beta para afetar outros traços biológicos do polipeptídeo de IFN beta. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo mas não limitada à resistência à degradação proteolítica) do polipeptídeo de IFN beta ou aumentar a afinidade do polipeptídeo de IFN beta para seu receptor. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a : estabilidade farmacêutica do polipeptídeo de IFN beta. Em alguns casos, as outras adições, E substituições ou deleções podem realçar a atividade antiviral do polipeptídeo de IFN beta.

Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo mas não limitada quando expressada em E. Coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo de IFN beta. Em algumas modalidades, adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade do polipeptídeo de IFN beta após a expressão em E. Coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, sítios são selecionados para a substituição com um aminoácido naturalmente codificado ou não natural, além de um outro sítio para a incorporação de um aminoácido não natural que resulta em aumentar da solubilidade do polipeptídeo após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta compreendem uma outra adição, substituição ou deleção que modula a afinidade para o receptor do polipeptídeo de IFN beta, proteínas de ligação ou ligante associado, modular a transdução do sinal depois da ligação ao receptor de IFN, modular a meia-vida circulante, modular a liberação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação ou aperfeiçoar ou alterar uma via particular de administração. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta compreendem uma adição, substituição ou deleção que aumenta a afinidade da variante do —IFN beta para seu receptor. Similarmente, polipeptídeos de IFN beta podem compreender sequências de clivagem química ou enzimática, sequências de clivagem da protease, grupos reativos, domínios de ligação ao anticorpo (incluindo mas não limitados a FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base na afinidade (incluindo, mas não limitadas a FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não limitadas à biotina) que aperfeiçoam a detecção (incluindo, mas não limitado à GFP), purificação, transporte através de membranas de tecidos ou células, liberação ou ativação de pró-fármacos, redução do tamanho delFN beta ou outros traços do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, a substituição de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado gera um antagonista de IFN beta. Em algumas modalidades, um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído ou adicionado em uma região envolvida com a ligação ao receptor. Em algumas modalidades, os antagonistas de IFN beta compreendem pelo menos uma substituição que faz com que IFN beta atue como um antagonista. Em algumas modalidades, o antagonista de IFN beta compreende um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação ao receptor da molécula de IFN beta.

Em alguns casos, 1,2, 3 e 4,5, 6,7,8,9, 10 ou mais aminoácidos são substituídos comum ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados. Em alguns casos, o polipeptídeo de IFN beta inclui ainda 1, 2, 3 e 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados por aminoácidos que ocorrem naturalmente. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais resíduos em ; IFN beta são substituídos com um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados. Em alguns casos, um ou mais resíduos que não ocorrem naturalmente codificados são ligados a um ou mais PEGs lineares ou ramificados com peso molecular mais baixo, desse modo realçando a afinidade de ligação e meia-vida no soro comparável em relação à espécie ligada a um PEG único e com peso molecular mais alto. Em algumas modalidades, até dois dos resíduos do IFN beta seguintes são — substituídos com um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados. VII. Expressão em Não Eucariontes e Eucariontes Para se obter alto nível de expressão de um polinucleotídeo de IFN beta clonado, este tipicamente subclona os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de IFN beta da invenção em um vetor de expressão que contém um promotor forte para direcionar a transcrição, um terminador de transcrição/tradução e, se for um ácido nucléico que codifica uma proteína, um sítio de ligação ao ribossomo para iniciação da tradução. Promotores bacterianos adequados são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et a/. e Ausubel et a/. fh Sistemas de expressão bacterianos para expressar polipeptídeos de IFN beta da invenção estão disponíveis em, incluindo mas não limitados a, E. Coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). Kits para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucarióticos para células de mamíferos, células de leveduras e insetos são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica e também estão comercialmente disponíveis. Em casos onde os tRNAs e aminoacil tRNA sintetases ortogonais (descritos acima) são usados para expressar os polipeptídeos de IFN beta da invenção, células hospedeiras para expressão são selecionadas com base em sua capacidade de usar os componentes ortogonais. Células hospedeiras exemplares incluem bactérias Gram-positivas (incluindo mas não limitadas a B. brevis, B. subtilis ou Streptomyces) e bactérias Gram-negativas (E. Coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), assim como levedura e outras células eucarióticas. Células compreendendo pares de O-tRNA/O- RS podem ser usadas, conforme descrito neste relatório.

Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção fornece a capacidade de sintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Em um aspecto, a composição — opcionalmente inclui, incluindo mas não limitada a pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos ' 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos 1 grama ; ou mais da proteína que compreende um aminoácido não natural ou uma quantidade que pode ser obtida com métodos de produção da proteína in vivo (detalhes sobre produção e purificação de proteína recombinante são fornecidos neste relatório). Em um outro aspecto, a proteína está opcionalmente presente na composição em uma concentração de, incluindo mas não limitada a pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo —menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais em um lisato celular, um tampão, um tampão farmacêutico ou outra suspensão líquida (incluindo mas não limitado em um volume de cerca de 1 nl a cerca —de100Loumais). A produção de grandes quantidades (incluindo mas não limitada a mais do que tipicamente possível com outros métodos, incluindo mas não limitados à tradução in vitro) de uma proteína em uma célula eucariótica incluindo pelo menos um aminoácido não natural é uma característica da invenção. h fl f Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção fornece a capacidade de biossintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Por exemplo, proteínas compreendendo um aminoácido não natural podem ser produzidas em uma concentração de, incluindo mas não limitado a pelo menos 10 ugllitro, pelo menos 50 ug/litro, pelo menos 75 ugllitro, pelo menos 100 ugllitro, pelo menos 200 ug/litro, pelo menos 250 ugllitro ou pelo menos 500 ug/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos 3 mg/litro, pelo menos 4 mg/litro, pelo menos 5 mgllitro, pelo menos 6 mgylitro, pelo menos 7 mgllitro, pelo S —menos8 mg/litro, pelo menos 9 mgllitro, pelo menos 10 mg/litro, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mgl/litro, 1 glitro, 5 gilitro, 10 litro ou mais de proteína em um extrato celular, lisato celular, meio de cultura, um tampão, e/ou semelhantes.

Vários vetores adequados para a expressão do IFN beta estão comercialmente disponíveis. Vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, incluem mas não são limitados aos vetores compreendendo sequências de controle de expressão a partir de SV40, papilomavírus bovino, adenovírus e citomegalovírus. Tais vetores incluem PCDNAS3. 1(+)|Hyg (Invitrogen, Carisbad, Calif., USA) e pCl-neo (Stratagene, La Jolla, Calif, USA). Plasmídeos bacterianos, tais como plasmídeos de E. Coli, incluindo pBR322, pET3a e —pET12a, plasmídeos com faixa de hospedeiro mais ampla, tais como RP4, DNAs do fago, por exemplo, os numerosos derivados de fago lambda, por exemplo, NM989 e outros fagos de DNA, tais como M13 e fagos de DNA com filamento único filamentoso podem ser À usados. O plasmídeo 24 e derivados do mesmo, o vetor POT1 (Pat. U.S. Nº 4.931.373, a . qual é incorporada como referência), o vetor pJSO037 descrito em (Okkels, Ann. Nova lorque —Aced, Sci, 782, 202 207, 1996) e pPiICZ A, Bou C (Invitrogen) podem ser usados com células hospedeiras de levedura. Para células de inseto, os vetores incluem, mas não são limitados a pvL941, pBG311 (Cate et al., “Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells”, Cell, 45, páginas 685-98 (1986), pBluebac 4.5 e PMelbac (Invitrogen, Carlsbad, CA).

A sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de IFNB também pode ou não incluir a sequência que codifica um peptídeo sinal. O peptídeo sinal está presente quando o polipeptídeo deve ser secretado das células nas quais ele é expressado. Tal peptídeo sinal pode ser qualquer sequência. O peptídeo sinal pode ser procariótico ou eucariótico. Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89-104) descreve um peptídeo sinal —paraousoem células de mamíferos (peptídeo sinal de cadeia leve de Ig capa de murino). Outros peptídeos sinais incluem, mas não são limitados ao peptídeo sinal do fator a de S. cerevisiae (Patente U.S. Nº 4.870.008, a qual é incorporada como referência neste relatório), o peptídeo sinal da amilase salivar do camundongo (O. Hagenbuchle et al, Nature 289, ; 1981, páginas 643-646), um peptídeo sinal de carboxipeptidase modificada (L. A. Valls et a/., —Cell48,1987,páginas 887-897), o peptídeo sinal BAR1 de levedura (WO 87/02670, o qua! é incorporado como referência neste relatório) e o peptídeo sinal da protease aspártica de levedura 3 (YAP3) (conforme M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, páginas 127-137).

Exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

Tais células hospedeiras podem ser células de ovário de hamster chinês (CHO), (por exemplo, CHO-K1; ATCC CCL-61), células de macaco verde (COS) (por exemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de — camundongo (por exemplo, NS/O), linhagens celulares de rim de hamster neonato (BHK) (por exemplo, ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL-10) e células humanas (por exemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)), assim como células de planta em cultura de tecido.

Estas linhagens celulares e outras estão disponíveis a partir de depósitos públicos, tais como the American Type Culture Collection, Rockville, Md.

De modo a fornecer glicosilação aperfeiçoada do —polipeptídeo de IFN beta, uma célula hospedeira de mamífero pode ser modificada para expressar sialiltransferase, por exemplo, 1,6-sialiltransferase, por exemplo, conforme descrito na Pat.

U.S.

Nº 5.047.335, a qual é incorporada como referência neste relatório.

Métodos para a introdução de DNA exógeno em células hospedeiras de mamífero incluem mas não são limitados à transfecção mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossoma, vetores virais e os métodos de transfecção descritos por Life Technologies Ltd, Paisley, UK usando Lipofectamina 2000 e Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, USA usando FuUGENE 6. : Estes métodos são bem conhecidos na técnica e são descritos por Ausbel et a/. (eds.), . 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova lorque, USA.

O — cultivo de células de mamíferos pode ser realizado de acordo com métodos estabelecidos, por exemplo, conforme divulgado em Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc.

Totowa, N.

J., USA e Harrison Massa. e Rae SE, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997. |. Sistemas de Expressão, Cultura e Isolamento Polipeptídeos de IFN beta podem ser expressados em qualquer número de sistemas de expressão adequados incluindo, por exemplo, levedura, células de inseto, células de mamíferos e bactérias.

Uma descrição de sistemas de expressão exemplares é fornecida abaixo.

Levedura: Conforme usado neste relatório, o termo “levedura” inclui qualquer uma das várias leveduras capazes de expressar um gene que codifica um polipeptídeo de IFN beta.

Tais leveduras incluem, mas não são limitadas às leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras pertencentes ao grupo Fungi imperfecti (Blastomycetes). As leveduras ascosporogêneas são divididas em duas famílias, f Spermophthoraceae e Saccharomycetaceae.

A última é compreendida de quatro —subfamílias, Schizosaccharomycoideae (por exemplo, gênero Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (por exemplo, gêneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces). As leveduras basidiosporogêneas incluem os gêneros

Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, e Filobasidiella. Leveduras pertencentes ao grupo Fungi Imperfecti (Blastomycetes) são divididas em duas famílias, Sporobolomycetaceae (por exemplo, gêneros Sporobolomyces e Bullera)) e Cryptococcaceae (por exemplo, gênero Candida).

De particular interesse para o uso com a presente invenção são espécies dentro dos gêneros Píchia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis e Candida, incluindo, mas não limitadas a P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kKluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa e H. polymorpha.

A seleção de levedura adequada para a expressão de polipeptídeos de IFN beta está dentro da habilidade de uma pessoa habilitada na técnica. Na seleção de hospedeiros de levedura para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles mostrados, por exemplo, tendo boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica, boa capacidade de secreção, boa produção de proteína solúvel e robustez global. As leveduras geralmente estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes incluindo, mas não limitadas ao Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) e a American Type Culture Collection ('ATCC”) (Manassas, VA).

E O termo “hospedeiro de levedura” ou “célula hospedeira de levedura” inclui a . levedura que pode ser, ou foi usada como um recipiente para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira de levedura original que recebeu os vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. É entendido que a progênie de uma célula parental única pode, não necessariamente, ser completamente idêntica na morfologia ou no complemento de DNA genômico ou total ao precursor original, devido à mutação acidental ou proposital. A progênie da célula parental que é suficientemente similar ao precursor a ser caracterizado pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de IFN beta, está incluída na progênie intencionada por esta definição.

Vetores de expressão e transformação, incluindo replicons extracromossômicos ou vetores integrantes, foram desenvolvidos por transformação em muitos hospedeiros de levedura. Por exemplo, vetores de expressão foram desenvolvidos para S. cerevisiae (Sikorski et al, GENETICS (1989) 122:19; Ito et al, J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL.

(1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et a/., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC

MICROBIOL. (1985) 25:141); P. pastoris (Patentes U.S. Nº 5.324.639; 4.929.555; e

4.837.148; Cregg et al, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach et al, NATURE (1982) 300:706); e Y. lipolytica; A. nidulans (Ballance et al, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al, GENE (1983) 26:205-221; e Yelton et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T. reesia (EPO 244 234); e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neurospora, Penicilium, Tolypocladium (WO 91/00357), os quais são incorporados como referência neste relatório. Sequências de controle para vetores de levedura são conhecidas âqueles de — habilidade comum na técnica e incluem, mas não são limitadas às regiões promotoras a partir de genes, tais como álcool desidrogenase (ADH) (EPO 284 044); enolase; glicocinase; glicose-6-fosfato isomerase; gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH); hexocinase; fosfofrutocinase; 3-fosfoglicerato mutase; e piruvato cinase (PyK) (EPO 329 203). O gene PHOS5 de levedura, que codifica ácido fosfatase, também pode fornecer sequências promotoras úteis (Miyanohara et af, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1). Outras sequências promotoras adequadas para o uso com hospedeiros de levedura podem incluir os promotores para 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et a/., J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073); e outras enzimas glicolíticas, tais como piruvato decarboxilase, : triosefosfato isomerase e fosfoglicose isomerase (Holland et al, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149). Promotores de levedura induzíveis tendo a vantagem adicional da transcrição controlada por condições de crescimento podem incluir as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2; isocitocromo C; ácido fosfatase; metalotioneína; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; enzimas degradantes associadas com o metabolismo do nitrogênio; e enzimas responsáveis pela utiizição de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para o uso na expressão de levedura são descritos ainda em EPO 073 657. Realçadores de levedura também podem ser usados com promotores de levedura. Além disso, promotores sintéticos também podem funcionar como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências de ativação a montante (UAS) de um promotor de levedura —podem ser unidas com a região de ativação da transcrição de um outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência regulatória ADH ligada à região de ativação da transcrição GAP. Veja, Patentes U.S. Nº 4.880.734 e 4.876.197, as quais são incorporadas como referência neste —* relatório. Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem das — sequências regulatórias dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PHOS5, combinados com a região de ativação transcricional de uma gene da enzima glicolítica, tal como GAP ou PyK. Veja, EPO 164 556. Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores que ocorrem naturalmente de origem de não levedura que têm a capacidade de se ligar à RNA polimerase da levedura e iniciar a transcrição. Outros elementos de controle que podem compreender parte dos vetores de expressão de levedura incluem terminadores, por exemplo, a partir de GAPDH ou dos genes de enolase (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385). Além disso, a origem da replicação a partir da origem de plasmídeo 2u é adequada para a levedura. Um gene de seleção adequado para o uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo da levedura. Veja, Tschumper et al, GENE (1980) 10:157; Kingsman et al, GENE (1979) 7:141. O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sema capacidade de crescer em triptofano. Similarmente, cepas de levedura deficientes de Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas por plasmídeos conhecidos portando o gene Leu2. Métodos de introduzir DNA exógeno em hospedeiros de levedura são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica e tipicamente incluem, mas não são limitados à transformação de esferoplastos ou de células hospedeiras de levedura intactas tratadas com cátions álcali. Por exemplo, a transformação da levedura pode ser realizada de acordo com . o método descrito em Hsiao et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 e Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. Entretanto, outros métodos para introduzir DNA ' em células, tais como por injeção nuclear, eletroporação ou fusão de protoplasto, podem ser usados, conforme descrito, no geral, em SAMBROOK et a/.., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). Células hospedeiras de levedura depois podem ser cultivadas usando técnicas padrão conhecidas àqueles de habilidade comum no ramo. Outros métodos para expressar proteínas heterólogas em células hospedeiras de levedura são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Veja, no geral, Publicação da Patente U.S. Nº 20020055169, Patentes U.S. Nº 6.361.969; 6.312.923;

6.183.985; 6.083.723; 6.017.731; 5.674.706; 5.629.203; 5.602.034; e 5.089.398; Patentes Reexaminadas U.S. Nº RE37.343 e RE35J49; Pedidos de Patente Publicados PCT WO 99/07862; WO 98/37208; e WO 98/26080; Pedidos de Patente Europeus EPO 946 736; EPO 732 403; EPO 480 480; WO 90/10277; EPO 340 986; EPO 329 203; EPO 324 274; e EPO 164

556. Veja, também Gellissen et al, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(1-2): 79-93; Romanos et al, YEAST (1992) 8(6):423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, cada um dos quais é incorporado como referência neste relatório. É As cepas de levedura hospedeiras podem ser cultivadas em fermentadores durante * o estágio de amplificação usando métodos de fermentação em lote de alimentação padrão — conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Os métodos de fermentação podem ser adaptados considerando as diferenças em uma via de utilização do carbono do hospedeiro de levedura particular ou modo de controle de expressão. Por exemplo, a fermentação de um hospedeiro de levedura Saccharomyces pode exigir uma alimentação de glicose única, fonte de nitrogênio complexa (por exemplo, hidrolisatos de caseína) e suplementação múltipla de vitaminas. Ao contrário, a levedura metilotrófica P. pastoris pode exigir glicerol, metanol e alimentações mineral-traço, porém apenas sais de amônio simples (nitrogênio) para crescimento e expressão ideais. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nº

5.324.639; Elliott et af, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; e Fieschko et a/, BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113, incorporados como referência neste relatório. Tais métodos de fermentação, entretanto, podem ter certas características comuns independente da cepa hospedeira de levedura utilizada. Por exemplo, um nutriente limitante de crescimento, tipicamente carbono, pode ser adicionado ao fermentador durante a fase de amplificação para permitir o crescimento máximo. Além disso, métodos de fermentação geralmente utilizam um meio de fermentação designado para conter quantidades adequadas de carbono, nitrogênio, sais basais, fósforo e outros nutrientes menores (vitaminas, minerais-traço e sais, etc.). Exemplos de meios de fermentação adequados para o uso com Pichia são descritos nas Patentes U.S. Nº 5.324.639 e 5.231.178, as quais são incorporadas como referência neste relatório. Células de Inseto Infectadas com Baculovírus: O termo “hospedeiro de inseto” ou É “célula hospedeira de inseto” refere-se a um inseto que pode ser, ou foi usado como um E recipiente para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira de inseto original que foi transfectada. É entendido que a progênie de uma célula parental única pode, não necessariamente, ser completamente idêntica na morfologia ou no complemento de DNA genômico ou total ao precursor original, devido à mutação acidental ou proposital. A progênie da célula parental que é suficientemente similar ao precursor a ser caracterizado pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de IFN beta, está incluída na progênie intencionada por esta definição. A expressão de baculovírus de polipeptídeos de IFN beta foi descrita na Patentes U.S. Nº 7.144.574, a qual é incorporada como referência neste relatório. A seleção de células de inseto adequadas para a expressão de polipeptídeos de IFN beta é conhecida àqueles de habilidade comum na técnica. Várias espécies de inseto são bem descritas na técnica e estão comercialmente disponíveis incluindo Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Na seleção de hospedeiros de inseto para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles mostrados ter, inter alia, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica e robustez — global. Insetos geralmente estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes incluindo, mas não limitadas ao Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA); e a American Type Culture Collection

(“ATCC”) (Manassas, VA).

Geralmente, os componentes de um sistema de expressão de inseto infectado por baculovírus incluem um vetor de transferência, usualmente um plasmídeo bacteriano, que contém um fragmento do genoma do baculovírus e um sítio de restrição de conveniente paraainserção do gene heterólogo a ser expressado; um baculovírus do tipo selvagem com homólogos de sequências ao fragmento específico do baculovírus no vetor de transferência (isto inclui a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovírus); e células hospedeiras de inseto e meios de crescimento apropriados. Os materiais, métodos e técnicas usados para construir vetores, transfectar células, selecionar placas, cultivar células em cultura e semelhantes são conhecidos na técnica e manuais estão disponíveis descrevendo estas técnicas.

Depois de inserir o gene heterólogo no vetor de transferência, o vetor e o genoma viral do tipo selvagem são transfectados em uma célula hospedeira de inseto onde o vetor e o genoma viral se recombinam. O vírus recombinante acondicionado é expressado e placas —recombinantes são identificadas e purificadas. Materiais e métodos para sistemas de expressão celular de baculovírus/inseto estão comercialmente disponíveis na forma de kit, i por exemplo, da Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Estas técnicas geralmente são conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica e completamente descritas em SUMMERS E " SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987), “20 nesterelatório incorporado como referência. Veja, também, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9 — 16.11 (1994); KING E POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); e OREILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).

De fato, a produção de várias proteínas heterólogas usando sistemas de expressão celular de baculovírus/inseto é conhecida àqueles de habilidade comum na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nº 6.368.825; 6.342.216; 6.338.846; 6.261.805; 6.245.528,

6.225.060; 6.183.987; 6.168.932; 6.126.944; 6.096.304; 6.013.433; 5.965.393; 5.939.285;

5.891.676; 5.871.986; 5.861.279; 5.858.368; 5.843.733; 5.762.939; 5.753.220; 5.605.827;

5.583.023; 5.571.709; 5.516.657; 5.290.686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; — WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, os quais são incorporados como referência neste relatório.

Vetores que são úteis em sistemas de expressão celular de baculovírus/inseto são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, vetores de expressão e transferência de inseto derivados do baculovírus nucleopoliedrovírus da Autographa californica (ACNPV), que é um vetor de expressão viral independente do auxiliar. Vetores de expressão viral derivados deste sistema usualmente usam o promotor do gene de poli-hedrina viral forte para conduzir a expressão de gene heterólogos. Veja, no geral, O “Reilly et al, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).

Antes de inserir o gene estranho no genoma do baculovírus, os componentes descritos acima, compreendendo um promotor, líder (se desejado), sequência codificante de interesse e sequência de terminação de transcrição, são tipicamente agregados em um constructo de transcolocação intermediário (vetor de transferência). Os constructos de transcolocação intermediários são frequentemente mantidos em um replicon, tal como um elemento extracromossômico (por exemplo, plasmídeos) capaz de manutenção estável em um hospedeiro, tal como bactérias. O replicon terá um sistema de replicação, permitindo assim que ele seja mantido em um hospedeiro adequado para clonagem e amplificação.

Mais especificamente, o plasmídeo pode conter o sinal de poliadenilação de poli-hedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177) e um gene (amp) resistente à ampíicilina procariótico e origem de replicação para seleção e propagação em E. Coli.

Um vetor de transferência comumente usado para introduzir genes estranhos em . ACNPV é pAc373. Muitos outros vetores, conhecido àqueles de habilidade na técnica, “20 também foram designados incluindo, por exemplo, pVL 985, que altera o códon de início de poli-hedrina a partir de ATG a ATT e que introduz um sítio de clonagem BamHI com 32 pares de base a jusante de ATT. Veja, Luckow e Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Depois da inserção do gene heterólogo, o vetor de transferência e o genoma baculoviral do tipo selvagem são cotransfectados em uma hospedeiro de célula de inseto. Métodos para introduzir DNA heterólogo no sítio desejado no vírus baculovírus são conhecidos na técnica. Veja, SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; —Luckowe Summers, VIROLOGY (1989) 170:31. Por exemplo, a inserção pode estar em um gene, tal como o gene de poli-hedrina, por recombinação de cruzamento duplo homóloga; a inserção também pode estar em um sítio de enzima de restrição engendrado no gene de E baculovírus desejado. Veja, Miller et al, BIOASSAYS (1989) 11(4):91. i A transfecção pode ser realizada por eletroporação. Veja, TROTTER E WOOD, 39 “METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann e King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Alternativamente, lipossomas podem ser usados para transfectar as células de inseto com o vetor de expressão recombinante e o baculovírus. Veja, por exemplo, Liebman et al, BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36; Graves et al, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al, NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS et al, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al, GENE (1997) 190:139; Jakobsson ef al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376; Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et a/., J. VIROL. (1994) 68(2):766; e Peng et al, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274. Lipossomas comercialmente disponívelS incluem, por exemplo, Cellfectin& e LipofectinO (Invitrogen, Corp., Carisbad, CA). Além disso, a transfecção por fosfato de cálcio pode ser usada. Veja, TROTTER E WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19):5667; e Mann e King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501.

Vetores de expressão de baculovírus usualmente contêm um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar a . uma RNA polimerase de baculovírus e iniciar a transcrição (3') a jusante de uma sequência codificante (por exemplo, gene estrutural) em mRNA. Um promotor terá uma região de -. iniciação de transcrição que usualmente é colocada próxima à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação de transcrição tipicamente inclui um sítio de ligação à RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor de baculovírus também pode ter um segundo domínio chamado realçador, que, se presente, é usualmente distal ao gene estrutural. Além disso, a expressão pode ser regulada ou constitutiva. Genes estruturais, abundantemente transcritos em períodos tardios no ciclo de infecção, fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína de poliedro viral (FRIESEN et al., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EPO 127 839 e 0 155 476) e do gene que codifica a proteína p10 (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765).

O vetor de expressão de baculovírus recém formado é empacotado em um baculovírus recombinante infeccioso e subsequentemente as placas cultivadas podem ser purificadas por técnicas conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica. Veja, Miller et al, BIOESSAYS (1989) 11(4):91; SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987).

Vetores de expressão de baculovírus recombinantes foram desenvolvidos para infecção em várias células de inseto. Por exemplo, os baculovirus recombinantes foram desenvolvidos, inter alia, para Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125), Bombyx mori (ATCC Nº

CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC Nº 1963), Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Veja, Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell et a/., J. VIROL. (1985) 56:153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Veja, no geral, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Mais especificamente, as linhagens celulares usadas para sistemas de vetorde expressão de baculovirus comumente incluem, mas não são limitadas a Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC Nº CRL-1711), Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat. Nº 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (Trichopulsia ni) e High-Five'"" BTI-TN- 5B1-4 (Trichopulsia ni).

Células e meios de cultura estão comercialmente disponíveis para expressão direta efusão de polipeptídeos heterólogos em um baculovírus/expressão e a tecnologia de cultura celular geralmente é conhecida àqueles de habilidade comum na técnica.

E. Coli, espécie de Pseudomonas e outros Procariontes: As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica. Uma ampla variedade de vetores estão disponíveis para o uso em hospedeiros bacterianos. Os vetores podem ser vetores de cópias simples ou baixas ou altas multicópias. Vetores podem servir para clonagem e/ou expressão. Tendo em vista a ampla literatura sobre os vetores, a : disponibilidade comercial de muitos vetores e ainda os manuais descrevendo vetores e seus mapas de restrição e características, nenhum debate extensivo é necessário neste relatório. . Como é bem conhecido, os vetores normalmente envolvem marcadores considerando a seleção, em que os marcadores podem incluir resistência ao agente citotóxico, prototrofia ou imunidade. Frequentemente, uma pluralidade de marcadores está presente, os quais incluem características diferentes.

Um promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição (3') a jusante de uma sequência codificante (por exemplo, gene estrutural) no mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que usualmente é colocada próxima à extremidade 5' da sequência codificante.

Esta região de iniciação de transcrição tipicamente inclui um sítio de ligação à RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor bacteriano também pode ter um segundo domínio chamado operador, que podem sobrepor um sítio de ligação à RNA —polimerase adjacente no qual a síntese de RNA inicia. O operador permite transcrição regulada (induzível) negativa, como uma proteína repressora de gene pode se ligar ao operador e, desse modo, inibir a transcrição de um gene específico. A expressão f constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos regulatórios negativos, tais como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser obtida por uma sequência de ligação à proteína ativadora de gene, que, se presente, é usualmente próxima (5') à sequência de ligação à RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína ativadora de gene é a proteína ativadora de catabólito (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operon lac em Escherichia coli (E.

Coli) [Raibaud et al, ANNU.

REV.

GENET. (1984) 18:173]. Portanto, a expressão regulada pode ser positiva ou negativa, desse modo realçando ou reduzindo a transcrição.

Sequências que codificam enzimas da via metabólica fomecem sequências promotoras particularmente úteis.

Exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizando açúcar, tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al, NATURE (1977) 198:1056] e maltose.

Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas, tais como triptofano (trp) [Goeddel et al, NUC.

ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL.

ACIDS RES. (1981) 9:731; Pat.

U.S.

Nº 4.738.921; Pub.

EP Nº 036 776 e 121 775, os quais são incorporados como referência neste relatório]. O sistema promotor de B-galactosidase (bla) Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes”. In Interferon 3 (Ed. |. Gresser)], sistemas promotores do bacteriófago lambda PL [Shimatake et al, NATURE (1981) 292:128] e T5 [Pat.

U.S.

Nº 4.689.406, os quais são incorporados como referência neste relatório] também fornecem sequências promotoras úteis.

Método preferidos da presente invenção utilizam promotores fortes, tais como o promotor T7 para induzir polipeptídeos de IFN beta em altos níveis.

Exemplos de tais vetores são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica e incluem a série E pET29 da Novagen e os vetores pPOP descritos no WO99/05297, o qual é incorporado como referência neste relatório.

Tais sistemas de expressão produzem altos níveis de : polipeptídeos de IFN beta no hospedeiro sem comprometer a viabilidade ou parâmetros de crescimento da célula hospedeira. pET19 (Novagen) é um outro vetor conhecido na técnica.

Além disso, promotores sintéticos que não ocorem na natureza também funcionam como promotores bacterianos.

Por exemplo, as sequências de ativação de transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago podem ser unidas com as sequências do operon de um outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [Pat.

US Nº4.551.433, a qual é incorporada como referência neste relatório]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor trp-lac híbrido compreendido das sequências do promotor trp e operon lac, a qual é regulada pelo repressor lac [Amann et al, GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC.

NATL. ACAD.

SCI. (1983) 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores que ocorrem naturalmente de origem não bacteriana que têm a capacidade de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição.

Um promotor que ocorre naturalmente de origem não bacteriana também pode ser ligado com uma RNA polimerase compatível para produzir altos níveis de expressão de alguns genes em procariontes.

O sistema RNA polimerase/promotor T7 bacteriófago é um exemplo de um sistema de promotor ligado [Studier et a/., J.

MOL.

BIOL. (1986) 189:113; Tabor et a/., Proc —Natl Acad.

Sci. (1985) 82:1074]. Além disso, um promotor híbrido também pode ser compreendido de um promotor bacteriófago e uma região do operador de E.

Coli (Pub.

EP Nº 267 851).

Além de uma sequência de promotor funcional, um sítio de ligação ao ribossomo eficaz também é útil para a expressão de genes estranhos em procariontes. Em E. Colli, o sítio de ligação ao ribossomo é chamado de sequência Shine-Dalgarno (SD) e inclui um códon de iniciação (ATG) e uma sequência de 3 a 9 nucleotídeos no comprimento localizada em3a11 nucleotídeos a montante do códon de iniciação [Shine et al, NATURE (1975) 254:34]. A sequência SD é considerada para promover a ligação do mRNA ao ribossomo pelo pareamento de bases entre a sequência SD e a 3' e do rRNA 168 de E. Coli [Steitz et al. “Genetic signals and nucleotides sequences in messenger RNA”, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]). Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com sítio de ligação ao ribossomo fraco [Sambrook et al. “Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].

O termo “hospedeiro bacteriano” ou “célula hospedeira bacteriana” refere-se a uma bactéria que pode ser, ou foi usada como um recipiente para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira bacteriana original que foi transfectada. É entendido que a progênie de uma célula parental única pode, ; não necessariamente, ser completamente idêntica na morfologia ou no complemento de DNA genômico ou total ao precursor original, devido à mutação acidental ou proposital. A : progênie da célula parental que é suficientemente similar ao precursor a ser caracterizado pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de IFN beta, está incluída na progênie intencionada por esta definição. A seleção de bactérias hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos de IFN beta é conhecida àqueles de habilidade comum na técnica. Na seleção de — hospedeiros bacterianos para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles mostrados, inter alia, tendo boa capacidade de inclusão de formação corpórea, baixa atividade proteolítica e robustez global. Hospedeiros bacterianos geralmente estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes incluindo, mas não limitadas ao Bacterial . Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA); e the American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA). A fermentação industrial/farmacêutica geralmente usa derivado bacteriano de cepas K (por exemplo, W3110) ou de bactérias derivadas de cepas B (por exemplo, BL21). Estas cepas são particularmente úteis, pois seus parâmetros de crescimento são extremamente bem conhecidos e robustos. Além disso, estas cepas são não patogênicas, o que é comercialmente importante por razões de segurança e ambientais. Outros exemplos de hospedeiros de E. Coli adequados incluem, mas não são limitados às cepas de BL21, DH10B ou derivados das mesmas. Em uma outra modalidade dos métodos da presente invenção, o hospedeiro E. Coli é uma cepa desprovida de protease incluindo, mas não limitada a OMP- e LON-. A cepa da célula hospedeira pode ser uma espécie de Pseudomonas, incluindo mas não limitada a Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens biovar 1, designado cepa —MB101,é conhecido ser útil para a produção recombinante e está disponível para processos de produção de proteína terapêuticos. Exemplos de um sistema de expressão de Pseudomonas incluem o sistema disponível da The Dow Chemistry Company como uma cepa hospedeira (Midland, MI disponível na rede mundial de computadores no site dow.com).

Uma vez que uma cepa de célula hospedeira recombinante foi estabelecida (isto é, o constructo de expressão foi introduzido na célula hospedeira e células hospedeiras com o constructo de expressão apropriado são isoladas) a cepa de célula hospedeira recombinante é cultivada sob condições apropriadas para a produção de polipeptídeos de IFN beta. Como será evidente a uma pessoa de habilidade na técnica, o método de cultura da cepa de célula hospedeira recombinante será dependente da natureza da constructo de expressão utilizada e da identidade da célula hospedeira. Cepas hospedeiras recombinantes : normalmente são cultivadas usando métodos que são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Células hospedeiras recombinantes são tipicamente cultivadas em meio : líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos e, opcionalmente, contendo vitaminas, aminoácidos, fatores de crescimento e outros suplementos de cultura proteináceos conhecido àqueles de habilidade comum na técnica. Meios líquidos para a cultura de células hospedeiras pode opcionalmente conter antibióticos ou antifúngicos para prevenir o crescimento de microorganismos e/ou compostos indesejáveis incluindo, mas não limitados aos antibióticos para selecionar células hospedeiras contendo o vetor de expressão.

Células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em lotes ou formatos contínuos, com coleta celular (no caso onde o polipeptídeo de IFN beta se acumula intracelularmente) ou coleta de sobrenadante de cultura em lotes ou formatos contínuos. Para a produção em células hospedeiras procarióticas, cultura em lotes e coleta celular são preferidas.

Os polipeptídeos de IFN beta da presente invenção normalmente são purificados depois da expressão em sistemas recombinantes. O polipeptídeo de IFN beta pode ser purificado a partir de células hospedeiras ou meio de cultura por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Polipeptídeos de IFN beta produzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser deficientemente solúveis ou insolúveis (na forma de corpos de inclusão). Em uma modalidade da presente invenção, substituições de aminoácidos podem facilmente ser feitas no polipeptídeo de IFN beta, as quais são selecionadas para o propósito de aumentar a solubilidade da proteína recombinantemente produzida utilizando o métodos divulgado neste relatório, assim como aquelas conhecidas na técnica. No caso de proteína insolúvel, a proteína pode ser coletada a partir de lisatos de célula hospedeira por centrifugação, seguido por homogenização opcional das células. No caso de proteína deficientemente solúvel, compostos incluindo, mas não limitados ao polietilenoimina (PEI), podem ser adicionados para induzir a precipitação de proteína parcialmente solúvel. À proteína precipitada depois pode ser convenientemente coletada por centrifugação. Células hospedeiras recombinantes podem ser divididas ou homogeneizadas para liberar os corpos de inclusão de dentro das células usando uma variedade de métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. A divisão ou homogenização da célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas bem conhecidas incluindo, mas não limitadas à divisão celular enzimática, sonicação, homogenização dounce ou divisão de liberação de alta pressão. Em uma modalidade do método da presente invenção, a técnica de liberação de alta pressão é usada para dividir as células hospedeiras de E. Coli para liberar os corpos de inclusão dos —polipeptídeos de IFN beta. O manejo de corpos de inclusão do polipeptídeo de IFN beta pode ser vantajoso para minimizar o tempo de homogenização em repetições, de modo a : maximizar a produção de corpos de inclusão sem perda, devido a fatores, tais como solubilização, cisalhamento mecânico ou proteólise.

E O polipeptídeo de IFN beta insolúvel ou precipitado depois pode ser solubilizado usando qualquer um dos vários agentes de solubilização adequados conhecidos na técnica. O polipeptídeo de IFN beta pode ser solubilizado com ureia ou cloridreto de guanidina. O volume do polipeptídeo de IFN beta solubilizado deve ser minimizado, de modo que grandes lotes possam ser produzidos usando tamanhos de lote convenientemente manejáveis. Este fator pode ser significante em um série comercial de larga escala onde o hospedeiro recombinante pode ser cultivado em lotes que estão em milhares de litros em volume. Além disso, na fabricação do polipeptídeo de IFN beta em uma série comercial de larga escala, em particular para usos farmacêuticos humanos, os produtos químicos adversos que podem danificar o mecanismo e recipiente ou o produto de proteína por si só, devem ser avitados, se possível. Foi mostrado no método da presente invenção que a ureia do agente desnaturante suave pode ser usada para solubilizar os corpos de inclusão do polipeptídeo de IFN beta no lugar do cloridreto de guanidina do agente desnaturante adverso. O uso de ureia reduz significantemente o risco de dano ao equipamento de aço inoxidável utilizado no processo de fabricação e purificação do polipeptídeo de IFN beta, enquanto eficazmente solubiliza os corpos de inclusão do polipeptídeo de IFN beta. No caso da proteína de IFN beta solúvel, o IFN beta pode ser secretado no espaço periplasmático ou no meio de cultura. Além disso, IFN beta solúvel pode estar presente no citoplasma das células hospedeiras. Pode ser desejado concentrar IFN beta solúvel antes da realização das etapas de purificação. Técnicas padrão conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica podem ser usadas para concentrar IFN beta solúvel, por exemplo, a partir de lisatos celulares ou meio de cultura. Além disso, técnicas padrão conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica podem ser usadas para dividir células hospedeiras e liberar —IFN beta solúvel a partir do citoplasma ou espaço periplasmático das células hospedeiras.

Quando o polipeptídeo de IFN beta é produzido como uma proteína de fusão, a sequência de fusão pode ser removida. A remoção de uma sequência de fusão pode ser realizada por clivagem enzimática ou química. A remoção enzimática das sequências de fusão pode ser realizada usando métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. À escolha da enzima para a remoção da sequência de fusão será determinada pela identidade da fusão e as condições de reação serão especificadas pela escolha da enzima, como será evidente a uma pessoa de habilidade comum na técnica. A clivagem química pode ser realizada usando reagentes conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo mas não limitados a brometo de cianogênio, protease TEV e outros reagentes. o — polipeptídeo de IFN beta clivado pode ser purificado a partir da sequência de fusão clivada por métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Tais métodos serão Ú determinados pela identidade e propriedades da sequência de fusão e pelos polipeptídeo de IFN beta, como será evidente a uma pessoa de habilidade comum na técnica. Métodos para £ purificação podem incluir, mas não são limitados à cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica ou diálise ou qualquer combinação das mesmas.

O polipeptídeo de IFN beta também pode ser purificado para remover DNA da solução de proteína. O DNA pode ser removido por qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como cromatografia por precipitação ou de troca iônica, porém pode ser — removido por precipitação com um agente precipitante de ácido nucléico, tal como, mas não limitado a sulfato de protamina. O polipeptídeo de IFN beta pode ser separado do DNA precipitado usando métodos padrão bem conhecidos incluindo, mas não limitados à centrifugação ou filtração. A remoção de moléculas de ácido nucléico hospedeiras é um fator importante em um ajuste onde o polipeptídeo de IFN beta deve ser usado para tratar seres humanos e os métodos da presente invenção reduzem o DNA da célula hospedeira a níveis farmaceuticamente aceitáveis.

Métodos para fermentação pequena escala ou larga escala também podem ser usados na expressão da proteína, incluindo mas não limitados a fermentadores, frascos de agitação, biorreatores de leito fluidizado, biorreatores de fibra oca, sistemas de cultura giratórios (“roller bottles”) e sistemas de biorreator do tipo tanque agitado. Cada um destes métodos pode ser realizado em um lote, lote alimentado ou processo no modo contínuo.

Polipeptídeos de IFN beta humanos da invenção geralmente podem ser recuperados usando métodos padrão na técnica. Por exemplo, o meio de cultura ou lisato celular pode ser centrifugado ou filtrado para remover resíduos celulares. O sobrenadante pode ser concentrado ou diluído a um volume desejado ou diafiltrtado em um tampão adequado para condicionar a preparação para purificação adicional. A purificação adicional do polipeptídeo de IFN beta da presente invenção inclui separar formas desamidadas e clipadas da variante do polipeptídeo de IFN beta a partir da forma intacta.

Qualquer um dos procedimentos exemplares seguintes pode ser utilizado para a purificação de polipeptídeos de IFN beta da invenção: cromatografia de afinidade; cromatografia de troca aniônica ou catiônica (usando, incluindo mas não limitada a DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC); HPLC de fase reversa; filtração em gel (usando, incluindo mas não limitada a SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia por exclusão de tamanho; cromatografia com quelante de metal; ultrafiltração/diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; cromatofocalização; cromatografia por deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo mas não limitados à focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo mas não limitado à precipitação com sulfato : de amônio), SDS-PAGE ou extração. Proteínas da presente invenção, incluindo mas não limitadas às proteínas : compreendendo aminoácidos não naturais, peptídeos compreendendo aminoácidos não naturais, anticorpos para proteínas compreendendo aminoácidos não naturais, pares de ligação para proteínas compreendendo aminoácidos não naturais, etc, podem ser purificadas, parcial ou substancialmente para homogeneidade, de acordo com procedimentos padrão conhecidos e usados por aqueles de habilidade na técnica. Consequentemente, os polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e purificados por qualquer um de vários métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo mas não limitados à precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração ácido- base, cromatografia em coluna, cromatografia de afinidade em coluna, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia em hidroxilapatita, cromatografia em lectina, eletroforese em gel e semelhantes. As etapas de redobra da proteína podem ser usadas, conforme desejado, na preparação de proteinas maduras corretamente dobrada. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de afinidade ou outros métodos adequados podem ser utilizados nas etapas finais de purificação onde pureza elevada é desejada. Em uma modalidade, anticorpos preparados contra aminoácidos não naturais (ou proteínas ou peptídeos compreendendo aminoácidos não naturais) são usados como reagentes de purificação, incluindo mas não limitados para purificação com base na afinidade de proteínas ou peptídeos compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade, conforme desejado, os polipeptídeos são opcionalmente usados para uma ampla variedade de utilidades, incluindo mas não limitadas aos componentes de ensaio, produtos terapêuticos, profilaxia, diagnósticos, reagentes de pesquisa, e/ou como imunogenes para a produção de anticorpos. Anticorpos gerados contra polipeptídeos da presente invenção podem ser obtidos administrando-se os polipeptídeos ou fragmentos portando o epítopo ou células a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando protocolos de rotina. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode gerar anticorpos usando uma variedade de técnicas conhecidas. Também, camundongos ou outros organismos transgênicos, incluindo outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados. Os anticorpos descritos acima podem ser utilizados para isolar ou identificar clones expressando o polipeptídeo ou purificar os polipeptídeos. Anticorpos contra polipeptídeos da presente invenção também podem ser utilizados para tratar doenças.

Polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção também podem ser usados como vacinas. Consequentemente, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de induzir uma resposta imunológica em um mamífero que compreende . inocular o mamífero com um polipeptídeo da presente invenção, adequado para produzir anticorpos e/ou resposta imune às células T, incluindo, por exemplo, células T produtoras de : citocina ou células T citotóxicas, para proteger o dito animal da doença, se tal doença já está estabelecida ou não dentro do indivíduo. Um resposta imunológica em um mamífero também pode ser induzida por um método compreendendo liberar um polipeptídeo da presente invenção por intermédio de um vetor direcionando a expressão do polinucleotídeo e codificando o polipeptídeo in vivo de modo a induzir tal resposta imunológica para produzir anticorpos e proteger o dito animal das doenças da invenção. Uma maneira de administrar o —vetoré aceleraromesmo nas células desejadas como um revestimento em partículas, ou de outro modo. Tal vetor de ácido nucléico pode compreender DNA, RNA, um ácido nucléico modificado ou um DNA/RNA híbrido. Para o uso como uma vacina, um polipeptídeo ou um vetor de ácido nucléico será normalmente fornecido como uma formulação de vacina (composição). A formulação pode compreender ainda um portador adequado. Visto que um —polipeptídeo pode ser quebrado no estômago, ele pode ser administrado parenteralmente (por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam fi a formulação isotônica com o sangue do recipiente; e suspensões estéreis aquosas e não — aquosas que podem incluir agentes de suspensão ou agentes espessantes. A formulação de vacina também pode incluir sistemas adjuvantes para realçar a imunogenicidade da formulação que são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. A dosagem dependerá da atividade específica da vacina e pode ser facilmente determinada por experimentação de rotina.

Além de outras referências observadas neste relatório, uma variedade de métodos de purificação/redobra da proteina é conhecida àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo, mas não limitada aquela apresentada em R.

Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc.

N.

Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods. segunda Edição Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris e Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press em Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris e Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press em Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3º Edição Springer Verlag, NY; Janson e Ryden, (1998) Protein Purification: Princíples, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edição Wiley-VCH, NY; e Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; e as referências citada nos mesmos.

Uma vantagem de produzir uma proteína ou polipeptídeo de interesse com um . aminoácido não natural em uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica é que tipicamente as proteínas ou polipeptídeos serão dobrados em suas - conformações nativas.

Entretanto, em certas modalidades da invenção, aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que, depois da síntese, expressão e/ou purificação, proteínas ou peptídeos podem possuir uma conformação diferente das conformações desejadas dos polipeptídeos relevantes.

Em um aspecto da invenção, a proteína ou polipeptídeo expressado é opcionalmente desnaturado e depois renaturado.

Isto é realizado utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não limitados pela adição de uma —chaperonina à proteína ou polipeptídeo de interesse, solubilização das proteínas em um agente caotrópico, tal como HC! de guanidina, utilizando proteína dissulfeto isomerase, etc.

No geral, é ocasionalmente desejável desnaturar e reduzir polipeptídeos expressados e depois fazer com que os polipeptídeos redobrem na conformação preferida.

Por exemplo, guanidina, ureia, DTT, DTE, e/ou um chaperonina podem ser adicionados a um produto de tradução de interesse.

Métodos de reduzir, desnaturar e renaturar proteínas são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica (veja, as referências acima e Debinski, et a/. (1993) J.

Biol.

Chem., 268: 14065-14070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug.

Chem.. 4: 581-585; e Buchner, et al., (1992) Anal.

Biochem.. 205: 263-270). Debinski, et a/., por exemplo, descrevem a desnaturação e redução de proteínas do corpo de inclusão em guanidina-DTE.

As proteínas podem ser redobradas em um tampão redox contendo, incluindo mas não limitado à glutationa e L- arginina oxidada.

Reagentes de redobra podem ser submetidos ao fluxo ou, de outro modo, movidos em contato com um ou mais polipeptídeos ou outro produto de expressão ou vice-versa.

No caso de produção procariótica do polipeptídeo de IFN beta, o polipeptídeo de IFN beta assim produzido pode ser misdobrado e assim carecer ou ter reduzida a atividade biológica. A bioatividade da proteina pode ser restaurada pela “redobra”. No geral, —polipeptídeo de IFN beta misdobrado é redobrado por solubilização (onde o polipeptídeo de IFN beta também é insolúvel), não redobra e redução da cadeia de polipeptídeo usando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (por exemplo, ureia e/ou guanidina) e um agente redutor capaz de reduzir ligações dissulfeto (por exemplo, ditiotreitol DTT ou 2- mercaptoetanol, 2-ME). Em uma concentração moderada de caotropo, um agente oxidante depois é adicionado (por exemplo, oxigênio, cistina ou cistamina), o qual possibilita a reformação de ligações dissulfeto. O polipeptídeo de IFN beta pode ser redobrado usando métodos padrão conhecidod na técnica, tais como aqueles descritos nas Pat. U.S. Nº

4.511.502, 4.511.503 e 4.512.922, as quais são incorporadas como referência neste relatório. O polipeptídeo de IFN beta também pode ser corredobrado com outras proteínas paraformar heterodímeros ou heteromultímeros. Depois da redobra, o IFN beta pode ser adicionalmente purificado. A purificação do ; IFN beta pode ser realizada usando uma variedade de técnicas conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica, incluindo cromatografia de interação hidrofóbica, : cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia líquida de alto desempenho em fase reversa, cromatografia de afinidade e semelhantes ou qualquer combinação das mesmas. A purificação adicional também pode incluir uma etapa de secar ou precipitar a proteína purificada.

Depois da purificação, IFN beta pode ser trocado em tampões diferentes e/ou concentrado por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados à diafiltiração e diálise. IFN beta que é fornecido como uma proteína purificada única pode estar sujeito à agregação e precipitação.

O IFN beta purificado pode ser pelo menos 90 % puro (conforme medido por cromatografia líquida de alto desempenho em fase reversa, RP-HPLC ou dodecil sulfato de sódio-eletroforese em gel de poliacrilamida, SDS-PAGE) ou pelo menos 95 % puro ou pelo menos 98% puro ou pelo menos 99 % ou mais puro. Não obstante o valor numérico exato da pureza do IFN beta, o IFN beta é suficientemente puro para o uso como um produto farmacêutico ou para processamento adicional, tal como conjugação com um polímero solúvel em água, tal como PEG. á Em algumas modalidades, farmacocineticamente, os polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm Cmáx e AUC linear de dosagem. Em algumas modalidades, a farmacocinética dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm uma Cmáx de não menos do que 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % de Rebif na dosagem equivalente. Em algumas modalidades, a farmacocinética dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm uma Cmáx de não menos do que 100 % de Rebif na dosagem equivalente. Em algumas modalidades, a farmacocinética dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm uma Cmáx de não menos do que 105 %, 110 %, 115 %, 120%, 125%, 130%, 135%, 140 %, 145 %, 150 %, 155 %, 160 %, 165 %, 170 %, 175%, 180 %, 185 %, 190 %, 195 %, 200 % ou mais de Rebif na dosagem equivalente. Em algumas modalidades, a farmacocinética dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm uma Cmáx de não menos do que 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % de Avonex ou um outro controle administrado na dosagem equivalente. Em algumas modalidades, a farmacocinética dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm uma Cmáx de não menos do que 100 % de Avonex ou um outro controle administrado na dosagem equivalente. Em algumas modalidades, a farmacocinética dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm uma Cmáx de não menos do que 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 155 %, 160 %, 165

15. % 170%, 175%, 180 %, 185 %, 190 %, 195 %, 200 % ou mais de Avonex ou um outro controle administrado na dosagem equivalente. Em algumas modalidades, a farmacocinética E dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção têm PK a níveis suficiente para suportar allometricamente a dosagem uma vez por semana. F: Em algumas modalidades, a farmacodinâmica dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção induzem Neopterina e sustentam níveis de Neopterina uma vez por semana. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta da presente invenção induzem níveis de Neopterina sustentados durante 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 31 dias ou mais dias. Em algumas 25 — modalidades, a farmacodinâmica dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção induz a expressão do gene OAS1 não menos do que um controle positivo (um IFN beta terapêutico correntemente comercializado) e sustenta os níveis uma vez por semana. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta da presente invenção induzem a expressão do gene OAS1 não menos do que um controle positivo (um IFN beta terapêutico correntemente comercializado) e sustentam níveis durante 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 31 dias ou mais dias. Em algumas modalidades da presente invenção, as reações do sítio de injeção não são piores do que os controles positivos no Exemplo 27 na dosagem equivalente. Em algumas modalidades da presente invenção, as reações do sítio de injeção são melhores do que os controles positivos no Exemplo 27 na dosagem equivalente. Em outras modalidades, existem 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % menos reações do sítio de injeção causadas pelos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção.

Certas moléculas de IFN beta podem ser usadas como agentes terapêuticos na ausência de outros ingredientes ativos ou proteínas (exceto excipientes, portadores e estabilizadores, albumina sérica e semelhantes) ou elas podem ser complexadas com uma outraproteina ou um polímero.

Métodos de Purificação Gerais Qualquer uma de uma variedade de etapas de isolamento pode ser realizada no lisato celular, extrato, meio de cultura, corpos de inclusão, espaço periplasmático das células hospedeiras, citoplasma das células hospedeiras ou outro material, compreendendo o polipeptídeo de IFN beta ou em quaisquer misturas de — polipeptídeo de IFN beta resultantes de quaisquer etapas de isolamento incluindo, mas não limitadas à cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC"), HPLC em fase reversa (“RP-HPLC”), adsorção em leito expandido ou qualquer combinação e/ou repetição das mesmas e em qualquer ordem apropriada.

O equipamento e outros materiais necessários usados na realização das técnicas descritas neste relatório estão comercialmente disponíveis. Bombas, coletores de fração, Y monitores, registradores e sistemas completos estão disponíveis, por exemplo, da Applied Biosystems (Foster City, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) e Amersham Z Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ). Materiais cromatográficos incluindo, mas não limitados a materiais de matriz de troca, meios e tampões também estão disponíveis a partir de tais companhias.

O equilíbrio e outras etapas nos processos de cromatografia em coluna descritos neste relatório, tais como lavagem e eluição, podem ser mais rapidamente realizados usando equipamento especializado, tal como uma bomba. Bombas comercialmente disponíveis incluem, mas não são limitadas a Bomba P-50 HILOADº, Bomba Peristáltica P- 1, Bomba P-901 e Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Exemplos de coletores de fração incluem Coletor de Fração RediFrac, Coletores de Fração FRAC-100 e FRAC-200 e Coletor de Fração SUPERFRACº (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Misturadores também estão disponíveis para formar o pH e gradientes de concentração linear. Misturadores comercialmente disponíveis incluem o Misturador de Gradiente GM-1 e Misturadores In-Line (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

O processo cromatográfico pode ser monitorado usando qualquer monitor * comercialmente disponível. Tais monitores podem ser usados para recolher informações do tipo UV, pH e condutividade. Exemplos de detectores incluem Monitor UV-1, UVICORDº S Il, Monitor UV-M Il, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900 e Monitor de Condutividade (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). De fato, sistemas completos estão comercialmente disponíveis incluindo os vários sistemas AKTAº da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Em uma modalidade da presente invenção, por exemplo, o polipeptídeo de IFN beta pode ser reduzido e desnaturado desnaturando-se primeiro o polipeptídeo de IFN beta purificado resultante em ureia, seguido por diluição em tampão TRIS contendo um agente redutor (tal como DTT) em um pH adequado. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de IFN beta é desnaturado em ureia em uma faixa de concentração entre cerca de 2 M a cerca de 9 M, seguido por diluição em tampão TRIS em um pH na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0. A mistura da redobra desta modalidade depois pode ser incubada. Em uma modalidade, a mistura da redobra é incubada na temperatura ambiente durante quatro a vinte e quatro horas. A mistura de polipeptídeo de IFN beta reduzida e desnaturada depois pode ser ainda isolada ou purificada.

Conforme estabelecido neste relatório, o pH da primeira mistura de polipeptídeo de IFN beta pode ser ajustado antes da realização de quaisquer etapas de isolamento subsequentes. Além disso, a primeira mistura de polipeptídeo de IFN beta ou qualquer mistura subsequente da mesma pode ser concentrada usando técnicas conhecidas no ramo. Além disso, o tampão de eluição compreendendo a primeira mistura de polipeptídeo f de IFN beta ou qualquer mistura subsequente da mesma pode ser trocado por um tampão ' adequado para a próxima etapa de isolamento usando técnicas conhecidas àqueles de — habilidade comum no ramo.

Cromatografia de troca iônica Em uma modalidade e como uma etapa adicional opcional, a cromatografia de troca iônica pode ser realizada na primeira mistura de polipeptídeo de IFN beta. Veja, no geral, EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. Nº 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)). Colunas de troca iônica comercialmente disponíveis incluem as Colunas HITRAPº, HIPREPº e HILOADº (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Tais colunas utilizam trocas aniônicas fortes, tais como Fluxo Rápido com Q SEPHAROSES, Alto Desempenho com Q SEPHAROSEº e Q SEPHAROSEº? XL; trocadores catiônicos fortes, tais como Alto Desempenho com SP SEPHAROSE”, Fluxo Rápido com SP SEPHAROSEº e SP —SEPHAROSE? XL; trocadores aniônicos fracos, tais como Fluxo Rápido com DEAE SEPHAROSEº: e trocadores catiônicos fracos, tais como Fluxo Rápido com CM SEPHAROSE? (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A cromatografia de troca aniônica É ou catiônica em coluna pode ser realizada no polipeptídeo de IFN beta em qualquer estágio * do processo de purificação para isolar substancialmente o polipeptídeo de IFN beta purificado. A etapa da cromatografia de troca catiônica pode ser realizada usando qualquer matriz de troca catiônica adequada. Matrizes de troca catiônica úteis incluem, mas não são limitadas a materials de matriz de troca catiônica fibrosos, porosos, não porosos,

microgranulares, na forma de pérolas ou reticulados. Tais materiais de matriz de troca catiônica incluem, mas não são limitados à celulose, agarose, dextrano, poliacrilato, polivinila, poliestireno, sílica, poliéter ou compósitos de qualquer um dos precedentes.

A matriz de troca catiônica pode ser qualquer trocador catiônico adequado incluindo trocadores catiônicos fortes e fracos. Trocadores catiônicos fortes podem permanecer ionizados em uma faixa de pH ampla e assim, podem ser capazes de se ligar ao IFN beta em uma faixa de pH ampla. Trocadores catiônicos fracos, entretanto, podem perder a ionização como uma função do pH. Por exemplo, um trocador catiônico fraco pode perder carga quando o pH cai abaixo de cerca de pH 4 ou pH 5. Trocadores catiônicos fortes adequados incluem, mas não são limitados a grupos funcionais carregados, tais como sulfopropila (SP), sulfonato de metila (S) ou sulfoetila (SE). A matriz de troca catiônica pode ser um trocador catiônico forte, preferivelmente tendo uma faixa de pH ligante ao IFN beta de cerca de 2,5 a cerca de 6,0. Alternativamente, o trocador catiônico forte pode ter uma faixa de pH ligante ao IFN beta de cerca de 2,5 a cerca de 5,5. A matriz de troca catiônica pode ser um trocador catiônico forte tendo um pH ligante ao IFN beta de cerca de 3,0. Alternativamente, a matriz de troca catiônica pode ser um trocador catiônico forte, " preferivelmente tendo uma faixa de pH ligante ao IFN beta de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. À ” matriz de troca catiônica pode ser um trocador catiônico forte preferivelmente tendo uma 5 faixa de pH ligante ao IFN beta de cerca de 8,0 a cerca de 12,5. Alternativamente, o trocador catiônico forte pode ter uma faixa de pH ligante ao IFN beta de cerca de 8,0 a cerca de 12,0.

Antes de carregar o IFN beta, a matriz de troca catiônica pode ser equilibrada, por exemplo, usando vários volumes de coluna de um ácido fraco, diluído, por exemplo, quatro volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3. Após o equilíbrio, o IFN beta pode ser —adicionadoe a coluna pode ser lavada um a várias vezes, antes da eluição do IFN beta substancialmente purificado, também usando uma solução de ácido fraco, tal como uma solução de ácido acético ou ácido fosfórico fraco. Por exemplo, aproximadamente 2 a 4 volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3, podem ser usados para lavar a coluna. Lavagens adicionais usando, por exemplo, 2 a 4 volumes de coluna de acetato de sódio 0,05M, pH 5,5 ou acetato de sódio 0,05 M misto com cloreto de sódio 0,1 M, pH 5,5, também podem ser usadas. Alternativamente, usando métodos conhecidos na técnica, a matriz de troca catiônica pode ser equilibrada usando vários volumes de coluna de uma base fraca, diluída. f ff Alternativamente, o IFN beta substancialmente purificado pode ser eluído —contatando-sea matriz de troca catiônica com um tampão tendo um pH suficientemente baixo ou resistência iônica para substituir o IFN beta da matriz. O pH do tampão de eluição pode variar de cerca de 2,5 a cerca de 6,0. Mais especificamente, o pH do tampão de eluição pode variar de cerca de 2,5 a cerca de 5,5, cerca de 2,5 a cerca de 5,0. O tampão de eluição pode ter um pH de cerca de 3,0. Além disso, a quantidade de tampão de eluição pode variar amplamente e geralmente estará na faixa de cerca de 2 a cerca de 10 volumes de coluna.

Após a adsorção do polipeptídeo de IFN beta na matriz de troca catiônica, o polipeptídeo de IFN beta substancialmente purificado pode ser eluído contatando-se a matriz com um tampão tendo um pH suficientemente alto ou resistência iônica para substituir o polipeptídeo de IFN beta da matriz. Tampões adequados para o uso na eluição de pH alto do polipeptídeo de IFN beta substancialmente purificado podem incluir, mas não são limitados aos tampões citrato, fosfato, formiato, acetato, HEPES e MES variando em concentração de pelo menos cerca de 5 mM a pelo menos cerca de 100 mM.

Cromatografia em Fase Reversa RP-HPLC pode ser realizada para purificar proteínas seguindo protocolos adequados que são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Veja, por exemplo, Pearson et a/., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al, J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al, J. CHROM. (1986) 359:391-402. A RP-HPLC pode ser realizada no polipeptídeo de IFN beta para isolar o E polipeptídeo de IFN beta substancialmente purificado. A este respeito, resinas derivatizadas é com sílica com funcionalidades alguila com uma ampla variedade de comprimentos, , incluindo, mas não limitados de pelo menos cerca de C; a pelo menos cerca de Cao, pelo menos cerca de C; a pelo menos cerca de Cx, ou pelo menos cerca de C; a pelo menos cerca de Cs, podem ser usadas. Alternativamente, uma resina polimérica pode ser usada.

Por exemplo, a resina TosoHaas Amberchrome CG1000sd pode ser usada, a qual é uma resina polimérica de estireno. Ciano ou resinas poliméricas com uma ampla variedade de comprimentos de cadeia de alquila também podem ser usados. Além disso, a coluna de RP- — HPLC pode ser lavada com um solvente, tal como etanol. A coluna Source RP é um outro exemplo de uma coluna de RP-HPLC.

Um tampão de eluição adequado contendo um agente de pareamento iônico e um modificador orgânico, tal como metanol, isopropanol, tetraidrofurano, acetonitrila ou etanol, podem ser usados para eluir o polipeptídeo de IFN beta a partir da coluna de RP-HPLC. Os agentes de pareamento iônico mais comumente usados incluem, mas não são limitados ao ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, tetrametilamônio, acetato de tetrabutilamônio e trietilamônio.

É A eluição pode ser realizada usando um ou mais gradientes ou condições isocráticas, com condições de gradiente preferidas para reduzir o tempo de separação e diminuir a largura do pico. Um outro método envolve o uso de dois gradientes com faixas de concentração de solvente diferentes. Exemplos de tampões de eluição adequados para o uso neste relatório podem incluir, mas não são limitados às soluções de acetato de amônio e acetonitrila.

Técnicas de Purificação por Cromatografia de Interação Hidrofóbica A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) pode ser realizada no polipeptídeo de IFN beta.

Veja, no geral, HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat.

Nº 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) o qual é incorporado como referência neste relatório.

Matrizes de HIC adequadas podem incluir, mas não são limitados às matrizes de alquila ou arila substituído, tal como matrizes de butila, hexila, octila ou fenila substituído incluindo matrizes de agarose, agarose reticulada, sepharose, celulose, sílica, dextrano, poliestireno, poli(metacrilato) e resinas no modo misto, incluindo mas não limitada a um resina de polietilenoamina ou uma matriz de — polimetacrilato) de butila ou fenila substituído.

Fontes comercialmente disponíveis para cromatografia de interação hidrofóbica em coluna incluem, mas não são limitadas às colunas HITRAPº, HIPREPº e HILOADº (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Brevemente, antes do carregamento, a coluna de HIC pode ser equilibrada usando tampões padrão conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica, tais como uma solução de ácido acético/cloreto de sódio ou HEPES contendo sulfato de amônio.

O sulfato de amônio pode ser usado como o tampão para carregar a coluna de HIC.

Depois do ; carregamento do polipeptídeo de IFN beta, a coluna depois pode ser lavada usando i tampões padrão e condições para remover materiais não desejados, porém retendo o polipeptídeo de IFN beta na coluna de HIC.

O polipeptídeo de IFN beta pode ser eluído com cercade 3a cerca de 10 volumes de coluna de um tampão padrão, tal como um tampão HEPES contendo EDTA e concentração de sulfato de amônio menor do que o tampão de equilíbrio ou um tampão de ácido acético/cloreto de sódio, entre outros.

Uma diminuição do gradiente de sal linear usando, por exemplo, um gradiente de fosfato de potássio, também pode ser usado para eluir as moléculas de IFN beta.

O eluente depois pode ser concentrado, por exemplo, por filtração, tal como diafiltração ou ultrafiltração.

A diafiltração pode ser utilizada para remover o sal usado para eluir o polipeptídeo de IFN beta.

Outras Técnicas de Purificação Uma outra etapa de isolamento usando, por exemplo, filtração em gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat.

Nº 18- 1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), o qual é incorporado como referência neste relatório, cromatografia em hidroxiapatita (matrizes adequadas incluem, mas não são limitadas a HA-Ultrogel, High Resolution (Calbiochem), CHT Ceramic Hydroxyapatite (BioRad), Bio — Gel HTP Hydroxyapatite (BioRad)), HPLC, adsorção em leito expandido, ultrafiltração, diafiltração, liofilização e semelhantes, pode ser realizada na primeira mistura de polipeptídeo de IFN beta ou qualquer mistura subsequente da mesma, para remover — qualquer excesso de sais e substituir o tampão com um tampão adequado para a próxima etapa de isolamento ou ainda a formulação do produto final do fármaco.

O rendimento do polipeptídeo de IFN beta, incluindo polipeptídeo de IFN beta substancialmente purificado, pode ser monitorado em cada etapa descrita neste relatório usando técnicas conhecidas àqueles de habilidade comum no ramo. Tais técnicas também podem ser usadas para avaliar o rendimento do polipeptídeo de IFN beta substancialmente purificado após a última etapa de isolamento. Por exemplo, o rendimento do polipeptídeo de IFN beta pode ser monitorado usando qualquer uma das váriass colunas de cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa, tendo uma variedade de comprimentos de cadeia de alquila, tais como RP-HPLC, C,RP-HPLC em ciano; assim como HPLC de troca catiônica e HPLC de filtração em gel. Em modalidades específicas da presente invenção, o rendimento do IFN beta depois de cada etapa de purificação pode ser pelo menos de cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cercade 92%, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, - pelo menos cerca de 99 %, pelo menos cerca de 99,9 % ou pelo menos cerca de 99.99 %, ' do IFN beta no material de partida para cada etapa de purificação. A pureza pode ser determinada usando técnicas padrão, tais como SDS-PAGE ou —medindo-se o polipeptídeo de IFN beta usando os ensaios Western blot e ELISA. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser gerados contra proteínas isoladas da fermentação de levedura controle negativo e a recuperação da troca catiônica. Os anticorpos também podem ser usados para sondar a presença de proteínas de célula hospedeira contaminantes.

O material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílica, as superfícies das quais carrega cadeias de alquila C4. A separação do polipeptídeo de IFN beta a partir das impurezas proteináceas é fundamentada nas diferenças na resistência de interações hidrofóbicas. A eluição é realizada com um gradiente de acetonitrila em ácido trifluoroacético diluído. A HPLC preparativa é realizada usando uma coluna de aço inoxidável (enchida com 2,8 a 3,2 litros de gel de sílica Vydac C4). O eluato Hydroxyapatite Ultrogel é acidificado adicionando-se ácido trifluoroacético e carregado na coluna de Vydac CA. A lavagem e eluição de um gradiente de acetonitrila em ácido trifluoroacético diluído são usadas. As frações são coletadas e imediatamente neutralizadas com tampão fosfato. As frações do polipeptídeo de IFN beta que estão dentro dos limites IPC são agrupadas.

O material de DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste de grupos de dietilaminoetila (DEAE) que são covalentemente ligados à superfície de pérolas de Sepharose. A ligação do polipeptídeo de IFN beta aos grupos DEAE é mediada por interações iônicas. A acetonitrila e o ácido trifluoroacético passam através da coluna sem repetição. Depois que estas substâncias foram lavadas, impurezas traço são removidas lavando-se a coluna com tampão acetato em um pH baixo. Depois a coluna é lavada com tampão fosfato neutro e o polipeptídeo de IFN beta é eluído com um tampão com resistência iônica aumentada. À —colunaé empacotada com fluxo rápido de DEAE Sepharose. O volume da coluna é ajustado para assegurar que uma carga de polipeptídeo de IFN beta esteja na faixa de 3 a 10 mg do gel de polipeptídeo de IFN beta/ml. A coluna é lavada com água e tampão de equilíbrio (fosfato de sódio/potássio). As frações agrupadas do eluato de HPLC são carregadas e a coluna é lavada com tampão de equilíbrio. Depois, a coluna é lavada com tampão de lavagem (tampão acetato de sódio) seguido por lavagem com tampão de equilíbrio. Subsequentemente, o polipeptídeo de IFN beta é eluído da coluna com tampão de eluição (cloreto de sódio, fosfato de sódio/potássio) e coletado em uma fração única, de acordo com o perfil eluição mais apropriado. O eluato da coluna DEAE Sepharose é ajustado à condutividade especificada. A substância do fármaco resultante é estéril e filtrada em frascos de Teflon e armazenada a -70ºC.

Métodos adicionais que podem ser utilizados incluem, mas não são limitados às .: etapas para remover endotoxinas. Endotoxinas são lipopolissacarídeos (LPSs) que estão á localizados na membrana externa de células hospedeiras Gram-negativas, tais como, por | exemplo, Escherichia coli. Métodos para reduzir níveis de endotoxina são conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica e incluem, mas não são limitados às técnicas de purificação usando suportes de sílica, pó de vidro ou hidroxiapatita, cromatografia em fase reversa, por afinidade, por exclusão de tamanho, de troca aniônica, cromatografia de interação hidrofóbica, uma combinação destes métodos e semelhantes. Modificações ou métodos adicionais podem ser necessários para remover contaminantes, tais como proteinas comigrantes do polipeptíideo de interesse. Métodos para medir níveis de endotoxina são conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica e incluem, mas não são limitados aos ensaios de Limulus Amebocyte Lysate (LAL). O ensaio Endosafe'"- PTS é um sistema de tubo único colorimétrico que utiliza cartuchos pré-carregados com reagente de LAL, substrato cromogênico e endotoxina controle padrão junto ao um espectrofotômetro manejável. Métodos alternados incluem, mas não são limitados a um método Kinetic LAL que é turbidimétrico e usa um formato de 96 poços.

Uma ampla variedade de métodos e procedimentos pode ser usada para avaliar o rendimento e pureza de uma proteína de IFN beta compreendendo um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados, incluindo mas não limitado ao ensaio Bradford, —SDS-PAGE, SDS-PAGE pigmentada em prata, SDS-PAGE pigmentada em coomassie, espectrometria de massas (incluindo mas não limitada a MALDI-TOF) e outros métodos para caracterizar proteínas conhecidas a uma pessoa de habilidade comum na técnica.

Métodos adicionais incluem, mas não são limitados a: SDS-PAGE ligado com métodos de pigmentação da proteína, imunoblotting, dessorção a laser assistida por matriz/espectrometria de ionização-massas (MALDI-MS), cromatografia líquida/espectrometria de massas, focalização isoelétrica, troca aniônica analítica, cromatofocalização e dicroísmo circular.

VIII.

Expressão em Sistemas Alternados Várias estratégias foram utilizadas para introduzir aminoácidos não naturais em proteínas em células hospedeiras não recombinantes, células hospedeiras mutagenizadas ou em sistemas livre de célula.

Estes sistemas também são adequados para o uso na preparação dos polipeptídeos de IFN beta da presente invenção.

A derivatização de aminoácidos com cadeias reativas ao sítio, tais como Lys, Cys e Tyr resultou na conversão de lisina à Nº-acetil-lisina.

A síntese química também fornece um método direto para incorporar aminoácidos não naturais.

Com o desenvolvimento recente da ligação enzimática e ligação química nativa de fragmentos de peptídeo, é possível preparar proteínas mais longas.

Veja, por exemplo, P.

E.

Dawson e S.

B. H.

Kent, Annu.

Rev.

Biochem, 69:923 (2000). A ligação de peptídeo química e ligação química nativa são descritas na Patente U.S.

Nº 6.184.344, Publicação da Patente U.S.

Nº 2004/0138412, Publicação da Patente : U.S.

Nº 2003/0208046, WO 02/098902 e WO 03/042235, os quais são incorporados como Z referência neste relatório.

Um método biossintético in vitro geral em que um tRNA supressor quimicamente acilado com o aminoácido não natural desejado é adicionado a um extrato in vitro capaz de suportar a biossíntese da proteina, foi usado para incorporar sítio- especificamente nos 100 aminoácidos não naturais em uma variedade de proteínas de qualquer tamanho virtual.

Veja, por exemplo, V.

W.

Cornish, D.

Mendel e P.

G.

Schultz, Angew.

Chem.

Int.

Ed.

Engl. 1995, 34:621 (1995); CJ.

Noren, S.J.

Anthony-Cahill, M.C.

Griffith, P.G.

Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids in proteins, Science 244:182-188 (1989); e, J.D.

Bain, CG.

Glabe, T.A.

Dix, AR.

Chamberlin, E.S.

Diala, Biosynthetic site-speciífic incorporation of a unnatural amino acids into a polypeptide, J.

Am.

Chem.

Soc. 111:8013-8014 (1989). Uma faixa ampla de grupos funcionais foi introduzida em proteínas para estudos de estabilidade da proteína, redobra da proteína, mecanismo da enzima e transdução do sinal.

Um método in vivo, denominado incorporação por pressão seletiva, foi desenvolvido para explorar a promiscuidade de sintetases do tipo selvagem.

Veja, por exemplo, N.

Budisa, C Minks, S.

Alefelder, W.

Wenger, F.

M.

Dong, L.

Moroder e R.

Huber, FASEB J., 13:41 (1999). Uma cepa auxotrófica, em que a via metabólica relevante fornecendo a célula — comum aminoácido natural particular é desativada, é cultivada em meios mínimos contendo concentrações limitadas do aminoácido natural, enquanto a transcrição do gene alvo é reprimida.

No início de uma fase de crescimento estacionária, o aminoácido natural é depletado e substituído com o análogo do aminoácido não natural. A indução da expressão da proteína recombinante resulta no acúmulo de uma proteína contendo o análogo não natural. Por exemplo, usando esta estratégia, o, m e p-fluorofenilalaninas foram incorporadas nas proteínas e exibem dois ombros característicos no espectro de UV que podem ser facilmente identificados, veja, por exemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder e N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); trifluorometionina foi usada para substituir metionina na lisozma do bacteriófago T4 para estudar sua interação com ligantes de quitooligossacarídeo por RMN de **F, veja, por exemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson e J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); e trifluoroleucina foi incorporada no lugar da leucina, resultante na estabilidade térmico-química aumentada de uma proteína com Zíper de leucina. Veja, por exemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado e D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Além disso, selenometionina e telurometionina são incorporadas em várias proteinas recombinantes para facilitar a solução de fases em cristalografia de raios X. Veja, por exemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton e D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda e M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann e R. Huber, Eur. J. í Biochem,, 230:788 (1995); e, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, ' T. Neuefeind, L. Moroder e R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997). Os análogos de metionina com funcionalidades alceno ou alcino também foram eficazmente incorporados, considerando a modificação adicional de proteínas por meios químicos. Veja, por exemplo, J. C. van Hest e D. A. Tirrell, FEBS Lett.. 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kicke D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc, 122:1282 (2000); e, K. L. Kick e D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente U.S. Nº 6.586.207; Publicação da Patente U.S. 2002/0042097, as —quaissão incorporadas como referência neste relatório.

O sucesso deste método depende do reconhecimento dos análogo do aminoácido não natural por aminoacil-"RNA sintetases, que, no geral, exigem alta seletividade para garantir a fidelidade da tradução da proteína. Uma maneira de prolongar o escopo deste método é relaxar a especificidade do substrato de aminoacil-tRNA sintetases, que foram — obtidas em um número limitado de casos. Por exemplo, a reposição de Ala”* por Gly em fenilalani-tRNA sintetase de Escherichia coli (PReRS) aumenta o tamanho da bolsa de ligação ao substrato e resulta na acilação de tRNAPhe por p-Cl-fenilalanina (p-CI-Phe). Veja, M. lIbba, P. Kast e H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Uma cepa de Escherichia coli adjacente ao seu mutante PheRS permite a incorporação de p-Cl-fenilalanina ou p-Br- fenilalanina no lugar de fenilalanina. Veja, por exemplo, M. Ibba e H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); e, N. Sharma, R. Furter, P. Kast e D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Similarmente, um ponto de mutação de Phel30Ser próximo ao sítio de ligação do aminoácido de tirosil-(RNA sintetase de Escherichia coli foi mostrado para pssibilitar que a azatirosina seja incorporada mais eficazmente do que a tirosina. Veja, F. Hamano-Takaku, T. Wama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Solo e S. Nishimura, J. Biol. Chem. 275:40324 (2000).

Uma outra estratégia para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas in vivo é modificar sintetases que têm mecanismos revisores. Estas sintetases não podem discriminar e, portanto, ativar os aminoácidos que são estruturalmente similares aos aminoácidos naturais cognatos. Este erro é corrigido em um sítio separado, que desacila o aminoácido miscarregado do tRNA para manter a fidelidade de tradução da proteína. Se a atividade revisora da sintetase é inabilitada, análogos estruturais que são misativados podem escapar da função de edição e ser incorporados. Este método foi demonstrado recentemente com a vali-tRNA sintetase (ValRS). Veja, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel e P. Marliere, Science. 292:501 (2001). ValRS pode misaminoacilar tRNAVal com Cys, Thr ou aminobutirato (Abu); estes aminoácidos não cognatos são subsequentemente hidrolisados pelo domínio de edição. Depois da mutagênese aleatória do cromossomo de Escherichia coli, uma cepa mutante de . Escherichia coli foi selecionada, a qual tem uma mutação no sítio de edição de ValRS. Esta ó ValRS defectiva na edição incorretamente modifica tRNAVal com Cys. Como Abu | estericamente se assemelha a Cys (o grupo -SH de Cys é substituído com -CH3 em Abu), a ValRS mutante também incorpora Abu em proteínas quando esta cepa mutante de Escherichia coli é cultivada na presença de Abu. A análise espectrométrica de massas mostra que cerca de 24 % de valinas são substituídas por Abu em cada posição de valina na proteína nativa.

Métodos de síntese em fase sólida e semissintéticos também incluíram a síntese de várias proteinas contendo novos aminoácidos. Por exemplo, veja, as publicações e referências seguintes citadas em: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K,, Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pirazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem. 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, ET. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Ace Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme tiosubtilisin, J) Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected — synthetic peptides: — backbone-engineered HIV protease, Science.

— 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 11(3):255-301 (1981); Offord, RE. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); e, Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom,

J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 266(5183):243 (1994). Modificação química foi usada para introduzir uma variedade de cadeias laterais não naturais, incluindo cofatores, marcações “spin” e oligonucleotídeos em proteínas in vitro. Veja, por exemplo, Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-speciífic single-stranded desoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specifícity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science. 226(4674):505-511 (1984); Neet, KE., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem. 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et al. M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); e, Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242(4881):1038-1040 (1988). Alternativamente, “métodos biossintéticos que utilizam —aminoacil-tRNAS quimicamente modificados foram usadas para incorporar várias sondas biofísicas em . proteínas sintetizadas in vitro. Veja, as publicações e referências seguintes citadas em: Í Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 f (1993); e, Krieg, U. C, Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of —nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604-8608 (1986).

Previamente, foi mostrado que os aminoácidos não naturais podem ser sítio- especificamente incorporados em proteínas in vitro pela adição de tRNAs supressores quimicamente aminoacilados à reação de síntese de proteínas programadas com um gene contendo uma mutação não-sentido âmbar desejada. Usando estes métodos, uma pessoa pode substituir vários dos vinte aminoácidos comuns com homológos estruturais próximos, por exemplo, fluorofenilalanina por fenilalanina, usando cepas auxotrópicas para um aminoácido particular. Veja, por exemplo, Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C, Schultz, P.G. A general method for site-specífic incorporation of unnatural amino acids into proteins, — Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C. G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-speciífic incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide, |. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et a/., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site- —specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); e, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-directed mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophversus Biomol Struct. 24, 435-62 (1995).

Por exemplo, um tRNA supressor foi preparado, o qual reconheceu o códon de parada UAG e foi quimicamente aminoacilado com um aminoácido não natural. Mutagênese dirigida ao sítio convencional foi usada para introduzir o códon de parada “TAG”, no sítio de interesse no gene da proteína. Veja, por exemplo, Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5- 3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988). Quando o tRNA supressor acilado e o gene mutante foram combinados em um sistema de transcrição/tradução in vitro, o aminoácido não natural foi incorporado em resposta ao códon UAG que forneceu uma proteína contendo tal aminoácido na posição especificada. Experimentos usando [H]-Phe e experimentos com ácidos a-hidróxi demonstraram que apenas o aminoácido desejado é incorporado na posição especificada pelo códon UAG e que este aminoácido não é incorporado em qualquer outro sítio na proteína. Veja, por exemplo, Noren, et al., supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; e, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specífic incorporation of novel backbone structures into proteins, Science.

255(5041):197-200 (1992).

Um tRNA pode ser aminoacilado com um aminoácidob desejado por qualquer método ou técnica, incluindo mas não limitados à aminoacilação química ou enzimática.

A aminoacilação pode ser realizada por aminoacil-RNA sintetases ou por outras i moléculas enzimáticas, incluindo mas não limitada às ribozimas. O termo “ribozima” é interpermutável com “RNA catalítico”. Cech e colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et a/., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demonstraram a presença de RNAs que ocorrem naturalmente, os quais podem atuar como catalisadores (ribozimas). Entretanto, embora estes catalisadores de RNA naturais tenham apenas atuado em substratos de ácido ribonucléico para clivagem e “splicing”, o desenvolvimento recente da evolução artificial de ribozimas expandiu o repertório de catálise a várias químicas de reação. Estudos identificaram moléculas de RNA que podem catalisar ligações aminoacil- RNA em seus próprios (2')3'-terminais (Ilangakekare et a/., 1995 Science 267:643-647) e uma molécula de RNA que pode transferir um aminoácido a partir de uma molécula de RNA a um outro (Lohse et a/., 1996, Nature 381:442-444).

A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0228593, a qual é incorporada como referência neste relatório, descreve métodos para construir ribozimas e seu uso na aminoacilação de tRNAs com aminoácidos naturalmente codificados e que não ocorrem naturalmente codificados. Formas imobilizadas em substrato de moléculas enzimáticas que podem aminoacilar tRNAs, incluindo mas não limitadas às ribozimas, pode permitir purificação por afinidade eficaz dos produtos aminoacilados. Exemplos de substratos adequados incluem agarose, sepharose e pérolas magnéticas. A produção e uso de uma forma imobilizada em substrato de ribozima para aminoacilação são descritos em Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 e Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0228593, os quais são incorporados como referência neste relatório.

Métodos de aminoacilação química incluem, mas não são limitados àqueles introduzidos por Hecht e colaboradores (Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler;T.G.;Roesser,J. R; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253 e 4517) e por Schultz, Chamberlin, Dougherty e outros (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G.

Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, ef al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), os quais são incorporados como referência neste relatório, para evitar o uso de sintetases na aminoacilação. Tais métodos ou outros métodos de aminoacilação química podem ser usados para aminoacilar . molécula de tRNAs. : Métodos para gerar RNA catalítico podem envolver gerar “pools” separados de " sequências de ribozima randomizadas, realizando evolução dirigida nos “pools”, triando os “pools” quanto à atividade de aminoacilação desejável e selecionando sequências destas ribozimas que exibem atividade de aminoacilação desejada.

Ribozimas podem compreender motivos e/ou regiões que facilitam a atividade de acilação, tais como um motivo GGU e uma região rica em U. Por exemplo, foi relatado que regiões ricas em U podem facilitar o reconhecimento de um substrato de aminoácido e um —motivo GGU pode formar pares de base com os terminais 3' de um tRNA. Em combinação, o motivo GGU e a região rica em U facilitam o reconhecimento simultâneo do aminoácido e tRNA simultaneamente e, desse modo, facilitam a aminoacilação do terminal 3' do tRNA.

Ribozimas podem ser geradas por seleção in vitro usando um r24mini parcialmente randomizado conjugado com tRNA“ccoe, seguido por engenharia sistemática de uma sequência consenso encontrada nos clones ativos. Uma ribozima exemplar obtida por este método é denominada “ribozima Fx3” e é descrita na Pub. do Pedido U.S.A. Nº 2003/0228593, os conteúdos da qual! são incorporados como referência neste relatório, atua como um catalisador versátil para a síntese de vários aminoacil-|RNAs carregados com E aminoácidos não naturais cognatos.

A imobilização em um substrato pode ser usada para garantir a purificação por afinidade eficaz dos tRNAs aminoacilados. Exemplos de substratos adequados incluem, mas não são limitados à agarose, sepharose e pérolas magnéticas. Ribozimas podem ser imobilizadas em resinas tomando-se vantagem da estrutura química de RNA, tal como o 3”- cis-diol na ribose do RNA pode ser oxidado com periodato para produzir o dialdeído correspondente para facilitar a imobilização do RNA na resina.

Vários tipos de resinas podem ser usados, incluindo resinas de hidrazida com preço acessível, em que a aminação — redutivatorna a interação entre a resina e a ribozima uma ligação irreversível.

A síntese de aminoacil-RNAs pode ser significantemente facilitada por esta técnica de aminoacilação em coluna.

Kourouklis et a/. Methods 2005; 36:239-4 descrevem um sistema de aminoacilação com base em coluna.

O isolamento dos tRNAs aminoacilados pode ser realizado em uma variedade de maneiras.

Um método adequado é eluir os tRNAs aminoacilados a partir de uma coluna com um tampão, tal como uma solução de acetato de sódio com EDTA 10 mM, um tampão contendo N-(2-hidroxietil)piperazino-N'-(ácido 3-propanossulfônico) 50 mM, KCI 12,5 MM, pH 7,0, EDTA 10 mM ou simplesmente água tamponada em EDTA (pH 7,0). Os tRNAs aminoacilados podem ser adicionados às reações de tradução, de modo aincorporar o aminoácido com o qual o tRNA foi aminoacilado em uma posição de escolha em um polipeptídeo preparado pela reação de tradução.

Exemplos de sistemas de tradução . em que os tRNAs aminoacilados da presente invenção podem ser usados incluem, mas não Í são limitados aos lisatos celulares.

Lisatos celulares fornecem componentes de reação ” necessários para a tradução in vitro de um polipeptídeo a partir de um mRNA de entrada.

Exemplos de tais componentes de reação incluem, mas não são limitados às proteínas ribossômicas, r»RNA, aminoácidos, tRNAs, GTP, ATP, iniciação de tradução e fatores de alongamento e fatores adicionais associados com a tradução.

Adicionalmente, sistemas de tradução podem ser traduções de lote ou tradução compartimentalizada.

Sistemas de tradução de lote combinam componentes de reação em um compartimento único, enquanto sistemas de tradução compartimentalizada separam os componentes da reação de tradução dos produtos de reação que podem inibir a eficiência da tradução.

Tais sistemas de tradução estão comercialmente disponíveis.

Além disso, um sistema de transcrição/tradução ligado pode ser usado.

Sistemas de transcrição/tradução ligados incluem a transcrição de um DNA de entrada em um MRNA — correspondente, que por sua vez é traduzido pelos componentes de reação.

Um exemplo de um sistema de transcrição/tradução ligado comercialmente disponível é o Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.). O sistema inclui uma mistura contendo lisato de E.

Coli para fornecer componentes de tradução, tais como ribossomos e fatores de tradução. ' Adicionalmente, uma RNA polimerase é incluída para a transcrição do DNA de entrada em um moldedemRNA para ouso na tradução.

RTS pode usar a compartimentalização dos componentes de reação por via de uma membrana interposta entre os compartimentos de reação, incluindo um compartimento de fornecimento/resíduo e um compartimento de transcrição/tradução. A aminoacilação do tRNA pode ser realizada por outros agentes, incluindo mas não limitados às transferases, polimerases, anticorpos catalíticos, proteínas multifuncionais e semelhantes.

Stephan em Scientist, 10 de Outubro de 2005; páginas 30-33 descreve métodos adicionais para incorporar aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados em proteínas. Lu et al. em Mol Cell. 8 de Outubro de 2001 (4):759-69 descrevem um método em que uma proteína é quimicamente ligada a um peptídeo sintético contendo aminoácidos não naturais (ligação da proteína expressada).

Técnicas de microinjeção também foram usadas para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas. Veja, por exemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M.

E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N.

Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Science, 268:439 (1995); e, D. A.

Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Um oócito de Xenopus foi coinjetado com duas espécies de RNA preparadas in vitro: um MRNA que codifica a proteína alvo com um códon de parada UAG na posição do aminoácido de interesse e um tRNA supressor âmbar R aminoacilado com o aminoácido não natural desejado. O mecanismo de tradução do oócito ' depois insere o aminoácido não natural na posição especificada por UAG. Este método Ss permitiu estudos de estrutura-função in vivo de proteínas integral de membrana, que geralmente não são acessíveis a sistemas de expressão in vitro. Exemplos incluem a incorporação de um aminoácido fluorescente no receptor neuroquinina-2 taquiquinina para medir distâncias por transferência de energia por ressonância fluorescente, veja, por exemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J.

Knowles, H. Vogel e A. Chollet, J, Biol. Chem., 271:19991 (1996); a incorporação de aminoácidos biotinilados para identificar resíduos expostos à superfície em canais de íon, veja, por exemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester e D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); o uso de análogos de tirosina delimitados para monitorar mudanças conformacionais em um canal de íon em tempo real, veja, por exemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. Inglaterra, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); e, o uso de alfa hidróxi aminoácidos paramudar as cadeias principais dos canais de íon para sondar seus mecanismos de ativação. Veja, por exemplo, P. M. Inglaterra, Y. Zhang, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); e, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz e J. Yang, Nat. Neurosci.. 4:239 (2001). K f A capacidade de incorporar aminoácidos não naturais diretamente em proteínas in vivo oferece uma ampla variedade de vantagens incluindo, mas não limitadas aos rendimentos superiores de proteínas mutantes, facilidade técnica, o potencial para estudar as proteínas mutantes em células, ou possivelmente em organismos vivos e o uso destas proteínas mutantes em tratamentos terapêuticos e usos diagnósticos. A capacidade de incluir aminoácidos não naturais com vários tamanhos, acidez, nucleofilicidades, hidrofobicidades e outras propriedades em proteínas podem amplamante prolongar nossa capacidade de racional e sistematicamente manipular as estruturas de proteínas, tanto para sondara função da proteina quanto criar novas proteínas ou organismos com novas propriedades.

Em uma tentativa de síitio-especificamente incorporar para-F-Phe, um par de tRNAPheCUA supressor/fenilalanil--*RNA sintetase âmbar de levedura foi usado em uma cepa de Escherichia coli auxotrófica Phe resistente a p-F-Phe. Veja, por exemplo, R. Furter, Protein Sci,7:419 (1998).

Também pode ser possível obter a expressão de um polinucleotídeo de IFN beta da presente invenção usando um sistema de tradução livre de célula (in vitro). Sistemas de tradução podem ser celular ou livre de célula e pode ser procariótico ou eucariótico. Sistemas de tradução celulares incluem, mas não são limitados às preparações celulares completas, tais como células ou culturas de célula permeabilizadas, em que uma sequência de ácido nucléico desejada pode ser transcrita ao MRNA e o mRNA traduzido. Sistemas de . tradução livres de célula estão comercialmente disponíveis e muitos tipos e sistemas ' diferentes são bem conhecidos. Exemplos de sistemas livres de célula incluem, mas não Á são limitados a lisatos procarióticos, tais como lisatos de Escheríchia coli e lisatos —eucarióticos, tais como extratos de germe de trigo, lisatos celulares de inseto, lisatos de reticulócito de coelho, lisatos de oócito de coelho e lisatos celulares humanos. Extratos ou lisatos eucarióticos podem ser preferidos quando a proteína resultante é glicosilada, fosforilada ou de outro modo modificada, pois muitas de tais modificações são apenas possível em sistemas eucarióticos. Alguns destes extratos e lisatos estão disponíveis comercialmente (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Extratos membranosos, tais como os extratos pancreáticos caninos contendo membranas microssômicas, também estão disponíveis, os quais são úteis para traduzir proteínas secretórias. Nestes sistemas, os quais podem incluir MRNA como um molde (tradução in vitro) ou DNA como um molde (transcrição e tradução in vitro combinadas), a síntese in vitro é dirigida pelos ribossomos.

Esforço considerável foi aplicado para o desenvolvimento de sistemas de expressão de proteína livres de célula. Veja, por exemplo, Kim, D.M. e JR. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001); Kim, D.M. e JR. Swartz, Biotechnology Letters, 22, á 1537-1542, (2000); Kim, D.M. e J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M.eJR. Swartz, Biotechnology and Bivengineering, 66, 180-188, (1999); e Patnaik, R. e J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente U.S. Nº 6.337.191; Publicação da Patente U.S. Nº 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, os quais são incorporados como referência neste relatório.

Um outro método que pode ser aplicado para a expressão de polipeptídeos de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado inclui a técnica de fusão de MRNA-peptídeo.

Veja, por exemplo, R.

Roberts e J.

Szostak, Proc.

Natl Acad.

Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997); A.

Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). Neste método, um molde de mMRNA ligado à puromicina é traduzido em peptídeo no ribossomo.

Se uma ou mais moléculas de tRNA foram modificadas, aminoácidos não naturais também podem ser incorporados no peptídeo.

Depois que o último códon de mRNA foi lido, puromicina captura o C-terminal do peptídeo.

Se o conjugado de mRNA-peptídeo resultante mostrar propriedades interessantes em um ensaio in vitro, sua identidade pode ser facilmente revelada a partir da sequência de mMRNA.

Desta forma, uma pessoa habilitada pode triar bibliotecas de polipeptídeos de IFN beta compreendendo um ou mais amincácidos que não ocorrem naturalmente codificados para identificar polipeptídeos tendo propriedades desejadas.

Mais recentemente, traduções do ribossomo in vitro com componentes purificados foram relatadas, as quais permitem a síntese de peptídeos substituídos com aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados.

Veja, por exemplo, A.

Forster ef al., Proc.

Natl Acad.

Sci. (USA) 100:6353 (2003). h Sistemas de tradução reconstituídos também podem ser usados.

Misturas de É fatores de tradução purificados também foram usadas com êxito para traduzir o MRNA na " proteína, assim como combinações de lisatos ou lisatos suplementados com fatores de tradução purificados, tais como fator de iniciação 1 (IF-1), IF-2, IF-3 (a ou 6), fator de alongamento T (EF-Tu) ou fatores de terminação.

Sistemas livres de célula também podem ser sistemas de transcrição/tradução ligados em que o DNA é introduzido ao sistema, transcrito em mRNA e o mRNA traduzido, conforme descrito em Current Protocol in Molecular Biology (F.

M.

Ausubel et al. editores, Wiley Interscience, 1993), o qual é especificamente incorporado como referência.

O RNA transcrito em sistema de transcrição eucariótico pode estar na forma de RNA heteronuclear (hnRNA) ou “caps” da extremidade 5' (7-metil guanosina) e mRNA maduro com poli A na extremidade 3', que pode ser uma vantagem em certos sistemas de tradução.

Por exemplo, mMRNAs tampados são traduzidos com alta eficiência no sistema de lisato de reticulócitos.

IX.

Polímeros Macromoleculares Ligados aos Polipeptídeos de IFN beta Várias modificações aos polipeptídeos de aminoácidos não naturais descritos neste relatório podem ser efetuadas usando as composições, métodos, técnicas e estratégias descritos neste relatório.

Estas modificações incluem a incorporação de funcionalidade õ adicional no componente do aminoácido não natural do polipeptídeo, incluindo mas não limitada a uma marcação; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; um fotorreticulador; um radionuclídeo; um composto citotóxico; um fármaco; uma marcação por afinidade; uma marcação por fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um cofator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo antissentido; um sacarídeo; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina,; um ácido ribonucléico inibitório um biomaterial; uma nanopartícula; uma marcação spin; um fluoróforo, uma porção contendo metal; uma porção radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que interage covalente ou não covalentemente com outras moléculas; uma porção fotodelimitada; uma porção excitável por radiação actínica; uma porção fotoisomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma porção que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral prolongada; um açúcar ligado ao carbono; um agente redox-ativo; um aminotioácido; uma porção tóxica; uma porção isotopicamente marcada; uma sonda biofísica, um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo elétron-denso; um grupo magnético; , um grupo intercalante; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; uma marcação detectável; uma molécula pequena; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleotídeo; um radiotransmissor; um agente de capture de f nêutrons; ou qualquer combinação dos mesmos acima ou qualquer outro composto ou f substância desejável. Como um ilustrativo, o exemplo não limitante das composições, : métodos, técnicas e estratégias descritos neste relatório, a descrição seguinte focalizará adicionar polímeros macromoleculares ao polipeptídeo de aminoácido não natural com o entendimento de que as composições, métodos, técnicas e estratégias descritos também são aplicáveis (com modificações apropriadas, se necessário e para que uma pessoa de habilidade na técnica possa preparar as divulgações neste relatório) para adicionar outras funcionalidades, incluindo mas não limitadas àquelas listadas acima.

Uma ampla variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas podem ser ligados a polipeptídeos de IFN beta da presente invenção para modular propriedades biológicas do polipeptídeo de IFN beta, e/ou fornecer novas propriedades biológicas às molécula de IFN beta. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados ao polipeptídeo de IFN beta por intermédio de um aminoácido que ocorre naturalmente codificado, por intermédio de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ou qualquer substituinte funcional de um aminoácido natural ou não natural ou qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou não natural. O peso molecular do polímero pode ser de uma faixa ampla, incluindo mas não limitada entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre —cercade 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo mas não limitado a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000

Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da,

2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entrecercade 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.

A presente invenção fornece preparações substancialmente homogêneas de conjugados polímero:proteína. “Substancialmente homogêneas” conforme usado neste relatório, significa que moléculas conjugadas de polímero:proteína são observadas maiores do que a metade da proteina total. O conjugado de polímero:proteína tem atividade biológica e o polipeptídeo PEGilado “substancialmente homogêneo” presente de preparações de IFN beta fornecidos neste relatório são aquels que são homogêneos o suficiente para apresentar é as vantagens de uma preparação homogênea, por exemplo, facilidade na aplicação clínica ; na previsibilidade de farmacocinética entre lotes. E Uma pessoa também pode preparar uma mistura de moléculas do conjugado de . polímero:proteína e a vantagem fornecida neste relatório é que esta pessoa pode selecionar a proporção do conjugado de monopolímero:proteína a ser incluída na mistura. Assim, se desejado, uma pessoa pode preparar uma mistura de várias proteínas com vários números de porções de polímero fixadas (isto é, di-, tri-, tetra-, etc.) e combinar os ditos conjugados com o conjugado de monopolimero:proteína preparado usando os métodos da presente invenção e têm uma mistura com uma proporção pré-determinada de conjugados de —monopolímero:proteína.

O polímero selecionado pode ser solúvel em água de modo que a proteína a qual ele é ligado não precipite em um ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para uso terapêutico da preparação extremidade-produto, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

Exemplos de polímeros incluem, mas não são limitados aos éteres polialquílicos e análogos revestidos com alcóxi dos mesmos (por exemplo, polioxietilenoglico|, polioxietileno/propilenogilcol e metóxi ou análogos revestidos com etóxi dos mesmos, : especialmente polioxietilenoglicol, o último também é conhecido como polietilenoglicol ou * PEG); polivinilpirrolidonas; éteres polivinilalquílicos; polioxazolinas, polialquiloxazolinas e —poli-hidroxialquiloxazolinas; poliacrilamidas, polialquilacrilamidas e poli- hidroxialquilacrilamidas (por exemplo, poli-hidroxipropilmetacrilamida e derivados da mesma); acrilatos de poli-hidroxialquila; ácidos polisiálicos e análogos dos mesmos;

sequências de peptídeo hidrofílicas; polissacarídeos e seus derivados, incluindo dextrano e derivados de dextrano, por exemplo, carboximetildextrano, sulfatos de dextrano, aminodextrano; celulsse e seus derivados, por exemplo, carboximetilcelulose, hidroxialquilcelulose; quitina e seus derivados, por exemplo, quitosano, succinilquitosano, —carboximetilquitina, carboximetilquitosano; ácido hialurônico e seus derivados; amidos; alginatos; sulfato de condroitina; albumina; pululano e carboximetilpululano; ácidos poliamínicos e derivados dos mesmos, por exemplo, ácidos poliglutâmicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas; copolímeros de anidrido maléico, tais como: copolímero do anidrido maléico do estireno, copolímero do anidrido maléico do éter diviniletílico; álcoois polivinílicos; copolímeros dos mesmos; terpolímeros dos mesmos; misturas dos mesmos; e derivados dos precedentes.

A proporção das moléculas de polietilenoglicol para as moléculas de proteína variará, de acordo com suas concentrações na mistura de reação. No geral, a razão ideal (em termos de eficiência de reação em que existe excesso mínimo de proteína ou polímero —nãoreagido) pode ser determinada pelo peso molecular do polietilenoglicol selecionado e no número de grupos reativos disponíveis. Com referência ao peso molecular, tipicamente : quanto maior o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas do polímero que : podem ser ligadas à proteína. Similarmente, a ramificação do polímero deve ser . considerada quando se otimiza estes parâmetros. Geralmente, quanto maior o peso —molecular(ouo mais ramiíificado), maior a razão de polímero:proteína.

Conforme usado neste relatório e quanto à contemplação de PEG: conjugados do polipeptídeo de IFN beta, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade que fornece o benefício desejado a um paciente. A quantidade variará de um indivíduo a outro e dependerá de vários fatores, incluindo a condição física global do paciente ea causa básica da condição a ser tratada. À quantidade de polipeptídeo de IFN beta usado para a terapia fornece uma taxa aceitável de mudança e mantém a resposta desejada a um nível benéfico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica usando materiais e procedimentos publicamente disponíveis.

O polímero solúvel em água pode ser qualquer forma estrutural, incluindo, mas não limitada à forma linear, bifurcada ou ramificada. Tipicamente, o polímero solúvel em água é um poli(alquilenogilco!), tal como poli(etilenoglico!) (PEG), porém outros polímeros solúveis i em água também podem ser utilizados. Por via de exemplo, PEG é usado para descrever certas modalidades desta invenção.

PEG é um polímero solúvel em água bem conhecido, o qual é comercialmente disponível ou pode ser preparado por polimerização de abertura de anel de etilenoglicol, de acordo com os métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica (Sandler e

Karo, Polimer Synthesis, Academic Press, Nova lorque, Vol. 3, págs. 138-161). O termo “PEG” é amplamente usado para abranger qualquer molécula de polietilenoglicol, sem relação ao tamanho ou modificação em uma extremidade do PEG e pode ser representado como ligado ao polipeptídeo de IFN beta pela fórmula: XO-(CH.CH20),-CH;CH2-Y onde n é 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação terminal, incluindo, mas não limitada a um alquila C1.4, um grupo de proteção ou um grupo funcional terminal.

Em alguns casos, um PEG usado na invenção termina em uma extremidade com hidróxi ou metóxi, isto é, X é H ou CH3 (“metóxi-PEG”). Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, desse modo formando um polímero bifuncional.

Os grupos reativos típicos podem incluir aqueles grupos reativos que são comumente usados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não limitados aos grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, mas não limitados ao éster p-nitrofenílico), ésteres ativados (incluindo, mas não limitados à N-hidroxissuccinimida, éster p-nitrofenílico e aldeídos) assim como grupos funcionais que são inertes aos 20 aminoácidos comuns, porém que reagem especificamente com grupos funcionais : complementares presentes em aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados (incluindo, mas não limitados aos grupos azida e grupos alcino). É observado que a outra . extremidade do PEG, que é mostrada na fórmula acima por Y, se fixará direta ou indiretamente a um polipeptídeo de IFN beta por intermédio de um aminoácido que ocorre naturalmente ou que não ocorre naturalmente codificado.

Por exemplo, Y pode ser uma ligação amida, carbamato ou ureia a um grupo amina (incluindo, mas não limitado a epsílon amina de lisina ou N-terminal) do polipeptídeo.

Alternativamente, Y pode ser uma ligação maleimida a um grupo tiol (incluindo, mas não limitado ao grupo tiol de cisteíina). —Alternativamente, Y pode ser uma ligação a um resíduo não comumente acessível por intermédio dos 20 aminoácidos comuns.

Por exemplo, um grupo azida no PEG pode ser reagido com um grupo alcino no polipeptídeo de IFN beta para formar um produto da cicloadição [3+2] de Huisgen.

Alternativamente, um grupo alcino no PEG pode ser reagido com um grupo azida presente em um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado para formar um produto similar.

Em algumas modalidades, um nucleófilo forte (incluindo, mas não limitado a hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser reagido com um grupo aldeído ou cetona presente em um aminoácido que não ocorre naturalmente ' codificado para formar uma hidrazona, oxima ou semicarbazona, conforme aplicável, que em alguns casos pode ser reduzida ainda por tratamento com um agente redutor — apropriado.

Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado no polipeptídeo de IFN beta por intermédio de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e usado para reagir preferencialmente com um grupo cetona ou aldeído presente no polímero solúvel em água.

Qualquer massa molecular para um PEG pode ser usada, conforme praticamente desejado, incluindo, mas não limitada a cerca de 100 Daltons (Da) a 100.000 Da ou mais, conforme desejado (incluindo, mas não limitada a 0,1 a 50 kDa ou 10 a 40 kDa). O peso —moleculardePEG pode ser de uma faixa ampla, incluindo, mas não limitado entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O PEG pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não limitado a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9,000 Da,8.000 Da, 7,000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4,000 Da, 3.000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da. Em algumas modalidades, PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 1,000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. Os PEGs de ; cadeia ramificada, incluindo, mas não limitados às moléculas de PEG com cada cadeia tendo um MW variando de 1 a 100 kDa (incluindo, mas não limitado de 1 a 50 kDa ou 5 a 20 . kDa) também podem ser usados. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramíificada pode estar, incluindo, mas não limitado entre cerca de 1.000 Da e cerca de

100.000 Da ou mais. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode estar entre cerca de 1.000 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não limitado a,

100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da,

4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o — peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 20.000 Da. Uma faixa ampla de moléculas de PEG são descritas em Sheanvater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog, incorporado neste relatório como referência. Geralmente, pelo menos um terminal da molécula de PEG está disponível para reação com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Por exemplo, os derivados de PEG portando porções alcino e azida para reação com cadeias laterais de aminoácidos podem ser usados para fixar o PEG aos aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados, conforme descrito neste relatório.

Se o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende uma azida, então o PEG tipicamente conterá uma porção alcino para efetuar a formação do produto da cicloadição [3+2] ou uma espécie —dePEG ativado (isto é, éster, carbonato) contendo um grupo fosfina para efetuar a formação da ligação amida.

Alternativamente, se o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um alcino, então o PEG tipicamente conterá uma porção azida para efetuar a formação do produto da cicloadição de Huisgen [3+2]. Se o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila, o PEG tipicamente compreenderá um nucleófilo potente (incluindo, mas não limitado a uma funcionalidade hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida) de modo a efetuar a formação de ligações hidrazona, oxima e semicarbazona correspondentes, respectivamente.

Em outras alternativas, um reverso da orientação dos grupos reativos descritos acima pode ser usado, isto é, uma porção azida no aminoácido que não ocorre naturalmente codificado pode ser reagidacom um derivado de PEG contendo um alcino.

Em algumas modalidades, a variante do polipeptídeo de IFN beta com um derivado : de PEG contém uma funcionalidade química que é reativa com a funcionalidade química presente na cadeia lateral do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. . A invenção fornece, em algumas modalidades, derivados de polímero contendo azidae acetileno compreendendo uma cadeia principal do polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da.

A cadeia principal do polímero solúvel em água pode ser poli(etilenoglico!). Entretanto, deve ser entendido que uma ampla variedade de polímeros solúveis em água incluindo, mas não limitados ao poli(fetileno)gilco! e outros polímeros relacionados, incluindo poli(dextrano) e —polilpropilenogilco!), também são adequados para o uso na prática desta invenção e que o uso do termo PEG ou poli(etilenoglico!) é intencionado a abranger e incluir todas as moléculas.

O termo PEG inclui, mas não é limitado ao poli(etilenoglicol) em qualquer uma de suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG multirramificado, PEG derivatizado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendente (isto é, PEG ou polímeros relacionados tendo um —oumais grupos funcionais pendentes à cadeia principal do polímero) ou PEG com ligações degradáveis nas mesmas.

O PEG é tipicamente claro, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte a muitos agentes químicos, não hidrolizam ou deterioram e geralmente é não tóxico.

O poli(etilenoglico!) é considerado ser biocompatível, o que quer dizer que o PEG é capaz de coexisistircom tecidos ou organismos vivos sem causar dano.

Mais especificamente, o PEG é substancialmente não imunogênico, o que quer dizer que O PEG não tende a produzir uma resposta imune no corpo.

Quando ligado a uma molécula tendo alguma função desejável no corpo, tal como um agente biologicamente ativo, o PEG tende a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imune, de modo que um organismo possa tolerar a presença do agente. Os conjugados de PEG tendem a não produzir uma resposta imune substancial ou causar coagulação ou outros efeitos indesejáveis. O PEG tendoa fórmula -CH;CHO-(CH;CH2O).-CH2CH7-, onde n é de cerca de 3 a cerca de 4000, tipicamente de cerca de 20 a cerca de 2000, é adequado para o uso na presente invenção. O PEG tendo um peso molecular de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da está em algumas modalidades da presente invenção particularmente úteis como a cadeia principal do polímero. O peso molecular de PEG pode ser de uma faixa ampla, incluindo, mas não limitada entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular de PEG pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não limitado a

100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9,000 Da, 8.000 Da, 7,000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da,

4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG está entre : cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso . molecular de PEG está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. A cadeia principal do polímero pode ser linear ou ramificada. As cadeias principais do polímero ramificadas geralmente são conhecidas na técnica. Tipicamente, um polímero ramificado tem uma porção nuclear do ramo central e uma pluralidade de cadeias poliméricas lineares ligadas ao núcleo do ramo central. O PEG é comumente usado em formas ramificadas que podem ser preparadas por adição de óxido de etileno a vários polióis, tais como glicerol, oligômeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. À porção do ramo central também pode ser derivada de vários aminoácidos, tais como lisina. O —poli(etilenoglicol) ramificado pode ser representado na forma geral como R(-PEG-OH),, em que R é derivado de uma porção do núcleo, tal como glicerol, oligômeros de glicerol ou pentaeritrito! e m representa o número de ramos. As moléculas de PEG multirramificadas, tais como aquelas descritas nas Patentes U.S. Nº 5.932.462; 5.643.575; 5.229.490;

4.289.872; Pedido de Pat. U.S. 2003/0143596; WO 96/21469; e WO 93/21259, os quais são integralmente incorporados como referência neste relatório, também podem ser usadas como a cadeia principal do polímero. O PEG ramiíficado também pode estar na forma de um PEG bifurcado representado por PEG(-YCHZ>2),., onde Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.

Ainda em uma outra forma ramificada, o PEG pendente tem grupos reativos, tais como carboxila, ao longo da cadeia principal de PEG ao invés da extremidade das cadeias dePEG.

Além destas formas de PEG, o polímero também pode ser preparado com ligações fracas ou degradáveis na cadeia principal. Por exemplo, o PEG pode ser preparado com ligações éster na cadeia principal do polímero, as quais estão sujeitas à hidrólise. Conforme mostrado abaixo, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de peso molecular mais baixo: -PEG-CO,-PEG- + HO — PEG-CO,H + HO-PEG- É entendido por aqueles de habilidade comum na técnica que O termo poli(etilenoglicol) ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitadas àquelas divulgadas neste relatório.

Muitos outros polímeros também são adequados para o uso na presente invenção.

Em algumas modalidades, as cadeias principais do polímero que são solúveis em água, ç com 2 a cerca de 300 terminais, são particularmente úteis na invenção. Os exemplos de polímeros adequados incluem, mas não são limitados a outros poli(alquilenoglicóis), tais . como poli(propilenogilco!) (“PPG”), copolímeros dos mesmos (incluindo, mas não limitados aos copolímeros de etilenoglico! e propilenogilcol), terpolímeros dos mesmos, misturas dos mesmos e semelhantes. Embora o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero possa variar, este está tipicamente na faixa de cerca de 800 Da a cerca de

100.000 Da, frequentemente de cerca de 6.000 Da a cerca de 80.000 Da. O peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de

100.000 Da, incluindo, mas não limitado a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da,

80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da,

40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9,000 Da,

8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da. Em algumas — modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o —pesomolecularde cada cadeia da cadeia principal do polímero está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.

Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que a lista precedente para as cadeias principais substancialmente solúveis em água não se apresenta de forma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os materiais poliméricos tendo as qualidades descritas acima são considerados como sendo adequados para o uso na presente invenção.

Em algumas modalidades da presente invenção os derivados de polímero são “multifuncionais”, significando que a cadeia principal do polímero tem pelo menos dois terminais e possivelmente cerca de 300 terminais funcionalizados ou ativados com um grupo funcional. Os derivados de polímero multifuncionais incluem, mas não são limitados aos polímeros lineares tendo dois terminais, cada terminal sendo ligado a um grupo funcional que pode ser o mesmo ou diferente.

Em uma modalidade, o polímero derivado tem a estrutura: X-A-POLI-B-N=N=N em que: N=N=N é uma porção azida; B é uma porção ligante, que pode estar presente ou ausente; : POLI é um polímero não antigênico solúvel em água; A é uma porção ligante, que pode estar presente ou ausente e que pode ser a : mesma como B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.

Exemplos de uma porção ligante para A e B incluem, mas não são limitados a um grupo alquila com funcionalidades múltiplas contendo até 18 e podem conter entre 1 a 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, tal como nitrogênio, oxigênio ou enxofre, pode ser incluído com a cadeia de alquila. A cadeia de alquila também pode ser ramíficada em um —heteroátomo. Outros exemplos de uma porção ligante para A e B incluem, mas não são limitados a um grupo arila com funcionalidades múltiplas, contendo até 10 e podem conter 5 a 6 átomos de carbono. O grupo arila pode ser substituído com mais átomos de carbono, nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descritos nas Patentes U.S. Nº 5.932.462; 5.643.575; e Publicação do Pedido de Pat. U.S. 2003/0143596, as quais são incorporadas como referência neste relatório. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que a lista precedente para porções de ligação não se apresenta de forma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todas as porções de ligação tendo as qualidades descritas acima são consideradas adequadas para o uso na presente invenção.

Exemplos de grupos funcionais adequados para o uso como X incluem, mas não são limitados a hidroxila, hidroxila protegido, alcoxila, éster ativo, tal como ésteres N- hidroxissuccinimidílicos e ésteres 1-benzotriazolílicos, carbonato ativo, tal como carbonatos de N-hidroxissuccinimidila e carbonatos de 1-benzotriazolila, acetal, aldeído, aldeídos hidratados, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminoóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, —iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, cetona e azida. Conforme é entendido por aqueles de habilidade comum na técnica, a porção X selecionada deve ser compatível com o grupo azida, de modo que a reação com o grupo azida não ocorra. Os derivados de polímero contendo azida podem ser homobifuncionais, significando que o segundo grupo funcional (isto é, X) também é uma porção azida ou —heterobifuncionais, significando que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

O termo “protegido” refere-se à presença de um grupo ou porção de proteção que previne a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições de reação.

O grupo de proteção variará dependendo do tipo do grupo quimicamente reativo sendo protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonila (t-Boc) e 9- : fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo for um tiol, o grupo de proteção pode ser ortopiridildissulfeto. Se o grupo quimicamente reativo for um ácido . carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiônico ou um grupo hidroxila, o grupo de proteção pode ser grupo benzila ou alquila, tal como metila, etila ou terc-butila. Outros grupos de proteção conhecidos na técnica também podem ser usados na presente invenção.

Exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, mas não são limitados ao carbonato de N-succinimidila (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nº

5.281.698, 5.468.478), amina (veja, por exemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polim. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Veja, por exemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), propionato de succinimidila e butanoato de succinimidila (veja, por exemplo, Olson et al. em Poly(ethyleneglycol) Chemistry & Biological Applications, págs. 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C, 1997; veja, também Pat. U.S. Nº 5.672.662), succinato de succinimidila (Veja, por exemplo, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), éster succinimidílico (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 4.670.417), carbonato de benzotriazol (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 5.650.234), éter glicidílico (veja, por exemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et a/., Biotech. Appl. Biochem.

—13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (veja, por exemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenila (veja, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); e Sartore et al.,

Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (veja, por exemplo, Harris et al. J. Polim. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Pat. U.S. Nº 5.824.784, Pat. U.S. Nº 5.252.714), maleimida (veja, por exemplo, Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. em Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)) e Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), dissulfeto de ortopirídila (veja, por exemplo, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (veja, por exemplo, Sawhney et a/., Macromolecules, 26:581 (1993), vinilsulfona (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nº 5.900.461). Todas as referências e patentes acima são incorporados neste relatório como referência. Em certas modalidades da presente invenção, os derivados de polímero da invenção compreendem uma cadeia principal do polímero tendo a estrutura: X-CHCH20-(CH.CHO0),-CH,;CH7-N=N=N em que: X é um grupo funcional, conforme descrito acima; e n é de cerca de 20 a cerca de

4000. Em uma outra modalidade, os derivados de polímero da invenção compreendem uma cadeia principal do polímero tendo a estrutura: z X-CH2CH20-(CH;CH2O),-CHCH2-O-(CH>)Jn-W-N=N=N em que: . W é uma porção ligadora alifática ou aromática compreendendo entre 1 a 10 átomos de carbono; n é de cerca de 20 a cerca de 4000; e X é um grupo funcional, conforme descrito acima, m está entre 1 e 10. Os derivados de PEG contendo azida da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica e/ou divulgados neste relatório. Em um —método, mostrado abaixo, uma cadeia principal de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, a cadeia principal do polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo de partida adequado, é reagida com um ânion azida (que pode ser pareado com qualquer um dos vários contraíons adequados, incluindo sódio, potássio, terc- —butilamônio e assim por diante). O grupo de partida sofre um deslocamento nucleofílico e é substituído pela porção azida, fornecendo o polímero PEG contendo azida desejado. X-PEG-L + Ny; — X-PEG-N; Conforme mostrado, uma cadeia principal do polímero adequada para o uso na presente invenção tem a fórmula X-PEG-L, em que PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de partida adequado. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não são limitados a hidroxila, hidroxila protegido, acetal, alquenila, amina, aminoóxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina e vinilpiridina e cetona. Exemplos de grupos de partida adequados incluem, mas não são limitados ao cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato. Em um outro método para a preparação dos derivados de polímero contendo azida da presente invenção, um agente de ligação portando uma funcionalidade azida é contatado com uma cadeia principal de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, em que o agente de ligação porta uma funcionalidade química que reagirá seletivamente com uma funcionalidade química no polímero PEG, para formar um produto derivado do polímero contendo azida em que a azida é separada a partir da cadeia principal do polímero por um grupo de ligação.

Um esquema de reação exemplar é mostrado abaixo: X-PEG-M + N-ligador-N=N=N — PG-X-PEG-ligador-N=N=N em que: PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo de coroamento, tal como alcóxi ou um — grupo funcional, conforme descrito acima; e M é um grupo funcional que não é reativo com a funcionalidade azida, porém : reagirá eficaz e seletivamente com o grupo N funcional. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não são limitados a M f sendo um ácido carboxílico, carbonato ou éster ativo se N for uma amina; M sendo uma —cetona se N for uma porção hidrazida ou aminoóxi; M sendo um grupo de partida se N for um nucleófilo.

A purificação do produto bruto pode ser realizada por métodos conhecidos, incluindo, mas não são limitados à precipitação do produto, seguido por cromatografia, se necessário.

Um exemplo mais específico é mostrado abaixo no caso de PEG-diamina, em que uma das aminas é protegida por uma porção do grupo de proteção, tal como terc-butil-Boc e o PEG-diamina monoprotegido resultante é reagido com uma porção ligante que porta a funcionalidade azida: BoCHN-PEG-NH, + HO2C-(CH2);-N=N=N Neste exemplo, o grupo amina pode ser ligado ao grupo ácido carboxílico usando uma variedade de agentes ativadores, tais como os reagentes de cloreto de tionila ou carbodiimida e N-hidroxissuccinimida ou N-hidroxibenzotriazol para criar uma ligação amida entre o derivado de monoamina-PEG e a porção" ligadora portando azida. Depois da formação bem sucedida da ligação amida, o derivado contendo azida de N-terc-butil-Boc- protegido resultante pode ser diretamente usado para modificar as moléculas bioativas ou pode ser elaborado ainda para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo N-t-Boc pode ser hidrolisado por tratamento com ácido forte para gerar uma ômega-amino-

PEG-azida. A amina resultante pode ser usada como uma alça sintética para instalar outra funcionalidade útil, tal como grupos maleimida, dissulfetos ativados, ésteres ativados e assim por diante para a criação de reagentes heterobifuncionais valiosos. Os derivados heterobifuncionais são particularmente úteis quando estes são desejados para fixar moléculas diferentes a cada terminal do polímero. Por exemplo, o ômega-N-amino-N-azido-PEG possibilitaria a ligação de uma molécula tendo um grupo eletrofílico ativado, tal como um aldeído, cetona, éster ativado, carbonato ativado e assim por diante, a um terminal do PEG e uma molécula tendo um grupo acetileno ao outro terminal do PEG. Em uma outra modalidade da invenção, o polímero derivado tem a estrutura: X-A-POLI-B-C =€6-R em que: R pode ser H ou um grupo alquila, alceno, alcióxi ou arila ou arila substituído; B é uma porção ligante, que pode estar presente ou ausente; POL! é um polímero não antigênico solúvel em água; A é uma porção ligante, que pode estar presente ou ausente e que pode ser a : mesma como B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional. - Exemplos de uma porção ligante para A e B incluem, mas não são limitados a um grupo alquila com funcionalidades múltiplas contendo até 18, e pode conter entre 1 a 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, tal como nitrogênio, oxigênio ou enxofre pode ser incluído com a cadeia de alquila. A cadeia de alquila também pode ser ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de uma porção ligante para A e B incluem, mas não são limitados a um grupo arila com funcionalidades múltiplas, contendo até 10, e pode conter 5 a 6 átomos de carbono. O grupo arila pode ser substituído com mais átomos de carbono, nitrogênio, oxigênio ou átomos de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descrito nas Patentes U.S. Nº 5,932.462 e

5.643.575 e Publicação do Pedido de Pat. U.S. 2003/0143596, as quais são incorporadas como referência neste relatório. Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica —reconhecerão que a lista precedente para as porções de ligação não se apresenta de forma exaustiva e é intencionada ser meramente ilustrativa e que uma ampla variedade de porções de ligação tendo as qualidades descritas acima é considerada ser útil na presente invenção. f f i Exemplos de grupos funcionais adequados para o uso como X incluem hidroxila, —hidroxila protegido, alcoxila, éster ativo, tais como ésteres N-hidroxissuccinimidílicos e ésteres — 1-benzotriazolílicos, carbonato ativo, tais como carbonatos de N- hidroxissuccinimidila e carbonatos de 1-benzotriazolila, acetal, aldeído, aldeído hidratado,

alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminoóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilatos, alceno, cetona e acetileno. — Conforme seria entendido, a porção X selecionada deve ser compatível com o grupo acetileno, de modo que a reação com o grupo acetileno não ocorra. Os derivados de polímero contendo acetileno podem ser homobifuncionais, significando que o segundo grupo funcional (isto é, X) também é uma porção acetileno ou heterobifuncionais, significando que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente. Em uma outra modalidade da presente invenção, os derivados de polímero compreendem uma cadeia principal do polímero tendo a estrutura: X-CH2CH20-(CHCH20),-CH;CH2-0-(CH2)Jn-C =cH em que: X é um grupo funcional, conforme descrito acima; n é de cerca de 20 a cerca de 4000;:e m está entre 1 e 10. : Exemplos específicos de cada um dos polímeros de PEG heterobifuncionais são mostrados abaixo. í Os derivados de PEG contendo acetileno da invenção podem ser preparados usando métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica e/ou divulgados neste relatório. Em um método, uma cadeia principal de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, a cadeia principal do polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo nucleofílico adequado, é reagida com um composto que porta tanto uma funcionalidade acetileno quanto um grupo de partida que é adequado para a reação com o grupo nucleofílico no PEG. Quando o polímero PEG portando a porção nucleofílica e a molécula portando o grupo de partida são combinados, o grupo de partida sofre um deslocamento nucleofílico e é substituído pela porção nucleofílica, fornecendo o polímero contendo acetileno desejado. X-PEG-Nu + L-A-C > X-PEG-Nu-A-C=CR' Conforme mostrado, uma cadeia principal do polímero preferida para o uso na reação tem a fórmula X-PEG-Nu, em que PEG é poli(etilenoglicol), Nu é uma porção nucleofílica e X é um grupo funcional que não reage com Nu, L ou à funcionalidade ã acetileno.

Exemplos de Nu incluem, mas não são limitados aos grupos amina, alcóxi, arilóxi, sulfidrila, imino, carboxilato, hidrazida, aminóxi, que primeiramente reagiriam por intermédio de um mecanismo do tipo SN2. Exemplos adicionais de grupos Nu incluem aqueles grupos funcionais que primeiramente reagiriam por intermédio de uma reação de adição nucleofílica. Exemplos de grupos L incluem cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato e espera-se que outros grupos sofram deslocamento nucleofílico assim como cetonas, aldeídos, ticésteres, olefinas, grupos carbonila alfa-beta insaturados, carbonatos e espera-se que outros grupos eletrofílicos sofram adição por nucleófilos. Em uma outra modalidade da presente invenção, A é um ligador alifático entre 1 a átomos de carbono ou um anel de arila substituído entre 6 a 14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de partida adequado. Em um outro método para a preparação dos derivados de polímero contendo 10 —acetileno da invenção, um polímero PEG tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, portando um grupo funcional protegido ou um agente de coroamento em um terminal e um grupo de partida adequado no outro terminal é contatado por um ânion acetileno. Um esquema de reação exemplar é mostrado abaixo: X-PEG-L + -CECR' — X-PEG-C =CR' em que: : PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo de coroamento, tal como alcóxi ou um grupo funcional, conforme descrito acima; e . R' é H, um grupo alquila, alcóxi, arila ou arilóxi ou um grupo alquila substituído, —alcoxila, arila ou arilóxi.

No exemplo acima, o grupo de partida L deve ser suficientemente reativo para sofrer o deslocamento do tipo SN2 quando contatado com uma concentração suficiente do ânion acetileno. As condições de reação exigidas para realizar o deslocamento SN2 de grupos de partida por ânions acetileno são conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica.

A purificação do produto bruto pode usualmente ser realizada por métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não são limitados à precipitação do produto seguido por cromatografia, se necessário.

Os polímeros solúveis em água podem ser ligado aos polipeptídeos de IFN beta da invenção. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados por intermédio de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado incorporado no polipeptídeo de IFN beta ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ou que ocorre naturalmente codificado ou qualquer grupo funcional ou substituinte adicionado a um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ou que ocorre naturalmente codificado. Alternativamente, os polímeros solúveis em água são ligados a um polipeptídeo de IFN beta incorporando um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado por intermédio de um aminoácido que ocorre naturalmente

(incluindo, mas não limitado à cisteina, lisina ou o grupo amina do resíduo N-terminal). Em alguns casos, os polipeptídeos de IFN beta da invenção compreendem 1,2, 3 e 4, 5,6,7,8, 9, 10 aminoácidos não naturais, em que um ou mais aminoácido(s) que não ocorre(m) naturalmente codificado(s) é(são) ligado(s) ao(s) polímero(s) solúvel(s) em água (incluindo, mas não limitado(s)aPEG e/ou oligossacarídeos). Em alguns casos, os polipeptídeos de IFN beta da invenção compreendem ainda 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácido(s) que ocorre(m) naturalmente codificado(s) ligado(s) aos polímeros solúveis em água. Em alguns casos, os polipeptídeos de IFN beta da invenção compreendem um ou mais aminoácido(s) que não ocorre(m) naturalmente codificado(s) ligado(s) aos polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ligados aos polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os polímeros solúveis em água usados na presente invenção realçam a meia-vida do polipeptídeo de IFN beta no soro em relação à forma não conjugada. O número de polímeros solúveis em água ligados a um polipeptídeo de IFN beta (istoé, a extensão de PEGilação ou glicosilação) da presente invenção pode ser ajustado para fornecer uma característica (incluindo, mas não limitado a uma característica : aumentada ou diminuída) farmacológica, farmacocinética ou farmacodinâmica alterada, tal como meia-vida in vivo. Em algumas modalidades, a meia-vida do IFN beta é aumentada rn pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por cento, 2 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes,8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes em um polipeptídeo não modificado. Derivados de PEG contendo um grupo nucleofílico forte (isto é, hidrazida, hidrazina hidroxilamina ou semicarbazida. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo carbonila é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida terminal que é ligada diretamente à cadeia principal de PEG. Em algumas modalidades, o derivado de PEG-hidroxilamina terminal terá a estrutura: RO-(CH2CH20),-O-(CH2).-O-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), mé 2a 10 e né 100a

1.000 (isto é, peso molecular médio está entre 5 a 40 kDa). É f Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo hidrazina ou hidrazida terá aestrutura: RO-(CH2CH20),-O-(CH2)J-X-NH-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.) mé 2a 10 e né 100a

1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C=O) que pode estar presente ou ausente. Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo semicarbazida terá a estrutura: RO-(CHzCH20),-O-(CH2).-NH-C(O)-NH-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), mé 2a 10 ené100a

1.000. Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptideo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo carbonila é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção hidroxilamina, hidrazida, hidrazina ou semicarbazida terminal que é ligada à cadeia principal de PEG por meio de uma ligação amida. Em algumas modalidades, os derivados de PEG-hidroxilamina terminal têm a estrutura: RO-(CH2CH20),-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2).-O-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc), mé 2a 10ené100a

1.000 (isto é, peso molecular médio está entre 5 a 40 kDa).

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo hidrazina ou hidrazida têm a estrutura: RO-(CH2CH20),-O-(CH2)a-NH-C(O(CH2)1n-X-NH-NH, ' onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10, n é 100 a 1.000 eXé opcionalmente um grupo carbonila (C=O) que pode estar presente ou ausente.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo semicarbazida têm a estrutura: RO-(CH2CH20),-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-NH-C(O)-NH-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc), mé 2a 10 e né 100a

1.000.

Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptideo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo carbonila é modificado com um derivado de PEG ramíificado que contém uma porção hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida terminal, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um MW variando de 10 a 40 kDa e, —podeserde5a20kDa.

Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptideo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é modificado com um derivado de PEG tendo uma estrutura ramificada. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG-hidrazina ou hidrazida terminal terá a estrutura seguinte: [RO-(CH2CH2O0),-O-(CH>)2-NH-C(O)I-CH(CH2).-X-NH-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.) mé 2a 10 e né 100a

1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C=O) que pode estar presente ou ausente.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo semicarbazida terão a estrutura: [RO-(CH2CH2O),-O-(CH2).-C(O)-NH-CH2-CH3]laCH-X-(CH2).i-NH-C(O)-NH-NH, onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), X é opcionalmente NH, O, S,C(O0)ounão presente, mé 2a10ené 100 a1.000.

Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo hidroxilamina terão a estrutura: [RO-(CH2CH20),-O-(CH2)-C(O)-NH-CH2-CH3I5CH-X-(CH2).n-O-NH> onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), X é opcionalmente NH, O, S,C(O) ou não presente, m é 2a 10 en é 100 a 1.000.

O grau e os sítios em que o(s) polímero(s) solúvel(s) em água é(são) ligado(s) ao polipeptídeo de IFN beta podem modular a ligação do polipeptídeo de IFN beta ao receptor do polipeptídeo de IFN beta. Em algumas modalidades, as ligações são arranjadas, tal que o polipeptídeo de IFN beta se liga ao receptor do polipeptídeo de IFN beta com uma K,; de —cercade 400 nM ou menos, com uma Ka de 150 nM ou menos e em alguns casos com uma Kg de 100 NM ou menos, conforme medido por um ensaio de ligação de equilíbrio, tal como : aquele descrito em Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988). Os métodos e química para ativação de polímeros, assim como para conjugação de : peptídeos, são descritos na literatura e são conhecidos na técnica. Os métodos comumente usados para ativação de polímeros incluem, mas não são limitados à ativação de grupos funcionais com brometo de cianogênio, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epicloroidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haletos de sulfonila, triclorotriazina, etc. (veja, R. F. Taylor, (1991), Protein immobilisation. fundamental and applications, Marcel Dekker, NY.; S. S. Wong, (1992), Chemistry of protein conjugation and crosslinking, CRC Press, Boca Raton; GT. Hermanson et al, (1993), Immobilized affinity ligand techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al, Eds. Polymeric drugs and drug delivery systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991). Várias revisões e monografias sobre a funcionalização e conjugação de PEG estão disponíveis. Veja, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); — Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995). Os métodos para ativação de polímeros também podem ser encontrados no WO 94/17039, Pat. U.S. Nº 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. U.S. Nº 5.219.564, Pat US. Nº 5.122.614, WO 90/13540, Pat. U.S. Nº 5.281.698 e WO 93/15189 e para conjugação entre polímeros e enzimas ativados, incluindo, mas não limitados ao Fator VII da Coagulação (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula portando oxigênio

(Pat. U.S. Nº 4.412.989), ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). Todas as referências e patentes citadas são incorporadas como referência neste relatório. A PEGilação (isto é, adição de qualquer polímero solúvel em água) de polipeptídeos de IFN beta contendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, tal como p-azido-L-fenilalanina, é realizada por qualquer método conveniente. Por exemplo, o polipeptídeo de IFN beta é PEGilado com um derivado de mPEG com terminação em alcino. Resumidamente, um excesso de mPEG(5000)-O-CH,;-C=CH sólido é adicionado, com agitação, a uma solução aquosa de polipeptídeo de IFN beta contendo p-azido-L-Phe na temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com um tampão tendo uma pK, próxima ao pH no qual a reação deve ser realizada (no geral, pH 4 a 10). Os exemplos de tampões adequados para PEGilação ao pH 7,5, por exemplo, incluem, mas não são limitados a HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCI, EPPS e TES. O pH é continuamente monitorado e ajustado, se necessário. A reação é tipicamente continuada entre cerca de 1 a A48horas.

O produtos de reação são subsequentemente submetidos à cromatografia de . interação hidrofóbica para separar as variantes de polipeptídeo de IFN beta PEGilado do mMPEG(5000)-O-CH,;-C=CH livre e quaisquer complexos de peso molecular alto do f polipeptídeo de IFN beta pegilado que possam ser formados quando PEG não bloqueado são ativadosem ambas as extremidades da molécula, desse modo reticulando as moléculas da variante do polipeptídeo de IFN beta. As condições durante a cromatografia de interação hidrofóbica são tais que mPEG(5000)-O-CH7-C =CH livre flui através da coluna, enquanto quaisquer complexos da variante do polipeptídeo de IFN beta PEGilado reticulados eluem depois das formas desejadas, as quais contêm um conjugado da molécula da variante do —polipeptídeo de IFN beta em um ou mais grupos PEG. As condições adequadas variam dependendo dos tamanhos relativos dos complexos reticulados versus os conjugados desejados e são facilmente determinadas por aqueles de habilidade comum na técnica. O eluente contendo os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalinizado por diafiltração.

Se necessário, o polipeptídeo de IFN beta PEGilado obtido a partir da cromatografia hidrofóbica pode ser purificado ainda por um ou mais procedimentos conhecidos por àqueles de habilidade comum na técnica incluindo, mas não são limitados à cromatografia de afinidade; cromatografia de troca aniônica ou catiônica (usando DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; HPLC em fase reversa; filtração em gel (usando SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia com quelante de metal; ultrafiltração/diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; cromatofocalização; cromatografia por deslocamento;

procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não limitados à focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo, mas não limitada à precipitação com sulfato de amônio) ou extração. O peso molecular evidente pode ser estimado por GPC comparando-se aos padrões da proteína globular (Preneta, AZ em Protein purification S — methods, a practical method (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). A pureza do conjugado do IFN beta-PEG pode ser avaliado por degradação proteolítica (incluindo, mas não limitada à clivagem de tripsina) seguido por análise de espectrometria de massas. Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001). Um polímero solúvel em água ligado a um aminoácido de um polipeptídeo de IFN —betada invenção pode ser ainda derivatizado ou substituído sem limitação. Derivados de PEG contendo azida Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IFN beta é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção azida que reagirá com uma porção alcino presente na cadeia lateral do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. No geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio variando de 1 a 100 kDa e, em algumas modalidades, de 10 a 40 kDa.

a Em algumas modalidades, o derivado de PEG com terminal azida terá a estrutura: RO-(CH;CH20),-O-(CH2).n-N3 f onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), mé 2a 10 e né 100 a

1.000 (isto é, o peso molecular médio está entre 5 a 40 kDa).

Em uma outra modalidade, o derivado de PEG com terminal azida terá a estrutura: RO-(CH2CH20),-O-(CH2)Jn-NH-C(O)-(CH>),-Ns onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), mé 2a 10, pé2ai10ené 100 a 1.000 (isto é, o peso molecular médio está entre 5 a 40 kDa).

Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptideo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo alcino é modificado com um derivado de PEG ramificado que contém uma porção azida terminal, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um MW variando de 10 a 40 kDa e pode ser de 5 a 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG com terminal azida terá a estrutura seguinte: [RO-(CH2CH2O0),-O-(CH2)2-NH-C(O)I-CH(CH2)1-X-(CH2),N3 onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), n é 2a 10, pé 2a 10ené 100 a 1.000 e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonila (C=O), em cada caso que pode estar presente ou ausente. ' Derivados de PEG contendo alcino Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IFN beta é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção alcino que reagirá com uma porção azida presente na cadeia lateral do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG com terminal alcino terá a estrutura seguinte: RO-(CH;CH20),-0-(CH2)J“n-C =CH onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2a 10 e né 100 a

1.000 (istoé,peso molecular médio está entre 5 a 40 kDa).

Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptideo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo alcino é modificado com um derivado de PEG que contém um terminal azida ou porção alcino terminal que é ligado à cadeia principal do PEG por meio de uma ligação amida.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG com terminal alcino terá a estrutura seguinte: RO-(CH2CH20),-O-(CH2)J)-NH-C(O)-(CH2),-C =CH onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2a 10, pé 2a 10ené 100 a 1.000.

Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo azida é modificado com um derivado de PEG ramíficado que contém uma porção alcino terminal, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um MW variando de 10 a 40 kDa e pode ser de 5 a 20 kDa. Por exemplo, em algumas " modalidades, o derivado de PEG com terminal alcino terá a estrutura seguinte: [RO-(CH;CH2O),-O-(CH2)2-NH-C(O)I-CH(CH2) .n-X-(CH2), C =CH onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc.), mé 2a 10, pé 2a 10en é 100 a 1.000 e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonila (C=O) ou não presente.

Derivados de PEG contendo fosfina Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IFN beta é modificado com um derivado de PEG que contém um grupo funcional ativado (incluindo, mas não limitado ao éster e carbonato) compreendendo ainda um grupo arilfosfina que reagirá com uma porção azida presente na cadeia lateral do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. No geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio variando de 1 a 100 kDa e, em algumas modalidades, de 10 a 40 kDa.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a estrutura:

PROPEOO OW o em que n é 1 a 10; X pode ser O, N, S ou não presente, Ph é fenila e W é um polímero solúvel em água.

Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a estrutura: O. X.. SS" PPha em que X pode ser O, N, S ou não presente, Ph é fenila, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, grupos alquila, arila, alguila substituído e arila substituído. Os grupos R exemplares incluem, mas não são limitados a -CH>, -C(CH3) 3, -OR', -NR'R”, -SR', halogênio, -C(O)R', -CONR'R”, -S(OLR', -S(O)NRR", -CN e -NO> R, R', Re R”º independentemente referem-se a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, incluindo, mas não limitado a arila substituído com 1 a 3 halogênios, alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são os grupos R', Rº, Rº e R”, quando mais do que um destes grupos estão presentes. Quando R' e R" são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R' inclui, mas não é limitado a 1- pirrolidinila e 4-morfolinila. De acordo com debate acima sobre substituintes, uma pessoa de habilidade na técnica entenderá que o termo “alquila” inclui grupos incluindo átomos de — carbono ligados aos grupos, exceto os grupos hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo, mas não limitado a -CF; e -CH.CF;) e acila (incluindo, mas não limitado a -C(O)CH,, - : C(O)CF3, -C(O0)CH;OCH; e semelhantes). Outros Derivados de PEG e Técnicas de PEGilação Gerais fi Outras moléculas de PEG exemplares que podem ser ligadas aos polipeptídeos de IFN beta, assim como métodos de PEGilação incluem, mas não são limitados àqueles descritos, por exemplo, na Publicação das Patentes U.S. Nº* 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; — 2004/0013637; 2003/0228274, 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047, — 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; Patentes U.S. Nº 6.646.110; 5.824.778; 5.476.653;

5.219.564; 5.629.384; 5.736.625; 4.902.502; 5.281.698; 5.122.614; 5.473.034; 5.516.673;

5.382.657; 6.552,167; 6.610.281; 6.515.100; 6.461.603; 6.436.386; 6.214.966; 5.990.237;

5.900.461; 5.739.208; 5.672.662; 5.446.090; 5.808.096; 5.612,460; 5.324.844; 5.252.714;

6.420.339; 6.201,072; 6.451.346; 6.306.821; 5.559.213; 5.747.646; 5.834.594; 5.849.860;

5.980.948; 6.004.573; 6.129.912; WO 97/32607, EP 229.108, EP 402.378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316, os quais são incorporados como referência neste relatório.

Qualquer uma das moléculas de PEG descritas neste relatório pode ser usada em qualquer forma, incluindo, mas não limitada à cadeia única, cadeia ramificada, cadeia multirramificada, funcional única, bifuncional, multifuncional ou qualquer combinação das mesmas.

O polímero e os derivados de PEG adicionais, incluindo, mas não limitados a derivados de PEG-hidroxilamina (aminoóxi), são descritos nos pedidos de patente seguintes, os quais são todos integralmente incorporados como referência neste relatório: Publicação da Patente U.S. Nº 2006/0194256, Publicação da Patente U.S. Nº 2006/0217532, Publicação da Patente U.S. Nº 2006/0217289, Patente Provisória U.S. Nº 60/755.338; Patente Provisória U.S. Nº 60/755.711; Patente Provisória U.S. Nº 60/755.018; Pedido de Patente Internacional PCT Nº US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória U.S. Nº 60/743.041; Patente Provisória U.S. Nº 60/743.040; Pedido de Patente Internacional PCT Nº USO06/47822; Patente Provisória U.S. Nº 60/882.819; Patente Provisória U.S. Nº 60/882.500; e Patente Provisória U.S. Nº 60/870.594. Proteínas de Fusão Fc Heterólogas Os compostos de interferon beta descritos acima podem ser diretamente fundidos, : ou por intermédio de um ligador de peptídeo, à porção Fc de uma imunoglobulina. As imunoglobulinas são moléculas contendo cadeia de polipeptídeos mantidas por ligações " dissulfeto, tipicamente tendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Em cada cadeia, um domínio (V)tem uma sequência de aminoácidos variável, dependendo da especificidade do anticorpo da molécula. Os outros domínios (C) têm uma sequência particularmente constante comum às moléculas da mesma classe. Conforme usado neste relatório, a porção Fc de uma imunoglobulina tem o significado comumente fornecido ao termo no campo da imunologia. Especificamente, este termorefere-se a um fragmento de anticorpo que é obtido removendo-se as duas regiões de ligação do antígeno (os fragmentos Fab) a partir do anticorpo. Um modo de remover os fragmentos Fab é digerir a imunoglobulina com papaína protease. Assim, a porção Fc é formada de fragmentos dimensionados, aproximadamente iguais, da região constante de ambas as cadeias pesadas, as quais se associam através de interações não covalentes e ligações dissulfeto. A porção Fc pode incluir as regiões da dobradiça e estende-se através dos domínios CH2 e CH3 ao C-terminal do anticorpo. As regiões da dobradiça representativas para imunoglobulinas humanas e de camundongo podem ser encontradas em Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman e à Co., 1992, os ensinamentos do qual são incorporados como referência neste relatório. A porção Fc pode incluir ainda um ou mais sítios de glicosilação. As sequências de aminoácidos de numerosas proteínas Fc representativas contendo uma região da dobradiça, domínios CH2 e CH3 e um sítio de N-glicosilação são bem conhecidas na técnica.

Existem cinco tipos de regiões Fc da imunoglobulina humana com funções efetoras e propriedades farmacocinéticas diferentes: IgG, IgA, IGM, IgD e IgE. IgG é a imunoglobulina mais abundante no soro. IgG também tem a meia-vida mais longa no soro de qualquer imunoglobulina (23 dias). Ao contrário de outras imunoglobulinas, IgG é eficazmente —recirculada após a ligação a um receptor de Fc. Existem quatro subclasses de IgG, tais como G1, G2, G3 e G4, cada uma das quais tem funções efetoras diferentes. G1, G2 e G3 podem se ligar a C1q e fixar o complemento, enquanto G4 não pode. Ainda que G3 seja capaz de se ligar a Ciq mais eficazmente do que G1, G1 é mais eficaz em mediar a lise celular dirigida ao complemento. G2 fixa o complemento ineficazmente. O sítio de ligação de C1iqem IgG está localizado na região carbóxi terminal do domínio CH2.

Todas as subclasses de IgG são capazes de se ligar aos receptores de Fc (CD16, CD32, CD64) com G1 e G3 sendo mais eficazes do que G2 e G4. A região de ligação de Fc ao receptor de IgG é formada por resíduos localizados nas regiões da dobradiça e no terminal carbóxi do domínio CH2.

IgA pode existir tanto em uma forma monomérica quanto dimérica mantidas por uma J-cadeia. IgA é a segunda Ig mais abundante no soro, porém ela tem uma meia-vida de . apenas 6 dias. IgA tem três funções efetoras. Ela se liga a um receptor de IgA específico em macrófagos e eosinófilos, a qual direciona a fagicitose e desgranulação, respectivamente. hi Ela também pode fixar o complemento por intermédio de uma via alternativa desconhecida. IgM é expressada como um pentâmero ou um hexâmero, ambos os quais são mantidos por uma J-cadeia. IM tem uma meia-vida no soro de 5 dias. Ela se liga fracamente ao C1q por intermédio de um sítio de ligação localizado em seu domínio CH3. I|gD tem uma meia-vida de 3 dias no soro. Não está claro quais funções efetoras são atribuíveis a esta lg. IgE é uma lg monomérica e tem uma meia-vida no soro de 2,5 dias. IgE —seligaaosdois receptores de Fc, a qual direciona a desgranulação e resulta na liberação de agentes pró-inflamatórios.

Dependendo do efeito /n vivo desejado, as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem conter qualquer um dos isotipos descritos acima ou podem conter regiões Fc modificadas, em que o complemento e/ou funções de ligação ao receptor de Fc foram alteradas. Assim, as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem conter a porção Fc inteira de uma imunoglobulina, fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina ou análogos dos mesmos fundidos a um composto de interferon beta.

As proteínas de fusão da presente invenção podem consistir de proteínas de cadeia i única ou como polipeptídeos de cadeia múltipla. Duas ou mais proteínas de fusão Fc podem ser produzidas tal que elas interagem através de ligações dissulfeto que naturalmente se formam entre regiões Fc. Estes multimeros podem ser homogêneos, com respeito ao composto de interferon beta ou eles podem conter compostos de interferon beta diferentes fundidos no N-terminal da porção Fc da proteína de fusão.

Não obstante a estrutura final da proteína de fusão, Fc ou região do tipo Fc podem servir para prolongar a meia-vida in vivo no plasma do composto de interferon beta fundido no N-terminal. Além disso, o componente de interferon beta de um composto de proteína de fusão deve reter pelo menos uma atividade biológica do interferon beta. Um aumento na meia-vida terapêutica ou circulante pode ser demonstrado usando o método descrito neste relatório ou conhecido na técnica, em que a meia-vida da proteína de fusão é comparada à meia-vida do composto de interferon beta sozinho. A atividade biológica pode ser determinada por métodos in vitro e in vivo conhecidos na técnica.

Visto que a região Fc da IgG produzida por proteólise tem a mesma meia-vida in vivo como a molécula de IgG intacta e fragmentos Fab são rapidamente degradados, acredita-se que a sequência relevante para prolongar a meia-vida reside nos domínios CH2 e/ou CH3. Além disso, foi mostrado na literatura que as taxas catabólicas das variantes de IgG que não se ligam ao receptor de Fc ou C1q com alta afinidade são indistinguíveis da taxade separação do anticorpo do tipo selvagem precursor, indicando que o sítio catabólico é distinto dos sítios envolvidos na ligação ao receptor de Fc ou C1q. [Wawrzynczak et al., : (1992) Molecular Immunology 29:221]. Os estudos de mutagênese dirigida ao sítio usando uma região Fc da IgG1 murina sugeriram que o sítio da região Fc da I9G1 que controla a taxa catabólica está localizado na interface do domínio CH2-CH3. As regiões Fc podem ser “modificadas no sítio catabólico para otimizar a meia-vida das proteínas de fusão. A região Fc usada para as proteínas de fusão da presente invenção pode ser derivada de uma região Fc de I9G1 ou IgG4 e pode conter as regiões CH2 e CH3, incluindo a região da dobradiça.

Proteínas de fusão de FC-IFN beta são descritas no WO 2006/000448, o qual é incorporado como referência.

Proteínas de Fusão de Albumina Heterólogas O interferon beta descrito neste relatório pode ser diretamente fundido, ou por intermédio de um ligador de peptídeo, polímero solúvel em água ou ligador de pró-fármaco à albumina ou um análogo, fragmento ou derivado dos mesmos. Geralmente, as proteínas de albumina que são parte das proteínas de fusão da presente invenção podem ser derivadas de albumina clonada de qualquer espécie, incluindo a humana. A albumina sérica humana (HSA) consiste de uma única cadeia de polipeptídeo não glicosilada de 585 aminoácidos com um peso molecular de 66.500. A sequência de aminoácidos de HSA humana é conhecida [Veja, Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et'al. (1975) Fed. f Proc. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; Minghetti, et al.

—(1986)J. Biol. Chem. 261:6747, os quais são incorporados como referência neste relatório].

Uma variedade de variantes polimórficas, assim como análogos e fragmentos de albumina, foram descritos. [Veja, Weitkamp, et a/., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219]. Por exemplo,

veja em EP 322.094 várias formas mais curtas de HSA. Alguns destes fragmentos de HSA são divulgados, incluindo HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369) e HSA(1-419) e fragmentos entre 1 a 369 e 1 a 419. EP 399.666 divulga fragmentos de albumina que incluem HSA(1-177) e HSA(1-200) e fragmentos entre HSA(1-177) e HSA(1-200).

É entendido que as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção incluem compostos de interferon beta que são ligados a qualquer proteína de albumina incluindo fragmentos, análogos e derivados nos quais tal proteína de fusão é biologicamente ativa e tem uma meia-vida no plasma mais longa do que o composto de interferon beta sozinho. Assim, a porção albumina da proteína de fusão não necessariamente precisa ter uma meia- vida no plasma igual àquela de albumina humana nativa. Os fragmentos, análogos e derivados são conhecidos ou podem ser gerados, os quais têm meias-vidas mais longas ou têm meias-vidas intermediárias àquelas de albumina humana nativa e o composto de interferon beta de interesse.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção abrangem as proteínas tendo substituições conservativas de aminoácidos no composto de interferon beta e/ou a porção Fc ou albumina da proteína de fusão. Uma “substituição conservativa" é a reposição . de um aminoácido com um outro aminoácido que tem a mesma carga eletrônica líquida e aproximadamente o mesmo tamanho e forma. Os aminoácidos com cadeias laterais de ã aminoácidos alifáticas ou alifáticas substituídas têm aproximadamente o mesmo tamanho — quando o número total de carbonos e heteroátomos em suas cadeias laterais difere em não mais do que cerca de quatro. Eles têm aproximadamente a mesma forma quando o número de ramos em suas cadeias laterais difere em não mais do que um. Os aminoácidos com grupos fenila ou fenila substituído em suas cadeias laterais são considerados ter aproximadamente o mesmo tamanho e forma. A menos que de outro modo especificamente fornecido neste relatório, substituições conservativas são preferivelmente feitas com aminoácidos que ocorrem naturalmente.

As proteínas de albumina e imunoglobulina do tipo selvagem podem ser obtidas a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, estas proteínas podem ser obtidas de uma biblioteca de cCDNA preparada de tecido ou células que expressam o mRNA de interesse em um nível detectável. As bibliotecas podem ser triadas com sondas designadas usando o DNA ou sequência da proteína publicados para a proteína de interesse particular. Por exemplo, as regiões constantes de cadeia leve ou pesada da imunoglobulina são descritas em Adams, et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry é 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6027-6031; Rice et al.

(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862-7862; Falkner, et a/. (1982) Nature 298:286-288; e Morrison, et a/. (1984) Ann. Rev. Immuno!. 2:239-256. Algumas referências que divulgam proteína de albumina e sequências de DNA incluem Meloun, et al. (1975) FEBS Letters

58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 929:6102-6114; e Minghetti, et a/. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747. Caracterização das Proteínas de Fusão Heterólogas da Presente Invenção Existem numerosos métodos para caracterizar as proteínas de fusão da presente invenção. Alguns destes métodos incluem, mas não são limitados a: SDS-PAGE ligado aos métodos de pigmentação da proteína ou imunoblotting usando anticorpos anti-lgG ou anti- HSA. Outros métodos incluem dessorção a laser assistida por matriz/espectrometria de ionização-massas — (MALDI-MS), — cromatografia líquida/espectrometria de “massas, focalização isoelétrica, troca aniônica analítica, cromatofocalização e dicroísmo circular, por exemplo. Realce da afinidade para albumina sérica Várias moléculas também podem ser fundidas ao polipeptídeos de IFN beta da invenção para modular a meia-vida de polipeptídeos de IFN beta no soro. Em algumas modalidades, as moléculas são ligadas ou fundidas aos polipeptídeos de IFN beta da invenção para realçar a afinidade para albumina sérica endógena em um animal. Por exemplo, em alguns casos, uma fusão recombinante de um polipeptídeo de IFN , beta e uma sequência de ligação à albumina é preparada. As sequências de ligação à albumina exemplares incluem, mas não são limitadas ao domínio de ligação à albumina da : proteína G estreptocócica (veja, por exemplo, Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) e Sjolander et al, J Immunol. Methods 201:115-123 (1997)) ou peptídeos de ligação à albumina, tais como aqueles descritos, por exemplo, em Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

Em outras modalidades, os polipeptídeos de IFN beta da presente invenção são acilados com ácidos graxos. Em alguns casos, os ácidos graxos promovem a ligação à — albumina sérica. Veja, por exemplo, Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995).

Em outras modalidades, os polipeptídeos de IFN beta da invenção são diretamente fundidos com albumina sérica (incluindo, mas não limitada à albumina sérica humana). Aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que uma ampla variedade de outras moléculas também podem ser ligadas ao IFN beta na presente invenção para modular a ligaçãoà albumina sérica ou outros componentes do soro.

X. Glicosilação de Polipeptídeos de INF beta A invenção inclui polipeptídeos de IFN beta incorporando um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados portando resíduos de sacarídeos. Os resíduos de f sacarídeos podem ser naturais (incluindo, mas não limitados a N-acetilglicosamina) ou não naturais (incluindo, mas não limitados a 3-fluorogalactose). Os sacarídeos podem ser ligados aos aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados por uma ligação glicosídica N ou O-ligada (incluindo, mas não limitada a N-acetilgalactose-L-serina) ou uma ligação não natural (incluindo, mas não limitada a uma oxima ou o glicosídeo C ou S-ligado correspondente). As porções sacarídeo (incluindo, mas não limitadas à glicosila) podem ser adicionadas aos polipeptídeos de IFN beta in vivo ou in vitro.

Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo carbonila é modificado com um sacarídeo derivatizado com um grupo aminoóxi para gerar o polipeptídeo glicosilado correspondente ligado por intermédio de uma ligação oxima.

Uma vez que ligado ao aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, o sacarídeo pode ser elaborado ainda por tratamento com —glicosiltransfererases e outras enzimas para gerar um oligossacarídeo ligado ao polipeptídeo de IFN beta.

Veja, por exemplo, H.

Liu, et al. |. Am.

Chem.

Soc. 125: 1702-1703 (2003). Em algumas modalidades da invenção, um polipeptíideo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo carbonila é diretamente modificado com um glicano com estrutura definida preparado como um derivado de aminoóxi.

Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que outras funcionalidades, incluindo azida, alcino, hidrazida, hidrazina e semicarbazida, podem ser - usadas para ligar o sacarídeo ao aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

Em algumas modalidades da invenção, um polipeptideo de IFN beta compreendendo uma azida ou aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo —alquinila depois pode ser modificado por uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen com, incluindo, mas não limitado aos derivados de alquinila ou azida, respectivamente.

Este método inclui as proteínas modificadas com seletividade extremamente alta.

O WO 2007/022799 descreve processos para produzir IFN beta humano recombinante sob condições de cultura livres de soro e purificação do IFN beta com um único padrão de glicosilação.

Xl.

Dimeros e Multímeros de IFN beta A presente invenção também inclui IFN beta e combinações análogas de IFN beta, tais como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros (isto é, trímeros, tetrâmeros, etc.) onde IFN beta contendo um ou mais aminoácidos que não — ocorrem naturalmente codificados são ligados a um outro IFN beta ou variante do IFN beta dos mesmos ou qualquer outro polipeptídeo que não é IFN beta ou variante do IFN beta dos mesmos, diretamente à cadeia de polipeptídeo principal ou por intermédio de um ligador.

Devido ao seu peso molecular aumentado comparado aos monômeros, os conjugados de dímeros ou multímeros de IFN beta podem exibir propriedades novas ou desejáveis, incluindo, mas não limitadas às propriedades farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinâmicas, meia-vida terapêutica modulada ou meia-vida no plasma modulada diferentes em relação ao IFN beta monomérico.

Em algumas modalidades, dímeros de IFN beta da invenção modularão a transdução do sinal do receptor de IFN. Em outras modalidades, os dímeros ou multímeros de IFN beta da presente invenção atuarão como um antagonista, agonista ou modulador do receptor de IFN.

Em algumas modalidades, uma ou mais da moléculas de IFN beta presentes em umlFN beta contendo dímero ou multimero compreende um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado ligado a um polímero solúvel em água.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta são ligados diretamente, incluindo, mas não limitados por intermédio de uma ligação amida Asn-Lys ou ligação dissulfeto Cys-Cys. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IFN beta, e/ou a molécula de IFN beta não ligada, compreenderão aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados diferentes para facilitar a dimerização, incluindo, mas não limitado a um alcino em um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado de um primeiro polipeptídeo de IFN beta e uma azida em um segundo aminoácido que não ocorre naturalmente codificado de uma segunda molécula serão conjugados por intermédio de uma —cicloadição [3+2] de Huisgen. Alternativamente, IFN beta e/ou a molécula de IFN beta não ligada compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo - cetona podem ser conjugados a um segundo polipeptídeo compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo hidroxilamina e os polipeptídeos são : reagidos por intermédio da formação da oxima correspondente.

Alternativamente, os dois polipeptídeos de IFN beta e/ou a molécula de IFN beta não ligada, são ligados por intermédio de um ligador. Qualquer ligador hetero ou homobifuncional pode ser usado para ligar as duas moléculas e/ou as moléculas de IFN beta não ligadas, que podem ter a mesma ou uma sequência primária diferente. Em alguns casos, o ligador usado para se unir ao IFN beta e/ou as moléculas de IFN beta não ligada juntos podem ser um reagente de PEG bifuncional. O ligador pode ter uma faixa ampla de peso molecular ou comprimento molecular. Ligadores com pesos moleculares maiores ou menores podem ser usados para fornecer um relacionamento ou conformação espacial desejado entre IFN beta e a entidade ligada ou entre IFN beta e seu receptor ou entre a entidade ligada e seu par de ligação, se qualquer. Ligadores tendo comprimentos — moleculares mais longos ou mais curtos também podem ser usados para fornecer um espaço ou flexibilidade desejado entre IFN beta e a entidade ligada ou entre a entidade ligada e seu par de ligação, se qualquer.

Em algumas modalidades, a invenção fornece ligadores bifuncionais solúveis em água que têm uma estrutura “dumbbell” que inclui: a) uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina ou uma porção contendo carbonila em pelo menos uma primeira extremidade de uma cadeia principal do polímero; e b) pelo menos um segundo grupo funcional em uma segunda extremidade da cadeia principal do polímero. O segundo grupo funcional pode ser o mesmo ou diferente, como o primeiro grupo funcional. O segundo grupo funcional, em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. A invenção fornece, em algumas modalidades, compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um ramo de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a — estrutura molecular ramificada pode ser dendrítica.

Em algumas modalidades, a invenção fornece multímeros compreendendo um ou mais polipeptídeo de IFN beta, formados por reações com polímeros ativados solúveis em água que têm a estrutura: R-(CH2CH3O),-O-(CHo).n-X em que n é de cerca de 5 a 3.000, m é 2 a 10, X pode ser uma porção contendo azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, um grupo aminoóxi, uma hidroxilamina, um acetila ou carbonila e R é um grupo de coroamento, um grupo funcional ou um grupo de partida que pode ser o mesmo ou diferente como X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado do grupo que consiste de hidroxila, hidroxila protegido, alcoxila, éster — N-hidroxissuccinimídílico, éster 1-benzotriazolílico, carbonato de N-hidroxissuccinimidila, carbonato de 1-benzotriazolila, acetal, aldeído, aldeído hidratado, alquenila, acrilato, : metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminoóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, ã isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, —glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilato, alceno e cetona. XII. Medição da Atividade do Polipeptídeo IFN beta e Afinidade do Polipeptídeo de IFN beta para o Receptor de IFN A atividade do polipeptídeo de IFN beta pode ser determinada usando ensaios in vitro ou in vivo padrão ou conhecidos. Os polipeptídeos de IFN beta podem ser analisados — quanto à atividade biológica por métodos adequados conhecidos na técnica. Tais ensaios incluem, mas não são limitados à ativação de genes responsivos ao interferon, ensaios de ligação ao receptor, ensaios de atividade antiviral, ensaios de inibição do efeito citopático, (Familletti et al, Meth. Enzymol. 78:387-394), ensaios antiproliferativos, (Aebersold e Sample, Meth. Enzymol. 119:579-582), ensaios imunomodulatórios (Pat. U.S. Nº 4.914.033;

4.753.795) e ensaios que monitoram a indução de moléculas do MHC (por exemplo, Hokland et al, Meth. Enzymol. 119:688-693), conforme descrito em Meager, J. Immunol. Meth., 261:21-36 (2002). Os polipeptídeos de IFN beta podem ser analisados quanto à sua capacidade de * ativar as vias de transdução de sinal sensíveis ao interferon. Um exemplo é o ensaio do — elemento de resposta estimulada por interferon (ISRE). As células que constitutivamente expressam o receptor de interferon do tipo | (por exemplo, células Hela e células 293T) são transitoriamente transfectadas com um vetor de ISRE-luciferase (PISRE-luc, Clontech).

Depois da transfecção, as células são tratadas com um polipeptídeo de interferon beta. Várias concentrações de proteínas, por exemplo de 0,0001 a 10 ng/mL, são testadas para gerar uma curva de resposta de dosagem. Se o polipeptídeo de interferon beta se liga e ativa o receptor de IFN, a cascata de transdução de sinal resultante induz a expressão de —luciferase. A luminescência pode ser medida de várias maneiras, por exemplo usando-se um leitor de microplaca TopCount?" ou Fusion" e Sistema de Ensaio de Luciferase Steady- Glo? (Promega).

Os polipeptídeos de IFN beta podem ser analisados quanto à sua capacidade de se ligar ao receptor de interferon do tipo | (IFNAR). O receptor de IFN pode ser preparado usando técnicas e métodos que são conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica. O receptor de hlFN pode ser preparado conforme descrito nas Patentes U.S. NS

6.566.132; 5.889.151; 5.861.258; 5.731.169; 5.578.707, as quais são incorporadas como referência neste relatório. Por exemplo, as células ou linhagens celulares que modulam o crescimento ou produção de antígeno da Classe | ou 1! do MHC em resposta ao hlFN ou se ligam a hIFN (incluindo mas não limitado às células contendo receptores de IFN ativos, tais como células Daudi linfoblastóides humanas ou células de produção do receptor de IFN " recombinantes) podem ser usadas para monitorar a ligação do receptor de hlFN. Para um polipeptídeo de IFN beta não PEGilado ou PEGilado compreendendo um aminoácido não natural, a afinidade do IFN beta a seu receptor pode ser medida usando-se um biossensor —BlAcore"" (Pharmacia). Ensaios de ligação adequados incluem, mas não são limitados aos ensaios BlAcore (Pearce et al, Biochemistry 38:81-89 (1999)) e ensaios AlphaScreenTY (PerkinElmer). AlphaScreenT“ é um ensaio de proximidade luminescente não radioativo com base pérolas onde as pérolas doadoras são excitadas por um laser a 680 nm para liberar oxigênio singleto. O oxigênio singleto difunde e reage com o derivado de tioxeno na superfície de pérolas aceitantes levando à emissão de fluorescência de -600 nm. A emissão de fluorescência ocorre apenas quando as pérolas doadoras e aceitantes são levadas em proximidade por interações moleculares que ocorrem quando cada uma é ligada ao ligante e receptor respectivamente. Esta interação ligante-receptor pode ser competida usando variantes de ligação ao receptor enquanto variantes não ligantes não competem.

Não obstante quais métodos são usados para criar os análogos de hlFN presentes, os análogos estão sujeitos aos ensaios para a atividade biológica. Os ensaios de timidina tritiada podem ser conduzidos para determinar o grau de divisão celular. Outros ensaios í biológicos, entretanto, podem ser usados para determinar a atividade desejada. Os polipeptídeos de IFN beta podem ser analisados quanto à sua atividade antiviral e/ou atividade antiproliferativa. Os ensaios antiproliferativos são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Basu et al. em Bioconjugate Chem (2006) 17:618-630 descrevem um ensaio antiproliferação usando células A549 e MTT para medir a proliferação. Ensaios biológicos, tais como avaliação quanto à capacidade de inibir a replicação viral, também fornecem indicação da atividade IFN. Os ensaios conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica também podem ser usados para avaliar a atividade biológica e efeitos colaterais potenciais de polipeptídeos de IFN beta da invenção. Platanias et al. em Experimental Hematology 1999; 27:1583-1592, que está incorporado como referência neste relatório, debatem as vias de sinalização ativadas por interferons incluindo a via Jak-Stat. Os ensaios avaliando a sinalização e vias a jusante da ligação do receptor de interferon podem ser usados para avaliar os polipeptídeos de IFN da invenção.

Os ensaios de replicação viral ou estudos in vivo podem ser realizados com polipeptídeos de IFN beta da invenção para triar a atividade antiviral. Os ensaios de replicação viral são conhecidos àqueles habilitados na técnica e podem envolver HCV (Vírus da Hepatite C),) VSV (Vírus da Estomatite Vesicular)) ou EMCV (Vírus da Encefalomiocardite). A redução do efeito citopático (CPE) de células, tais como células BHK21 de rim de hamster neonato infectadas com VSV, também pode ser medida com polipeptídeos de IFN beta. Várias linhagens celulares e algoritmos de cálculo podem ser . usados para determinar a potência nos ensaios de CPE. Comparações são feitas com padrões de referência e unidades internacionais conhecidos e podem ser calculadas. Outros ensaios in vitro podem ser usados para determinar a atividade biológica. No geral, o teste para atividade biológica deve fornecer análise para o resultado desejado, tal como aumento ou diminuição na atividade biológica (em comparação ao IFN beta não alterado), atividade biológica diferente (em comparação ao IFN beta não alterado), análise da afinidade do receptor ou análise da meia-vida no soro.

Outros ensaios incluem, mas não são limitados à neutralização do anticorpo da atividade antiviral, indução das atividades da proteína cinase, oligoadenilato 2,5-A sintetase ou fosfodiesterase (EP 41313, o qual está incorporado como referência neste relatório); ensaios imunomodulatórios (Pat. U.S. Nº 4.753.795, a qual está incorporada como referência neste relatório), ensaios de inibição do crescimento e ensaios de ligação com células que expressam os receptores de interferon (Patente U.S. Nº 7.144.574, a qual está incorporada como referência neste relatório).

Independentemente de quais métodos serão usados para criar os polipeptídeos de IFN beta, os polipeptídeos de IFN beta estão sujeitos aos ensaios para atividade biológica. No geral, o teste para atividade biológica deve fornecer análise do resultado desejado, tal como aumento ou diminuição na atividade biológica (em comparação ao IFN beta — modificado), atividade biológica diferente (em comparação ao IFN beta modificado), análise de afinidade do receptor ou par de ligação, mudanças conformacionais ou estruturais do IFN beta por si só ou de seu receptor (em comparação ao IFN beta modificado) ou análise da meia-vida no soro.

A compilação acima de referências para metodologias de ensaio não é exaustiva e aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão outros ensaios úteis para testar o resultado final desejado.

As alterações a tais ensaios são conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica.

Medição da Formação de Anticorpo para Polipeptídeos e Teste Pré-clínico para Imunogenicidade Ensaios para medir e avaliar a formação de anticorpos incluem, mas não são limitados aos bioensaios e ensaios de ligação.

Os bioensaios incluem, mas não são limitados aos ensaios que usam soro de pacientes animais ou pacientes para detectar anticorpos neutralizantes.

A capacidade de o soro neutralizar a atividade biológica da molécula exógena é medida.

Bioensaios com base em célula, por exemplo, podem medir a proliferação, citotoxicidade, sinalização ou liberação de citocina.

Os ensaios de ligação que detectam tanto anticorpos neutralizantes quanto não neutralizantes mensuram a capacidade deosoro se ligar à proteína exógena.

Os métodos para medir tais anticorpos incluem, mas não são limitados a ELISA.

A significância da presença destes anticorpos é debatida em : Schellekens, H et al.

Clinical Therapeutics 2002; 24(11):1720-1740, o qual está incorporado como referência neste relatório.

É Schellekens, H et al.

Clinical Therapeutics 2002; 24(11):1720-1740, o qual está incorporado como referência em sua totalidade, também debate testes animais em modelos primatas não humanos e em camundongo transgênico que expressam a proteína endógena humana assim como métodos de teste in vitro.

Whiteley et al. em J.

Clin.

Invest. 1989; 84:1550-1554, o qual está incorporado como referência neste relatório, debatem o uso de camundongos transgênicos em estudos de imunogenicidade com insulina humana.

Wadhwa, M. et al.

J of Immunol Metods 2003; 278:1-17, o qual está incorporado como referência neste relatório, debatem várias técnicas para a detecção e medição de imunogenicidade, tal como ressonância superficial com plásmons (SPR; Biacore), ensaios de radioimunoprecipitação (RIPA), imunoensaios, tais como imunoensaios de ligação à fase sólida, ELISA de ligação e competitivo e imunoblotting.

Outras técnicas incluem, mas não sãolimitadas à eletroquimioluminescência (ECL). Chirino et al.

DDT 2004; 9(2): 82-90, o qual está incorporado como referência neste relatório, descrevem os ensaios de ativação de células T ex vivo para investigar a imunogenicidade de produtos terapêuticos de proteína.

A absorção de proteínas de interferon do tipo selvagem e variantes por células apresentadoras de antígeno é monitorada.

Ensaios de ativação de células T ex vivo podem ser usados para quantificar experimentalmente a imunogenicidade.

Neste método, células apresentadoras de antígeno e células T naive de doadores combinados são provadas com um peptídeo ou proteína total de interesse uma ou mais vezes.

Então, a ativação de células T pode ser detectada usando vários métodos, por exemplo monitorando-se a produção de citocinas ou medindo-se a absorção de timidina tritiada.

Outros ensaios de células T adequados incluem aqueles divulgados em Meidenbauer, et al.

Prostate 43, 88-100 (2000); Schultes, B.

C e Whiteside, TL,J.

Immunol.

Methods 279, 1-15 (2003); e Stickler, et al., J.

Immunotherapy, 23, 654- 660 (2000). Os doadores PBMC usados para os ensaios de ativação de células T descritos acima podem compreender alelos da classe Il do MHC que são comuns em pacientes necessitando de tratamento para os distúrbios responsivos ao interferon beta.

Por exemplo, para a maioria de doenças e distúrbios, é desejável testar doadores compreendendo todos osalelosque são prevalentes na população.

Entretanto, para doenças ou distúrbios que são ligados com alelos do MHC específicos, pode ser mais apropriado focalizar a triagem em alelos que conferem suscetibilidade aos distúrbios responsivos ao interferon beta.

Os haplótipos do MHC de doadores ou pacientes PBMC que elevam uma resposta imune ao interferon beta podem ser comparados com os haplótipos do MHC de pacientes que não elevam uma resposta.

Estes dados podem ser usados para guiar estudos pré-clínicos e clínicos, assim como auxiliar na identificação de pacientes que provavelmente responderão E favorável ou desfavoravelmente ao produto terapêutico de interferon beta.

A imunogenicidade pode ser medida em sistemas de camundongo transgênicos.

Por exemplo, hi camundongos expressando moléculas do MHC da classe |l completa ou parcialmente humanas podem ser usados.

A imunogenicidade pode ser testada administrando-se as variantes de interferon beta a um ou mais animais, incluindo roedores e primatas e monitorando a formação de anticorpos.

Os primatas não humanos com haplótipos do MHC definidos podem ser especialmente úteis, como as sequências e consequentemente especificidades de ligação ao peptídeo das moléculas do MHC em primatas não humanos — podem ser muito similares às sequências e especificidades de ligação ao peptídeo de seres humanos.

Similarmente, modelos de camundongo geneticamente engendrados expressando domínios de ligação ao peptídeo do MHC humanos podem ser usados (veja, por exemplo Sonderstrup et al.

Immunol.

Rev. 172: 335-343 (1999) e Forsthuber et al.

J.

Immunol. 167: 119-125 (2001)). Métodos adicionais para avaliar polipeptídeos da invenção são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

Xl.

Medição de Potência, Meia-Vida Funcional In Vivo e Parâmetros Farmacocinéticos E Um aspecto importante da invenção é a meia-vida biológica prolongada que é obtida por construção do polipeptídeo de IFN beta com ou sem conjugação do polipeptídeo a uma porção de polímero solúvel em água.

A diminuição da pós-administração rápida de concentrações do polipeptídeo de IFN beta no soro tornou-se importante para avaliar respostas biológicas ao tratamento com polipeptídeo de IFN beta conjugado e não conjugado e variantes do mesmo. O polipeptídeo de IFN beta conjugado e não conjugado e variantes do mesmo da presente invenção podem ter meias-vidas no soro prolongadas, depois da administração por intermédio, por exemplo, de administração subcutânea ou i.v., tornando possível à medição, por exemplo, pelo método ELISA ou por um ensaio de triagem primário. Os kits ELISA ou RIA de fontes comerciais podem ser usados, tais como Invitrogen (Carlsbad, CA). A medição da meia-vida biológica in vivo é realizada, conforme descrito neste relatório.

A potência e meia-vida funcional in vivo de um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado podem ser determinadas de acordo com protocolos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

Os parâmetros farmacocinéticos para um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado podem ser avaliados em ratos machos Sprague-Dawley normais (N = 5 animais por grupo de tratamento). Os animais receberão uma única dosagem de 25 ug/rato iv ou 50 ug/rato sc e aproximadamente 5 a 7 amostras de sangue serão tomadas, de acordo com um curso de tempo pré-definido, geralmente de cerca de 6 horas para um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um f aminoácido que não ocorre naturalmente codificado não conjugado a um polímero solúvel em água e cerca de 4 dias para um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e conjugado a um polímero solúvel em água. Os dados farmacocinéticos para o IFN beta sem um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado podem ser diretamente comparados aos dados obtidos para os polipeptídeos de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

Basu et al. em Bioconjugate Chem (2006) 17:618-630 descrevem estudos farmacocinéticos e de imunogenicidade de polipeptídeos de IFN beta em camundongos e ratos. Os parâmetros farmacocinéticos também podem ser avaliados em um primata, por exemplo, macacos cinomolgos. Tipicamente, uma única injeção é administrada subcutânea — ouintravenosamente e níveis de IFN beta no soro são monitorados com o passar do tempo.

A atividade específica de polipeptídeos de IFN beta de acordo com esta invenção pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica das muteínas do polipeptídeo de IFN beta ou fragmentos das mesmas, obtidas e purificadas, de acordo com esta invenção, podem ser testadas por métodos descritos ou referenciados —nesterelatório ou conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

Os polipeptídeos de IFN beta podem ser analisados quando a sua eficácia em tratar um modelo animal de doença, tal como o modelo EAE de camundongo ou rato para esclerose múltipla. Um modelo animal, tal como o modelo encefalomielite autoimune experimental (EAE) comumente usado, pode ser utilizado para estabelecer a eficácia de um polipeptídeo da invenção. No modelo EAE, a imunização com mielina ou proteínas derivadas de mielina provoca uma doença imitando a maioria das características inflamatórias e neurológicas da esclerose múltipla em seres humanos. EAE foi usado em camundongos, ratos, coelhos e saguis (Cannella et al. PNAS, 95, 10100 5, 1998, Zaprianova et al. Morfologiia, 112, 25 8, 1997, Hassouna et al. J. Urology, 130, 806 10, 1983, Genain & Hauser J. Mol. Med. 75, 187 97, 1997). Outros modelos incluem o modelo de vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) (Murray et al. J. Neurosci. 18, 7306 14,1998)e podem ser usados para estabelecer a eficácia do polipeptídeo de IFN beta. XIV. Administração e Composições farmacêuticas Os polipeptídeos ou proteínas da invenção (incluindo mas não limitados ao IFN beta, sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais, etc.) são opcionalmente utilizados para uso terapêutico, incluindo mas não limitado em combinação com um portador farmacêutico adequado. Tais composições, por exemplo, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e um portador ou excipiente . farmaceuticamente aceitável. Um tal portador ou excipiente inclui, mas não é limitado à solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, e/ou E combinações dos mesmos. A formulação é preparada para se adequar ao modo de administração. No geral, métodos de administrar as proteinas são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica e podem ser aplicados para a administração dos polipeptídeos da invenção. As composições podem estar em uma forma solúvel em água, tal como aquela presente como sais farmaceuticamente aceitáveis, que incluem sais de adição de ácido e base.

Composições terapêuticas compreendendo um ou mais polipeptídeos da invenção são opcionalmente testadas em um ou mais modelos animais de doença in vitro e/ou in vivo apropriados, para confirmar a eficácia, metabolismo do tecido e para estimular as dosagens, de acordo com métodos conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas pela atividade, estabilidade ou outras medições adequadas de aminoácidos não naturais a homológos de aminoácidos naturais (incluindo mas não limitados à comparação de um polipeptídeo de IFN beta modificado que inclui um ou mais aminoácidos não naturais a um polipeptídeo de IFN beta de aminoácidos h naturais e comparação de um polipeptídeo de IFN beta modificado que inclui um ou mais aminoácidos não naturais a um tratamento de IFN beta correntemente disponível), isto é, em umensaiorelevante.

A administração ocorre por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula em contato íntimo com células do sangue ou tecido. Os

1 polipeptídeos de aminoácido não naturais da invenção são administrados em qualquer maneira adequada, opcionalmente com um ou mais portadores farmaceuticamente : aceitáveis. Os métodos adequados de administrar tais polipeptídeos no contexto da presente invenção a um paciente estão disponíveis, e, embora mais do que uma via possa ser usada para administrar uma composição particular, uma via particular pode frequentemente fornecer uma ação ou reação mais imediata e mais eficaz do que uma outra via.

Portadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular sendo administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composição. Consequentemente, há uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente invenção.

Os polipeptídeos de IFN beta da invenção podem ser administrados por qualquer via convencional adequada para proteínas ou peptídeos, incluindo, mas não limitada à via parenteral, por exemplo, injeções subcutâneas ou intravenosas ou qualquer outra forma de injeções ou infusões. As composições de polipeptídeo podem ser administradas por várias vias incluindo, mas não limitadas ao meio oral, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, : transdérmico, subcutâneo, tópico, sublingual ou retal. As composições compreendendo polipeptídeos de aminoácidos não naturais, modificados ou não modificados, também . podem ser administradas por intermédio de lipossomas. Tais vias de administração e formulações apropriadas geralmente são conhecidas àqueles de habilidade na técnica. o polipeptídeo de IFN beta pode ser usado sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, tais como um portador farmacêutico. O polipeptídeo de IFN beta pode ser usado em combinação com outros agentes ou produtos terapêuticos.

O polipeptideo de IFN beta compreendendo um aminoácido não natural, sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, também pode ser preparado em formulações de aerosso! (isto é, eles podem ser “nebulizados”) administradas por intermédio de inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.

As formulações adequadas para administração parenteral, tais como, por exemplo, . por via intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas, z isotônicas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente intencionado e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes espessantes, estabilizadores e preservantes. As formulações do IFN beta podem ser apresentadas em recipientes vedados de dosagem única ou dosagem múltipla, tais f como ampolas e frascos.

A administração parenteral e administração intravenosa são métodos preferidos de É administração.

Em particular, as vias de administração já em uso para produtos terapêuticos homólogos de aminoácido natural (incluindo mas não limitadas àquelas tipicamente usadas para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs por exemplo, IFN beta, interleucinas, anticorpos, FGFs, e/ou qualquer outra proteína farmaceuticamente liberada), junto com formulações em uso corrente, fornecem vias preferidas de administração e formulação para os polipeptídeos da invenção.

A dosagem administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, é — suficiente para ter um resposta terapêutica benéfica no paciente, com o passar do tempo, ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação.

A dosagem é determinada pela eficácia do vetor particular ou formulação e a atividade, estabilidade ou meia-vida no soro do polipeptídeo de aminoácido não natural utilizada e a condição do paciente, assim como o peso corpóreo ou área superficial do paciente a ser tratado.

O proporção da dosagem também é determinada pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um vetor e formulação particulares ou . semelhantes em um paciente particular.

Ao determinar a quantidade eficaz do vetor ou formulação a ser administrada no f tratamento ou profilaxia da doença (incluindo mas não limitada a cânceres, doenças hereditárias, diabetes, AIDS ou semelhantes), o médico avalia níveis plasmáticos circulantes, toxicidades da formulação, progressão da doença, e/ou, onde relevante, a produção de anticorpos de polipeptídeo de aminoácido anti-não naturais.

A dosagem administrada, por exemplo, a um paciente de 70 kg, está tipicamente na faixa equivalente às dosagens de proteínas terapêuticas correntemente usadas, ajustadas paraa atividade ou meia-vida no soro alterada da composição relevante.

Os vetores ou formulações farmacêuticas desta invenção podem suplementar as condições de tratamento em qualquer terapia convencional conhecida, incluindo administração de anticorpos, administração de vacinas, administração de agentes citotóxicos, polipeptídeos de aminoácido natural, ácidos nucléicos, análogos de nucleotídeo, modificadores de resposta —biológicae semelhantes. : Para administração, as formulações da presente invenção são administradas em uma taxa determinada pela LD-50 ou ED-50 da formulação relevante, e/ou observação de quaisquer efeitos colaterais dos polipeptídeos de aminoácido não naturais em várias concentrações, incluindo a massa e saúde global do paciente.

A administração pode ser realizada por intermédio de dosagens únicas ou divididas.

Se um paciente sofre infusão de uma formulação, o mesmo desenvolve febres, calafrios ou dores musculares e recebe a dosagem apropriada de aspirina, ibuprofeno,

acetaminofeno ou outro fármaco que controla dor/febre. Os pacientes que experienciam reações à infusão, tais como febre, dores musculares e calafrios são pré-medicados 30 minutos antes das infusões futuras com aspirina, acetaminofeno ou difenidramina. . Meperidina é usada para calafrios e dores musculares mais severos que não respodem rapidamente aos antipiréticos e anti-histamínicos. A infusão celular é reduzida ou . descontinuada dependendo da severidade da reação.

Os polipeptídeos de IFN beta humanos da invenção podem ser diretamente administrados a um paciente mamífero. A administração é feita por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir o polipeptídeo de IFN beta em um paciente. As composições de polipeptídeo de IFN beta, de acordo com as modalidades da presente invenção, incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica ou por inalação (por intermédio de um aerossol), bucal (incluindo sub-lingual), vaginal, parenteral (subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-articular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial ou intravenosa), tópica (isto é, tanto superfícies da pele quanto da mucosa, incluindo superfícies aéreas), pulmonar, intraocular, intranasal e transdérmica, embora a via mais adequada em qualquer caso fornecido dependerá da natureza e severidade da condição sendo tratada. A administração pode ser local ou sistêmica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes vedados de dosagem única ou dosagem múltipla, tais como ampolas e frascos. Os polipeptídeos de IFN beta da invenção podem ser preparados em uma mistura em uma forma injetável de dosagem única (incluindo mas não limitada à solução, suspensão ou emulsão) com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídeos de IFN beta da invenção também podem ser administrados por infusão contínua (usando minibombas, tais como bombas osmóticas), bolo único ou formulações de depósito com liberação lenta.

Formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica e suspensões estéreis aquosas E e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes espessantes, estabilizadores e preservantes. Soluções e suspensões podem ser preparadas . 30 naforma de pós, grânulos e tabletes estéreis do tipo previamente descritos.

A liofilização é uma técnica comumente utilizada para apresentar proteínas que servem para remover água da preparação da proteína de interesse. A liofiização é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e depois o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação em um ambiente a vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações pré-liofilizadas para realçar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou para aperfeiçoar a estabilidade do produto liofilizado na armazenagem. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991).

' A secagem por pulverização de produtos farmacêuticos também é conhecida àqueles de habilidade comum na técnica. Por exemplo, veja, Broadhead, J. et al., “The Ê Spray Drying of Pharmarceuticals”, em Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992). Além dos produtos farmacêuticos de molécula pequena, uma variedade de materiais — biológicos foram secos por pulverização e estes incluem: enzimas, soro, plasma, micro- organismos e leveduras. A secagem por pulverização é uma técnica útil, pois esta pode converter uma preparação farmacêutica líquida em um pó fino ou aglomerado em um processo de etapa única. A técnica básica compreende as quatro etapas seguintes: a) atomização da solução alimentadora em uma pulverização; b) contato com o ar da pulverização; c) secagem da pulverização; e d) separação do produto seco a partir do ar seco. As patentes U.S. Nº 6.235.710 e 6.001.800, as que são incorporadas como referência neste relatório, descrevem a preparação de eritropoietina recombinante pela secagem por pulverização.

As composições farmacêuticas e formulações da invenção podem compreender um portador, excipiente ou estabiizador farmaceuticamente aceitável. Portadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular . sendo administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composição. Consequentemente, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (incluindo portadores, excipientes ou estabilizadores —farmaceuticamente aceitáveis opcionais) da presente invenção (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17º ed. 1985).

Portadores adequados incluem, mas não são limitados aos tampões contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo, mas não limitados ao ácido ascórbico; —polipeptídeos de baixo peso molecular, incluindo, mas não limitados àqueles menores do que cerca de 10 resíduos; proteínas, incluindo mas não limitadas à albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, incluindo, mas não limitados a polivinilpirrolidona; aminoácidos, incluindo, mas não limitados à glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina ou derivados de histidina, metionina, glutamato ou lisina; monossacarídeos, —dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo, mas não limitados a trealose, sacarose, F glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, incluindo, mas não limitados a EDTA e edetato dissódico; íons metálicos bivalentes, incluindo, mas não limitados a zinco, cobalto . ou cobre; álcoois de açúcar, incluindo, mas não limitados a manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, incluindo, mas não limitados a cloreto de sódio e sódio; enchedores, tais como celulose microcristalina, lactose, milho e outros amidos; agentes de ligação; adoçantes e outros agentes flavorizantes; agentes corantes; e/ou tensoativos não iônicos, incluindo, mas não limitados a Tween'" (Tween 80 (polissorbato 80) e Tween 20 g (polissorbato 20), Pluronics"" e outros ácidos plurônicos, incluindo, mas não limitados ao ácido plurônico F68 (poloxâmero 188) ou PEG. Tensoativos adequados incluem, por : exemplo, poliéteres com base em polilóxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), isto é, (PEO-PPO-PEO) ou poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), isto é, (PPO-PEO-PPO) ou uma combinação dos mesmos. PEO-PPO-PEO e PPO-PEO-PPO estão comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais PluronicsY, R- Pluronics"", Tetronics"" e R-Tetronics Tv (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) e são adicionalmente descritos na Pat. US. Nº 4.820.352, integralmente incorporada como referência neste relatório. Outros polímeros em bloco de etileno/polipropileno podem ser —tensoativos adequados. Um tensoativo ou uma combinação de tensoativos pode ser usado para estabilizar o IFN beta PEGilado contra um ou mais estresses, incluindo, mas não limitado ao estresse que resulta da agitação. Alguns dos precedentes podem ser referidos como “agentes encorpantes”. Alguns também podem ser referidos como “modificadores de tonicidade”. Preservantes antimicrobianos também podem ser aplicados para a estabilidade e efetividade antimicrobiana do antimicrobiano; preservantes adequados incluem, mas não são limitados ao álcool benzílico, cloreto de benzalcônio, metacresol, metil/propilparabeno, . cresol e fenol ou uma combinação dos mesmos. A Patente U.S. Nº 7.144.574, a qual está incorporada como referência neste relatório, descreve materiais adicionais que podem ser adequados em composições e formulações farmacêuticas da invenção e outras preparações deliberação.

Os polipeptídeos de IFN beta da invenção, incluindo aqueles ligados a polímeros solúveis em água, tais como PEG, também podem ser administrados por, ou como parte de sistemas de liberação sustentada. Composições de liberação austentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, incluindo, mas não limitados a películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação austentada incluem materiais biocompatíveis, tais como poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et a/., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etileno vinil acetato (Langer et al., supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988), polilactídeos (ácido poliláctico) (Patente U.S. Nº 3.773.919; EP 58.481), poliglicolideo (polimero de ácido glicólico), — polilactpideo/coglicolideo (copolímeros de ácido láctico e glicólico ácido) polianidridos, . copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et a/., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(forto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de 2 condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, polissacarídeos, ácidos t nucléicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, — polinucleotídeos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona e silicona. Composições de liberação austentada também incluem um composto lipossomicamente capturado. Lipossomas contendo o composto são preparados por métodos conhecidos: DE 3.218,121; Eppstein et f al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et a/l., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; Patente U.S. Nº 4.619.794; EP á 143.949; Patente U.S. Nº 5.021.234; Pedido de Patente Japonês 83-118008; Pat. U.S. Nº

4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. Todas as referências e patentes citadas são incorporadas como referência neste relatório.

Polipeptídeos de IFN beta lipossomicamente capturados podem ser preparados por métodos descritos, por exemplo, em DE 3.218.121; Eppstein et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; Patente U.S. Nº 4.619.794: EP 143.949; Patente U.S. Nº

5.021.234; Pedido de Patente Japonês 83-118008; Patentes U.S. Nº 4.485.045 e

4.544.545; e EP 102.324. A composição e tamanho dos lipossomas são bem conhecidos ou capazes de ser facilmente determinados empiricamente por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Alguns exemplos de lipossomas, conforme descrito, por exemplo, em Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D e Papahadjopoulos D(eds): Medical applications of liposomes (1998); Drummond DC, et a/., Lipossomal drug delivery systems for cancer therapy, em Teicher B (ed): Câncer drug discovery and - development (2002); Park JW, et a/., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et a/., Cancer Res. 63: 3154- ã 3161 (2003). Todas as referências e patentes citadas são incorporadas como referência —nesterelatório. Várias formulações do IFN beta foram descritas, incluindo, mas não limitadas às formulações intranasais, formulações em hidrogel! e formulações líquidas (veja, WO 2005/120551, WO 2005/110466 e WO 2005/058346, os quais são incorporados como referência neste relatório). Outras formaulações são debatidas no WO 95/31479 e WO 95/31213, os quais são incorporados como referência neste relatório.

A dosagem administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para causar uma resposta benéfica no paciente, com o passar do tempo. Geralmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz total do polipeptídeo de IFN beta da presente invenção administrado parenteralmente por dose está na faixa de cerca de 0,01 uglkg/dia a cerca de 100 yg/kg ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, do peso — corpóreo do paciente, embora esta esteja sujeita à discrição terapêutica. A frequência da dosagem também está sujeita à discrição terapêutica e pode ser mais frequente ou menos frequente do que os produtos de polipeptídeo de IFN beta comercialmente disponíveis - aprovados para o uso em seres humanos. Geralmente, um polipeptídeo de IFN beta : PEGilado da invenção pode ser administrado por qualquer uma das vias de administração descritas acima. XV. Usos terapêuticos dos Polipeptídeos de IFN beta da invenção Os polipeptídeos de IFN beta da invenção são úteis para tratar uma faixa ampla de

É distúrbios. Os polipeptídeos de IFN beta da invenção podem ser administrados a indivíduos i com esclerose múltipla. Eles podem ser usados como um tratamento para uma variedade de malignidades, cânceres, tumores ou angiogênese tumoral, tais como leucemia mielóide aguda, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, carcinoma das células basais, carcinoma ovariano, displasia cervical, carcinoma cervical, pPapilomatose laríngea, micose fungóide, glioma, leucemia mielóide aguda, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, melanoma, carcinoma da mama, câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma maligno (adjuvante, último estágio, assim como profilático), tumor carcinóide, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma folicular, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crônica, carcinoma de células renais, câncer de bexiga superfícial recorrente, carcinoma colorretal, tricoleucemia e osteossarcoma. IFN beta pode ser usado como um agente terapêutico contra uma variedade de infecções virais, incluindo, mas não limitadas à hepatite viral, herpes zoster e genital, papilomavírus, encefalite viral, pneumonia por citomegalovirus, ceratite herpética, herpes simples, hepatite crônica persistente por rinovírus, HCV crônica ativa (tipo 1), HCV crônica ativa (tipo 11) e hepatite B crônica, colite ulcerativa, síndrome de . Guillain-Barre, glioma, fibrose pulmonar idiopática, crescimento celular anormal ou para imunomodulação. : Os polipeptídeos de IFN beta da invenção podem ser usados para o tratamento de — esclerose múltipla (MS), tal como qualquer um dos quatro tipos geralmente reconhecidos de MS (benigna, MS nas forma surto-remissão (RRMS), MS progressiva primária (PPMS) e MS progressiva secundária (SPMS)) e para MS monossintomática), câncer ou tumores, hepatite, por exemplo, hepatite B e hepatite C ou uma infecção por herpes (o tratamento mais recente opcionalmente sendo combinado com um tratamento com 11-10).

Além disso, a invenção inclui um método de tratar um mamífero que tem anticorpos circulantes contra IFN beta 1a, por exemplo, Avonex"" ou Rebif"" ou contra IFN beta 1b, por exemplo, Betaseron'Y. Tal método envolve a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de IFN beta que tem uma reação reduzida ou nenhuma reação com os ditos anticorpos. Os mamíferos tratados podem sofrer de qualquer uma das doenças listadas acima ou qualquer condição em que IFN beta é um tratamento útil. Também " incluído nesta invenção está um método de preparar um produto farmacêutico para o uso em tratamento de mamíferos tendo anticorpos circulantes contra IFN beta 1a, por exemplo, - AvonexT" ou Rebif"" ou contra IFN beta 1b, por exemplo, Betaseron'". Os polipeptídeos de iÚ IFN beta da presente invenção que têm uma reação reduzida ou nenhuma reação com tais anticorpos circulantes (por exemplo, a reação é reduzida em pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 75 % ou pelo menos cerca de 100 % (isto é, nenhuma reação) são formulados em uma formulação injetável ou de outro modo

7 adequada. Anticorpos, em particular anticorpos neutralizantes, formados em um mamífero em resposta ao tratamento com qualquer uma das preparações de IFN beta comercialmente Ô disponíveis (Rebifº, Betaseronº, Avonex*) podem ser referidos como “anticorpos circulantes”.

O WO 2007/042602, o qual está incorporado como referência neste relatório, descreve o uso de IFN beta para a prevenção ou tratamento de lesão de isquemia reperfusão ou falência múltipla dos órgãos. Várias condições, incluindo lesões abdominais, infecção intestinal, cirurgia cardiovascular e choque, podem levar à lesão de isquemia reperfusão intestinal (IRI). Além de causar lesão local, a IRI também ativa a resposta inflamatória sistêmica em órgãos remotos resultantes em uma síndrome chamada falência múltipla dos órgãos. Nesta síndrome, os pulmões são especialmente vulneráveis. À publicação da Patente US Nº US 2004/0105843, a qual está incorporada como referência neste relatório, descreve o uso de interferon beta em hipoxia/ischemia relacionada à resistência do fluxo sanguíneo em um paciente.

O WO 2007/025991, o qual está incorporado como referência neste relatório, descreve um método para tratar um paciente tendo neurite óptica desmielinizante (DON) - compreendendo a administração sequencial ou simultânea de um composto de esteróide e uma proteína de interferon-beta. Além disso, pacientes com manifestações de EM precoce (neurite óptica) foram beneficiados com o tratamento de IFN beta.

O WO2006/064026, o qual está incorporado como referência neste relatório, descreve o uso de IFN beta para tratar indivíduos infectados com HCV que não receberam tratamento prévio com IFN alfa.

O WO 2003/075944 descreve polipeptídeos do tipo interferon beta para o tratamento de acidente vascular cerebral ou ataque isquêmico transitório. IFN beta — combinado com outros agentes pode ser usado, incluindo interferon beta em combinação com fator XIII para tratar doença inflamatória intestinal por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn; IFN beta com um antagonista de IL-2R para doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla; ou IFN beta com ribavirina (veja, WO 2004/017921; WO 2004/002500; WO 2004/075903, os quais são incorporados como referência neste relatório).

— Os polipeptídeos de IFN beta podem ser usados para monoterapia de CML, monoterapia de UV linfoma de células B, terapia de linfoma folicular, monoterapia de hepatite C, monoterapia de mieloma múltiplo ou monoterapia de carcinoma renal. Os polipeptídeos de IFN beta podem . ser usados em combinação com citarabina para terapia de CML, em combinação com regimes com base em doxorrubicina para terapia de linfoma de células B, como um adjunto —àregiãodo tipo CHOP para terapia de linfoma folicular, em combinação com ribavirina para terapia de hepatite C, em combinação com VBMCP, BCNU ou VBMCP+HIiCy para terapia de mieloma múltiplo ou em combinação com Vinblastina, floxuridina, 5-fluoruouracil ou IL-10

' para terapia de carcinoma renal. Quantidades médias do IFN beta podem variar e, em particular, devem ser É apresentadas com base nas recomendações e prescrição de um médico qualificado. À quantidade exata do IFN beta é uma questão de preferência sujeita a fatores, tais como o tipo exato de condição sendo tratada, a condição do paciente sendo tratado, assim como os outros ingredientes na composição. A invenção também inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente ativo. A quantidade fornecida pode ser facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica, com base na terapia com IFN beta. Composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas em uma maneira convencional.

EXEMPLOS Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, porém não limitar a invenção reivindicada. Exemplo 1 Este exemplo descreve alguns dos muitos conjuntos potenciais de critérios para a ' seleção de sítios de incorporação dos aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados em IFN beta. Com base na análise da estrutura cristalina com PDB ID 1AU1, sete sítios foram selecionados: 28, 36, 76, 80, 107, 108 e 111 para a substituição com a p-acetilfenilalanina do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Veja, Figura 1. O resíduo 80 (N80) é um sítio de glicosilação. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação das mesmas da SEQIDNO:1ouos aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitado às posições: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Em uma análise separada, valores de Cx médios foram calculados para o interferon " beta com base na estrutura cristalina com PDB ID 1AU1. Usando o programa Cx (Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, pág. 980), a extensão da protusão para cada átomo da , proteína foi avaliada. As coordenadas para esta estrutura estão disponíveis no Banco de Dados de Proteína (PDB) (Bernstein et al. J Mol. Biol. 1997, 112, pág. 535). Karpusas, M., —Nolte M., Benton, C.B., Meier, W., Lipscomb, W.N., Goelz, S. descrevem a estrutura cristalina do interferon beta humano em Proc Natl Acad Sci 1997 94:11813-11818. Os critérios seguintes foram usados para avaliar cada posição de interferon beta para a

] introdução de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado: o resíduo (a) não  deve interferir com a ligação do receptor de IFN com base na análise estrutural, b) não deve ser afetado por mutagênese de varredura de alanina ou de homólogo (c) deve ser exposto à superfície e exibir interações de união de van der Waals ou de hidrogênio mínimas com — resíduos adjacentes, (d) deve ser suprimido ou variável em variantes de interferon beta, (e) resultaria em mudanças conservativas na substituição com um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e (f) pode ser encontrado em regiões altamente flexíveis ou regiões estruturalmente rígidas.

O seguinte representa os resíduos envolvidos com as hélices diferentes: resíduos 2 a22(Hélice A); resíduos 51 a 71 (Hélice B); resíduos 80 a 107 (Hélice C); resíduos 118 a 136 (Hélice D); e resíduos 139 a 162 (Hélice E). O “loop” AB pode ser representado como segmentos-AB1 (resíduos 23 a 35), AB2 (resíduos 36 a 40); e AB3 (resíduos 41 a 50) O interferon beta é glicosilado na posição 80 (Asn80). Uma cisteína livre está na posição 17 (Cys17) na sequência tipo selvagem de interferon beta.

A região de ligação ao anticorpo —neutralizante é os resíduos 41 a 49. Existem duas regiões de ligação putativas para o receptor de IFN (R2 de IFN alfa): 1) resíduos 25a35 e 2) resíduos 121 a 135. A região de M ligação putativa para R1 de IFN alfa é: resíduos 80 a 100. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes no IFN beta: antes da posição 1 (isto é,no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 6 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113,114,115,116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente t codificados são incorporados em qualquer posição em uma ou mais das regiões correspondentes seguintes às estruturas secundárias no interferon beta, como segue: Hélice . A (2 a 22); Hélice B (51 a 71); Hélice C (80'a 107); Hélice D (118 a 1 36); Hélice E (139a => 162); “loop” AB: AB1 (23 a 35); AB2 (36 a 40); AB3 (41 a 50) da SEQ ID NO: 1 ou os — aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4. Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 25 a 35, 80 a 100 e 121 a 135 do interferon beta (SEQ ID NO: 1

Ô ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4). Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 41 a 49 do interferon beta da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação das mesmas da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4. Veja, as Figuras 1 e 2 e a Tabela 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados são incorporados em uma ou mais das posições seguintes do IFN beta: 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido natural.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma substituição C17S (serina por uma cisteína na posição 17) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 3 e 4. Em algumas modalidades, o ' Polipeptídeo da invenção compreende uma substituição C178S (serina por uma cisteina na posição 17) e uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido natural.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre — substituição, adição ou deleção do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado na sequência sinal.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que não ocorre naturalmente codificado na sequência sinal da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que ocorre naturalmente codificado na sequência sinal da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados na sequência líder ou sinal da SEQ ID NOs: 4 ou outra sequência de IFN beta.

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas às posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, J 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, o 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, —107,108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160,

' 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4 ou os aminoácidos correspondentes em uma outra sequência de IFN beta).

Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou —mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitadas a: Hélice A (2 a 22); Hélice B (51 a 71); Hélice C (80 a 107); Hélice D (118 a 136); Hélice E (139 a 162); “loop” AB: AB1 (23 a 35); AB2 (36 a 40); AB3 (41 a 50) da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4. Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitado aos resíduos 25 a 35, 80 a 100 e 121 a 135 do interferon beta (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO: 3 e 4).

Em outras modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas regiões é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitado aos resíduos 41 a 49 do interferon beta da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NO 3ed4 Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não : limitado às posições: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID , NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo mas não limitado às posições: 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). Em algumas modalidades, o aminoácido que não ocorre naturalmente na sequência sinal ou líder é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 4 ou outra sequência de IFN beta).

A sequência de aminoácidos do IFN beta sem uma sequência/peptídeo líder ou sinal, porém com uma substituição C17S é mostrada como SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos do IFN beta sem uma sequência/peptídeo líder ou sinal e sem uma substituição C17S é mostrada como SEQ ID NO: 3. À sequência de aminoácidos do IFN beta com uma sequência/peptídeo líder ou sinal e sem uma substituição C17S é mostrada —comoSEQIDNO:4.

: Nº do ' Aa Cx Médio Resíduo Posição Aa A A RO o A ea A E RE ERA EA da AA REL AIEA OO EE ara RS RA o TA Es fes TAS ne

: Resíduo ANANENAN Ma E TR en) oras | Rego dee Tenaae | Es ca Toa E Se OA A A aa o ETR MIO E ae RR Rr ES AE | RICO ao TITE EL a NISTO Eneas aee Exemplo 2 Este exemplo detalha a clonagem e a expressão de um polipeptídeo de IFN beta incluindo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado em E. coll. Este exemplo também descreve métodos para avaliar a atividade biológica de polipeptídeos de IFN beta “5 modificados.

Os métodos para clonar IFN beta são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. As sequências de polipeptídeo e polinucleotídeo para IFN beta e clonagem do IFN beta em células hospedeiras, assim como a purificação do IFN beta são detalhadas em Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), Patente US Nº 7.144.574; 6.531.111;

4.966.843; 5.376.567; 5.795.779; 7.144.574; 4.462.940; 4.894.330; 4.518.584; 5.702.699;

6.962.978; 5.814.485; 6.887.462; 6.800.735; 6.514.720: e Publicação U.S. Nº US2002/0137895, US2004/0115169 e US2005/0054053, os quais são integralmente incorporados como referência neste relatório.

O cDNA que codifica o IFN beta sem uma sequência líder ou sinal e com uma substituição C17S é mostrado como SEQ ID NO: 2. As modificações na sequência do gene de IFN do tipo selvagem foram preparadas na extremidade 5' para torná-la mais rica em A-T nos quatro primeiros códons. Estas modificações na extremidade 5' não alteraram a sequência de aminoácidos. O polipeptídeo codificado por esta sequência é mostrado como e SEQ ID NO: 1. A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de aminoácidos do IFN beta sem uma sequência é líder ou sinal e sem uma substituição C17S. i É A SEQ ID NO: 4 é uma sequência de aminoácidos do IFN beta com uma sequência líder e sem uma substituição C17S. Um sistema de tradução introduzido, o qual compreende um tRNA ortogonal (O- tRNA) e uma aminoacil-RNA sintetase ortogonal (O-RS) é usada para expressar IFN beta

À contendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

A O-RS preferencialmente aminoacila o O-(RNA com um aminoácido que não ocorre naturalmente : codificado.

Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado no IFN beta, em resposta à um códon seletor codificado.

As sequências de O-RS e O-t(RNA adequadas são descritas no WO 2006/068802 intitulado “Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof' (E9-SEQ ID NO: 5 & D286R mutante de E9-SEQ ID NO: 24) e WO 2007/021297 intitulado “Compositions of tRNA and Uses Thereof' (F13; SEQ ID NO: 6), os quais são integralmente incorporados como referência neste relatório.

Tabela 3: Sequências de O-RS e O-tRNA.

Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de p-azido-L- SEQ ID NO: 10 fenilalanina RS p-Az-PheRS(6) ' Aminoacil-lRNA sintetase para a incorporação de p-benzoil-L- SEQ ID NO: 11 fenilalanina RS Pp-BpaRS(1) Aminoacil-RNA sintetase para a incorporação de propargil- SEQ ID NO: 12 fenilalanina RS Propargil-PheRS Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de propargil- SEQ ID NO: 13 fenilalanina RS Propargil-PheRS Aminoacil-RNA sintetase para a incorporação de propargil- SEQ ID NO: 14 fenilalanina RS Propargil-PheRS Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de p-azido- SEQ ID NO: 15 fenilalanina RS - p-Az-PheRS(1) Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de p-azido- i SEQ ID NO: 16 fenilalanina Á RS p-Az-PheRS(3) Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de p-azido- SEQ ID NO: 17 fenilalanina RS P-Az-PheRS(4)

É Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de p-azido- : SEQ ID NO: 18 fenilalanina RS p-Az-PheRS(2) fenilalanina (LW1) fenilalanina (LWS5) fenilalanina (LW6) fenilalanina (AzPheRS-5) Aminoacil-tRNA sintetase para a incorporação de p-azido- SEQ ID NO: 23 RS A ameno oo "| A transformação de E.

Coli com plasmídeos contendo a sequência de polinucleotídeo de IFN beta modificado e o par de aminoacil-"RNA sintetase/tRNA ortogonal (específico para o aminoácido desejado que não ocorre naturalmente codificado) possibilita f a incorporação específica do sítio de aminoácidos que não ocorrem naturalmente — codificados no polipeptídeo de IFN beta.

A expressão de polipeptídeos de IFN beta ocorreu sob o controle do promotor T7. Supressão com para-acetil-fenilalanina (pAF) Os constructos de expressão foram gerados com base na sequência de polipeptídeos mostrada como SEQ ID NO: 3. Cada constructo apresentou um códon de parada âmbar que geraria um polipeptideo de IFN beta com uma substituição de aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados em uma destas posições: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111. Os plasmídeos para os polipeptideos de IFN beta da expressão foram transformados em células de E.

Coli BL21DE3. A para-acetil-fenilalanina (pAF) foi adicionada às células e a expressão de proteína foi induzida.

A análise por SDS PAGE da expressão de polipeptídeos de IFN beta é mostrada na Figura 3 e os polipeptídeos de IFN beta são marcados com uma seta.

Banda 1 — Polipeptídeo de IFN beta do tipo selvagem . original (sequência de polinucleotídeos obtida da CODA, Laguna Hills, CA); Banda 2 — L28pAF; Banda 3 — M36pAF; Banda 4 — S76pAF; Banda 5 — N80pAF; Banda 6 — E107pAF; “* 20 Banda7- K108pAF; Banda 8- F111pAF; Banda 9 — IFN beta do tipo sevagem com extremidade 5' otimizada.

Para os polipeptídeos de IFN beta substituídos por pAF, L28pAF, por exemplo, refere-se a um polipeptídeo de IFN beta com uma substituição de para- acetilfenilalanina na posição 28 (leucina) (veja, SEQ ID NO: 3 para a sequência original antes da substituição). Os polipeptídeos de IFN seguintes mostrados na Figura 3 não f apresentaram uma substituição C17S: L28pAF, M36pAF, S76pAF, N80OpAF, E107pAF, K108pAF e F111pAF.

A sequência de polinucleotídeos obtida da CODA não foi a sequência de polinucleotídeos de IFN beta nativa, ainda que a sequência de aminoácidos de IFN beta resultante da sequência de polinucleotídeo tenha sido inalterada.

Para a amostra apresentada na Banda 9, os quatro primeiros códons da sequência de polinucleotídeo de IFN beta foram modificados, de modo que esta região apresentou-se mais rica em A-T, ainda que a sequência de aminoácidos de IFN beta tenha sido inalterada.

Os plasmídeos para os polipeptídeos de IFN beta da expressão também foram transformados em células de E.

Coli W3110-B2. A expressão da T7 polimerase manteve-se sob controle de um promotor induzível por arabinose, para-acetil-fenilalanina (pAF) foi adicionada às células e a expressão de proteína foi induzida pela adição de arabinose (0,2 % final). As culturas foram incubadas durante 5 horas a 37 ºC.

À partir de uma cultura em frasco de 1 litro, 100 a 200 mg de corpos de inclusão foram isolados.

A Figura 4 mostra a análise por SDS PAGE do lisato total (TL), sobrenadante (S) e pelota (P) a partir da supressão em células de E.

Coli W3110-B2; uma seta indica os polipeptídeos de IFN beta produzidos.

Bandas 1 e 8 - Marcadores; Banda 2 — TL de IFN beta do tipo selvagem com as - modificações na extremidade 5' rica em A-T na sequência de polinucleotídeos; Banda 3 - S de IFN beta do tipo selvagem com as modificações na extremidade 5' rica em A-T na É sequência de polinucleotídeos; Banda 4 - P de IFN beta do tipo selvagem com as modificações na extremidade 5' rica em A-T na sequência de polinucleotídeos; Banda 5 — TL do IFN beta com substituição N80pAF e com as modificações na extremidade 5' rica em A-T na sequência de polinucleotídeos; Banda 6 — S do IFN beta com substituição NS80pAF e com as modificações na extremidade 5' rica em A-T na sequência de polinucleotídeos; Banda 7 — P do IFN beta com substituição N80pAF e com as modificações na extremidade 5' rica em AT na sequência de polinucleotídeos.

Nenhum dos constructos codificaram para a substituição C17S.

Constructos Adicionais Os constructos de expressão foram gerados com a sequência de polinucleotídeos de IFN beta com uma extremidade 5' rica em A-T, que codifica a mutação C178S e os códons —seletores para uma substituição de aminoácido não natural.

Os polipeptídeos de IFN beta : gerados com estes constructos foram isolados e PEGilados.

Solubilização da Prep. do Corpo de Inclusão - As massas celulares foram recolocadas em suspensão misturando-se em um sólido final 10 % em Tampão | de corpo de inclusão (1B) 4 ºC (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; —EDTA1 mM; Triton X-100 1%; 4 ºC). As células foram lisadas passando-se o material recolocado em suspensão através de um microfluidizador em um total de duas vezes.

As amostras foram centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 ºC) e os sobrenadantes foram

1 decantados.

As pelotas do corpo de inclusão foram lavadas recolocando-se em suspensão ó em um volume adicional de tampão | 1B (Tris 50 MM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; Triton X-100 1 %; 4ºC) e os materiais recolocados em suspensão foram passados através do microfluidizador em um total de duas vezes.

As amostras depois foram centrifugadas S (14.000 g; 15 minutos; 4ºC) e os sobrenadantes foram decantados.

As pelotas do corpo de inclusão foram recolocadas em suspensão em um volume de tampão |! (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 MM; EDTA 1 mM; 4ºC). As amostras foram centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 “*C) e os sobrenadantes foram decantados.

As pelotas do corpo de inclusão foram recolocadas em suspensão em */, volume de tampão |! (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 MM; 4 ºC). Os corpos de inclusão depois foram fracionados em recipientes apropriados.

As amostras foram centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 ºC) e os sobrenadantes foram decantados.

A corpos de inclusão foram solubilizados ou armazenados a -80 ºC até o próximo uso.

Solubilização do Corpo de inclusão Os corpos de inclusão foram solubilizados em uma concentração final entre 10 a 15 mg/mL em tampão de solubilização (Tris 20 mM, pH 8,0; Guanidina 8 M; B-ME 10 mM). Os corpos de inclusão solubilizados depois foram incubados na temperatura ambiente sob mistura constante durante 1 hora ou até que se apresentaram completamente solubilizados. : As amostras depois foram centrifugadas (10.000 g; 20 minutos; 4 ºC) para remover qualquer material não solubilizado.

À concentração de proteina de cada amostra depois foi ajustada por diluição com tampão de solubilização adicional, se a concentração de proteína for alta.

Redobra A redobra foi realizada diluindo-se as amostras em uma concentração de proteína final de 0,5 mg/mL em Tris 20 mM, pH 8,0; Sacarose 60 %; 4 ºC.

A redobra foi deixada duranteSdiasad4"C, Purificação O material redobrado foi diluído 1:1 com H2O MÍilli-Q.

O material foi filtrado através de um filtro PES 0,22 um e carregado em uma coluna Blue Sepharose FF (GE Healthcare), equilibrado em Tris 20 mM, pH 8,0; NaCl 0,15 M (tampão A). Até o fluxo, a coluna foi lavada —com5 volumes de coluna de tampão B 30 % (Tris 20 mM, pH 8,0; NaCl 2 M; Etilenoglico! 50 : %). Os polipeptídeos de IFNS foram eluídos lavando-se a coluna com 10 volumes de coluna de tampão B 100 %. - PEGilação e Purificação Á O “pool” de IFNB foi tomado e diluído 10x com água MIlli-Q.

O pH de cada amostra foiajustadoa4,0 com ácido acético glacial 50 %. As amostras foram concentradas até -1,0 mg/mL.

O PEG ativado por excesso molar 1:12 (hidroxilamina-PEG) foi adicionado a cada amostra.

As amostras depois foram incubadas a 27 ºC de 48 a 72 horas.

As amostras foram

E tomadas e diluídas 8 a 10 vezes com água (<8 m/S) e carregadas em uma coluna SP HP & (GE Healthcare) equilibradas em Tampão A (NaAc 50 mM, pH 6,0; NaCl 50 mM; Zwittergente 3-14, 0,05 %). Os polipeptídeos de IFN$ foram eluídos com 5 volumes de coluna de tampão B (NaAc 50 mM, pH 6,0; NaCl 500 mM; Zwittergente 3-14, 0,05 %). As frações de IFNB foram agrupadas e conduzidas em uma coluna calibrada Superdex 200, equilibradas em tampão de armazenamento de IFN8 (NaAc 20 mM, pH 5,0; NaCl 150 mM; Zwittergente 3-14, 0,05 %). O material PEGilado foi coletado e armazenado a 4ºC, A Figura 5 mostra polipeptídeos de IFN beta antes e depois da PEGilação: Banda 1: IFN beta com substituição C17S; Banda 2: IFN beta com substituições C17S e L28pAF; Banda3:1IFN beta com substituições C17S e M36pAF; Banda 4: IFN beta com substituições C17S e S76pAF; Banda 5: IFN beta com substituições C17S e F111pAF; Banda 6: IFN beta com PEG C178S e L28pAF-30K; Banda 7: IFN beta com PEG C17S e M36pAF-30K; Banda 8: IFN beta com PEG C17S e S76pAF-30K; Banda 9: IFN beta com PEG C17S e F111pAF- 30K.

As moléculas PEGiladas foram conjugadas na posição mostrada para pAF.

À sequência de polinucleotídeos para todos estes polipeptídeos de IFN beta apresentou as modificações na extremidade 5' rica em A-T previamente mencionadas. à Estudos em Biacore (Afinidade de Ligação ao Receptor) A sequência para o domínio extracelular de IFNAR2 (que consiste de 206 " aminoácidos terminando com a sequência LLPPGOQ) foi amplificada a partir do clone MHS1011-61064 (OpenBiosystems, Huntsville, AL). Este inserto foi clonado no vetor de expressão pET20 (Novagen) a jusante do promotor T7. A expressão de proteína foi induzida com IPTG 0,4 mM em células BL21(DE3) (Novagen). Visto que a proteína expressada foi insolúvel, os corpos de inclusão foram purificados a partir de células lisadas e solubilizadas em GndCl 6 M.

Uma alíquota de 5 ml (quantidade de 50 mg) foireduzida com DTT 10 mM durante 45 minutos a 37 ºC.

Depois, a mistura foi injetada em 200 ml de tampão de redobra que consistiu de Tris 50 mM, pH 8, NaCl 20 mM, Arginina 0,5 M, glicerol 10 % a 4ºC e incubada durante a noite com agitação suave.

A reação de redobra depois foi concentrada a 25 ml usando uma célula de agitação Amicon e dialisada durante a noite contra Tris 20 mM, pH 8, NaCl 20 mM, glicerol 10 %. : IFNAR ECD rebobrado monomérico foi purificado em HP Q Sepharose usando o sistema AKTA FPLC (Amersham). IFNAR2 ECD purificado foi imobilizado em “chip” CM5 Biacore - usando um procedimento de ligação específica à lisina recomendado pelo fabricante.

Cerca de 200 RUs de proteína funcional foram imobilizados.

Várias concentrações de variantes de IFN beta em tampão HBS-EP (Biacore) foram injetadas em uma taxa de fluxo de 50 mel/minuto no fluxo celular contendo IFNAR2 imobilizado e um fluxo celular controle contendo albumina sérica bovina imobilizada.

Sensogramas gerados foram ajustados ao modelo de interação 1:1 para calcular os valores de Kon Kog & Kd usando o software BiaEvaluation (Biacore). Produtos de interferon alfa, PEGASYSº e Roferonº, foram incluídos como amostras controle. A Tabela 4 mostra a K; média obtida com os polipeptídeos de IFN beta. LTS oem [STS TSSPAFSOKPES | som | Ensaio Anti-Viral contra VSV A atividade antiviral dos polipeptídeos de IFN beta pode ser medida por uma " variedade de ensaios. A atividade antiviral dos polipeptídeos de IFN beta foi determinada usando o Vírus da Estomatite Vesicular (VSV). Os meios de cultura para este ensaio foram DMEM, FBS 10 %, Penicilina/Estreptomicina 1 %, HEPES 5 ml. Reagentes adicionais incluíram RPMI sem FBS e Vermelho de Fenol. A concentração de estoque de MTT usada foi de 5 mg/ml. em PBS. Esta solução-estoque foi armazenada durante apenas duas semanas a 4ºC. Células WISH humanas foram semeadas em 30.000 células/poço em 50 ul de meios de cultura. No dia seguinte, diluições em série 2x foram realizadas a partir dos —polipeptíideos de IFN beta em meios de cultura. IFN beta com uma substituição de aminoácido natural C17S foi usado como um controle nestes experimentos. Em triplicata, 100 uL dos polipeptídeos de IFN beta diluídos foram adicionados às células WISH para um volume do poço final de 150 ul. As células e os polipeptídeos de IFN beta foram incubados durante 6 horas a 37 ºC em um incubador de CO,. Depois destas seis horas de incubação,

10.000 PFU de VSV foram adicionados por poço, em um volume de 50 ul. de meio; 20 uL de VSV foram diluídos em 5 ml! de meio por 96 poços/placa. O meio foi removido por aspiração . quarenta e cinco horas pós-infecção. As placas foram suavemente compactadas em toalhas de papel para remover o meio residual. - 50 ul. de MTT brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ila) 2,5-difenilttetrazólio) 1 mg/ml preparado em RPMI sem Vermelho de Fenol e FBS foram adicionados a partir de uma solução-estoque de MTT 5 mg/mL. MTT 1 mg/mL foi usualmente preparado a fresco para cada ensaio. Em seguida, as placas foram incubadas durante três horas a 37 ºC no incubador de CO>2. O MTT foi cuidadosamente removido por aspiração. 50 ul de isopropanol foram adicionados por poço. As placas foram colocadas em um agitador de placa de 30 a 40 segundos para concluir a formação de MTT. As placas foram lidas a 560 nm com 690 nm como um comprimento de onda de referência. Os dados foram plotados e a ICs9 calculada usando o programa Sigma-Plot. A Tabela 5 resume a atividade antiviral dos polipeptídeos de IFN beta. À segunda coluna lista os valores de IC; médios para cada composto. Duas moléculas, (C 17S) M36pAF-30K PEG e (C 178) F111pAF-30K PEG, apresentaram atividade antiviral realçada sobre a molécula (C 17S)-IFN beta do tipo selvagem. [ CRETA 5 | Exemplo 3 i Este exemplo detalha a introdução de um aminoácido contendo carbonila e a Í reação subsequente com um PEG contendo aminoóxi. Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipeptídeo de IFN ; beta que incorpora um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo cetona i que é subsequentemente reagido com um PEG contendo aminoóxi de aproximadamente

5.000 MW. Cada um dos resíduos antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1,2, 3 e 4,5, Í 6,7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, Í 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, Í 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,104,105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, i 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, i 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da i proteína) e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos Í correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4) é separadamente substituído com um aminoácido i que não ocorre naturalmente codificado tendo a estrutura seguinte: j

. o As sequências utilizadas para a incorporação específica do sítio de p-acetil- fenilalanina em IFN beta são a SEQ ID NO: 1 (IFN beta) e SEQ ID NO: 6 ou 7 (muttRNA, MIRNA""cya de M. jannaschii) e SEQ ID NOs: 24, 5, 19, 20, 21 (TyrRS LW1, 5 ou 6) descritas no Exemplo 2 acima.

Uma vez modificada, a variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo o aminoácido contendo carbonila é reagida com um derivado de PEG contendo aminoóxi da forma: R-PEG(N)-O-(CH2),-O-NH, onde R é metila, n é 3 e N é aproximadamente 5.000 MW. O IFN beta purificado contendo p-acetilfenilalanina dissolvida a 10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0 ou em Acetato de E Sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, é reagido com um excesso de 10 a 100 vezes de PEG contendo aminoóxi e depois agitado durante 10 a 16 horas na i temperatura ambiente (Jencks, W. J Am. Chem. Soc. 1959, 81, pág. 475). O PEG-IFN beta depois é diluído em tampão apropriado para purificação e análise imediatas. Exemplo 4 í A conjugação com um PEG que consiste de um grupo hidroxilamina ligado ao PEG por intermédio de uma ligação amida. Um reagente de PEG tendo a estrutura seguinte é ligado a um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado contendo cetona usando o procedimento descrito no Exemplo 3: R-PEG(N)-O-(CH2),-NH-C(O)(CH>2),-O-NH, onde R = metila, n= 4 e N é aproximadamente 20.000 MW. As condições de reação, purificação e análise são conforme descritas no Exemplo 3. Exemplo 5 Este exemplo detalha a introdução de dois aminoácido distintos que não ocorrem f naturalmente codificados em polipeptídeos de IFN beta. Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipeptídeo de IFN beta que incorpora o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreendendo uma funcionalidade cetona em duas posições entre os resíduos seguintes: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 € 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,

í. 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ó 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, S —149,150,151,152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4). O polipeptídeo de IFN beta é preparado, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, exceto que o códon seletor é introduzido em dois sítios distintos dentro do ácido nucléico.

Exemplo 6 Este exemplo detalha a conjugação do polipeptídeo de IFN beta a um PEG contendo hidrazida e redução in situ subsequente.

Um polipeptídeo de IFN beta que incorpora um aminoácido contendo carbonila é preparado de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos 2 e 3. Uma vez modificado, um PEG contendo hidrazida tendo a estrutura seguinte é conjugado ao polipeptídeo de IFN beta: R-PEG(N)-O-(CH2)-NH-C(O)(CH2),-X-NH-NH, E onde R = metila, n= 2 e N = 10.000 MW e X é um grupo carbonila (C=O). O IFN beta purificado contendo p-acetilfenilalanina é dissolvido entre 0,1 a 10 mg/ml em MES 25 mM (Sigma Chemical, St.

Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St.

Louis, MO) pH 7,0 ou em Acetato de Sódio 10 mM (Sigma Chemical, St.

Louis, MO) pH 4,5, é É reagido com um excesso de 1 a 100 vezes de PEG contendo hidrazida e a hidrazona correspondente é reduzida in situ por adição de NACNBH;3 1 M estoque (Sigma Chemical, St.

Louis, MO), dissolvido em HO, em uma concentração final de 10 a 50 mM.

As reações são realizadas no escuro a 4 ºC até a temperatura ambiente durante 18 a 24 horas.

As reações são interrompidas por adição de Tris 1 M (Sigma Chemical, St.

Louis, MO) ao pH 7,6 em uma concentração de Tris final de 50 mM ou diluídas em tampão apropriado para purificação imediata.

Exemplo 7 Este exemplo detalha a introdução de um aminoácido contendo alcino em um polipeptídeo de IFN beta e derivatização com mPEG-azida.

Á Os resíduos seguintes, antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5,6, . 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, —56,57,58,59,60,61,62,63,64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,

121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, ' 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4), são substituídos com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado seguinte: o Ê o As sequências utilizadas para incorporação específica do sítio de b-propargil- tirosina em IFN beta são SEQ ID NO: 1 (IFN beta), SEQ ID NO: 7 (muttRNA, MtRNA""cy, de M. jannaschii) e 12, 13 ou 14 descritas no Exemplo 2 acima.

O polipeptídeo de IFN beta contendo a propargil-tirosina é expressado em E.

Coli e purificado usando as condições descritas no Exemplo 3. fr O IFN beta purificado contendo propargil-tirosina dissolvida entre 0,1 a 10 mga/mL em tampão PB (fosfato de sódio 100 MM, NaCl! 0,15 M, pH = 8) e um excesso de 10 a 1000 ' vezes de um PEG contendo azida é adicionado à mistura de reação.

Uma quantidade —catalíica de CuSO, e fio de Cu depois é adicionada à mistura de reação.

Depois que a mistura é incubada (incluindo, mas não limitada a cerca de 4 horas na temperatura ambiente fr ou 37 ºC ou durante a noite a 4 *C), HO é adicionado e a mistura é filtrada através de uma membrana de diálise.

A amostra pode ser analisada para a adição, incluindo, mas não limitada por procedimentos similares descritos no Exemplo 3. Neste exemplo, o PEG terá a estrutura seguinte: R-PEG(N)-O-(CH2))-NH-C(O)(CH>),-N3 onde R é metila, né 4e N é 10,000 MW.

Exemplo 8 Este exemplo detalha a substituição de um aminoácido amplo e hidrofóbico em um —polipeptídeo de IFN beta com propargil-tirosina.

Um resíduo Phe, Trp ou Tyr presente dentro de uma das regiões seguintes do IFN f beta: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, Y à: 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, —63,64,65, 66,67, 68,69, 70,71, 72,73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,

f 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer ] combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4) é substituido com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado — seguinte, conforme descrito no Exemplo 7: o Ê a Uma vez modificado, um PEG é ligado à variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo o aminoácido contendo alcino.

O PEG terá a estrutura seguinte: Me-PEG(N)-O-(CH>7)>-N;3 e procedimentos de ligação seguiriam aqueles no Exemplo 7. Isto geraria uma variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que é aproximadamente isostérico com um dos aminoácidos que ocorrem naturalmente, amplos e hidrofóbicos, e que é modificado com um derivado de PEG em um sítio distinto dentro do polipeptídeo. f Exemplo 9 Este exemplo detalha a geração de um homodímero, heterodímero, homomultímero ou heteromultímero do polipeptídeo de IFN beta separado por um ou mais ligadores de - PEG.

A variante do polipeptídeo de IFN beta contendo alcino produzida no Exemplo 7 é reagida com um derivado de PEG bifuncional da forma: N3-(CH2),-C(O)-NH-(CH2).-O-PEG(N)-O-(CH2).-NH-C(O)-(CH2),-Ns onde n é 4 e o PEG tem um MW médio de aproximadamente 5.000, para gerar o homodímero do polipeptídeo de IFN beta correspondente, onde as duas moléculas de IFN betas são fisicamente separadas por PEG.

Em uma maneira análoga, um polipeptídeo de IFN beta pode ser ligado a um ou mais outros polipeptídeos para formar heterodímeros, —homomultímeros ou heteromultímeros.

A ligação, purificação e análises serão realizadas como no Exemplos 7 e 3. . Exemplo 10 Este exemplo detalha a ligação de uma porção sacarídeo a um polipeptídeo de IFN : í beta.

Um resíduo seguinte é substituído com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado abaixo: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

f 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, À 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, —142,143,144,145,146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação do mesmo (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4), conforme descrito no Exemplo 3. o a Uma vez modificada, a variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo o aminoácido contendo carbonila é reagida com um análogo de aminoóxi B-ligado de N- acetilglicosamina (GIcNAc). A variante do polipeptídeo de IFN beta (10 mg/mL) e o : aminoóxi-sacarídeo (21 mM) são misturados em tampão acetato de sódio aquoso 100 mM (pH 5,5) e incubados a 37 ºC de 7 a 26 horas. Um segundo sacarídeo é enzimaticamente É ligado ao primeiro incubando-se o polipeptídeo de IFN beta conjugado ao sacarídeo (5 mg/ml) com UDP-galactose (16 mM) e 6-1,4-galacitosiltransferase (0,4 unidades/mL) em tampão HEPES 150 mM (pH 7,4) durante 48 horas na temperatura ambiente (Schanbacher et al. J Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061). Exemplo 11 Este exemplo detalha a geração de um antagonista do polipeptídeo de IFN beta —PEGilado.

Um resíduo, incluindo, mas não limitado àqueles envolvidos na ligação do receptor de IFN, é substituído com o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado seguinte, conforme descrito no Exemplo 3.

& í | Uma vez modificado, a variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo o aminoácido contendo carbonila será reagida com um derivado de PEG contendo aminoóxi da forma: R-PEG(N)-O-(CH>),-O-NH, onde R é metila, n é 4 e N é 20.000 MW para gerar um antagonista do polipeptídeo

À de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que é modificado com um derivado de PEG em um sítio único dentro do polipeptídeo. A ligação, E purificação e análises são realizadas como no Exemplo 3. Exemplo 12 Geração de um homodímero, heterodímero, homomultímero ou heteromultímero do polipeptídeo de IFN beta, em que as moléculas de IFN beta estão diretamente ligadas.

Uma variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo o aminoácido contendo alcino pode ser diretamente ligada a uma outra variante do polipeptídeo de IFN beta compreendendo o aminoácido contendo azido. Em uma maneira análoga, um polipeptídeo delFN beta pode ser ligado a um ou mais outros polipeptídeos para formar heterodímeros, homomultímeros ou heteromultimeros. À ligação, purificação e análises são realizadas como nos Exemplos 3, 6 e 7. Exemplo 13 PEG-OH + Br-(CH2),-CECR' — PEG-O-(CH2),-C=CR'

A B O polialquilenogilco! (P-OH) é reagido com o haleto de alquila (A) para formar o éter (B). Nestes compostos, n é um número inteiro de um a nove e R pode ser um grupo alquila . ou heteroalquila C1 a C20 saturado ou insaturado de cadeia reta ou ramificada. R' também pode ser um grupo alquila cíclico ou heteroalquila cíclico saturado ou insaturado C3 a C7, um grupo arila ou heteroarila substituído ou não substituído ou um alcarila (o alquila é um alquila saturado ou insaturado C1 a C20) ou heteroalcarila substituído ou não substituído. Tipicamente, PEG-OH é polietilenoglico! (PEG) ou monometóxi-polietilenoglicol (MPEG) tendo um peso molecular de 800 a 40.000 Daltons (Da). Exemplo 14 MPEG-OH + Br-CH, -C=CH — mPEG-O0-CH,-C =CH MPEG-OH com um peso molecular de 20.000 Da (MPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL). Uma solução de brometo de propargila, dissolvida como uma solução em xileno 80 % em peso (0,56 mL, 5 mmols, 50 equiv., Aldrich) e uma quantidade catalítica de KI depois foram adicionadas à — solução e a mistura resultante foi aquecida em refluxo durante 2 horas. Água (1 mL) depois foi adicionada e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo, foi adicionado CHCI; (25 ' mL) e a camada orgânica foi separada, seca em Na-SO, anidro e o volume foi reduzido a . aproximadamente 2 mL. Esta solução de CHCl, foi adicionada, às gotas, ao éter dietílico ' (150 mL). O precipitado resultante foi coletado, lavado com várias porções de éter dietílico —frioeseco para fornecer propargil-O-PEG. Exemplo 15 MPEG-OH + Br-(CH2);-C=CH — mPEG-O0-(CH>);-C =CH

É O mPEG-OH com um peso molecular de 20.000 Da (MPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL). Cinquenta ' equivalentes de 5-bromo-1-pentino (0,53 mL, 5 mmois, Aldrich) e uma quantidade catalítica de KI depois foram adicionados à mistura.

A mistura resultante foi aquecida em refluxo durante 16 horas.

Água (1 mL) depois foi adicionada e o solvente foi removido sob vácuo.

Ao resíduo, foi adicionado CH.Cl, (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca em Na7zSO, anidro e o volume foi reduzido a aproximadamente 2 mL.

Esta solução de CHCl, foi adicionada, às gotas, ao éter dietílico (150 mL). O precipitado resultante foi coletado, lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco para fornecer o alcino correspondente. 5- —Cloro-1-pentino pode ser usado em uma reação similar.

Exemplo 16 (1) M-HOCH2CsH,OH + NaOH + Br-CH;-CECH > m-HOCH3CsH.0-CH3-C =CH (2) M-HOCH2C;H,O-CH2-C =CH + MsCI + N(Et); > m-MsOCH,CH.O-CH3-C =CH (3) M-MSOCH2Cs;H,0-CH3-C=CH + LiBr — m-Br-CH;C.H,0-CH7-C=CH (4) MPEG-OH + m-Br-CH,CsH,O-CHz-C=CH — mPEG-O0-CH7-Cs;H,O0-CH7-C =CH A uma solução de álcool 3-hidroxibenzílico (2,4 g, 20 mmols) em THF (50 mL) e Í água (2,5 mL) foi adicionado primeiro hidróxido de sódio em pó (1,5 g, 37,5 mmols) e depois 3 uma solução de brometo de propargila, dissolvida como uma solução em xileno 80 % em peso (3,36 mL, 30 mmois). A mistura de reação foi aquecida em refluxo durante 6 horas.

À mistura foi adicionado ácido cítrico 10 % (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo.

O resíduo foi extraído com acetato de etila (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de NaCl saturada (10 mL), secas em MgSO, e concentradas para fornecer o álcool 3-propargiloxibenzílico.

Cloreto de metanossulfonila (2,5 g, 15,7 mmois) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmois) foram adicionados a uma solução do composto 3 (2,0 g, 11,0 mmoIs) em CHChk a 0ºCea reação foi colocada no refrigerador durante 16 horas.

Um processamento usual forneceu o mesilato como um óleo amarelo claro.

Este óleo (2,4 g, 9,2 mmols) foi dissolvido em THF (20 mL) e LiBr (2,0 g, 23,0 mmols) foi adicionado.

A mistura de reação foi aquecida em refluxo durante 1 hora e depois foi esfriada até a temperatura ambiente.

À mistura foi — adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo.

O resíduo foi extraído com acetato de etila (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com Ê solução de NaCl saturada (10 mL), secas em NasSO, anidro e concentradas para fornecer o " brometo desejado. h MmMPEG-OH 20 kDa (1,0 g, 0,05 mmol, Sunbio) foi dissolvido em THF (2o0mL)ea solução foi esfriada em um banho de gelo.

NaH (6 mg, 0,25 mmol) foi adicionado com agitação vigorosa em um período de vários minutos seguido por adição do brometo obtido do precedente (2,55 g, 11,4 mmois) e uma quantidade catalítica de KI.

O banho de

E esfriamento foi removido e a mistura resultante foi aquecida em refluxo durante 12 horas.

É Água (1,0 mL) foi adicionada à mistura e o solvente foi removido sob vácuo.

Ao resíduo foi é adicionado CH2CI; (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca em Na7SO, anidro e o volume foi reduzido a aproximadamente 2 mL.

A adição, às gotas, de uma solução de éter (150 mL) resultou em um precipitado branco, que foi coletado para produzir o derivado de PEG.

Exemplo 17 MPEG-NH, + X-C(O)-(CH2) -CECR' — mPEG-NH-C(O0)-(CH>),-C =CR' Os polímeros poli(etilenoglicol) contendo alcino terminal também podem ser obtidos ligando-se um polímero poli(etilenoglicol) contendo um grupo funcional terminal a uma molécula reativa contendo a funcionalidade alcino.

Conforme mostrado acima, n está entre 1 e 10. R' pode ser H ou um grupo alquila C1 a C4 pequeno.

Exemplo 18 (1) HO2C-(CH2),-C=CH + NHS + DCC — NHSO-C(O)-(CH;);-C =CH (2) MPEG-NH, + NHSO-C(O)-(CH72) ;-C=CH — mPEG-NH-C(0)-(CH2).-C =CH Ácido 4-pentinóico (2,943 g, 3,0 mmols) foi dissolvido em CH,Cl; (25 mL). N- É hidroxissuccinimida (3,80 g, 3,3 mmols) e DCC (4,66 g, 3,0 mmol) foram adicionados e a E solução foi agitada durante a noite na temperatura ambiente.

O éster 7 de NHS bruto resultante foi usado na reação seguinte sem purificação adicional. mMPEG-NH,; com um peso molecular de 5.000 Da (mMPEG-NH>, 1 9, Sunbio) foi dissolvido em THF (50 mL) e a mistura foi esfriada a 4 ºC.

Éster 7 de NHS (400 mg, 0,4 i mmol) foi adicionado às porções com agitação vigorosa.

A mistura foi deixada agitar durante 3 horas, enquanto aquecida até a temperatura ambiente.

Água (2 mL) depois foi adicionada e o solvente foi removido sob vácuo.

Ao resíduo, foi adicionado CHCl, (50 mL) e a camada orgânica foiseparada, seca em Na,SO, anidro e o volume foi reduzido a aproximadamente 2 mL.

Esta solução de CH,CI, foi adicionada, às gotas, ao éter (150 mL). O precipitado resultante foi coletado e seco a vácuo.

Exemplo 19 Este exemplo representa a preparação do éster metano sulfonílico de — polifetilenoglicol), que também pode ser referido como o metanossulfonato ou mesilato de poli(etilenoglicol). O tosilato correspondente e os haletos podem ser preparados por À procedimentos similares. : MPEG-OH + CH3SO2CI + N(Et); — mPEG-O-SO,CH; — mPEG-N; í O mPEG-OH (MW = 3.400, 25 g, 10 mmols) em 150 mL de tolueno foi azeotropicamente destilado durante 2 horas sob nitrogênio e a solução foi esfriada até a temperatura ambiente. 40 mL de CH,Cl; seco e 2,1 mL de trietilamina seca (15 mmolis) foram adicionados à solução.

A solução foi esfriada em um banho de gelo e 1,2 mL de ã cloreto de metanossulfonila destilado (15 mmois) foi adicionado às gotas.

A solução foi É agitada na temperatura ambiente sob nitrogênio durante a noite e a reação foi extinta adicionando-se 2 mL de etanol absoluto.

A mistura foi evaporada sob vácuo para remover os solventes, exceto tolueno, filtrada, concentrada novamente sob vácuo e depois precipitada em 100 mL de éter dietílico.

O filtrado foi lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco a vácuo para fornecer o mesilato.

O mesilato (20 g, 8 mmols) foi dissolvido em 75 ml de THF e a solução foi esfriada a 4 ºC.

À solução esfriada, foi adicionada azida sódica (1,56 g, 24 mmols). A reação foi aquecida em refluxo sob nitrogênio durante 2 horas.

Os solventes depois foram evaporados eoresíduo diluído com CHzCI; (50 mL). A fração orgânica foi lavada com solução de NaCl e seca em MgSO;, anidro.

O volume foi reduzido a 20 ml e o produto foi precipitado por adição a 150 ml de éter seco frio.

Exemplo 20 (1) N3-CsH4-CO2H — N3-C5H,CHOH (2) N3-CsHACH2OH — Br-CH2-CaHa-N3 (3) MPEG-OH + Br-CH7z-CsH4-N3 — mPEG-O-CHy7-C5H,-N;3 Álcool 4-azidobenzílico pode ser produzido usando o método descrito na Patente j U.S. 5.998.595, a qual é incorporada como referência neste relatório.

Cloreto de metanossulfonila (2,5 g, 15,7 mmols) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmols) foram adicionados a uma solução de álcool 4-azidobenzílico (1,75 g, 11,0 mmois) em CH.Cl a 0 ºCea reação foi colocada no refrigerador durante 16 horas.

Um processamento usual forneceu o mesilato como um óleo amarelo claro.

Este óleo (9,2 mmois) foi dissolvido em THF (20 mL) e LiBr (2,0 g, 23,0 mmols) foi adicionado.

A mistura de reação foi aquecida em refluxo durante 1 hora e depois foi esfriada até a temperatura ambiente.

À mistura, foi adicionada água (2,5 mL)eo solvente foi removido sob vácuo.

O resíduo foi extraído com acetato de etila (3x15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de NaCl saturada (10 mL), secas em Na7SO, anidro e concentradas para fornecer o brometo desejado. mMPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL) e o brometo (3,32 g, 15 mmois) foi adicionado à mistura junto a uma — quantidade catalítica de KI.

A mistura resultante foi aquecida em refluxo durante 12 horas.

Água (1,0 mL) foi adicionada à mistura e o solvente foi removido sob vácuo.

Ao resíduo, foi E adicionado CH2CI; (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca em NazSO, anidro e o E volume foi reduzido a aproximadamente 2 mL.

A adição, às gotas, de uma solução de éter (150 mL) resultou em um precipitado, que foi coletado para produzir mMPEG-O-CH,-CsH4-N3. Exemplo 21 NH2-PEG-O-CH,CHCOH + N3-CHCHCOx-NHS — N3-CH;CH7-C(O)NH-PEG-O- CHCH;COH ii NH3-PEG-O-CH,CH;CO2H (MW 3.400 Da, 2,0 g) foi dissolvido em uma solução ] aquosa saturada de NaHCO; (10 mL) e a solução foi esfriada a 0 ºC.

Propionato de 3-azido- É 1-N-hidroxissuccinimido (5 equiv.) foi adicionado com agitação vigorosa.

Depois de 3 horas, 20 mL de H,zO foram adicionados e a mistura foi agitada durante um adicional de 45 minutos —natemperatura ambiente.

O pH foi ajustado a 3 com H2SO, 0,5 N e NaCl foi adicionado em uma concentração de aproximadamente 15 % em peso.

A mistura de reação foi extraída com CH2Cl; (100 mL x 3), seca em Na,SO, e concentrada.

Depois de precipitação com éter dietílico frio, o produto foi coletado por filtração e seco sob vácuo para produzir o derivado de PEG ômega-carbóxi-azida.

Exemplo 22 MPEG-OM;s + HCZCLi — mPEG-O-CH7-CHz-C =C-H A uma solução de acetilida de lítio (4 equiv.), preparada conforme conhecido na técnica e esfriada a -78 ºC em THF, é adicionada, às gotas, uma solução de mMPEG-OMs dissolvida em THF com agitação vigorosa.

Depois de 3 horas, a reação é aquecida até a temperatura ambiente e extinta com a adição de 1 mL de butanol. 20 mL de H;O depois são adicionados e a mistura agitada durante um adicional de 45 minutos na temperatura ambiente.

O pH foi ajustado a 3 com H,SO, 0,5 N e NaCl foi adicionado em uma ; concentração de aproximadamente 15 % em peso.

A mistura de reação foi extraída com CH2Clz (100 mL x 3), seca em Na,/SO, e concentrada.

Depois da precipitação com éter dietílicofrio, o produto foi coletado por filtração e seco sob vácuo para produzir o 1-(but-3- inilóxi)-metoxipolietilenoglico! (MPEG). Exemplo 23 Os aminoácidos contendo azida e acetileno podem ser seletivamente incorporados ao sítio em proteínas usando os métodos descritos em L.

Wang, et al., (2001), Science 292:498-500,J.

W.

Chin et al, Science 301:964-7 (2003)), J.

W.

Chin et a/., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J.

W.

Chin, & P.

G.

Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137; J.

W.

Chin, et a/l,, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: e L.

Wang, & P.

G.

Schultz, (2002), Chem.

Conim., 1:1-11. Uma vez que os aminoácidos foram incorporados, a reação de cicloadição é realizada com proteína 0,01 —mMem tampão fosfato (PB), pH 8, na presença de derivado de PEG 2 mM, CuSO, 1 mM e fio de Cu de -1 mg durante 4 horas a 37 ºC.

À Exemplo 24 ' Este exemplo descreve a síntese dos derivados de p-acetil-D,L-fenilalanina (pAF) e m-PEG-hidroxilamina.

O pAF racêmica é sintetizada usando o procedimento previamente descrito em Zhang, Z., Smith, B.

A.

C, Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P.

G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746.

À Para sintetizar o derivado de m-PEG-hidroxilamina, os procedimentos seguintes : são concluídos.

A uma solução de ácido (N-t-Boc-aminoóxi)acético (0,382 g, 2,0 mmols) e ' 1,3-Diisopropilcarbodiimida (0,16 mL, 1,0 mmol) em diclorometano (DCM, 70 mL), que é agitada na temperatura ambiente durante 1 hora, metóxi-polietilenoglicolamina (m-PEG-NH,, 7,59, 0,25 mmol, Mt. 30 K, da BioVectra) e Diisopropiletilamina (0,1 mL, 0,5 mmol) são adicionados.

A reação é agitada na temperatura ambiente durante 48 horas e depois é concentrada a cerca de 100 mL.

A mistura é adicionada, às gotas, ao éter frio (800 mL). O produto t-Boc-protegido é separado por precipitação e coletado por filtragem e lavado com éter 3 x 100 mL.

Este é purificado ainda redissolvendo-se em DCM (100 mL) e precipitando- se, duas vezes, em éter (800 mL). O produto é seco a vácuo produzindo 7,2 g (96 %), confirmado por RMN e teste da Ninhidrina.

A deBoc do produto protegido (7,0 g) obtido acima é realizada em 50 % de TFA/DCM (40 mL) a 0 ºC durante 1 hora e depois na temperatura ambiente durante 1,5 hora.

Depois de remover a maioria do TFA a vácuo, o sal de TFA do derivado de hidroxilamina é convertido ao sal de HCI adicionando-se HCI 4 N em dioxano (1 mL) ao resíduo.

O precipitado é dissolvido em DCM (50 mL) e precipitado novamente em éter (800 À mL). O produto final (6,8 g, 97 %) é coletado por filtragem, lavado com éter 3 x 100 mL, seco a vácuo e armazenado sob nitrogênio.

Outros derivados de PEG-hidroxilamina (SK, 20K) são sintetizados usando o mesmo procedimento. “20 Exemplo 25 Estudos /n Vivo de IFN beta PEGilado E PEG-IFN beta, IFN beta não modificado e solução tampão são administrados aos camundongos ou ratos.

Os resultados mostrarão atividade superior e meia-vida prolongada do IFN beta PEGilado da presente invenção em comparação ao IFN beta não modificado.

Similarmente, IFN beta modificado, IFN beta não modificado e solução tampão são administrados aos camundongos ou ratos.

Análise farmacocinética O WO 2005/091944 descreve estudos farmacocinéticos que podem ser realizados com os compostos de IFN beta da presente invenção.

Um polipeptídeo de IFN beta da invenção é administrado por vias intravenosas ou subcutâneas aos camundongos.

Os animais são sangrados antes da, e em pontos no tempo depois da dosagem.

O plasma é ] coletado de cada amostra e analisado por radioimunoensaio.

A meia-vida de eliminação ã pode ser calculada e comparada entre polipeptídeos de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e IFN beta do tipo selvagem ou várias formas de polipeptídeos de IFN beta da invenção.

Similarmente, os polipeptídeos de IFN beta da invenção podem ser administrados aos macacos cinomolgos.

Os animais são sangrados antes da, e em pontos no tempo depois da dosagem.

O plasma é coletado de

' cada amostra e analisado por radioimunoensaio. A Patente US Nº 6.962.978, a qual é : incorporada como referência neste relatório, descreve estudos farmacodinâmicos e farmacocinéticos do IFN beta em primatas. Os polipeptídeos da invenção podem ser administrados a um modelo animal da doença, tal como o modelo EAE de camundongo ou rato para esclerose múltipla. Um modelo animal, tal como o modelo encefalomielite autoimune experimental (EAE) comumente usado, pode ser utilizado para estabelecer a eficácia de um polipeptídeo da invenção. No modelo EAE, a imunização com mielina ou proteínas derivadas de mielina provoca uma doença imitando a maioria das características inflamatórias e neurológicas de esclerose múltipla em seres humanos. A EAE foi usada em camundongos, ratos, coelhos e saguis (Cannella et al. PNAS, 95, 10100 5, 1998, Zaprianova et al. Morfologiia, 112,258, 1997, Hassouna et al. J. Urology, 130, 806 10, 1983, Genain & Hauser J. Mol. Med. 75, 187 97, 1997). Outros modelos incluem modelo de vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) (Murray et al. J. Neurosci. 18, 7306 14, 1998) e podem ser usados para estabelecer a eficácia do polipeptídeo de IFN beta. Exemplo 26 | Experiência Clínica Humana da Segurança e/ou Eficácia de IFN beta PEGilado " Compreendendo um Aminoácido que Não Ocorre Naturalmente Codificado.

Objetivo Observar a segurança e farmacocinética de IFN beta humano “20 recombinante PEGilado subcutaneamente administrado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

Ê Pacientes Dezoito voluntários saudáveis variando entre 20 a 40 anos de idade e pesando entre 60 a 90 kg são registrados no estudo. Os pacientes não terão valores laboratoriais anormais clinicamente significantes para hematologia ou química do soro e uma triagem toxicológica de urina negativa, triagem do HIV e antígeno de superfície da hepatite B. Eles não devem ter quaisquer evidências que seguem: hipertensão; uma história de qualquer doença hematológica primária; história de doença hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, geniturinária, metabólica, neurológica significante; uma história de distúrbio de anemia ou convulsão; uma sensibilidade conhecida aos produtos — derivados de bactéria ou mamífero, PEG ou albumina sérica humana; consumidor habitual e constante de bebidas contendo cafeína; participação em qualquer outra experiência clínica â ou transfusão ou doação de sangue até 30 dias antes da iniciação do estudo; exposição ao IFN beta até três meses antes da iniciação do estudo; uma doença até sete dias antes da í iniciação do estudo; e anormalidades significantes no exame físico pré-estudo ou avaliações clínicas laboratoriais até 14 dias antes da iniciação do estudo. Todos os pacientes são avaliáveis quanto à segurança e todas as coletas de sangue para análise farmacocinética são coletadas, conforme programado. Todos os estudos são realizados com a aprovação do ft comitê de ética institucional e consenso do paciente. h Projeto de Estudo Este será um estudo de Fase |, centralizado, aberto, Â randomizado, com dois momentos cruzados em voluntários machos saudáveis.

Dezoito pacientes são aleatoriamente desiginados a um dos dois grupos da sequência de tratamento (nove pacientes/grupo). O IFN beta é administrado em dois períodos de dosagem separados como um injeção em bolo s.c. na coxa usando doses equivalentes do IFN beta PEGilado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado e um produto comercialmente disponível, tal como BETASERONº, REBIFº ou AVONEX?. A dosagem e frequência de administração do produto comercialmente disponível são instruídas no rótulo da embalagem.

Dosagem adicional, frequência de dosagem ou outro parâmetro, conforme desejado, usando os produtos comercialmente disponíveis podem ser adicionados ao estudo incluindo-se os grupos adicionais de pacientes.

Cada período de dosagem é separado por um período de suspensão do medicamento de 14 dias.

Os pacientes são confinados no centro de estudo pelo menos 12 horas antes da, e 72 horas após a dosagem para cada um dos dois períodos de dosagem, porém não entre períodos de dosagem.

Os grupos adicionais de pacientes podem ser adicionados se houver dosagem, frequência ou À outro parâmetro adicional, a ser testado igualmente para o IFN beta PEGilado.

A formulação . experimental do IFN beta é o IFN beta PEGilado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. “20 Amostragem Sanguínea Sangue em série é retirado por punção direta da veia antes e depois da administração do IFN beta.

Amostras de sangue venoso (5 mL) para E determinação das concentrações de IFN beta no soro são obtidas em cerca de 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem (amostras com valor base 3) e erca de tempos seguintes após a dosagem: 30 minutos e a 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 e 72 horas.

Cada amostra de soroé dividida em duas alíquotas.

Todas as amostras de soro são armazenadas a -20 ºC.

Amostras de soro são colocadas em gelo seco.

Testes em jejum de laboratório clínico (hematologia, química do soro e análise da urina) são imediatamente realizados antes da dosagem inicial no dia 1, na manhã do dia 4, imediatamente antes da dosagem no dia 16 e na manhã do dia 19. Métodos Bioanalíticos Um kit ELISA é usado para a determinação das concentrações de IFN beta no soro.

É Determinações de Segurança Sinais vitais são imediatamente registrados antes de . cada dosagem (Dias 1 e 16) e a 6, 24, 48 e 72 horas depois de cada dosagem.

Á Determinações de segurança são fundamentadas na incidência e tipo de eventos adversos e nas mudanças em testes de laboratório clínico a partir do valor base.

Além disso, as mudanças de pré-estudo nas medições de sinal vital, incluindo pressão sanguínea e resultados de exame físico, são avaliadas.

Análise dos Dados Valores de concentração no soro pós-dosagem são corrigidas Í para as concentrações de IFN beta de valor base de pré-dosagem subtraindo-se de cada : um dos valores de pós-dosagem, a concentração de IFN beta e valor base médio determinada a partir da poderação dos níveis de IFN beta a partir de três amostras —coletadasem 30,20 e 10 minutos antes da dosagem. Concentrações de IFN beta no soro pré-dosagem não são incluídas no cálculo do valor médio se elas estão abaixo do nível de quantificação do ensaio. Parâmetros farmacocinéticos são determinados a partir dos dados de concentração no soro corrigidos quanto ao valor base das concentrações de IFN beta. Parâmetros farmacocinéticos são calculados por métodos independentes do modelo em um sistema de computador Digital Equipment Corporation VAX 8600 usando a última versão do software BIOAVL. Os parâmetros farmacocinéticos seguintes são determinados: pico de concentração no soro (Cmáx); tempo do pico de concentração no soro (tra); área sob a curva do tempo de concentração (AUC) a partir do tempo zero ao tempo da última amostragem de sangue (AUCO.7) calculada com o uso da regra trapezoidal linear; e meia- vida de eliminação terminal (t,2), computada a partir da constante da taxa de eliminação. À constante da taxa de eliminação é estimada por regressão linear de pontos de dados consecutivos na região linear terminal do plot concentração-tempo log-linear. A média, " desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos são calculados para cada tratamento. A razão da média do parâmetro (formulação preservada/ formulação não preservada) é calculada.

Resultados de Segurança A incidência of eventos adversos é igualmente distribuída á entre os grupos de tratamento. Não existem mudanças clinicamente significantes no valor base ou testes de laboratório clínico pré-estudo ou pressões sanguíneas e não há mudanças notáveis no pré-estudo nos resultados de exame físico e medições de sinal vital.

Os perfisde segurança para os dois grupos de tratamento devem ser similares.

Resultados Farmacocinéticos A concentração média de IFN beta nos perfis soro- tempo (não corrigidos para valor base de níveis de IFN beta) em todos os 18 pacientes depois do recebimento IFN beta PEGilado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado em cada ponto no tempo medido. Todos os pacientes devem ter valor base de concentrações de IFN beta pré-dosagem dentro da faixa fisiológica normal.

Parâmetros farmacocinéticos são determinados a partir dos dados do soro corrigidos para o f valor base médio de concentrações de IFN beta pre-dosagem e a Cmáx e tra, São F determinados. O tra, médio para qualquer comparador clínico escolhido é significantemente À mais curto do que o tra, para o IFN beta PEGilado compreendendo o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado. Valores de meia-vida terminais são significantemente mais curtos para o comparador pré-clínico testado em comparação com a meia-vida terminal para o IFN beta PEGilado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente

: codificado. : Embora o presente estudo seja conduzido em pacientes machos saudáveis, À características de absorção similares e perfis de segurança seriam antecipados em outras populações de pacientes; tais como pacientes machos ou fêmeas com câncer ou insuficiência renal crônica, pacientes com insuficiência renal pediátrica, pacientes em programas pré-deposito autólogos ou pacientes programados para cirurgia eletiva.

Em conclusão, doses únicas subcutaneamente administradas de IFN beta PEGilado compreendendo aminoácido que não ocorre naturalmente codificado serão seguras e bem toleradas por pacientes machos saudáveis.

Com base em uma incidência comparativa de eventos adversos, valores laboratoriais clínicos, sinais vitais e resultados de exame físico, os perfis de segurança das formas comercialmente disponível do IFN beta e IFN beta PEGilado compreendendo aminoácido que não ocorre naturalmente codificado serão equivalentes.

O IFN beta PEGilado compreendendo aminoácido que não ocorre naturalmente codificado potencialmente fornece ampla utilidade clínica a pacientes e fornecedores de serviços de saúde.

Exemplo 27 Í Experiência em Primatas — Interferon Beta Definitivo PK/PD Um Estudo de PK/PD de 14 dias de Quatro Análogos de Interferon-B-1b Após uma Administração Subcutânea Única em Macacos Cinomolgos “20 Objetivo: Avaliar a farmacocinética e respostas hematológicas em macacos cinomolgos para quatro análogos de interferon-B após uma administração subcutânea única Í comparada ao veículo e controles Rebifº.

A aclimatização iniciou no dia Al do estudo, com dias subsequentes consecutivamente numerados.

O dia da dosagem será designado D1 com dias — subsequentes consecutivamente numerados.

Os artigos do teste usados foram Rebif (15 u9/kg), M36-30K (3, 15 e 50 ug/kg), M36-40K (3, 15 e 50 ug/kg), F111-30K (3, 15 e 50 uglkg) e F111-40K (3, 15 e 50 vg/kg). O veículo usado, formulação IFB 2007, é Ácido aspártico 10 mM, Trealose 9 %, pH 4,0. As condições de armazenagem usadas foram a -60 ºC ou menos e as instruções de —manejo usadas foram as precauções laboratoriais padrão, conforme definido em SNBL USA SOPs. º Preparação do Artigo/Veículo de Teste ou Controle: ! Artigo de Teste Descongelar os artigos de teste durante a noite de 2a 8 ºC. h Cuidadosamente misturar o artigo de teste invertendo-se suavemente o frasco 5 a 6 vezes. —Nãoagitara solução.

Realizar os procedimentos de diluição imediatamente após a mistura.

As soluções da dosagem do artigo de teste serão preparadas a partir dos artigos de teste estoque que foram formulados pelo Sponsor em concentrações de 0,20 mg/mL.

As i soluções da dosagem do artigo de teste serão preparadas por diluição em série.

Recipientes " estéreis serão marcados com a concentração final e o volume total e colocados em gelo durante as preparações.

O volume apropriado do veículo será adicionado primeiro e depois, usando uma pipeta com tamanho apropriado, o volume apropriado da solução do artigo de teste será adicionado lentamente ao frasco marcado contendo o veículo previamente adicionado.

Não introduzir bolhas de ar e evitar a formação de espuma.

Misturar bem com a pipeta para cima e para baixo de 5 a 10 vezes.

Misturar bem a solução final invertendo-se o recipiente de 7 a 10 vezes.

Artigo Controle Positivo: Misturar cuidadosamente o artigo controle positivo —invertendo-se suavemente o frasco de 5 a 6 vezes antes do uso.

Veículo: Descongelar a solução veículo durante a noite de 2 a 8 ºC.

Misturar cuidadosamente o veículo invertendo-se suavemente o frasco de 5 a 6 vezes.

Sistema do Teste: Espécie: Macaca fascicularis (macaco cinomolgo com propósito de procriação) é uma espécie intimamente relacionada aos seres humanos facilitando a análise filogenética e fisiológica e é uma espécie comumente usada para avaliações de toxicidade não clínicas. : Adicionalmente, esta espécie tem mostrado respostas farmacológicas ao artigo de teste. : animal específicos do estudo Condições do Meio: Os animais são alojados em um meio com temperatura e umidade monitoradas.

À faixa alvejada de temperatura e umidade relativa está entre 18 e 29 ºC e 30 e 70 %, nã respectivamente.

Excursões fora da faixa de umidade alvejada durante menos do que 60 . minutos são consideradas incidentais e não serão relatadas.

Um sistema de iluminação : automático fornecerá um ciclo de 12 horas diurnas.

O ciclo escuro pode ser interrompido para atividades relacionadas ao estudo ou facilidade.

Além disso, os animais são individualmente alojados em gaiolas que condescendem com the Animal Welfare Age e recomendações apresentadas no “The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (National Research Council 1996).

Dieta e Alimentação: Animais são alimentados duas vezes ao dia de acordo com SNBL USA SOPs. Os animais podem ser submetidos ao jejum, conforme exigido por procedimentos específicos (por exemplo, antes da retirada de sangue para química do soro, coleta de urina ou quando procedimentos envolvendo anestesia são realizados). A dieta é rotineiramente analisada quanto a contaminantes e realizada de acordo com as especificações do fabricante. Espera- se que contaminantes não estejam presentes em níveis que interfeririam nos resultados do estudo. Registros da análise de alimentação serão mantidos nos registros de facilidade do teste.

Água potável fresca é fornecida à vontade a todos os animais. A água é rotineiramente analisada quanto a contaminantes e atividades e tratos serão rotineiramente fornecidos de acordo com SNBL USA SOP's.

Projeto Experimental Seleção de Animais: Um número apropriado de animais foi selecionado a partir do estoque de SNBL USA. Animais foram examinados quanto à saúde por uma equipe veterinária e passaram Í pela triagem da química do soro, hematologia e coagulação. Quarenta e nove machos saudáveis foram avaliados no estudo. Durante PE, um adicional de 1 mL de sangue será coletado, processado em soro e colocado no Sponsor para triagem viral.

Quarenta e dois machos foram avaliados nos grupos de estudo específicos no critério de Sponsor e os animais remanescentes apresentaram-se disponíveis como reservas.

Randomização: Um esquema de randomização estratificado com base nos pesos corpóreos foi usado para avaliar os animais nos grupos de estudo.

Período de Aclimatização: Animais previamente quarantenados foram aclimatizados no ambiente do estudo durante um mínimo de 14 dias antes da iniciação da dosagem. Os dados da aclimatização foram coletados de todos os animais, incluindo os reservas. Todos os animais foram — avaliados quanto às anormalidades comportamentais que podem afetar o desempenho no estudo. Animais avaliados podem ser substituídos com animais reserva, conforme a & necessidade, com base nos resultados gerados durante a fase de aclimatização. Os animais ã reserva serão removidos do estudo depois de DI. : À Os animais foram avaliados em grupos e tratados, conforme indicado na tabela seguinte: TABELA 6: AVALIAÇÕES DO GRUPO

S . Nível de | Concentração alum Número Grupo de Artigo de Via de de Tratamento teste Dosagem Dosagem | de Dosagem Dosagem Es (vg/kg) (mg/mL) Animais (mL/kg) Veículo

EE O je e ce es em e o ee es | 3 Cr EEE o TE o sms e EAR CO EE Add [o Es sa | : e Tee eras O O Nota: O volume da dosagem total (mL) foi calculado com base no peso corpóreo mais recente. Administração de Artigos de Teste e Controle: Os níveis de dosagem estudados, observados na Tabela 6 — Avaliações do grupo, foram selecionados com base em estudos anteriores com macacos cinomolgos em uma faixa de próxima às dosagens humanas antecipadas a múltiplos altos da dosagem humana antecipada. Via e Frequência de Administração: Todos os grupos foram dosados subcutaneamente na área interescapular clipada do dorso e sua via de administração é compatível com a via de administração proposta em seres humanos e espera-se que sejam fornecidos níveis no soro apropriados para investigação e atividade farmacológica e farmacocinética associada. A frequência é de uma vez. p Observações e Exames: Os dados mostrados nas Figuras 6 a 21 e nas tabelas incluídas dentro deste Exemplo fornecem observações e exames realizados com este protocolo. Observações clínicas foram realizadas duas vezes ao dia para cada animal iniciando em A2. A primeira observação ocorreu pela manhã, antes do ambiente se tornar claro. A segunda observação foi depois de 4 horas depois da observação da manhã. Seas observações clínicas para um animal demonstram um declínio na condição do animal, uma avaliação veterinária deve ser realizada e o Guia do Estudo notificado. O sítio de injeção foi avaliado uma vez ao dia para cada animal iniciando em DI. Os pontos no tempo de PK e Neopterina foram 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 216, 264 e 336 horas após a administração. Os pontos no tempo de PD foram -1, 2, 3, 5, 9, 11 e 15 dias após à administração (e-1 sendo pré). Os pontos no tempo de hematologia foram -1, 2, 5, 8, 11, 15 dias; e os pontos no tempo de imunogenicidade e química clínica foram -1 e 15 dias. Observação Superfície da gaiola: checada diariamente e ISR checada duas vezes ao dia. Peso Corpóreo: Cada animal foi pesado durante a primeira semana de aclimatização, no dia antes da dosagem e no final da porção “in-life” do estudo.

4.7. Procedimentos de Laboratório Tabela de Frequência Dia do Estudo Heme EDTA (1,3 mL) Quim. SST (1,0 mL) PK SST (1,0 mL) PD/qPCR À TABELA 7: DADOS DO ESTUDO DA COLETA E ANÁLISES DE DADOS . REALIZADAS Dia do Estudo (1,3 mL) SST (1,0 mL) SST (1,0 mL) PAXgene (2,5 mL)

TEEM IRRITA ER EE A

REEETTTTTEINITTI E Err OE Ra LEA a r—

TFT EEE os Er aa a dn FREE AA a

EFEITO ER a aa ada Fra Aa: EEE AE Aa a) pane

EE TT RO EO Er aa REA A Emo OTA

ERITREA FREE AE

Dia do Estudo (1,3 mL) SST (1,0 mL) SST (1,0 mL) PAXgene (2,5 mL) o As AE EE A as A A A

ERA E O OCA AA EEE A A EA

EEE AO Eos EE O E EE,

E TA A OA For E ZH d Ts IEEE ET AE e ca X: procedimento realizado ". Coleta de Sanque: Método de coleta/amostragem de sangue geral e processamento do espécime: : O sangue foi coletado por punção da veia a partir de uma veia periférica de animais —contidose conscientes. Quando possível, o sangue foi coletado por intermédio de uma retirada única e depois apropriadamente dividido. Espécimes (com a exceção de Paxgene) " foram processados para soro ou plasma, de acordo com SNBL USA SOPs. Hematologia: O volume da amostra de 1,3 mL de sangue foi coletado de todos os Animais/Grupos, EDTA anticoagulante foi adicionado e depois as amostras foram analisadas e parâmetros de hematologia foram determinados usando um analisador automático Advia.

Parâmetros de Hematologia: Os parâmetros seguintes foram medidos e comparados às faixas normais: (Código Xybion) Glóbulos Brancos (WBC), Glóbulos Vermelhos (RBC), Hemoglobina (HGB), Hematócrito (HCT), Volume Corpuscular Médio (MCV), Hemoglobina Corpuscular Média (MCH), Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média (MCHC), Largura da Distribuição dos Glóbulos Vermelhos (RDW), Plaquetas (PLT), Volume da Plaqueta Médio (MPV), Porcentagem de Reticulócito (% de RET), Reticulócito Absoluto (RETA) e contagem de leucócitos diferenciais (absoluta) incluindo; Neutrófilos Absolutos (NEUA), Linfócitos Absolutos (LYMA), Monócitos Absolutos (MONA), Eosinófilos Absolutos (EOSA) e Basófilos Absolutos (BASA).

Medições da Química do Soro:

Para as medições da química do soro, estas foram feitas em todos os animais/grupos e exigiu jejum durante a noite e um volume de amostra de 1 mL de sangue.

Nenhum anticoagulante foi usado, porém tubos separadores de soro foram usados e parâmetros de química foram determinados usando um analisador automático Olympus.

Os parâmetros incluíram: (Código Xybion) Albumina (ALB), Alcalino Fosfatase (ALP), Alanina Aminotransferase (ALT), Aspartato Transaminase (AST), Bilirubina Total (TBIL), Cálcio (Ca), Colesterol Total (TCho), Creatina Cinase (CK), Creatinina (CRN), Gama Glutamiltransaminase (GGT), Glicose (GLU), Fósforo Inorgânico (IP), Proteína Total (TP), Triglicerídeo (TRIG), Nitrogênio Ureico no Sangue (BUN), Globulina (GLOB), Razão —Albumina/Globulina (AJG), Cloreto (CI), Potássio (K) e Sódio (Na). Processamento e Armazenagem do Espécime: O soro foi dividido em dois volumes aproximadamente iguais e cada um transferido a um frasco da marca Matrix e armazenado a -20 ºC ou menos.

Reações em Cadeia da Polimerase farmacodinâmicas e quantitativas foram conduzidas em todos os animais/grupos na frequência fornecida na Tabela 7 e a coleta foi feito usando procedimentos de operação padrão SNBL USA.

O volume da amostra foi de : aproximadamente 2,5 mL de sangue em tubos de PAXgene anticoagulante processados e " armazenados de -15 ºC a -25ºC.

Dados a partir da Experiência em Primatas: TABELA 8: ESCALONAMENTO ALOMÉTRICO DA DOSAGEM — REBIF.

Escalonamento alométrico da dosagem de Rebif — 0,044 mg/injeção = 0,003 Ê mg/kg Dosagem em | Dosagem em Espécie Peso, kg Dosagem Est.

BSA, m2 mg/kg mg/m2 Total, mg [SsTmano | esto o on on | mo pemmundonao oe om [om | ow ae [mes fo im aa | om amo | [55 a am es Porquinho- 1,00 0,01 0,089 e a A nda oem om o | er os [a Ta a o a ese es Ta a e | om ar [ooo Ta e a e oa Est.

Dosagem em | Dosagem em Espécie Peso, kg Est.

BSA, m2 [9 | reto | o [SST ones

Porquinho- : 1,00 0,04 0,089 da-Índia TABELA 9: ESCALONAMENTO ALOMÉTRICO DA DOSAGEM — BETASERON Escalonamento alométrico da dosagem — Betaseron 0,25 mg/injeção = —-0,013 mg/kg Est. na.

Dosagem em | Dosagem em . Espécie Peso, kg Dosagem Est.

BSA, m2 mg/kg mg/m2 Total, mg Porquinho- 0,04 0,089 da-Índia Est.

Dosagem em | Dosagem em Espécie Peso, kg Dosagem Est.

BSA, m2 mg/kg mg/m2 Total, mg Porquinho- 1,00 0,01 0,01 0,089 da-Índia

Com base em doses terapêuticas correntes de produtos comercializados e ajustadas quanto à área da superfície corpórea, Betaseron = 32 MIU/mg; Rebif = 270 MIU/mg e Avonex = 200 MIU/mg.

TABELA 10: DADOS DA VARIANTE DO INTERFERON BETA Artigo ne de Dosagem | Cmáx | Tmáx B AUC Vd/F CVF Lagtime Terminal teste (ug/kg) (ng/ml) (h) (h) (ng'hml) (mlL/kg) (mlL/h/kga) (h) Rebif 15 10,96 284 595,8 Nº : so | | | nd | So37a [74285 | 171 | mo | E Taças m36- Ah aoK" ae EmA Estcoia AREA a | pn [| na | na | na | na | nad | no) a er 30K* [E E TE as | 17 [es] 27 | 7º | 6663 [278 | 47 | oo | no 39,5 22,3 47,54 3396,9 358,8 0,3 aos | 5) PS [as] sa | asas [assa | ao Dos | ts [1a] e] imo oras | 46 | 96 | TABELA 11: DADOS HEMATOLÓGICOS DA VARIANTE DO INTERFERON BETA Grupo de Linfócitos | Monócitos | Eosinófilos | Basófilos Plaquetas | WBCs | RBCs Tratamento Absolutos | Absolutos | Absolutos | Absolutos M36-30K N.S.

NS.

N.S. | N.S.

N.ºS.

N.ºS.

N.S.

N.ºS. (3 ug) h M36-30K N.S.

NS.

N.S. | N.S.

N.ºS.

N.S. N.S.

N.ºS. (15 pg) M36-30K NS.

NS.

N.S. |NS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS. (50 ug)

Grupo de Linfócitos | Monócitos | Eosinófilos | Basófilos Ea Plaquetas | WBCs | RBCs | i Tratamento Absolutos | Absolutos | Absolutos | Absolutos M36-40K N.ºS.

Ns.

N.S. | NS.

N.ºS.

NS. N.S.

N.S. (3 vg) M36-40K N.ºS.

N.ºS.

N.S. |N.S.

N.S. N.S. NS.

N.S. (15 vg) MIS NS] ns |NS|NSs Ns Ns Ns (50 ug) .S. .S. .S. |N.S. .s. .Ss. .s.

F111-30K N.S.

N.S.

N.S. | NS.

N.S.

N.ºS.

N.ºS. 8 ug) F111-30K N.ºS.

Ns.

N.S. |N.S.

NS.

N.ºS.

N.ºS.

NS. (15 pg) F111-30K N.S.

N.S.

N.S. |N.S.

N.S. NS.

N.ºS. (50 pg) F111-40K N.S.

N.ºS.

N.S. |N.S.

N.S.

N.ºS.

N.S. (3 pg) F111-40K NS.

N.ºS.

N.S. | NS.

N.ºS.

N.Ss.

N.S.

N.ºS. ' (15 pg) F111-40K NS.

N.S. | NS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS. (50 pg) Y TABELA 12: DADOS DE HEMATÓCRITOS DO INTERFERON BETA Conc. de Largura Volume Volume Hemoglobina . Hemoglobina | da Dist.de da Grupo de . Corpuscular | Corpuscular Hemoglobina | Hematócrito : Corpuscular | Glóbulos | Plaqueta Tratamento Médio Média R MOV MON Média Vermelhos | Médio MCHC (RDW) | (MPV) M36-30K N.ºS.

N.ºS.

NS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS. (3 po) M36-30K N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

NS. NS.

N.S. (15 ug) M36-30K N.S.

N.ºS.

Ns.

NS.

N.ºS.

N.ºS: N.S. (50 ug) M36-40K N.ºS.

N.S. N.S.

N.ºS.

N.ºS.

NS.

N.ºS. (3 pg) M36-40K N.ºS.

N.S.

N.ºS.

N.ºS.

N.S.

NS. (15 pg)

Conc. de Largura Volume Volume Hemoglobina Ns Hemoglobina | da Dist.de da Grupo de ó . ) Corpuscular | Corpuscular Hemoaglobina | Hematócrito Corpuscular | Glóbulos | Plaqueta Tratamento Médio Média , MCV MCH Média Vermelhos | Médio (MCHC) (RDW) | (MPV) M36-40K N.S.

N.S. N.S.

N.ºS.

N.ºS.

NS. (50 pg) F111-30K N.S.

NS. N.S. NS.

N.ºS.

N.s.

N.ºS. (3 pg) F111-30K N.S.

NS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.Ss.

NS. (15 pg) F111-30K N.ºS.

NS.

N.ºS.

N.S.

N.ºS.

Ns.

N.S. (50 pg) F111-40K N.S.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

NS. (3 pg) F111-40K N.S.

NS.

N.ºS.

N.ºS.

N.ºS.

N.S.

Ns. (15 ug) F111-40K N.ºS.

N.S.

N.ºS.

N.ºS.

NS. NS.

N.S. — (50ug) * Diferença significante usando ANOVA unidirecional com post hoc de Bonferonni (p ' > 0,05) A diferença da MCHC no Dia 8 pós-tratamento é de 31,5 + 0,8 g/dl (Veículo controle) vs 33,9 + 0,9 g/dL (Rebif) A média de todos os grupos no Dia 8 é de 32,6 + 0,6 g/dL.

À faixa de referência do histórico é de 30,3 + 1,11 g/dL AUC de 3 ug/kg de Rebif (dosagem humana equivalente) = 13,6 ng*h/mL, administrados três vezes por semana = 40,8 ng"hymlL e AUC de uma dosagem única de M36-40K a 3 vg/kg igualada a 19 x a AUC da administração semanal de Rebif.

Em termos de glóbulos brancos, neutrófilos significantes diminuem em Rebif, M36- 30K (dosagens de 15 e 50 ug/kg), M36-40K (dosagens de 15 e 50 ug/kg), F11 1-30K (dosagem de 50 ug/kg) e F111-40K (dosagens de 3 e 50 ug/kg), entretanto a faixa no Dia -1 foi de 1,92 a 5,66 (10%/ uL), a faixa do histórico de SNBL foi de 5,37 + 2,75 (10%/ uL) e todos os grupos retornaram aos níveis da pré-dosagem no Dia 15 pós-tratamento (e a maioria retornou no Dia 5 pós-tratamento). Em termos de química clínica, não houve diferenças significantes dos valores controle e houve uma tendência de níveis de ALT no soro aumentados em um grupo.

F111- 30K aumentou em todos os grupos do Dia -1 ao Dia 15 pós-tratamento, entretanto houve um amplo desvio padrão em todos os grupos e a faixa do histórico de SNBL foi de 36 + 12 U/L [F111-30K (dosagem de 3 ug/kg): 36 a 49 U/L; F111-30K (dosagem de 15 ug/Kkg): 34 a 60 U/L; F111-30K (dosagem de 50 ug/kg): 32 a 57 U/L] e não houve outras mudanças relacionadas nas medições da função do fígado.

Exemplo 28 Propósito O método seguinte deve ser usado para avaliar a degradação química de pureza e potencial relativa (isto é, oxidação) e impurezas relacionadas ao processo, de Interferon-B não PEGilado e PEGilado 40K (PEG-IFB) por cromatografia líquida de alto desempenho em fasereversa (RP-HPLC).

Princípio RP-HPLC é uma técnica que separa moléculas com base em hidrofobicidades relativas. As amostras são passadas em uma fase estacionária de sílica covalentemente ligada às cadeias de hidrocarboneto. As moléculas de interesse são retardadas pela fase estacionária e eluídas com uma fase móvel gradiente. O tempo de eluição cromatográfico é característico para uma molécula particular. Este método separa IFB e PEG-IFB de isoformas com base em diferenças sutis no comportamento de hidrofobicidade e retenção P associado com modificações estruturais, tais como oxidação. Escopo Este método suporta a determinação de identificação e pureza de IFB e PEG-IFB. Alguns produtos com degradação parcial e impurezas relacionadas ao processo são | observáveis usando esta técnica. Apenas a resolução parcial de certa oxidação de sítios de metionina e desamidação potencial podem ser observadas usando este método. Limites Injeção Nominal = 10 vg Linearidade obtida com quantidades de injeção de 50 a 150 % de nominal

1. Materiais e Equipamento Pipetman P20, P200, P1000 ajustável ou equivalente. Pipetas com bico aplicador P20, P200 e P1000 descartáveis.

Frascos e tampas de HPLC (frascos de polipropileno com tampa-rosca de 100 4l, Alltech 112962, tampas lineares TFE 73048, tampas-rosca com orifício de abertura t73044 ou equivalentes) Limpar os frascos de vidro de 1 e 2L f f Coluna — Agilent Zorbax 300SB-C3 e 4,6 x 150 mm, 3,5 mícrons, 300À (P.N.

863973-909) O instrumento de cromatografia líquida de alta pressão é capaz de realizar gradientes lineares (tal como Agilent 1100 HPLC equipado com um desgaseificador a vácuo,

bomba quaternária, autoamostrador em termostato, compartimento de coluna em termostato, detector com arranjo de diodos (DAD), e software para cromatografia Chemstation)

2. Reagentes a. Água, qualidade Milli-Q ou equivalente b. Os produtos químicos sólidos tem grau analítico e os solventes tem grau de HPLC, a menos que de outro modo observado. A armazenagem de reagentes e etapas de procedimento ocorrem na temperatura ambiente, a menos que de outro modo indicado. c. Exemplo de Produtos Químicos Ambrx: i. Acetonitrila, Fisher A998, grau de HPLC ou equivalente ii. Ácido trifluoroacético, Halocarbon UN2699, Biograde ou equivalente d. Fase móvel A: TFA 0,1 % (vv) em HO e. Fase móvel B: TFA 0,1 % (v/v) em Acetonitrila Amostras a. Injetar volume suficiente de solução de amostra para carregar 10 ug de proteína. Procedimento E a. Os instrumentos podem ser ajustados às condições seguintes . i. Coluna: Agilent Zorbax 300SB-C3 e 4,6 x 150 mm, 3,5 mícrons, 300 À ii. Temperatura do Autoamostrador: 4 ºC ili. Taxa de fluxo: 1,0 mL/min iv. Configuração da Bomba: Da ALA

E EO as Configuração do Injetor: Injeção: Injeção Padrão Volume de Injeção: Variado Velocidade de Retirada: 100 ul/min Velocidade de Injeção: 100 ul/min Lavagem de agulha: H,O 20 ul Tempo de Parada: Igual ao da bomba

Sinais DAD: Amostra Referência Bw Unidades Bw Monitoramento do Comprimento de onda 214 4 600 100 nm 276 4 600 100 nm 280 16 600 100 nm 220 4 600 100 nm 250 8 600 100 nm Largura do Pico: >0,1 min Sit: 4 nm Tempo de Parada: Igual ao da bomba Termostato da Coluna: Temperatura: 25 ºC Eventos de Integração: Dependente do software de análise b.

Novas colunas devem ser fluxadas com pelo menos IOCV de água do grau de HPLC destilada para remover o solvente extra. q c.

Procedimento de limpeza: Fluxar a coluna com mais do que IOCV de água do graude HPLC seguido por 10 a 15 CV de metanol 100 %. . d.

Procedimento de Armazenagem: Armazenar a coluna em metanol 100 %. e.

Procedimento de Condução: Equilibrar a coluna com 10 a 15 volumes de coluna de fase móvel A 100 %. EF f.

Injetar o artigo de teste e conduzir o programa de HPLC.

Análise de Dados a.

Tempo de retenção (usando Az14) Relatar o tempo de retenção do artigo de teste: b.

Pureza Calcular a pureza do artigo de teste: (Área de Integração do pico principal/áreas de integração de todos os picos) x 100 % Os exemplos de cromatogramas produzidos e purezas a partir deste procedimento são fornecidos nas Figuras 24 a 28. É entendido que os exemplos e modalidades descritos neste relatório são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças na luz dos mesmos serão sugeridas àqueles de habilidade comum na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e faixa de operações deste pedido e escopo das reivindicações anexas.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e/ou outros documentos citados neste pedido são integralmente incorporados como referência para todos os propósitos, da mesma forma como se cada publicação, patente, pedido de patente, e/ou outro documento individual fossem individualmente indicados para ser incorporados como referência para todos os propósitos.

TABELA 6: Sequências Citadas. [TI Saad smmoDãos do TF bela com sunstigão CMS 5' otimizada) c17S

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados.

.- 2. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelofatode que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais modificações pós- . tradução.

3. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é ligado a um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa.

4. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é ligado a um polímero solúvel em água.

5. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é ligado a um polímero bifuncional, ligador bifuncional ou pelo menos um polipeptídeo de IFN beta adicional.

6. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligador ou polímero bifuncional é ligado a um segundo polipeptídeo.

7. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo de IFN beta.

8. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO —pelofatode que o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(etilenoglicol).

9. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polímero solúvel! em água é ligado a um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, presente no dito polipeptídeo de IFN beta.

10. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO —pelofatodequeo aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste de resíduos antes da posição 1 (isto é, no N- terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, - 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, - 30 74,75,76,77,78,79,80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3, 4).

11. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 10,

CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação . dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3, 4).

12. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 10, - CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

13. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

14. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

15. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos na sequência líder ou sinal da SEQ ID NO: 4.

16. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO —pelofatodequeo aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos antes da posição 1 (isto é, no N- terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, E 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, : 30 74,75,76,77,78,79, 80,81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, OO, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3 e 4).

17. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 16,

CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação . dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3, 4).

18. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 16, - CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

19. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3 e 4).

20. Polipeptíideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

21. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos na sequência líder ou sinal da SEQ ID NO: 4.

22. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO —pelofatode que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que modula a afinidade do polipeptídeo de IFN beta para um receptor de IFN.

. 23. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre substituição, . 30 adição ou deleção do aminoácido que aumenta a estabilidade ou solubilidade do polipeptídeo de IFN beta.

24. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta A compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que aumenta a expressão do polipeptídeo de IFN beta em uma célulahospedeirarecombinante ou sintetizada in vitro.

25. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre substituição,

adição ou deleção do aminoácido que aumenta a resistência à protease do polipeptídeo de IFN beta.

26. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO . pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é reativo em relação aum ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa que é, de outro modo, não reativa - em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns no polipeptídeo.

27. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo —semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.

28. Polipeptíideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila.

29. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado tem a estrutura: (CH,RICOR? sen Soo em que n é 0 a 10; R, é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; R2 é H, uma alquila, arila, alquila substituída e arila substituída; e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino, e R, é H, um aminoácido, um —polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

30. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo aminoóxi.

31. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 27, —CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado . compreende um grupo hidrazida.

32. Polipeptideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 27, " CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo hidrazina.

33. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo semicarbazida.

34. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo azida.

35. Polipeptíideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o amincácido que não ocorre naturalmente codificado tem a estrutura: - (CHIRKX(CH2)mNs

NON em que n é O a 10; R, é uma alquila, arila, alguila substituída, arila substituída ou 5 não presente; X é O, N, S ou não presente; m é 0 a 10; R é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

36. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo alcino.

37. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado tem a estrutura:

TO R2HN COR; em que n é 0 a 10; R, é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; X éoO N Sou não presente; m é 0 a 10, R- é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal amino e R; é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação no terminal carbóxi.

38. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa ecercade100kDa.

39. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular . entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 50 kDa.

40. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO A 25 —pelofatode que é preparado reagindo-se um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo carbonila com um polímero solúvel em água compreendendo um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida.

41. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado ao polímero solúvel em água através de uma ligação amida.

42. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é preparado reagindo-se um polímero solúvel em água compreendendo um grupo carbonila com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado que compreende um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. . 43. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelofatode que é preparado reagindo-se um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um . aminoácido contendo alcino com um polímero solúvel em água compreendendo uma porção azida.

44. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é preparado reagindo-se um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido contendo azida com um polímero solúvel em água compreendendo uma porção alcino.

45. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo azida ou alcino é ligado a um polímero solúvel em água através de uma ligação amida.

46. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água é um polímero ramificado ou multirramificado.

47. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que cada ramo do polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa.

48. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é um antagonista de IFN beta.

49. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo compreende um ou mais entre modificação pós-tradução, ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa.

50. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero compreende uma porção selecionada de um grupo que consiste de um polímero solúvel em água e poli(etilenoglico!).

. 51. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo previne a ativação do receptor de IFN.

. 30 52. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende uma porção sacarídeo.

53. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa é ligado ao —polipeptídeo por intermédio de uma porção sacarídeo.

54. Ácido nucléico isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de polinucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 3 ou 4, em que o polinucleotídeo compreende pelo menos um códon seletor.

55. Ácido nucléico isolado, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO . pelo fato de que o códon seletor é selecionado do grupo que consiste de um códon âmbar, códonocre,códon opala, um códon único, um códon raro e um códon de quatro bases. - 56. Método de preparar o polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende contatar um polipeptídeo de IFN beta isolado compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado com um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa compreendendo uma porção —quereage como aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero compreende uma porção selecionada de um grupo que consiste de um polímero solúvel em água e poli(etilenoglico!).

58. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que —oaminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.

59. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende uma porção carbonila e oligador, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção aminoóxi, uma hidrazina, uma hidrazida ou uma semicarbazida.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligada ao ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa através de uma ligação amida.

61. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende uma porção alcino e o ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção azida. . 62. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende uma porção azida e o . 30 ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção alcino.

63. Método, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção azida ou alcino é ligada a um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa através de uma ligação amida.

64. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção polifetilenoglicol) tem um peso molecular médio entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa.

65. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção poli(etilenoglicol) é um polímero ramificado ou multirramificado.

66. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo de IFN beta conforme definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente . aceitável.

67. Composição, de acordo com a reivindicação 66, CARACTERIZADA pelo fato . de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado a um polímero solúvel em água.

68. Uso de uma composição, conforme definida na reivindicação 66, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar um paciente tendo um distúrbio modulado por IFN beta.

69. Célula, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 54.

70. Célula, de acordo com a reivindicação 69, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula compreende uma tRNA sintetase ortogonal ou um tRNA ortogonal.

71. Método de preparar um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende cultivar células compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de IFN beta compreendendo um códon seletor, uma RNA sintetase ortogonal e um tRNA ortogonal sob condições que possibilitam a expressão do polipeptídeo de IFN beta compreendendo um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado; e purificar o polipeptídeo de IFN beta.

72. Método de modular a meia-vida do soro ou tempo de circulação de um polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende substituir um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados por qualquer umoumaisaminoácidos que ocorrem naturalmente no polipeptídeo de IFN beta.

73. Polipeptídeo de IFN beta codificado por um polinucleotídeo tendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 ou que codifica um polipeptídeo mostrado na SEQ ID : NO: 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende um códon seletor e em que o dito polipeptídeo compreende pelo menos um aminoácido que não . 30 ocorre naturalmente codificado.

74. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é ligado a um ligador, polímero, polímero solúvel em água ou molécula biologicamente ativa.

75. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 74, —CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(etilenoglico!).

76. Polipeptideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 73,

CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, . 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, —44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, . 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,149,150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 (isto é, no terminal carboxila da proteína) e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3, 4).

77. Polipeptideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3, 4).

78. Polipeptíideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

79. Polipeptíideco de IFN betay de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4). . 80. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é - 30 substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 15, 42, 80, 108, 111, 155 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes da SEQ ID NOs: 3, 4).

81. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é — substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos na sequência líder ou sinal da SEQ ID NO: 4.

82. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 73,

CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino. . 83. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção poli(etilenoglicol) tem um peso molecular . entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa.

84. Polipeptideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção poli(etilenoglicol) é um polímero ramificado ou muiltirramificado.

85. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 84, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa.

86. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo de IFN beta, conforme definido na reivindicação 73, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

87. Polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que aumenta a expressão do polipeptídeo de IFN beta em uma célula hospedeira recombinante.

88. Polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente ao polipeptídeo de !IFN beta em um aminoácido único.

89. Polipeptideco de IFN betay de acordo com a reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água compreende uma porção poli(etilenoglico!).

90. Polipeptideco de IFN betay de acordo com a reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido covalentemente ligado ao polímero solúvel em água é um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado.

. 91. Polipeptideo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito aminoácido que não ocorre naturalmente . 30 codificado é ligadoa uma molécula de poli(etilenoglico!).

92. Polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa, em que o dito ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa é ligado ao polipeptídeo através de um grupo funcional de um aminoácido que não ocorre naturalmente codificado, ribossomicamente incorporado no polipeptídeo.

93. Polipeptideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 92, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo de IFN beta é monoPEGilado.

94. Polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa que é ligado a um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados, em que o dito aminoácido que não ocorre . naturalmente codificado é ribossomicamente incorporado no polipeptídeo em sítios pré- selecionados.

. 95. Polipeptíideo de IFN betay de acordo com a reivindicação 94, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta compreende um ligador, polímero ou molécula biologicamente ativa.

96. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que modula a imunogenicidade do polipeptídeo de IFN beta.

97. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleçãodo aminoácido que modula a meia-vida no soro ou o tempo de circulação do polipeptídeo de IFN beta.

98. Método de modular a imunogenicidade de um polipeptídeo de IFN beta, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende substituir um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente codificados por qualquer um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente no polipeptídeo de IFN beta.

99. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo também compreende uma substituição do aminoácido naturalmente codificado.

100. Polipeptídeo de IFN beta, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, — CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido que não ocorre naturalmente codificado é substituído em uma posição selecionada do grupo que consiste dos resíduos 36 e F111 e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na ' SEQ ID NOs: 3, 4).

101. Polipeptídeo de IFN, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, - 30 CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo também compreende uma substituição do aminoácido natural C17S (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NOs: 3, 4).

102. Polipeptíideco de IFN betay de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de IFN beta compreende uma ou mais entre substituição, adição ou deleção do aminoácido que realça a atividade antiviral do polipeptídeo de IFN beta.

103. Polipeptíideco de IFN beta, de acordo com a reivindicação 4,

CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água é ligado ao dito polipeptídeo por uma ligação oxima.

Figura 1 : s76 AA.

LB 4 | não TA E N í - id FO ae : Y 2, | “e K108

Figura 2 19 8 Sítio de Glicosilação 15 SS so À > À >. PANCAS VA, K * 2 õ A JL à i 4 o 108 à DO ao 1 Larter Y o SS D/ o | & . Vo NET 2 113 NA EUR O =. ê 42

Figura 3 pull nl A nt Cr Rea te] Poroed NE

— no vast Ts À 28 tan dia ads cadio

A digito E A oi ns us Bd Ss COREBRERERES | f CNE Do E eia

E 1234 5678089

Figura 4 123 4 5 678 LL lolol oi — ME 2 E a NB:

TENS : CORRS.

f TLSP/TL SP WT N80am

Figura 5 Esso BA TERES EO SEA : E DEAR ooo

TEA TUR EE eee id dia rea E 3 Wee TERES E co EEE E bes o Eos, à CS REREs ZE o Roo REA oo o oo a au ao eo AOS SE ERRANTE ste ARE ata EU TVE ETA oo a USD AREA 5 = ESA Do quam E DNNA CARR SENSO EUMRC Co MTTERIZAES BD Rá

Figura 6

A e Farmacocinética de IFB-3 ug/Kkg — s m Rebif (15) E 4 M36-30K (3) 8 v M36-40K(3) Ó + F111-30K(3) 2 o F111-40K(3) ma E = 8 Tv o Ss o Ss o O o 25 5 75 100 125 150 Tempo (horas) f B Farmacocinética de IFB-15 pg/Kg E m Rebif (15) P 4 M36-30K (15) Ss 6 v M36-40K (15) + F111-30K(15) ê e F111-40K(15) m

É 3 r 2 e o G o o 50 100 150 200 250 Tempo (horas)

Figura 7

À Farmacocinética de IFB-S0 pg/kg 3 5 £ m Rebif (15) 2 4 M36-30K (50) S v M36-40K (50) PÓ + F111-30K (50) 2 e F111-40K (50) mo z o = . o so O O 50 100 150 200 250 300 B Tempo (horas) na. Farmacocinética de IFB-M36-30K É m Rebif(15) > v M36-30K (3) e + M36-30K (15) 8 4 M36-30K (50) o ce ma

E o = 8 8 o 25 50 75 100 125 150 175 Tempo (horas)

Figura 8

A Farmacocinética de IFB-M36-40K DD) E m Rebif (15) 2 v M36-40K (3) Ss + M36-40K (15) 3 4 M36-40K (50) 2 mo uz à 3 1, z o gs o O O SO 100 150 200 250 300 ; B Tempo (horas) Farmacocinética de IFB-F111-30K LE o. É m Rebif (15) > v F111-30K (3) e + F111-30K (15) õ 4 F111-30K (50)

S c g z E- há é " Ss o 8 Oo 25 60 75 100 125 150 175 Tempo (horas)

Figura 9

A Farmacocinética de IFB-F111-40K - E m Rebif (15) 2 v F111-40K (3) º so + F111-40K (15) o ô 24 F111-40K (50) 2 m L : is) ES õ Ss o O O 50 100 150 200 250 300 Tempo (horas)

B ' 2 Ccmáx = 200 2 m Rebif e à M36-30K 3 v M36-40K 2º + FIT1I-30K $ 1 e F111-40K 2 2 & o "o ã o õ O 10 20 30 40 650 60 Dosagem (pg/Kkg)

Figura 10

AUC

A 1 o wu Rebif 8 4 M36-30K es v M36-40K m E + F111-30K E S e FI1TI40K 3 É soo

E o - = o O 10 20 30 40 50 6 Dosagem (upg/Kkg) B Conc. de IFB no Soro em 168 horas É 17,5: s 18 E 12 c = o ô 7 o c ma u 2

0.0: ALSO So

OTTO O rd Pa É X Fa É - TESTE Grupo de tratamento ;

nn Figura 11

A Resposta à neopterina-grupos de dosagem de 3 po/kg . 6 E mw Placebo 2 8 —- Rebif (15) e ARS v M36-30K(3) 8 FAN + M36-40K(3) 2 FETADE q e FITI30K(3) & ATE SESDA. E me F111-40K (3) H f FREE = 1 E " E o Zz o o 100 200 300 400 Tempo (horas)

B Resposta à neopterina-grupos de dosagem de 15 po/kg E no m Placebo s 5 —t== Rebif (15) E ' . v M36-30K (15) 8 + M36-40K (15) “S 50 e F111-30K (15) 8 m F111-40K (15) É 25 E: $ ooo = q 100 200 300 400 Tempo (horas)

Figura 12

À Resposta à neopterina-grupos de dosagem de 50 po/kg = 1 E 13 mw Placebo 2 R — Rebif (15) e 1 v M36-30K(50) 8 1% + M36-40K (50) 2 7 RN + F111-30K (50) E Fido o FS m F111-40K (50) S 2318 h EE í = Ú o. rt —— 2 1 mu... E E = 0 o 100 200 300 400 " Tempo (horas)

B - o AUC versus Dosagem õ 3

DÓ o Ss m Placebo É nx 200 4 Rebif EE —— M36-30K 8 E —— M36-40K za ã sÊ 10 —e F111-30K o — F111-40K oO o o

O > < O 10 2 30 40 8 O Dosagem (pg/Kkg)

Figura 13 À Níveis de Neopterina M36-30K-168 B Níveis de Neopterina M36-40K-168 s horas pós-dosagem E horas pós-dosagem 7 E E . 2 Po 8 —— s . — eg . e + ô * 3 —s . o 2 a — S DA E Je —& a E (feto E Te = == * o º = : 8

OLLFLEIÊ SE FÊ — C NiíveisdeNeopterinaF111-320x168 —D Níveisde Neopterina F111-40K-168 E horas pós-dosagem . horas pós-dosagem E E . ' o + C

E E o — 2 2 : ã to. 3 & — 2 . s .º - 2 à . q ES TET Ss . E 1. E se E, à à Yao — Z Dá E ” SL º Zz PÁ E ” E E PS E, r A & É ".

Figura 14 AUC de Rebif IFB-Pr-001 versus BLA 1300

1200. m Rebif (IFB-Pr-001) E 190 24 Rebif (BLA) 2 Ss 2 B 2 37 o VV 5 E ao o) z 1 ' o 10 20 30 4o Dosagem (pg/Kg)

Figura 15 FESSSENIERH 1050 Antiviral T1C50 Antiviral " EEE (nom) e amb > af zZ —E— : $ NemPEGZ O 16 a? a 3 ão E 1 É ê ri FA Á z = os L, êÊ 8 e fi Horas depois da Dosagem SS os 3 e S oa > 8 z gm Vá É 3 < A s z ig à ê o É s 1 1o 1oo = à TEN-R-1a (Ufo) ? 2 Horas depois da Dosagem

Figura 16

A Expressão do gene OAS por qgPCR-3 pg/Kkg n Ss E m Veículo 2 3 —e Rebif (15) Ss & 3 — M36-30K (3) 233 e M36-40K (3) 23 —— F111-30K (3) 8 ES —e F111-40K (3) $ 55 202 o o. o 100 200 300 400 Tempo (horas) *1 ponto excluído a partir de 1 veículo animal B Expressão do gene OAS por qgPCR õ Ao ua; << E 126. mu Veículo S 3 —a Rebif (15) Ss = 3100 me M35-30K (3) 533 -” —e M36-40K (3) 88 e F111-30K (3) 9,6 —e F111-40K (3)

BE 838”

E o 40 20 30 40 50 6D 70 80 90 100 Tempo (horas)

Figura 17 À Expressão do gene OAS por qPCR-15 ug/Kkg 500 2om mu Veículo o 5 NS —m Rebif (15) E BS No à —i— M36-30K (15) 52 FS —— M36-40K (15) 8 o? —e F111-30K (15)

À 23% e) No e F111-40K (15) Ci fEiSS à os Et o 100 200 300 400 Tempo (horas) *1 ponto excluído a partir de 1 veículo animal B Expressão do gene OAS por qPCR-50 po/Kkg 7 500 $ SE E ma Veículo o 35 NA —ms Rebif (15) 8 ES 5 ERES — M36-30K (50) s* Z NY —- M36-40K (50) 8 3º NON e F111-30K (50) " BD - 82 Ss SS —e F111-40K (50) 5d DS o! 6 E ção O so 100 150 200 250 300 360 400 Tempo (horas) *1 ponto excluído a partir de 1 veículo animal

Figura 18 AUCAall de OAS1 versus Dosagem

CD

XT S : E Veículo 8! um Rebif o 2 te M36-30K e 1 —— M36-40K 3 —e F111-30K FE | —e F111-40K + Rus só = o 8 O 10 20 30 40 50 6 a Dosagem de IFN beta (Vg/Kg)

Figura 19

8 % das reações do sítio de injeção durante as primeiras 24 horas pós-tratamento Es 7o pa ata rasa East rr antro ati ra = - e o “E É à

3 A nad ; = gg marte 2 o ES E

Do a à 2 eai o * à e

Ba o AR EE HR —— ANNAN 2 " *

E * é

B ão Ei — 1 — dada - :

FA | | | o + Es

+. BE RER |)

o S ” o

O o is e = rr m— MIILSIII !

o E Ea E É

"o o EE É = " 4

R Rebif M3G-30K M36-30K M36-30K MIGAOK MAG4OK M3GA0K FA11-30K F111-30K F111-30K F1L1-40K F111-40K F121-40K ue) (1Sug) (SOvgl (Sue) (1508) (SOue) (2) (1506) (soug) (Bug) (15ug) (SOU)

Figura 20 Gama Alcaino Aarira aAsparteto — Bikmbina regina Guam Fostataso — Aminovansferase — Transaminase — Total Colesterol CEO Transaminase Grupo de Abumina| (ALP) AD 1AsT) cado | Total tc (creia, [SGD tratamento, tz [ses as | xe [eles dns ss] nº A us ns | na ne | mstus| ns |ns/as] ne ro [Ns | ne | me | ne lmslns| ne ms/ne| ne | Mas ns | as ne natas] ns ns as | ne e [es ns | me loms .mslms/|as Ins)xs| ne | TA [Ns | ne | me .ome dns ln ns nsdas| ns | Tom [es | ns | ns one dmslns las Insdss| ns | 2209 [Ns ns | ne ns lnslasloes nsdxs| ne | ES [Ns | ns | ns ms lmslus ns dnsdas | ns | fis lus [ns | se le lmalna|as (nalns) ne MIA oo | vs | nã | me LuslNsl xe InslN&l ne )

Figura 21 Proteina Niogênio Uráico Fósaro — Tola no Sangue .. Inorgânico 1mP) Trighcerideao — (SUN) Sodo Potássio Cloreto — Globulina — AbBumina Globulina Grupo de Fases Eee Fe e e de ss e ss se | xs | e [ns [us | ns me dus Ne ms dns) xe CO] no [ne | ne | meus Na ms as | we M36-30K " [ns [ns me bas me das netas xe 6-40K E] no | na | ne | na dus dns Lane das dns MEN [nã | ne Lone med xNe Lastne xs FI1-30K FI1-30K Ex NS.

NS.

NS. o) : Í ME a [na dae ns ns das das das ns US) S.

AIR] o [na Lua Las us dae usas ns (S0ug NS.

NS.

Figura 22 M36 SN MT dc AIN AS O AS CS À SF PP . = 0d. o, É E E SN À NE RN p EE RE sm MI!

Figura 23 M36 ; Ja A Zoo A MENOS

E E War aumenta o >” OI j

AH Pi * h x : e k À ASS ' t

Figura 24 COD Aee UESB OTTO - [gre . | 7 ' ! " A — FB não modificado possivel | À esamidado possivel — | ] AN | EN | A EO OR OIE Og TAC A

Figura 25 o | PEGIFBndomodícado posstel PEG-FB À Gosamendoposshei — À = . Evento de xdação 3 = -» Im ci Ne A E a ” MM ce é gra presa

| e

Figura 27 > ARA Asas DESSE METAIS meme Amu -TFBVCSAE (conto) 1 À i ” : | 1 ;

MR e É na6redundo com TCE?

Figura 28 Az) PESADIFONOSÇAF Goo) (treino.

PEGED FBVASÇAF (Rrduzdo com TOES 10 mM duarte -S tora a 4*0) : " 40KM36 =. . . HA à AA 40K M36 reduzido com TOEP.

Í : . | P F V é