KR20040104504A - 스트로크의 치료를 위한 인터페론 베타-유사 분자 - Google Patents

스트로크의 치료를 위한 인터페론 베타-유사 분자 Download PDF

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KR20040104504A
KR20040104504A KR10-2004-7014245A KR20047014245A KR20040104504A KR 20040104504 A KR20040104504 A KR 20040104504A KR 20047014245 A KR20047014245 A KR 20047014245A KR 20040104504 A KR20040104504 A KR 20040104504A
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스티븐 그라제르
토마스 사거르
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맥시겐 에이피에스
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Abstract

본 발명은 영장류 특히 인간에 있어서, 스트로크 또는 일시적 허혈성 발작을 치료하기 위한 인터페론 베타 유사 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 인터페론 베타 유사 폴리펩티드는 적어도 하나의 글리코실화 부위, 바람직하게는 적어도 하나의 생체내 N-글리코실화 부위가 도입되었다는 점에서 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO;2)와 상이하다. 임의적으로, 인터페론 베타-유사 폴리펩티드는 PEG 화 된다.

Description

스트로크의 치료를 위한 인터페론 베타-유사 분자{INTERFERON BETA-LIKE MOLECULES FOR TREATMENT OF STROKE}
인터페론은 항바이러스, 항증식성 및 면역조절 활성의 특징을 가진 중요한 사이토카인(cytokines)이다. 이들 활성들은 간염, 다양한 암 및 다발성 경화증을 포함하는 수 많은 질병에서 발견된 임상적인 이점에 대한 기초를 형성한다. 인터페론은 타입Ⅰ 및 타입Ⅱ로 나누어진다. 인터페론 β(또한 인터페론 베타, IFNB 또는 IFN-β 으로도 표시됨)는 또한 인터페론 α,τ및 ω를 포함하는 타입Ⅰ인터페론에 속하며, 반면에, 인터페론 γ는 명백한 타입Ⅱ 인터페론의 유일하게 알려진 구성원이다.
야생형 인간 IFNB 는 166 아미노산 잔기로 이루어진 분자량 22 kDa의 조절 폴리펩티드이다. 이것은 바이러스 감염 또는 다른 생물체에의 노출에 반응하여 체내의 대부분의 세포들, 특히 섬유아세포(fibroblast)에 의해 생산될 수 있다. 이것은 다중결합의 세포 표면 수용체에 결합하고, 증식성 수용체 결합은 항바이러스, 항증식성 및 면역조절성으로 분류될 수 있는 효과를 차례로 생성하는 IFNB-유도 유전자의 발현을 이끄는 단계적인 세포내 반응을 일으킨다.
야생형 인간 IFNB의 아미노산 서열은 Taniguchi, Gene 10:11-15,1980에 의해, 그리고 EP 0 083 069, EP 0 041 313 및 US 4,686,191에서 보고되었다.
사람 및 쥐의 IFNB를 위한 결정 구조들이 각각(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818,1997. J.Mol.Biol.253:187-207,1995) 보고되어왔다. 이들은 Cell Mol. Life Sci.54:1203-1206,1998에서 재검토되었다.
IFNB의 비교적 소수의 단백질-조작 변이체들이 보고되었다(WO 9525170, WO9848018, US5545723, US4914033, EP260350, US4588585, US4769233, Stewart 등, DNA Vol 6 No.2 1987, pp.119-128, 및 Runkel 등, 1998, Jour. Biol.Chem.273, No.14, pp. 8003-8008).
CHO세포에서의 IFNB의 발현의 보고되었다(US4966843, US5376567 및 US5795779).
Redlich 등, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, Vol.88, pp.4040-4044, 1991은 돌연변이 C17S를 가진 재조합 인간 IFNB의 펩타이드 스트레치(stretch)에 대응하는 합성 펩타이드에 대한 항체의 면역반응에 대하여 공개하고 있다.
특별한 글리코실화(glycosylation) 패턴을 가진 IFNB 및 이들의 제법이 보고되었다(EP 0 287 075 및 EP 0 539 300).
많은 참고문헌들은 폴리머 콘주게이션 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형에 대하여 공개하고 있다. 천연상태(native) IFNB의 폴리머 변형 또는 이들의 C17S 변이체들이 보고되었다(EP 229108, US 5382657, EP 593868, US 4917888 및WO99/55377).
US 4,904,584는 PEG화된 리신이 결손된 폴리펩티드를 공개하고 있는데, 여기서 적어도 하나의 리신(lysine) 잔기가 제거되거나 또는 다른 아미노산 잔기와 대체된다. WO 99/67291은 PEG를 가진 단백질을 컨쥬게이트하는 공정을 공개하고 있는데, 여기서 단백질의 적어도 하나의 아미노산이 제거되고, 단백질은 단백질에 콘주게이션을 달성하기에 충분한 조건하에 PEG와 접촉한다. WO 99/03887은 성장 호르몬 상과(上科)(superfamily)에 포함되는 폴리펩티드의 PEG화된 변이체에 대하여 공개하고 있는데, 여기서 시스테인(cysteine) 잔기는 폴리펩티드의 구체화된 영역에 위치된 비-필수 아미노산 잔기로 치환된다. IFNB는 성장 호르몬 상과에 포함되는 폴리펩티드의 하나의 예로 언급된다. WO 00/23114은 글리코실화되고 PEG화된 IFNB를 공개하고 있다. IFNB 융합 단백질은 WO 00/23472 에 공개되어 있다.
인터페론 β의 상업적인 조제물은 Betoseron?(또한 인터페론 β1b으로 명명되는데, 이것은 비-글리코실화되고, 재조합 박테리아 세포를 사용하여 생산되며, C17S 돌연변이를 포함하며, N-말단 메티오닌 잔기의 삭제부분을 가진다) 및 Avonex? , Rebif?(또한 인터페론 β1a으로 불리는데, 글리코실화되고, 재조합 포유류 세포을 사용하여 생산된다)으로 판매되고 있다. 이들 조제물은 다발성 경화증을 가진 환자의 치료를 위해서 사용되며, 질환의 악화율을 감소시키는데 효과적이며, 플라시보-처리한 환자와 비교했을 때 더 많은 환자가 장기간 병세의 악화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 장애의 축적 속도가 감소되었다(Neurol.51:682-689,1998).
구조 및 기능에 관한 인터페론 β1a 및 β1b의 비교는 Pharmaceut. Res. 15: 641-649, 1998에 나타나 있다.
IFNB는 다발성 경화증의 진행, 중추신경계의 진행성 염증성 퇴행성 질병의 재발을 지연시키는 것으로 나타난 첫 번째 치료상 중재(therapeutic intervention)이다. 하지만, 이것의 작용기전은 대부분 불명확한 채로 남아있다. 인터페론 β가 백혈구의 증식 및 항원 발현(antigen presentation)에 억제효과를 가지는 것으로 여겨진다. 더욱이, IFNB는 항-염증성 표현형에 대한 사이토카인의 프로파일profile)을 조절할 수 있다. 마지막으로, IFNB는 T-세포 매트릭스 금속단백질분해효소(metalloproteases)의 활성을 억제시킴으로써 T-세포 이동을 감소시킬 수 있다. 이러한 활성들은 다발성 경화증에서 IFNB의 기전을 설명하는데 기여할 것이다(Neurol. 51:682-689,1998).
뿐만 아니라, IFNB는 골육종, 기저세포암, 경부이형성(cervical dysplasia), 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 및 유두종 바이러스(papilloma virus), 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴 및 코감기바이러스와 같은 바이러스성 감염의 치료에 사용될 수 있다. 주입부위 반응, 발열, 한기, 근육통, 관절통, 유행성 감기와 유사한 증상들을 포함하는 다양한 부작용들이 현재 IFNB의 조합약의 사용과 관련되어 있다(Clin. Therapeutics, 19:883-893,1997).
WO 01/15736 은 일예로 PEG 및 글리코실화 부위와 같은 비폴리펩티드 부분에 대한 부착부위의 도입 및/또는 제거에 의 해서 변형된 IFNB 폴리펩티드에 부착된 비폴리펩티드 부분을 포함하는 신규한 IFNB 컨쥬게이트를 공개하고 있다. 분자는향상된 특성, 일예로 향상된 반감기, 및/또는 현 IFNB 제품에 대해서 증가된 중화 항체와의 감소된 반응성을 가진다.
현재, IFNB 는 스트로크 및 관련 질병의 치료 약물로 제시되고 있다(WO 01/41782; WO 02/089828; WO 02/080953 및 Veldhuis et al. Stroke, January 2002, page 346).
본 발명의 요약
본 발명은 인터페론 β1a(예를 들어, Avones 및 Rebif) 및 인터페론 β1b(예를 들어, Betaseron)보다 스트로크 및 관련된 질병의 치료에 보다 효과적인 IFNB-유사 폴리펩티드를 제공한다.
따라서, 본 발명의 제 1 측면은 영장류에서 스트로크 또는 뇌혈관 발작(CVA)의 치료제를 제조하기 위해서, 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입된 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 β(IFNB)의 이용에 관련된 것이다.
다른 일면으로, 본 발명은 영장류에서 스트로크 또는 뇌혈관 발작(CVA)을 치료하거나 또는 예방하는 방법에 관련된 것이며, 이 방법은 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되었다는 점에서, 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 β(IFNB)폴리펩티드 변이체를 효과적인 양으로 그것이 필요한 영장류에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 영장류에서 일시적 허혈성 발작의 치료용 약제의 제조를 위해서, 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되었다는 점에서 야생형 인간IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 이용에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 영장류에서 일시적 허혈성 발작을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이며, 이 방법은 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되었다는 점에서 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 β(IFNB)폴리펩티드 변이체를 효과적인 양으로 그것이 필요한 영장류에 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면들은 하기 내용들로부터 명확해질 것이다.
본 발명은 영장류, 특히 인간에 있어서, 일시적 허혈성 발작 또는 스트로크의 치료를 위한 인터페론 베타-유사 폴리펩티드의 이용에 관한 것이다.
정의
본 출원의 문맥에서는 다음의 정의들이 적용된다:
"컨쥬게이트"(또는 다른 용어로 "컨쥬게이트된 폴리펩티드")라는 용어는 1이상의 비-폴리펩티드 부분에 1이상의 폴리펩티드의 공유 결합에 의해 형성된 이종의(조성 또는 키메릭의 의미에서) 분자를 가리키는 것으로 의도된다. 공유결합이라는 용어는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분이 서로 직접적으로 공유적으로 연결되거나, 또는 폴리펩티드에 존재하는 부착기를 이용하는 브릿지, 스페이서(spacer), 또는 연결 부분 또는 부분들과 같은 개입 부분 또는 부분들을 통하여 서로 간접적으로 연결되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 컨쥬게이트는 적절한 농도 및 조건에서 가용성, 즉 혈액과 같은 생리적 액상에서 가용성이다. 본 발명에서 이용을 위한 컨쥬게이트된 폴리펩티드의 예는 글리코실화된 및/또는 PEG화된 폴리펩티드를 포함한다. "비-컨쥬게이트된 폴리펩티드"라는 용어는 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분에 대하여 사용될 수 있다.
"비-폴리펩티드 부분"이라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드의 부착기에 콘쥬게이팅할 수 있는 분자를 나타내는 것으로 의도된다. 이러한 분자의 바람직한 실시예는 폴리머 분자, 당 부분, 지방친화성 화합물 또는 유기 유도제를 포함한다. 본 발명 컨쥬게이트에서 사용될 때, 비-폴리펩티드 부분은 폴리펩티드의 부착기를 통하여 컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분에 연결된다는 것이 이해될 것이다.
"폴리머 분자"라는 용어는 2이상의 모노머의 공유결합에 의해 형성된 분자로 정의되는데, 폴리머가 사람 알부민 또는 다른 풍부한 혈장 단백질인 경우를 제외하고는, 모노머의 어느 것도 아미노산 잔기가 아니다. "폴리머"라는 용어는 "폴리머 분자"라는 용어와 바꾸어 사용될 수 있다. 바람직한 폴리머 분자는 PEG 및 mPEG를 포함한다. "폴리머 분자"라는 이 용어는 생체외 글리코실화 즉, 선택적으로 가교제를 사용하여, 탄수화물 분자의 폴리펩티드의 부착기에로의 공유결합을 생체외에서 정상적으로 관련시킴으로써 수행된 합성 글리코실화에 의해 부착된 탄수화물 분자를 커버하는 것으로 의도된다.
N- 또는 O-글리코실화와 같은 생체내 글리코실화에 의해 결합된(아래에서 더 자세하게 설명된 바와 같이)탄수화물 분자들은 여기서 "당 부분"으로 언급된다. 통상적으로 생체내 글리코실화 부위는 N-글리코실화 부위이며, 또한 O-글리코실화 부위가 본 발명에 관련된 것으로 고려된다. 글리코실화된 IFNB 변이체가 또한 IFNB변이체로 언급될 수 있다는 것이 이해되어야 한다(컨쥬게이트의 폴리펩티드 부분에부착된 당부분인 비폴리펩티드 부분을 포함함).
컨쥬게이트에서 폴리머 분자 또는 당 부분과 같은 비-폴리펩티드의 수가 명백하게 지적된 곳을 제외하고는, 컨쥬게이트에 포함된 또는 그렇지 않으면 본 발명에 사용된 "비-폴리펩티드 부분"에 대한 모든 참고문헌은 컨쥬게이트내에서, 폴리머 분자 또는 당 부분과 같은 1이상의 비-폴리펩티드 부분에 대한 참고문헌이 될 것이다.
"부착기"용어는 적절한 비-폴리펩티드 부분에 연결될 수 있는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들면, 폴리머, 특히 PEG 에 대해서 종종 사용된 부착기는 리신의 ε-아미노산기 또는 N-말단 아미노산기이다. 다른 폴리머 부착기는 유리 카르복실산기(예를 들면, C-말단 아미노산 잔기 또는 아스파르트산 또는 글루탐산잔기의 유리 카르복실산기), 적당하게 활성화된 카르보닐기, 머캡토기(예를 들어, 시스테인 잔기), 방향족산 잔기(예를 들어, Phe, Tyr, Trp), 하이드록시기(예를 들어,Ser, Thr 또는 OH-Lys), 구아니딘(예를 들어, Arg), 이미다졸(예를 들어, His) 및 산화된 탄수화물 부분을 포함한다.
생체내 N-글리코실화의 경우에, "부착기"라는 용어는 N-글리코실화 부위(N-X'-S/T/C-X''를 가진, 여기의 X'는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산이고, X''는 X'과 동일하거나 또는 상이할 수 있는 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 플로린과 다르고, N은 아스파라긴이며, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인의 어느 하나이고, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌이며, 가장 바람직하게는 트레오닌이다)를 구성하는 아미노산 잔기를 나타내기 위해 약식으로 사용된다. N-글리코실화 부위의아스파라긴 잔기가 글리코실화 동안에 당 부분이 결합되는 부분임에도 불구하고, N-글리코실화 부위의 다른 아미노산 잔기가 존재하지 않으면 이러한 결합은 달성될 수 있다. 따라서, 비-폴리펩티드 부분이 N-결합된 당 부분이면, 모 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변경과 관련하여 사용된 "비-폴리펩티드 부분을 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기"라는 용어는, 기능성의 N-글리코실화 부위가 아미노산 서열내로 도입되거나 또는 상기 서열로부터 제거되는 방식으로 변경될 수 있는 N-글리코실화부위를 구성하는 아미노산 잔기로 이해된다. "O-글리코실화 부위"의 경우, 부착기는 세린 또는 트레오닌 잔기의 OH-기이다.
용어 "용매에 노출된 그 측쇄의 적어도 25 %(또는 50 %)"가 체내 N-글리코실화 부위의 도입과 관련해서 사용될 때, 이 용어는 당 부분이 실질적으로 부착된 위치에 아미노산 체인의 표면 접근도를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 많은 경우, 당 부분이 실제적으로 부착된 아스파라긴 잔기에 상대적으로 +2 위치에 트레오닌 잔기 또는 세린 잔가를 도입하는 것이 필수적이며, 세린 또는 트레오닌 잔기들이 도입된 이들 위치는 매몰되는 것, 즉 용매에 노출되는 이들의 측쇄의 25 %(또는 50 %) 미만을 가지는 것이 허용된다.
글리코실화 부위에 부착된 당 부분은 전형적으로 시알리화(sialylated)된다. 그러나 시알산은, 예를 들어, 뉴라미니다아제에 의한 효소적 분해에 의해서 제거되어, 아시아로글리코실화된 IFNB 폴리펩티드를 생산할 수 있다(Brady et al. J.Inher. Metab. Dis.(1994) 17, 510-519 및 5,549,892). 다른 실시예에서, 당 부분은 단순히 만노오스를 함유하기 위해서 더 변형된다. 이것은 뉴라미니다아제,β-갈락토시다제 및 β-N-아세틸글루코사미니다제의 연속적 처리에 의해서 수행될 수 있다(Brady et al. J. Inher. Metab. Dis.(1994) 17, 510-519 및 US 5,549,892).
"비폴리펩티드 부분을 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기"라는 용어는 아미노산 잔기가 비폴리펩티드 부분이 결합하거나(도입된 아미노산 잔기의 경우) 또는 결합되는(제거된 아미노산 잔기의 경우)것임을 가리키는 것으로 의도된다.
구체적인 변형, 일예로 치환과 관련하여 사용된 "하나의 차이" 또는 "다르다"라는 용어는 특정 아미노산 차이와는 별개로 존재하는 추가적인 차이를 허용하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 비-폴리펩티드 부분을 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기의 제거 및/또는 도입 이외에, IFNB 폴리펩티드는 이러한 아미노산 잔기의 도입 및/또는 제거에 관련되지 않은 다른 치환들을 포함할 수 있다. 이들은 예를 들어 하나 이상의 아마노산 잔기에 의한 C-말단의 절단, 하나 이상의 아미노산 잔기에 의한 N-말단의 절단 및/또는 "보존적 아미노산 치환", 즉, 유사한 특성, 예를 들어 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산, 및 방향족 아미노산과 같은 특성을 가지는 아미노산의 그룹내에서 이루어지는 치환을 포함한다. 본 발명에 있어서, 보존적 아미노산 치환의 예로는 특히 하기 표에 열거된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
1 Alanine(A) Glycine(G) Serine(s) Threonine(T)
2 Aspartic Acid(D) Glutamic acid(E)
3 Asparagine(N) Glutamine(Q)
4 Arginine(R) Histidine(H) Lysine(K)
5 Isoleucine(I) Leucine(L) Methionine(M) Valine(V)
6 Phenylalanine(F) Tyrosine(Y) Tryptophan(W)
비-폴리펩티드 부분, 아미노산 잔기, 치환체 등에 대하여 사용된 "적어도 하나"라는 용어는 1이상을 의미한다.
본 출원에 있어서, 아미노산 명 및 원자명(예들 들면, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C 등)은 IUPAC 명명법(IUPAC 명명법 및 아미노산 및 펩타이드(잔기명, 원자명 등)를 위한 기호체계,Eur. J. Biochem.,138,9-37(1984), 이것의 보정,Eur. J. Biochem., 152,1(1985))에 기초된 프로테인 데이타뱅크(PDB)(www.pdb.org)에 의해 정의된 대로 사용된다. CA는 종종 Cα, CB 및 Cβ로 언급된다. "아미노산 잔기"라는 용어는 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소루신(Ile 또는 I), 리신(Lys 또는 K), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라긴(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(Glu 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(Val 또는 V), 트립토판(Trp 또는 W) 및 티로신(Tyr 또는 Y) 잔기로 구성되는 그룹에 포함된 아미노산 잔기를 나타내는 것으로 의도된다. 아미노산 위치/치환을 구별하기 위한 용어는 다음과 같이 예시된다:
아미노산 위치/치환을 구별하기 위한 용어는 다음과 같이 예시된다:C17는 SEQ ID NO 2에서 나타낸 아미노산 서열에서 시스테인 잔기에 의해 위치 17 이 점유된 것을 나타낸다). C17S는 17 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되었다는 것을 나타낸다. 다수 치환들은 "+"를 사용하여 표시된다. 예를 들면, R71N+D73T/S는 위치71의 아르기닌 잔기를 아스파라긴으로의 치환 및 위치73의 아스파르트산을 트레오닌 또는 세린 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 여기의 치환에 대하여 사용된 T/S는 T 또는 S 잔기, 바람직하게는 T 잔기를 의미한다. 삭제는 별표로 표시된다. 예를 들어 M1*는 위치 1 의 Met 잔기가 삭제되었다는 것을 의미한다. 삽입은 하기와 같은 방법으로 표시된다: 위치 17 에 위치한 Cys 잔기 다음 추가적인 Phe 잔기의 삽입은 C17CF 로 표시된다. 치환과 삽입은 결합은 하기와 같이 표기된다. Cys 잔기의 17 위치에서의 Ser 잔기와의 치환 및 17 위치 아미노산 잔기 다음 Phe 잔기의 삽입은C17SF 로 표시된다.
"뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 2이상의 뉴클레오티드 분자의 연속적인 스트레치를 가리키는 것으로 의도된다. 뉴클레오티드 서열은 게노믹, cDNA, RNA, 반합성의, 합성의 기원(origin) 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
"IFNB 단백질 서열 패밀리"라는 용어는 이것의 일반적인 의미 즉, 예들 들면 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 서열의 정열을 가능하게 하는 충분히 이종성 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드의 그룹을 가리키기 위해 사용된다. IFNB 서열 패밀리는 예들 들면, PFAM 패밀리, 버전 4.0으로부터 입수가능하고, 또는 디폴트 변수를 사용하는 CLUSTALW 버전 1.74와 같은 적당한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 제조될 수 있다(Thompson 등, 1994, CLUSTALW: 서열 무게, 위치-특이성 갭 페널티 및 중량 매트릭스 선택을 통하여 진행성의 다수의 서열 정렬의 감도를 향상시킴, Nucleic Acids Research,22:4673-4680).
"세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 여기서 서로 바꾸어 사용되고, 모든 이러한 용어들은 세포 성장 또는 배양으로부터 생기는 자손을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"변형" 및 "형질전환"이라는 용어는 DNA를 세포내로 도입하는 과정을 말하는 것으로 서로 바꾸어 사용된다.
"실시가능하게 결합된"이라는 용어는 서열의 정상적인 기능이 작동될 수 있도록 서로 관련된 형태에서 효소에 의한 결합(ligation) 등의 방법으로 2이상의 뉴클레오티드 서열의 공유결합을 말한다. 예들 들면, 프리시퀀스(presequence) 또는 분비 선도서열(secretory leader)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 단백질원(preprotein)으로 발현되면 폴리펩티드를 위한 뉴클레오티드 서열에 실시 가능하게 연결된다: 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는, 이것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩서열에 실시 가능하게 결합된다; 리보좀 결합부위는 이것이 번역이 용이하도록 위치되면 코딩서열에 실시 가능하게 결합된다. 일반적으로, "실시 가능하게 결합된"이라는 용어는 결합된 뉴클레오티드 서열은 인접하고, 분비 선도서열의 경우에는 인접하고 해독상(reading phase)에 있다. 결합은 일반적인 제한 부위에 연결(ligation)됨으로서 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않으면, 표준 재조합 DNA 방법과 함께 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 연결자(linker) 사용된다.
"도입"이라는 용어는 원칙적으로 존재하는 아미노산 잔기의 치환을 의미하는 것으로 의도되지만, 또한 추가적인 아미노산 잔기의 삽입을 의미할 수 있다.
"제거"라는 용어는 원칙적으로 다른 아미노산 잔기에 의해 제거될 아미노산잔기의 치환을 의미하도록 의도되지만, 또한 제거될 아미노산 잔기의 삭제(치환없이)를 의미할 수 있다.
"변형"이라는 용어는 여기서 사용되는 것과 같이 치환, 삽입, 및 삭제를 포함한다.
"돌연변이"와 "치환"은 여기서 상호 변형 가능하게 이용된다.
주어진 물질과의 관련되어 사용된 "면역원성"이라는 용어는 면역체계로부터의 반응을 유도할 수 있는 물질의 능력을 나타내는 것으로 의도된다. 면역반응은 세포 또는 항체 매개 반응일 수 있다(예를 들어, 면역원성에 대한 더 구체적인 정의에 대한 Roitt; Essential Immunology(8thEdition, Blackwell)를 참고). 면역원성은 이 기술 분야에서 공지된 적당한 방법, 예들 들면, 생체내 또는 생체외에서, 아래에 있는 재료 및 방법 부분에서 개략 화된 생체외에서의 면역원성 테스트를 사용하여 측정될 수 있다.
주어진 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트에 대한 "감소된 면역원성"이라는 용어는 컨쥬게이트 또는 폴리펩티드가 야생형 인간 IFNB, 예들 들면, Rebif 또는 Avonex, 또는 Betaseron과 같은 야생형 인간 IFNB의 변이체와 같은 대조 분자들보다 필적하는 조건에서 측정되었을 때, 측정 가능하게 낮은 면역반응을 일으키는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 여기의 대조 분자가 상업적으로 입수 가능한 IFNB 제품(즉, Betaseron, Avonex 및 Rebif)으로 만들어지면, 이것은 제형화된 제품 또는 (적절하게는)제품의 IFNB 폴리펩티드 부분을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 정상적으로, 감소된 항체 반응성(예들 들면, 상업적인 IFNB 제품으로 치료된 환자로부터의 혈청에 존재하는 항체에 대한 반응성)은 감소된 면역원성을 나타내는 표시이다.
"생체내 기능성 반감기"라는 용어는 이것의 일반적인 의미, 즉 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 주어진 기능성의 50%가 유지되는 시간(폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 생물학적 활성의 50%가 여전히 몸/목표 기관에 존재하는 시간, 또는 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 활성이 초기 값의 50%가 되는 시간과 같은)의 의미로 사용된다.
생체내 기능성 반감기를 측정하는 대신으로, "혈청 반감기", 즉 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트 분자의 50%가 청소(clear)되기 전 혈장 또는 혈류내에 순환하는 시간이 측정될 수 있다. 혈청 반감기의 측정은 종종 기능 생체내 반감기의 측정보다 더 간단하고, 혈청 반감기의 크기는 일반적으로 생체내 기능성 반감기 크기의 좋은 표시가 된다. 혈청 반감기를 대신할 수 있는 용어는 "혈장 반감기", "순환 반감기", "혈청 청소율", "혈장 청소율" 및 "청소 반감기"를 포함한다. 보유될 기능성은 항바이러스, 항증식성, 면역조절 또는 수용체 결합 활성으로부터 선택된다. 생체내 기능성 반감기 및 혈청 반감기는 이하의 재료 및 방법 부분에서 더 구체적으로 설명한 바와 같이 이 분야에 공지된 적당한 방법에 의해 측정될 수 있다.
폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 일반적으로 1이상의 세망내피계(RES), 신장, 비장 또는 간의 작용에 의해, 또는 특이적 또는 비특이적 단백질 가수분해에 의해 청소된다. 신장에 의해 일어나는 청소는 또한 "신장 클리어런스"로 언급될 수 있고, 예를 들면, 신사구체 여과, 세뇨관 분비 또는 세뇨관 배출에 의해 수행된다.정상적으로, 클리어런스는 분자량, 크기(직경)(신사구체 여과에 대한 컷 오프(cut-off)에 비례하는), 전하, 대칭, 형태/강성도, 부착된 탄수화물 체인 및 단백질에 대한 세포 수용체의 존재를 포함하는 컨쥬게이트의 물리적 특성에 따라 달라진다. 약 67kDa의 분자량은 신장 클리어런스에 대한 중요한 컷오프 값으로 여겨진다.
감소된 신장 클리어런스는 적당한 에세이(assay), 예를 들면, 확립된 생체내 에세이에 의해 확립될 수 있다. 전형적으로, 신장 클리어런스는 표지된(예들 들면, 방사성 표지된 또는 형광 표지된) 폴리펩티드 컨쥬게이트를 환자에 투여하고 환자로부터 수집된 뇨에서 표지의 활성을 측정함으로써 측정된다. 감소된 신장 클리어런스는 필적하는 조건하에서, 대응하는 비-컨쥬게이트된 폴리펩티드 또는 비-컨쥬게이트된 대응 야생형 폴리펩티드 또는 상업적인 IFNB 제품에 관련하여 측정된다.
생체내 기능성 반감기 또는 혈청 반감기에 대하여 사용된 "증가된"이라는 용어는 컨쥬게이트 또는 폴리펩티드의 적절한 반감기는, 필적하는 조건하에 측정되었을 때 비-컨쥬게이트된 와일드타입 인간 IFNB(예를 들면, Avonex 또는 Rebif) 또는 비컨쥬게이트된 변이 인간 IFNB(예를 들면, Betaseron)과 같은 대조 분자의 반감기에 비례하여 통계적으로 현저하게 증가된다.
"감소된 면역원성 및/또는 증가된 생체내 기능성 반감기 및/또는 증가된 혈청 반감기"이라는 용어는 이러한 특성들의 하나, 둘 또는 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시예에서, 여기서 기술된 본 발명의 컨쥬게이트 또는 폴리펩티드는 2 이상의 또는 이러한 특성들, 즉 감소된 면역원성 및 증가된 생체내 기능성 반감기, 감소된 면역원성 및 증가된 혈청 반감기 또는 증가된 생체내 기능성 반감기 및 증가된 혈청 반감기를 가진다.
"필적하는 조건하에서"라는 본 발명과 참고문헌에서 사용하기 위한 분자의 상대적인 특성(절대적이기 보다는)을 측정하기 위해서 사용되는 용어는 2 분자의 관련특성이 동일한 에세이를 이용하여(즉, 측정이 동일한 내부 표준을 포함하는 동일한 조건하에서 수행된다), 그리고 관련시 동일한 타입의 동물을 이용하여 측정되는 것을 가리키는 것으로 이해된다.
"IFNB 활성을 나타내는"이라는 용어는 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트가 하나이상은 천연IFNB의 특성을 가지는 것을 나타내며, 특히 SEQ ID NO 2에 나타낸 아미노산 서열(성숙한 서열인)을 가진, 글리코실화 숙주 세포 또는 상업적으로 입수 가능한 IFNB 제품에서 임의적으로 발현된 것이다. 이러한 특성은, IFNB를 결합할 수 있고, 수용체로부터 세포간 신호를 시작할 수 있는 인터페론 수용체, 특히 수용체 서브유니트 IFNAR-2 및 IFNAR-1(Domanski 등, The Journal of Biological Chemistry, Vol.273,No.6,pp 3144-3147,1998, Morgensen 등, Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069-1098,1999)로 구성된 타입 Ⅰ인터페론 수용체에 결합할 수 있는 능력, 항바이러스, 항증식성 또는 면역조절 활성(이 분야에서 공지된 에세이(예들 들면, 다음의 공개서에 인용된 것들)를 사용하여 측정될 수 있는)을 포함한다. IFNB 활성은 이하의 재료 및 방법 부분에서 예시한 바와 같이 이 분야에 공지된 방법에 의해 시험될 수 있다.
IFNB 활성을 "나타내는" 또는 "가지는" 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 이것이 측정가능한 작용, 예들 들면, 활성을 결합 및 자극하는 측정가능한 수용체를 표시할 때(예들 들면, 재로 및 방법 부분에서 설명된 제1 또는 제2 에세이에 의해 측정되었을 때) 이러한 활성을 가지는 것으로 여겨진다. IFNB 활성을 나타내는 폴리펩티드는 또한 여기서 "IFNB분자" 또는 "IFNB 폴리펩티드"라는 용어로 사용될 수 있다. "IFNB 폴리펩티드", "IFNB 변이체" 및 "변이체 폴리펩티드"라는 용어는 원칙적으로 본 발명의 변형된 폴리펩티드에 대하여 사용된다.
"모 IFNB"라는 용어는 본 발명에 따라 향상될 출발 분자를 나타내는 것으로 의도된다. 바람직하게, 모 IFNB는 IFNB 서열 패밀리에 속한다. 모 IFNB 가 척추 또는 포유류 유래(예들 들면, WO00/23472에서 정의된 어떤 기원)와 같은 어떤 기원일 수 있는 반면에, 모 IFNB는 바람직하게는 SEQ ID NO 2를 가진 야생형 인간 IFNB β또는 이것의 변이체이다.
모 IFNB 폴리펩티드의 문맥에서, "변이체"는 폴리펩티드이며, 이것은 모 IFNB 폴리펩티드, 일예로 야생형 인간 IFNB와는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 있어서 상이하다. 전형적으로 변이체는 모 IFNB 폴리펩티드, 일예로 야생형 인간 IFNB와 1-15 아미노산 잔기, 1-10 아미노산 잔기, 1-8 아미노산 잔기, 2-8 아미노산 잔기, 1-5 아미노산 잔기, 또는 2-5 아미노산 잔기에 있어서 상이하다. 그래서, 전형적으로 변이체는 모 폴리펩티드와 1 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 또는 15 아미노산 잔기에서 다른 폴리펩티드이다. 야생형 IFNB의 예는 Avonex 또는 Rebif의 폴리펩티드 부분을 포함한다. 모 IFNB 변이체의 예는 Betaseron이다. 선택적으로, 모 IFNB 폴리펩티드는 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이것은 임의적으로 하이브리드 분자내로 도입된 하나 이상의 추가적인 치환을 포함하는 인터페론 α와 같은 다른 이종성 폴리펩티드와 IFNB 사이의 하이브리드(hybrid) 분자이다. 이러한 하이브리드 분자는 SEQ ID NO2에서 나타낸 아미노산 서열로부터 10이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 모 폴리펩티드로서 유용하기 위해, 하이브리드 분자는 인터페론 β활성(예를 들면, 여기의 재료 및 방법에 설명된 제2 에세이에서 측정된 바와 같이)을 나타낸다. 본 발명에 있어서 모 IFNB 분자로서 작용할 수 있는 야생형 인간 IFNB 변이체의 다른 실시예는 WO 01/15736 에서 기술되어 있으며, 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 도입 및/또는 제거된 아미노산 서열을 가지며, 또 WO 00/23114, WO 00/23472, WO 99/3887 또는 그렇지 않으면 종래 이용가능한 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트에 대하여 사용된 "기능성 부위"라는 용어는 인터페론 β의 작용 또는 수행에 필수적이거나 또는 관련되어, 따라서 기능성 부위에 "위치된" 1이상의 아미노산 잔기를 나타내도록 의도된다. 기능성 부위는 예를 들면, 수용체 결합 부위이며, 이 분야에 공지된 방법, 바람직하게는 IFNAR-1 및 IFNAR-2에 의해 구성된 타입 Ⅰ인터페론 수용체와 같은 적절한 수용체에 결합된(complexed) 폴리펩티드의 구조 분석에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 문맥에 있어서, 용어"증가된 글리코실화"는 증가된 수준의 부착된 탄화수소 분자를 의미하며, 통상적으로 증가된(또는 나아진)글리코실화 부분의 이용의 결과로서 얻어진다. 증가된 글리코실화는 부착된 탄화수소 구조를 분석하는 종래의 공지된 적절한 방법에 의해서 측정될 수 있다. 부착된 탄화수소 구조를 측정하는 한 통상적인 측정법은 여기서 실시예 7 과 8 에서 기술된다.
글리코실화부위에 "근접하게 위치된"아미노산 잔기는 일반적으로 당부분이 부착되는 글리코실화 부위의 아미노산 잔기와 관련하여 -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 또는 +4 위치에 위치하며, 특히 -2, -1, +1 또는 +2 이며, 일예로 -1 또는 +1 이며, 특히 -1 이다. 이들 위치들은 부위에서 글리코실화를 증가시키기 위해서 변형될 수 있다. 통상적으로 변형은 치환이며, 치환은 모 IFNB 폴리펩티드에 비해서 IFNB 변이체의 증가된 글리코실화를 야기하는 어떤 적절한 다른 아미노산 잔기로 만들어진다. 그러한 아미노산 잔기는 실험의 시행오차 방식으로 결정될 수 있다(예를 들어, 어떤 다른 아미노산 잔기에 대한 상대적인 위치의 아미노산 잔기의 치환, 및 결과적인 변이체의 결과적인 글리코실화의 결정).
여기서 사용되는 용어"자연적으로 발생한 글리코실화 부위" 는 N80 및 T82 에 의해서 결정되는 N-글리코실화 부위를 의미하는 것으로 의도된다.
여기서 사용되는 용어"스트로크"는 혈류의 결핍 또는 뇌로의 불충분한 산소로 인한 뇌 세포의 죽음으로부터 유래하는 조건을 의미하는 것으로 의도된다. 용어"스트로크" 및 "뇌혈관 발작"(또는 "CVA")은 여기서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 설명한 바와 같이, 스트로크는 허혈성 또는 출혈성일 수 있다. 허혈성 스트로크의 특정예로는 색전 스트로크, 심장 색전 스트로크, 혈전성 스트로크, 대용기(large vessel) 혈전증, 열공(lacunar) 파열, 동맥-동맥 스트로크, 및 원인불명 스트로크이다. 출혈성 스트로크의 특정예로는 경막하 스트로크, 인트라파렌키말(intraparenchymal stroke)스트로크, 경막외 스트로크 및 지주막하스트로크를 포함하는 출혈성 스트로크이다.
다른 문맥에서, 용이 "일시적 허혈성 스트로크"는 순간적인 뇌의 혈액 공급에서의 부족에서 야기되는 뇌기능의 장애를 커버하는 것으로 의도된다.
본 발명에서 변이체의 이용
본 발명의 바람직한 실시예에서, IFNB 폴리펩티드는 야생형 인간 IFNB의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 적어도 하나의 도입된(추가된) 생체내 글리코실화 부위를 포함한다. 도입된 생체내 글리코실화 부위는 O-글리코실화 부위일 수 있으나, 그러나 바람직하게는 N-글리코실화 부위이다. 당부분이 글리코실화 부위에 부착되는 것을 보증하기 위해서, 그러한 글리코실화 변이체가 글리코실화를 할 수 있는 숙주세포에서 생산되어야 한다는 것이 이해될 것이다.
그래서, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 적어도 하나의 생체내 N-글리코실화 부위가 도입되었다는 점에서 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 IFNB 폴리펩티드 변이체를, 영장류, 특히 인간에 있어서 스트로크 또는 일시적 허혈성 발작의 치료를 위한 약제로서 이용에 관한 것이다.
보다 바람직하게는, 생체내 N-글리코실화 부위는, 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기, 바람직하게는 25% 이상의 용매에 노출된 측쇄로, 특히 50%이상(이들 위치들은 방법 섹션에서 확인된다) 용매에 노출된 측쇄에 의해 점유된 모 IFNB 분자의 위치내로 도입된다. 생체내 N-글리코실화 부위는 상기 부위의 N-잔기가 상기 부위에 위치하도록 하는 방식으로 도입된다. 비슷하게, o-글리코실화 부위는 이러한 부위를 구성하는 S 또는 T 잔기가 상기 자리에 위치되도록 도입된다. 더욱이, 효율적인 글리코실화를 확실하게 하기 위해, 생체내 글리코실화 부위, 특히 N-글리코실화 부위의 N 잔기 또는 O-글리코실화 부위의 S 또는 T 잔기가 IFNB 폴리펩티드의 일차 141 아미노산 잔기내에, 더 바람직하게는 일차 116 아미노산 잔기내에 위치되는 것이 바람직하다.
모 IFNB 분자의 표면에 노출되고, 25%이상의 용매에 노출된 측쇄를 가진 아미노산 잔기에 의해 점유된 위치에서 추가적인 N-글리코실화 부위에 이르게 되는 치환은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환을 포함한다.
S2N+N4S/T, L6S/T, L5N+G7S/T, F8N+Q10S/T, L9N+R11S/T, R11N, R11N+S13T, S12N+N14S/T, F15N+C17S/T, Q16N+Q18S/T, Q18N+L20S/T, K19N+L21S/T, W22N+L24S/T, Q23N+H25S/T, G26N+L28S/T, R27N+E29S/T, L28S+Y30S/T, Y30N+L32S/T, L32N+D34S/T, K33N+R35S/T, R35N+N37S/T, M36N+F38S/T, D39S/T, D39N+P41S/T, E42N+I44S/T, Q43N+K45S/T, K45N+L47S/T, Q46N+Q48S/T, L47N+Q49T/S, Q48N+F50S/T, Q49N+Q51S/T, Q51N+E53S/T, K52N+D54S/T, L57N+I59S/T, Q64N+I66S/T, A68N+F70S/T, R71N+D73S/T, Q72N, Q72N+S74T, D73N, D73N+S75T, S75N+T77S, S75N, S76N+G78S/T, E81N+I83S/T, T82N+V84S/T, E85N+L87S/T, L88S/T, A89N+V91S/T, Y92S/T, Y92N+Q94S/T, H93N+I95S/T, L98S/T, H97N+K99S/T, K99N+V101S/T, T100N+L102S/T, E103N+K105S/T, E104N+L106S/T, K105N+E107S/T, E107N+E109S/T, K108N+D110S/T, E109N+F111S/T, D110N+T112S, D110N, F111N+R113S/T, R113N+K115S/T, G114N+L116S/T, K115N+M117S/T, L116N, L116N+S118T, S119N+H212S/T, L120N+L122S/T,H121N+K123S/T, K123N+Y125S/T, R124N+Y126S/T, G127N+I129S/T, R128N+L130S/T, L130N+Y132S/T, H131N+L133S/T, K134N+K136S/T, A135N+E137S/T, K136N+Y138S/T, E137N, Y138N+H140S/T, H140N+A142S/T, V148N+I150S/T, R152N+F154S/T, Y155N+I157S/T, L160S/T, R159N+T161S, R159N, G162N+L164S/T 및 Y163N+R165S/T.
50%이상의 용매에 노출된 측쇄를 가진 IFNB 분자의 표면에 노출된 위치에서 추가적인 생체내 N-글리코실화 부위의 도입을 이끄는 치환들은
L6S/T, L5N+G7S/T, F8N+Q10S/T, L9N+R11S/T, S12N+N14S/T, F15N+C17S/T, Q16N+Q18S/T, K19N+L21S/T, W22N+L24S/T, Q23N+H25S/T, G26N+L28S/T, R27N+E29S/T, Y30N+L32S/T, K33N+R35S/T, R35N+N37S/T, M36N+F38S/T, D39S/T, D39N+P41S/T, E42N+I44S/T, Q46N+Q48S/T, Q48N+F50S/T, Q49N+Q51S/T, Q51N+E53S/T, K52N+D54S/T, L57N+I59S/T, R71N+D73S/T, D73N, D73N+S75T, S75N+T77S, S75N, S76N+G78S/T, E81N+I83S/T, T82N+V84S/T, E85N+L87S/T, A89N+V91S/T, Y92S/T, Y92N+Q94S/T, H93N+I95S/T, T100N+L102S/T, E103N+K105S/T, E104N+L106S/T, E107N+E109S/T, K108N+D110S/T, D110N+T112S, D110N, F111N+R113S/T, R113N+K115S/T, L116N, L116N+S118T, K123N+Y125S/T, R124N+Y126S/T, G127N+I129S/T, H131N+L133S/T, K134N+K136S/T, A135N+E137S/T, E137N, V148N+I150S/T 및 Y155N+I157S/T을 포함한다.
상기 리스트에서 언급된 치환들 중에서, 141 N-말단 아미노산 잔기들 중에서, 특히 116 N-말단 아미노산 잔기 중에서 도입된 N 잔기를 가지는 것들이 바람직하다.
현재 가장 바람직한 치환들은 S2N+N4T/S, L9N+R11T/S, R11N, S12N+N14T/S, F15N+C17S/T, Q16N+Q18T/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S, L28N+Y30T/S, D39T/S, K45N+L47T/S, Q46N+Q48T/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S, Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S, N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S, E104N+L106T/S, E107N+E109T/S, K108N+D110T/S, D110N, F111N+R113T/S 및 L116N 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 치환을 포함하며, 보다 바람직하게는 S2N+N4T, L9N+R11T, Q49N+Q51T, R71N+D73T 및 F111N+R113T으로 이루어진 그룹에서 선택되고, 보다 더 바람직하게는 Q49N+Q51T, R71N+D73T 및 F111N+R113T이며, 특히 Q49N+Q51T 및 F111N+R113T 으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
바람직한 IFNB 변이체의 특정 예는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환을 포함한다.
Q49N+Q51T+F111N+R113T,
Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+ R113T,
S2N+N4T+F111N+R113T,
S2N+N4T+Q49N+Q51T,
S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T,
S2N+N4T+L9N+R11T+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
L9N+R11T+Q49N+Q51T,
L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T 또는
L9N+R11T+F111N+R113T.
가장 바람직하게는 IFNB 변이체가 치환 Q49N+Q51T+F111N+R113T를 포함한다(두개의 추가적인 생체내 N-글리코실화 부위의 도입에 이르게 된다).
기능성의 생체내 글리코실화 부위를 도입하기 위해서는 N-잔기 및 S/T 잔기사이에서의 아미노산은 프롤린과는 다르다는 것이 이해될 것이다. 정상적으로, 사이에서의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO2에서 나타낸 아미노산 서열에서 적절한 위치를 점유하는 것이 될 것이다. 예를 들면, 치환 Q49N+Q51T를 포함하는 폴리펩티드에서 위치50이 사이(in between) 위치이다.
IFNB 변이체는 단일의 생체내 글리코실화 부위를 포함할 수 있다(예를 들어, N80 에서 자연적으로 발생한 생체내 N-글리코실화 부위). 그러나, 모 폴리펩티드의 표면상에 존재하는 에피토프의 효율적인 차폐를 얻기 위해서는 폴리펩티드가 1 이상의 생체내 글리코실화 부위, 특히 2,3,4,5,6 또는 7 생체내 글리코실화 부위와 같은 2~7, 또는 2~5 글리코실화 부위를 포함하는 것이 종종 바람직하다. 따라서, IFNB 폴리펩티드는 하나의 추가적인 글리코실화 부위를 포함할 수 있고(위치 N80 에서 이미 존재하는 자연 발생한 생체내 N-글리코실화 부분에 더하여), 또는 1-6 또는 1-4 첨가(도입된)적인 생체내 글리코실화 부위, 일예로 1,2,3,4,5 또는 6 의 첨가(도입) 생체내 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 생체내 글리코실화 부위는 생체내 N-글리코실화 부위이다. 추가적으로, IFNB 변이체는 하나의 당 부분을 포함할 수 있으며(예를 들어, N80 에서 존재하는 자연 발생하는 당 부분), 그러나 IFNB 변이체가 하나 이상의 당부분, 특히 2-7 또는 2-5 당부분, 일예로 2,3,4,5,6, 또는 7 당부분을 포함하는 것이 바람직하다.
매우 바람직한 실시예에서, IFNB 폴리펩티드는 세 개의 생체내 N-글리코실화 부위(즉, 두개의 첨가(도입된) 생체내 N-글리코실화 부위(자연발생적인 N80 N-글리코실화 부위 이외에))를 포함하며, 즉 IFNB 변이체는 3 개의 생체내 N-글리코실화 부위와 3 개의 당부분을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 3 개의 생체내 N-글리코실화 부위는 위치 49, 80, 111 에 존재한다.
추가적인 변형
상기 공개된 어떤 글리코실화 변이체도 더 변형될 수 있다.
예를 들어, IFNB 폴리펩티드가 시스테인 잔기, 즉 SEQ ID NO 2 의 위치 17 에 존재하는 시스테인 잔기가 없다는 것은, 매우 바람직하다. 바람직하게는, 시스테인 잔기는 C17S 치환에 의해서 제거되었다.
따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 적어도 하나의 생체내 N-글리코실화 부위가 도입되었으며, 그리고 여기서 위치 17 에 위치한 시스테인 잔기가 제거되었다는 점에서 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 IFNB 폴리펩티드 변이체를, 영장류, 특히 인간에 있어서 스트로크 또는 일시적 허혈성 발작의 치료를 위한 약제로서 이용에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 시스테인 잔기는 치환 C17S 에 의해서 제거된다.
특히 바람직한 IFNB 변이체의 특정 실시예는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환을 포함하는 변이체를 포함한다.
C17S+Q49N+Q51T,
C17S+F111N+R113T,
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
C17S+Q49N+Q51T+R71N+D73T+F111N+R113T,
S2N+N4T+C17S+F111N+R113T,
S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T,
S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T,
L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T 및
L9N+R11T+C17S+F111N+R113T.
가장 바람직하게는, IFNB 변이체가 치환 C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T(두 개의 첨가적인 생체내 N-글리코실화 부위를 위치 49 및 111 에 도입하고, 위치 17 시스테인 잔기의 제거에 이르게 됨)을 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, IFNB 변이체는 부위에서 글리코실화를 증가시키거나 또는 최적화시키기 위해서 글리코실화 부위에 근접하게 위치하는 하나 이상의 치환을 더 포함할 수 있다. 특정 예가 pp. 14-23, WO 02/074806 에서 "Variantwith increased glycosylation" 제목의 섹션에 기술된다.
발명의 흥미로운 실시예에서, IFNB 변이체는 위치 48 에서 아미노산 치환을 포함하며, 특히 변이체가 도입된 생체내 N-글리코실화 부위를 위치 49 에 가지는 경우이다. 바람직하게, 위치 49 에 위치한 글루타민 잔기는 소수성 아미노산 잔기, 일예로 Q48F, Q48V, Q48W 또는 W48T로 치환된다.
매우 바람직한 실시예에서, IFNB 변이체는 위치 110 에서 아미노산 치환을 포함하며, 특히 변이체가 위치 111 에서 도입된 생체내 N-글리코실화 부위를 포함할 경우이다. 바람직하게, 위치 110 에 위치한 아스파틱 산 잔기는 소수성 아미노산 잔기, 일예로 D110F, D110V, D110W, 또는 D110Y 로 치환된다. 특히 바람직한 실시예에서, 변이체는 치환 D110F 를 포함하며, 바람직하게는 F111N+R113T/S, 특히 F111N+R113T 와 조합될 경우이다.
따라서, 특히 바람직한 IFNB 변이체의 특정 실시예는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환을 포함하는 변이체를 포함한다.
D110F+F111N+R113T,
Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
Q49N+Q51T+R71N+D73T+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
L9N+R11T+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T 및
L9N+R11T+D110F+F111N+R113T.
보다 더 바람직하게는, IFNB 변이체는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 치환을 포함한다.
C17S+D110F+F111N+R113T,
C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
C17S+Q49N+Q51T+R71N+D73T+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+C17S+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T 및 L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T.
가장 바람직하게는, IFNB 변이체는 치환 C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T (SEQ ID NO 3)을 포함한다.
접합
상기 공개된 글리코실화된 변이체는 당 부분과는 상이한 비폴리펩티드 부분에 더 접합될 수 있다. 특정 실시예가 WO 01/15736 호에서 섹션 "Conjugate of the invention, wherein the non-polypeptide moiety is a molecule that has lysin as an attachment group"(pp 17-22), "Conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety binds to a cysteine residue"(pp. 22-23) 및 "Conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety binds to an acid group"(pp. 23-25)에 기술되어 있다.
비폴리펩티드 부분을 위한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기를 제거 및/또는 도입함으로서, 특정적으로 폴리펩티드를 조절하는 것이 가능해지고, 접합 패턴을 최적화하도록, 선택 비폴리펩티드 부분에 대한 접합에 보다 민감한 분자를 만들게 된다(예를 들어, 비폴리펩티드 부분의 IFNB 분자의 표면에서의 최적 분포를 보장하고 이에 의해 효과적으로 예를 들어 에피토프와 그리고 폴리펩티드의 다른 표면 부분을 그 기능을 손상시킴이 없이 차폐하는 것). 예를 들어, 부착기의 도입에 의해서 IFNB 폴리펩티드는 적절한 비폴리펩티드 부분이 결합하고, 그에 의해 보다 효과적이고, 특정적인, 및/또는 광대한 접합이 이루어지는 특정 아미노산 잔기의 내용에 늘어나거나 또는 변형된다. 하나 이상의 부착기 그룹의 제거에 의해서, 그러한 접합이 불리한, 예를 들어 폴리펩티드의 기능성 부위의 근처 또는 부위에 위치한 아미노산 잔기에 폴리펩티드 부분에서 비폴리펩티드에 대한 접합을 피하는 것이 가능해 진다(그러한 부위에서 접합은 손상된 수용체 인식 때문에 결과적인 접합체의 IFNB 활성의 감소 또는 비활성에 이르게 된다). 또한 그러한 그룹에 대한 이종 접합을 피하기 위해서, 다른 부착기에 가깝게 위치한 부착기를 제거하는 것이 유익하다.
비폴리펩티드 부분에 대한 부착기를 포함하는 아미노산 잔기는, 그것이 제거되거든 또는 도입되든, 비폴리펩티드의 기본 특성과, 그리고 대부분의 경우, 사용되는 접합 방법에도 기초하여 선택된다. 예를 들어, 비폴리펩티드 부분이 폴리머 분자인 경우, 일예로 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 옥사이드 유도 분자인 경우, 부착기로서 기능할 수 있는 아미노산 잔기는 리신, 시스테인, 아스파틱 산, 글루탐산 및 아르기닌으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 비폴리펩티드 부분이 당 부분인 경우에는 부착기는 생체내 글리코실화 부위, 바람직하게는 N-글리코실화 부위 일 수 있다. 비폴리펩티드 부분에 대한 부착기가 도입되거나 또는 IFNB 폴리펩티드로부터 제거될 때마다, 변형되는 IFNB 폴리펩티드의 위치는 하기와 같은 방식으로 통상적으로 선택된다:
위치는 IFNB 폴리펩티드의 표면에 바람직하게 위치하며, 그리고 보다 바람직하게는 적어도 25 % 의 측쇄가 용매에 노출된 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 50 % 의 측쇄가 용매에 노출된 아미노산 잔기에 의해서 점유된다. 그러한 위치는 3D 구조의 야생형 인간 IFNB 분자의 분석에 기초하여 규명되며, 여기서는 방법 섹션에 기술되어 있다.
기능성 생체내 반감기는 접합체의 분자량에 달려있으며, 그리고 증가된 반감기를 제공하는데 필요한 부착기의 수는 그래서 비폴리펩티드의 분자량에 달려있다. 한 실시예에서, 본 발명의 이용을 위한 접합체가 적어도 67 kDa 의 분자량을 가지며, 특히 적어도 70 kDa 를 가지며, 이는 Laemmli, U.K., Nature Vol 227(1970), p680-85 에 따라서 SDS-PAGE 에 의해서 측정되었다. IFNB 는 약 20 kDa 의 분자량을 가지며, 그리고 추가적으로 약 50 kDa 가 소정의 효과를 얻기 위해서 필요하다. 이것은 5, 10, 12, 또는 20 kDa PEG 분자에 의해서 예를 들어 제공될 수 있으며,또는 여기서 기술된 것들이다.
본 발명의 이용을 위한 접합체는 하나 이상의 하기 향상된 특성을 가진다(필적하는 조건에서 측정시).
야생형 인간 IFNB(예를 들어, Avonex 또는 Rebif) 또는 Betaseron 에 비해서 감소된 면역원성, 일예로 적어도 25 % 감소, 보다 바람직하게는 적어도 50 % 감소, 보다 더 바람직하게는 적어도 75 % 감소.
야생형 인간 IFNB(예를 들어, Avonex 또는 Rebif) 또는 Betaseron 에 비해서 증가된 기능성 생체내 반감기 및/또는 증가된 혈청 반감기
야생형 인간 IFNB (예를 들어, Avonex 또는 Rebif) 또는 Betaseron 로 처리된 양친으로부터 중화항체와의 감소된 또는 없어진 반응, 예를 들어, 야생형 인간 IFNB(예를 들어, Avonex 또는 Rebif) 또는 Betaseron 에 비해서 적어도 25 % 의 중화 감소, 일예로 적어도 50 %, 그리고 바람직하게는 적어도 75 % 의 감소.
본 발명에서 이용을 위한 접합체의 항바이러스 활성의 크기는 중요하지 않을 수 있으며, 그리고 야생형 인간 IFNB(예를 들어, Avonex 또는 Rebif) 또는 Betaseron 에 비해서 그래서 감소되거나(예를 들어 75 %까지), 또는 증가되거나(예를 들어 적어도 5 %), 또는 등가일 수 있다.
또한, 항바이러스 활성의 정도는 본 발명에서 이용을 위한 접합체의 항증식성 활성과 비교하여 변할 수 있으며, 그래서 야생형 인간 IFNB 에 비해서 더 높거나, 낮거나, 또는 동일할 수 있다.
비폴리펩티드 부분은 바람직하게는 폴리머 분자, 일예로 PEG이며, 그리고 폴리머는 변이체의 아미노산 잔기에 공유적으로 부착되고, 여기서 아미노산 잔기는 폴리머 분자에 대한 부착기를 포함한다. 그러한 부착기의 예는 WO 03/002152 의 7-8 페이지에 있는 표에 보여진다. 바람직한 부착기는 N-말단 아미노기를 포함하며, 리신 잔기의 ε-아미노 기와 시스테인 잔기의 -S-H 기, 특히 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 아미노기를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 모 폴리펩티드의 적어도 하나의 리신 잔기가 제거되며, 예를 들어 어떤 상기 섹션 "Conjugate of the invention, wherein the nonpolypeptide moiety is a molecule which has lysine as an attachment group", pp. 17-23, WO 01/15736 에 언급된 것들이다.
그래서, 본 발명의 일 측면의 실시예에서, IFNB 변이체의 아미노산 서열은 인간 야생형 IFNB와 적어도 하나의 리신이 제거되었다는 점에서 상이하다. 전형적으로, 1-5 리신 잔기가 제거되고, 특히 1-4, 또는 1-3 리신잔기가 제거된다. 제거되는 리신 잔기는 바람직하게는 치환에 의해서 제거되며, K19, K33, K45, K52, K105, K108, K115, K123, K134 및 K136, 바람직하게는 K19, K33, K45,및 K123 이다. 리신 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있지만, 그러나 최소의 구조적 차이를 야기하기 위해서 아르기닌 또는 글루타민 잔기로 대체되는 것이 바람직하다.
따라서, 여기서 공개된 IFNB 변이체는 하기로 구성된 그룹에서 선택된 치환을 더 포함할 수 있다 .
K19R, K33R, K45R, K123R, K19R+K33R, K19R+K45R, K19R+K123R, K33R+K45R,K33R+K123R, K45R+K123R, K19R+K45R+K123R, K19R+K33R+K123R, K19R+K33R+K45R, K33R+K45R+K123R 및 K19R+K33R+K45R+K123R, 바람직하게는 K19R+K45R+K123R, K19R+K33R+K123R, K19R+K33R+K45R 및 K33R+K45R+K123R, i특히, K19R+K33R+K45R.
그래서, 적어도 하나의 비폴리펩티드 부분, 일예로 폴리머 분자, 특히 PEG가 공유적으로 변이체의 아미노산 잔기의 부착기에 부착하는 바람직한 IFNB 컨쥬게이트의 특정예는 하기로 이루어진 그룹에서 선택되는 치환을 포함하는 IFNB 변이체를 포함한다.
C17S+Q49N+Q51T+K19R+K33R+K45R,
C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
C17S+Q49N+Q51T+R71N+D73T+D110F+F111N+ R113T+K19R+K33R+K45R,
S2N+N4T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R 및
L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R, 특히 C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R.
IFNB 변이체가 PEG 화될 때, 이것은 보통 1-5 폴리에틸렌글리콜(PEG)분자를 포함한다. 다른 실시예에서, IFNB 분자는 1-5 PEG 분자, 일예로 1-3 PEG 분자, 예를 들어, 1, 2, 또는 3 PEG 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 각각 PEG 분자는 약 5 kDa(킬로 달톤)에서 100 kDa, 일예로 10 kDa 에서 40 kDa, 예를 들어, 약 12 kDa 또는 약 20 kDa의 분자량을 가진다. 특히 바람직한 실시예에서, IFNB 변이체는 약 20kDa 의 분자량을 가지는 1 PEG 분자를 포함한다.
여기서 폴리머 분자에 대해서 사용될 때, "약" 이라는 용어는 대략적인 평균 분자량을 가르키며, 주어진 폴리머 제법에서 어떤 분자량 분포가 통상적으로 존재할 수 있다는 사실을 반영한다.
적절한 PEG 분자는 Shearwater Polymers, Inc. 와 Enzon, Inc. 에서 구입할 수 있으며, SS-PEG, NPC-PEG, 알데히드-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, 트레실레이티드 mPEG(tresylated)(US 5,880,255), 또는 옥시카르보닐-옥시-N-디카르복시이미드-PEG(US 5,122, 614)으로부터 선택될 수 있다.
컨쥬게이트 제조 방법
여기서 공개된 IFNB 변이체에 대한 특히 PEG 고분자, 비폴리펩티드 부분의 접합에 관련된 상세한 사항은 "Methods of preparing a conjugate of the invention". pp.32-40, in WO 01/15736 의 섹션에서 주어진다.
당부분에 커플링
여기서 기술된 IFNB 폴리펩티드의 생체내 글리코실화을 성취하기 위해서, IFNB 변이체를 엔코팅하는 뉴클레오티드 서열은 글리코실화, 유카요틱 발현 숙주, 일예로 CHO 세포에 삽입되어야 한다. 적절한 발현 숙주 세포는 WO 01/15736 의 "coupling to a sugar moiety" 섹션에 기술된다.
IFNB 변이체를 제조하는 방법
본 발명에서 사용되는 IFNB 변이체, 임의적으로 글리코실화된 형태는 공지의 적절한 방법을 통해서 제조될 수 있다. 그러한 방법은 폴리펩티드 변이체를 엔코딩 하는 적절한 뉴클레오티드 서열을 구축하는 것과 적절한 변형 또는 감염된 호스트에서 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 그러나, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드는 덜 효율적이기는 하지만, 화학적 합성 또는 화학적 합성과 재조합 DNA 기술의 조합에 의해서 생산될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 IFNB 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 , 예를 들어 SEQ ID NO:2 에서 나타나는 아미노산 서열로, 모 IFNB를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하거나 또는 분리하고, 다음 뉴클레오티드 서열을 변화시켜, 관련된 아미노산 잔기를 도입(예를 들어, 사입 또는 치환) 또는 제거(예를 들어, 결실 또는 치환)에 영향을 미치게 함으로서 구축될 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 통상적으로 부위-지정 돌연변이에 의해서 공지된 방법에 따라서 변형되며, "Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66(1984);와 미국 특허 제 4,588,585 호를 참조할 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오티드 서열은 화학적 합성에 의해서 제조될 수 있는데, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하는 것, 여기서 올리고뉴클레오티드는 소정의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 설계되고, 그리고 바람직하게는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주세포에서 선호되는 이들 코돈들을 선택하는 것에의한다. 예를 들어, 소정의 폴리펩티드를 위한 몇몇 적은 올리고뉴클레오티드 코드화는 합성될 수 있으며, 그리고 PCR, 결찰, 또는 결찰 사슬반응(LCR) 에 의해서 어셈블될 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 5' 또는 3' 오버행을 상보성 어셈블리에 대해서 함유한다.
일단 어셈블(합성, 부위지정 돌연변이 또는 다른 방법에 의해서)되면, IFNB 폴리펩티드 엔코딩 뉴클레오티드 서열은 재조합 벡터에 삽입되고, 소정의 변형된 숙주 세포에서 IFNB 변이체의 발현에 필수적인 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
적절한 발현 벡터, 조절 서열, 숙주 세포, 생산 배지, 정제 기법 등을 포함하는 여기서 기술된 IFNB 변이체의 생산에 관한 상세 사항은 WO 01/15736 에서 pp 43-51 의 "Methods of preparing an interferon β polypeptide for use in the invention" 섹션에서 찾아볼 수 있다.
IFNB 폴리펩티드의 생화학적 활성은 공지의 적절한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 그러한 측정법은 항바이러스 활성의 항체 중화, 단백질 키나이제의 유도, 올리고아데닐레이트 2,5-A 합성 또는 포스포디에스테르아제 활성을 포함하며, EP 0 41 313 B1 에 기술되어 있다. 그러한 측정법은 또한 면역조절성 측정(US 4,753,795 참조), 성장 억제성 측정, 및 인터페론 수용체를 발현하는 세포에 대한 결합성 측정을 포함한다.
본 발명의 용도를 위한 폴피펩티드 또는 컨쥬게이트의 생화학적 활성을 결정하는 특정 측정법은 여기서 재료 및 방법 섹션에서 여기서 공개된다.
약제학적 조성물
본 발명의 IFNB 분자는 "그 자체로" 및/또는 이것의 염 형태로 사용될 수 있다. 적당한 염은 제한적이지는 않지만, 예를 들면, 아연염 뿐아니라 알칼리 금속 또는 소듐, 포타슘, 리듐, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알카리 토금속 염을 포함한다. 이들 염 또는 복합체들은 결정 구조 및/또는 비결정 구조로 존재할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 바람직하게는 약제학적으로 수용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 조성물로 투여된다. "약제학적으로 수용가능한"이라는 말은 투여된 환자에게 역효과를 발생시키지 않는 캐리어 또는 부형제를 의미한다. 이러한 약제학적으로 수용가능한 캐리어 및 부형제는 이 기술 분야에 공지되어 있다.
IFNB 분자는 널리 공지된 방법으로 약제학적 조성물로 제형될 수 있다. 적당한 제형들은 US 5,183,746, Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin, 18thedition,A.R.Gennaro, Ed., Mack Pulishing Company[1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S.Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor&Francis[2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A.Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press[2000])에 설명되어 있다.
IFNB 분자는 액상, 겔, 동결건조, 폐 확산 또는 다른 적당한 형태, 예를 들면, 압축된 고체를 포함한 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 바람직한 형태는 치료되는 특정 징후에 따라 달라질 것이며 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게명백할 것이다.
약제학적 조성물은 비경구적으로(예를 들어, 정맥내로, 근육내로, 복강내적으로, 또는 피하적으로), 경구적으로, 뇌속으로, 경피적으로, 코를 통해, 폐내로, 흡입 또는 다른 수용할 수 있는 방식으로, 예를 들면 PowderJect 또는 ProLease technology를 사용하여 투여될 수 있다. 바람직한 투여의 형태는 치료되는 특정 징후에 따라 달라질 것이며, 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
적절한 약제학적 조성물의 상세한 설명은 WO 01/15736 호에서 52 - 61 페이지의 "Pharmaceutical composition and uses of a conjugate of the invention" 섹션에서 주어진다.
본 발명의 바람직한 약제학적 조성물의 실시예는 설포알킬 에테르 사이클로덱스트린 유도체, 일예로 Captisol(Cydex, Overland Park, Kansas, US 에서 구입가능)이다. 여기서 공개된 IFNB 변이체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 상세한 사항과 설포알킬 에테르 사이클로덱스트린 유도체는 WO 03/002152 의 37-49 페이지의 "The sulfoalkyl ether cyclodextrin derivative" 섹션에서 발견될 수 있다.
치료적 용도
여기서 공개된 변이체와 접합체는 주로 신경성 또는 정신적 증후군, 안과적 질병, 심장질환, 심폐적 질병, 호흡기 질병, 신장, 비뇨기 및 생식 질병, 위창자 질병, 및 내분비와 대사적 비정상을 가지는 중추신경계 또는 말단 신경계의 인간 질병 치료적 또는 예방적 조치에 유용하다. 특히, 그러한 조건 및 질병은 염증을포함하는데, 예를 들어, 신경 염증 과정이며, 이것은 중추 신경계 조직, 말단 신경계조직, 심장 조직 또는 일예로 뇌, 심장, 또는 레티나/눈과 같은 레티날 조직에서의 흥분성 조직과 같은 흥분성 조직에 나쁜 영향을 미칠 수 있다.
그러므로, 여기서 공개된 변이체는 다양한 조건과 주변환경에서의 염증 프로세스로부터 유래하는 흥분성 조직에 대한 손상을 치료하거나 막기 위해서 사용될 수 있다. 그러한 조건과 환경의 비제한적인 실시예는 하기 표 1 에 주어진다.
본 발명에 따라서 치료가능한 뉴런 조직 병리학의 예에서, 그러한 병리학은 뉴런 조직의 감소된 산화로부터 기인하는 것들을 포함한다. 산소의 뉴런 조직에 대한 이용성을 감소시키는 어떤 조겅은 스트레스, 손상, 및 최종적으로는 뉴런 세포 사망에 이르게 되며, 본 발명의 방법에 의해서 치료될 수 있다.
허혈 및/또는 저산소증으로 일반적으로 언급된, 이들 조건들은 제한적이지는 않지만 하기로부터 일어나거나 또는 포함하는데, 스트로크, 혈관폐색, 출생전후 산소 결핍, 질식, 숨막힘, 거의 익사, 일산화 탄소 중독, 연기 흡입, 쇼크에서 발생하며, 수술 및 방사능 요법, 질식, 간질, 저혈당증, 만성 폐쇄성 폐질병, 기종, 성인 호흡 장애 증후군, 저혈압 쇼크, 폐혈성 쇼크, 과민성 쇼크, 인슐린 쇼크, 겸상 적혈구 위기, 심장 정지, 율동 부정, 질소 중독, 및 심장-허파 바이패스 절차에서 기인하는 신경학적 결손을 포함한다.
일 실시예에서, 여기서 공개된 IFNB 변이체는 예를 들어 종양 절제, 또는 동맥류 수리와 같은 외과적 절차중 조직 손상 또는 부상의 위험으로부터 기인하는 조직 손상 또는 부상을 막기 위해서 투여될 수 있다. 여기서 공개된 방법에 의해서처리될 수 있는 저혈당증으로부터 유래된 또는 결과로 야기된 다른 병소는 발작 이상, 일예로 간질, 경련, 또는 만성 발작 이상을 포함한다. 다른 치료가능한 질병 및 조건은 스트로크, 저혈압, 심장 마비, 알츠하이머 질병, 파킨슨씨 병, 뇌성마비, 뇌 또는 척추 코트 손상, 에이즈 치매, 인지 기능의 노화 손상, 기억 감퇴, 근위축성 측방경화, 발작이상, 알콜중독, 레티날 허혈, 녹내장로부터 유래한 광 신경 손상, 및 뉴우런 손상이다.
여기서 공개된 IFNB 변이체는 레티날 조직에 대한 손상 및 그 조건을 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 질병은 제한적이지는 않지만, 레티날 허혈, 반점 변성, 레티날 분리, 망막염 색소성, 동맥경화성 망막 병증, 고혈압 망막 병증, 레티날 동맥 폐쇄, 레티날 정맥 폐쇄, 저혈압 및 당뇨병 망막염증을 포함한다.
다른 실시예에서, 발명의 방법의 원칙은 흥분성 조직에 대한 방사선 손상으로부터 유래하는 손상을 치료하거나 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 추가적 이용은 신경독 중독, 일예로 도모익산 조개 중독, 뉴로라티리증(neurolathyrism), 및 괌 질병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨씨 병의 치료이다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 상기와 같은 인터페론 베타 변이체의 보조 투여에 의해서 영장류에서 흥분성 조직 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 다양한 질병 및 조건이 이러한 방법을 이용한 치료에 이용될 수 있으며, 또한 이 방법은 어떤 조건 또는 질병의 부재하에서 인지 기능의 향상에 유용하다. 본 발명의 이러한 용도들은 하기에 보다 상세하게 기술되고, 인간 및 비인간 영장류에서 배우고 훈련함에 있어서의 향상을 포함한다.
중추 신경계에 관련된 본 발명의 이러한 측면의 방법에 의해서 치료가능한 조건 및 질병은 제한적이지는 않지만, 감정 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 부족 과다 활동 장애, 및 인지 기능장애를 포함한다. 이들 조건은 뉴런 기능의 향상으로부터 이점을 얻을 수 있다. 본 발명의 공개에 따라서 치료가능한 다른 질병은 수면 방해, 일예로 수면 무호흡 장애 및 여행-관련 장애, 지주막하 및 동맥류 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕성 손상, 패혈성 쇼크, 아나필락시성 쇼크, 및 다양한 엔세플라리타이드(encephalitides)와 메닝기타이드(meningitide)의 후유증, 예를 들어, 연결 조직 질병 관련 세레브리타이드(cerebritide), 일예로 루퍼스를 포함한다. 다른 용도로는 도모익산 셀피쉬 중독과 같은 신경독 중독, 뉴로라티리즘(neurolathyrism)과 괌 질병, 근위축성 측방 경화증, 파킨슨병으로부터의 보호 또는 예방; 색전 또는 허혈성 손상에 대한 수술후 치료; 전체적인 뇌 조사; 겸상적혈구 위험; 및 자간을 포함한다.
다양한 신경정신학적 질병은 흥분성 조직 손상에 의해서 기인한다고 믿어지는데, 여기서 공개된 방법에 의해서 치료가능하다. 염증성 프로세스 및 그로인안 신경 손상이 관련되고, 본 발명이 그 치료를 위해서 제공되는 만성적 질병은 중추 신경계 및/또는 말단 신경계에 관련된 질병을 포함하며, 인지 기능의 수명 관련 손실 및 노인성 치매, 만성 발작 질병, 알츠하이머 질병, 파킨스씨 질병, 치매, 기억 상실, 근위축성 측방 경화층, 복수 경화증, 결정성 경화증, 윌슨씨 병 뇌 및 점진적 상핵 마비 , 괌 질병, 로이 바디 경화증, 프리온 질병, 일예로 해면양 뇌급증,예를 들어, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅턴 질병, 근긴장성 이영양증, 프레드릭 운동실조증, 및 다른 운동 실조증, 및 길레스 데 라 토우레테 증후군, 간질 및 만성 발작 질병과 같은 발작 질병, 스트로크, 뇌 또는 척수 종양, AIDS 치매, 알콜중독, 자폐증, 레티날 허혈, 녹내장, 고혈압 및 수면장애과 같은 자율성 기능 장애, 및 제한적이지는 않지만 정신분열증, 분열정동성 장애, 집중력 결핍증 장애, 기분변조성 장애, 주요한 우울증 장애, 조병, 강박 장애, 향정신성 물질 남용 질병, 불안, 공포증, 및 일극 및 양극 영향 질병 포함하는 신경정신과적 질병을 포함한다. 추가적인 신경정신과적 및 신경퇴행성 질병은 예를 들어 American Psychiatirc Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder(DSM)에 수록된 것을 포함하며, 최신 버젼이 여기서 참고문헌으로 도입되었다.
하기 표는 앞서언급한 인터페론 베타 변이체에 의한 치료에 해당하는 다양한 조건과 질병에 관한 예시적이며, 비제한적인 자료이다.
표 1
세포, 조직,또는 기관 기능장애 또는 병소 조건 또는 질병 타입
심장 허혈성 관상동맥질병 급성, 만성, 안정, 불안정
미오카디날 경색 드레슬러 신드롬
안기나
선천성 심장 질병 판막심근증
프린즈메탈 안기나
심장파열 동맥중격 천공
맥관염
부정맥 타키-,브레디부정맥심실상성,심실전도비정상 안정, 불안정과민성 경동맥시누스 노드
출혈성 심장 파열 좌, 우, 양자심실 심근증, 일예로특발성 가족성,감염성, 대사성,저장 질병,결핍성, 연결 조직 장애,침입 및 육아종,신경혈관
심근염 자가면역, 감염성, 특발성
폐심증
블런트 및 천공성 트라우마
독성 코카인
혈관 고혈합 일차, 이차
감압질병
섬유근증생
동맥류 해부, 파쇄, 팽창
폐 폐쇄 천식만성 기관지염기종 및 기도 폐쇄
허혈성 폐 질환 폐색선,폐혈전,지방 색전증
환경적 폐 질병
허혈성 폐 질환 폐색전폐혈전
간질성 폐 질병 특발성 폐 섬유증
인지 낭포성 섬유증
폐 심증
외상
폐렴 및 뉴모니타이드 감염, 기생, 독성, 외상, 화상, 기음
사르코이도시스
췌장 내분비의 진성 당뇨병 타입 I,II 베타세포 장애, 이상기능 당뇨성 신경병
췌장의 다른 내분비 세포 이상
외분비 외분비 췌장 이상 췌장염
뼈 골감소증 1 차, 2차 성선기능저하증부동증,페경기후노화관련하이퍼가라티로이디즘갑상성기능항진증칼슘, 마그네슘,포스포러스 및/또는 비타민 D 결핍증
골수염
무혈관증 괴사
회상
paget 질병
피부 탈모증 원형전부 1차2차남성 타입 대머리
백버짐 국소전체 1차2차
당뇨병증 궤양
말단 혈관 질병
화상
자가면역 장애 낭창이리테마토드(erythematodes)씨오그렌(sjiogren)류마티스 관절염사구체 신염맥관염
랑게르한스조직구증
세포, 조직, 또는 기관 이상 또는 병소 조건 또는 질병 타입
눈 광학 신경염
무딘 및 관통상해, 감염유육종, 시켈 C질병, 레티날 분리, 순간 동맥염
배아 및 태아 질병 질식
허혈
CNS 만성 피로증후군, 급성 및 만성 과삼투성 및 저삼투성, AIDS 치매, 감전사
뇌염 광견병, 포진
수막염
경막하 혈종
니코틴 중독
약물 남용 및 철회 코카인, 헤로인,크랙,마리화나, LSD, PCP, 다중 약물 남용,엑스터시, 오피오이드, 진정제, 수면제, 암페타인, 카페인
강박-강제적인 장애
척수 협착증,횡 척수염,길랑 바레,외상, 신경종압박,종양성 압막, 심장마비
ENT 이명, 뫼니에르 신드롬청력 손상
외상성 손상,압력외상
신장 신장 손상 급성, 만성 혈관, 허혈성,간질성 질병,당뇨성 신장 질병,네프로시스 증후군,감염
Henoch S. Purpura
가로무늬근 자가면역 질병 중증 근무력증피부근염다발성 근염
근육의 어떤 질병 유전성 대사,내분비, 독성
심장마비
충돌 부상
라브도밀로시스(rhabdomylosis)
미토콘드리아 질병
감염 괴상성 근막염
성적 기능장애 중추 및 말단 치료후 2 차 발기부전
간 간염 바이러스, 박테리아, 기생충
허혈성 질병
경변증, 지방간
침투성/대사성 질병
위장관 허혈성 창자 질병
염증성 창자 질병
괴사성 소장결장염
기관 이식 공여자 및 피공여자의 처리
생식 불임 혈관
세포, 조직, 또는 기관 기능장애 또는 병소 조건 또는 질병 타입
관 자가면역자궁비정상이식 질병
내분비 선 과다- 및 과소기능
상기와 같이, 이들 질병, 장애 또는 조건들은 단지 여기서 공개된 IFNB 에 의해서 제공되는 이익의 범위를 예시하고 있을 뿐이다. 따라서, 이 발명은 일반적으로 기계적 외상의 결과의 예방적 또는 치료적 처리를 제공한다. CNS 및/또는 말단 신경계의 질병, 장애 또는 조건에 대한 치료적 또는 예방적 처리가 바람직하다.
본 발명의 매우 바람직한 실시예에서, 처리되는 질병은 스트로크, 일예로 허혈성 또는 출혈성 스트로크이다. 허혈성 스트로크에서, 뇌의 부분으로의 혈액 공급이 아테롬 또는 혈병이 혈관을 막았기 때문에 중단된다. 출혈성 스트로크에서, 혈관이 파쇄되며, 정상 흐름을 막고, 그리고 혈액이 뇌의 영역으로 새나가서 그것을 파괴하도록 한다.
허혈성 스트로크에서, 폐쇄는 뇌로의 동맥 통로를 따라서 어디에서든지 발생할 수 있다. 예를 들어, 지방성 물질(아테롬)의 다량 침적은 경동맥에서 발생할 수 있으며, 그 혈액흐름을 방울씩 떨어질 정도로까지 줄이게 된다. 이 조건은 각 동맥이 통상적으로 뇌 혈액 공급의 많은 퍼센트를 제공하기 때문에 매우 심각하다. 지방질 물질은 또한 경동맥의 벽으로부터 떨어져 나와서, 혈액과 함께 움직이다. 보다 작은 동맥을 완전히 막아버릴 수 있다. 경동맥 및 척추 동맥 과 이들의 지류들은 다른 방식으로도 막힐 수 있다. 예를 들어, 심장에서 발생한 혈액 응고물 또는 그 밸브의 하나는 루즈를 깨뜨릴 수 있으며(색전물이 된다), 뇌까지 동맥을 따라서움직이고, 그리고 거기서 계류하게 된다. 결과는 스트로크이다. 그러한 스트로크는 최근 심장 외과 수술을 받은 사람들에서 가장 흔하며, 부족한 심장 밸브 또는 비정상적인 리듬에서 가장 흔하다.
대부분의 스트로크들이 갑자기, 급격하게 발생하며, 수분안에 뇌손상을 야기한다. 가끔, 스트로크는 뇌를 죽이면서 꾸준히 커지면서 몇 시간에서 하루 또는 이틀간 계속 나빠진다.
가능한 스트로크를 가르키는 징후는 즉각적인 의료적 조치를 요구하며, 의사는 때때로 손상을 감소시키고, 재빨리 조치함으로서 추가적인 손상을 막을 수 있다. 스트로크는 의료적 조치를 요구하며, 특히 최초 몇시간이다. 먼저, 의사는 일반적으로 산소를 투여하고, 환자가 유체와 영양분을 공급받을 수 있도록하는 혈관 라인을 삽입한다. 발전 단계에 있는 스트로크는 헤파린과 같은 항응혈제가 투여될 수 있다.
스트로크와 관련된 질병의 처치를 위해서 여기서 개시된 IFNB 변이체의 효과는 다양한 동물 모델을 이용하여 당업자가 실시할 수 있다. 많은 테스트들이 여기서 기록된 변이체가 스트로크와 이와 관련된 질병(주로 허혈성 뇌 질환, 및 척수 코드 허혈성)에서 이로운 효과가 있는지를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 하기 관련된 테스트에 대한 참고문헌들이 제공되지만, 다른 테스트 방법들도 또한 적절함을 증거할 수 있다.
i) thromboembolic stroke model (cf. Lapchak et al.Stroke2002; 33:1665-1670 or
Lapchak et al.Stroke2002; 33:1411-1415),
ii) photothrombosis (cf. Zhao et al.Stroke2002; 32:2157-2163),
iii) sub-arachnoid haemorrhage (cf. Grasso et al.J. Neurosurgery2002; 96:565-570),
iv) transient middle cerebral artery occlusion by aneurysm clips (cf. Yenari et al.
Neurological Research2001; 23:72-78),
v) transient spinal cord ischemia (aneurysm clip, ballon) (cf. Murakawi et al.
Crit. Care Med.2001; 29:814-818; Lips et al.Anesthesiol.2000; 93:1303-1311;
Lips et al.J. Neurosurg. Anesthesiol.2002; 14:35-42; Lapchak et al.Stroke2001; 33:1220-1225 or Sukarai et al.Stroke2000; 31:200-207)
재료 및 방법
재료
HeLa 세포-(American Type Culture Colletion(ATCC)로부터 입수가능)
ISRE-Luc(Stratagene, La Jolla USA)
pCDNA 3.1/hygro(Invitrogen, Carsbad USA)
pGL3 basic vector(Promega)
인간 게모믹 DNA(CloneTech, USA)
DMEM 배지: Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM), 10% 소 태아 혈청(Life Technologies A/S, Copenhagen, Denmark로부터 입수가능)
에세이(Assay)
인터페론 에세이의 개략
인터페론 β가 HeLa 세포의 인터페론 타입Ⅰ수용체와 서로 작용하고 활성화시킨다는 내용이 이전에 간행되었다. 따라서, 전사는 인터페론 자극 반응 요소(ISRE)를 포함하는 프로모터에서 활성화된다. 따라서 HeLa 세포에 위치한 ISRE 결합된 루시페라제 수용체 유전자(ISRE-luc)의 사용을 사용하여 인터페론 수용체의 작용제(agonist)를 스크린하는 것이 가능하다.
1차 에세이
HeLa세포는 ISRE-Luc 및 pCDNA 3.1/hygro로 함께-형질전환되고, 병소(세포 클론)는 Hygromycin B을 포함하는 DMEM 배지에서의 선택에 의해 만들어진다. 세포 클론들은 인터페론 β의 존재 또는 부존재시의 루시페라제 활성을 위해 스크린된다. 자극된 루시페라제 활성의 자극되지 않은 루시페라제 활성에 대한 가장 높은 비율을 나타내는 이러한 클론들은 더 많은 에세이에서 사용된다.
뮤테인(mutein)을 스크린하기 위해, 15,000세포/웰들이 96웰 배양 플레이트에 시드되고 DMEM 배지에 밤새 배양된다. 다음 날에 공지된 표준뿐 아니라 뮤테인이 다양한 농도로 세포에 첨가된다. 플레이트는 5% CO2공기 환경, 37℃에서 약 6시간 배양된다. LucLite 기질(Packard Bioscience, Groningen The Netherlands)가 각 웰에 후속적으로 첨가된다. 플레이트가 봉인되고 SPC(단일 광자 카운팅) 모드에서 TopCount 루미노미터(Packard)상에 형광 측정된다. 각각의 플레이트는 자극된 대조군으로 인터페론 β으로 배양된 웰 및 자극되지 않은 대조군으로 정상적인 배지를 포함하는 다른 웰들을 포함한다. 자극된 및 자극되지 않은 루시페라제 활성사이의 비율은 뮤테인활성 및 실험-대-실험 변이모두를 위한 내부표준으로 작용한다.
2차 에세이
현재, 18 비-대립형질의 인터페론 α유전자 및 하나의 인터페론 β유전자가 있다. 이들 단백질은 중복 활성을 나타내고, 따라서 뮤테인이 인터페론 β의 선택성 및 특이성을 유지하는 것을 확실히 하는 것이 중요하다.
β-R1 유전자는 다른 인터페론이 아닌 인터페론 β에 의해 활성화된다. 따라서 β-R1의 전사는 인터페론 β활성의 제2 마커로 작용하고 뮤테인이 인터페론 β활성을 유지하는 것을 확실히 하는데 사용된다. 인터페론 감수성 전사를 이끄는 것으로 나타난 β-R1의 300 bp 프로모터 단편(Rani. M.R.등(1996)JBC271 22878-22884)은 인간 게노믹 DNA로부터 PCR에 의해 분리되었고 pGL3계 벡터(Promega)내로 삽입되었다. 결과 β-R1:루시페라제 유전자는 상기에서 설명된 1차 에세이에 유산한 에세이에 사용된다. 성상세포종 세포에 있어서, 결과 β-R1:루시페라제 유전자는 인터페론 α보다 인터페론 β에 대한 250배 높은 감수성을 나타내는 것으로 설명되어 있다(Rani 등, 인용)
ELISA 에세이
IFN-β의 농도는 상업적인 샌드위치 면역분석법(PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ,USA)의 사용에 의해 정량화된다. 키트는 테스트 샘플에서 IFN-β의 포착 및 제거를 위한 단일항체 마우스 항-IFN-β항체를 가진 ELISA에 기초된다. 발견하는 항체는 비오틴에 컨쥬게이트된다.
테스트 샘플 및 재조합 인간 IFN-β표준은 0.1 mL에서 10~0.25 ng/mL의 농도에서 포착하는 항체로 전코팅된 마이크로리터 플레이트에 첨가된다. 샘플 및 표준은 키트 희석 완충제에서 희석된다. 플레이트는 키트 완충제에서 세척되고 RT에서 1시간 동안 0.1mL에서 비오틴화된 발견 항체로 배양된다. 다른 세척 후에, 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화효소 컨쥬게이트가 0.1 mL에 첨가되고 RT에서 1시간 동안 배양된다.
반응은 0.1 mL의 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 색소원의 첨가에 의해 시각화된다. 플레이트는 RT에서 어두운 곳에서 15분간 배양되고 반응은 정지 용액의 첨가에 의해 정지된다. 흡광도는 ELISA 판독기를 사용하여 450nm에서 판독된다.
수용체 결합 에세이
폴리펩티드 또는 본 발명의 컨쥬게이트의 수용체 결합 능력은 WO 95/25170"Analysis Of IFN-β(Phe101) For Receptro Binding"(Daudi 또는 A549세포에 기초함)에 설명된 에세이를 사용하여 측정될 수 있다. IFNAR1 및 IFNAR2의 가용성 도메인은 Arduini 등, Protein Science, 1999, vol.8, 1867-1877 또는 여기의 실시예9에 설명된 것 처럼 본질적으로 얻어질 수 있다.
선택적으로, 수용체 결합 능력은 다음과 같이, Piere, Rockford, IL, USA로부터 입수가능한 디숙시니미딜 수베레이트(DSS)와 같은 가교형성제를 사용하여 측정된다.
폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 제작 지침에 따라 DSS의 존재 또는 부존재시에서 가요성 IFNAR-2수용체와 배양된다. 샘플들은 SDS-PAGE에 의해 분리되고, 항-인터페론 β 또는 항-IFNAR2항체를 사용하는 웨서턴 블랏이 행해진다. 기능성 인터페론 β폴리펩티드/콘쥬게이션:수용체 상호작용의 존재는 DSS의 존재에서수용체 및 인터페론 β의 분자크기에서의 증가가 명백하다.
더욱이, 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 사용하는 가교형성 에세이 및 양 수용체 서브유니트(IFNAR-1 및 IFNAR-2)는 인터페론 수용체 1 결합능력을 확립할 수 있다. 이와 관련해서, 단지 인터페론 β:IFNAR-2 복합체 뒤에 결합하는 IFNAR-1이 형성된다(Mogensen 등, Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069-1098,1999)는 내용이 간행되었다.
인터페론 β컨쥬게이트의 생체외 면역원성 테스트
본 발명 컨쥬게이트 또는 폴리펩티드의 감소된 면역원성은 대조분자 또는 제형에 관한 컨쥬게이트 또는 폴리펩티드의 면역반응성을 측정하는 ELISA 방법의 사용으로 측정된다. 대조분자 또는 약제는 정상적으로 Avonex, Rebif 또는 Betaseron과 같은 재조합 인간 인터페론 β약제, 또는이들 제품들이 제조되는 방식과 동일한 동등한 방법에 의해 생산된 재조합 인간 인터페론 β약제이다. ELISA 방법은 이들 재조합 인간 인터페론 β약제의 하나로 치료된 환자로부터의 항체에 기초한다. 면역원성원은, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 폴리펩티드은 대조 분자 또는 약제보다 에세이에서 통계적으로 현저히 낮은 반응을 가질 때 감소되는 것으로 여겨진다.
면역원성을 측정하는 다른 방법은 Ross 등, J. Clin Invest, 95, 1974-78, 1995에 설명된 것과 유사한 바익으로 인터페론 베타(즉, 상업적인 인간 인터페론 β제품)으로 치료된 환자로부터의 혈청의 사용에 의한 것이다. 항바이러스 무효화 바이오에세이에서 감소된 면역원성은 wt IFN-베타 대조 분자와 비교한 환자 혈청에 의한 본 발명 컨쥬게이트의 감소된 억제를 나타낸다. 더욱이, 생화학 IFN 결합 에세이는 작은 면역원성 컨쥬게이트는 대조 IFN-베타 분자보다 적은 범위까지 환자 IgG에 결합하는 것으로 예상된다.
무효과 에세이의 경우에, 대조 및 컨쥬게이트 분자들은 항바이러스 무효화 생물학적 에세이에서 약 80% 바이러스 보호를 생산하는 농도에서 첨가된다. IFN-β단백질은 다양한 희석도(1:20에서 시작)에서 환자 혈청과 혼합된다.
항바이러스 활성
항바이러스 생물학적 에세이는 A549세포(CCL 185, American tissue culture collection) 및 Encephalomyocarditis(EMC)바이러스(VR-129B, Ameriacan tissue culture collection)을 사용하여 행해진다.
세포들은 10,000 세포/웰의 농도에서 조직 배양 플레이트에 시드되고 5% CO2공기 환경에서 37℃에서 배양된다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트는 송아지 태아 혈청 및 항체를 포함하는 전체 100㎕ DMEM 배지에서 100-0.0001 IU/mL로부터 농도에서 첨가된다.
24시간 후에, 배지는 제거되고, EMC바이러스를 포함하는 0.1 mL 신서한 배지가 각각의 웰에 첨가된다. EMC 바이러스는 24시간 후에 IFN-β유리 세포 배지에서 100% 세포사를 유발하는 농도에서 첨가된다.
또 다른 24시간 후에, 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 항바이러스 효과는 WST-1 에세이를 사용하여 특정된다. 0.01 mL WST-1(WST-1 세포 증식제, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)가 0.1 mL배지에 첨가되고 5% CO2대기 환경, 37℃에서 30분~2시간동안 배양된다. 생존하는 세포에서 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 테트라졸리움 염 WST-1의 분열은 흡광도 450 nm 측정에 의해 정량되는 포르마잔의 형성을 나타낸다.
인터페론 자극화된 반응 요소(ISRE)에세이에서 활성의 무효화
항-인터페론β의 인터페론 β무효화 효과는 ISRE-루시페라제 활성 에세이를사용하여 분석된다.
인터페론 β치료된 환자 또는 면역된 동물로부터의 혈청이 사용된다. 혈청은 고정된 농도(희석도 1:20-1:500(pt sera) 또는 20-600 ng/mL(동물 혈청))에 또는 1/20(pt sera)에서 시작하는 혈청의 5배 연속 희석도 또는 600 ng/mL(동물 혈청)에 첨가된다. 인터페론 β는 25.000 IU/mL에서 시작하는 5배 희석도에서 또는 80㎕ DMEM 배지 + 10% FCS의 전체 부피에서 고정된 농도(0.1~10 IU/mL)에 첨가된다. 혈청은 37℃에서 IFN-β와 1시간동안 배양된다.
샘플들은 그 후, DMEM 배지에서 전에 24시간부터 성장한 ISRE-Luc로 형질전환된 HeLa세포(15,000 세포/웰)들을 포함하는 96웰 조직 배양 플레이트로 옮겨진다. 이 배양은 5% CO2대기 환경, 37℃에서 6시간동안 배양된다. LucLite 기질(Packard Bioscience, Groningen, The Netherland)이 후속적으로 각 웰에 첨가된다. 플레이트는 봉인되고 SPC(단일 광자 카운팅)모드에서 TopCount 루미노미터(Packard)에 형광 측정된다.
인터페론 β샘플들이 혈청의 고정된 양의 존재하에 적정되면, 무효화 효과는 EC50(w.serum)/EC50(w/o serum)으로 정량화된 폴드 억제(FI)로 정의되었다. 인터페론 β변이 단백질의 항체 무효화의 감소는
FI 변이
(1 - ------------ ) X 100%
FI wt
로 정의된다.
생물학적 반감기의 측정
생물학적 반감기의 측정은 문헌에 기재된 수 많은 방법으로 수행될 수 있다. 하나의 방법은 인터페론 β의 피하 및 근육내 투여 후 인터페론 β의 혈청 수준을 찾기 위해 ELSIA 방법을 사용한 Munafo 등(European Journal of Neurology 1998, vol No2 p 187-193)에 의해 설명되어 있다.
정맥내 투여 후의 인터페론 β혈청 농도의 빠른 감소는 인터페론 β치료에 대한 생물학적 반응을 평가를 중요하게 만들었다. 그러나, 본 발명의 컨쥬게이트는, 본 발명의 컨쥬게이트가, 예를 들면, ELISA 방법 또는 1차 스크리닝 에세이로 측정하는 것을 가능하게 하는 정맥내 투여 후에 혈청 반감기를 연장시키게 될 것이라는 것이 기대된다.
다른 약력학 마커(예를 들면, 혈청 뉴프테린 및 베타2 마이크로글로부린)가 또한 연구되어 왔다(Clin Drug Invest(1999)18(1): 27-34). 이들은 연장된 생물학적 효과를 평가하기 위해 균등하게 잘 사용될 것이다. 이들 실험들은 또한 적합한 동물종, 예를 들면 래트에서 수행될 것이다.
항바이러스, 항증식 및 면역조절효과(Annals of Neurology 1995 vol 37 No 1 p 7-15)와 같은 IFNB 의 생화학적 효과를 측정하는 어세이는 여기서 야생형 IFNB와 비교하면서 컨쥬게이트의 생물학적 효과를 계량하기 위한 1 차 및 2 차 측정법과 함께 사용될 수 있다.
접근 가능 표면 영역(ASA)
컴퓨터 프로그램 Access(B. Lee 및 F.M.Richards, J. Mol.Biol. 55:379-400(1971)) 버전 2(Copyright(c) 1983 Yale University)가 구조에서 각 원자의 접근가능한 표면 영역(ASA)을 계산하기 위해 사용된다. 이 방법은 전형적으로 1.4Å의 프로브 크기를 사용하고, 프로브의 가운데에 의해 형성된 영역으로 접근가능한 표면 영역(ASA)를 정의한다. 이 계산 전에, 다른 원자들이 단백질에 직접적으로 관련되지 않기 때문에, 모든 물 분자 및 모든 수소원자가 동등한 세트로부터 제거된다. 대안적인 프로그램이 ASA 계산을 위해 이용가능한데, 예를 들면, program WhatIf G.Vriend, J.Mol.Graph.(1990) 8, 52-56, 접근가능한 분자 표면을 계산하기 위해 선택Accessibility를 사용하는 http://swift.emblheidelberg.de/servers2/ 상의 WWW 인터페이스에서 전기적으로 이용가능하다(R.Rofriguez 등, CABIOS(1998)14, 523-528).
측쇄의 분별ASA
측쇄 원자의 부분적 ASA는, 확장된 ALA-x-ALA 트리펩타이드에서 그 잔기타입의 측쇄원자의 ASA를 나타내는 값으로 가진 측쇄에서 원자의 ASA의 합을 나눔으로써 계산된다. Hubbard, Campbell & Thornton(1991) J.Mol.Biol.220, 507-530을 참고. 이 실시예의 경우, CA원자는 글리신 잔기의 측쇄의 부분으로 간주되지만, 나머지 잔기의 경우 그렇지 않다. 다음의 표는 측쇄에 위한 100% ASA 표준을 나타낸다:
Ala 69.23Ų
Arg 200.35Ų
Asn 106.25Ų
Asp 102.06Ų
Cys 96.69Ų
Gln 140.58Ų
Glu 134.61Ų
Gly 32.28Ų
His 147.00Ų
Ile 137.91Ų
Leu 140.76Ų
Lys 162.50Ų
Met 156.08Ų
Phe 163.90Ų
Pro 119.65Ų
Ser 78.16Ų
Thr 101.67Ų
Trp 210.89Ų
Tyr 176.61Ų
Val 114.14Ų
표면 노출된 아미노산 잔기의 측정
2.2Å 해상력에서 인간 인터페론 베타의 3차원 크리스탈 구조(Karpusas 등,Proc. Nat. Acad. Sci. USA(1997) 94:11813-11818)은 단백질 정보은행(PDB)(Bernstein 등, J. Mol.Biol.(1977)으로부터 입수가능하고, 접근 코드 1AU1하의http://www.pdb.org/에서 구조 생물정보학 PDB를 위한 The Research Collaboratory를 통하여 전자적으로 이용가능하다. 이 결정 구조는 A분자가 사용되는 이 실시예에서 인간 인터페론 베타의 2개의 독립 분자를 포함한다.
표면 노출:
상기에서 설명된 바와 같이 WhatIf 프로그램을 사용하여, 다음의 잔기는 이들의 측쇄 원자을 위한 제로 표면 접근성을 가지는 것으로 밝혀졌다(Gly의 경우 CA원자의 접근성이 사용된다): G7, N14, C17, L21, I44, A55, A56, T58, I59, M62, L63, L98, L122, Y125, I129, L133, A142, W143, V146, I150, N153, I157, L160, T161 및 L164.
분별 표면 노출
더 많은 분석을 위해, 원자의 공간 배치 충돌때문에 잔기 R71, R113, K115, L116, M117의 측쇄를 재모델하는 것이 필요하였다. 재모델은 Modeler 98, MSI INC를 사용하여 수행되었다. 재모델된 인터페론 베타 분자(단지 아미노산 잔기를 포함하고 N-결합된 당 부분을 제외하는)상에 Access 컴퓨터 프로그램을 사용하여 기능성 ASA 계산의 수행은 표면에 노출된 그들의 측쇄의 25%이상을 가진 다음 잔기를 낳았다: S2, N4, L5, F8, L9, R11, S12, F15, Q16 Q18, K19, W22, Q23, G26, R27, L28, E29, Y30, L32, K33, R35, M36, N37, D39, E42, K45, Q46, L47, Q48, Q49, Q51, K52, Q64, A68, R71, Q72, D73, S75, S76, G78, N80, E81, T82, E85, N86,A89, Y92, H93, N96, H97, K99, T100, E103, E104, K105, E107, K108, E109, D110, F111, R113, G114, K115, L116, S119, L120, H121, K123, R124, G127, R128, L130, H131, K134, A135, K136, E137, Y138, S139, H140, V148, R152, Y155, N158, G162, Y163, R165, 및 N166.그리고 하기 잔기는 50 % 이상의 이들의 표면에 노출된 측쇄를 가진다 : N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, G26, R27, E29, Y30, K33, R35, N37, D39, E42, Q46, Q48, Q49, Q51, K52, R71, D73, S75, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, K99, T100, E103, E104, E107, K108, D110, F111, L116, K123, R124, G127, H131, K134, E137, V148, Y155, R165, 및 N166.
실시예1
포유동물 및 곤충 세포에서 IFNB 의 발현에 대한 발현 카세트의 설계
천연의 신호 펩타이드를 가진 인간 IFNB 를 엔코딩하는 전장 cDNA을 포함하는, DNA 서열, GenBank 접근 번호 M28622(SEQ ID NO 1에 나타냄)가 포유동물 세포에서 높은 발현을 용이하게 하기 위해 변형되었다. 제1 ATG 시작 코돈 내용은, ATG 시작 코돈의 공통 서열 상류에 완전한 일치가 있도록, Kozak 공통서열(Kozak, M.J Mol Biol1987 Aug 20; 196(4):947-50)에 따라 변형되었다. 둘째로, 천연의 인간 IFNB 의 코돈은, 높게 발현된 인간 유전자에서 빈번하게 사용된 코돈에 대한 코돈 용법에서 바이어스(bias)를 만듬으로써 변형되었다. 그 결과로써, 서열에서 어떤 뉴클레오티드는 DNA 제한 엔도뉴글레아제(이것은 DNA 서열 후자의 쉬운 변형을 허용한다)을 위해 인식 부위를 도입하기 위해 다른 것으로 치환되었다. 프라이머는 유전자가 합성될 수 있도록 설계되었다
CBProFpr1:
5'GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCGCCACCATGACCAACAAGTGCCTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGT-3'
CBProFpr2:
5'ACAACCTGCTCGGCTTCCTGCAGAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGAAGCTCCTGTGGCAGCTGAACGG 3'
CBProFpr3:
5'GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCTCTGACCATC 3'
CBProFpr4:
5'TTCCGCCAGGACTCCAGCTCCACCGGTTGGAACGAGACCATCGTGGAGAACCTGCTGGCCAACGTGTACC 3'
CBProFpr5:
5'AGGAGAAGCTGGAGAAGGAGGACTTCACCCGCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTA 3'
CBProFpr6:
5'GGAGTACAGCCACTGCGCCTGGACCATCGTACGCGTGGAGATCCTGCGCAACTTCTACTTCATCAACCGC 3'
CBProFpr9:
5'CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGTCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT 3'
CBProFpr10:
5'AGGCGCAGTGGCTGTACTCCTTGGCCTTCAGGTAGTGCAGGATGCGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAG 3'
CBProFpr11:
5'CTCCTTCTCCAGCTTCTCCTCCAGCACGGTCTTCAGGTGGTTGATCTGGTGGTACACGTTGGCCAGCAG 3'
CBProFpr12:
5'GAGCTGGAGTCCTGGCGGAAGATGGCGAAGATGTTCTGCAGCATCTCGTAGATGGTCAGAGCGGCGTCCT 3'
CBProFpr13:
5'CCTCGGGGATGTCGAAGTTCATCCTGTCCTTCAGGCAGTACTCCAGGCGCCCGTTCAGCTGCCACAGGAG 3'
CBProFpr14:
5'CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCGATAGGGCCGTGGTGCTGAAGCACAGGAGCAGGGCGATCTGG 3'
프라이머는 백금Pfx-폴리머레라제 키트(Life Technologes)를 사용하는 일단계 PCR과 표준 3단계 PCR 사이클링 인자에 의해서 합성 유전자에 집결되었다. 이 집결된 유전자는 같은 조건을 사용하는 PCR에 의해 증폭되었다.
인간 IFNB 의 N-말단 연장된 형태를 엔코딩하는 cDNA는, IFNB 분자에 정제TAG 를 도입하기 위해서, 하기 프라이머로 치환된 프라이머 CBProFpr1 및 -14 를 사용한 것을 제외하고는 상기에서 설명된 것과 같은 PCR 조건을 사용하여 합성되었다.
CBProFpr7:
5'CTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGTGCTTCAGCACCACGGCCCTATCGATGAAGCACCAGCACCAGCATC- 3'
CBProFpr8:
5'CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAAC 3'
CBProFpr15:
5'CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCTGTTGGTGTTGATGTTGGTGCTGATGCTGGTGCTGGTGCTTC- 3'
CBProFpr16:
5'AGCAGGGCGATCTGGAGCAGGCACTTGTTGGTCATGGTGGCGAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGCCAGCTT- 3'
합성된 유전자들은 pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)의 5'말단에서HindIII 부위 및 3'에서BamHI사이에 클론되어, pCBProF1 및 pCBProF2를 나타내었다.
합성 인트론 형태 pCl-Neo(Promega)는 상기에서 설명된 것과 같은 표준 PCR 조건과 프라이머:
CBProFpr37:
5'CCGTCAGATCCTAGGCTAGCTTATTGCGGTAGTTTATCAC- 3'
CBProFpr38:
5'GAGCTCGGTACCAAGCTTTTAAGAGCTGTAAT- 3'
를 이용하여 증폭되어, NheI 및 HindIII으로 절단되고, 플라스미드 pCBProF1 및 pCBProF2의 5'UTR내로 삽입되어 pCBProF4와 pCBProF5가 되는 332 bp PCR 단편이 된다.
각 아미노산을 위한 코돈은, 서열에서 PCR 도입된 변화가 일반적인 클로닝 기술로 발현 플라스미드내로 도입될 수 있도록 하는 방식으로, PCR에 의해 코딩 영역의 적절한 영역을 증폭함으로써 변화되었다. 예를 들면, 프라이머:
Lys45arg-5'primer(NarI/KasI):
5'GCTGAACGGGCGCCTGGAGTACTGCCTGAAGGACAGGATGAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCCGCCAGCTGCAGC-3',
Lys45mut-3'primer(BsiWI):
5'TCTCCACGCGTACGATGGTCCAGGCGCAGTGGCTG-3'
는 pDBProF1내의 위치 1055로부터 1243까지 영역을 재는(spanning) PCR-단편내에 K45R 치환을 도입하기 위해 사용되었다. PCR 단편 및 pCBProF1는 양자 모두 독특한 NarI 및 BsiWI로 절단되었다. PCR 단편 및 pCBProF1의 벡터 백본(backbone)은 정제되고 결합되어, pCBProF1에서 Lys45 코돈 AAG가 Arg 코돈 CGC로 치환된다.
더욱이, SOE(sequence overhang extension) PCR은 아미노산 치환체의 도입을 위해 사용되었다. SOE-PCR에서 INFB분자의 N-말단 및 C-말단부분은 각각의 1차PCRs에서 처음으로 증폭되었다.
이들 1차 PCRs을 위해 중앙의 상보 프라이머가 합성되어, 치환될 아미노산에 대한 코돈이 원하는 코돈으로 변한다. 말단 프라이머는 INF β분자의 N- 및 C-말단을 각각 한정하는 표준 프라이머였다. 더욱이 말단 프라이머는 전장 PCR 산물의 후속적인 클로닝을 허가 하는 제한 효소부위를 제공하였다. 따라서, 중앙(nonsense) 프라이머 및 N-말단(sense)프라이머가 1차 PCRs의 어느 하나에서 INFB 코딩 영역의 N-말단 부분 및 대등한 C-말단 부분을 증폭하기 위해 사용되었다. 일단 증폭되면, N- 및 C-말단 부분은 2차 PCR내 전장 산물내로 집결되고 상기에서 설명한 바와 같이 p/DNA3.1/Hygro의 변형된 버전으로 클론된다. 예를 들면, 다음의 플라이머는 치환 F111N 및 R113T을 위한 돌연변이체를 도입하기 위해 사용되었다:
CBProFprimer9(Sense):
CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGTCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT,
CBProFprimer231(Antisense):
CATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC,
CBProFprimer230(Sense):
GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATG,
CBProFprimer42(Antisense):
CACACTGGACTAGTAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGC,
더욱이, 도입된 돌연변이가 발현 플라스미드내 특이한 제한 엔도-뉴클레아제 부위에 충분히 근접하여 있는 경우에는, 변이 유전자들은 단일 PCR 단계 및 후속적인 클로닝을 포함하는 구성(construction) 과정을 사용하여 구성된다. 예를 들면, 치환 K19R은 PCR프라이머:
CBProFpr58:
GAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAGCTGAACG, 및 CBProFprimer9 의 사용에 의해 도입되었다.
PCR 산물은 제한 엔도-뉴클레아제 부위 BsiWI 및BstBI를 사용하여 후속적으로 클론되었다.
실시예2
111 위치에서 하나의 도입된 글리코실화 부위를 가진 IFMB 의 구성 및 발현
엑스트라(extra) N-결합된 글리코실화 부위를 인간 INFB 내 위치111에 삽입하기 위해, 인간 INFB(실시예1에서 설명)를 엔코딩하는 합성 유전자(hinf-β)는 특정-부위 PCR돌연변이에 의해 변경되었다. 템플레이트(template)로 BIO-X-ACT(Bioline, UK) 및 플라스미드 PF050 [hinf-β/pcDNA3.1(-) Hygro/Intron (pCI-neo(Promega, USA)로부터 입수된 키메릭 인트론이 벡터의 MCS내 BamHI 및 NheI사이로 삽입된 pcDNA3.1(-) Hygro(Invitrogen, USA)의 유도체)]를 사용하여, 2개의 PCR반응들이 2개의 단편들이 각각 446 및 184 염기쌍을 나타내는, 2개의 오버래핑 프라이머-세트
[CB41(5'-TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG-3)
/CB55(5'-CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAGGGAGCTCATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC-3') 및 CB42 /CB86(5'-GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTATGGCC G-3')로 수행되었다.
이들 두 개의 단편들은 프랜킹 프라이머(flanking primer) CB41 및 CB42를 가진 제3 PCR에서 집결되었다. 결과 유전자는 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1(-)Hygro/Intron내로 삽입되었고, DNA서열화에 의해 인간 INFB(PF085으로 지정된 플라스미드)내의 F111N 및 R113T로 선도하는 올바른 염기 변화를 가지는 것으로 확인되었다.
[F111N + R113T] 인간 INFB 변이체의 활성을 테스트하기 위해, PF085가 형질전환제로 Lipofectamine 2000(Life Technologies, USA)의 사용에 의해 CHO K1 세포주(ACTT #CCL-61)로 도입되었다. 24시간 후에, 배양 배지가 회수되어 INF-β활성/농도에 대하여 시험하였다:
활성: 56046 UI/ml [1차 에세이]
ELISA: 80ng/ml
특이적 활성: 7 x108IU/mg
상기에서와 같이, [F111N + R113T] 인간 INFB 변이체는 아주 높은 특이적 활성, 야생형 인간 INFB 의 특이적 활성의 약2배를 가진다.
실시예3
위치 49 에서 한 도입된 글리코실화 부위를 가진 IFNB 구성 및 발현
WO 01/15736 호의 실시예5에서 설명된 것과 유사하게, 엑스트라 N-연결된 글리코실화 부위는 치환 Q47N 및 Q51T의 수단에 의해 위치49에 도입되었다. 템플레이트로 PF043 (hinf-β/pcDNA3.1(Invitrogen, USA))를 사용하여, 2개의 PCR반응들은, 각각 228 및 369 염기쌍의 2개의 단편을 나타내는, 2개의 오버랩핑 프라이머-세트 [PBR7] /PBR78(5'- GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTCTGCAGCTG-3' 및PBR8(5'- ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT-3') /PBR77(5'- CAGCTGCAGAACTTCACCAAGGAGGACGCC-3')로 수행되었다. 이들 2개의 단편들은 이 프랜킹 프라이어(flanking primer) PBR7 및 PBR8를 가진 제3 PCR에서 집결되었다. 결과 유전자는 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1(-)Hygro/Intron내로 삽입되었고, DNA서열화에 의해 [Q49N,Q51T] 인간 INFB(PF104로 지정된 플라스미드)로 선도하는 올바른 염기 변화를 가지는 것으로 확인되었다.
[Q49N,Q51T] 인간 INFB 변이체의 활성을 테스트하기 위해, PF104가 형질전환제로 Lipofectamine 2000(Life Technologies, USA)의 사용에 의해 CHO K1 세포주로 도입되었다. 24시간 후에, 배양 배지가 회수되어 INFB 활성/농도에 대하여 시험하였다:
활성: 17639 UI/ml [1차 에세이]
ELISA: 10ng/ml
특이적 활성: 1.7 x109IU/mg
상기에서와 같이, [Q49N,Q51T] 인간 INFB 변이체는 아주 높은 특이적 활성을가진다. 이것은 ELISA에 사용된 단일클론항체의 하나에 의한 인식이 미약하기 때문일 수 있다.
실시예4
2개의 도입된 글리코실화 부위를 가진 IFNB의 구성 및 발현
WO 01/15736 의 실시예 5 및 6에서 설명된 추가적인 글리코실화 부위는 치환 Q49N, Q51T, F111N 및 R113T에 의하여 인간 IFNB 내로 도입되었다.
템플레이트로 PF085(WO 01/15736 실시예5에서 설명됨)을 사용하여, 2개의 PCR반응들이, 2개의 단편들이 각각 228 및 369 염기쌍을 나타내는, 2개의 오버래핑 프라이머-세트 [PBR 89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/ PBR 78 및 PBR 8)/PBR 77]로 실행되었다.
이들 두 개의 단편들은 프랜킹 프라이어(flanking primer) PBR89 및 PBR8를 가진 제3 PCR에서 집결되었다. 결과 유전자는 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1(-)Hygro/Intron내로 삽입되었고, DNA서열화에 의해 [Q49N, Q51T, F111N, R113T] 인간 INFB(PF123으로 지정된 플라스미드)로 선도하는 올바른 염기 변화를 가지는 것으로 확인되었다.
PF123가 형질전환제로 Fugene6(Roche)의 사용에 의해 CHO K1 세포로 도입되었다. 24시간 후에, 배양 배지가 회수되어 INF-β활성/농도에 대하여 시험하였다:
활성: 29401 UI/ml [1차 에세이]
ELISA: 14ng/ml
특이적 활성: 2.1 x109IU/mg
상기에서와 같이, [Q49N+Q51T+F111N + R113T] 인간 IFNB 변이체 또한 아주 높은 특이적 활성을 가진다.
이 변이체는, 가교제 DSS의 사용에 기초된, 재료 및 방법 섹션에서 설명된 수용체 결합 에세이에서 수용체 결합 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
실시예5
롤러 바틀에서 [Q49N, Q51T, F111N, R113T] 인간 IFNB 글리코실화의 생산
[Q49N+Q51T+F111N+R113T]글리코실화 변이를 생산하는 CHOK1 서브-클론이, 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)로 보충된 200 ml DMEM/F-12 배지(LifeTchnologies; Cat. #31330)에서, 각각이 1700 ㎠(Corning, USA)의 확장된 표면을 가진 2개의 롤러 바틀(bottle)내로 시드되었다. 2일 후에, 배기가 변경되었다. 또 다른 2일 후에, 2개의 롤러 바틀은 거의 100% 군집되고 배지는, 1/500 EX-CYTE(Serologicals Proteins; Cat. #81129N) 및 P/N로 보충된 300 ml의 혈청이 없는 UltraCHO 배지(BioWhittaker; Cat. #12-724)로 옮겨졌다. 이 배지에서의 세포 성장은, 혈청을 포함하는 배지에서 달성될 수 있는 것보다 더 높은, 높은 세포 집단을 촉진시킨다. 2일 후에, 배지를 다시 새로 바꾸었다. 또 다른 2일 후에, 배지는 생산 배지로 옮겨졌다: 1/100 ITSA(Life Technologies; Cat. #51300-044)[유착 배양을 위한 인슐린(1.0 g/L)-트랜스페린(0.55 g/L)-셀레늄(0.67 mg/L)첨가물을 위한 ITSA 스트랜드], 1/500 EC-CYTE 및 P/S로 보충된 DMEM/F-12 배지(Life Technologies; Cat. #21041). IFNB 활성의 측정을 위해 샘플들이 취해지기 전에 2개의 롤러 바틀로부터 회수된 배지가 모아졌다.
실시예6
[K19R, K45R, K123R] 인간 IFNB 의 생산, 정제 및 PEG화
IFNB 변이체 K19R+K45R+K123R을 포함하는 100 ml의 혈청-없는 배지를 만들기 위해, 3T-175 플라스크가, 10% FBS + 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지(Lifetechnologies; Cat.#21969-035)에서 COS-7세포로 시드되었다. 도입하는(거의 100% 군집에서)의 날에, 도입 전 4~5시간에 30 ml 신선한 배지로 새로 바꾸었다. 도입을 준비하기 위해, 보충제가 없는 1890 ㎕ DMEM배지가 14 ml 폴리프로필렌 튜브(Corning)내로 분별되었다. 210㎕ Fugene 6(Roche)가 배지내로 직접 첨가되었고 RT에서 5분간 배양되었다. 한편, 168㎍ 플라스미드 DNA([K19R, K45R, K123R]INF-β/pcDNA3.1(-)Hygro; PF #161)가 또 다른 14㎖ 폴리프로필렌 튜브내로 분별되었다. 5분간의 배양 후에 Fugene6 혼합물이 DNA용액에 직접 첨가되었고 RT에서 15분간 배양되었다. 배양 후에, 700㎕가 3개의 세포 배지의 각각에 방울단위로 첨가되었다.
다음 날에, 도입된 배지가 35㎖이 혈청-없는 생산배지로 교체되었다. 혈청-없는 배지는, 글루타민, 소듐 피루베이트, 페니실린/스트렙토마이신, 1% ITSA(Life Technologies; Cat. #51300-044) 및 0.2% Ex-Cyte(Serologicals Proteins; Cat.#81-129)로 보충된 DMEM 배지(Lfie Technologies; Cat. # 31053-028)에 기초된다.생산배지가 첨가되기 전에 세포 층은 첨가제가 없는 DMEM배지에서 2회 세척되었다.
도입 후 3일에, 100 ㎖ 혈청-없는 배지가 인터페론-β변이체의 정제 및 PEG화를 위해 수확되었다.
pH는 6.8로 조정되었고, 전도성은 밀리 큐 와터(Milli Q water)을 가진 10 mS/㎝ 미만으로 조정되었다. 그 후, 브로쓰는, 완충액 A(20 mM 포스페이트, 100mM NaCl, pH7)으로 전평형된 1 ㎖ SP 550 양이온 교환 수지(TosoHass)에 배치(batch) 흡수되었다. 2시간의 회전 후에, 수지는 침전이 되도록하고 컬럼으로 옮겨졌다. 수지는 5 컬럼 부피의 완충액 A로 세척되고 2 ㎖ 완충액 B(20 mM 포스페이트, 800 mM NaCl, pH 7)로 용출되었다. 용출액은 5% 에틸렌글리콜의 첨가 후에 VivaSpin(컷오프 10 kDa)상에 500㎕로 조정되었다. 농축물은 2㎖의 최종 부피에서 50 mM 포스페이트, 0.3 M NaCl, 20% 에틸렌글리콜, pH8로 조정되고, 0.5㎖로 더 농축된다.
최종 농축물은 다음과 같이 PEG화되었다: 활성화된 PEG의 0, 5, 10, 25 또는 50 ㎎/㎖의 최종 농도를 만들기 위해, 100㎕의 최종 농축물에 포스페이트 완충액, pH8에서 새롭게 준비된 25㎕의 활성화된 mPEG-SPA(5000 kDa, Shearwater, Alabama)가 첨가되었다. 이 반응은 상온에서 30분간 진행되도록 허용되고, 그 후 50 mM 글리신 완충액의 첨가에 의해 냉각되었다. 샘플들은 -80℃에서 즉시 동결되고 생물활성은 설명된 바와 같이(제1 에세이) 측정되었다. PEG화된 샘플에 존재하는 반응하지 않은 인터페론-β변이체의 양을 평가하기 위해, 각 샘플의 웨스턴 블랏이 수행되었다.
결과는, 웨스턴 블랏에 의한 판단에 의하면 25 mg의 활성화된 PEG/ml, 비PEG화된 인터페론-β변이체가 존재하지 않고, 변이체가 대조군 샘플(동일하게 처리되었지만, 0 mg/ml의 활성화된 PEG를 가진)에 비교하여 생물활성이 50%를 보유하였다는 것을 나타낸다.
실시예 7
위치 49 에서 증가된 탄화수소 부착을 가지는 변이체
WO 01/15736 의 실시예 6 에서 기술된 IFNB 변이체[Q49N, Q51T]에서 위치 49 에서 삽입된 N-결합 글리코실화 부위가 단지 약 60 % 정도만 사용된다. 부착된 탄화수소의 양을 증가시키기 위해서, 위치 48 에서 글루타민 잔기가 페닐알라닌(Q48F), 발린(Q48V) 및 트립토판(Q48W)으로 특정부위 PCR 돌연변이 유발에 의해서 치환되었다. 템플레이트(template)로 BIO-X-ACT(Bioline, UK) 및 PF185(Kozak 서열이 시작 ATG 의 앞에 삽인된다는 사실에도 불구하고, PF185는 실시예 6 에서와 같이 PF104 와 같은 동일한 cDNA을 포함한다) 를 사용하여, PCR반응들이 하기 오버래핑 프라이머-세트로 수행된다.
Q48F, Q49N, Q51T
PBR89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR148 (5GTCCTCCTTGGTGAAGTTGAACAGCTGCTT) 및 PBR8 ((5'- ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT-3))/ PBR147 (5AAGCAGCTGTTCAACTTCACCAAGGAGGAC)
Q48V, Q49N, Q51T
PBR89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR150 (5'GTCCTCCTTGGTGAAGTTCACCAGCTGCTT) 및 PBR8 /PBR149 (5'AAGCAGCTGGTGAACTTCACCAAGGAGGAC)
Q48W, Q49N, Q51T
PBR89(5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR152
(5'GTCCTCCTTGGTGAAGTTCCACAGCTGCTT) 및 PBR8 /PBR151
(5'AAGCAGCTGTGGAACTTCACCAAG GAGGAC)
단편들이 프랭킹 프라이머 PBR89 와 PBR 8 로 PCR 반응에서 모집되었다. 결과적인 유전자는 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1(-)Hygro/Intron 내로 삽입되고, 각각 [Q48F, Q49N, Q51T]인간 IFNB (플라스미드 지정된 PF305), [Q48V, Q49N, Q51T] 인간 IFNB (플라스미드 지정된 PF306), 및 [Q48W, Q49N, Q51T] 인간 IFNB (플라스미드 지정된 PF307)에 이르는 정확한 염기 변화를 가지도록 서열화함으로서 확인된다.
PF305, PF306, PF307 및 PF185(엔코팅[Q49N, Q51T]인간 IFNB)가 트랙스팩션 제로 Fugene 6(Roche)를 이용하여 CHO K1 세포내로 감염된다. 24 시간 후, 배양 배지는 회수되어 IFNB 활성에 대해서 측정되었다.
PF185 134713 IU/ml
PF305 53122 IU/ml
PF306 65949 IU/ml
PF307 45076 IU/ml
이들 글리코실화 변이체에서 부착된 탄화수소의 양을 측정하기 위해서, 웨스턴 블럿이 각각의 레인에서 동량의 활성으로 수행되었다. 도입된 글리코실화 부위(Q49N, Q51T)앞서 아미노산 변화(Q48F, Q48V, Q48W)가 보여지는 바와 같이, 양자 는 유의하게 증가된 양의 전부 글리코실화된 물질에 이르게 된다.
다른 실시예에서, 특히 티로신 삽입이 위치 48 에서 삽입된 N-연결된 글리코실화 부위로의 위치 111 에서 증가된 양의 부착된 탄화수소에 이르게 된다.
실시예8
위치 111에서 증가된 탄화수소 부착을 가지는 변이체
WO 01/15736 의 실시예 5 에서 기술된 IFNB 변이체[F111N, R113T]에서 위치 111 에서 삽입된 N-결합 글리코실화 부위가 단지 약 50 % 정도만 사용된다. 부착된 탄화수소의 양을 증가시키기 위해서, 위치 110 에서 아스파라틱 산 잔기가 페닐알라닌(D110F), 발린(D110V)으로 특정부위 PCR 돌연변이 유발에 의해서 치환되었다. 템플레이트(template)로 BIO-X-ACT(Bioline, UK) 및 PF085(WO 01/15736 에 기술)를 사용하여, PCR반응들이 하기 오버래핑 프라이머-세트로 수행된다.
D110F, F111N, R113T
PBR89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR154 (5'CAGCTTGCCGGTGGTGTTGAACTCCTTCTC) 및 PBR8 /PBR153 (GAGAAGGAGTTCAACACCACCGGCAAG CTG)
D110V, F111N, R113T
PBR89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) /PBR156
(5'CAGCTTGCCGGTGGTGTTCACCTCCTTCTC) 및 PBR 8 /PBR 155
(5'GAGAAGGAGGTGAACACCACCGGCAAGCTG) .
단편들이 프랭킹 프라이머 PBR89 와 PBR 9 로 PCR 반응에서 모집되었다. 결과적인 유전자는 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1(-)Hygro/Intron 내로 삽입되고, 각각 [D110F, F111N, R113T] 인간 IFNB (플라스미드 지정된 PF308) 및 [D110V, F111N, R113T] 인간 IFNB (플라스미드 지정된 PF309)에 이르는 정확한 염기 변화를 가지도록 서열화함으로서 확인된다.
PF308, PF309 및 PF085(엔코팅[F111N, R113T]인간 IFNB)가 트랙스팩션 제로 Fugene 6(Roche)를 이용하여 CHO K1 세포내로 감염된다. 24 시간 후, 배양 배지는 회수되어 IFNB 활성에 대해서 측정되었다.
PF085 58615 IU/ml
PF308 50900 IU/ml
PF309 15063 IU/ml
이들 글리코실화 변이체에서 부착된 탄화수소의 양을 측정하기 위해서, 웨스턴 블럿이 각각의 레인에서 동량의 활성으로 수행되었다. 도입된 글리코실화 부위(F111N, R113T)앞서 아미노산 변화(D110F 및 D110V)가 보여지는 바와 같이, 양자 는 유의하게 증가된 양의 전부 글리코실화된 물질에 이르게 된다.
다른 실시예에서, 특히 티로신 삽입이 위치 110 에서 삽입된 N-연결된 글리코실화 부위로의 위치 111 에서 증가된 양의 부착된 탄화수소에 이르게 된다.
실시예 9
IFNB 폴리펩티드 글리코폼의 분리
하이드록시에피타이트 크로마토그래피는 IFNB 글리코폼의 효과적인 분리 수단이며, 예를 들면, 완전히 이용된 글리코실화 부위를 가지는 글리코폼을 얻는다. 이는 본 발명의 실시예에 기술된다.
WO 01/15736 의 실시예 8 에서 기술된 IFNB 변이체[Q49N+Q51T+F111N+R113T]가 3 단 절차로 정제되었다:
롤러 바틀로부터 회수된 배지가 원심분리되고, 0.22 um 필터(PVDF)를 통해서 여과된다. 여과된 배지는 컷오프 10000를 가지는 폴리에테르설폰 막이 구비된 Vivaflow 200 시스템 상에서 디아필트레이트(diafiltrate)되고, 50 mM 쏘듐 아세테이트, 50 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5로 평형된 S-Sepharose 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 컬럼에 고정된 IFNB 변이체는 50 mM 쏘듐 아세테이트, 0.5 M 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 호 용출된다. S-Sepharose 컬럼 용출물에서 쏘듐 클로라이드의 농축물은 1.0 M 로 조절되고, 시료는 50 mM 쏘듐 아세테이트, 1.0 M 쏘듐 클로라이드, pH 5.5로 평형된 Phenyl-Sepharose High Perfomance column(Pharmacia) 에 적용된다. 적용 후, 컬럼은 Milli Q Water 로 세척된다. IFNB 변이체는 Milli Q Water 에서 60 % 에틸렌 글리콜, 50 mM 쏘듐 아세테이트, pH 5.5 로의 구배로 30 컬럼 부피에서 용출되었다. 전부 글리코실화된 IFNB 변이체를 함유하는 분획물이 모아지고, 용출물에서 버퍼가 15 mM 쏘듐 포스페이트 버퍼, pH 7.2 로 변화되었다. 시료는 15 mM 쏘듐 포스페이트로 평형된 하이드록시에피타이트 컬럼(CHT II, Ceramic hydroxyapatite, Type II, Biorad)상에 적용되었다. 전부 글리코실화된 형태는 컬럼을 통과하고, 반면, 사용되는 하나의 여유의 사이트를 가지는 부족한 글리코실화 형태는 컬럼에 고정되며, 그리고 15 mM 에서 200 mM 로의 선형 쏘듐 포스페이트 구배로 20 컬럼 부피에서 용출된다.
전부 글리코실화된 [Q49N+Q51T+F111N+R113T] 의 순도는 SDS-PAGE 기준에서 95 % 보다 더 높은 것으로 판단되었다.
실시예 10
도입된 글리코실화 부위를 가지는 IFNB 변이체의 PEG 화
SCM-PEG(카르복실화된 PEG 의 숙신이미딜 에스테르, Shearwater, Alabama 에서 구매, 5 kDa 또는 12 kDa)의 신규 스탁 용액이 각 실험 전에 메탄올에서 제조되었다.
50 mM 쏘듐포스페이트에서 100 마이크로리터의 0.3 mg/ml 용액의 글리코변이체[Q49N+Q51T+F111N+R113T]인간 IFNB, 100 mM 쏘듐 클로라이드, pH 7.0 이 SCM-PEG,5 kDa 또는 12 kDa 로, 가능한 PEG 부위, 예를 들어 리신 및 N-말단에 대해서 PEG 의 두배의 몰과량으로 PEG 화되었다. 30 분간의 실온 배양후, 반응은 5 마이크로리터 20 mM 글리신, pH 8.0 의 투입으로 중단되었다. 이 상태에서, 반응 혼합물은 SDS-PEG 에 의한 판독결과 소수의 비변형 단백질을 함유하였다. 1 차 스크린 어세이를 이용하는 세포외 시험은 PEG 화된 물질이 부착된 12 kDa PEG 의 1-3 그룹을 가지고 40 % 활성을 보지한다는 것을 보여주었다. 부착된 5 kDa PEG 의 1-3 그룹은 보지된 생활성이 25 % 였다.
다른 실시예에서, 0.1 mg/ml 의 단백질 농도의 50 ㎕ 의 정제된[Q49N+Q51T+F111N+R113T+K19R+K45R+K123R]인간 IFNB 가 50 mM 쏘듐 포스페이트, 100 mM 쏘듐 클로라이드, pH8.0 에서 SCM-PEG 5 kDa로 가능한 PEG 화 부위, 예를 들어 리신 및 N-말단에 대해서 20 배의 과몰량으로 PEG 화되었다. 30 분간의 실온 배양 후, 반응은 50 ㎕ 20 mM, pH 8.0 글리신의 투입에 의해서 종료되었다. 이 단계에서, SDS-PAGE 에 의해서 판단된 비변형된 단백질을 반응 혼합물이 소량 함유하였다.
1 차 스크린 어세이를 이용하는 세포외 시험은 PEG 화된 물질이 부착된 5 kDa PEG 의 1-3 그룹을 가지고 45 % 활성을 보지한다는 것을 보여주었다. PEG 의 보다 높은 몰 과량은 하나 또는 몇개의 리신이 다른 아미노산 잔기로 치환되는 PEG 화 변이체에 요구된다.
PEG 화 물질은 비PEG 화된 물질과 PEG 잉여분으로부터 크기 배제 크로마토그래피 또는 카티온 교환 크로마토그래피 또는 양자의 조합에 의해서 분리된다. 크기 배제 크로마토그래피는 PBS 버퍼, pH 7.2 로 평형된 Superose 12 또는 Superdex 75 컬럼(Pharmacia)으로 수행되었다. 카티온 교환 크로마토그래피는 20 mM 사이트레이트, pH 2.7로 평형된 PBS 버퍼로 평형된 Pharmacis 의 SP-Sepharose HP 상에서 제거되었다. SP-Sepharose HP 컬럼으로부터의 용출은 염의 농도를 증가시키거나(예를 들어 쏘듐 클로라이드) 또는 버퍼의 pH 를 증가시킴으로서(예를 들어, 쏘듐 아세테이트 또는 쏘듐 포스페이트) 수행되었다.
실시예 11
C17S 의 치환의 수행에 의해서 글리코실화된 IFNB 의 안정화
CHO-K1 세포가 두개의 하기 하이퍼-글리코실화된 IFNB 변이체를 엔코딩하는 플라스미드로 감염되었다:[S2N,N4T,Q51N,E53T]인간 IFNB(PF276) 및 [S2N, N4T,C17S,Q51N,E53T]인간 IFNB(PF279). 융합성 안정한 1 차 감염 풀이 4 개의 T-175 플라스크로 각각 확장되었다. 융합에서, 플라스크가 혈청함유 배지에서 1/100 ITSA(Life Technologies No 51300-044)와 1/1000 Ex-Cyte(Serologicals Corp. No 81-129)로 보충된 DMEM/F12 배지(Lifetecnologies No 21045-025) 에 기초한 무혈청 배지로 전이되었다. 매일, 15 일간, 120 ml 의 각 변이체가 회수되고, 그리고 - 80 ℃ 에서 냉동되었다.
매일 회수물로부터의 상층액이 모아지고, 0.22 um 필터(PVDF 계)를 통해서 여과된다. 상층액은 대략 15 배 정도 컷오프 10000의 폴리에테르설폰 막을 구비한 Vivaflow 200 시스템 상에서 농축되고, 농축된 시료는 50 mM 쏘듐 아세테이트, 50 mM NaCl, pH 5.5 로 평형된 S-Sepharose 컬럼상에 적용된다. IFNB 변이체는 50 mM 쏘듐 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 5.5 단계에서 용출하였다.
S-Sepharose 컬럼으로부터 용출물에서 쏘듐 클로라이드의 농축물은 1.0 M 로 조절되고, 시료는 50 mM 쏘듐 아세테이트, 1.0 M NaCl, pH 5.5로 평형된 Phenyl-Sepharose 컬럼에 적용되었다. 다량의 세척이 평형 버퍼로 IFNB 변이체가 50 mM 쏘듐 아세테이트, pH 5.5 로 60 % 에틸렌 글리콜로 용출되기 전에 이루어진다.
정제후 비감소된 SDS-PAGE 는 명백하게 [S2N, N4T, Q51N, E53T]인간 IFNB의 이량체 형성을 보여주며, 반면 [S2N, N4T, C17S, Q51N, E53T]인간 IFNB에서는 어떤 이량체도 존재하지 않았다.
실시예 12
[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]인간 IFNB생산, 정제 및 PEG화
[C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]인간 IFNB 글리코실화 변이체를 생산하는 CHOK1 서브-클론(5/G-10)이 각각이 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)로 보충된 200 ml DMEM/F-12 배지(LifeTchnologies; Cat. #31330)에서, 각각이 1700 ㎠(Corning, USA)의 확장된 표면을 가진 2개의 롤러 바틀(bottle)내로 시드되었다. 2일 후에, 배기가 변경되었다. 또 다른 2일 후에, 2개의 롤러 바틀은 거의 100% 군집되고 배지는, 1/500 EX-CYTE(Serologicals Proteins; Cat. #81129N) 및 P/N로 보충된 300 ml의 혈청이 없는 UltraCHO 배지(BioWhittaker; Cat. #12-724)로 옮겨졌다. 이 배지에서의 세포 성장은, 혈청을 포함하는 배지에서 달성될 수 있는 것보다 더 높은, 높은 세포 집단을 촉진시킨다. 2일 후에, 배지를 다시 새로 바꾸었다. 또 다른 2일 후에, 배지는 생산 배지로 옮겨졌다: 1/100 ITSA(Life Technologies; Cat. #51300-044)[유착 배양을 위한 인슐린(1.0 g/L)-트랜스페린(0.55 g/L)-셀레늄(0.67 mg/L)첨가물을 위한 ITSA 스트랜드], 1/500 EC-CYTE 및 P/S로 보충된 DMEM/F-12 배지(Life Technologies; Cat. #21041). IFNB 활성의 측정을 위해 샘플들이 취해지기 전에 롤러 바틀로부터 회수된 배지가 모아졌다. 매일, 21일간, 1.8 l 배지가 회수되고, 그리고 - 80 ℃ 에서 냉각되었다.
롤러바틀로부터 회수된 배지는 0.22 마이크로미터 필터(PVDF)를 통해서 여과되고, 원심분리되었다. 여과된 배지는 컷오프 10000를 가지는 폴리에테르설폰 막이 구비된 Vivaflow 200 시스템 상에서 디아필트레이트(diafiltrate)되고, S-Sepharose 컬럼(Pharmacia)적용되었다.
50 mM 쏘듐 아세테이트, 50 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5으로 S-Sepharose 컬럼(Pharmacia)이 평형되고, 그리고 50 mM 쏘듐 아세테이트, 0.5 M 쏘듐 클로라이드, pH 5.5로 용출되었다. 용출물에서 쏘듐 클로라이드의 농도는 1.0 M 으로 조절되었다.
S-Sepharose 컬럼으로부터의 용출물은 50 mM 쏘듐 아세테이트, 1.0 M 쏘듐 클로라이드, pH 5.5로 평형된 Phenyl-Sepharose High Perfomance column(Pharmacia) 에 적용된다. 적용 후, 컬럼은 50 mM 쏘듐 아세테이트, 0.5 M 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 로 세척된다. IFNB 변이체는 50 mM 쏘듐 아세테이트, 0.5 M 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 에서 60 % 에틸렌 글리콜, 50 mM 쏘듐 아세테이트, pH 5.5 로의 구배로 30 컬럼 부피에서 용출되었다. 전부 글리코실화된 IFNB 변이체를 함유하는 분획물이 모아졌다.
Phenyl-Sepharose 로부터 용출물내 에틸렌 글리콜이 용출물을 50 mM 쏘듐 아세테이트, 50 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 로 평형된 S-Sepharose 컬럼을 통과시킴으로서 제거된다. 에틸렌 글리콜은 흐름속에 존재하고, 반면 인터페론 변이체는 컬럼에 고정된다. 적용 후, 컬럼이 20 mM 쏘듐 아세테이트, pH 5.5 으로 세척되고, 인터페론 변이체는 100 mM 쏘듐 포스페이트, pH 7.5 로 용출되었다.
용출물에서 포스페이트 농축물은 15 mM 쏘듐 포스페이트 버퍼 pH 7.2로 조절되었으며, 그리고 15 mM 쏘듐 포스페이트, pH 7.2로 평혀된 하이드록시에피타이트 컬럼(CHT1, 세라믹 하이드록시, 타입 I, Biorad)에 적용되었다. 전부 글리코실화된형태는 컬럼을 통과하고, 반면 사용되는 하나의 여유의 사이트를 가지는 부족한 글리코실화 형태는 컬럼에 고정되며, 그리고 pH 6.8, 15 mM 에서 200 mM 로의 선형 쏘듐 포스페이트 구배로 20 컬럼 부피에서 용출된다.
전부 글리코실화된 [C17S+Q49N+Q51T+D100F+F111N+R113T] 인간 IFNB 변이체의 순도는 SDS-PAGE 기준에서 95 % 보다 더 높은 것으로 판단되었다.
정제후, 변이체는 PEG 화되었다. SCM-PEG(카르복실화된 PEG 의 숙신이미딜 에스테르, Shearwater, Alabama 에서 구매, 5 K 또는 12 K)의 신규 스탁 용액이 각 실험 전에 96 % 에탄올에서 제조되었다.
20 mM 쏘듐포스페이트, pH 7.0 으로 0.1 mg/ml 단백질 용액이 SCM-PEG, 20 K 로, 가능한 PEG 부위, 예를 들어 리신 및 N-말단에 대해서 PEG 의 0.75배의 몰과량으로 PEG 화되었다. 30 분간의 실온 배양후, 반응은 과량의 20 mM 글리신, pH 8.0 의 투입으로 중단되었다. 반응 혼합물은 모노, 디, 및 비PEG화된 물질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG화된 물질은 카티온 교환 크로마토그래피나 또는 크기-배제 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로부터 다른 종류로부터 분리되었다. PEG 화 용액의 pH 는 2.7 로 조절되고, 그리고 시료들은 20 mM 사이트레이트, pH 2.7로 평형된 SP-Sephorese HR(Pharmacis)에 적용된다. PEG 화된 단백질은 1 M 쏘듐 클로라이드를 함유한 50 mM 쏘듐 아세테이트로 컬럼으로부터 용출되고, 100 mM 쏘듐아세테이트, 200 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 로 평행된 크기배제 컬럼, Sephacryl S-100((16/60)Pharmacia)상에 적용된다. 모노-PEG 화된 물질을 함유한 분획물은 모아졌고, 그리고 더 분석되었다.
다른 실시예에서, 단백질 용액, 20 mM 쏘듐 포스페이트, pH 7.0 에서 0.16 mg/ml 의 단백질 용액이 SCM-PEG, 12 K로, PEG 가능한 부위, 일예로 리신과 N-말단에 대해서 2 배 몰량의 과량의 PEG로 PEG 화된다. 실온에서 30 분간의 배양후, 과량의 20 mM 글리신, pH 8.0 의 투입으로 중단되었다. 반응 혼합물은 모노, 디, 및 비PEG화된 물질의 혼합물과 비유도된 물질을 함유하였다. PEG화된 물질은 카티온 교환 크로마토그래피나 또는 크기-배제 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로부터 비변형된 단백질로부터 분리되었다. PEG 화 용액의 pH 는 2.7 로 조절되고, 그리고 시료들은 20 mM 사이트레이트, pH 2.7로 평형된 SP-Sephorese HR(Pharmacis)에 적용된다. PEG 화된 단백질은 1 M 쏘듐 클로라이드를 함유한 50 mM 쏘듐 아세테이트로 컬럼으로부터 용출되고, 100 mM 쏘듐아세테이트, 200 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 로 평행된 크기배제 컬럼, Sephacryl S-100((16/60)Pharmacia)상에 적용된다. 모노-, 디, 및 트리-PEG 화된 단백질을 함유한 분획물은 모아졌고, 그리고 더 분석되었다.
실시예 13
롤러버틀에서[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]인간 IFNB생산, 정제 및 PEG화
[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]인간 IFNB 글리코실화 변이체를 생산하는 CHOK1 서브-클론(5/G-10)이 실시예 12에서와 같은 6 롤러버틀에서 생산되고, 실시예 12 에서 사용된 프로토콜에 따라서 정제되었다. 전부 글리코시화된 [C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T]인간 IFNB 변이체의 순도는 SDS-PAGE 기준에서 95 % 보다 더 높은 것으로 판단되었다.
정제후, 변이체는 PEG 화되었다. SCM-PEG(카르복실화된 PEG 의 숙신이미딜 에스테르, Shearwater, Alabama 에서 구매, 5 K 또는 12 K)의 신규 스탁 용액이 각 실험 전에 에탄올에서 제조되었다.
20 mM 쏘듐포스페이트, pH 7.0 으로 0.1 mg/ml 단백질 용액이 SCM-PEG, 20 K 로, 가능한 PEG 부위, 예를 들어 리신 및 N-말단에 대해서 PEG 의 3 배의 몰과량으로 PEG 화되었다. 30 분간의 실온 배양후, 반응은 과량의 20 mM 글리신, pH 8.0 의 투입으로 중단되었다. 반응 혼합물은 모노, 디, 및 비PEG화된 물질의 혼합물을 함유하였다. 모노-PEG화된 물질은 카티온 교환 크로마토그래피나 또는 크기-배제 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로부터 다른 종류로부터 분리되었다. PEG 화 용액의 pH 는 2.7 로 조절되고, 그리고 시료들은 20 mM 사이트레이트, pH 2.7로 평형된 SP-Sephorese HR(Pharmacis)에 적용된다. PEG 화된 단백질은 1 M 쏘듐 클로라이드를 함유한 50 mM 쏘듐 아세테이트로 컬럼으로부터 용출되고, 100 mM 쏘듐아세테이트, 200 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 로 평행된 크기배제 컬럼, Sephacryl S-100((16/60)Pharmacia)상에 적용된다. 모노-PEG 화된 물질을 함유한 분획물은 모아졌고, 그리고 더 분석되었다.
다른 실시예에서, 단백질 용액, 20 mM 쏘듐 포스페이트, pH 7.0 에서 0.1 mg/ml 의 단백질 용액이 (10mg/ml)SCM-PEG, 12 K로, PEG 가능한 부위, 일예로 리신과 N-말단에 대해서 5 배 몰량의 과량의 PEG로 PEG 화된다. 실온에서 30 분간의 배양후, 과량의 20 mM 글리신, pH 8.0 의 투입으로 중단되었다. 반응 혼합물은 모노,디, 및 비PEG화된 물질의 혼합물과 비유도된 물질을 함유하였다. PEG화된 물질은 카티온 교환 크로마토그래피나 또는 크기-배제 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로부터 비변형된 단백질로부터 분리되었다. PEG 화 용액의 pH 는 2.7 로 조절되고, 그리고 시료들은 20 mM 사이트레이트, pH 2.7로 평형된 SP-Sephorese HR(Pharmacis)에 적용된다. PEG 화된 단백질은 1 M 쏘듐 클로라이드를 함유한 50 mM 쏘듐 아세테이트로 컬럼으로부터 용출되고, 100 mM 쏘듐아세테이트, 200 mM 쏘듐 클로라이드, pH 5.5 로 평행된 크기배제 컬럼, Sephacryl S-100((16/60)Pharmacia)상에 적용된다. 모노-, 디, 및 트리-PEG 화된 단백질을 함유한 분획물은 모아졌고, 그리고 더 분석되었다
SEQUENCE LISTING <110> Maxygen ApS; H. Lundbeck A/S <120> Interferon beta-like molecules for treatment of stroke <130> 0256wo210 - INFB for stroke <140> <141> <160> 51 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Expression casette for expression of IFNB in mammalian and insect cells <400> 1 acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60 gttcgtgttg tcaacatgac caacaagtgt ctcctccaaa ttgctctcct gttgtgcttc 120 tccactacag ctctttccat gagctacaac ttgcttggat tcctacaaag aagcagcaat 180 tttcagtgtc agaagctcct gtggcaattg aatgggaggc ttgaatactg cctcaaggac 240 aggatgaact ttgacatccc tgaggagatt aagcagctgc agcagttcca gaaggaggac 300 gccgcattga ccatctatga gatgctccag aacatctttg ctattttcag acaagattca 360 tctagcactg gctggaatga gactattgtt gagaacctcc tggctaatgt ctatcatcag 420 ataaaccatc tgaagacagt cctggaagaa aaactggaga aagaagattt caccagggga 480 aaactcatga gcagtctgca cctgaaaaga tattatggga ggattctgca ttacctgaag 540 gccaaggagt acagtcactg tgcctggacc 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 caccacactg gactagtgga tccttatcag ttgcgcaggt agccggtcag gcggttgatg 60 aagtagaagt 70 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 25 catcagcttg ccggtggtgt tgtcctcctt c 31 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 26 gaaggaggac aacaccaccg gcaagctgat g 31 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 27 cacactggac tagtaagctt ttatcagttg cgcaggtagc 40 <210> 28 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 28 gaggagttcg aacttccagt gccagcgcct cctgtggcag ctgaacg 47 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 29 tttaaactgg atccagccac catgaccaac aag 33 <210> 30 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 30 cggccatagt agcgcttcag gtgcagggag ctcatcagct tgccggtggt gttgtcctcc 60 ttc 63 <210> 31 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 31 gaaggaggac aacaccaccg gcaagctgat gagctccctg cacctgaagc gctactatgg 60 ccg 63 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 32 ggcgtcctcc ttggtgaagt tctgcagctg 30 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 33 atatatccca agcttttatc agttgcgcag gtagccggt 39 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 34 cagctgcaga acttcaccaa ggaggacgcc 30 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 35 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 36 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 37 gtcctccttg gtgaagttga acagctgctt 30 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 38 atatatccca agcttttatc agttgcgcag gtagccggt 39 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 39 aagcagctgt tcaacttcac caaggaggac 30 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 40 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 41 gtcctccttg gtgaagttca ccagctgctt 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 42 aagcagctgg tgaacttcac caaggaggac 30 <210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 43 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 44 gtcctccttg gtgaagttcc acagctgctt 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 45 aagcagctgt ggaacttcac caaggaggac 30 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 46 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 47 cagcttgccg gtggtgttga actccttctc 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 48 gagaaggagt tcaacaccac cggcaagctg 30 <210> 49 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 49 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 50 cagcttgccg gtggtgttca cctccttctc 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 51 gagaaggagg tgaacaccac cggcaagctg 30 11 12

Claims (46)

  1. 영장류에 있어서 스트로크 또는 뇌혈관 발작(CAA)을 처리하기 위한 약제를 제조하기 위한, 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되어 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 스트로크가 허혈성 스트로크인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  3. 제2항에 있어서, 상기 허혈성 스트로크가 색전 스트로크, 심장 색전 스트로크, 혈전성 스트로크, 대용기(large vessel) 혈전증, 열공(lacunar) 파열, 동맥-동맥 스트로크, 및 원인불명 스트로크로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  4. 제1항에 있어서, 상기 스트로크가 출혈성 스트로크인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  5. 제4항에 있어서, 상기 출혈성 스트로크가 인트라파렌키말(intraparenchymal stroke)스트로크, 경막하 스트로크, 경막외 스트로크 및 지주막하스트로크로 이루어진 그룹에서 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  6. 영장류에서 일시적 허혈성 발작을 처리하기 위한 약제를 제조하기 위한, 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되어 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  7. 제 1-6 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 영장류가 인간인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  8. 제 1-7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실화 부위가 생체내 N-글리코실화 부위인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  9. 제 8 항에 있어서, IFNB 변이체가 아시알로(axialo)-글리코실화된 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  10. 제 1-9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체의 아미노산 서열이 1-15 아미노산 잔기에서 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)와 상이한 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  11. 제 1-10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 글리코실화 부위는
    S2N+N4T/S, L9N+R11T/S, R11N, S12N+N14T/S, F15N+C17S/T, Q16N+Q18T/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S, L28N+Y30T/S, D39T/S, K45N+L47T/S, Q46N+Q48T/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S, Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S, N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S, E104N+L106T/S, E107N+E109T/S, K108N+D110T/S, D110N, F111N+R113T/S 및 L116N 으로 이루어진 그룹에서 선택된 치환에 의해서 도입되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 치환이 S2N+N4T, L9N+R11T, Q49N+Q51T, R71N+D73T 및 F111N+R113T 으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 치환이 4Q9N+Q51T, R71N+D73T 및 F111N+R113T 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 치환이 Q49N+Q51T 및 F111N+R113T 으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  15. 제 11-14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는
    Q49N+Q51T+F111N+R113T,
    Q49N+Q51T+R71N+D73T+ F111N+ R113T,
    S2N+N4T+F111N+R113T,
    S2N+N4T+Q49N+Q51T,
    S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+F111N+R113T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
    L9N+R11T+Q49N+Q51T,
    L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T 및
    L9N+R11T+F111N+R113T 로 이루어진 그룹에서 선택된 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 변이체가 Q49N+Q51T+F111N+R113T 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  17. 제 1-16 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 야생형 타입 IFNB(SEQ ID NO:2)에서 위치 17 에 위치한 시스테인 잔기가 제거된 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 시스테인 잔기가 C17S 치환에 의해서 제거되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 변이체가
    C17S+Q49N+Q51T,
    C17S+F111N+R113T,
    C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
    C17S+Q49N+Q51T+R71N+D73T+ F111N+R113T,
    S2N+N4T+C17S+F111N+R113T,
    S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T,
    S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+F111N+R113T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T,
    L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T,
    L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T 및
    L9N+R11T+C17S+F111N+R113T 로 이루어진 그룹에서 선택된 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 변이체는 C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  21. 제 1-20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 위치 110 에서 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 치환이 D110F, D110V, D110W 및 D110Y 로 이루어진 그룹에서 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 치환이 D110F인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 변이체는
    C17S+D110F+F111N+R113T,
    C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
    C17S+Q49N+Q51T+R71N+D73T+D110F+F111N+R113T,
    S2N+N4T+C17S+D110F+F111N+R113T,
    S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T,
    L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T 및
    L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T로 이루어진 그룹에서 선택된 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 변이체는 C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 변이체가 SEQ ID NO:3에서 나타난 아미노산 서열을 가지는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  27. 제 1-26 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머 분자가 변이체의 아미노산 잔기에 공유결합적으로 부착되고, 상기 아미노산 잔기가 폴리머 분자에 대한 부착기를 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 폴리머가 PEG 분자인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 상기 부착기가 라이신 잔기의 ε-아미노기 또는 N-말단 아미노기인 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  30. 제 27-29 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 라이신 잔기가 제거된인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 라이신 잔기는 K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108, K115, K123, K134 및 K136 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 라이신 잔기가 K19, K33, K45 및 K123 으로 이루어진 그룹에서 선택된 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  33. 제 30-32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이신 잔기가 아르기닌 또는 글루타민 잔기로 라이신 잔기를 치환함으로서 제거되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  34. 제33항에 있어서, 상기 치환이
    K19R, K33R, K45R, K123R, K19R+K33R, K19R+K45R, K19R+K123R, K33R+K45R, K33R+K123R, K45R+K123R, K19R+K45R+K123R, K19R+K33R+K123R, K19R+K33R+K45R, K33R+K45R+K123R 및 K19R+K33R+K45R+K123R 로 이루어진 그룹에서 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  35. 제34항에 있어서, 상기 치환은 K19R+K45R+K123R, K19R+K33R+K123R,K19R+K33R+K45R 및 K33R+K45R+K123R 로 이루어진 그룹에서 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상기 치환이 K19R+K33R+K123R 로 이루어진 그룹에서 선택되는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 변이체가
    C17S+Q49N+Q51T+K19R+K33R+K45R,
    C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
    C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
    C17S+Q49N+Q51T+R71N+D73T+D110F+F111N+ R113T+K19R+K33R+K45R,
    S2N+N4T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
    S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
    S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R,
    L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R 및 L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R 로 이루어진 그룹에서 선택되는 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 변이체가 C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R 치환을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 용도.
  39. 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되어 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 효과적인 양을, 그것이 필요한 영장류에 투입하는 것을 포함하는, 영장류에서 스트로크 또는 뇌혈관 발작(CAA)을 처리하거나 또는 예방하기 위한 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 스트로크가 허혈성 스트로크인 방법
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 허혈성 스트로크가 색전 스트로크, 심장 색전 스트로크, 혈전성 스트로크, 대용기(large vessel) 혈전증, 열공(lacunar) 파열, 동맥-동맥 스트로크, 및 원인불명 스트로크로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  42. 제 39 항에 있어서, 상기 스트로크가 출혈성 스트로크인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 출혈성 스트로크는 인트라파렌키말(intraparenchymal stroke)스트로크, 경막하 스트로크, 경막외 스트로크 및 지주막하스트로크로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  44. 적어도 하나의 글리코실화 부위가 도입되어 야생형 인간 IFNB(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인터페론β(IFNB) 폴리펩티드 변이체의 효과적인 양을, 그것이 필요한 영장류에 투입하는 것을 포함하는, 영장류에서 일시적 허혈성 발작을 처리하거나 또는 예방하기 위한 방법.
  45. 제 39-44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영장류는 인간인 방법.
  46. 제 39-45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IFNB 변이체는 청구항 8-38항중 어는 한 항에서 한정되는 방법.
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