CZ299460B6

CZ299460B6 - DNA konstrukt, izolovaná molekula nukleové kyseliny, homologne rekombinantní bunka a její použití azpusob produkce G-CSF

Info

Publication number: CZ299460B6
Application number: CZ20003807A
Authority: CZ
Inventors: A. Treco@Douglas; W. Heartlein@Michael; F. Selden@Richard
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies, Inc.
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2008-08-06
Also published as: AU762969B2; EP1075530A1; NZ507451A; AR016263A1; KR20010071207A; ZA200005744B; CZ20003807A3; CN1308680A; AU3788799A; CA2328476A1; HUP0101355A3; US20030022850A1; JP2002513579A; US6242218B1; GC0000172A; HUP0101355A2; NO20005586D0; NO20005586L; PL344391A1; TR200003272T2

Abstract

Je popsán DNA konstrukt, který pozmenuje po zaclenení do genomu savcí bunky prostrednictvím homologní rekombinace expresi endogenního G-CSF genu v bunce, a obsahuje: (i) urcující sekvenci, obsahujícíalespon 20 bezprostredne po sobe následujících nukleotidu ze SEQ ID císlo 5 a (ii) transkripcní regulacní sekvenci. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahuje alespon 100 bezprostredne po sobe následujících nukleotidu ze SEQ ID císlo 5 nebo její komplement, pricemž izolovaná nukleová kyselina nekóduje celý G-CSF; dále je popsána homologne rekombinantní bunka stabilne transfektovaná DNA konstruktem, pricemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k iniciacnímukodónu ATG sekvence, kódující endogenní G-CSF, a rovnež zpusob produkce G-CSF, podle kterého se shora uvedená homologne rekombinantní bunka kultivujein vitro za takových podmínek, které umožnují bunce exprimovat a vylucovat G-CSF.

Description

DNA konstrukt, izolovaná molekula nukleové kyseliny, homologně rekombinantní buňka a její použití a způsob produkce G-CSF

Oblast techniky

Tento vynález se týká genomické DNA.

Dosavadní stav techniky

Běžné přístupy k léčbě onemocnění pomocí terapeutických proteinů zahrnují podávání proteinů, produkovaných in vitro i genovou terapii. Produkce proteinu in vitro obecně zahrnuje začlenění exogenní DNA, kódující protein, který je předmětem zájmu, do vhodných hostitelských buněk v kultuře. Na druhé straně genová terapie zahrnuje podávání geneticky upravených buněk, plasmidů, virů, které obsahují sekvenci, kódující terapeutický sledovaný protein, pacientovi.

Určité terapeutické proteiny mohou být také produkovány žádoucím pozměněním exprese jejich endogenních genů a to pomocí genových technik. Toto je možno nalézt např. v US 5 641 670,

US 5 733 761 a US 5 272 071, ve WO 91/06 666, WO 91/06 667 a WO 90/11 354. Všechny zmíněné odkazy jsou zde začleněny.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je DNA konstrukt, který pozměňuje po začlenění do genomu savčí buňky prostřednictvím homologní rekombinace expresi endogenního G-CSF genu v buňce, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje: (i) určující sekvenci, obsahující alespoň 20 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 a (ii) transkripční regulační sekvenci.

Dalším předmětem vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny, která obsahuje alespoň 100 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement, přičemž izolovaná nukleová kyselina nekóduje celý G-CSF.

Dalším předmětem vynálezu je homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k iniciačnímu kodonu ATG sekvence, kódující endogenní G-CSF a způsob produkce G-CSF, podle kterého se shora uvedená homologně rekombinantní buňka kultivuje in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat G-CSF.

Předmětný vynález je založen na identifikaci a sekvenování genomické DNA v pozici 5' ke kódující sekvenci genu pro lidský faktor stimulující granulocytovou kolonii („G-CSF“). Tato DNA může být použita např. v DNA konstruktu, který po začlenění do genomu savčí buňky pomocí homologní rekombinace, pozměňuje (např. zvyšuje) expresi endogenního G-CSF genu v této buňce. „Endogenní G-CSF gen“ znamená genomickou („tzn. Chromozomální“) kopii genu, který kóduje G-CSF. Konstrukt obsahuje určující sekvenci, včetně nově odhalené 5' nekódující sekvence nebo sekvence od ní odvozené, a transkripční regulační sekvenci. Transkripční regulační sekvence se výhodněji sekvenčně odlišuje od transkripční regulační sekvence endogenního G-CSF genu. Určující sekvence řídí integraci regulační sekvence do oblasti, která je v rámci sekvencí cílového genu, kódujících G-CSF nebo upstream (po směru transkripce) vůči nim. Regulační sekvence je operativně připojena k endogenní kódující sekvenci. Pod pojmem „operativně připojena“ je míněno to, že regulační sekvence může řídit expresi sekvence, kódující endogenní G-CSF. Konstrukt může dále obsahovat selekční značkový gen, který usnadňuje selekci buněk, které mají stabilně začleněný konstrukt a/nebo jinou kódující sekvenci, operativně připo55 jenou na promotor.

-1 CZ 299460 B6

V jednom provedení DNA konstrukt obsahuje: (a) určující sekvenci, (b) regulační sekvenci, (c) exon a (d) místo sestřihu donoru. Určující sekvence řídí integraci sebe samé a prvků (b) až (d) do oblasti, kteráje v rámci sekvencí, kódujících G-CSF, cílového genu nebo v upstream pozici vůči nim. Jakmile je prvek (b) začleněn, může řídit transkripci prvků (c) a (d) a všech kódujících sekvencí endogenního genu, které jsou v downstream pozici. V konstruktu je exon většinou na 3' konci regulační sekvence a místo sestřihu donoru je na 3' konci exonu.

V jiném provedení DNA konstrukt obsahuje: (a) určující sekvenci, (b) regulační sekvenci, (c) exon, (d) místo sestřihu donoru, (e) intron a (f) místo sestřihu akceptoru, přičemž určující sekvence řídí začlenění sebe samé a prvků (b) až (f) tak, že prvky (b) až (f) jsou v rámci endogenního genu nebo v upstream pozici vůči němu. Regulační sekvence poté řídí produkci transkriptu, který neobsahuje pouze prvky (c) až (f), ale také sekvence, kódující endogenní G-CSF. Výhodněji jsou intron, pocházející z konstruktu a místo sestřihu akceptoru umístěny v konstruktu v downstream pozici od místa sestřihu donoru.

Určující sekvence je homologní s předem vybraným cílovým místem v genomu, se kterým má proběhnout homologní rekombinace. Obsahuje alespoň 20 (např. alespoň 50 až 100) bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze sekvence s identifikačním číslem 5 (SEQ ID číslo 5), která reprezentuje nukleotidy -6578 až-364, vztaženo k místu počátku translace, v lidském GCSF genu. Pod pojmem „homologní“ je míněno to, že určující sekvence je identická nebo dostatečně podobná se svým genomickým cílovým místem, takže určující sekvence a cílové místo mohou podstoupit homologní rekombinaci. Malé procento chybně spojeným párů bází je přijatelné do té míry, pokud může homologní rekombinace probíhat s užitečnou frekvencí. Pro usnadně25 ní homologní rekombinace má určující sekvence výhodněji délku alespoň asi 20 (např. 50, 100, 250, 400 nebo 1000) párů bází („bp“). Určující sekvence může také zahrnovat genomické sekvence vně oblasti, pokryté SEQ ID číslo 5 a to do té míry, dokud zahrnuje alespoň 20 nukleotidů z této oblasti. Další určující sekvence mohou například pocházet ze sekvence, ležící mezi SEQ ID číslo 5 a endogenní sekvencí pro zahájení transkripce G-CSF genu.

Vzhledem k polymorfismu, který může existovat v genetickém místě G-CSF, se mohou v nukleotidovém složení jakéhokoliv daného genomického cílového místa v jakýchkoliv daných savčích druzích vyskytovat minoritní variace. Určující sekvence, které odpovídají těmto polymorfním variantám SEQ ID číslo 5 (konkrétně lidské polymorfní varianty) jsou v rámci rozsahu tohoto vynálezu.

Po homologní rekombinaci je regulační sekvence konstruktu začleněna do předem vybrané oblasti chromozómu buňky, která je v upstream pozici ke kódující sekvenci G-CSF genu. Vzniklá nová transkripční jednotka, obsahující regulační sekvenci pocházející z konstruktu, pozměňuje expresi cílového G-CSF genu. Takto produkovaný G-CSF protein může být z hlediska sekvence identický s G-CSF proteinem, který je kódován nepozměněným endogenním genem, nebo může ve srovnání s divokým G-CSF proteinem obsahovat další substituované zbytky nebo zbytky s menším počtem aminokyselin a to vzhledem ke změnám, které jsou začleněny jakožto výsledek homologní rekombinace.

Pozměněná exprese genu zahrnuje aktivování (nebo přimění k expresi) genu, který je obvykle v získané buňce klidný (tzn. v podstatě není exprimován), zvýšení nebo snížení hladiny exprese genu a změnu průběhu regulace genu a to takovou, že průběh se liší od průběhu v získané buňce. „Získaná buňka“ znamená buňku před homologní rekombinaci.

Vynález se také věnuje transfektováným nebo infikovaným buňkám, ve kterých konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k endogennímu iniciačnímu kodonu ATG v jedné nebo obou alelách endogenního G-CSF genu. Tyto transfektované nebo infikované buňky, také označované jako homologně rekombinantní buňky, mají pozměněný průběh exprese G-CSF. Tyto buňky jsou konkrétně užitečné pro produkci G-CSF in vitro a pro

-2CZ 299460 B6 dodávání G-CSF prostřednictvím genové terapie. Způsoby přípravy a použití těchto buněk jsou vynálezem rovněž pokryty. Buňky mohou pocházet z obratlovců jako jsou např. savčí buňky (např. lidské buňky, buňky primáta jiného než člověk, kravské, prasečí, koňské, kozí, ovčí, kočičí, psí, králičí, myší, buňky z morčete, křečka nebo potkana).

Předmětný vynález se dále týká způsobu produkce savčího G-CSF proteinu in vitro nebo in vivo, a to pomocí začlenění výše popsaného konstruktu do genomu hostitelské buňky prostřednictvím homologní rekombinace. Homologně rekombinantní buňka je poté ponechána v takových podmínkách, kdy dochází k transkripci, translaci a příležitostně sekreci G-CSF proteinu.

Vynález se také věnuje izolované nukleové kyselině, obsahující sekvenci alespoň 20 (např. alespoň 30, 50, 100, 200 nebo 1000) bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement nebo sekvenci ze sekvence identické se SEQ ID číslo 5 až na polymorfní variace nebo jiné minoritní variace (např. méně než 5 % sekvence), která nezabraňuje homologní rekombinaci s cílovou sekvencí. V jednom provedení zahrnuje izolovaná nukleová kyselina blok bezprostředně po sobě následujících 100 bp SEQ ID číslo 5. Například, izolovaná DNA může obsahovat nukleotidy 1 až 100, 101 až 200, 201 až 300, 301 až 400, 401 až 500, 501 až 600, 601 až 700, 701 až 800, 801 až 900, 901 až 1000, 1001 až 1100, 1101 až 1200, 1201 až 1300, 1301 až 1400, 1401 až 1500, 1501 až 1600, 1601 až 1700, 1701 až 1800, 1801 až 1900,

1 901 až 2000, 2001 až 2100, 2101 až 2200, 2201 až 2300, 2301 až 2400, 2401 až 2500, 2501 až

2600, 2601 až 2700, 2701 až 2800, 2801 až 2900, 2901 až 3000, 3001 až 3100, 3101 až 3200, 3201 až 3300, 3301 až 3400, 3401 až 3500, 3501 až 3600, 3601 až 3700, 3701 až 3800, 3801 až 3900, 3901 až 4000, 4001 až 4100, 4101 až 4200, 4201 až 4300, 4301 až 4400, 4401 až 4500, 4501 až 4600, 4601 až 4700, 4701 až 4800, 4801 až 4900, 4901 až 5000, 5001 až 5100, 5101 až

5200, 5201 až 5300, 5301 až 5400, 5401 až 5500, 5501 až 5600, 5601 až 5700, 5701 až 5800,

5801 až 5900, 5901 až 6000, 6001 až 6100, 6101 až 6200 nebo 6136 až 6235 ze SEQ ID číslo 5 nebo z jejího komplementu. Tyto bloky SEQ ID číslo 5 a její komplement jsou také užitečné jako určující sekvence v konstruktech předmětného vynálezu.

V izolované DNA není sekvence, pocházející ze sekvence SEQ ID číslo 5, připojena na celou sekvenci, kódující G-CSF nebo alespoň není připojena ve stejné konfiguraci (tzn. oddělená stejnou nekódující sekvencí) jako to probíhá v jakémkoliv nativním genomu. Termín „izolovaná DNA“, jak je zde používán, tedy neoznačuje chromozóm nebo velký kus genomické DNA (který by mohl být začleněn do kosmidu nebo kvasinkového uměle sestrojeného chromozómu), který obsahuje pouze celou sekvenci SEQ ID číslo 5 nebo její část, ale obsahuje také neporušenou sekvenci, kódující G-CSF a všechno, co leží mezi sekvencí kódující G-CSF a sekvencí odpovídající SEQ ID číslo 5, jak to existuje v genomu buňky. Sem patří, ale neznamená to omezení v žádném směru, DNA (i) která je začleněna do plasmidu nebo viru nebo (ii) která existuje jako samostatná molekula nezávislá na jiných sekvencích např. fragment produkovaný pomocí poly40 merázové řetězové reakce („PCR“) nebo působením restrikční endonukleázy. Izolovaná DNA výhodněji neobsahuje sekvenci, která kóduje neporušený prekurzor G-CSF (tzn. G-CSF doplněný o svůj endogenní sekreční signální peptid).

Vynález rovněž zahrnuje izolovanou DNA, obsahující vlákno, které obsahuje sekvenci, jejíž délka je alespoň 100 (např. alespoň 200, 400 nebo 1000) nukleotidů a která hybridizuje buď za vysoce, nebo středně stringentních podmínek se SEQ ID číslo 5 nebo s komplementem SEQ ID číslo 5. Sekvence není připojena na sekvenci kódující G-CSF nebo alespoň není připojena ve stejné konfiguraci jako se to vyskytuje v jakémkoliv nativním genomu. Pod pojmem středně stringentní podmínky je míněna hybridizace při 50 °C v Churchově pufru (7% SDS, 0,5%

NaHPO₄, 1 M EDTA, 1% hovězí sérový albumin) a promytí při 50 °C v 2x SSC. Vysoce stringentní podmínky jsou definovány jako hybridizace při 42 °C v přítomnosti 50% formamidu; první promytí při 65 °C roztokem 2x SSC, obsahujícím 1% SDS, následuje druhé promytí při 65 °C roztokem 0,lx SSC.

-3CZ 299460 B6

Vynález rovněž zahrnuje izolovanou DNA obsahující vlákno, které obsahuje sekvenci, jejíž délka je alespoň 100 (např. alespoň 200, 400 nebo 1000) nukleotidů a která vykazuje alespoň 80% (např. alespoň 85%, 90%, 95% nebo 98%) sekvenční totožnost se stejně dlouhým úsekem ze SEQ ID číslo 5 nebo jejím komplementem. Sekvence není připojena na sekvenci kódující G-CSF nebo alespoň není připojena ve stejné konfiguraci jako se to vyskytuje v jakémkoliv nativním genomu.

Jestliže konkrétní polypeptidová molekula nebo molekula nukleové kyseliny vykazuje specifickou procentuální totožnost nebo konzervativitu s referenčním polypeptidem nebo molekulou to nukleové kyseliny, pak jsou procentuální totožnost nebo konzervativita určeny pomocí algoritmu podle Myerse a Millera CABIOS (1989), který je součástí programu ALIGN (version 2.0) nebo pomocí jeho ekvivalentu s použitím délky mezery 12 a mezerou 4, kde tyto parametry jsou nutné.

Všechny ostatní parametry jsou nastaveny na své předem dané pozice. Přístup do ALIGN je snadno dostupný např. na Internetu http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi.

Vynález se také zabývá způsobem dodání G-CSF jedinci (např. savci jako je člověk, primátu jinému než člověk, krávě, praseti, koni, koze, ovci, kočce, psovi, králíkovi, myši, morčeti, křečkovi nebo potkanovi). Toto je realizováno poskytnutím buňky, jejíž endogenní G-CSF gen byl zde popsaným způsobem aktivován a implantováním buňky do zvířete, kde buňka vylučuje G20 CSF. Ve vynálezu je rovněž zahrnut způsob produkce G-CSF, který zahrnuje poskytnutí buňky, jejíž endogenní G-CSF gen byl zde popsaným způsobem aktivován a kultivování této buňky in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat G-CSF.

Izolovaná DNA podle předmětného vynálezu může být použita například jako zdroj upstream primerů pro PCR pro použití (je-li kombinován s vhodným downstream příměrem) při získávání regulačních a/nebo kódujících oblastí endogenního G-CSF genu nebo jako hybridizační próba pro indikaci přítomnosti chromozómu 17 v preparátu lidských chromozómů. Také může být použita při pozměňování exprese endogenního G-CSF genu v buňce obratlovce, což je popsáno níže.

Pokud není definováno jinak, jsou všechny technické a vědecké termíny, které se zde vyskytují, používány ve stejném smyslu jako je běžně znám odborníkům v dané oblasti techniky, kterým je tento vynález určen. Exemplární způsoby a materiály jsou popsány níže, ale při zkoušení nebo testování předmětného vynálezu mohou být také použity způsoby a materiály podobné nebo stej35 né jako jsou ty, které jsou zde popsány. Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a jiné zde zmiňované odkazy jsou zde začleněny. V případě sporu bude předložená specifikace včetně definicí kontrolována. Materiály, způsoby a příklady jsou pouze ilustrativní a nejsou zamýšleny jako jakýmkoliv způsobem limitující.

Další znaky a výhody vynálezu budou patrné z následujícího podrobnějšího popisu a z nároků.

Předmětný vynález je založen na objevu nukleotidového složení sekvence upstream ke kódující sekvenci lidského G-CSF genu.

G-CSF je cytokin, který stimuluje množení a diferenciaci hematopo i etických progenitorových buněk spojených s neutrofil/granulocytovou linií. G—CSF je běžně používán při prevenci neutropénie, indukované chemoterapií, a ve spojení s transplantací kostní dřeně. Rovněž chronická idiopatická a vrozená neutropenická onemocnění vykazují po aplikaci G-CSF zlepšení.

Lidský G-CSF gen kóduje prekurzorový protein o 204 nebo 207 aminokyselinách, který obsahuje 30 aminokyselinový signální peptid. Genomická mapa lidského G-CSF genu je ukázána na obr. 1. Mapa je sestrojena na základě publikované sekvence o 2960 bp (HUMGCSFG, GenBank přístupové číslo X03656), která začíná v pozici -363 ve vztahu k translačnímu startovnímu místu (pokud není jinak uvedeno, všechny zde uváděné pozice jsou vztaženy k translačnímu startovní55 mu místu). Gen obsahuje 5 exonů a 4 introny, přičemž první exon, kódující 13 2/3 aminokyselin

-4CZ 299460 B6 signálního peptidu (tzn. první exon obsahuje 13 kodonů a první dva nukleotidy čtrnáctého kodonů, kódujícího signální peptid).

Sekvence v 5' pozici vůči lidskému G-CSF genu

Pro získání genomické DNA, obsahující upstream sekvenci G-CSF genu, byla testována genomická knihovna lidského leukocytu v lambda EMBL3 (Clontech katalogové # HL1006d). Testování bylo provedeno s oligonukleotidovou próbou o 729 bp, získanou PCR. Tato próba zahrnuje G-CSF exony 1 a 2 a byla amplifikována z lidské genomické DNA s pomocí oligonukleotidoío vých primerů, označených 102 a 105. Oba primery byly navrženy na základě dostupné genomické DNA sekvence G-CSF (obr. 1). 5' konec primerů 102 odpovídá pozici -345 a sekvence příměru je 5 -TATCAGCGGCTCAGCCTTTG-3' (SEQ ID číslo 3). 5' konec primerů 105 odpovídá pozici +384 a sekvence primerů je 5'-CC ACCTCACTCACCAGCTTCTC-3' (SEQ ID číslo

4)·

Pomocí radioznačené próby o 729 bp bylo testováno přibližně 1,5 milionu rekombinantních fágů. Byly izolovány 4 nezávislé fágové plaky. Jeden z nich, označený jako klon G-CSF/3, byl použit pro další studie.

Fragment z fágu G-CSF/3 o velikosti 6,5 kb, HindlII-KpnI, byl subklonován do pBluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) s cílem produkovat pHGCSFl, který obsahuje upstream sekvence a celou oblast G-CSF genu, která kóduje protein. Další upstream subklon, pHGCSF4, byl připraven z fragmentu Sáli o velikosti 3,3 kb, který se s inzertem pHGCSFl překrývá úsekem o velikosti asi 0,4 kb (obr. 2.).

Plasmidy pHGCSFl a pHGCSF4 byly sekvenovány metodou podle Sangera. Soubory sekvenčních dat byly porovnány. Cílem bylo získat sekvenci oblasti o velikosti 6,6 kb, kteráje v bezprostřední upstream pozici k transkripčnímu iniciačnímu místu lidského G-CSF genu, začínajícího v pozici -6578. Tato sekvence je částí SEQ ID číslo 1, ukázané na obr. 3.

bp (na obr. 3 podtrženy) na 5' konci SEQ ID číslo 1 pocházejí ze spojení genomického inzertu a raménka fága ve fágovém klonu G-CSF/3. Sáli místo v této oblasti, jejíž velikost je 19 bp, tudíž není přítomno v lidském genomu, ze kterého pochází fágová knihovna. Sekvence mezi pozicemi -6578 a -364 (SEQ ID číslo 5) je lidská genomická sekvence z oblasti upstream k dříve publikované genomické sekvenci G-CSF. Tato sekvence nebyla dosud nikde uvedena.

Aby byla pozměněna exprese endogenního G-CSF genu, byl DNA fragment, obsahující nukleotidy 1470 až 4723 ze SEQ ID číslo 5, klonován do plasmidů pGG13 upstream k CMV promotoru a genu pro rezistenci vůči neomycinu.

Nukleotidy 1470 až 4723 (SEQ ID číslo 6) reprezentují první určující sekvenci jako je to schematicky znázorněno na obr. 4. V případě druhé určující sekvence z obr. 4 byl DNA fragment, obsahující nukleotidy 4728 až 5979 (SEQ ID číslo 7), vztaženo k translačnímu startovnímu místu, sekvence G-CSF genu klonován downstream k CMV promotoru a genu pro rezistenci vůči neomycinu. Plasmid pGG13 byl začleněn do lidských fibroblastových buněk, vykazujících malou nebo nulovou expresi G-CSF genu s cílem umožnit homologní rekombinaci s endogenním GCSF genem. Buňky, které vykazovaly po začlenění plasmidů rezistenci vůči G418, byly vybrány a testovány. Cílem bylo identifikovat buňky se zvýšenou expresí G-CSF genu, což lze očekávat v případě, že se homologní rekombinace mezi pGG13 a genomickou DNA uskutečnila v blízkosti endogenního G-CSF genu.

-5CZ 299460 B6

Obecná metodologie

Pozměnění exprese endogenního G-CSF

Pomocí výše popsaných upstream G-CSF sekvencí je možno pozměnit expresi endogenního lidského G-CSF genu a to způsobem, který je obecně popsán v patentu US 5 641 670. Jedna možná strategie je ukázána na obr. 4. V této strategii je konstrukt sestrojen tak, aby zahrnoval první určující sekvenci homologní s prvním cílovým místem v upstream pozici vůči genu, amplifíkační značkový gen, selekční značkový gen, regulační oblast, CAP místo, exon, kódující aminokyseliío novou sekvenci, která je identická nebo funkčně rovnocenná se sekvencí prvních 13 2/3 aminokyselin G-CSF signálního peptidů (tzn. první exon obsahuje 13 kodonů a první dva nukleotidy 14 kodonů, kódujícího signální peptid), místo sestřihu donoru a druhou určující sekvenci homologní s druhým cílovým místem downstream k prvnímu cílovému místu a terminaci buď v rámci sekvence, kódující G-CSF, nebo upstream k ní. V této strategii před homologní rekombinaci v chromozómu spolu první a druhé cílové místo bezprostředně sousedí, avšak tato konfigurace není nutná (viz níže). Homologně rekombinantní buňky budou produkovat prekurzor mRNA, který odpovídá exogennímu exonu a místu sestřihu donoru a jakékoliv sekvenci mezi místem sestřihu donoru a transkripční terminační sekvencí G-CSF genu včetně G-CSF intronů, exonů a 3' nepřeložené oblasti (obr. 4). Výsledkem sestřihu tohoto transkriptuje mRNA, ve které je exo20 genní exon fúzován s exonem 2 endogenního G-CSF genu. Translací mRNA vzniká prekurzor G-CSF. Začlenění následujícího exonu do DNA konstruktu umožňuje provést jakékoliv žádoucí modifikace signálního peptidů.

Mohou být také použity jiné přístupy. Například první a/nebo druhé cílové místo může být v prv25 ním intronu G-CSF genu. Příležitostně může být DNA konstrukt sestrojen tak, aby obsahoval, od 5' ke 3' konci, první určující sekvenci, amplifíkační značkový gen, selekční značkový gen, regulační oblast, CAP místo, exon, místo sestřihu donoru, intron, místo sestřihu akceptoru a druhou určující sekvenci. Pro tuto strategii je 5' konec druhého cílového místa výhodněji méně než 60 bp upstream k běžnému translačnímu iniciačnímu místu G-CSF. Důvodem je vyloučení nežádou30 cích startovních kodonů ATG. Prekurzor mRNA, produkovaný z homologně rekombinovaného místa, bude zahrnovat exogenní exon, exogenní místo sestřihu donoru, exogenní intron, exogenní místo sestřihu akceptoru, druhou určující sekvenci a jakékoliv sekvence mezi druhou určující sekvencí a 3' nepřepsanou oblastí endogenního genu. Výsledkem sestřihu tohoto transkriptu bude mRNA, která může být přeložena s cílem produkovat prekurzor lidského G-CSF, který má buď běžnou signální sekvenci pro sekreci G-CSF, nebo geneticky modifikovanou sekreční signální sekvenci. Velikost exogenního intronu a tedy i pozice exogenní regulační oblasti se může vzhledem ke kódující oblasti genu lišit, a to z toho důvodu, aby byla optimalizována funkce regulační oblasti.

V jakékoliv strategii aktivace spolu nemusí první a druhé cílové místo bezprostředně sousedit nebo dokonce ani nemusí být blízko sebe. Jestliže spolu bezprostředně nesousedí, měla by být část běžné upstream oblasti genu G-CSF a/nebo část kódující oblasti po homologní rekombinaci odstraněna.

DNA konstrukt

DNA konstrukt podle vynálezu zahrnuje alespoň určující sekvenci a regulační sekvenci. Může také dále obsahovat exon; nebo exon a nepárované místo sestřihu donoru; nebo exon, místo sestřihu donoru, intron a místo sestřihu akceptoru. Exon, je-li přítomen, je 3' část regulační sekvence a nepárované místo sestřihu donoru je na 3’ konci exonu. Intron a místo sestřihu akceptoru, jestliže jsou přítomny, jsou 3' místa sestřihu donoru. Dále zde může být více exonů a intronů (s odpovídajícími místy sestřihu donoru a akceptoru) předcházejících (tzn. 5') k exonu, který přesahuje o nepárované místo sestřihu donoru. DNA v konstruktu je označována jako exogenní, protože není původní částí genomu hostitelské buňky. Exogenní DNA může mít sekvence odlišné nebo identické s částmi endogenní genomické DNA, přítomné v buňce před transfekci nebo

-6CZ 299460 B6 infekcí virovým vektorem. Zde používaný pojem „transfekce“ znamená začlenění plasmidů do buňky chemickým nebo fyzikálním způsobem jako je srážení fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem, lipofekce, elektroporace, mikroinjekce, mikroprojektilace nebo zachycení pomocí biolistiku. „Infekce“, jak je zde použí5 vána, znamená začlenění virové nukleové kyseliny do buňky pomocí infekce virem. Různé prvky, obsažené v DNA konstruktu podle vynálezu, jsou podrobněji popsány níže.

DNA konstrukt může také zahrnovat cis-pracující nebo trans-pracující virové sekvence (např. signály pro sbalování), čímž je umožněno dopravení konstruktu do jádra buňky prostřednictvím infekce virovým vektorem. Jestliže je to nezbytné, může být DNA konstrukt uvolněn během různých stupňů životního cyklu viru jako je intergrace zprostředkovaná integrázou v retrovirech nebo episomový způsob. Uvolnění může být doprovázeno odpovídajícími delecemi nebo mutacemi virových sekvencí jako je delece integrázové kódující oblasti v retrovirovém vektoru. Další podrobnosti týkající se konstrukce a použití virových vektorů je možno nalézt v Robbins a kol.

Pharmacol. Ther. 80:35 až 47, 1998 a v Gunzburg a kol.. Mol. Med. Today 1:410 až 417, 1995, které jsou zde začleněny jako odkaz.

Určující sekvence

Určující sekvence umožňují homologní rekombinací žádoucí sekvence do zvoleného místa v genomu hostitele. Určující sekvence jsou homologní (tzn. schopny homologně se rekombinovat) se svými odpovídajícími cílovými oblastmi v genomu hostitele.

Kružnicový DNA konstrukt může používat jedinou určující sekvenci nebo dvě nebo více samo25 statných určujících sekvencí. Lineární DNA konstrukt může obsahovat dvě nebo více samostatných určujících sekvencí. Cílové místo, se kterým je daná určující sekvence homologní, může být v exonu a/nebo intronu G-CSF genu, v upstream pozici a v pozici bezprostředně sousedící s oblastí, kódující G-CSF nebo v upstream pozici a v pozici vzdálené od oblasti, kódující GCSF.

První ze dvou určujících sekvencí v konstruktu (nebo celá určující sekvence v případě, že je v konstruktu pouze jedna určující sekvence) pochází alespoň částečně z nově odhalené oblasti genomu, upstream k sekvencím, kódujícím G-CSF. Tato určující sekvence může obsahovat část SEQ ID číslo 1, např. alespoň 20 po sobě jdoucích nukleotidů ze sekvence, odpovídající pozicím

-6578 až-364 (SEQ ID číslo 5). Druhá ze dvou určujících sekvencí v konstruktu může zaměřit oblast genomu upstream ke kódující sekvenci (tzn. také obsahuje část SEQ ID číslo 5) nebo zaměří exon nebo intron genu.

Určující sekvence může (mohou) dále zahrnovat sekvence, pocházející z dříve odhalené oblasti

G—CSF genu včetně těch, které jsou zde popsány. Dále může zahrnovat také oblast v upstream pozici, která není strukturálně charakterizována, ale může být odborníkem v dané oblasti zmapována.

Fragmenty genomu, které mohou být použity jako určující sekvence, mohou být identifikovány pomocí své schopnosti hybridizovat s próbou, obsahující celou nebo pouze část SEQ ID číslo 5. Tato próba může být vytvořena pomocí PCR s použitím primerů, odvozených od SEQ ID číslo 1. Regulační sekvence

Regulační sekvence DNA konstruktu mohou obsahovat jeden nebo více promotorů (např. konstitutivní, tkáňově-specifický nebo indukovatelný promotor), zesilovače, podpůrné oblasti při připojování („scaffold-attachment region“) nebo místa pro připojení na matrici, negativní regulační prvky, vazebná místa pro transkripční faktor nebo kombinace těchto prvků.

-7CZ 299460 B6

Regulační sekvence může pocházet z genomu eukaryotní (např. savčí) buňky nebo z genomu viru. Užitečné regulační sekvence zahrnují, aniž by to znamenalo nějaké omezení, takové sekvence, které regulují expresi genů časné a pozdní fáze SV40, cytomegalovirových genů a zejména adenovirových genů pozdní fáze. Také zahrnují regulační oblasti, pocházející z genů, kódujících myší metallothionein-I, elongační faktor-ία, kolagen (např. kolagen lal, kolagen Ia2 a kolagen IV), aktin (např. γ-aktin), imunoglobulin, HMG-CoA reduktázu, glyceraldehydfosfátdehydrogenázu, 3-fosfoglycerátkinázu, kolagenázu, stromelysin, fibronektin, vimentin, plasminogenový aktivátor inhibitor I, thymosin 64, tkáňové inhibitory metaloproteinázy, ribosomální proteiny, molekuly hlavního histokompatibilitního komplexu a lidské leukocytové antigeny.

Regulační sekvence výhodněji obsahuje vazebné místo pro transkripční faktor jako je TATA Box, CCAAT Box, API, Spi nebo vazebné místo NF-kB.

Značkové geny

V případě potřeby může konstrukt zahrnovat sekvenci, kódující žádoucí polypeptid, operativně připojenou na svůj vlastní promotor. Příkladem tohoto může být selekční značkový gen, který může být použit pro usnadnění identifikace sledovaného případu. Amplifikační značkový gen může být také použit pro usnadnění selekce buněk, které mají současně amplifikované i přesa20 hující DNA sekvence. Buňky, obsahující amplifikované kopie amplifikačního značkového genu, mohou být identifikovány prostřednictvím růstu v přítomnosti činidla, které selektuje expresi amplifikačního genu. Aktivovaný endogenní G-CSF gen bude většinou amplifikován spolu s amplifikačním selekčním značkovým genem. Buňky, obsahující více kopií aktivovaného endogenního genu, mohou produkovat velmi vysoké hladiny G-CSF a jsou tudíž užitečné pro pro25 dukci proteinu in vitro a pro genovou terapii.

Selekční a amplifikační značkové geny spolu nemusí bezprostředně sousedit. Amplifikačním značkovým genem a selekčním značkovým genem může být stejný gen. Jeden nebo oba značkové geny mohou být umístěny v intronu DNA konstruktu. Vhodné amplifikační a selekční značko30 vé geny jsou popsány v patentu US 5 641 670.

Exogenní exon

DNA konstrukt může dále obsahovat exon, tzn. DNA sekvenci, která je kopírována do RNA aje přítomna ve zralé molekule mRNA. Exon v konstruktu je zde označován jako exogenní exon. Exogenní exon může být identický s prvním exonem lidského G-CSF genu nebo se od něj může lišit. Příležitostně exogenní exon kóduje jeden nebo více aminokyselinových zbytků nebo částečně kóduje aminokyselinový zbytek (tzn. obsahuje jeden nebo dva nukleotidy kodonu). Jestliže exon obsahuje kódující sekvenci, měl by být DNA konstrukt sestrojen tak, že po transkripci a sestřihu je čtecí rámec vznikající mRNA uvnitř rámce s kódující oblastí cílového G-CSF genu. To znamená, že exogenní exon je připojen na endogenní exon tak, že nedochází ke změně příslušného čtecího rámce té části mRNA, pocházející z endogenního exonu.

Začlenění kódujícího exonu do konstruktu umožňuje produkci fúzního proteinu, kteiý obsahuje jak sekvenci endogenního G-CSF proteinu tak i sekvenci exogenního proteinu. Tento hybridní protein může kombinovat strukturální vlastnosti, enzymatické vlastnosti nebo vlastnosti související s vazbou ligandu nebo receptorů, dvou nebo více proteinů do jednoho polypeptidu. Například exogenní exon může kódovat buněčnou membránovou kotvu, signální peptid pro zvýšení buněčné sekrece, vedoucí sekvenci, enzymatickou oblast, oblast pro vazbu kofaktorů nebo epitopový cíl pro usnadnění přečištění G-CSF hybridního proteinu, produkovaného z rekombinantního genového místa.

-8CZ 299460 B6

Místo sestřihu donoru

Exogenní exon přesahuje na svém 3' konci o místo sestřihu donoru. Místo sestřihu donoru je sekvence, která řídí sestřih jednoho exonu RNA transkriptů na místo sestřihu akceptoru jiného exonu RNA transkriptů. První exon většinou leží v pozici 5' ke druhému exonu a místo sestřihu donoru, které se nachází na 3' konci prvního exonu, je párováno s místem sestřihu akceptoru na 5' straně druhého exonu. Místa sestřihu donoru mají charakteristickou shodnou sekvenci reprezentovanou (A/C)AGGURAGU (kde R značí purin), přičemž GU ve čtvrté a páté pozici jsou nezbytné (Jackson, Nucleic Acids Research 19: 3715 až 3798, 1991). První tři báze shodného ío místa sestřihu donoru jsou poslední tři báze exonu: tzn. nejsou vystřiženy. Místa sestřihu donoru jsou funkčně definována svou schopností ovlivňovat odpovídající reakci při sestřihu mRNA.

Například, místo sestřihu donoru může být umístěno v pozici bezprostředně sousedící a současně 3' k ATG kodonu, a to tehdy, když pro exogenní exon není požadováno, aby byly jeden nebo více zasahujících nuleotidů přítomny v rámci s druhým exonem zacíleného genu. Jestliže exogenní exon kóduje jednu nebo více aminokyselin v rámci s kódující sekvencí zacíleného genu, může být místo sestřihu donoru výhodněji umístěno v pozici bezprostředně sousedící s exogenní kódující sekvencí na její 3' straně.

Místo sestřihu donoru, přesahující exogenní exon, je v konstruktu nespárováno tzn. v samotném konstruktu není žádné další místo sestřihu akceptoru, které by bylo downstream k místu sestřihu donoru, na které by bylo místo sestřihu donoru sestřiženo. Následná homologní rekombinace do cílového místa upstream k sekvenci, kódující G-CSF, což je nepárované místo sestřihu donoru v konstruktu, je funkčně spárováno s endogenním místem sestřihu akceptoru endogenního exonu z G-CSF. Výsledkem zpracování transkriptů, produkovaného z homologně rekombinovaného G-CSF genu, je sestřih exogenního exonu s místem sestřihu akceptoru endogenního exonu.

Konstrukt podle vynálezu může také zahrnovat místo sestřihu akceptoru. Toto místo, ve spojení s místem sestřihu donoru, řídí sestřih exonu na jiný exon. Místa sestřihu akceptoru mají charakte30 ristickou sekvenci reprezentovanou (Y)₁₀NYAG (SEQ ID číslo 8), kde Y značí jakýkoliv pyrimidin aN značí jakýkoliv nukleotid (Jackson, Nucleic Acids Research 19:3715 až 3798, 1991). Introny

DNA konstrukt může také obsahovat intron. Intron je sekvence jednoho nebo více nukleotidů, ležící mezi místem sestřihu donoru a místem sestřihu akceptoru a je sestřihem z molekuly prekurzoru RNA odstraněn za vzniku zralé mRNA.

CAP místo

DNA konstrukt může také příležitostně obsahovat CAP místo. CAP místo je specifické transkripční startovní místo, které je spojeno s regulační oblastí, která jej využívá. Toto CAP místo je umístěno v takové pozici vůči regulační sekvenci v konstruktu, že po homologní rekombinaci regulační sekvence řídí syntézu transkriptů, která začíná v CAP místě. Příležitostně není v kon45 struktu zahrnuto žádné CAP místo a transkripční aparát bude hledat odpovídající místo v zacíleném genu, které bude využito jako CAP místo.

Další prvky DNA

Konstrukt může někdy obsahovat sekvence, které negativně ovlivňují strukturu nebo stabilitu RNA nebo proteinu, produkovaného homologní rekombinaci.

DNA konstrukt může příležitostně zahrnovat bakteriální počátek replikace a bakteriální značky rezistence vůči antibiotiku nebo jiné selekční značky, které umožňují rozmnožování plasmidu ve

-9CZ 299460 B6 velkém měřítku v bakterii nebo v jakémkoliv jiném hostitelském systému, který je vhodný pro klonování.

Všechny výše popsané prvky DNA konstruktu jsou operativně připojeny nebo funkčně umístěny.

To znamená, že po homologní rekombinaci mezi konstruktem a sledovanou genomickou DNA, může regulační sekvence řídit produkci primárního RNA transkriptu, která začíná v CAP místě (příležitostně zahrnutém v konstruktu) a zahrnuje (i) sekvenci odpovídající exonu a místu sestřihu donoru z konstruktu, jestliže jsou nějaká přítomna, a (ii) sekvenci ležící mezi tímto místem sestřihu donoru a transkripčním stop místem endogenního genu. Druhá zmíněná sekvence může zahr10 novat regulační oblast endogenního G-CSF genu i sekvenci sousedící s touto oblastí, která není běžně přepisována. V operativně připojené konfiguraci řídí místo sestřihu donoru sledovaného konstruktu sestřih k místu sestřihu akceptoru, přesahujícího jeden z exonů endogenního G-CSF genu tak, že žádoucí protein může být produkován ze zcela sestřiženého zralého transkriptu. Místo sestřihu akceptoru může být endogenní, takže sestřih je řízen na endogenní exon. V jiném provedení, kde je místo sestřihu akceptoru zahrnuto ve sledovaném konstruktu, odstraňuje sestřih exogenní intron, začleněný sledovaným konstruktem.

Uspořádání prvků v DNA konstruktu může být různé. Jestliže je konstruktem kružnicový plasmid nebo virový vektor, pak může být vzájemné uspořádání prvků ve vznikající struktuře například:

určující sekvence, plasmidová DNA (složená ze sekvencí použitých pro selekci a/nebo replikaci sledovaného plasmidu v mikrobiálním nebo jiném vhodném hostiteli), selekční značka(y), regulační sekvence, exon, nespárované místo sestřihu donoru.

Jestliže je konstrukt lineární, pak může být uspořádání například: první určující sekvence, selek25 ční značkový gen, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru a druhá určující sekvence; nebo první určující sekvence, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, selekční značkový gen a druhá určující sekvence. Uspořádání prvků může také být: první určující sekvence, selekční značka, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, intron, místo sestřihu akceptoru, příležitostně vnitřní ribozomální vstupní místo a druhá určující sekvence.

Příležitostně může uspořádání být: první určující sekvence, první selekční značkový gen, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, druhá určující sekvence a druhý selekční značkový gen nebo první určující sekvence, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, první selekční značkový gen, druhá určující sekvence a druhý selekční značkový gen. Výsledkem rekombinace mezi určujícími sekvencemi, přesahujícími první selekční značku, s homologními sekvencemi v genomu hostitele je intergrace první selekční značky, zatímco druhá selekční značka integrována není. Žádoucí transfektované nebo infikované buňky jsou takové buňky, které jsou stabilně transfektovány nebo infikovány první, ale nikoliv druhou selekční značkou. Tyto buňky mohou být selektovány během růstu v médiu, které obsahuje činidlo pro selekci exprese první značky ajiné činidlo pro druhou značku. U transfektovaných nebo infikovaných buněk, které mají nevhodně začleněný sledovaný konstrukt mechanismem jiným než je homologní rekombinace, lze očekávat, že budou exprimovat druhý značkový gen a budou tedy v selekčním médiu usmrceny.

Značka pro pozitivní selekci je někdy v konstruktu zahrnuta proto, aby byla umožněna selekce buněk, obsahujících amplifikované kopie této značky. V tomto provedení může být uspořádání složek konstruktu například: první určující sekvence, amplifikační značka pro pozitivní selekci, druhá selekční značka (příležitostná), regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru a druhá určující DNA sekvence.

Různé prvky konstruktu mohou být získány z přirozených zdrojů (např. genomická DNA) nebo mohou být produkovány pomocí genového inženýrství nebo pomocí syntetických technik. Regulační oblast, CAP místo, exon, místo sestřihu donoru, intron a místo sestřihu akceptoru v konstruktu mohou být izolovány jako kompletní jednotka např. z genu lidského elongačního faktoru-10CZ 299460 B6

Ια (Genbank sekvence HUMEF1A) nebo z časné oblasti cytomegaloviru (Genbank sekvence HEHCMVP1). Tyto komponenty mohou být také izolovány z jednotlivých genů.

Transfekce nebo infekce a homologní rekombinace

DNA konstrukt podle vynálezu může být začleněn do buňky jako je primární, sekundární nebo nesmrtelná buňka jako samostatný DNA konstrukt nebo jako DNA sekvence, které jsou začleněny do chromozomální nebo jaderné DNA transfektované nebo infikované buňky. DNA může být začleněna jako lineární dvouvláknová (s nebo bez jednovláknových oblastí na jednom nebo obou koncích), jednovláknová nebo kružnicová molekula. DNA konstrukt nebo jeho RNA ekvivalent mohou být také začleněny jako virová nukleová kyselina.

Jestliže je konstrukt začleněn do hostitelských buněk ve dvou samostatných DNA fragmentech, pak tyto dva fragmenty sdílejí sekvenční homologií DNA (překryv) na 3' konci jednoho frag15 mentu a na 5' konci druhého, zatímco jeden nese první určující sekvenci a druhý nese druhou určující sekvenci. Po začlenění do buňky mohou tyto dva fragmenty podstoupit homologní rekombinaci za vzniku jediné molekuly s první a druhou určující sekvencí, přesahující oblast překryvu mezi dvěma původními fragmenty. Molekula produktu je poté ve formě, která je vhodná pro homologní rekombinaci s cílovými místy buňky. Mohou být použity více než dva fragmenty, přičemž každý z nich je sestrojen tak, aby došlo k homologní rekombinaci jednoho s druhým za vzniku konečného produktu, vhodného pro homologní rekombinaci s cílovými místy buňky, jako je to popsáno výše.

Jestliže DNA konstrukt podle vynálezu sám o sobě neobsahuje selekční značku, může být trans25 fektován nebo infikován spolu s jiným konstruktem, který tuto značku obsahuje. Plasmid může být před transfekci nebo infekcí štěpen na jednom nebo více místech restrikčním enzymem za vzniku lineární molekuly nebo molekuly, obsahující mezery (gapy). Vzniklé volné konce DNA zvyšují frekvenci žádoucích výsledků homologní rekombinace. Na volné DNA konce může být dále působeno exonukleázou, jejíž výsledkem jsou přečnívající 5' nebo 3' konce jednovláknové

DNA (např. délka alespoň 30 nukleotidů a výhodněji délka 100 až 1000 nukleotidů). Důvodem je zvýšit frekvenci žádoucích výsledků homologní rekombinace. V tomto provedení budou výsledkem homologní rekombinace mezi určující sekvencí a genomickým cílem dvě kopie určujících sekvencí, přesahujících prvky, které jsou obsaženy v začleněném plasmidu.

DNA konstrukty mohou být transfektovány do buněk (výhodněji in vitro) pomocí různých fyzikálních a chemických postupů včetně elektroporace, mikroinjektování, bombardování mikroprojektilem, srážení fosforečnanem vápenatým, lipozómového podávání nebo tranfekce prostřednictvím polybren- nebo DEAE -dextranu.

Transfektované nebo infikovaná buňka je udržována v takových podmínkách, které umožňují homologní rekombinaci, jako je to popsáno ve stavu techniky (viz např. Capecchi, Science 24:1288 až 1292, 1989). Pod pojmem „transfektované buňka“ je míněna buňka, do které (nebo do jejíhož předka) byla způsoby jinými než je použití virového vektoru, začleněna molekula DNA. Pod pojmem „infikovaná buňka“ je míněna buňka, do které (nebo do jejíhož předka) byly začleněny molekula DNA nebo RNA použitím virového vektoru. Mezi viry, o kterých je známo, že mohou být použity jako vektory patří adenovirus, virus jemu podobný, Herpes virus, virus příušnic, virus dětské obrny, lentivirus, retrovirus, virus Sindbis a viry neštovic jako je virus kanárských neštovic. Je-li homologně rekombinantní buňka udržována v podmínkách, které jsou dostatečně vhodné pro průběh transkripce DNA, bude regulační oblast, začleněná DNA kon50 struktem, pozměňovat transkripci G-CSF genu.

Homologně rekombinantní buňky (tzn. buňky, které podstoupily žádoucí homologní rekombinaci) mohou být identifikovány testováním a výběrem fenotypu nebo analýzou G-CSF genu v supematantu kultury pomocí enzymoimunoanalýzy (ELISA). Komerčně dostupné soupravy pro

ELISA pro detekci G-CSF genu jsou dostupné od R & D Systems (Minneapolis, MN). Homo- 11 CZ 299460 B6 logně rekombinantní buňky mohou být identifikovány také pomocí Southern nebo Nothem blotů nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

Termín „primární buňky“ ve smyslu, ve kterém jsou zde používány, zahrnuje (i) buňky přítomné v suspenzi buněk, izolovaných z tkáně obratlovců (před jejich rozetřením na misku, tzn. spojené s nosičem tkáňové kultury jako je miska nebo baňka), (ii) buňky přítomné v explantátu tkáňové kultury, (iii) buňky rozetřené poprvé a (iv) buněčné suspenze odvozené z těchto rozetřených buněk. Primární buňky také mohou být buňky, přirozeně se vyskytující u lidí nebo zvířat.

Sekundární buňky jsou takové buňky, které se vyskytují ve všech následujících krocích kultivace. To znamená, když jsou rozetřené primární buňky odstraněny z kultivační nádoby a znovu rozetřeny (pasážovány), jsou zde označeny jako sekundární buňky a stejně tak i všechny buňky v následných pasážích. Kmeny sekundárních buněk obsahují sekundární buňky, které byly jednou nebo vícekrát pasážovány. Sekundární buňky většinou vykazují omezený počet populačních zdvojení v kultuře a kontaktem inhibované, závisle narůstající přilnutí (závislé přilnutí není aplikováno na buňky, které jsou množeny v suspenzní kultuře). Primární a sekundární buňky nejsou učiněny nesmrtelnými.

Nesmrtelné buňky jsou takové buněčné linie (na rozdíl od kmenů buněk, u nichž je označení „kmen“ rezervováno pro primární a sekundární buňky), které vykazují zřetelně neomezenou životnost v kultuře.

Buňky, vybrané pro transfekci nebo infekci, mohou spadat do 4 typů kategorií: (i) získané buňky, které neprodukují nebo neobsahují více než stopová množství G-CSF proteinu, (ii) buňky, které produkují nebo obsahují protein, ale v množstvích jiných než která jsou požadována (jako jsou množství menší než je hladina, která je fyziologicky běžná pro typy získaných buněk), (iii) buňky, které produkují protein v množství, které je fyziologicky běžné pro získaný typ buněk, ale budou množeny nebo bude zvýšen jejich obsah nebo produkce a (iv) buňky, u kterých je žádoucí změnit průběh regulace nebo indukce genu, kódujícího protein.

Primární, sekundární a nesmrtelné buňky, které mají být transfektovány nebo infikovány způsobem, který je předmětem vynálezu, mohou být získány z různých tkání a zahrnují všechny odpovídající typy buněk, které mohou být udržovány v kultuře. Mezi vhodné primární a sekundární buňky patří například fibroblasty, keratinocyty, epitelové buňky (např. epitelové buňky mléčné žlázy, střevní epitelové buňky), endotelové buňky, gliové buňky, neurální buňky, prvky krve (např. lymfocyty, buňky kostní dřeně), svalové buňky a prekurzory těchto somatických buněčných typů. Mají—li být homologně rekombinantní buňky použity v genové terapii, jsou primární buňky získány výhodněji z jedince, jemuž by měly být podávány transfektované nebo infikované primární nebo sekundární buňky. Primární buňky však mohou být získány od dárce (tzn. jedince jiného než je příjemce) stejného druhu.

Mezi příklady nesmrtelných lidských buněčných linií, užitečných pro produkci proteinu nebo pro genovou terapii, patří, ale nejsou tím nijak limitovány, ovariální karcinomové buňky 2780AD (Van der Blick a kol., Cancer Res. 48: 5 927 až 5 932, 1988), A549 (sbírka American Type

Culture Collection („ATCC“) CCL 185), BeWo (ATCC CCL 98), melanomové buňky Bowes (ATCC CRL 9607), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1), COLO201 (ATCC CCL 224), COLO205 (ATCC CCL 222), COLO 320DM (ATCC CCL 220), COLO 320HSR (ATCC CCL 220.1), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), Detroit 562 (ATCC CCL 138), buňky HeLa a jejich deriváty (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), HCT116 (ATCC CCL 247), buňky HL-60 (ATCC CCL 240), buňky HT1080 (ATCC CCL 121), IMR-32 (ATCC CCL 127), buňky Jurkat (ATCC TIB 152), buňky leukémie K-562 (ATCC CCL 243), karcinomové buňky KB (ATCC CCL 17), KG-1 (ATCC CCL 246), KG-la (ATCC CCL 246.1), LS123 (ATCC CCL 255), LS174T (ATCC CCL CL-188), LSI 80 (ATCC CCL CL-187), MCF-7 buňky nádoru prsu (ATCC BTH 22), buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), buňky Namalwa (ATCC CRL 1432),

NCI-H498 (ATCC CCL 254), NCI-H508 (ATCC CCL 253), NCI-H548 (ATCC CCL 249),

- 12CZ 299460 B6

NCI-H716 (ATCC CCL 251), NCI-H747 (ATCC CCL 252), NC1-H1688 (ATCC CCL 257), NCI-H2126 (ATCC CCL 256), buňky Ráji (ATCC CCL 86), RD (ATCC CCL 136), RPMI 2650 (ATCC CCL 30), buňky RPMI 8226 (ATCC CCL 155), SNU-C2A (ATCC CCL 250.1), SNU-C2B (ATCC CCL 250), SW-13 (ATCC CCL 105), SW48 (ATCC CCL 231), SW403 (ATCC CCL 230), SW480 (ATCC CCL 227), SW620 (ATCC CCL 227), SW837 (ATCC CCL 235), SW948 (ATCC CCL 237), SW1116 (ATCC CCL 233), SW1417 (ATCC CCL 238), SW1463 (ATCC CCL 234), T84 (ATCC CCL 248), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), WiDr (ATCC CCL 218) a WI-38VA13 sublinie buněk 2R4 (ATCC CCL 75.1), stejně tak jako heterohybridomové buňky, produkované fúzí lidských buněk a buněk jiných druhů. Kmeny sekundário nich lidských fibroblastů jako je WI-38 (ATCC CCL 75) a MRC-5 (ATCC CCL 171) mohou být rovněž použity. Primární, sekundární nebo nesmrtelné lidské buňky stejně jako primární, sekundární nebo nesmrtelné buňky z jiných druhů mohou být dále použity pro produkci proteinu in vitro nebo pro genovou terapii.

Buňky, exprimující G-CSF

Homologně rekombinantní buňky podle předmětného vynálezu exprimují G-CSF v žádoucích hladinách a jsou užitečné pro produkci G-CSF in vitro i pro genovou terapii.

Genová terapie

Homologně rekombinantní buňky podle předmětného vynálezu jsou užitečné jako populace homologně rekombinantních buněčných linií, jako populace homologně rekombinantních primárních nebo sekundárních buněk, jako homologně rekombinantní klonovací kmeny nebo linie buněk, jako homologně rekombinantní heterogenní buněčné kmeny nebo linie a jako směsi buněk, ve kterých je přítomna alespoň jedna reprezentativní buňka jedné ze čtyř výše uvedených kategorií homologně rekombinantních buněk. Tyto buňky mohou být použity při dodávání za účelem stimulace rozmnožování a diferenciace hematopoietických progenitorových buněk nebo jiného stavu, který lze léčit pomocí G-CSF. Buňky mohou být použity například pro prevenci neutropenie, vyvolané chemoterapií, pro léčbu pacientů, kteří podstupují nebo podstoupili transplantaci kostní dřeně nebo pro léčbu chronických idiopatických a vrozených neutropenických onemocnění.

Homologně rekombinantní primární buňky, klonovací kmeny buněk nebo heterogenní buněčné kmeny jsou podávány jedincům, u nichž je léčen abnormální nebo nežádoucí stav nebo je u nich prováděna prevence, a to v dostatečném množství a odpovídajícím způsobem. Cílem je exprimovat nebo učinit dostupným protein nebo exogenní DNA ve fyziologicky odpovídajících hladinách. Fyziologicky odpovídající hladina je taková, která je přibližně stejná jako hladina, při které je produkt v těle běžně produkován nebo vede ke zlepšení abnormálního nebo nežádoucího stavu.

Jsou-li buňky syngenní s ohledem na imunokompetentního příjemce, mohou být podávány nebo implantovány intravenózně, intraarteriálně, podkožně, intraperitoneálně, intraomentálně, prostřednictvím subrenální kapsule, intratekálně, intrakraniálně nebo intramuskulámě.

Jestliže buňky nejsou syngenní a příjemce je imunokompetentní, mohou být homologně rekombi45 nantní buňky, které mají být podávány, uzavřeny do jedné nebo více semipermeabilních bariérových forem. Vlastnosti, související s permeabilitou prostředku, jsou takové, že buňky po implantování do subjektu nemohou opustit prostředek, ale terapeutický protein může volně procházet a může opustit bariérový prostředek a vstoupit do místa, obklopujícího implant nebo může vstoupit do systemického oběhu. Toto je uvedeno např. v patentu US 5 641 670, US 5 470 731,

US 5 620 883, US 5 487 737 a US patentové přihlášce s názvem „Delivery of Therapeutic Proteins“ (autoři vynálezu: Justin C. Lamsa a Douglas A. Treco), podané 16. dubna 1999, přičemž všechny jsou zde začleněny jako odkaz. Bariérový prostředek může být implantován v jakémkoliv odpovídajícím místě: např. intraperitoneálně, intratekálně, podkožně, intramuskulámě, v ledvinové kapsuli nebo omentu.

- 13CZ 299460 B6

Bariérové prostředky jsou konkrétně užitečné a umožňují, aby byly implantovány homologně rekombinantní nesmrtelné buňky, homologně rekombinantní buňky z jiných druhů (homologně rekombinantní xenogeneické buňky) nebo buňky z nehistokompatibilního dárce (homologně rekombinantní allogeneické buňky) s cílem léčit daný subjekt. Prostředky zadržují buňky ve fixní pozici in vivo, čímž chrání buňky od imunitního systému hostitele. Bariérové prostředky také umožňují odpovídající krátkodobou (tzn. přechodnou) terapii a to proto, že umožňují správné odstranění buněk, jestliže je léčba z jakéhokoliv důvodu zastavena. Transfektované nebo infikované xenogeneické a allogeneické buňky mohou také být pro krátkodobou genovou terapii použity bez bariérového prostředku. V tomto případě bude dodáván G-CSF, produkovaný buňkami, in vivo do té doby, dokud budou buňky hostitelským imunitním systémem odmítány.

Pro tyto účely může být použita řada syntetických, polosyntetických nebo přírodních filtračních membrán včetně celulózy, acetátu celulózy, nitrocelulózy, polysulfonu, difluoridu polyvinylidenu, polymerů polyvinylchloridu a polymerů polyvinylchloridových derivátů. Bariérové prostřed15 ky mohou být využity k tomu, aby mohly být pro genovou terapii u lidí použity primární, sekundární nebo nesmrtelné buňky z jiných druhů.

Jiná provedení

Mělo by být zřejmé, že ačkoliv byl vynález popsán pomocí podrobnějšího popisu, je tento popis zamýšlen jako ilustrativní a nijak neomezuje rozsah vynálezu, který je definován rozsahem připojených nároků.

Jiné aspekty, výhody a modifikace jsou v rámci rozsahu následujících nároků.

Přehled obrázků ve výkresech

Obr. 1 je schematické znázornění ukazující genomickou strukturu lidského G-CSF genu.

Obr. 2 je schematické znázornění ukazující genomické oblasti lidského G-CSF obklopené inzerty plasmidů pHGCSFl a PHGCSF4.

Obr. 3 reprezentuje částečnou sekvenci (SEQ ID číslo 1) lidského G-CSF genu včetně 6578 nukleotidů ze sekvence 5' k iniciačnímu kodonu ATG. Rovněž je ukázána částečná polypeptidová sekvence (SEQ ID číslo 2), kódovaná kódující sekvencí. Sekvence pocházející ze spojení genomického inzertu a raménka fága v klonu G-CSF/3, jsou podtrženy.

Obr. 4 je schematické znázornění ukazující konstrukt podle vynálezu. Konstrukt obsahuje první určující sekvenci (1); amplifikační značkový gen (AM); selekční značkový gen (SM); regulační sekvenci; CAP místo; exon, kódující část signálního peptidu G-CSF; nepárované místo sestřihu donoru (SD) a druhou určující sekvenci (2). Černé bloky představují kódující DNA a tečkované bloky představují přepsané, ale nepřeložené sekvence.

Obr. 5 znázorňuje SEQ ID číslo 5, genomickou sekvenci upstream k lidskému transkripčnímu startovnímu místu lidského G-CSF.

Obr. 6 je znázornění první určující sekvence (SEQ ID číslo 6), použité v konstruktu podle vynálezu.

Obr. 7 je znázornění druhé určující sekvence (SEQ ID číslo 7), použité v konstruktu podle vynálezu.

- 14CZ 299460 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Produkce proteinu

Homologně rekombinantní buňky podle předmětného vynálezu mohou být použity pro produkci G-CSF in vitro. Buňky jsou udržovány v takových podmínkách, které jsou popsány ve stavu ío techniky a jejichž výsledkem je exprese proteinů. G-CSF protein může být přečištěn z buněčných lyzátů nebo z buněčných supematantů. Farmaceutický prostředek, obsahující G-CSF protein, může být dodán člověku nebo zvířeti prostřednictvím vhodných farmaceutických cest, známých v dané oblasti techniky (např. orálně, intravenózně, intramuskulámě, intranazálně, pulmonálně, transmukozálně, intradermálně, transdermálně, rektálně, intratekálně, podkožně, intraperitonálně nebo intralesionálně). Orální podávání může vyžadovat použití strategie pro ochranu proteinu před degradací v trávicím traktu: např. enkapsulace v polymemích mikrokapsulích.

Příklad 2

Jiným typem prostředku, který může být použit v genové terapii podle vynálezu, je kolagenová matrice, kterou lze implantovat a ve které jsou zabudovány buňky. Tento prostředek, který může obsahovat kuličky, na které se buňky přichytí, je popsán v WO 97/15 195, který je zde zahrnut jako odkaz.

Počet buněk potřebných pro podávanou dávku nebo implantaci závisí na několika faktorech včetně hladiny exprese proteinu, velikosti a podmínkách hostitelského organismu a na omezeních, souvisejících s postupem implantování. Obvykle se počet buněk, implantovaných do dospělého člověka nebo podobně velkého jedince, pohybuje v rozmezí 1.10⁴ až 5.10¹⁰ a výhodněji 1.10⁸ až

1.10⁹. V případě potřeby mohou být implantovány v několika místech pacienta buď v jednom okamžiku, nebo v průběhu období měsíců nebo let. Dávka může být v případě potřeby opakována.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. DNA konstrukt, který pozměňuje po začlenění do genomu savčí buňky prostřednictvím homologní rekombinace expresi endogenního G-CSF genu v buňce, obsahuje: (i) určující sekvenci, obsahující alespoň 20 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 a (ii) transkripční regulační sekvenci.

ío
2. DNA konstrukt podle nároku 1, který dále obsahuje exon a místo sestřihu donoru.
3. DNA konstrukt podle nároku 2, který v pozici downstream k místu sestřihu donoru dále obsahuje intron a místo sestřihu akceptoru.

15
4. DNA konstrukt podle nároku 1, který dále obsahuje selekční značkový gen.
5. DNA konstrukt podle nároku 1, ve kterém určující sekvence obsahuje alespoň 50 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5.

20
6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která obsahuje alespoň 100 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement, přičemž izolovaná nukleová kyselina nekóduje celý G-CSF.
7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která obsahuje alespoň 200 bezpro25 středně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která obsahuje alespoň 500 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.

30
9. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která obsahuje nukleotidy 1470 až

4723 ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
10. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která obsahuje SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
11. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec, který obsahuje nukleotidovou sekvenci (i) jejíž délka je alespoň 1000 nukleotidů a (ii) vykazuje alespoň 80% sekvenční totožnost s fragmentem SEQ ID číslo 5, který má stejnou délku jako nukleotidová sekvence.

40
12. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 1, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k iniciačnímu kodonu ATG sekvence, kódující endogenní G-CSF.
13. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 2,

45 přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k iniciačnímu kodonu ATG sekvence, kódující endogenní G-CSF.
14. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 3, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k ini50 ciačnímu kodonu ATG sekvence, kódující endogenní G-CSF.
15. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 4, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k iniciačnímu kodonu ATG sekvence, kódující endogenní G-CSF.