KR100379356B1 - 상동재조합을달성하기위한dna구성물및이것의용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열: (c) 엑손; 및 (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하는 구성물에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기에서 설명된 바와 같이 세포내의 구성물의 동종 재조합을 포함하며 시험관내 또는 생체내 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 그리고 나서 동종 재조합 세포는 전사 및 번역을 일어나게 하는 조건하에서 유지되고, 단백질 발현을 얻는다. 추가로 본 발명은 일차, 이차, 또는 불멸화된 척추 동물 세포를 포함하는 동종 재조합 세포, 이러한 세포들을 제조하는 방법, 동종 재조합에 의해 융합 유전자를 생성하는 방법, 세포안에서 유전자 발현을 변화시키는 방법, 및 본 발명의 구성물을 사용하는 세포안에서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

상동재조합을 달성하기 위한 DNA 구성물 및 이것의 용도
치료용 단백질의 투여에 의하여 질병을 치료하기 위한 현재의 방법은 종래의 약제학적 전달(예컨대, 정맥내, 피하, 또는 근내 주사)을 위한 치료용 단백질의 시험관내 생성 및 보다 최근에는 유전자 치료법을 포함한다.
치료적으로 관심이 있는 단백질들은 일반적으로 치료적 관심의 단백질을 코딩하는 외인성 DNA를 적절한 세포안으로 도입시킴으로써 생성된다, 예를 들어, 원하는 치료용 단백질을 코딩하는 외인성 DNA는 코딩된 단백질이 발현되는 플라스미드와 같은 벡터에서 불멸화된 세포와 같은 세포안으로 도입된다. 추가로, 내인성 세포 유전자 및 이것들의 발현이 유전자 표적화에 의해 변형될 수 있는 것이 제안되어 오고 있다. 예를 들어 미국 특허 5,272,071 호, WO 91/06666 호, WO 91/06667호 및 WO 90/11354호를 참조한다.
유전자 치료법에 대한 현재 활용가능한 접근법들은 발현될 유전물질을 포함하는, 예컨대 레트로바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터를 이용하는 것이다. 상기 접근법들은 벡터가 제조되는 동안 복제-경합 바이러스가 생성될 가능성: 신규한 세포 특이성, 숙주 범위, 또는 증가된 병원성 및 세포 독성을 가지는 감염성 병원체를 잠재적으로 생성할, 치료용 바이러스와 내인성 레트로바이러스 게놈 사이의 재조합; 대다수의 세포안으로의 독립적인 통합으로 야기되는 종양 발생적인 삽입 과정의 위험의 증가; 레트로바이러스내에서의 제한된 클로닝 능력(이것은 치료 적응성을 제한한다); 및 목적하는 생성물의 단기적인 생체내 발현이라는 한계점들을 갖는다. 유전자 생성물을 제공하기 위한 보다 좋은 접근법, 특히 현재 활용가능한 방법들과 관련된 한계 및 위험을 피하는 방법이 가치있을 것이다.
본 발명은 치료용 단백질의 시험관내 생성 및 유전자 치료법에 의한 치료용 단백질의 생성 및 전달을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
도 1은 굵은 선, 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터; 스팁플된 박스, hGH의 5' 번역되지 않은 영역; 솔리드 박스, hGH 엑손 1; 빗금친 박스, hEPO 인트론 1으로부터의 10 bp 스플라이스-도너 서열; 직교 빗금친 박스, hEPO의 5' 번역되지 않은 영역; 빈 속의 숫자를 매긴 박스, hEPO 코딩 서열; 사선으로 빗금친 박스, hEPO의 3' 번역되지 않은 서열; HIII, HindIII 부위를 포함하는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2는 굵은 선, 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터; 스팁플된 박스, hGH의 5' 번역되지 않은 영역; 솔리드 박스, hGH 엑손 1; 빈 속의 숫자를 매긴 박스, hEPO 코딩 서열; 사선으로 빗금친 박스, hEPO의 3' 번역되지 않은 서열; HIII,HindIII 부위를 포함하는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 3은 마우스 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에서 hGH 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pXGH5를 나타내는 개략도이다.
도 4는 플라스미드 pE3neoEPO를 나타내는 개략도이다. 사람 에리트로포이에틴 유전자 및 네오미신 포스포 트랜스퍼라제 유전자(neo) 및 암피실린(amp) 내성 유전자들의 위치가 표시되어 있다. 화살표는 다양한 유전자들의 전사방향을 나타낸다. pmMT1은 마우스 메탈로티오네인 프로모터(hEPO 발현을 가동시킴)를 나타내고 pTK는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터(neo 발현을 가동시킴)를 나타낸다. 지도의 점선 영역들은 사람 히폭산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT) 서열의 위치들을 나타낸다. 제한 엔도누클레아제 인지 부위들의 상대적인 위치가 표시되어 있다.
도 5는 플라스미드 pcD의 BamHI 부위안에 삽입된 네오 코딩 영역(BamHI-Bg1II 단편) ; pBR322로부터의 Amp-R 및 PBR322Ori 서열 ; 및 SV40 으로부터의 16S 스플라이스 결합부 및 초기 프로모터 영역을 포함하는 플라스미드 pcDNEO를 나타내는 개략도이다.
도 6은 플라스미드 pREPO4를 나타내는 개략도이다.
도 7은 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4μM의 메토트렉세이트에서 단계적인 선택이 수행된 표적화된 사람 세포 라인에서의 에리트로포이에틴 발현을 나타내는 그래프이다.
도 8은 플라스미드 pREPO15를 나타내는 개략도이다. 게놈성 hEPO 서열로부터 유도된 단편은 채워진 박스로 나타낸다. BamHI(3537) 및 BgIII'/HindIII' 사이의 영역은 겐방크(Genbank) 엔트리 HUMERPALU에서 위치 1-4008에서의 서열에 상응한다. BgIII'/HindIII'(11463) 사이의 영역은 겐방크(Genbank) 엔트리 HUMERPALU에서 위치 4009-5169에서의 DNA 서열에 상응한다. HindIII(11463) 및 XhoI(624) 사이의 영역은 진뱅크(Genbank) 엔트리 HUMERPA에서 위치 7-624 에 상응하는 서열을 함유한다. CMV 프로모터 서열은 빈 박스로서 도시하고 진뱅크 서열 HS5MIEP의 뉴클레오티드 546-2105로부터의 서열을 함유한다. neo 유전자는 화살표를 가지는 빈 박스로 도시한다. neo 유전자를 가동시키는 티미딘 키나아제(tk) 프로모터는 교차선을 그은 박스로 도시한다. amp 유전자를 포함하는 pBSIISK+ 서열은 얇은 선으로 도시한다.
도 9A는 제한 효소 지도가 포함되고 pREPO15(하부)로부터의 표적화 단편으로 상동 재조합한 후에 내인성 hEPO 유전자(상부) 및 활성화된 hEPO 유전자가 분해됨에 따라 관찰되는 생성물의 개략적 표현이다.
도 9B는 제한 효소 분해 및 치료되지 않고(HF) 표적화된(T1) 사람 섬유아세포 클론 HF342-15의 서던(Southern) 혼성화 분석의 결과를 나타낸다(실시예 7 참조).
도 10은 플라스미드 pREPO18을 나타내는 개략도이다. 게놈성 hEFO 서열로부터 유도된 단편은 채워진 박스로 도시한다. BamHI(3537) 및 ClaI(7554) 사이의 영역은 진뱅크(Genbank) 엔트리 HUMERPALU에서 위치 1-4008에서의 서열에 상응한다.ATG(12246) 및 HindIII(13426) 사이의 영역은 진뱅크(Genbank) 엔트리 HUMERPALU에서 위치 4009-5169에서의 DNA 서열에 상응한다. HindIII(13426) 및 XhoI(624) 사이의 영역은 진뱅크(Genbank) 엔트리 HUMERPA에서 위치 7-624에 상응하는 서열을 함유한다. CMV 프로모터 서열은 빈 박스로서 도시하고 진뱅크 서열 HS5MIEP의 뉴클레오티드 546-2015로부터의 서열을 함유한다. 디히드로폴레이트리덕타제(dhfr) 전사 유니트는 화살표를 가지는 스티플된 박스로서 도시한다. neo 유전자는 화살표를 가지는 빈 박스로 도시한다. neo 유전자를 가동시키는 티미딘 키나아제(tk) 프로모터는 교차선을 그은 박스로 도시한다. amp 유전자를 포함하는 pBSIISK+ 서열은 얇은 선으로 도시한다.
도 11은 제 1 표적화 서열(1), 증폭될 수 있는 마아커 유전자(AM), 선택성 마아커 유전자(SM), 조절 서열, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위(SD), 인트론(얇은 선), 스플라이스-억셉터 부위(SA) 및 제 2 표적화 서열(2)를 포함하며, 인트론 없이 유전자, α-인터페론 유전자를 활성화시키고 증폭시키기 위한 본 발명의 구성물을 예시하는 개략도이다. 블랙 박스는 코딩한 DNA를 나타내고, 스티플된 박스는 번역되지 않은 서열을 나타낸다.
도 12는 제 1 표적화 서열(1), 증폭될 수 있는 마아커 유전자(AM), 선택성 마아커 유전자(SM), 조절 서열, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위(SD), 및 제 2 표적화 서열(2)를 포함하며, 제 1 엑손이 시그널 펩티드에 기여하는 내인성 유전자를 활성화시키고 증폭시키기 위한 본 발명의 구성물을 예시하는 개략도이다. 블랙 박스는 코딩한 DNA를 나타내고, 스티플된 박스는 번역되지 않은 서열을 나타낸다.
도 13은 제 1 표적화 서열(1), 증폭될 수 있는 마아커 유전자(AM), 선택성 마아커 유전자(SM), 조절 서열, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위(SD), 및 제 2 표적화 서열(2)를 포함하며, 제 1 엑손이 시그널 펩티드에 기여하는 내인성 유전자를 활성화시키고 증폭시키기 위한 본 발명의 구성물을 예시하는 개략도이다. 검은 박스는 코딩한 DNA를 나타내고, 스티플된 박스는 번역되지 않은 서열을 나타낸다.
도 14은 제 1 표적화 서열(1), 증폭될 수 있는 마아커 유전자(AM), 선택성 마아커 유전자(SM), 조절 서열, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위(SD), 및 제 2 표적화 서열(2)를 포함하며, 제 1 엑손이 시그널 펩티드에 기여하는 내인성 유전자를 활성화시키고 증폭시키기 위한 본 발명의 구성물을 예시하는 개략도이다. 블랙 박스는 코딩한 DNA를 나타내고, 스티플된 박스는 번역되지 않은 서열을 나타낸다.
본 발명은 치료용 단백질의 시험관내 생성 및 유전자 치료법에 의한 치료용 단백질의 생성 및 전달을 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서, 세포안에서의 원하는 표적화된 유전자 (즉, 원하는 내인성 세포 유전자)의 발현은 적어도 조절 서열, 엑손 및 스플라이스 도너 부위를 포함하는 DNA를 예정된 부위에서의 세포 유전자내로의 도입, 상동 재조합에 의해 변화된다. 이들 성분들은 새로운 전사 유니트 (DNA 구성물에 존재하는 조절 서열, 엑손 및 스플라이스 도너 부위가 내인성 유전자에 효과적으로 링크되는 전사 유니트)를 생성시킬 수 있는 방식으로 염색체(유전자) DNA 내로 도입된다, 염색체 DNA 내로 상기 성분들을 도입시킨 결과로서, 원하는 내인성 유전자의 발현이 변화된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 변화된 유전자 발현은 얻어진 세포안에 정상적으로 잠복하는 (발현되지 않은) 유전자를 활성화시키는 단계 (또는 발현시키는 단계), 수득된 세포안에서 생리학적으로 상당한 수준으로 발현되지 않은 유전자의발현을 증가시키는 단계, 수득된 세포안에서 일어나는 것과 상이하도록 조절 또는 유도의 패턴을 변화시키는 단계, 및 수득된 세포안에서 발현되는 유전자의 발현을 감소시키는 단계 (제거시키는 단계 포함)를 포함한다.
추가로 본 발명은 표적 유전자의 발현을 변화시키는 방법에 유용한 DNA구성물에 관한 것이다. 이러한 DNA 구성물은 (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함한다. 상기 DNA 구성물에서 표적화 서열은 세포안에서 표적 유전자내로 상기 성분 (a) 내지 (d)의 통합을 유도하여 성분 (b) 내지 (d)가 내인성 표적 유전자의 서열에 효과적으로 링크된다. 다른 구체예에서, DNA 구성물은 (a) 표적화 서열, (b) 조절 서열; (c) 엑손; (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위; (e) 인트론, 및 (f) 스플라이스-억셉터 부위를 포함하고, 상기 표적화 서열은 성분 (a) 내지 (f)의 통합을 유도하여 성분 (b) 내지 (f)가 내인성 유전자에 효과적으로 링크된다. 표적화 서열은 상동 재조합이 일어나는 세포 염색체 DNA 안에서 예정된 부위와 상동이다. 상기 구성물에서, 일반적으로 엑손은 조절 서열의 3'이고, 스플라이스 도너 부위는 엑손의 3'이다.
하기에서는 본 발명의 2가지 구체예를 예시하고, 사람 에리트로포이에틴h(EPO) 유전자 서열의 상류가 얻어진 형질전환되지 않은 상태에서 감지될 수 있는 양으로 EPO를 발현시키지 않는 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에서 hEPO를 발현시키도록 변화된다. 구체예 1에서, 표적화 구성물은 2가지 표적화 서열을 함유한다. 제 1 표적화 서열은 제 2 표적화 서열의 서열 5'와 상동이고, 상기 2 서열 모두 hEPO 코딩 영역의 상류이다. 또한 표적화 구성물은 조절 영역(mMT-1 프로모터), 엑손 [사람 성장 호르몬 (hGH) 엑손 1] 및 쌍을 이루치 않은 스플라이스-도너 부위를 함유한다. 이러한 표적화 구성물을 갖는 상동 재조합의 생성물은 도 1에 도시되어 있다.
구체예 2에서, 표적화 구성물은 2가지 표적화 서열을 또한 함유한다. 제 1 표적화 서열은 내인성 hEPO 조절 영역내의 서열에 상동이고, 제 2 표적화 서열은 hEPO 인트론 1과 상동이다. 또한 표적화 구성물은 조절 영역 (mMT-1 프로모터), 엑손 (hGH 엑손 1) 및 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 함유한다. 이러한 표적화 구성물을 갖는 상동 재조합 생성물이 도 2에 도시되어 있다.
상기 2가지 구체예에서, 표적화 과정의 생성물은 hGH 유전자의 제 1 엑손이 hEPO 엑손 2-5의 상류에 위치되는 성숙 mRNA를 발생시키는 키메라 전사 유니트이다. 전사, 스플라이스, 및 번역의 생성물은 hEPO 시그널 펩티드의 아미노산 1-4가 hGH의 아미노산 잔기 1-3에 의해 치환된 단백질이다. 상기 2가지 구체예는 삽입되는 표적화 구성물의 조절 서열의 상대 위치 및 최종으로 처리되는 전사물을 제조하는데 필요한 스플라이싱의 특정 패턴의 2가지 면에서 다르다.
추가로 본 발명은 상동 재조합에 의한 숙주 세포 염색체 DNA내로 상기 설명된 구성물의 도입을 통해시험관내또는생체내단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 다음, 상동 재조합 세포는 전사, 번역 및 분비를 일어나게 하는 조건하에서 유지되어 목적하는 단백질을 생성한다.
본 발명은 단백질, 특히 치료용 단백질을 생성하기에 유용한 형질전환된 일차 또는 이차 세포 (즉, 불멸화되지 않은 세포) 및 형질전환된 불멸화된 세포와 같은 세포,시험관내단백질 제조를 위한 이러한 세포들의 사용 방법 및 유전자 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포들은 척추동물, 구체적으로 포유동물로부터 유래되며, 보다 구체적으로는 사람으로부터 유래되기도 한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포들은 치료 생성물을 코딩하는 DNA, 그 자체가 치료 생성물인 DNA 및/또는 형질전환된 세포들이 더 높은 수준으로 또는 상응하는 형질전환되지 않은 세포에서 일어나는 것과 다른 조절 또는 유도패턴을 가지는 유전자를 발현하도록 하는 DNA를 함유한다.
본 발명은 또한 일차, 이차, 및 불멸화된 세포와 같은 세포가 외인성 유전물질을 포함하도록 형질전환시키는 방법, 클론성 세포주 또는 이종성 세포주를 제조하는 방법, 및 동물을 면역시키거나 또는 형질전환된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포들을 사용하여 면역된 동물에서 항체를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 균류, 식물 또는 동물 예컨대, 척추동물, 구체적으로 포유동물, 및 더욱 구체적으로 사람 기원의 세포와 같은 진핵 세포에서 유전자를 표적화하거나 또는 상동 재조합하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 척추동물 기원의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포안에 상동 재조합을 통해 DNA가 예정된 부위에서 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포들의 게놈 DNA 안에 도입되도록 DNA를 도입시키는 방법에 관한 것이다. 사용되는 표적화 서열은 표적화 DNA 구성물내의 DNA 가 삽입될 부위에 의해 결정된다. 추가로 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된, 상동 재조합체 (HR) 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들로서 언급되는 상동 제조합체 일차, 이차 또는 불멸화된 세포 및 HR 일차, 이차 또는 불멸화 세포의 사용에 관한것이다.
유전자의 발현이 변화되는 본 발명의 일 구체예에서, 유전자는 활성화된다. 즉, 척추동물 기원의 일차, 이차 또는 불멸화된 세포에 존재하며, 정상적으로 얻어지는 세포에서 발현되지 않는 유전자가 활성화되고, 결과로서 코딩된 단백질이 발현된다. 상기 구체예에서, 상동 재조합은 상응하는 형질전환되지 않은 세포에서 명백한 것보다 더 높은 수준으로 유전자가 발현되는 것을 유발하는 조절 서열의 삽입을 통해 얻어지는 세포내의 유전자와 정상적으로 결합된 조절영역을 대체하거나, 무능화시키거나, 또는 분열시키기 위해 사용된다.
일 구체예에서, 활성화된 유전자는 추가로 선택가능한 마아커 유전자를 증폭된 복사수만큼 함유하고 있는 세포들이, 이 세포들을 적절한 선택성 제제의 존재하에서 배양시킴에 의해 선택될 수 있는 성질을 가지는 선택가능한 마아커 유전자를 포함시킴에 의해 증폭될 수 있다. 활성화된 내인성 유전자는 증폭된 선택가능한 마아커 유전자와 연관되어 증폭된다. 활성화된 내인성 유전자의 많은 복사체를 함유하는 세포들은시험관내단백질 생성 및 유전자 치료법에 유용하다.
본 발명에 기재되는 바와 같은 유전자 표적화 및 증폭은, 단리 및 발현이 어려울 정도로 충분히 큰 전사 단위체를 형성하는 유전자의 발현을 활성화시키기에, 또는 그것에 대한 완전한 단백질 코딩영역이 사용될 수 없거나 또는 클론되어 있지않은 유전자들을 활성화시키는데 특히 유용하다.
추가 구체예에서, 수득된 세포내에서 발현되는 유전자의 발현은 증가되거나 또는 상응하는 형질전환되지 않은 세포내에서 분명하게 상이한 조절 또는 유도의패턴을 제시하도록 유발된다. 다른 구체예에서, 수득된 세포안에서 발현되는 유전자의 발현은 감소된다 (즉, 줄어들거나 또는 제거된다). 본 발명은 또한 상동 재조합이 유전자를시험관내단백질 제조를 위해 효모 또는 박테리아내로 전달시키기 위하여, 인트론이 없는 cDNA 복사체로 전환시키기 위해 사용되는 방법을 기술한다.
본 발명의 형질전환된 세포들은 사람 및 동물에서 다양한 적용에 유용하다. 일 구체예에서, 세포들은 사람 또는 동물에서의 단백질 전달을 위해 사람 또는 동물에 이식될 수 있다. 예를 들며, hGH, hEPO, 사람 인슬리노트로핀 및 다른 단백질은 치료를 목적으로 사람에게 전신적으로 또는 국소적으로 전달될 수 있다. 부가적으로, 비-사람 기원의 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 인슐리노트로핀 및 다른 단백질을 생성하는 형질전환된 비사람 세포가 생성될 수 있다.
치료 생성물을 발현하는 형질전환된 세포들을 함유하고, 그것을 통해 치료 생성물이 자유롭게 투과될 수 있는 장벽장치가, 생체내의 고정된 위치에서 세포들을 보유하기 위해 또는 숙주의 면역 시스템으로부터 세포들을 보호하고 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 장벽장치는 특히 유용하고 형질전환된 불멸화된 세포, 형질전환 이종 세포, 또는 형질전환된 동종이형 세포가 사람 또는 동물 질환의 치료를 위해 또는 농업적인 용도 (예컨대, 유제품 생산을 위한 소 성장 호르몬)를 위해 이식되는 것을 가능하게 한다. 장벽장치는 또는 치료처방이 어떠한 이유로 중단되어야 할 때 제거를 위한 세포에 대한 용이한 접근법을 제공함으로써 편리한 단기간(즉, 일시적인) 치료법을 가능하게 한다. 또한, 형질전환된 이종 및 동종 세포들은 장벽장치 없이 단기간 유전자 치료법에 사용되며, 그 결과 세포에 의해 생성된 유전자 생성물은 세포들이 숙주의 면역 시스템에 의해 거부될 때까지생체내로 전달될 것이다.
본 발명의 형질전환된 세포들은 또한 항체 생성을 유도하거나 병원체에 대하여 사람 및 동물을 면역시키는데 유용하다. 이식된 형질전환된 세포들은 숙주의 세포성 및 체액성 면역 반응의 자극을 유발하는 면역화 항원들을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들 면역 반응은 미래의 감염성 병원체로부터 숙주를 보호하기 위해 (즉, 백신처리를 위해), 진행중인 감염에 대해 특정된 질병에 대항하여 싸우는 능력을 자극하고 불러 일으키기 위하여, 또는 치료 또는 진단 목적에 유용할 수 있는 형질전환된 세포들에 의해생체내생성된 항원에 대해 유도된 항체들을 생성시키기 위하여 디자인될 수 있다. 상기 세포들을 함유하는 제거가능한 장벽장치들은 항원에 대한 노출을 종결시키기는 간단한 수단을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다. 또는 달리, 궁극적으로는 거부될 세포들 (이종 또는 동종 형질전환된 세포들)을 사용하는 것은 항원에 대한 노출을 제한하기 위해 사용될 수 있다. 왜냐하면 세포가 거부될 때 항원생성이 정지될 것이기 때문이다.
본 발명의 방법들은 그것들에만 제한된 것은 아니지만, 호르몬, 사이토킨, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구성물 단백질, 전사 인자들, 리보자임 또는 안티-센서 RNA 를 포함하여 광범위한 치료적으로 유용한 생성물들을 생성하는 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법들은 치료 생성물의 시험관내 제조 또는 유전자 치료법에 유용한 자연적으로 발생하지 않는 리보자임, 단백질, 또는 핵산들을 생성하는 세포들을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 세포안에서 관심의 내인성 유전자의 조절 또는 활성이 상동 재조합을 통해, 예정된 부위에서, 세포 게놈내로의 삽입에 의해 변화될 수 있고, DNA 구성물은 (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하며, 상기 DNA 구성물에서 표적화 서열이 세포안에서 상기 성분 (a) 내지 (d)의 통합을 유도하여 성분 (b) 내지 (d)가 내인성 유전자에 효과적으로 링크되는 발견에 기초로 한다. 또다른 구체예에서, DNA 구성물은 (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손; (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위; (e) 인트론, 및 (f) 스플라이스-억셉터 부위를 포함하고, 상기 표적화 서열은 성분 (a) 내지 (f)의 통합을 유도하여 성분 (b) 내지 (f)가 내인성 유전자의 제 1 엑손에 효과적으로 링크된다. 사용된 표적화 서열은 DNA가 삽입될 부위에 의해 결정된다. 2가지 구체예에서 표적화 과정은 표적화 DNA 구성물 및 내인성 세포 유전자에 의해 도입되는 융합 단백질의 서열인 새로운 전사 유니트를 발생시키는데 사용된다. 예를 들어 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 새로운 전사 유니트의 형성은 전사적으로 잠복하고 있는 유전자(형질전환 이전에 세포안에서 발현되긴 않은 유전자)를 본 발명의 숙주 세포 게놈 DNA 구성물내로 도입시킴으로써 숙주 세포안에서 활성화되게 한다. 또한 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 얻어지는 세포안에서 발현되는 내인성 유전자의 발현은 변화될 수 있어 증가되거나, 제거되는 것을 포함하여 감소되거나, 또는 조절 또는 유도의 패턴이 본 발명의 방법 및 DNA 구성물의 사용을 통해 변화될 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이 본 발명은 균류, 식물 또는 동물 예컨대, 척추동물, 구체적으로 포유동물, 및 더욱 구체적으로 사람 기원의 세포와 같은 진핵 세포에서 유전자 또는 DNA를 표적화하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 척추동물 기원의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포안에 상동 재조합 또는 DNA의 표적화를 통해 DNA가 예정된 부위에서 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포들의 게놈 DNA 안에 도입되도록 DNA를 도입시키는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 내인성 유전자의 전사 및/또는 번역 생성물이 표적화 서열, 조절 서열, 엑손 및 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물의 사용을 통해 변형되는 상동 재조합에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 본 발명에 의해 생성되는 상동 재조합 세포 및 상동 재조합 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 척추동물 기원의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에는 존재하지만, 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 유전자를 활성화시키는 방법에도 관련된다. 상동 재조합하거나 또는 표적화하는 방법은 유전자가 수용체 세포안에서 발현되게 하는 세포의 게놈 서열내로 도입시키기 위해 사용된다. 추가 구체예에서, 세포안에서 유전자의 발현은 증가되거나 또는 유전자의 조절 또는 도입의 패턴이 DNA 구성물의 도입을 통해 변화된다. 결과로서, 코딩된 생성물은 상응하는 형질전환되지 않은 세포안에서 명백하게 나타나는 것보다 더 높은 수준으로 발현된다. 또한 본 발명의 방법 및 DNA 구성물은 원하는 생성물의 발현이 상응하는 형질전환되지 않은 세포안에서보다 형질전환된 세포안에서 더 적은 세포를 생성하는데 유용하다. 즉, 수득된 세포에서 보다 형질전환된 세포에서, 보다 더 적은 단백질(단백질이 없는 것을 포함)이 생성된다.
또다른 구체예에서, 원하는 생성물을 코딩하는 정상적으로 잠복하고 있는 유전자가 형질전환된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에서 활성화되고 증폭된다. 이러한 구체예는 게놈 DNA, DNA 서열과의 상동 재조합에 의하여 내인성 유전자와 정상적으로 기능적으로 결합되지 못하고 (1) 내인성 유전자에 또는 그 가까이에서 숙주 게놈에 삽입되는 경우 내인성 유전자의 발현을 변경(즉, 활성화)시키는 작용을 하며, 나아가 (2) 활성화된 내인성 유전자가 증폭되는 세포의 선택을 가능하게 하는 DNA 서열들을 도입시키는 방법에 관한 것이다. 선택적으로, 수득된 세포안에서 정상적으로 발현되는 유전자의 발현은 증가되고 그 유전자는 증폭된다.
이하, 본 발명의 DNA 구성물, 이 구성물이 형질전환된 세포를 생성하는 데 사용되는 방법, 형질전환된 세포 및 이들 세포들을 사용하는 방법을 설명한다.
DNA 구성물
본 발명의 DNA 구성물은 적어도 표적화 서열; 조절 서열; 엑손 및 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함한다. 상기 구성물에서, 엑손은 조절 서열의 3'이고 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위는 엑손의 3'이다. 부가적으로, 다수의 엑손 및/또는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위에 의해 플랭킹된 엑손을 연장(5'까지 연장)시키는 인트론이 존재할 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 선택할 수 있는 마아커 또는 증폭될 수 있는 마아커와 같은 부가적 구성물 성분들이 종종 있다.
상기 구성물에서 DNA는 외인성으로서 간주될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "외인성"은 예컨대 본 명세서에 정의된 DNA 구성물을 가지는 본 발명의 방법에 의해 세포안으로 도입되는 DNA로서 정의된다. 외인성 DNA는 형질전환 이전에 세포안에 존재하는 내인성 DNA와 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있다.
표적화 서열(들)
표적화 서열(들)은 관심의 유전자를 함유하는 선택된 세포의 게놈내로 상동 재조합을 적절하게 가능케하는 DNA 서열이다, 일반적으로, 표적화 서열은 수득된 세포의 게놈내에 정상적으로 존재하는 DNA 서열(예컨대, 관심의 유전자의 전사 시작 부위의 상류, 전사 정지 부위 내 또는 하류에 자리잡은 코딩되거나 코딩 되지않은 DNA, 또는 사전 변형을 통해 게놈내에 존재하는 서열)과 동종인(즉, 세포 DNA와 동일하거나 또는 충분히 유사하여 표적화 서열 및 세포형 DNA가 상동 재조합될 수 있다) DNA 서열이다. 사용된 표적화 서열(들)은 DNA 구성물내의 DNA가 삽입될 위치에 의해 결정된다.
1개 이상의 표적화 서열들이 사용될 수 있다, 예를 들어, 원형 플라스미드 또는 DNA 단편은 단일 표적화 서열을 바람직하게 사용한다. 선상 플라스미드 또는 DNA 단편은 2개의 표적화 서열을 바람직하게 사용한다. 독립적으로, 표적화 서열(들)은 관심 유전자 내에, 관심 유전자의 바로 가까이에(즉, 표적화 서열 및 관심 유전자의 코딩 영역 사이에 부가적 뉴클레오티드를 전혀 가지지 않음), 관심 유전자의 상류(예컨대, 비-코딩 영역의 서열 상류 또는 내인성 프로모터 서열), 또는 유전자의 상류 및 유전자와 떨어진 거리(예컨대, 내인성 프로모터 서열의 상류)에서 존재할 수 있다. 표적화 서열(들)은 최근에 공지되거나 또는 서열화된 표적화된유전자의 영역 및/또는 구조적으로 특정화되지 않지만 제한 효소를 사용하여 지도화될 수 있고 당업자들에게 결정될 수 있는 영역의 상류를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, 표적화하는 유전자는 내인성 세포 유전자내에, 바로 인접하여, 상류, 또는 상당히 떨어져서 상이한 유전자로부터 단리되거나, 상이한 세포 및/또는 바이러스원으로부터 단리된 성분들로부터 조합되거나, 또는 신규 조절 서열로서 유전공학 방법에 의해 합성되는 조절 서열을 삽입하는데 사용될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 생성된 RNA 또는 단백질의 구조 또는 안정성에 영향을 주는 서열이 표적화에 의해 대체되거나, 제거되거나, 부가되거나 또는 다른 방법으로 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA 안정성 성분, 스플라이스 부위, 및/또는 RNA 분자의 유도 서열이 RNA 분자의 작용, 안정성, 및/또는 번역능(translation ability)을 개선시키거나 또는 변화시키도록 변형될 수 있다. 또한 단백질 서열은 예컨대 단백질의 운반, 분비, 또는 작용성 성질을 증가시키거나 변형시키기 위한 시그널 서열, 프로펩티드 서열, 활성 부위 및/또는 구조 서열로 변화될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 외인성 DNA의 도입으로 유전자의 정상적 발현성 및/또는 단백질 또는 RNA의 구조적 성질이 변화한다.
조절 서열
DNA 구성물의 조절 서열은 1개 이상의 프로모터(예컨대 구조적 또는 유도성)프로모터), 인핸서, 스캐폴드(scaffold)-부착 영역 또는 매트릭스 부착 부위, 음성 조절 성분, 전사 인자 결합 부위, 또는 상기 서열의 조합체로 구성될 수 있다.
조절 서열은 유도성 프로모터를 함유할 수 있어, 그 결과 생성되거나 각각에도입되는 세포는 생성물을 발현시키지 않지만 발현시키도록 유도될 수 있다(즉, 발현은 형질전환된 세포가 생성된 후, 이식 전 또는 이식 후에 유도된다). 물론, 원하는 생성물을 코딩하는 DNA는 도입하자마자 발현되는 방식으로 세포 안으로 도입될 수 있다(예컨대 구조적 프로모터 하에서 도입). 조절 서열은 세포 또는 바이러스성 게놈으로부터 단리될 수 있다(예컨대 조절 서열은 SV 초기 또는 후기 유전자, 아데노바이러스 다수 후기 유전자, 마우스 메탈로티오네인-I 유전자, 연장 인자-1α 유전자, 사이토메갈로바이러스 유전자, 콜라겐 유전자, 액틴 유전자, 면역 글로불린 유전자 또는 HMG-CoA 환원효소 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함한다). 바람직하게는 조절 서열은 TATA Box, CCAAT Box, AP1, Sp1 또는 NF-κB 결합 부위와 같은 전사 인자 결합 부위를 함유한다.
부가적인 DNA 구성물 성분
DNA 구성물은 1개 이상의 엑손을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 엑손은 RNA 안에 복사되고 성숙 mRNA 분자안에 존재하는 DNA 서열로서 정의된다. 선택적으로, 엑손은 1가지 이상의 아미노산을 코딩하고 및/또는 아미노산을 부분적으로 코딩하는(즉, 1개 또는 2개 염기의 코돈) DNA를 함유할 수 있다. 또한, 엑손은 5' 비-코딩 영역에 상응하는 DNA를 함유한다. 외인성 엑손(들)이 1가지 이상의 아미노산 및/또는 아미노산의 일부를 코딩하는 경우, DNA 구조는 전사 및 스플라이싱되는 때, 리딩 프레임이 표적 유전자의 제 2 엑손 또는 코딩 영역과 함께 인-프레임이 되도록 디자인된다. 본 명세서에서 사용되는 인-프레임은 융합되는 경우, 제 1 엑손 및 제 2 엑손의 코딩 서열이 제 2 엑손으로부터 유도되는 mRNA 일부의 적당한리딩 프레임을 변화시키기 않는 방식으로 뉴클레오티드와 함께 결합되는 것을 의미한다.
표적화된 유전자의 제 1 엑손이 번역을 개시하기 위해 서열 ATG를 함유하는 경우, 상기 구조물의 외인성 엑손은 바람직하게는 ATG를 함유하고, 원하는 경우에, 1가지 이상의 뉴클레오티드를 함유하여 얻어진 표적화 유전자의 제 2 및 연속 엑손을 포함하는 mRNA의 코딩 영역이 인-프레임이 되도록 한다. 제 1 엑손이 ATG를 함유하는 상기 표적화 유전자의 예는 hEPO, hGH, 사람 콜로니 자극 인자-그래뉼로사이트/매크로파지(hGH-CSF), 및 사람 콜로니 자극 인자-그래뉼로사이트(hG-CSF)를 코딩하는 유전자를 포함한다.
스플라이스-도너 부위는 한 엑손을 다른 엑손으로 스플라이싱 하도록 유도하는 서열이다. 전형적으로, 제 1 엑손은 제 2 엑손의 5'에 놓여 있고, 제 1 엑손의 3' 면상에 제 1 엑손을 오버랩시키고 플랭킹시키는 스플라이스-도너 부위는 제 2 엑손의 5' 면상에 제 2 엑손을 플랭킹시키는 스플라이스-억셉터 부위를 인식한다. 스플라이스-도너 부위는 하기와 같이 표현된 특정 컨센서스 서열을 가진다: 요구되는 경우, 제 4 및 제 5 위치에 GU를 가지는 (A/C)AG GURAGU (상기에서 R은 푸린 뉴클레오티드이다) (Jackson, I.J., Nucleic Acids Research 19:3715-3798 (1991)). 스플라이스-도너 컨센서스 부위의 처음 3개의 염기는 엑손의 마지막 3개의 염기이다. 스플라이스-도너 부위는 mRNA 스플라이스싱 경로내에서 적합한 반응에 영향을 주는 이것의 능력에 의해 작용적으로 정의된다.
쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위는 표적화 구성물에 존재하고 쌍을이루지 않은 스플라이스-도너 부위에서 3'로 위치된 스플라이스-억셉터 부위에 의해 구성물내로 수반되지 않는 스플라이스-도너 부위로서 정의된다. 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위는 내인성 스플라이스-억셉터 부위에서 스플라이싱 된다.
스플라이스-도너 부위와 같이, 서열내의 스플라이스-억셉터 부위는 한 엑손에서 다른 엑손으로의 스플라이싱을 유도한다. 스플라이스-도너 부위와 함께 가동시키면서, 스플라이싱 장치는 스플라이스-억셉터 부위가 인트론의 제거에 영향을 주기 위해서 사용한다. 스플라이스-억셉터 부위는 하기와 같이 표현된 특정 서열을 가진다; YYYYYYYYYYNYAG, 상기에서 Y는 피리미딘이고 N은 뉴클레오티드이다(Jackson, I.J., Nucleic Acid Research 19:3715-3798 (1991)).
인트론은 2가지의 엑손 사이에 놓여 있고, mRNA 분자의 형성에서 전구체 RNA 분자로부터 스플라이싱에 의해 제거되는 1개 이상의 뉴클레오티드의 서열로서 정의된다.
예를 들어, 조절 서열은 번역을 개시하는 ATG 개시 코돈에 효과적으로 링크된다. 임의로, CAP 부위(조절 영역에 의해 결합되고 유용화되는 특히 mRNA 개시부위)는 조절 서열 및 ATG 개시 코돈에 효과적으로 링크된다. 선택적으로, 조절 서열에 의해 결합되고 유용화되는 CAP 부위는 표적화 구성물내에 포함되지 않고, 전사 장치는 새로운 CAP 부위를 지정할 것이다. 대부분의 유전자에서, 일반적으로 CAP 부위에서 find 3'의 TATA 박스의 약 25개의 뉴클레오티드가 발견된다. 한 구체예에서, 스플라이스-도너 부위는 ATG 바로 가까이에, 예컨대 1개 이상의 뉴클레오티드의 존재가 외인성 엑손이 표적화 유전자의 제 2 엑손을 가지는 인-프레임이 되도록요구되지 않는 곳에 배치된다. 바람직하게는, 표적화 유전자의 코딩 서열을 가지는 인-프레임에서 1개 이상의 아미노산 또는 아미노산의 일부를 코딩하는 DNA는 그것의 3' 상에 ATG 바로 인접하여 배치된다. 이러한 구체예에서, 스플라이스-도너 부위는 그것의 3' 면상에 코딩한 DNA 바로 인접하여 배치된다.
작동적 링크 또는 기능적 배치는 외인성 조절 서열, 엑손, 스플라이스-도너 부위 및 임의로, 서열 및 스플라이스-억셉터 부위가 내인성 유전자에 관련된 위치에서 적당하게 표적화되는 배열로서 지정되는 것으로서 그 결과 조절 성분이 CAP 부위(임의로 표적화 구성물내에 포함됨)에서 개시하고 엑손 및 표적화 구성물의 스플라이스-도너 부위에 상응하는 서열, 내인성 유전자의 조절 영역의 상류에 놓여 있는 DNA(존재하는 경우), 내인성 유전자의 조절 영역(존재하는 경우), 내인성 유전자의 5' 전사되지 않은 영역(존재하는 경우), 및 내인성 유전자의 엑손과 인트론(존재하는 경우)을 포함하는 일차 RNA 전사체의 생성을 유도한다. 작동적으로 링크되는 배열에서 표적화 구성물의 스플라이스-도너 부위는 내인성 유전자의 엑손중 한 개를 플랭킹시키는 스플라이스-억셉터 부위에 스플라이싱을 유도시킨다. 한 구체예에서, 스플라이스-억셉터 부위가 내인성이어서, 스플라이싱 과정이 예컨대 내인성 유전자의 내인성 엑손에서 일어난다. 또다른 구체예에서 스플라이스-억셉터 부위가 표적화 구성물내에 포함되는 경우, 스플라이싱 과정은 표적화 구성물에의해 도입되는 인트론을 제거한다.
사용되는 코딩 DNA (예컨대, 표적화 구성물의 엑손 1 에 존재)는 내인성 단백질의 것과 같은 1개 이상의 아미노산, 및/또는 아미노산의 일부를 선택적으로 코딩할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 코딩 DNA 서열은 관심 유전자의 제 1 엑손에 상응할 수 있다. 코딩 DNA는 관심 단백질의 제 1 엑손과 상이한 1개 이상의 아미노산 또는 아미노산 일부를 선택적으로 코딩할 수 있다. 상기 구체예는 관심 단백질의 제 1 엑손의 아미노산이 상기 단백질의 활성도(들)에 중요하지 않는 점에서 특히 관심이 되고 있다. 예를 들어, 내인성 hEPO 유전자에서의 융합이 구성되는 경우에, hGH의 제 1 엑손을 코딩하는 서열이 사용될 수 있다. 본 실시예에서, hGH 엑손 1의 hEPO 엑손 2로의 융합은 기능적인 혼성 시그널 펩티드를 형성시킨다. 관련 구성물에서, 코딩된 아미노산이 혼성 시그널 펩티드의 작용을 방해하지 않는 사람 또는 비-사람 기원의 모든 엑손이 사용될 수 있다. 관련 구체예에서, 본 발명의 기술은 표적 유전자에서 발견되는 변종을 수정하는데 또한 사용될 수 있다.
원하는 생성물이 표적화 구성물에서 내인성 단백질의 융합 단백질 및 코딩 서열인 경우에, 본 발명의 방법에 의해 세포내로 혼입되는 내인성 코딩 DNA는 내인성 표적화된 유전자의 생성물에 용융되는 번역 또는 전사 생성물에 상응하는 cDNA의 서열 또는 1개 이상의 엑손을 코딩하는 DNA를 포함한다. 본 구체예에시, 표적화는 2개 이상의 단백질로부터 구조적 특성, 효소적 특성, 또는 리간드 또는 리셉터 결합 성질 등을 하나의 폴리펩티드로 조합하여 키메라 또는 다작용 단백질을 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 외인성 DNA는 표적화 단백질 또는 시그널 펩티드용 막에 앵커를 코딩하여 세포 분비, 유도 서열, 효소 영역, 경막 (transmembrane)도메인 영역, 보조-인자 결합 영역 또는 다른 작용성 영역을 제공하거나 또는 개선시킬 수 있다. 정상적으로 분비되지 않으나, 시그널 단백질에 융합되어 분비할 수 있는 단백질의 예로는, 도파-데카르복실라제, 전사 조절 단백질, α-갈락토시다제 및 티로신 히드록실라제가 포함된다.
표적화된 유전자의 제 1 엑손(예컨대, 난포-자극 호르몬 베타((FSHβ) 유전자의 제 1 엑손)이 비-코딩 영역에 상응하는 경우에, 외인성 ATG는 필요하지 않고, 바람직하게는 생략된다.
유전 공학 기술 또는 합성 방법을 사용하여, DNA 구성물은 이것이 자연에서 발생하거나 또는 제조될 수 있는 공급원으로부터 얻어질 수 있다.
표적화된 유전자 및 결과 생성물
DNA 구성물이 일차, 이차 또는 불멸화된 세포와 같은 세포내로 형질전환되는 경우, 원하는 생성물 예컨대 단백질 또는 RNA의 활성 또는 작용성 부분의 발현을 조절할 수 있다. 생성물은 예를 들어, 호르몬, 사이토킨, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 운송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 안티-센스 RNA, 또는 리보자임이 될 수 있다. 또한, 생성물은 자연에서 발생하지 않는 단백질 또는 핵산(즉, 융합 단백질 또는 핵산)이 될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 에리트로포이에틴, 칼시토닌, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린계 성장 인자, 파라티로이드 호르몬, 인터페론 β, 및 인터페론 β, 신경 성장 인자, FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루타곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-그래뉼로사이트, CSF-매크로파지, CSF-그래뉼로사이트/매크로파지, 면역 글로불린, 촉매 항체, 단백질 키나아제 C, 글루코세레브로시다제, 초과산화 디스뮤타제, 조직 플라스미노겐 활성제, 우로키나아제, 안티프로빈 III, DNAse, α-갈락토시다제, 티로신 히록실라제, 혈액 응고 인자 V, 혈액응고 인자 VII, 혈액 응고 인자 VIII, 혈액 응고 인자 IX, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XIII, 아포리포 단백질 E 또는 아포리포 단백질 A-1, 글로빈, 저밀도 리포 단백질 수용체, IL-2 수용체, IL-2 길항제, 알파-1 안티트립신, 면역 반응 변형제, 및 용해성 CD4와 같은 1개 이상의 치료용 생성물을 생성 할 수 있다.
선택성 마아커 및 증폭
표적화 과정의 식별은 1가지 이상의 선택성 마아커 유전자의 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 마아커는 표적화 구성물내에 포함되거나 상이한 구성물상에 존재할 수 있다. 선택성 마아커는 2개의 카테고리, 즉 양성 선택성 및 음성 선택성(다시 말하면, 양성 선택 또는 음성 선택을 위한 마아커)로 분리될 수 있다. 양성 선택에서, 양성 선택할 수 있는 마아커를 발현하는 세포는 선택제(예컨대 neo, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(gpt), dhfr, 아데노신 데아미나제(ada), 프로미신(pac), 히그로미신(hyg); 카르바밀 포스페이트 신타제, 아스파레이트 트랜스카르바밀라제, 및 디히드로-오로타제 글루타민 신테타제(GS)를 코딩하는 CAD, 멀티드러그 내성 1(mdr1) 및 히스티딘 D)로 처리하여도 생존하며, 표적화 구성물의 세포 선택이 숙주 세포 게놈내로 통합된다. 음성 선택에서, 음성 선택성 마아커를 발현하는 세포는 선택제의 존재하에서 사멸된다. 표적화 과정의 식별은 음성 선택성을 나타내는 1개 이상의 마아커 유전자의 사용에 의해 수행되어, 음성 선택성 마아커가 외인성 DNA에 링킹될 수 있지만, 음성 선택성 마아커가 표적화 서열에 플링킹되고, 숙주 세포 게놈중의 서열과의 상동 재조합이 음성 선택성 마아커의 안정적인 통합을 초래하지 않도록 배열될 수 있다(Mansour, S.L.et al.,Nature 336:348-352 (1988)). 본 발명의 목적을 위해 유용한 마아커는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 유전자 또는 박테리아성 gpt 유전자를 포함한다.
다양한 선택성 마아커가 일차, 이차 또는 불멸화된 세포내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 약제 내성, 영양성 자가 영양, 세포독성제에 대한 내성 또는 표면단백질의 발현과 같은 선택성 표현형에 기여하는 선택성 마아커가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 선택성 마아커 유전자는 neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, CAD, GS, mdrl 및 hisD를 포함한다. 제공된 선택성 표현형에 따라 수용체 세포를 확인하거나 또는 단리시킬 수 있다.
선택성 마아커를 코딩하는 증폭성 유전자(예컨대, ada, GS, dhfr 및 다작용성 CAD 유전자)는 게놈내로 삽입되는 선택성 마아커의 증폭된 복사체를 함유하는 세포를 선택할 수 있는 부가된 특성을 가진다. 이러한 특징은 증폭이 바람직한 인접하거나 링킹된 유전자의 복사수를 상당히 증가시키는 메카니즘을 제공한다. 또한 개선된 선택 성질 및 다른 증폭할 수 있는 서열을 제시하는 상기 서열의 변형된 형태가 또한 사용될 수 있다.
DNA 구성물내에서 성분의 순서는 변할 수 있다. 상기 구성물이 원형 플라스미드인 경우, 결과 구조내에서 성분의 순서는 표적화 서열 - 플라스미드 DNA(선택 및/또는 미생물 또는 다른 적합한 숙주내에 표적화 플라스미드의 재조합을 위해 사용되는 서열로 구성) - 선택성 마아커(들) - 조절 서열 - 엑손 -스플라이스-도너부위가 될 수 있다. 바람직하게는, 표적화 서열 및 외인성 DNA 성분을 함유하는 플라스미드는 복사체 세포안으로 도입되기 전에 선형 또는 갭화된 분자를 생성하기 위해 표적화 서열내에 1번 이상 절단되는 제한 효소로 분할되어, 유리된 DNA 말단은 본 명세서에 설명된 바와 같이 원하는 상동 재조합 과정의 빈도수를 증가시킨다. 부가적으로, 유리된 DNA 말단은 엑소뉴클레아제로 처리되어 원하는 상동 재조합 과정의 빈도수를 증가시키기 위해 단일-가닥 DNA 말단을 돌출시키는 튀어나온 5' 또는 3'을 생성할 수 있다. 상기 구체예에서, 표적화 서열 및 세포 표적 사이의 상동 재조합은, 도입된 플라스미드내에 함유된 성분을 플랭킹시키는, 표적화 서열의 2개의 복사체를 생성시킨다.
상기 구성물이 선형인 경우, 예컨대 순서는 제 1 표적화 서열 - 선택성 마아커 - 조절 서열 - 엑손 - 스플라이스-도너 부위 - 제 2 표적화 서열 또는 선택적으로 제 1 표적화 서열 - 조절 서열 - 엑손 - 스플라이스-도너 부위 - 선택성 마아커를 코딩하는 DNA - 제 2 표적화 서열이 될 수 있다. 상기 구성물을 안정적으로 통합시킬 수 있는 세포는 선택 제제로 처리하는 경우 잔재할 것이고; 안정적으로 형질전환된 세포의 서브세트는 상동 재조합된 세포가 될 것이다. 상동 재조합 세포는 PCR, 서던 혼성화 및 표현형 스크리닝을 포함하여 많은 기술에 의해 확인될 것이다.
또다른 구체예에서, 구성물의 순서는 제 1 표적화 서열 - 선택성 마아커 - 조절 서열 - 엑손 - 스플라이스-도너 부위 - 인트론 - 스플라이스-억셉터 부위 - 제 2 표적화 서열이 될 수 있다.
선택적으로 예컨대 DNA 구성물내에 성분들의 순서는 제 1 표적화 서열 - 선택성 마아커 1 - 조절 서열 - 엑손 - 스플라이스-도너 부위 - 제 2 조절 서열 - 선택성 마아커 2, 또는 선택적으로, 제 1 표적화 서열 - 조절 서열 - 엑손 - 스플라이스-도너 부위 - 선택성 마아커 1 - 제 2 표적화 서열 - 선택성 마아커 2가 될 수 있다. 이러한 구체예에서 선택성 마아커 2는 음성 선택성을 나타낸다. 즉, 선택성 마아커 2의 유전자 생성물은 선택성 마아커 2를 발현하는 세포를 사멸시키는 제제(전형적으로 약제 또는 대사산물 유사체)를 함유하는 적합한 배지 제형에서의 성장에 반하여 선택될 수 있다. 숙주 세포 게놈에서 동종 서열로 선택할 수 있는 마아커 1을 플랭킹하는 표적화 서열들 사이의 재조합이 선택성 마아커 1의 표적화된 통합을 일으키나, 선택성 마아커 2는 통합되지 않는다. 상기 재조합 과정은 선택성 마아커 1로 안정적으로 형질전환되지만 선택성 마카어 2로는 안정적으로 형질전환되지 않는 세포를 발생시키고, 이러한 세포는 선택성 마아커 1에 대해 선택하는 선택제 및 선택성 마아커 2에 반하여 선택하는 선택제를 함유하는 배지에서의 성장에 따라 선택될 수 있다.
또한 DNA 구성물은 양성 선택성 마아커를 포함하여 그 마아커의 증폭된 복사체를 함유하는 세포를 선택하게 할 수 있다. 상기 마아커의 증폭은 플랭킹 DNA 서열을 동시-증폭시킨다. 이러한 구체예에서, 구성물 성분의 순서는 제 1 표적화 서열 - 증폭할 수 있는 양성 선택성 마아커 - 제 2 선택성 마아커(임의적) - 조절 서열 - 엑손 -스플라이스-도너 부위 - 제 2 표적화 DNA 서열이다.
이러한 구체예에서, 활성화된 유전자는 적절한 선택성 유전자의 존재하에서세포를 배양시킴으로써 선택성 마아커 유전자의 증폭된 복사체를 함유하는 세포가 선택될 수 있는 성질을 가지는 선택성 마아커 유전자를 포함함으로써 추가로 증폭될 수 있다. 활성화된 내인성 유전자는 증폭된 선택성 마아커 유전자와 연관되어 종폭될 것이다. 활성화된 내인성 유전자의 많은 복사체를 함유하는 세포는 매우 높은 수준의 원하는 단백질을 생성할 수 있고시험관내단백질 생성 및 유전자 치료법에 유용하다.
모든 구체예에서, 선택성이고 증폭할 수 있는 마아커 유전자는 서로 바로 인접하여 놓일 필요가 없다.
임의로, DNA 구성물은 박테리아 기원의 복제 및 박테리아성 항생 물질 내성 마아커 또는 다른 선택성 마아커를 포함할 수 있어 박테리아 또는 다른 모든 적합한 클로닝/숙주계 내에서 대규모 플라스미드 증식이 일어나게 할 수 있다. 프로모터 및 스플라이스 접합부와 같은 부가 서열과 함께, 선택성 마아커를 코딩하는 DNA를 포함하는 DNA 구성물은 형질전환된 세포(예컨대, 도 4에 개략적으로 표현된 플라스미드 pcDNEO)에 선책성 표현형을 제공하는데 사용될 수 있다. 상기 DNA 구성물은 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여, 표적화 DNA 서열과 함께, 일차 또는 이차 세포내로 동시-형질전환될 수 있다.
형질전환 및 상동 재조합
본 발명의 방법에 따라서, 구성물이 형질전환된 세포의 염색체 또는 핵 DNA 내로 혼입되는 단일 DNA 구성물로서, 또는 분리 DNA 서열로서, 일차, 이차 또는 불멸화된 세포와 같은 세내로 도입된다.
표적화 서열, 조절 서열, 엑손, 스플라이스-도너 부위 및 선택성 마아커 유전자(들)를 포함하는 표적화 DNA 구성물이 단일 DNA 구성물 또는 분리 구성물상의 세포내로 도입될 수 있다. DNA 구성물의 전체 길이는 성분(예컨대, 표적화 서열, 조절 서열, 엑손, 선택성 마아커 유전자 및 다른 성분)의 수 및 각각의 길이에 따라 변할 수 있다. 일반적으로 전체 구성물의 길이는 약 200개 이상의 뉴클레오티드가 될 것이다. 추가로, DNA는 선형, 이중-가닥(1개 또는 2개의 말단에 단일-가닥 영역을 가지거나 가지지 않는 이중-가닥), 단일-가닥, 또는 원형으로서 도입될 수 있다.
다음 개시된 발명의 모든 구성물 유형은 세포내로 도입되어 형질전환된 세포를 얻는다. 형질전환된 세포는 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 상동 재조합을 가능하게 하는 조건하에서 유지된다(Capecchi, M.R.,Science 244: 1288-1292 (1989)). 상동 재조합 세포가 DNA를 전사시키기에 충분한 조건하에서 유지되는 경우, 프로모터의 경우에서와 같이, 표적화 구성물에 의해 도입되는 조절 영역은 전사를 활성화시킬 것이다.
DNA 구성물은 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 마이크로프로젝타일 포격, 인산칼슘 침전, 및 리포솜-, 폴리브렌-, 또는 DEAE 덱스트란-배지 형질전환을 포함하여, 많은 물리적 또는 화학적 방법에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 선택적으로, 레트로바이러스, 헤르페스, 아데노바이러스, 다에노바이러스-부수물, 멈프스(mumps) 및 폴리오바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터가 DNA를 도입시키기 위해 사용될 수 있다.
임의로, 표적화 DNA는 2개 이상의 분리 DNA 단편에서 세포내로 도입될 수 있다. 2개의 단편이 사용되는 경우에, 2개의 단편은 한 단편의 3' 말단 및 다른 단편의 5' 말단에서 DNA 서열 동종체(오버랩)를 분리시키면서, 한 단편은 제 1 표적화 서열을 운반하고 다른 단편은 제 2 표적화 서열을 운반한다. 세포내로의 도입시에, 2개의 단편은 상동 재조합을 일으켜서 2개의 기원되는 단편 사이에서 오버랩의 영역을 플랭킹하는 제 1 및 제 2 표적화 서열을 가지는 단일 단편을 형성할 수 있다. 다음, 생성물 단편은 세포 표적 서열로 상동 재조합시키기에 적합한 형태로 존재한다. 2개 이상의 단편들은 서로 상동 재조합을 일으켜서 궁극적으로 상기에 설명된 바와 같이 세포 표적 서열을 가지는 상동 재조합에 적합한 생성물을 형성하도록 사용되고, 디자인될 수 있다.
상동 재조합 세포
표적화 과정에서 조절 서열의 제어하에서 내인성 유전자를 배치하여, 표적화 구성물의 조절 서열의 삽입(예컨대, 프로모터 또는 인핸서, 또는 2가지 모두, 내인성 유전자 또는 조절 영역의 상류에서의 삽입에 의함)이 이루어진다. 임의로, 표적화 과정은 조직-특이적 음성 조절 성분의 삭제와 같은 내인성 조절 성분의 삭제를 동시에 일으킬 수 있다. 표적화 과정은 존재하는 성분을 대체시킬 수 있다; 예를 들어, 조직-특이적 인핸서는 자연적으로 발생하는 성분보다 더 광범위하거나 상이한 세포형 특이성을 가지는 인핸서에 의해 대체될 수 있거나, 또는 상응하는 형질전환되지 않은 세포와 상이한 조절 또는 도입 패턴을 나타낼 수 있다. 본 구체예에서 자연적으로 발생하는 서열은 삭제되고, 새로운 서열이 첨가된다. 선택적으로,내인성 조절 성분이 제거되지 않거나 또는 대체되지만 내인성 조절 성분 내의 외인성 서열을 표적화시키는 과정과 같은 표적화 과정에 의해 무능화되어 분열된다.
DNA가 세포내로 도입된 후에, 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 게놈 DNA 및 일부 도입된 DNA 사이에서 발생하는 상동 재조합에 적당한 조건하에서 세포가 유지된다 (Capecchi , M.R.,Science 244: 1288-1292 (1989)).
게놈 DNA 및 도입된 DNA 사이의 상동 재조합으로 내인성 유전자의 발현을 변화시키는 서열이 생성물을 코딩하는 내인성 유전자에 효과적으로 링크되어, 내인성 유전자의 경우와 상이한 발현 및/또는 코딩 잠재성을 가지는 새로운 전사 유니트를 생성시키는 균류, 식물 또는 동물, 및 특히 일차, 이차, 또는 불멸화된 사람 또는 다른 포유류 세포와 같은 상동 재조합 세포를 얻는다. 특히, 본 발명은 스플라이스-도너 부위에 의해 플랭크되는 조절 서열 및 엑손을 포함하고, 표적화 DNA 구성물에 의해 예정된 부위에서 도입되며, 내인성 유전자의 제 2 엑손에 효과적으로 링크되는 상동 재조합 세포를 포함한다. 임의로, 다수의 외인성 엑손(코딩되거나 코딩되지 않는 엑손) 및 내인성 유전자의 모든 엑손에 효과적으로 링크되는 인트론이 있을 수 있다. 적합한 경우, 수득한 상동 재조합 세포는 증폭될 수 있는 마아커 및 신규 전사 유니트를 코딩하는 DNA의 증폭을 위해 선택되는 조건하에서 배양된다. 증폭이 이루어지거나 또는 이루어지지 않는 경우에도, 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 세포는시험관내단백질을 생성함으로써, 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양되거나, 또는 상기 세포는 치료용 단백질의 시험관내 전달(즉, 유전자 치료법)을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 일차 세포는 척추 동물 조직원으로부터 단리되는 세포(이것이 플레이트, 즉 접시 또는 플라스크와 같은 조직 배양 기질에 부착되기 전에 세포)의 현탁액에 존재하는 세포, 조직으로부터 유도되는 체외 이식 조직내에 존재하는 세포, 처음으로 플레이트되는 상기 유형의 세포 2가지 모두, 및 상기 플레이트된 세포로부터 유도된 세포 현탁액을 포함한다. 용어 이차 세포 또는 세포 스트레인은 배양 과정내의 모든 연속 단계에서의 세포에 관한 것이다. 즉, 처음에 플레이트된 일차 세포는 배양 기질로부터 제거되고 재플레이트(계대배양)되고, 본 명세서에서 후속하는 계대배양에 의한 세포는, 모두 이차 세포로서 언급된다. 이차 세포는 1번 이상 계대배양되는 이차 세포로 구성되는 세포 스트레인이다. 세포 스트레인 (cell strain)은 1) 1번 이상 계대배양되고; 2) 배양에서 한정된 수의 평균 집단 배가체를 나타내고; 3) 접촉-제한되고, 앵커리지에 의존하는 성장(앵커리지-의존성은 현탁액 배양에서 증식되는 세포에는 적용되지 않는다)의 특성을 나타내며; 4) 불멸화되지 않는 이차 세포로 구성된다.
불멸화된 세포는 세포주 (일차 및 이차 세포를 위해 보전된 지정 "스트레인"을 가지는 세포 스트레인과 비교하여)로서, 불멸화된 세포의 결정적인 특징은 명백하게 배양내에서 제한되지 않은 수명을 나타내는 것이다.
본 발명의 방법을 위해 선택된 세포는 하기의 4가지 유형 또는 카테고리가 될 수 있다; 1) 수득된 세포로서, 단백질 또는 생성물(예컨대 세포에 의해 정상적으로 발현되지 않는 단백질 또는 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 융합 단백질)을 제조하거나 또는 함유하지 않는 세포, 2) 단백질 또는 생성물을 제조하거나 또는 함유하지만 원하는 정도의 양을 함유하지 않는 세포(예컨대 수득된 세포에 대해 생리학적으로 정상인 저수준보다 적은 양), 3) 수득된 세포에 대해 생리학적으로 정상 수준으로 단백질 또는 생성물을 제조하지만, 이들의 성분 또는 생성기 증강 또는 강화되는 세포. 및 4) 단백질을 코딩하는 유전자의 조절 또는 도입 패턴을 변화시키기에 바람직한 세포.
본 발명의 방법에 의해 형질전환된 일차, 이차 및 불멸화된 세포는 다양한 조직으로부터 수득될 수 있고 배양에서 유지될 수 있는 모든 유형의 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 형질전환될 수 있는 일차 및 이차 세포는 섬유아세포, 케라티노사이트, 상피 세포(예컨대, 유방 상피 세포, 장 상피 세포), 내피 세포, 신경교 세포, 신경 세포, 혈액의 형성된 성분(예컨대, 림프구 골수 세포), 근육 세포 및 상기 체세포형의 전구체를 포함한다, 상동 재조합 세포가 유전자 치료에 사용되는 경우, 일차 세포는 형질전환된 일차 또는 이차 세포가 투여되는 개개인으로부터 바람직하게 얻어진다. 그러나, 일차 세포는 동일한 종의 도너(수용체와는 다름)로부터 수득될 수 있다.
또한 상동 재조합 불멸화된 세포는 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있고 단백질 생성 또는 유전자 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제한되지는 않지만, 단백질 생성 또는 유전자 치료에 유용한 불멸화된 사람 세포주의 예는 HT1080 세포(ATCC CCL 121), HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체(ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), MCF-7 유방암 세포(ATCC BTH 22), K-562 백혈병 세포(ATCC CCL 243), KB 암세포(ATCC CCL 17), 2780AD 난소 암세포(Van Der Blick, A.M.et al.,Cancer Res,48: 5927-5932 (1988)), 라지(Raji) 세포(ATCC CCL 86), 주르카트(Jurkat) 세포(ATCC TIB 152), 나말와(Namalwa) 세포(ATCC CRL 1432), HL-60 세포(ATCC CCL 240), 다우디(Daudi) 세포(ATCC CCL 213), RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155), U-937 세포(ATCC CRL 1582), 및 사람 세포 및 다른 종의 세포의 융합에 의해 생성된 헤테로하이브리도마 세포를 포함한다. WI-38(ATCC CCL 75) 및 MRC-5(ATCC CCL 171)과 같은 이차 사람 섬유아세포 스트레인이 사용될 수 있다. 또한,시험관내유전자 증폭의 성질을 나타내는 일차, 이차, 또는 불멸화된 사람 세포, 이외에도 다른 종의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포가시험관내단백질 생성 또는 유전자 치료에 사용될 수 있다.
유전자를 cDNA 복사체로 전환시키는 방법
본 발명은 또한 상동 재조합이 유전자를 cDNA 복사체(인트론이 없는 유전자락사체)로 전환시키는데 사용되는 방법에 관한 것이다. cDNA 복사체는시험관내단백질 생성을 위해 효모 또는 박테리아 안으로 형질전환될 수 있거나, 또는 cDNA 복사체는시험관내또는생체내단백질 생성을 위해 포유동물 세포내로 삽입될 수 있다. cDNA가 미생물 세포에 형질전환되는 경우, 표적화 서열을 함유하는 2가지 DNA 구성물이 상동 재조합에 의해 도입되고, 한 구성물은 치료용 단백질을 코딩하는 사람 유전자의 상류에 있고 한 구성물은 상기의 하류에 존재한다. 예를 들어, 상류로 도입되는 서열은 성숙하고, 가공된 치료용 단백질의 제 1 아미노산을 코딩하는 DNA에서 또는 DNA의 상류에서 게놈 DNA 서열에 동종인 DNA 서열; 레트로바이러스성 장기 반복(LTR); 미생물 세포에서 선택용 마아커를 코딩하는 서열; 미생물 세포에서작용하는 조절 성분; 및 스플라이스-도너 부위를 가지는 미생물 세포로부터 분비를 촉진하는 리더 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함한다. 상류로 도입되는 서열은 성숙하고, 가공된 치료용 단백질의 제 1 아미노산을 코딩하는 게놈 DNA의 가까이 및상류에서 도입된다. 하류로 도입되는 서열은 성숙하고, 가공된 단백질의 마지막 아미노산을 코딩하는 DNA에서 또는 DNA의 하류에서 게놈 DNA 서열에 동종인 DNA 서열; 미생물성 전사 종결 서열; 미생물 세포에 DNA 복제를 유도할 수 있는 서열; 및 레트로바이러스성 LTR을 포함한다. 하류로 도입되는 서열은 성숙하고, 가공된 치료용 단백질의 종료 코돈을 코딩하는 DNA의 가까이 및 하류로 도입된다. 2가지의 DNA 구성물이 세포내로 도입된 후에, 생성된 세포는 도입된 DNA 및 게놈 DNA 사이에서 상동 재조합에 적당한 조건하에서 유지되어, 상동 재조합 세포를 생성한다. 임의로, 1가지 또는 2가지 모두의 DNA 구성물은 DNA 구성물을 함유하는 세포의 양성 또는 음성 선택을 위한 1개 이상의 마아커를 코딩시킬 수 있고, 선택 단계는 1가지 또는 2가지 모두의 DNA 구성물이 세포내로 도입된 후에 본 방법에 부가될 수 있다. 선택적으로, 미생물 세포에서 선택용 마아커를 코딩하는 서열 및 미생물 세포에서 DNA 복제를 유도할 수 있는 서열은 표적화 구성물의 상류 또는 하류에 모두 존재할 수 있거나, 또는 미생물 세포에서 선택용 마아커는 표적화 구성물의 하류에 존재할 수 있고 미생물 세포에서 DNA 복제를 유도할 수 있는 서열은 표적화 구성물의 상류에 존재할 수 있다. 다음, 상동 재조합 세포는 치료용 단백질을 코딩하는 유전자의 RNA 생성물의 LTR 유도 전사, 가공 및 역전사에 적당한 조건하에서 배양된다. 역전사의 생성물은 치료용 단백질을 코딩하고 인트론이 없는 DNA 복사체를 포함하는DNA 구성물이고, 상기에 설명된 2가지 외인성 DNA 구성물을 포함하는 DNA 서열에 효과적으로 링크된다. 본 발명의 방법에 의해 생성되고 인트론이 없는 DNA 구성물이 미생물 세포내로 도입된다. 미생물 세포는 치료용 단백질의 발현 및 분비에 적합한 조건하에서 배양된다.
생체내 단백질 생성
본 발명의 상동 재조합 세포는 상동 재조합 세포주의 집단으로서, 상동 재조합체 일차 또는 이차 세포, 상동 재조합체 클론성 세포 스트레인 또는 세포주, 상동 재조합체 이종 세포 스트레인 또는 세포주의 집단으로서, 및 상동 재조합 세포의 4개의 상기 카테고리 중 한 카테고리의 1개 이상의 상징 세포가 존재하는 세포 혼합물로서 유용하다. 상기 세포들은 치료용 생성물, 즉 1) 치료용 단백질(예컨대, 부재이고, 개개인의 생리학적 요구에 대해 불충분하게 생성되고, 개개인에게 부족하거나 비효과적으로 또는 비적당하게 이용되는 단백질; 효소 또는 운송 작용과 같은 신규작용을 가지는 단백질) 또는 2) 치료용 핵산(예컨대, 유전자 발현을 저해하거나 또는 내인성 효소 활성을 가지는 RNA)의 전달에 감응하는 비정상적 또는 바람직하지 않은 조건으로 개개인을 치료하기 위한 전달계에서 사용될 수 있다. 치료용 단백질 또는 핵산을 제공하는 본 발명의 방법에서, 상동 재조합체 일차 세포, 클론성 세포 스트레인 또는 이종 세포 스트레인은, 치료되거나 예방되어야 하는 비정상적 또는 바람직하지 않은 상태에 있는 개체에 충분한 양 및 적당한 경로로 투여되어 생리학적 관련 수준에서 유용한 단백질 또는 외인성 DNA를 발현하거나 또는 제조한다. 생리학적 관련 수준은 생성물이 체내에서 정상적으로 생성되거나 또는 비정상적 또는 바람직하지 않은 상태가 개선시키는 수준으로 접근하는 것이다. 본 명세서에 설명된 본 발명의 구체예에 따라, 투여되는 상동 재조합 불멸화된 세포주는 1개 이상의 반투과성 장벽 장치에 포함될 수 있다. 장치의 투과성은, 세포가 동물에 이식되는 순간 장치를 이탈하는 것을 방지하지만, 치료용 단백질이 자유롭게 투과되고 장벽 장치를 이탈할 수 있고 이식체를 둘러싸고 있는 국소 표면에 유입되거나 또는 계 순환에 유입되는 점이다. 예를 들어, hGH, hEPO, 사람 인슐리노트로핀, hGH-CSF, hG-CSF, 사람 α-인터페론, 또는 사람 FSHβ는 치료상 장점을 위해 사람에게 전신적으로 전달될 수 있다.
장벽 장치는 특히 유용하고 상동 재조합 불멸화된 세포, 또다른 종으로부터의 상동 재조합 세포(상동 재조합 이종 세포), 또는 비조직접합성-대응 도너(상동 재조합 동종 세포)가 사람 또는 동물 질병을 치료하기 위해 또는 농업적인 용도(즉, 육류 및 유제품 생성)를 위해 이식되게 한다. 또한 장벽 장치는 치료처방이 여하한 이유로 중단되어야 하는 경우, 이를 제거를 위해 세포에 접근 용이성을 제공함으로써 편리한 단기간(즉, 일시적인) 치료를 가능케 한다.
많은 합성, 반합성, 또는 천연 거름막이 제한하지는 않지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 염화 폴리비닐 중합체 및 염화 폴리비닐 유도체의 중합체를 포함하여 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 장벽 장치는 또다른 종으로부터의 일차, 이차, 또는 불멸화 세포를 사람에 대한 유전자 치료법에 사용될 수 있도록 이용될 수 있다.
시험관내 단백질 생성
본 발명에 따른 사람 또는 비사람 종으로부터의 상동 재조합 세포가시험관내단백질 생성을 위해 또한 사용될 수 있다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 세포는 단백질의 발현을 일으키는 조건하에서 유지된다. 설명된 방법을 사용하여 발현된 단백질은 세포 용해물 또는 세포 상청액으로부터 정제되어 원하는 단백질을 정제시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 단백질은 당해 분야(예컨대, 경구, 정맥내, 근내, 비강내 또는 피하 방식)에서 공지된 통상적인 약제학적 방식에의해 사람 또는 비사람 동물에 전달될 수 있다. 상기 단백질은 hGH, hEPO, 및 사람 인슐리노트로핀, hGM-CSF, hG-CSF, FSHβ또는 α-인터페론을 포함한다. 이러한 세포들은 불멸화된, 일차 또는 이차 세포들이 될 수 있다. 다른 종으로부터의 세포를 사용하는 것은 비-사람 세포가 비-사람 단백질이 치료상 또는 상업상 유용한 단백질 생성 목적에 유리한 경우에 바람직할 수 있고, 그 예로는 연어 칼시토닌의 생성을 위해 연어로부터 유도된 세포의 사용, 돼지 인슐린의 생성을 위해 돼지로부터 유도된 세포의 사용, 및 소 성장 호르몬의 생성을 위한 소 세포의 사용을 들 수 있다.
장점
본 발명의 방법론, DNA 구성물, 세포들, 및 생성 단백질에는 유전자 표적화에서 당해 분야내에 현재까지 사용된 방법들에 비해서 다기능 및 많은 다른 장점이 있다. 관심 유전자(정상 유전자의 전사 영역에 바로 융합됨)에 바로 인접한 곳에서부터 30 kbp 또는 추가로 내인성 유전자의 전사된 영역의 상류, 또는 내인성 유전자의 인트론내에 이르는 많은 위치에 외인성 조절 서열을 위치시킴으로써 내인성유전자를 활성화시키는 능력은 세포내에서의 유전자 발현에 유용하다. 예를 들어, 그것은 정상적으로 잠복해있거나 또는 유전자를 음성 조절하는 영역의 상류 또는 하류에 조절 성분을 위치시키는데 사용될 수 있다. 상기 영역의 상류 또는 하류에 조절 성분의 위치화는 정상적으로 전사를 제한하는 우성의 음성 효과를 높일 수 있다. 부가적으로, 전사를 정상적으로 제한하거나 또는 다르게 유전자의 발현상에 대한 유해한 영향을 주는 DNA의 영역은 본 명세서에서 설명된 표적화 구성물을 사용하여 삭제될 수 있다.
또한, 프로모터 작용이 국부 환경상에 강하에 의존하는 것으로 공지되었기 때문에, 넓은 범위의 위치는 조사되어 상기 국부 환경이 작용에 있어서 최적인 것을 발견할 수 있다, 그러나, ATG 개시 코돈이 포유류의 DNA 내에서 종종 발견되기 때문에(대략 48개의 염기쌍당 1개가 발견됨), 전사는 유전자의 상류의 어느 위치에서나 간단하게 개시될 수 없고 수정 ATG 개시 코돈을 우선하는 긴 리더 서열을 함유하는 전사체를 생성할 수 없고, ATG 코돈의 빈번한 발생 때문에 상기 리더 서열은 수정 유전자 생성물의 번역을 억제하고 메시지를 사용할 수 없게 할 것이다. 이와 같이, 외인성 엑손, 스플라이스-도너 부위, 및 임의로, 인트론 및 스플라이스-억셉터 부위가 조절 영역을 포함하는 표적화 구성물내로 혼입되는 것은 유전자 발현이 생성된 mRNA에서 적당하지 않은 ATG 개시 코돈을 피하는 것이 요구됨으로써 부과되는 한계가 없이, 조절 영역 작용에 최적 부위를 확인함으로써 최적화되게 한다. 이것은 구성물의 배치에서 상당히 증가된 가용성을 제공하고, 넓은 범위의 유전자를 활성화시킬 수 있게 한다. 또한 본 발명의 DNA 구성물은 예컨대 재조합, 또는 외인성 서열 및 내인성 서열에 의해 코딩되는 융합 단백질을 제조하는 방법에서 유용하다.
상기에 설명된 유전자 표적화 및 증폭은 단리 및 발현시키기가 어려운 정도로 충분히 큰 전사 유니트를 형성하는 유전자의 발현을 변화시키거나 또는 전체 단백질 코딩 영역이 이용할 수 없거나 또는 클론되지 않는 유전자를 변화시키는데 특히 유용하다. 이와 같이, 상기에 설명된 DNA 구성물은 정확하게 전사 유니트를 정의하고, 외인성 조절 성분 및 궁극적으로 내인성 유전자의 관련 위치화에서 가용성을 제공하고, 치료상 관심이 되는 유전의 발현을 얻고 조절하기 위한 매우 조절된 계를 가능하게 하는 방식으로 내인성 유전자에 외인성 조절 성분을 효과적으로 링크시키는데 유용하다.
실시예의 설명
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 DNA가 일차, 이차 또는 불멸화된 척추동물 세포와 같은 세포에 도입될 수 있고, 상동 재조합에 의하여 형질전환된 세포들의 게놈에 통합될 수 있음을 증명하였다. 본 발명자들은 또한 외인성, DNA가 상동 재조합체(HR) 세포에서 원하는 기능을 가지며 정확하게 표적화된 세포들이 적절하게 표적화된 DNA에 의해 부여된 검출가능한 표현형을 토대로 확인될 수 있음을 증명하였다.
본 발명자들은 사람 게놈에서 특정 위치(HPRT 위치)에 표적화시키는데 유용한 플라스미드가 구성 및 약체 내성 표현형에 기초로 하는 선택화를 설명하고있다(실시예 1a). 상기 플라스미드는 pE3Neo로 지정되고, HPRT 위치에서 세포 게놈내로 상기 플라스미드의 통합으로 hprt 6-TG 내성 표현형을 가지고, 또한 G418 내성인 세포를 생성한다. 설명된 바와 같이, 본 출원인은 HPRT 유전자의 엑손 3내에서 생성된 세포내로 도입된 DNA의 국소화를 증명함으로써, 생성된 사람 섬유아세포주에서 유전자 표적화에 부합되는 pE3Neo 작용을 제시한다 (실시예 1b).
부가적으로, 본 출원인은 pE3Neo를 사용하여 일차 및 이차 사람 피부 섬유아세포에서의 유전자 표적화를 증명한다(실시예 1c). 추가로 본 출원은 DNA 종결부의 변형이 게놈 DNA내로 DNA의 표적화를 증가시키는 것을 증명한다(실시예 1c 및 1e). 또한 본 출원인은 유전자가 유전자 표적화에 의해 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포와 같은 세포의 게놈에서의 예정된 부위에서 삽입될 수 있는 방법을 설명한다 (실시예 1d).
또한, 본 발명은 형질전환된 세포들을 사용하는 단백질 제조방법에 관한 것이다. 방법은 일차, 일차 또는 불멸화된 세포들과 같은 세포들을 치료 생성물을 코딩하는 내인성 유전자를 표적화시키기에 충분한 DNA 또는 치료용 생성물을 코딩하는 외인성 DNA로 형질전환시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 실시예 1g, 1j, 1k, 2, 3, 4 및 6-9는 내인성 유전자의 발현을 변화시키는 DNA 서열 성분으로 선택된 내인성 유전자를 표적화시킴으로써 단백질을 생성하는 방법을 설명한다.
본 발명자들은 또한, 유전자 표적화에 의해 활성화된 내인성 세포 유전자를 증폭시키기 위한 DNA 구성물 및 방법을 기술한다(실시예 3, 6, 8 및 9).
실시예 1f-1h, 2, 4 및 6은 사람 EPO 유전자의 상류에 있는 정상적인 조절서열이 형질전환되지 않은 상태에서 검출가능한 양으로 EPO를 발현하지 않는 일차 또는는 이차 섬유아세포 스트레인에서의 hEPO의 발현을 가능하게 하기 위해 변형되는 구체예를 예시한다. 한 구체예에서 표적화의 생성물은 정상적인 EPO 단백질을 손상없이 유지시키나, 마우스의 메탈티오네인 프로모터의 제어하에 놓이게 한다. 실시예 1i 및 1j는 일차 또는 이차 사람 섬유아세포에서 내인성 성장 호르몬 유전자를 활성화시키기 위해 유사한 표적화 구성물을 사용하는 것을 증명한다. 사람 섬유아세포에서의 EPO 발현을 활성화시키기 위하여 설명된 다른 구체예에서, 표적화 사건의 생성물은 사람 성장 호르몬 유전자의 첫번째 엑손이 EPO 엑손 2-5의 상류에 위치한 키메라 전사 유니트이다. 전사(마우스의 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에 있음), 스플라이싱, 및 번역의 생성물은 hEPO 시그널 펩티드의 아미노산 1-4가 hGH의 아미노산 잔기 1-3으로 대체되어 있는 단백질이다. 이 단백질의 키메라 부분인 시그널 펩티드는 세포로부터 분비되기 전에 제거된다. 실시예 5는 유전자(인트론이 있음)를 그 유전자의 발현가능한 cDNA 복사체(인트론이 없음)로 전환시키고 그러한 발현가능한 CDNA 분자를 미생물(예컨대, 효모 또는 박테리아) 세포에서 회수하는 세포들을 제조하기 위한 표적화 구성물 및 방법을 설명한다. 실시예 6은dhfr유전자가 증폭되는 세포들의 이중 선택 및 선택을 위해 pREPO4 로 표시되는 표적화 벡터의 구성을 설명한다. 플라스미드 pREPO4 는 상동 재조합에 의해 내인성 hEPO 유전자의 활성화 후에 HT1080 세포(불멸화된 사람 세포주)에서 사람 EPO(hEFO) 유전자좌를 증폭시키기 위해 사용되었다. 설명된 바와 같이, 메토트렉세이트-함유 배지에서의 단계식 선택은 0.4μM의 메토트렉세이트에 대해 내성인 세포에서의 hEPO의생성을 70배 증가시켰다.
실시예 7 및 8은 정상 EPO 프로모터의 조절 서열 상류를 삽입하는 방법 및 상기 구성물을 사용하여 EPO를 생성하기 위한 방법을 설명한다. 부가적으로, 실시예 8은 실시예 7의 방법에 의해 생성되는 표적화된 EPO 유전자의 증폭을 설명한다. 실시예 9는 사람 α-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 및 FSHβ 유전자를 표적화하여 단백질 생성에 유용한 세포를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
실시예들은 표적 유전자들의 단백질 코딩영역에 대한 조작 또는 다른 사용을 필요로 하지 않는 유전자 표적화에 의하여 내인성 유전자를 활성화하기 위한 또는 활성화하고 증폭시키기 위한 방법들을 제공한다. 당업자에게 자명한 본 명세서에서 지시된 방법 및 DNA 구성물 또는 플라스미드 또는 이것들의 변형을 사용하여, 유전자 발현은시험관내단백질 생성 방법(예컨대, 약제학적 방법) 또는생체내단백질 전달 방법(예컨대, 유전자 치료법)에 바람직한 성질을 가지는 세포내에서 변경될 수 있다. 제 5도 및 6도는 전사적으로 hEPO 유전자를 활성화시키기 위한 2가지의 스트래티지를 예시한다.
본원에 기재된 방법들 및 DNA 구성물 또는 플리스미드 또는 당업자에게 명백한 그것들의 변형을 사용하여, 치료 생성물(예컨대 단백질, 리보자임, 안티-센스 RNA)을 코딩하는 외인성 DNA 는 척추동물(예컨대 사람 및 비사람을 포함하는 포유동물) 일차 또는 일차 세포에 예정된 부위에서 삽입될 수 있다.
본 발명을 이제 어떠한 방식으로든 제한하려는 의도가 없는 하기의 실시예에 의하여 예시하기로 한다.
실시예
실시예 1. 유전자 표적화에 의한 형질전환된 셀 스트레인의 제조
유전자 표적화는 형질전환용 DNA가 염색체 DNA 서열안으로 통합되거나 또는 상동 재조합 사건을 통해 부분적으로 염색체 DNA 서열을 대체시킬 때 일어난다. 그러한 사건은 어떠한 주어진 형질전환 실험의 과정중에 일어날 수 있는 한편, 그것들은 통상적으로 비동종의, 또는 변칙의 재조합에 의해 플라스미드 DNA가 통합되는 사건의 막대한 양에 의해 차단된다.
a.사람 세포에서 유전자 표적화 사건의 선택에 유용한 구성물의 생성
표적화된 사건을 선택하기 위한 한가지 접근법은 표적화 DNA의 통합에 기인하는 유전자 기능의 손실에 대한 유전자 선택에 의한 것이다. 사람 HPRT 유전자좌는 효소 히포크산틴-포스포리보실 트란스페라제를 코딩한다. hprt-세포는 누클레오시드 유사체인 6-티오구아닌(6-TG)을 함유하는 배지에서의 성장에 의하여 선택된다 : 야생형(HPRT+) 대립형질을 가지고 있는 세포들은 6-TG에 의해 죽는 한편, 돌연변이(hprt-) 대립형질을 가지고 있는 세포들은 생존할 수 있다. HPRT 유전자 기능을 파괴하는 표적화된 사건을 은닉하고 있는 세포들은 그러므로 6-TG 배지에서 선택가능하다.
HPRT 유전자좌에 대해 표적화하기 위한 플라스미드를 구성하기 위하여, HPRT 서열의 위치 11,960에서 18,869까지 뻗어 있고 HPRT 유전자의 엑손 2 와 3 을 포함하는 6.9kb 의 HindIII 단편을 pUC12 의 HindIII 주위에 하위클론하였다. 그 결과의 클론을 HPRT 유전자 단편의 엑손 3에 있는 유일한 XhoI 부위에서 절단하고, PMC1Neo (Stratagene)로부터의 neo 유전자를 함유하고 있는 1.1kb 의 SalI-XhoI 단편을 삽입시켜서 엑손 3의 코팅서열을 파괴하였다. HPRT의 전사방향과 반대되는 neo 전사의 방향을 가지는 한 배향을 선택하여 pE3Neo 로 표시한다. 정상적인 HPRT 엑손 3 을 neo 가 파괴된 버젼으로 대체시키는 것은 hprt-, 6-TG 내성 표현형을 초래할 것이다. 그러한 세포는 또한 G418 내성일 것이다.
b.수립된 사람 섬유아세포 세포주에서의 유전자 표적화
불멸화된 세포주에서의 표적화를 증명하기 위하여, 및 유전자 표적화에서 적절하게 기능하는 pE3Neo를 수립하기 위하여, 사람 섬유아세포 세포주 HT1080 (ATCC CCL 121)을 일렉트로포레이션에 의하여 pE3Neo로 형질전환시켰다.
HT1080 세포를 일렉트로포레이션전에 15%의 소혈청(Hyclone)이 첨가된 HAT(히포크산틴/아미노프테린/크산틴) 보충 DMEM중에 유지시켰다. 일렉트로포레이션 2일 전에 세포들을 아미노프테린이 없는 동일 배지에 옮겼다. 지수적으로 성장하는 세포들을 트립신으로 처리하고, DMEM/15% 소혈청으로 희석하여 원심분리한 후, PBS(인산염 완충 식염수)에 최종 세포부피를 13.3백만 세포/㎖로 재현탁시켰다. pE3Neo 를 HindIII 로 절단하고, pUC12 골격으로부터 8kb 의 HPRT-neo 단편을 분리한 후, 페놀 추출 및 알코올 침전에 의해 정제한 다음 600㎍/㎖ 의 농도로 재현탁시켰다. 일렉트로포레이션 큐빗(0.4cm 전극 갭 ; Bio-Rad Laboratories)에 50㎕(30㎍)을 750㎕ 의 세포 현탁액(일천만 세포)과 함께 첨가하였다. 일렉트로포레이션은450 볼트에서, 250㎌(Bio-Rad Gene Pulser; Bio-Rad Laboratories)에서 수행하였다. 큐빗의 내용물을 15% 의 소혈청이 첨가된 DMEM 에 즉시 첨가하여 25㎖ 의 배지당 일백만 세포의 세포의 현탁액을 만들었다. 처리된 세포 현탁액 25㎖ 을 150mm 직경의 조직배양 디쉬위에 플레이팅하여 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간후에 G418 용액을 직접 플레이트에 첨가하여 최종 농도를 800㎍/㎖ G418로 만들었다. 5일 후, 배지를 DMEM/15% 소혈청/800㎍/㎖ G418 및 10μM 6-티오구아닌으로 교체하였다. G418 및 6-TG에 대해 내성인 콜로니들을 이중 선택을 개시시킨 후 실린더 14-16을 클로닝하여 취하였다.
HT1080 세포에서 5회의 대표적인 표적화 실험의 결과를 하기 표 1에 나타낸다.
표 1
형질전환 5 의 경우, G418 콜로니의 전체 수율을 측정하기 위해 디자인된 대조 플레이트는 33,700 G418r콜로니들이 초기의 1×107의 처리된 세포로부터 생성될 수 있음을 나타냈다. 그러므로, 표적화된 사건 대 표적화되지 않은 사건의 비율은 66/33,700 또는 1 대 510이다. 조합한 5회의 실험에서, 표적화된 사건들은 3.6×106의 빈도로, 또는 처리된 세포의 0.00036%로 일어난다.
neo 및 HPRT 유전자로부터 유도된 프로브를 사용하는 제한 효소 및 서던 혼성화 실험은 HPRT 엑손 3 내의 예정된 부위에 HPRT 유전자좌에 대한 neo 유전자가 위치하는 것을 보여준다.
c.일차 및 이차 사람 피부 섬유아세포에서의 유전자 표적화
pE3Neo 를 HindIII 로 절단하고, pUC12 골격으로부터 8kb 의 HPRT-neo 단편을 분리한 다음, 페놀추출 및 알코올 침전에 의해 정제하였다. DNA 를 2mg/㎖ 로 재현탁시켰다. 0.5㎖의 부피내에 있는 3백만 개의 이차 사람 피부 섬유아세포들을 250 볼트 및 960㎌에서, 100㎍의 HindIII pE3Neo와 함께 일렉트로포레이션시켰다.총 9백만개의 처리된 세포에 대하여 3회의 별도의 형질전환을 수행하였다. 세포들을 프로세싱하고 G418 내성에 대해 선택하였다. 150mm의 배양 디쉬당 500,000개의 세포를 G418 선택을 위해 플레이팅하였다. 선택중인 10일 후, 배양 배지를 400㎍/㎖의 G418 및 10μM의 6-TG 를 함유하는 사람 섬유아세포 영양 배치로 교체시켰다. 두가지의 약물조합을 사용한 선택을 10일 동안 계속하였다. 플레이트를 현미경에 의해 조사하여 두가지 약물에 대해 내성인 사람 섬유 아세포 콜로니들을 정위시켰다. G418rt-TGr콜로니들의 분획은 9백만개의 처리된 세포당 4이다. 이들 콜로니들은 콜로니를 형성할 수 있는 모든 세포의 0.0001% (또는 백만분의 일)를 구성한다. G418r콜로니의 전체 수율을 측정하기 위하여 디자인된 대조 플레이트는 9×106개의처리전 세포로부터 2,850개의 G418r콜로니가 생성될 수 있음을 나타냈다. 그러므로, 표적화된 사건 대 표적화되지 않은 사건의 비율은 4/2,850, 또는 1 대 712이다. neo 및 HPRT 유전자로부터 유도된 프로브를 사용하는 제한 효소 및 서던 혼성화를 HPRT 엑손 3내의 예정된 부위에 HPRT 유전자좌에 대한 neo 유전자를 정위시키고 표적화가 이들 4가지의 클론 세포 스트레인에서 일어났음을 증명하기 위해 사용하였다. 두가지 약물에 대하여 내성인 콜로니들을 또한 일차 세포를 형질전환함으로써 단리하였다(1/3.0×107).
여러개의 pE3Neo 표적화 실험의 결과를 하기 표 2에 요약한다. HindIII 소화된 pE3Neo를 직접 형질전환시키거나 또는 엑소누클레아제 III로 처리하여 형질전환전에 5' 단일 가닥의 돌출부를 생성하였다(실시예 1c). 길이가 175에서 930 염기쌍까지 뻗어 있는 단일 가닥 영역을 가지고 있는 DNA 제제를 시험하였다. HindIII 단독을 사용하여 절단된 pE3Neo를 사용하여, HPRT 유전자좌에서neo유전자가 표적화되어 삽입되어 있는 콜로니를 제한 효소 및 서던 혼성화 분석에 의하여 1/799개의 C418-내성 콜로니를 확인하였다(총 24개의 표적화된 콜로니를 단리하였다). 175bp의 돌출부를 사용하였을 때 표적화는 최대로 자극되었고(대략 10배), 이때 제한 단편을 나타내는 1/80 G418r콜로니가 HPRT에서의 표적화에 대해 진단적이다(총 9개의 표적화된 클론을 단리하였다). 그러므로, 본원에 기재된 조건 및 재조합 DNA 구성물을 사용하여, 표적화는 사람 섬유아세포에서 쉽게 관찰할 수 있고, 전체적인 표적화 빈도(G418-내성에 대해 안정하게 형질전환된 클론의 총수에 의해 나누어진 표적화된 클론의 수)는 실시예 1e에 기재되는 방법에 의해, 단일 가닥의 돌출된 꼬리를 함유하는 표적화 구성물로 형질전환함으로써 자극될 수 있다.
표 2
사람 섬유아세포에서 HPRT 유전자좌에 대한 표적화
d.사람 게놈안으로의 치료적 관심의 유전자의 표적화된 삽입을 위한 구성물의 제조 및 그것을 유전자 표적화에 사용하는 방법
치료적 관심의 유전자가 neo 유전자에 인접하여 또는 그 가까이에 있는 HPRT 코딩영역내에 삽입되어 있는 pE3Neo의 변이체를 수용체 일차 또는 일차 세포 게놈의 특이한 위치에 치료적 관심의 유전자를 표적화하는데 사용할 수 있다. pE3Neo는 hGH 유전자를 HPRT 유전자좌에 표적화하기 위하여 구성할 수 있다.
pXGH5 (제 1도에 개략적으로 도시됨)를 EcoEI으로 소화시키고, hGH 유전자를 함유하고 마우스 메탈로티오네인(mMT) 프로모터와 결합되어 있는 4.1kb 단편을 단리했다. EcoRI 돌출부를 대장균 DNA 중합효소로부터의 클레노우 단편으로 채웠다. 별도로, pE3Neo 를 neo 단편과 HPRT 엑손 3 의 결합부분을 절단하는 XhoI 으로 소화시킨다(엑손 3으로의 삽입을 위한 3' 결합부). 선형화된 플라스미드의 XhoI 돌출 단부를 대장균 DNA 중합효소로부터의 클레노우 단편으로 채운 후, 그 결과의 단편을 4.1kb의 블런트-단부의 hGH-mMT 단편에 결찰시킨다. 결찰 혼합물로부터 유도된 박테리아 콜로니들을 제한효소 분석에 의하여 hGH-mMT 단편의 단일 복사체 삽입에 대하여 스크리닝하여 hGH 유전자가 neo 유전자와 동일한 방향으로 전사되어 있는 한 배향을 선택하여, PE3Neo/hGH 로 표시했다. pE3Ne/hGH 를 HindIII로 절단시키고, HPRT, neo 및 mMT-hGH 서열을 함유하고 있는 12kb 단편을 절출시켰다. 절단된 DNA를 실시예 1c에서 설명한 바와 같이 처리하고 일차 또는 이차 사람 섬유아세포내로 형질전환시켰다. G418r콜로니들을 선택하여 실시예 1c에서 설명한 바와 같이 HPRT 유전자 안으로의 표적화된 mMT-hGH 및 neo 서열의 삽입에 대하여 분석했다. 개개의 콜로니들을 상업적으로 활용되는 면역검정 (Nichols Institute)을 사용하여 hGH 발현에 대하여 검정했다.
일차 사람 섬유아세포들을 pE3Neo/hGH로 형질전환시키고 티오구아닌-내성 콜로니들을 안정한 hGH 발현에 대하여 및 제한효소 및 서던 혼성화에 의하여 분석하였다. 분석한 13개의 TGr콜로니들중에서 내인성 HPRT 유전자좌 안에 hGH 유전자가 삽입되어 있는 8개의 콜로니들을 확인하였다. 8개의 모든 스트레인들은 상당량의 hGH를 안정하게 발현하였는데, 평균 발현 수준은 24시간당 22.7㎍/106세포였다.
세포의 게놈 DNA의 특이한 위치에 치료적 관심의 유전자를 표적화하기 위하여 상동 재조합을 사용하는 것은, 증폭된 복사수의 유전자를 함유하고 있는 세포들이 적절한 약물 선택요법에 대한 세포들의 노출에 의하여 선택될 수 있는 유전자의 삽입에 의해 치료목적에 대해서까지 확장될 수 있으며, 보다 유용하게 그 목적을위해 만들어질 수 있다. 예를 들면, pE3Neo/hGH(실시예 1d)는dhfg, ada,또는 CAD 유전자를 pE3Neo/hGH의 hGH 또는neo유전자 바로 가까이에 있는 위치에 삽입시킴으로써 변형될 수 있다. 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들은 그러한 플라스미드로 형질전환시키고, 정확하게 표적화된 사건을 확인한다. 이들 세포들을 또한 증폭된 유전자를 함유하고 있는 세포들의 선택에 적절한 약물의 증가하는 농도로 처리한다(dhfr의 경우에 선택제는 메토트렉세이트이며, CAD의 경우 선택제는 N-(포스폰아세틸)-L-아스파테이트(PALA)이고,ada의 경우 선택제는 아데닌 누클레오시드(예컨대 알라노신)이다). 이런 방식으로 치료적 관심의 유전자의 통합은 그것의 증폭된 복사체가 선택되는 유전자와 함께 증폭될 것이다. 그러므로, 치료용도로 유전자를 생성하기 위한 세포의 유전자 공학은 표적화 구성물이 통합되고 증폭된 복사체들이 증폭된 세포에 잔류하는 부위를 예정함으로써 쉽게 조절될 수 있다.
e.표적화를 증가시키기 위한 DNA 말단의 변형
여러 계통의 증거들은 3'-돌출 단부가 대장균, 박테리오파지, 사카로마이세스 세르비재 ( S. cervisiae ) 및 제노푸스 라에비스 ( Xenopus laevis )의 특정 동족재조합 경로에 포함된다는 것을 시사한다. 제노푸스 라에비스 난모세포에서, 수백 염기쌍의 길이를 갖는 3'-돌출부를 지닌 분자들은 제한효소 소화에 의하여 생성된 매우 짧은 돌출부(4bp)를 가지고 있는 분자들보다 훨씬 더 빠르게 마이크로 주입후 훨씬 더 빠르게 유사하게 처리된 분자들과 상동 재조합을 진행한다. 효모에서, 수백 염기쌍의 길이를 갖는 3'-돌출단부의 생성은 유사분열 재조합에서 속도제한 단계인 것 같다. 사람 세포에서 재조합에 3'-돌출 단부가 포함된다는 증거는 아직 보고된 바 없으며, 어떠한 짧은 길이의 변형된 DNA 기질이 모든 종에서 표적화(상동 재조합의 한가지 형태)를 촉진하는 것으로 보이지는 않는다. 다음 실시예 및 실시예 1c에서 설명되는 실험은 5'-돌출 단부가 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유 아세포에서 표적화를 자극하기에 효과 적임을 시사한다.
형질전환용 DNA 분자의 단부를 변형시킴으로써 표적화가 증가된다는 것에 대해 보고된 것은 없었다. 이 실시예는 분자의 말단을 이중 가닥의 형태로부터 단일 가닥의 형태로 전환시킴에 의해 선형 DNA 분자의 단부들을 변형시키는 것은 일차 및 이차 사람 섬유아세포의 게놈 안으로의 표적화를 자극할 수 있다.
1100㎍의 플라스미드 pE3Neo (실시예 1a)를 HindIII 로 소화시켰다. 이 DNA는 페놀 추출 및 알코올 침전 후에 직접 사용할 수 있고, 또는 HPRT 및 neo 유전자만을 함유하는 8kb의 HindIII 단편을 겔 전기영동에 의하여 pUC12 벡터 서열로부터 분리할 수 있다. HindIII로 소화된 DNA를 ExoIII로 소화시키면, 각각의 자유로운 3' 단부에서 시작하여 5'-돌출 단부를 남기는 각 단부에서의 집중적인 엑소누클레오라이틱 소화가 유발된다. 엑소누클레오라이틱 작용의 크기 및 그 결과 생성되는 5'-돌출부의 길이는 ExoIII 소화의 시간을 변화시킴으로써 조절할 수 있다. HindIII로 소화된 pE3Neo 100㎍을 ExoIII으로 소화시키는 것은 제조업자가 권고하는 조건에 따라 30초, 1분, 1.5분, 2분, 2.5분, 3분, 3.5분, 4분, 4.5분, 및 5분동안 수행하였다. 소화 정도를 모니터링하기 위하여, ExoIII 처리된 DNA 1㎍을 함유하는 각 시간점으로부터의 일정액을 공급입자에 의해 제시된 조건하에서 녹두 누클레아제(Promega)로 처리하고, 샘플을 겔 전기영도에 의하여 분획화하였다. 처리되지 않은 HindIII 소화된 pE3Neo와 ExoIII 및 녹두의 누클레아제로 처리한 동일 분자의 크기의 차이를 측정했다. 이 크기의 차이를 2로 나누면 분자의 각 단부에서 5'쪽으로 돌출하는 부분의 평균 길이가 얻어진다. 상술한 시간점 및 30℃에서의 소화를 사용하여 생성된 5'-돌출부는 100 내지 1,000 염기의 범위여야 한다.
각 시간점으로부터의 ExoIII 소화된 DNA 60㎍ (pE3Neo의 총 HindIII 소화물)을 정제하여 실시예 1c에서 기재한 조건하에서 일차, 일차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포에 일렉트로포레이션시켰다. 각각의 ExoIII 처리된 제제에 의해 표적화가 증가되는 정도는 G418r6-TGr콜로니의 수를 계수하고, 이 수를 ExoIII 으로 처리하지 않은 HindIII 소화된 pE3Neo를 이용한 표적화와 비교함으로써 정량화했다.
3'-돌출 단부의 효과는 또한 유사한 시스템을 사용하여 정량화할 수 있다. 이 경우에 HindIII 소화된 pE3Neo는 공급자가 제시하는 조건하에서 변화되는 시간간격동안 박테리오파지 T7 유전자 6 엑소누클레아제(United States Biochemicals)로 처리하였다. 소화 정도의 측정(단부당 생성되는 3'-돌출부의 평균 길이) 및 일렉트로포레이션의 조건은 ExoIII으로 처리된 DNA에 대해 설명한 것과 같다. 각각의 T7 유전자 6 엑소누클레아제로 처리된 제조물에 의해 표적화가 증가되는 정도는 G418r6-TGr콜로니의 수를 계수하고, 이 수를 T7 6 유전자 6 엑소누클레아제로 처리하지 않은 HindIII 소화된 pE3Neo를 이용한 표적화와 비교함으로써 정량화한다.
5' 및 3' 돌출 단부를 생성하기 위한 다른 방법들도 가능한데, 예를 들면 상호 부분적으로 중복되는 2개의 선형 분자들의 변성 및 아닐링은 각각이 양 단부에 3'-돌출 단부 또는 5'-돌출 단부를 가지고 있는 분자들의 혼합물 뿐만 아니라, 출발 선형 분자들과 구별되지 않는 재아닐링된 단편들을 생성할 것이다. 돌출부의 길이는 2개이 DNA 단편 사이에 공통적이지 않는 DNA의 길이에 의해 측정했다.
f.일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포에서 마우스의 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에 사람 에리트로포이에틴 유전자를 배치하기 위한 표적화 플라스미드의 구성
다음 기술하는 본 발명의 한 구체예에서, 사람 에리트로포이에틴(hEPO)을 (수득되는 바에 따르면) 상당량으로 발현시키지 않는 일차 또는 불멸화된 사람 섬 유아세포가 사람 에리트로포이에틴을 발현할 수 있도록, hEPO 유전자 상류의 정상의 음성 및 양성 조절 서열이 변형된다.
사람 EPO 코딩영역의 상류에 집중적으로 놓여 있는 영역은 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 이 목적에 유용한 3개 세트의 프라이머를 공개된 사람 EPO 서열의 분석후에 디자인하였다[Genbank designation HUMERPA; Lin, F-K.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 7580-7584 (1985)]. 이들 프라이머들은 609, 603, 또는 590bp의 단편을 증폭시킬 수 있다.
표 3
3개의 단편은 실질적으로 중복하였고, 본 목적에 대해 상호 교환가능하다. 번역 개시 부위(HUMERA 누클레오티드 위치 2 에서 610)에 대하여 -623 에서 -14 까지 뻗어 있는 609bp의 단편을 ClaI 링커를 사용하여 양 단부에 결찰시켰다. 그 결과, 형성된 ClaI-결합된 단편을 ClaI으로 소화시켜서 HUMERA 누크레오티드 위치 610이 플라스미드 폴리링커의 SalI 부위에 인접하도록 하는 배향으로 p블루스크립트IISK/+(Stratagene)의 ClaI 부위에 삽입시켰다. 이 플라스미드, p5'EPO를 EPO 상류 단편의 유일한 FspI 또는 SfiI 부위(각각 HUMERA 누클레오티드 위치 150 및 405)에서 별도로 절단하여, 마우스의 메탈로티오네인 프로모터에 결찰시켰다. 전형적으로, mMT-I 유전자로부터의 8kb 의 EcoRI-BglII 단편[mMT 코딩서열을 함유하지 않음 ; Hamer, D. H. and Walling M.,J. Mol. Appl. Gen. 1. 273-288 (1982) ; 이단편은 또한 젠뱅크로부터 활용가능한 mMT 서열들 ; 즉, MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM의 분석으로부터 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 마우스의 게놈 DNA로부터 공지방법에 의하여 단리될 수 있다]을 공지방법에 의하여 블런트 단부로 만들고, SfiI 소화된(이것 또한 블런트 단부로 만든다), 또는 FspI 소화된 p5'EPO 와 결찰시켰다. 그 결과 생성되는 클론의 배향을 분석하고 전자의 mMT BglII 부위가 플라스미드 폴리링커의 SalI 부위에 근접하여 있는 것들을 일차 및 이차 사람 섬유아세포를 표적화하기 위해 사용한다. 이 배향은 mMT 전사가 최종 구성물에서 HUMERA 누클레오티드 위치 610을 향하도록 특정한다. 그 결과 생성되는 플라스미드를 FspI 및 SfiI 부위에 삽입되어 있는 mMT에 대하여 각각 p5'EPO-mMT 및 p5'EPO-mMTS로 표시한다.
추가의 상류서열은 최종 표적서열의 상류에 놓여 있는 음성 조절 성분 또는 인핸서를 변형, 증가 및/또는 대체하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. EPO의 경우, 간외에서 및 신장외에서 EPO 발현을 억제하는 음성 조절 성분[Semenza, G. L.et al.,Mol. Cell Biol. 10: 930-938 (1990)]이 결실될 수 있다. 6kb 단편내에 일련의 결실이 제조된다. 결실된 영역은 광범위한 숙주세포 활성을 가지는 인핸서[예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 인핸서]로 대체될 수 있다.
p블루스크립트IISK/+벡터의 609bp의 5'EPO 단편의 배향을 선택하였는데, 왜냐하면 HUMERA 서열이 BamHI (원위) HindIII 부위 (근위)에 의해 그것들의 5'상에서 진행되기 때문이다. 그러므로, 609bp 단편[Semenza, G. L.et al.,Mol. Cell Biol. 10: 930-938 (1990)]의 상류에 정상적으로 놓여 있는 6kb 의 BamHI-HindIII단편을 공지방법에 의하여 게놈 DNA로부터 단리할 수 있다. 예를 들면, 박테리오파지, 코스미드, 또는 효모 인공 염색체 라이브러리는 프로브로서 609bp의 PCR 증폭 단편으로 스크리닝될 수 있다. 원하는 클론은 6kb의 BamHI-HindIII 단편을 가질 것이며, 그것의 확인은 공지방법에 의하여 측정된 사람 EPO 유전자에 대한 제한 지도로부터의 제한 지도를 비교함으로써 확인될 수 있다. 또는 달리, 프로브로 609bp의 단편을 사용하여 EPO 유전자의 상류에 있는 사람 게놈의 제한 지도를 작성함으로써 HUMERA 배위 2와 609 사이에서 기원하여 상류의 BamHI 부위를 지나 뻗어 있는 단편을 생성하는 효소들을 확인할 수 있다. 이 단편은 전기영동에 의하여 사람 게놈 DNA 의 적절한 소화물로부터 단리될 수 있고, 박테리아 또는 효모 클로닝 벡터안에 결찰될 수 있다. 정확한 클론은 609bp의 5'EPO 프로프에 혼성화할 것이고, 6kb 의 BamHI-HindIII 단편을 함유할 것이다. 단리된 6kb의 단편을 적절한 배향으로 p5'EPO, p5'EPO-mMTF, 또는 p5'EPO-mMTS에 HindIII 부위가 HUMERA 누클레오티드 위치 2에 인접하도록 삽입시킨다. 추가의 상류서열을 염색체 워킹 기업을 사용하여, 또는 609bp의 5'EPO 프로브에 혼성화하는 효모 인공 염색체를 분리함에 의한 공지 방법들에 의해 단리될 수 있다.
상술된 클로닝 방법은 EFO의 상류에 있는 서열이 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포의 후속되는 표적화된 형질전환을 위해 시험관내에서 변형되는 것을 가능하게 한다. 상기 방법은 mMT 프로모터의 간단한 삽입뿐만이 아니라 음성조절영역의 결실, 및 음성 조절영역의 결실과 광범위한 숙주세포 활성을 가지고 있는 인핸서로의 대체를 설명한다.
g.사람 EPO 유전자의 활성화 및 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 스크리닝에 의한 단리
표적화를 위하여, 플라스미드를 플라스미드 골격으로부터의 삽입을 자유롭게 하는 제한효소들로 절단했다. p5'EPO-mMTS의 경우, HindIII 및 SalI 소화는 사람 EPO 유전자의 조절영역에 대하여 구성물을 표적화하기 위하여 DNA의 각각 405bp 및 204 염기쌍에 의하여 5'쪽과 3'쪽이 플랭킹되는 1.8kb의 mMT 프로모터로 구성된 2.4kb의 표적화 단편을 방출시켰다. 이 DNA 또는 2.4kb 표적화 단편을 단독으로 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의하여 정제하고, 실시예 1c 에 기재된 조건하에서 일차 또는 일차 사람 섬유아세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포들을 사람 섬유아세포 영양 배지중에서 150mm 디쉬상에 플레이팅했다. 48 시간후에 세포를 24 웰디시 위에 10,000 세포/㎠의 밀도(대략 웰당 20,000 세포 ; 만약 표적화가 106개의 클론가능한 세포당 1 사건의 비율로 일어난다면(실시예 1c) 약 50 웰이 단일한 발현 콜로니를 단리하기 위해 검정될 필요가 있을 것이다]로 플레이팅했다. DNA 형질전환이 사람 EPO의 상류에 있는 상동성 영역에 표적화되어 있는 세포들은 mMT 프로모터의 제어하에 hEPO를 발현할 것이다. 10일 후, 전체 웰 상층액을 시판중인 면역검정용 기트(Amgen)를 사용하여 EPO 발현에 대해 검정했다. hEPO 합성을 나타내는 웰로부티의 클론들을 공지의 방법을 사용하여, 전형적으로 개별적인 웰 또는 플레이트로 분리된 세포들의 이종 군집의 분획을 검정하고, 이들 양성 웰들의 분획을 검정하며, 필요에 따라 반복하고, 궁극적으로는 웰당 한 세포로 시드된 96-웰 미소적정플레이트를 스크리닝함으로써 표적화된 콜로니를 분리함에 의해 단리했다. 전체 플레이트 용해물로부터의 DNA는 또한 HUMERA 누클레오티드 위치 1의 상류에 있는 프라이머와 결합된 mMT 특이한 프라이머를 사용하여 단편의 증폭을 위한 PCR에 의해 분석할 수 있다, 이 프라이머 쌍은 DNA 서열을 토대로 정확하게 예상되는 크기의 DNA 단편을 증폭시켜야 한다. 양성 플레이트는 트립신으로 처리하고, 계속해서 더 낮은 희석률로 재플레이팅하며, DNA 제조 및 PCR 단계들을 표적화된 세포를 단리하기에 필요한만큼 반복했다.
본원에 설명된 표적화 방법은 또한 종래의 약제학적 전달을 위해 hGH를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080(ATCC CCL 121), HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체(ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), MCF-7 유방암 세포(ATCC HTB 22), K-562 백혈병 세포(ATCC CCL 232), KB 암종 세포(ATCC CCL 17), 2780AD 난소 암종 세포[Van der Bliek, A. M.et al.,Cancer Res. 48: 5927-5932 (1988)], 라지 세포(ATCC CCL 86), 주르캐트 세포(ATCC TIB 152), 나말와 세포(ATCC CRL 1432), HL-60 세포(ATCC CCL 240), 다우디 세포(ATCC CCL 213), RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155), U-937 세포(ATCC CRL 1593), 보우스 멜라노마 세포(ATCC CRL 9607), WI-38VA13 서브라인 2R4 세포(ATCC CLL 75.1), MOLT-4 세포(ATCC CRL 1582), 및 다양한 헤테로히브리도마 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
h.사람 EPO 유전자의 활성화 및 양성 또는 조합된 양성/음성 선택 시스템에 의한 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 단리
p5'EPO-mMTF, p5'EPO-mMTS, 및 추가로 상류의 6kb의 BamHI-HindIII 단편을 가지고 있는 상기 플라스미드들의 유도체를 구성하기 위한 방법은 mMT 프로모터에 인접한 neo 유전자를 삽입시키는 추가의 단계를 수반할 수 있다. 또한, 음성 선택 마아커, 예를 들면, gpt [PMSG(파마시아) 또는 다른 적절한 공급원으로부터]가 p블루스크립트IISK/+ 폴리링커의 HUMERA 서열에 인접하여 삽입될 수 있다. 전자의 경우에는, G418r콜로니들을 단리하여 PCR 증폭 또는 콜로니들의 푸울로부터 제조된 DNA의 제한 효소 및 서던 혼성화 분석에 의하여 스크리닝하여 표적화된 콜로니들을 확인한다. 후자의 경우에는, G418r콜로니들을 6-티오크산틴을 함유하고 있는 배지에 놓아 gpt 유전자의 통합에 대해 선택한다[Besnard, C.et al.,Mol. Cell Biol. 7: 4139-4144 (1987)]. 또한, HSV-TK 유전자는 gpt와 반대쪽에 삽입물에 놓일 수 있어서, 400㎍/㎖의 G418, 100μM의 6-티오크산틴, 및 25㎍/㎖ 의 간시클로비어를 함유하고 있는 사람 섬유아세포 영양 배지에서 성장시킴으로써 neo에 대하여 및 gpt 및 TK에 대하여 선택하는 것을 가능하게 한다. 이중 음성 선택은 진실한 표적화 사건에 대한 거의 절대적인 선택을 제공하여야 하고 서던 블롯 분석은 궁극적으로 확인을 제공한다.
본원에서 설명된 표적화 방법은 또한 종래의 약제학적 전달을 위해 hEPO를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080(ATCC CCL 121), HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체(ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), MCF-7 유방암 세포(ATCC HTB 22), K-562 백혈병 세포(ATCC CCL 232), KB 암종 세포(ATCC CCL17), 2780AD 난소 암종 세포[Van der Bliek, A. M.et al.,Cancer Res. 48: 5927-5932 (1988)], 라지 세포(ATCC CCL 86), 주르카트 세포(ATCC TIB 152), 나말와 세포(ATCC CRL 1432), HL-60 세포(ATCC CCL 240), 다우디 세포(ATCC CCL 213), RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155), U-937 세포(ATCC CRL 1593), 보우스 멜라노마 세포(ATCC CRL 9607), WI-38VA13 서브라인 2R4 세포(ATCC CLL 75.1), MOLT-4 세포(ATCC CRL 1582), 및 다양한 헤테로히브리도마 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
i.일차, 일차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포에서 마우스의 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에 사람 성장 호르몬 유전자를 놓기 위한 표적과 플라스미드의 구성
하기 실시예는 사람 성장 호르몬 유전자의 상류에 있는 정상적인 조절 서열이 일차, 이차 불멸화된 사람 섬유아세포에서 사람 성장 호르몬의 발현을 가능하게 하기 위해 변경되어 있는 본 발명의 한 구체예를 예시하기 위한 것이다.
EPO 유전자 조절영역을 표적화하기 위해 실시예 1f에서 설명한 것과 유사한표적화 분자들을 사람성장 호르몬 N 유전자의 5' 단부로부터 유도된 클론된 DNA 단편들을 사용하여 만들었다. HUMGHCSA (진뱅크 엔트리) 누클레오티드 위치 3787-5432에 있는 약 1.8kb 단편(2개의 EcoNI 부위의 위치는 클로닝 또는 상기 단편을 포함하는 하위 클론들의 진단적 소화를 위해 편리한 크기의 단편을 생성한다)을 상기 영역내에 있는 HUMGHCSA 서열의 분석에 의해 디자인된 PCR 프라이머에 의해 증폭시켰다, 이 영역은 hGH 유전자 N 인트론 1의 중간으로부터 번역 출발 부위에 대해 5'쪽으로 대략 1.5kb에 있는 상류 위치까지 뻗어 있다. pUC12를 EcoRI 및 BamHI으로 소화시키고, 클레노우를 사용하여 블런트 단부를 만든 후, 희석 조건하에서 재고리화하여 EcoRI 및 BamHI 부위들이 결실된 플라스미드를 만들었다. 이 플라스미드를 pUC12XEB로 표시했다. HindIII 링커를 증폭된 hGH 단편에 결찰시키고, 그 결과의 플라스미드를 HindIII로 소화시켜서 HindIII 소화된 pUC12XEB 에 결찰시켰다. 그 결과 생성되는 플라스미드, pUC12XEB- 5'hGH를 EcoRI 및 BamHI으로 소화시켜 hGH 전사 개시부위 바로 위에 놓여 있는 0.5kb 단편을 제거했다. 소화된 DNA를 mMT-I 유전자로부터의 8kb의 EcoRI-BglII 단편[mMT 코딩 서열을 함유하지 않음; Hamer, D. H. and Walling M.,J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982) ; 이 단편은 또한 젠뱅크로부터 활용가능한 mMT 서열들, 즉, MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM의 분석으로부터 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 마우스의 게놈 DNA로부터 공지방법에 의하여 단리될 수 있다]에 결찰시켰다. 이 플라스미드 p5'hGH-mMT는 상류의 hGH 서열들의 양 옆에 플랭킹된 mMT 프로모터를 갖는다.
상기 클로닝 방법은 hGH의 상류에 있는 서열이 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포의 후속되는 표적화된 형질전환을 위해 시험관내에서 변형되는 것을 가능하게 한다. 상기 방법은 mMT 프로모터의 간단한 삽입을 설명한다, 다른 방법, 예컨대 광범위한 숙주세포 특이성을 갖는 인핸서가 삽입된 mMT 서열의 상류에 삽입되는 것도 예측할 수 있다.
j.사람 hGH 유전자의 활성화 및 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 스크리닝에 의한 단리
표적화를 위하여, 플라스미드를 플라스미드 골격으로부터의 삽입을 자유롭게 하는 제한 효소들로 절단했다. 5'hGH-mMT의 경우, HindIII 소화는 hGH 유전자의 조절영역에 대하여 구성물을 표적화하기 위하여 DNA의 5'쪽과 3'쪽에 플랭킹되어 있는 1.8kb의 mMT 프로모터로 구성된 2.9kb의 표적화 단편을 방출시켰다. 이 DNA 또는 2.9kb 표적화 단편을 단독으로 페놀추출 및 에탄올 침전에 의하여 정제하고, 실시예 11에 기재된 조건하에서 일차 또는 이차 사람 섬유아세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포들을 사람 섬유아세포 영약배지 중에서 150mm 디쉬상에 플레이팅했다. 48시간 후 세포를 24 웰 디쉬 상에 10,000세포/㎠의 밀도(약 웰 당 20,000세포 ; 만약 표적화가 106개의 클론가능한 세포당 1 사건의 비율로 일어난다면(실시예 1c) 약 50 웰이 단일한 발현 콜로니를 단리하기 위해 검정될 필요가 있을 것이다]로 플레이팅했다. DNA 형질전환이 hGH 의 상류에 있는 상동성 영역에 표적화되어 있는 세포들은 mMT 프로모터의 제어하에 hGH를 발현할 것이다. 10일 후, 전체 웰 상층액을 시판중인 면역검정용 기트(Nichols)를 사용하여 hGH 발현에 대해 검정했다. hGH 합성을 나타내는 웰로부터의 클론들을 공지의 방법을 사용하여, 전형적으로 개별적인 웰 또는 플레이트로 분리된 세포들의 이종 군집의 분획을 검정하고, 이들 양성 웰들의 분획을 검정하고, 그리고 필요에 따라 반복하고, 궁극적으로는 웰당 한 세포로 시드된 96-웰 미소적정 플레이트를 스크리닝함으로써 표적화된 콜로니를 분리함에 의해 단리했다. 전체 플레이트 용해물로부터의 DNA는 또한 HUMGHCSA 누클레오티드 위치 5,432의 하류에 있는 프라이머와 결합된 mMT 특이한프라이머를 사용하여 단편의 증폭을 위한 PCR에 의해 분석할 수 있다. 이 프라이머 쌍은 DNA 서열을 토대로 정확하게 예상되는 크기의 DNA 단편을 증폭시켜야 한다. 양성 플레이트는 트립신으로 처리하고 계속해서 더 낮은 희석률로 재플레이팅하고, DNA 제조 및 PCR 단계들을 표적화된 세포를 단리하기에 필요한 만큼 반복했다.
본원에서 설명된 표적화 방법은 또한 종래의 약제학적 전달을 위해 hGH를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080(ATCC CCL 121), HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체(ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), MCF-7 유방암 세포(ATCC HTB 22), K-562 백혈병 세포(ATCC CCL 232), KB 암종 세포(ATCC CCL 17), 2780AD난소 암종 세포[Van der Bliek, A. M.et al.,Cancer Res. 48: 5927-5932 (1988)], 라지 세포(ATCC CCL 86), 주르카트 세포(ATCC TIB 152), 나말와 세포(ATCC CRL 1432), HL-60 세포(ATCC CCL 240), 다우디 세포(ATCC CCL 213), RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155), U-937 세포(ATCC CRL 1593), 보우스 멜라노마 세포(ATCC CRL 9607), WI-38VAl3 서브라인 2R4 세포(ATCC CLL 75.1), MOLT-4 세포(ATCC CRL 1582), 및 다양한 헤테로히브리도마 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
k.사람 hGH 유전자의 활성화 및 양성 또는 조합된 양성/음성 선택 시스템에 의한 표적환된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 단리
p5'hGH-mMT를 구성하기 위한 방법은 mMT 프로모터에 인접한 neo 유전자를 삽입시키는 추가의 단계를 수반할 수 있다. 또한, 음성 선택 마아커, 예를 들면 gpt[pMSG(파마시아) 또는 다른 적절한 공급원으로부터]가 pUC12 폴리링커의HUMGHCSA 서열에 인접하여 삽입될 수 있다. 전자의 경우, G418r콜리니들을 단리하여 PCR 증폭 또는 콜로니들의 푸울로부터 제조된 DNA의 제한 효소 및 서던 혼성화 분석에 의하여 스크리닝하여 표적화된 콜로니들을 확인한다. 후자의 경우, G418r콜로니들을 티오크산틴을 함유하는 배지에 놓아 gpt 유전자의 통합에 대해 선택한다[Besnard, C.et al.,Mol. Cell Biol. 7: 4139-4144 (1987)], 또한, HSV-TK 유전자는 gpt와 반대쪽에 삽입물에 놓일 수 있어, 400㎍/㎖의 G418, 100μM의 6-티오크산틴, 및 25㎍/㎖의 간시클로비어를 함유하고 있는 사람 섬유아세포 영양 배지에서 성장시킴으로써 neo에 대하여 및 gpt 및 TK에 대하여 선택하는 것을 가능하게 한다. 이중 음성 선택은 진실한 표적화 사건에 대한 거의 절대적인 선택을 제공하여야 하고, 서던 플롯 분석은 궁극적으로 확인을 위한 것이다.
본원에서 설명된 표적화 방법은 또한 종래의 약제학적 전달을 위해 hGH를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080(ATCC CCL 121), HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체(ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), MCF-7 유방암 세포(ATCC HTB 22), K-562 백혈병 세포(ATCC CCL 232), KB 암종 세포(ATCC CCL 17), 2780AD 난소 암종 세포[Van der Bliek, A. M.et al.,Cancer Res. 485927-5932 (1988)], 라지 세포(ATCC CCL 86), 주르카트 세포(ATCC TIB 152), 나말와 세포(ATCC CRL 1432), HL-60 세포(ATCC CCL 240), 다우디 세포(ATCC CCL 213), RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155), U-937 세포(ATCC CRL 1593), 보우스 멜라노마 세포(ATCC CRL 9607), WI-38VAl3 서브라인 2R4 세포(ATCC CLL 75.1), MOLT-4 세포(ATCC CRL1582), 및 다양한 헤테로히브리도마 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
실시예 1f 및 1i에서 설명되고, 실시예 1g, qh, qj 및 1k 에서 사용된 표적화 구성물은 활성화된 내인성 유전자, 및 증폭가능한 선택성 마아커가 증폭되는 세포들을 선택하기에 유용한 증폭가능한 선택성 마아커(예컨대 ada, dhfr, 또는 CAD)를 포함하도록 변형될 수 있다. 치료 생성물을 코딩하는 내인성 유전자를 발현하거나 발현할 수 있는 세포들은 종래의 약제학적 전달을 위한 또는 유전자 치료를 위한 단백질(예컨대 hGH 및 hEPO)를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
l.일렉트로포레이션에 의한 외인성 DNA 및 선택성 마아커 유전자로의 일차 및 이차 섬유아세포의 형질전환
지수 증식기 또는 초기 정상 증식기의 섬유아세포를 트립신으로 처리하고 플라스틱 표면으로부터 영양배지를 사용하여 세정했다. 세포 현탁액의 일정액을 계수를 위해 취하고, 남아 있는 세포들에 대해 원심분리를 수행했다. 상등액을 흡수하고 필렛을 5㎖의 일렉트로포레이션 완충액(20mM의 HEPES pH 7.3, 137mM의 NaCl, 5mM 의 KCl, 0.7mM 의 Na2HPO4, 6mM 의 덱스트로스)에 재현탁시켰다. 세포들을 원심분리하고, 상층액을 흡인 제거한 후, 1mg/㎖의 아세틸화된 소혈청 알부민을 함유하고 있는 일렉트로포레이션 완충액에 재현탁시켰다. 최종 세포 현탁액은 약 3 × 106세포/㎖를 함유했다. 일렉트로포레이션은 재현탁직후에 수행되어 한다.
슈퍼코일드 DNA를 0.4vm의 전극 갭을 갖는 멸균 큐빗(Bio-Rad)에 첨가했다.최종 DNA 농도는 일반적으로 최소한 120 ㎍/㎖ 였다. 0.5㎖의 세포 현탁액(약 1.5 × 106세포를 함유함)을 큐빗에 첨가하고, 세포 현탁액과 DNA 용액을 서서히 혼합하였다. 일렉트로포레이션을 진-펄서 장치(Bio-Rad)로 수행하였다. 정전용량 및 전압을 각각 960㎌ 및 25-300V에서 설정하였다. 전압이 증가함에 따라 세포 생존성은 감소하지만, 도입된 DNA를 그것의 게놈안으로 안정하게 통합시키는 생존 세포의 백분율은 극적으로 증가했다. 이들 파라미터가 제공되면, 약 14-20mSec의 맥동 시간이 관찰되어야 한다.
일렉트로포레이트된 세포들을 실온에서 대략 5분동안 유지시킨 후, 큐빗의 내용물을 멸균한 전달 피펫으로 천천히 제거하였다. 다음 세포들을 10cm 디쉬에 들어 있는 10㎖의 미리 가온시켜 놓은 영양 배지(상기와 같이 15% 소혈청이 첨가 됨)에 직접 첨가하고, 상술된 바와같이 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 흡인 제거하고 10㎖의 새로운 배지로 교체한 후, 다시 16-24 시간동안 인큐베이션하였다. 클로닝 효율을 측정하고 G418-내성 콜로니들을 선택하기 위하여, 그 다음날에 세포들을 하위 배양했다, 세포들을 트립신으로 처리하고, 계수한 후 플레이팅하였다. 전형적으로, 섬유아세포는 클로닝 효율을 측정하기 위해서는 10cm 디쉬당 103개의 세포로 플레이팅하였고, G418 내성을 선택하기 위해서는 10cm 디쉬당 104개의 세포로 플레이팅하였다.
사람 섬유아세포는 섬유아세포 영양 배지(15%의 소혈청 함유)중에 300-400㎍/㎖ 의 G418을 함유하는 배지(Geneticin, 대략 50%의 잠재력을 가지고 있는 이황산염 ; Gibco)에서 G418 내성에 대해 선택했다. 클로닝 효율은 G418이 없을 때 측정했다. 플레이팅된 세포들을 12-14일 동안 인큐베이션한 후, 그 시점에서 콜로니들을 포르말린으로 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, 플레이팅된 클로닝 효율에 대해 계수하고, G418 플레이트에 대해서는 클로닝 실린더를 사용하여 단리하였다. 토끼의 섬-R-아세포의 일렉트로포레이션 및 선택은, 사용한 선택 조건을 제외하고는 본질적으로는 사람 섬유아세포에 대하여 설명된 것과 같이 수행하였다. 토끼의 섬유아세포는 1g/㎖의 G418을 함유하는 배지에서 G418 내성에 대해 선택했다.
섬유아세포를 새롭게 절출된 사람 표피로부터 단리하였다. 배양물을 DMEM+10% 소혈청중에 cm당 50,000 세포로 시딩하였다. 배양물이 집밀도에 이르렀을 때, 섬유아세포를 트립신 처리에 의하여 수확하고, 일렉트로포레이션에 의해 형질전환시켰다. 일렉트로포레이션 조건은 플라스미드 pcDNEO를 이용한 형질전환에 의해 평가하였다(도 5 참조). 거의 최적의 조건(250볼트의 일렉트로포레이션 전압에서 및 960㎌의 정전용량 세팅에서 플라스미드 pcDNEO 60㎍)을 사용하는 대표적인 일렉트로포레이션 실험은 588개의 처리된 세포당 단지 하나의 G418 콜로니(모든 처리된 세포이 0.17%), 또는 71개의 클론가능한 세포당 하나의 G418 콜로니(1.4%)를 생성하였다.
거의 최적의 조건(300 볼트의 일렉트로포레이션 전압에서 및 960㎌의 정전용량 세팅에서 플라스미드 pcDNEO 60㎍)에서 9회의 별도의 일렉트로포레이션 실험을 수행하였을 때, 1,899개의 처리된 세포당 평균 하나의 G418 콜로니(0.05%)를 관찰할 수 있었다(범위는 1/882 내지 1/7,500 처리된 세포임).
계대수가 낮은 일차 사람 섬유아세포를 플라스미드 ; pcDNEO 및 pXGH5 와의 공동 형질전환에 의하여 hGH를 발현하는 세포로 전환시켰다. 전형적으로, 2개의 플라스미드의 등몰 (equimolar) 혼합물 60㎍을 거의 최적의 조건(300 볼트의 일렉트로포레이션 전압 및 960㎌의 정전용량)에서 형질전환시켰다. 그러한 실험의 결과는 14,705개의 처리된 세포당 하나의 G418 콜로니가 있음을 나타냈다.
동일한 형질전환 조건하에서 단리된 이들 및 다른 세포들의 hGH 발현 데이타를 하기에 요약한다. 궁극적으로는, 모든 G418r콜로니중 98%가 다량의 배양물을 생성하기 위하여 팽창될 수 있었다.
안정적인 형질전환은 또한 동일한 플라스미드 분자상에 neo와 hGH 유전자가 존재하는 DNA 구성물인 pXGH301로 일차 또는 이차 사람 섬유아세포의 일렉트로포레이션에 의해 제조하였다. pXGH301은 2-단계 과정에 의해 구성하였다. pBR322로부터의 SalI-ClaI 단편(pBR322 에서의 위치 23-651)을 단리하고 SalI-ClaI 소화된 pcDNEO 에 삽입시켜, pcDNEO 의 SV40 초기 프로모터 영역의 상류에 BamHI 부위를 만들었다. 이 플라스미드, pBNEO 를 BamHI 으로 소화시키고, SV40 초기 프로모터의제어하에 neo 유전자를 함유하고 있는 2.1kb 단편을 단리해내고 BamHI 소화된 pXHG5 에 삽입시켰다, neo와 hGH가 서로에 대하며 동일한 방향으로 전사되는, 2.1kb의 BamHI 단편이 하나 삽입되는 플라스미드를 하나 단리하였다. 이 플라스미드를 pXGH301로 표시하였다. 예를 들어, 1.5 × 106개의 세포를 60㎍의 pXGH301을 사용하여 300 볼트 및 960㎌에서 일렉트로포레이션하였다. G418 내성 콜로니들을 1.5× 10개의 처리된 세포당 652개의 G418 내성 콜로니들의 빈도(2299개의 처리된 세포당 1)로 형질전환된 이차 섬유아세포로부터 단리하였다. 이들 콜로니들의 약 59%가 hGH를 발현했다.
실시예 2: 사람 성장 호르몬 및 에리트로포이에틴 서열인 융합되어 있는 키메라 전사 유니트를 초래하는 표적화 플라스미드의 구성
이하, 사람 EPO 유전자의 상류에 있는 정상적인 조절 서열이 이것들의 형질전환 되지 않은 상태에서 얻어진 것처럼 검출될 수 있는 양으로 hEPO를 발현시키지 않는 일차 또는 이차 섬유아세포 스트레인에서 hEPO의 발현을 가능하게 하는 본 발명이 2가지 추가의 구체예를 예시한다. 이러한 구체예에 있어서, 표적화 사건의 생성물은 사람의 성장 호르몬 유전자의 제 1 엑손이 hEPO 엑손 2-5의 상류에 위치하는 키메라 전사 유니트이다. 전사, 스플라이싱 및 번역의 생성물은 hEPO 시그널 펩티드의 아미노산 1-4가 hGH의 아미노산 잔기 1-3으로 치환된 단백질이다. 이 두 가지 구체예는 삽입된 외래 조절 서열의 상대적 위치 및 최종의 프로세싱된 전사물을 형성시키는데 필요한 스플라이싱의 특이한 패턴에 있어서 상이한 것이다.
플라스미드 pXEP0-10은 hEPO의 엑손 1을 사람 염색체 7상에 있는 내인성 hEPO 유전자에 대한 유전자 표적화에 의해 hGH의 엑손 1로 대체시키기 위하여 디자인한다. 플라스미드 pXEPO-10은 하기와 같이 구성된다. 먼저, 중간 플라스미드 pT163은 hEPO 코딩영역의 상류에 놓여 있는 6kb 의 HindIII-BamHI 단편(실시예 1f 참조)을 HindIII-BamHI 소화된 p블루스크립트II SK+ (Stratagene, LaJolla, CA)안에 삽입시킴으로써 구성된다. 이러한 결찰의 생성물을 XhoI 및 HindIII으로 소화시키고, pMClneoPolyA[Thomas, K.R. and Capecchi, M. R.Cell 51: 503-512 (1987) ; Strategene, LaJolla, CA로부터 구매가능함]로부터의 1.1kb HindIII-XhoI 단편에 결찰시켜 pT163을 생성한다. 올리고누클레오티드 13.1-13.4를 중합효소 사슬반응에 활용하여 마우스 메탈로티오네인 1 (mMT-I) 프로모터 - hGH 엑손 1 서열이 hEPO 인트론 1 서열에 추가로 융합되어 있는 융합 단편을 생성했다. 먼저, 올리고누클레오티드 13.1 및 13.2를 pXGH5(제 1도)로부터의 약 0.73kb의 mMT-I 프로모터-hGH 엑손 1 단편을 증폭시키는데 사용했다. 다음, 올리고누클레오티드 13.3 및 13.4를 사람의 게놈 DNA로부터 주로 hEPO 인트론 1 로 이루어진 약 0.57kb 단편을 증폭시키는데 사용했다. 최종적으로, 2개의 증폭된 단편을 혼합하여 올리고누클레오티드 13.1 및 13.4로 추가로 증폭시켜서 mMT-I 부분의 5' 위치에서의 SalI 부위 및 hEPO 인트론 1 서열의 3' 위치에서의 XhoI 부위의 양 옆에 있는 최종 융합 단편(융합 단편 3)을 생성시켰다. 융합 단편 3을 XhoI 및 SalI으로 소화시키고 XhoI으로 소화된 pT163에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 대장균안에 형질전환시키고, XhoI 부위가 hEPO 인트론 1 서열의 3' 위치에서 재생되어 있는 융합 단편 3의 단일 삽입물이 함유된클론을 확인하고, pXEPO-10으로 표시하였다.
올리고 13.1의 굵은 글씨가 아닌 영역은 이것의 5' 경계로서 천연의 KpnI 부위를 가지고 있는 mMT-I 프로모터와 동일하다. 굵은 글씨는 5' 경계를 SalI 부위로 전환시키는 SalI 부위 테일을 나타낸다. 올리고 13.2 및 13.3의 굵은 부분은 hGH 서열을 나타내는 반면, 굵은 부분이 아닌 곳은 hEPO 유전자로부터의 인트론 1 서열을 나타낸다. 올리고 13.4의 굵은 부분이 아닌 영역은 hEPO 인트론 1의 마지막 25 염기와 동일하다. 굵은 부분은 증폭된 단편의 3' 경계를 XhoI 부위로 전환시키는 XhoI 부위 테일을 포함한다.
플라스미드 pXEPO-11은 유전자 표적화에 의해서, 사람의 염색체 7상에 위치된 내인성 hEPO 유전자좌에 있는 프로모터 영역 및 hEPO 구조 유전자의 상류에 있는 hGH 의 엑손 1 및 mMT-I 프로모터를 위치시키기 위해 디자인된 것이다. 플라스미드 pXEPO-11은 하기와 같이 구성된다. 올리고누클레오티드 13.1 및 13.5-13.7을 중합효소 사슬반응에 활용하여 마우스 메탈로티오네인 1 (mMT-I) 프로모터 - hGH 엑손 1 서열이 hEPO 코딩영역에 대하여 -1 내지 -630 에 있는 hEPO 서열에 추가로 융합되어 있는 융합 단편을 생성시킨다. 먼저, 올리고누클레오티드 13,1 및 13.6 를 pXGH5 (제 5도)로부터 대략 0.75kb 의 mMT-I 프로모터 -hGH 엑손 1 단편을 증폭시키는데 사용한다. 다음으로, 올리고누클레오티드 13.5 및 13.7을 사람의 게놈 DNA로부터, hEPO 코딩영역에 대하여 -1 에서 -620 에 있는 hEPO 서열로 주로 이루어진 대략 0.65kb 단편을 증폭시키는데 사용했다. 올리고 13.5와 13.6은 hGH 인트론 1 - hEPO 프로모터 영역에 위치된 10bp의 링커서열을 함유하며, 이것은 천연의 hEPO 인트로 1 스플라이스 기증체 부위에 상응한다. 최종적으로, 2개의 증폭된 단편을 혼합하여 올리고누클레오티드 13.1 및 13.7로 추가된 증폭시켜서 mMT-I 부분의 5' 위치에서의 SalI 부위 및 hEPO 프로모터 영역의 3' 위치에서의 XhoI 부위가 양 옆에 있는 최종 융합 단편(융합 단편 6)을 생성시킨다. 융합 단편 6을 XhoI 및 SalI으로 소화시키고 XhoI으로 소화된 pT163으로 결찰했다. 결찰 혼합물을 대장균안에 형질전환시키고, XhoI 부위가 hEPO 프로모터 시열의 3' 위치에서 재생되어 있는 융합 단편 6의 단일 삽입물이 함유된 클론을 확인하고, pXEPO-10 으로 표시하였다.
올리고 13.5 및 13.6의 굵은 부분은 hGH 서열을 나타낸다. 이탤릭체로 된 영역은 hEPO 인트론 1의 처음 10 염기쌍에 상응한다. 올리고의 나머지는 hEPO 코딩 영역에 대하여 -620에서 -597에 있는 hEPO 서열에 상응한다. 올리고 13.7의 굴은 부분이 아닌 영역은 hEPO 코딩 영역에 대하여 -1 에서 -24에 있는 염기와 동일하다. 굵은 부분은 증폭된 단편의 3' 경계를 XhoI 부위로 전환시키는 XhoI 부위 테일을 포함한다.
플라스미드 pXEPO-10은 BamHI 및 XhoI 와의 소화에 의한 유전자 표적화를 위해 사용될 수 있으며, hEPO 서열의 양쪽 끝에 붙어있는 mMT-I/hGH 융합물을 함유한 7.3kb 단편을 방출시킨다. 이 단편(표적화 단편 1)은 사람의 EPO 유전자좌로의 표적화를 향한 hEPO 코딩영역 및 hEPO 인트론 1 서열의 상류에 있는 -620과 약 6620 사이에 놓여 있는 서열만을 갖는, 어떠한 hEPO 코딩서열도 함유하지 않는다. 표적화 단편 1은 상기 실시예 1c 에서와 같은 것들과 유사한 조건을 사용하여 일차 또는 이차 사람 피부 섬유아세포로 형질전환시킨다. G418-내성 콜로니를 96-웰플레이트의 각각의 웰안에 넣고 ELISA 분석(R&D Systems, Minneapolis MN)에 의한 EPO 발현을 위해 선택한다, 형질전환용 DNA가 사람 게놈안으로 무질서하게 통합 되어 있는 세포들은 EPO 를 생성시킬 수 없다. 형질전환용 DNA가 외인성 hEPO 인트론 1 및 hEPO 상류 서열과 상동 재조합되어 있는 세포들은, mMT-I 프로모터와 비-전사된 서열 및 hGH 5' 번역되지 않은 서열과 hGH 엑손 1 이 정상적인 hEPO 프로모터 및 hEPO 엑손 1을 대체하는 키메라 유전자를 함유한다(도 5 참조). 표적화 단편 1 중의 비-hEPO 서열은 hEPO 인트론 1의 하류에 있는 hEPO 서열과 결합된다. 정상적인 hEFO 조절영역의 mT-I 프로모터로의 대체는 EPO를 정상적으로 발현시키지 않는 섬유아세포의 EPO 유전자를 활성시킬 것이다. hEPO 엑손 1의 hGH 엑손 1로의 대체는, hEPO 시그널 펩티드의 처음 4개의 아미노산이 hGH 의 아미노산 1-3으로 대체됨으로써, 성숙한 단백질로부터 후-번역 프로세싱에 의해 제거되고 발현 세포로부터 분비되는 기능적인 키메라 시그널 펩티드를 생성하는 단백질을 초래한다.
플라스미드 pXEPO-11은 hEPO 서열이 양쪽 끝에 붙어 있는 mMT-I/hGH 융합 물을 함유한 7 4kb 단편을 방출시키기 위하여 BamHI 및 XhoI로의 소화에 의한 유전자 표적화를 위해 사용할 수 있다. 이 단편(표적화 단편 2)은 사람의 EPO 유전자좌로의 표적화를 향한 hEPO 코딩영역의 상류에 있는 -1과 약 -6620 사이에 놓여있는 서열만을 갖는, 어떠한 hEPO 코딩서열도 함유하지 않는다. 표적화 단편 2를 상기 실시예 1g에서와 같은 것들과 유사한 조건을 사용하여 일차 또는 이차 사람 피부 섬유아세포에 형질전환시켰다. C418-내성 콜로니를 96-웰 플레이트의 각각의 웰안에 넣고 ELISA 분석(R&D Systims, Minneapolis, MN)에 의한 EFO 발현을 위해 선택했다. 형질전환용 DNA가 사람 게놈안으로 무작위로 통합되어 있는 세포들은 EPO를 생성시킬 수 없었다. 형질전환용 DNA가 외인성 hEPO 프로모터 및 상류 서열과 상동 재조합되어 있는 세포들은 mMT-I 프로모터와 비-전사된 서열, hGH 5' 미번역 서열과 hGH 엑손 1, 및 hEPO 인트론 1의 처음 10 염기로 이루어진 10 염기쌍의 링커가 hEPO 코딩영역에 대하여 위치 -620 에 놓여 있는 HindIII 부위에 삽입되어 있는 키메라 유전자를 함유한다(도 2 참조). 정상적으로는 침묵하는 hEPO 프로모터의 상류에 있는 mMT-I 프로모터의 위치 측정은 일차 또는 이차 피부 섬유아세포에서, 메시지를 판독하는 (5' 에서 3') 비-번역된 메탈로티오네인 및 hEPO 인트론 1, hEPO 인트론 1의 처음 10 염기쌍에 동일한 DNA 의 10 염기, 그리고 정상적인 hEPO 프로모터 및 hEPO 엑손 1 (EPO 코딩서열에 대해 -620에서 +13)의 합성을 지시 할 것이다. hEPO 인트론 1로부터의 10 염기쌍의 링커시열은 hEFO 엑손 2의 상류에 밀착되어 놓여 있는 다음 하류의 스플라이스 억셉터 부위에 hGH 엑손 1을 융합시키기 위해 스플라이스 도너 부위로서 작용한다. 그 결과 형성된 전사물의 프로세싱은 hEPO 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1 서열을 스플라이스할 것이다. hEPO 엑손 1의 hGH 엑손 1 서열로의 대체는 hEPO 시그널 펩티드의 처음 4 아미노산이 hGH 의 아미노산 1-3 으로 대체되으로써 성숙한 단백질로부터 후-번역 프로세싱에 의해 제거되고 발현 세포로부터 분비되는 기능적인 키메라 시그널 펩티드를 생성시키는 단백질을 초래한다.
pXEPO-10 및 pXEPO-11에 관련된 일련의 구성물은 공지된 방법에 의해 구성될 수 있다. 이러한 구성물에서, mMT-I 프로모터 및 hGH 서열의 상대적 위치뿐만 아니라, mMT-I/hGH 서열이 hEFO 상류 서열에 삽입시키는 위치는 유전자 표적화를 촉진하는 대용 키메라 전사 유니트를 생성하기 위해 다양하게 변화되어, 융합 전사물의 더욱 효과적인 발현을 초래시키거나, 또는 다른 바람직한 특성을 갖는다. 이러한 구성물은 유사한 결과를 낳을 것이며, hGH-hEPO 융합 유전자는 정상적인 hEPO 유전자좌에 대한 유전자 표적화에 의해 외인성 프로모터의 제어하에 놓인다. 예를 들면, hEPO 유전자의 상류에 있는 6kb 의 HindIII-BamHI 단편 (실시예 1f 참조)은neo유전자 및 mMT-I/hGH 융합 단편의 삽입을 위한 부위로서 활용될 수 있는 수많은 제한효소 인지서열을 갖는다. 이러한 부위의 한가지인 HindIII 부위의 상류로 약 1.3kb 에 놓여 있는 BgIII 부위는 이 영역중에서 유일하며 하나 이상의 선택적인 마아커 및 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 세포에서 EPO 발현을 활성시키는 작용을 할 다른 유전자로부터 유도된 조절영역의 삽입을 위해 사용될 수 있다.
먼저, 중간 플라스미드 pT164는 hEPO 코딩영역의 상류로 6kb 에 있는 HindIII-BamHI 단편(실시예 1f)을 HindIII_BamHI 소화된 p블루스크립트II SK*(Stratagene, LaJolla, CA)안으로 삽입시킴으로써 구성된다. 플라스미드 pMC1neoPolyA [Thomas, K. R. and Capecchi, M.R. Cell 51:503-512 (1987)available from Stragene, LaJolla, Ca]를 BamHI 및 XhoI 로 소화시키고, 대장균 DNA 중합효소의 클레노우 단편으로 처리함으로써 블런트 단부로 만들고, 그 결과 생성된 1.1kb 단편을 정제한다. pT164 를 Bg1II 로 소화시켜 대장균 DNA 중합효소의 클레노우 단편으로 블런트 단부로 만든다. 이 2가지의 선형 블런트 단부를 가지는 단편을 함께 결찰시켜 성분 대장균으로 형질전환시킨다. 1.1kbneo단편의 단일 삽이물을 가지는 클론을 단리하여 제한효소 분석법으로 분석하여 블런트 단부의 XhoI 및 Bg1II 부위의 융합에 의해 재생성된 Bg1II 부위가 플라스미드 pT164 에 존재하는 유일한 HindIII 부위로부터 1.3kb 벗어나서 편재되어 있는 것들을 확인하였다. 그 결과 형성된 플라스미드인 pT165는neo전사 유니트의 5' 쪽에 붙어있는 유일한 Bg1II 부위에서 절단할 수 있다.
올리고누클레오티드 13.8 및 13.9를 중합효소 사슬반응에 활용하여 마우스 메탈로티오네인 I (mMT-I) 프로모터 - hGH 엑손 1 서열이 스플라이스 도너 부위를 포함한 10 염기쌍 단편에 부가적으로 융합되어 있는 단편을 생성시켰다. 선택된 스플라이스 도너 부위가 천연의 hEPO 인트론 1 스플라이스 도너 부위에 상응할지라도, 더 많은 수의 스플라이스 도너 부위 또는 일치 스플라이스 도너 부위가 사용될 수 있다. 올리고누클레오티드(13.8 및 13.9)는 pXGH5로부터 약 0.73kb mMT-I 프로모터 - hGH 엑손 1 단편을 증폭시키는데 사용했다 (도 1). 증폭된 단편(단편 7)을 Bg1II로 소화시켜 Bg1II로 소화된 PT165에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 대장균안에 형질전환시키고, mMT-I 프로모터종의 KpnI 부위가neo유전자의 5' 단부에 근접되어 있으며 mMT-I 프로모터가, 전사가 유일한 HindIII 부위를 향하여 진행되는 방향으로 배향되는 단편 7 의 단일 삽입물을 함유한 클론을 확인하여 pXEPO-12로 표시하였다.
올리고 13.8의 굵은 분분이 아닌 영역은 그것의 5' 경계로서 천연의 KpnI 부위를 가지고 있는 mMT-I 프로모터와 동일하다, 굵은 부분은 5' 경계를 Bg1II 부위로 전환시키는 Bg1II 부위 테일을 나타낸다.
올리고 13.9의 굵은 부분이 아닌 영역은 hGH 서열을 나타낸다. 이택릭체로 된 영역은 hEPO 인트론 1의 처음 10 염기 쌍에 상응하는 것이다. 밑줄그은 Bg1II 부위는 플라스미드 구성 목적으로 첨가된 것이다.
플라스미드 pXEPO-12를 BamHI 및 HindIII 를 이용한 소화에 의한 유전자 표 적화를 위해 사용하여 hEPO서열이 양쪽 끝에 붙어 있는 mMT-I/hGH 융합물 및 네오 유전자를 함유한 7.9kb의 단편을 방출시켰다. 이 단편(표적화 단편 3)은 사람의 EPO 유전자좌의 상류로의 표적화를 지시하는 hEPO 코딩영역의 상류로서 -1 과 약 -6620 사이에 놓여 있는 서열만을 가지며, 어떠한 hEPO 코딩서열도 함유하지 않는다. 표적화단편 3을 상기 실시예 1b 및 1c 에서와 같은 것들과 유사한 조건을 사용하여 일차, 이차, 또는 불멸화된 사람 피부 섬유아세포에 형질전환시켰다. G418-내성 콜로니를 96-웰 플레이트의 각자의 웰안에 넣고 ELISA 분석(R&D Systims,Minneapolis, MN)에 의한 EPO 발현을 위해 선택했다. 형질전환용 DNA가 사람 게놈안으로 무작위로 통합된 세포들은 EPO를 생성시킬 수 없다. 형질전환용 DNA가 외인성 hEPO 프로모터 및 상류 서열과 동종으로 재조합된 세포들은 mMT-I 프로모터와 비-전사된 서열, hGH 5' 미번역 서열과 hGH 엑손 1, 및, hEPO 인트론 1의 처음 10 염기로 이루어진 10 염기쌍 링커가 hEPO 코딩영역에 대하여 상대적인 위치 -1920에 놓여 있는 Bg1II에서 삽입되어 있는 키메라 유전자를 함유한다. 정상적으로는 침묵하는 hEPO 프로모터의 상류에 있는 mMT-I 프로모터의 위치 측정은 일차, 이차, 또는 불멸화된 사람 섬유아세포(또는 다른 사람 세포)에서, (5' 에서 3' 으로) 비-번역된 메탈로티오네인 및 hGH 서열, hGH 엑손 1, hEPO 인 트론 1 의 처음 10 염기쌍에 동일한 DNA의 10 염기, 그리고 hEPO 상류 영역 및 hEPO 엑손 1(EPO 코딩서열에 대해 -1920 내지 +13 으로부터)을 판독하는 메시지의 합성을 지시할 것이다. hEPO 인트론 1로부터의 10 염기쌍 링커서열은 hGH 엑손 1을, hEPO 엑손 2 의 상류에 밀착되어 놓여 있는 하류 스플라이스 도너 부위에 융합시키기 위한 스플라이스 수용체 부위로서 작용한다. 따라서, 그 결과 생성된 전사물의 프로세싱은 hEPO 상류 서열, 프로모터 영역, 엑손 1 및 인트론 1 서열을 스플라이싱할 것이다. pXEPO-10, -11, 및 -12를 사용할 때, 메시지의 후-전사 프로세싱은 mMT-I 프로모터와 hEPO 엑손 1 사이의 hEPO 상류 서열중에 놓여 있는 스플라이스 억셉터 부위를 제거하기 위한 시험관내 돌연변이 유발에 의해 개선될 수 있으며, 이것은 원하는 메시지의 생성을 위해 필요한 생산성 스플라이싱 사건의 수준을 감소시킨다. hEPO 엑손 1 의 hGH 엑손 1로의 대체는 hEPO 시그널 펩티드의 처음 4 아미노선이 hGH 의 아미노산1-3 으로 대체되는 단백질을 초래함으로써, 성숙한 단백질로부터 후-번역 프로세싱에 의해 제거되고 발현 세포로부터 분비되는 기능성 키메라 시그널 펩티드를 생성한다.
실시예 3. 서열 상류의 표적화된 변형 및 표적화된 유전자의 증폭
EPO 유전자가 상기에서 설명된 방법에 의해 활성화된 사람의 세포는 만약 표적화 플라스미드가 유전자 증폭현상에 의해 세포 독성제제의 높은 수준에 대한 내성을 부여하는 마아커 유전자를 함유한다면, neo/mMT-I/EPO 전사 유니트를 증폭시키도록 유도될 수 있다. 선택적 마아커 유전자, 예컨대 디히드로플레이트 환원효소(dhfr,선택적인 제제는 메토트렉세이트), 다기능성 CAD 유전자[카르바밀 인산염 합성효소, 아스파르테이트 트란스카르바밀아제, 및 디히드로-오로타아제를 코딩 한다 ; 선택적 제제는 N- (포스포노아세틸)-L-아스파테이트 (PALA)], 글루타민 합성제이고; 선택제는 메티오닌 술폭시민(MSX)이고, 아데노신 탈아민효소 (ada; 선택적 제제는 아데닌 누클레오시드)는, 다른 유전자들 중에서도 특히, 불멸화된 사람 세포주중에서 증폭될 수 있는 것으로 증명되어 있다[Wright, J. A.et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 871791-1795 (1990); Cockett, M.I.et al. Bio/Technology8:662-567 (1990)]. 이들 연구에서, 유전자 증폭은 많은 불멸화된 사람 세포주에서 발생되는 것으로 기록되어 있다. 다른 세포들 중에서, HT1080, HeLa, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암세포, 또는 2780AD 난소 암세포 모두는 적합한 선택 조건하에서 증폭될 수 있다.
플라스미드 pXEPO-10 및 pXEPO-11은 정상적이거나 돌연변이체인dhfr유전자의 상기 플라스미드의 유일한 HindIII 부위로의 삽입에 의해 증폭될 수 있다. HT1080 세포와 적합한 DNA의 전사, G418-내성(neo 유전자에 의해 부여됨)에 대한 선택, 및 hEPO 유전자가neo,dhfr, 및 mMT-I 서열의 유전자 표적화에 의해 활성화되어서 hEPO 유전자의 상류 위치를 바로잡는 세포의 확인 후에, 이러한 세포는dhfr의 증폭 및 결합된neo, mMT-I, 및 hEPO 서열의 공-증폭에 대해 선택되도록 메토트렉세이트(MTX)에서의 단계적 선택에 대해 노출될 수 있다[Kaufman, R. J.Technique2:221=236 (1990)]. 이 단계적 선택의 방법 먼저 세포를 낮은 수준의 MTX (0.01 내지 0.08㎛)에 노출시킨 후, 계속해서 250㎛ MTX 이하 또는 이상의 MTX 농도의 증분 증가에 노출시키는 것으로 이루어진다. 0.04 내지 0.08㎛ MTX의 선형증분 단계 및 연속적으로 2배 증가된 MTX 농도가 증폭된 전사 세포주을 위해 선택적으로 효과적일지라도, 상대적으로 다양하게 적은 증분 또는 효과적일 것이다. 증폭은dhfr유전자 복사체 수의 증가에 의해 모니터되어 시험관내 hEPO 발현의 측정에 의해 확인된다. 이러한 방법에 의해, hEPO 의 실질적인 과발현은 hEPO 코딩 영역의 완전히 바깥쪽에 놓여 있는 서열의 표적하된 변형에 의해 성취될 수 있다.
사람의 세포에서의 hGH 발현의 활성화를 위해 상기에서 설명된 것들(실시예 1f, 1h, 1i, 1k, 2 및 7)과 유사한 구성물은 또한 유전자 표적화에 의한 hGH 유전자를 비-코딩 서열 및 연속적 증폭으로 과발현시키는 세포를 얻기 위한dhfr유전자를 포함하도록 추가로 변형될 수도 있다.
실시예 4. 불멸화된 사람 섬유아세포주에서 사람 EPO 유전자좌의 표적화 및 활성화
내인성 hEPO 유전자가 사람 섬유아세포 세포에서 활성화될 수 있을 것이라는 가설을 시험하기 위하여 표적화 구성물 pXEPO-13을 만들었다. 먼저, 마우스의 메탈로티오네인-1 프로모터(mMT-I)에 융합된 hEPO 유전자의 첫번째 코돈의 상류에 있는 63bp 의 게놈 hEPO를 함유하는 플라스미드 pT22.1을 구성하였다. mMT-I 와 hEPO 서열을 융합시키기 위하여 PCR 에 올리고누클레오티드 22.1 내지 22.4 를 사용하였다. 이들 프라이머들의 성질은 다음과 같다 : 22.1 은 mMT-I KpnI 부위에서 28bp 상류에서 시작하는 mMT-I 프로모터의 서열에 상동하는 21 염기의 올리고누클레오티드이며 ; 22.2 와 22,3 은 융합이 hEPO 유전자의 첫번째 코돈으로부터 35 염기만큼 상류에서 시작하는 hEPO 서열의 28bp 와, mMT-I 의 천연 Bg1II 부위를 포함하고 mMT-I 서열안으로 30 염기만큼 뻗어 있는, 올리고누클레오티드 22.2 의 염기 29에서 시작하는 mMT-I 서열을 함유하도록 hEPO 와 mMT-I 서열의 융합을 규정하는 58개의 누클레오티드의 상보하는 프라이머이고 ; 22.4 는 길이가 21 누클레오티드이고 hEPO 유전자의 첫번째 코돈으로부터 하류로 725 염기에서 시작하는 hEPO 서열에 상동한다. 이들 프라이머들을 상술한 바와같이 mMT-I 과 hEPO 서열의 융합을 포함하는 1.4kb 의 DNA 단편을 증폭시키기 위하여 사용하였다. 그 결과 생성된 단편을 KpnI 으로 소화시키고 (PCR 단편은 2개의 KpnI 부위 : mMT-I 프로모터 영역에 있는 단일한 천연 KpnI 부위 및 hEPO 서열에 있는 단일한 천연 KpnI 부위를 함유하였다), 정제하였다. 플라스미드 pXEPO1 (제 3도)을 또한 KpnI 으로 소화시켜서 1.4kb 단편 및 6.4kb 단편을 방출시켰다. 6.4kb 단편을 정제하여 1.4kb 의 KpnI PCR 융합 단편에 결찰시켰다. 그 결과 생성된 구성물은 pT22.1 로 표시하였다. 두번째 중간체인 pT22.2 는 hEPO 구조 유전자의 상류에 놓여 있는 대략 6kb 의 HindIII-BamHI 단편(실시예 1f 참조)을 BamHI 및 HindIII 로 소화된 pBSIISK+(Stratagene, LaJolla, Ca)에 결찰시킴으로써 구성하였다. 세번째 중간체인 pT22.3은 네오마이신 포스포트란스페라제 유전자를 함유하고 있는 pMCINEOpolyA Stratagene, LaJolla, CA)로부터 1.1kb 의 XhoI/BamHI 단편을 절출시킴으로써 구성하였다. 다음 단편을 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편(New England Biolabs)으로 블런트 단부로 만들었다. 이 단편은 pBSII나+ (DNA 중합효소 I을 사용하여 유사하게 만들어짐)의 HincII 부위에 결찰시켜서 pT22.3 을 만들었다. 네 번째 중간체인 pT22.4 는 pT22.3 으로부터neo유전자를 포함하고 있는 1.1kb 의 XhoI/HindIII 단편을 정제하고 이 단편을 XhoI 및 HindIII로 소화된 pT22.2 에 결찰시킴으로써 만들었다. 그러므로 pT22.4는 hEPO 단편의 상류에 있는 HindIII 쪽에 인접한neo유전자를 함유한다. 마지막으로, pXEPO-13 은 pT22.1 로부터 2.0kb의 EcoRI/AccI 단편을 먼저 절출시킴으로써 제하였다. 이 단편의 EcoRI 부위는 mMT-I 프로모터의 5' 경계를 규정하는 한편, AccI 부위는 hEPO 엑손 5 내에 있다. 그러므로, AccI/EcoRI 단편은 거의 완전한 hEPO 발현 유니트를 함유하며, 단지 엑손 5 의 일부분과 천연 폴리아데닐화 부위만이 없다. 이 2.0kb의 EcoRI/AccI 단편을 정제하여 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편으로 처리하여 블런트 단부로 만든 후, XhoI 으로 소화된 블런트 단부의 pT22.4 에 결찰시켰다.
HT1080 세포들을 PvuI-BamHI 소화된 pXEPO-13 으로 형질전환시켰다. 이 방법으로 소화된 pXEPO-13 은 3개의 단편 :amp유전자의 일부를 포함하는 1kb 의 벡터단편, 나머지 벡터 서열의 1.7kb 단편 및 hEPO,neo및 mMT-I 서열을 함유하는 대략 9kb 의 단편을 생성한다. 대략 9kb의 BamHi/PvuI 단편은 BamHI 부위로부터의 순서로 다음 서열들을 함유하였다 : 대략 5.2kb 의 상류 hEPO 게놈 서열, 1.1kb의neo전사 유니트, 0.7kb 의 mMT-I 프로모터 및 엑손 5 내에 절단된 hEPO 코딩서열을 함유하고 있는 2.0kb 의 단편, 이 방식으로 소화된 pXEPO-13 의 45㎍ 을 일천 이백만개의 세포를 일렉트로포레이션(일렉트로포레이션 조건은 실시예 1b 에서 설명한 바와 같다)에 사용하였다. 이 일렉트로포레이션을 총 8회 반복하였고, 그 결과 총 9천 6백만개의 세포가 일렉트로포레이션되었다. 세포들을 ml 당 백만 세포의 밀도로 배지와 혼합하고, 1ml 의 일정액을 총 96개로 분배하였으며, 150mm 조직배양 플레이트(Falcon)는 각각 최소한 35ml 의 DMEM/15% 소혈청을 함유하였다. 그 다음날, 배지를 흡인 제거하고 0.8mg/ml 의 G418 (gibco)을 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 인큐벤이션 10일 후, 각 플레이트의 배지를 ELISA 분석에 의한 hEPO 에 대해 샘플화하였다(R & D 시스템). 96 플레이트 중 6개가 최소한 10mU/ml 의 hEPO를 함유하였다. 이들 플레이트 중 하나인 #18을 hEPO 발현 콜로니의 정제를 위해 선택하였다. 각각의 96, 150mm 디쉬는 대략 600개의 G418 내성 콜로니를 함유하였다(모든 96 플레이트에 대해 평가된 총 G418 내성 콜로니의 수는 57,600 이다). 플레이트 #18 상에 있는 대략 600개의 콜로니들을 트립신으로 처리하고 364개의 플레이트(Sterilin) 위에 ml 당 50 세포로 재플레이트하였다. 인큐베이션 일주일 후에, 364 웰 플레이트의 큰 웰당 대략 10 의 콜로니로 단일 콜로니들을 볼 수 있었다(이들 플레이트는 24개의 큰 웰의 각각의 웰내에 있는 16개의 작은 웰로 구성된다). 각각의 웰을 이 시점에서 hEPO 발현에 대해 스크린하였다. 큰 웰중 2개가 최소한 20mU/ml 의 hEPO 가 들어 있는 배지를 함유하였다. 웰 번호 A2 가 16개의 작은 웰에 분배되어 있는 15 콜로니를 함유하는 것으로 발견되었다. 각각의 이들 작은 웰의 내용물을 트립신으로 처리하고 96 웰 플레이트의 16개의 개별적인 웰에 옮겼다. 인큐베이션 7일 후에, 각각의 이들 웰로부터의 배지를 hEPO ELISA 분석을 위해 샘플화하였다. 단지 하나의 웰(웰 번호 10) 만이 hEPO 를 함유하였다. 이 세포 스트레인을 HT165-18A2-10 으로 표시하고, 정량적인 hEPO 분석, RNA 단리 및 DNA 단리를 위해 배양으로 팽창시켰다. hEPO 생성의 정량적인 측정결과 2,500 mU/106세포/24시간의 값을 얻었다.
hEPO 엑손 5의 AccI 부위로부터 3'의 미번역 영역의 Bg1II 부위에 이르는 0.2kb의 DNA 프로브를 사용하여 HT165-18A2-10으로부터 단리된 RNA를 프로브하였다. 엑손 5내에 있는 AccI 부위에서 절단된 표적화 구성물, pXEPO-13은 이들 AccI/Bg1II 서열을 함유하지 않으므로, hEPO 유전자좌에서 표적화하는데 진단용으로 사용할 수 있다, 천연 hEPO 서열과 동종방식으로 재조합되는 세포 스트레인만이 AccI/Bg1II 서열에 상동하는 서열을 함유하는 hEPO mRNA를 생성할 수 있을 것이다. 제한효소 및 서던 분석은neo유전자 및 mMT-I 프로모터가 HT165-18A2-10 세포에서 2개의 hEPO 대립형질중 하나에 대해 표적화되었음을 확인시켜 주었다.
이들 결과는 상동 재조합이 사람 섬유아세포에서 정상적으로는 침묵하는 유전자에 대해 조절영역을 표적화하기 위해 사용될 수 있으며, 그 결과 그 유전자의기능적 활성화를 유발한다.
실시예 5. 인트론이 없는 유전자의 제조
유전자 표적화는 또한 유전자 발현 및 시험관내 단백질 제조를 위해 효모 또는 박테리아에 전달하기 위한, 인트론이 없는 프로세싱된 유전자를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, hGH 는 효모에서 하기에 설명되는 접근법에 의해 제조될 수 있다.
2개의 별도의 표적화 구성물을 제조했다. 표적화 구성물 1 (TC1)은 레트로 바이러스 LTR 서열, 예컨대 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(MoMLV)로부터의 LTR, 포유동물에서 선택가능한 마아커(예컨대 Tn5 로부터의neo유전자), 효모에서 선택가능한 마아커(예컨대 효모 URA3 유전자), 효모에서 유전자 발현을 지시할 수 있는 조절영역(예컨대 GAL4 프로모터), 및 임의로 hGH에 융합될 때 효모 세포로부터 hGH의 분비를 가능하게 할 서열(리더서열)을 포함했다. 벡터는 또한 사람 세포에서 레트로바이러스 패키징을 가능하게 하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 구성물은 상기 서열들의 양 옆에 게놈 hGH 유전자 N 서열과 상동 재조합이 일어날 때 hGH 유전자 N 코돈 1 (성숙한 프로세스된 단백질의 아미노산 위치 1에 상응한다)의 바로 상류에 있는 TC1에 외인성 서열을 통합시킬 hGH 게놈 서열이 있도록 조직된다. 통합이일어날 때 DNA 서열의 순서는 다음과 같다: hGH 상류 및 조절 서열,neo유전자, LTR, URA3 유전자, GAL4 프로모터, 효모 리더 서열, 성숙한 단백질의 아미노산 1을 포함하고 그것의 하류에 있는 hGH 서열들. 표적화 구성물 2 (TC2)는 효모에서 플라스미드가 복제하기에 충분한 서열(예컨대 2-미크론 써클 또는 ARS 서열), 효모 전사 종결 서열, 바이러스 LTR, 및 사람 세포에서 선택하기 위한 마아커 유전자(예컨대 박테리아 gpt 유전자)를 포함했다. 이 구성물은 상기 서열들의 양 옆에 게놈 hGH 유전자 N 서열과 상동 재조합이 일어날 때 hGH 유전자 N 정지 코돈의 바로 하류에 있는 TC2 에 외인성 서열을 통합시킬 hGH 게놈 서열이 있도록 조직된다. 통합이 일어날 때 DNA 서열들의 순서는 다음과 같다 : hGH 엑손 5 서열, 효모 전사 종결 서열, 효모 플라스미드 복제 서열, LTR, gpt 유전자, hGH 3' 미번역 서열.
TC1 및 TC2 로부터 유도된 선형 플라스미드를 hGH 유전자을 플랭킹하는 그것들의 각각의 위치에 대해 차례로 표적화했다. 이들 세포를 헬퍼 레트로바이러스로 초감염시킨 후, 이 영역을 통해 LTR 특정된 전사는 양 단부상에 LTR 서열을 가지는 RNA를 유발할 것이다. 이 RNA의 스플라이싱은 정상적인 hGH 인트론이 제거된 분자를 생신할 것이다. 프로세싱된 전사물의 역전사는 프로세스된 HGH 융합 유전자의 이중 가닥의 DNA 복사체의 축적을 유발할 것이다. DNA를 이중으로 표적화되고 레트로바이러스로 감염된 세포포로부터 단리하여 LTR 내에서 한번 전사 유니트를 절단하는 효소로 소화시킨다. 소화된 물질을 고리화를 촉진하는 조건하에서 결찰시켜 효모 세포안에 도입시킨 후, 세포를 계속해서 URA3 유전자에 대해 선택하기 위해 노출시켰다. URA3 유전자(TC1 및 TC2에 의해 및 프로세스된 hGH 유전자에 의해 도입된 서열에 결합된)를 취한 세포만이 성장할 수 있었다. 이들 세포들은 갈락토오스 유도시 hGH 단백질을 발현할 것이고 성숙한 생물학적으로 활성의 hGH 분자를 생성하기 위해 분비될 때 절단될 융합된 효모 리더 펩티드 서열에 의하여 세포로부터 hGH 단백질을 분비할 플라스미드를 함유했다.
박테리아 세포에서의 발현은 TC1 및 TC2 에서, 단순히 pBR322 로부터의 암피실린-내성 유전자를 효모 URA3 유전자로, tac 프로모터 [deBoeret al.,Proc. Natl. acad. Sci. 80: 21-25 (1983)]를 효모 GAL4 프로모터로, 박테리아 리더 서열을 효모 리더 서열로, pBR322 복제 기원을 2-미크론 써클 또는 ARS 서열로, 및 박테리아 전사 종결[예컨대 trpA 전사 터미네이터 : Christie, G. E.et al.,Proc. natl. Acad. Sci. 78: 4180-4184 (1981)] 서열을 효모 전사 종결 서열로 대체함으로써 이루어진다. 마찬가지로, hEPO 는 효모 및 박테리아에서, 단순히 hEPO 표적화 서열을 가지고 있는 hGH 표적화 서열로, 효모 또는 박테리아 리더 서열이 hEPO 코돈 1 (성숙한 단백질의 아미노산 위치 1 에 상응한다)의 바로 상류에 위치하도록 대체함으로써 발현될 수 있다.
실시예 6. 불멸화된 사람 세포주에서의 EPO 유전자의 활성화 및 증폭
dhfr발현 유니트의 pXEPO-13 (실시예 4 참조)의 유일한 HindIII 부위안으로 의 통합은 이중 선택 및dhfr유전자가 증폭된 세포를 선택할 수 있는 새로운 표적화 벡터를 초래한다. pXEPO-13 중에 있는 단일 HindIII 부위는neo유전자 및 사람의 EPO 유전자의 상류에 있는 자연스럽에 잔재된 게놈 서열의 연결을 제한한다. 이 부위에서 천연의 EPO 유전자좌로부터 유도된 DNA 서열에 의해 둘러싸인neo및dhfr유전자들로dhfr유전자가 대체되는 구성물이 제공된다. pXEPO-13과 같이 상동 재조합에 의해 EPO 유전자좌에 대해 표적화하는 것이 유용하다. 그러한 구성물은 pXEPO4로 표시되고, 제 8도에 도시된다. 플라스미드는 사람의 EPO 유전자의 일부분의 엑손 5 및 엑손 1-4 뿐만 아니라, hEPO 코딩영역의 상류에 있는 HindIII-BamHI 단편을 포함한다. pSVe, pTK 및 pmMT-I 는 SV40 초기 영역, 단순포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나아제 (TK) 유전자 및 마우스 메탈로티오네인-I 유전자로 부터의 프로모터에 상당한다. 이것은 하기와 같이 생성하였다 : HindIII - 소화된 pXEPO-13을 정제하여 DNA 중합효소 1의 클레노우 단편으로 그 끝을 무디게 만들었다.dhfr발현 유니트를 얻기 위해, 플라스미드 구성물 pF8CI9080 (Eatonet al.,Biochemistry 25: 8343-8347 (1986))을 EcoRI 및 SaII 로 소화시켰다. 이 소화물로부터dhfr발현 유니트를 함유한 2kb 단편을 정제하여 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편으로 끈을 무디게 만들었다. 이dhfr- 함유 단편을 pXEPO-13 의 블런트 HindIII 부위에 결찰시켰다. 이 결찰물의 일정분을 대장균안으로 형질전환시켜 암피실린 선택 플레이트상에 펼쳤다. 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 각 각의 박테리아 콜로니를 관찰하여 선별하여 성장시켰다. 이 배양액으로부터 미니 플라스미드 침전물을 만들었으며, 형성된 DNA 효소들, Bg1I + HindIII, 및 SfiI으로 제한효소 소화시킨 후, 삽입된dhfr단편들의 배향을 관찰하였다. 하나의 상기 침전물로부터의 플라스미드 DNA 가dhfr단편의 2kb 삽입물과 같은 것을 함유함을 밝혀냈다. 상기 플라스미드중에서dhfr발현 유니트의 전사 배향은 근접한neo유전자의 배항에 반대됨을 밝혀냈다. 이 구성물을 pXEPO4 로 표시하였다.
플라스미드 pREPO4를 상동 재조합에 의해 세포중에서 hEPO 유전자좌를 증폭시키고 외인성 hEPO 유전자의 활성을 증폭시키기 위해 사용하였다. 이러한 구성물을 사용한 유전자 활성화는 약제 메토트렉세이트(MTX)의 사용으로써 증가된 DHFR 발현을 위한 선택을 가능하게 한다. 전형적으로, 증가된 DHFR 발현은 DNA 증폭을 통한 복사체 수의 증가에 의해 발생되었다. 순수한 결과는dhfr서열에 따른 활성화된 EPO 유전자의 공-증폭일 것이다. 활성화된 EPO 유전자좌의 공-증폭은 EPO 발현을 증가시킬 것이다.
표적화 실험은 HT1080 세포와 pREPO4 중에서 수행하였다. hEPO 발현주 HTREPO-52를 단리하였다. 이 세포주를 EPO 생성에 대해 서던 및 노던 블롯으로 정량 분석하였다. 두가지 스트레인 모두dhfr/neo/mMT-I 서열의 단일 복사체로 표적화됨을 밝혀냈다. 0.8mg/ml의 G418 선택하에서 얻어진 발현수준은 약 1300mU/106세포/1일 이었다. 표적화된 EPO 유전자좌가dhfr발현 유니트를 함유하기 때문에, DHFR과 안티폴레이트 약제, MTX의 증가된 발현에 대해서는 선택 할 수 없었다. 따라서, 이러한 스트레인은 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4μM의 MTX 로 단계 선택하였다. 이 스트레인의 매스 배양물의 초기 선택 결과를 하기 표 4 및 제 7도에 나타낸다.
표 4
MTX의 상승된 수준과 선택은 세포주 HTREPO-52에서 EPO 발현을 증가시켰으며, 세포주 중에서 0.4μM MTX인 EPO 생성중에 70배 증가된 것으로 나타났다. EPO 유전자좌의 증폭확신은 MTX - 내성 세포주중에서 서던 블롯 분석에 의해 성취되었으며, 원래의 (비표적화된) hEPO 대립형질 유전자와 관련되는 활성화된 hEPO 유전자좌의 복사체 수를 10배 증가시켰다.
실시예 7 : 게놈 hEPO 코딩 영역의 CMV 프로모터 1.8 KB의 삽입에 의한 hEPO 융합 유전자 생산 방법
표적 플라스미드 pREPO15의 제작:
pREPO15는 먼저 PCR 증폭에 의해 CMV 프로모터를 hGH 엑손 1에 처음 융해시키므로써 제작했다. 1.6 kb 단편은, 뉴클레오티드 5225에서 시작하여 Genbank 서열HUMGHCSA의 뉴클레오티드 7322에서 끝나는 hGH 서열에 융해된 뉴클레오티드 546에서 시작 및 Genbank 서열 HS5MIEP의 뉴클레오티드에서 끝나는 CMV 프로모터 영역을 갖는, 올리고뉴클레오티드 20 및 35를 사용하여, hGH 발현 구조물 pXGH30 로부터 증폭되었다. 올리고 20(35 염기쌍, 서열 번호:18)은 정상 부위(Genbank 서열 HENCMVP1 에서)에 관계하는 -614에서 CMV 프로모터에서 혼성시켰고, 5' 말단에서 Sa1I부위를 포함시켰다. 올리고 35(42 염기쌍, 서열 번호:19)는 +966 및 인접 hGH 엑손 1에서 CMV 프로모터에서 어닐링시켰고, (스플라이스-도너의 일부를 포함하는)hEPO 개재배열 1의 처음 10 염기쌍 및 5' 말단에서 HindIII을 포함시켰다. 결과로써 얻은 PCR 단편은 HindIII 및 SA1I로 절단하였고 겔-정제시켰다. 플라스미드 pT163은 XhoI 및 HindIII로 절단하였고 neo 발현 유니트를 포함하는 대략 1.1 kb 단편-정제시켰다. 1.6 kv CMV 프로모터/hGH 엑손 1/스플라이스 도너 부위 단편 및 1.2 kb neo 단편을 결찰시켰고 pBSII나+(스트라타게네 인코포레이티드)의 HindIII 부위에 삽입시켰다. 결과로서 생성된 중간물질인 플라스미드는 CMV 프로 모터/hGH 엑손 1/스플라이스 도너 부위 단편의 배양에 반대되는 전사배양에 있어서 neo 발현 유니트를 포함한다. 두 번째 중간 생성물인 pREPO5△HindIII는 HindIII로 pREPO5를 절단함으로써 제조한다. 1.9 kb 및 8.7 kb 의 방출된 두 단편과 EPO 표적화 서열을 포함하는 8.7 kb 편각을 겔 정제화시키고 자체-묶임에 의해 둥글게 뭉친다. 결과로써 생성된 플라스미드인 pREPO5△HindIII는 보통 hEPO 유전자의 상류에 존재하는 비코딩 게놈 DNA 서열만을 포함한다 이는 EPO 엑손 1에 관계는-5786에서 -1까지의 서열을 포함시켰다. neo, CMV 프로모터, hGH 엑손 1, 및 스플라이스-도너부위를 포함하는 2.8 kb 단편은 HindIII로 pBNCHS로부터 실행시키고 겔 정제시켰다, 이 단편은 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 무디게 제조되었고(New England Biloabs, Inc) Bg1II-절단된 및 블런트-말단의 pREPO5△HindIII에 묶었다. Bg1II은 pREPOR△HindIII에서 hEPO 엑손 1의 -1779 염기쌍 위치에서 절단한다. 결과로써 생성된 구조물 pREPO5(도 8)는 hEPO 코딩 영역, neo 발현 유니트, CMV 프로모터, hGH 엑손 1, 스플라이스 도너 부위에 관계가 있는 -5786부터 -1779에 까지의 EOP 상류 서열을 포함했고 hEPO 상류영역의 뉴클레오티드 서열에 관계가 있는 5'에서 3' 으로 리스트된 순서에서, 여러 가지 원소가 모이게 하면서, hEPO 코딩 영역의 -1778부터 -1 염기쌍 상류 까지의 서열을 포함한다. 사람 세포의 형질전환에 대해 pREPO5는 NOT I 및 PvuI로 절단시켜 8.6 kb 표적화 단편을 유리시켰다. 표적화 단편은 hEPO 유전자의 상류 DNA에 상동성을 갖는, 각각 4.0 kb 및 1.8 kb의 첫 번째와 두 번째 표적화 서열을 포함한다.
EPO 발현 표적화된 클론의 세포 배양, 형질전환, 및 확인:
모든 세포를 10%의 송아지 혈청(DMEM/10, 하이클론 연구소)을 포함하는 DMEM에서 5%의 CO2및 98%의 습기, 37℃에 유지시켰다. 이차 사람 포피 섬유아세포의 형질전환을 250 volts 및 960㎌에서 DNA 100㎍으로 PBS(GIBCO)에 있는 12×106개의 세포를 일렉트로포레이팅을 함으로써 실행하였다. 처리된 세포들을 150mm플레이트당 1× 106개의 세포에 시딩했다. 다음날 배지들은 0.8mg/㎖의 G418(GIBCO)을 포함하는 DMEM/10으로 변했다. 14일동안 계속된 선정에서 EPO 생산에 대한 배지들이 견본으로 채취하였다. EPO ELISA(Genzyme inc)에 의해 결정될 만큼 중요한 hEPO 수준(> 5mU/ml)을 나타내는 플레이트상의 모든 클론들을 살균한 유리 클로닝 실린더(bellco)로 단리하고 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 1-2일 동안 배양후 에 이들 웰들을 hEPO 생산에 대한 견본으로 ELISA로 채택했다. 결과로서 생성된 hEPO-생산 세포 스트레인을 동결, 핵산 단리, 및 EPO 생산의 정량화를 위해 배양중에 익스팬딩했다. HT1080세포(ATCC CCL121)의 형질전환을 450 volts 및 250 ㎌에서 DNA 45㎍으로 PBS(GIBCO)에 있는 12×106개의 세포를 처리함으로써 실행하였다. 이차 사람 포피 섬유아세포에 대하여 일어나는 성장과 동정은 하기에 기술하였다. hEPO-생산하는 클론 세포주의 단리는 희석을 제한함으로써 발생했다. 이는 24 웰 플레이트의 웰 당 10-15 클론들의 pool에서 초기의 선택 플레이트에서 수확된 클론들을 최초 플레이팅시킴으로써 수행하였다. 그리고나서 hEPO-생산하는 pool 96 웰 플레이트의 웰당 < 1 의 클론을 낳는 세포 밀도에서 플레이팅시켰다. 개체 클론들은 상기 사람의 포피 섬유아세포에 대해서 기술된 것과 같이 더 이상의 분석을 위해 전개되었다.
EPO 발현 클론의 특성화
pREPO15는 어떠한 hEPO 코딩 서열도 가지고 있지 않다. neo/CMV 프로모터/hGH 엑손 1/hGH 엑손 1의 상류 스플라이스-도너 단편의 표적화 시에, hEPO 발현은 CMV 서열을 포함하는 일차 전사체를 생성하는 CMV 프로모터, hGH 엑손 1 및 스플라이스-도너 부위, 1.8 kb의 상류 hEPO 서열, 정상적인 hEPO 엑손, 인트론, 및 3' 번역되지 않은 서열로부티의 전사 초기화에 의해 발생한다, 이러한 전사를 스플라이싱하는 것은 hGH 엑손 2에 인접한 위치에 있는 하위로 흐르는 스플라이스-억셉터 부위의 다음에 hGH 엑손 1에 인접한 스플라이스-도너 부위로부터 일어날 것이다. 효과적으로 이것은 hEPO 유전자, 정상의 hEPO 프로모터, hGH 엑손 1, 및 hEPO 인트론 1의 게놈 서열로 구성된 새로운 인트론을 유발한다. 완성된 전사체에서, hEPO 엑손 1은 hGH 엑손 1에 의해 치환된다. hEPO 엑손 1은 세포로부터의 분비 이전에 전구체 단백질의 절단된 26 아미노산 시그널 펩티드의 처음 4 및 1/3의 아미노산만을 암호로 한다. hGH 엑손 1은 세포로부터 분비 이전에 전구체 단백질의 절단된 hGH 시그널 펩티드의 처음 3 및 1/3의 아미노산만을 암호로 한다. 그러므로 hEPO 엑손 1이 hGH에 의해 치환되는 메시지의 번역은, 시그널 펩티드가 hGH 및 hEPO 서열의 키메라인 단백질을 생성할 것이다. 보통의 번역후 절단에 의한 시그널 펩티드의 제거는 일차 서열이 정상적인 생성물과 구별할 수 없는 성숙한 hEPO 분자를 생성케 한다.
사람 섬유아세포로의 pREPO15의 형질전환은 이들 세포에 의한 EPO 발현의 결과를 낳았다. 표 5는 사람 섬유아세포 및 HT1080 세포에서 pREPO15를 사용한 표적화 실험의 결과를 나타낸다. 정상적인 사람 섬유아세포에서 표적화 빈도수가 1/264 G418r클론임이 판명되었고, HT1080 세포를 가지고 했을 때의 표적화 빈도수는 1/450 G418r클론임이 판명되었다. 각각의 이들 세포 스트레인으로부터 hEPO 생산 수준을 수량화하였다. 사람 섬유아세포의 형질전환으로부터 획득된 하나의 hEPO 생산자가 7.676 mU/106세포들/day를 분비하고 있음이 판명되었다. HT1080 세포들로부터 활성화된 hEPO 세포주은 12,582 mU/106세포들/day를 생산하고 있었다(표 5). 이 결과들은 hEPO 부위의 활성이 효과적이고 상대적으로 고수준에서 hEPO가 생산되게 야기시킨 것을 나타낸다. 제한효소 및 서던 혼성화 분석은 표적화 사건들이 EPO 부위에서 일어났다는 것을 증명하는데 사용되었다.
pREPO15로 표적화된 사람 섬유아세포 및 HT1080 클론의 서던 블롯 분석을 수행했다. 도 9A는 원래 및 표적화된 hEPO 부위의 제한 지도를 나타내며, 도 9B는 표적화된 사람 섬유아세포 클론에 대한 서던 블롯 분석 및 제한효소 결과를 제시한다. Bg1II/EcoRI 및 BamH 절단은 hEPO 부위 (레인 T1)에서의 표적화 사건의 결과로써 각각 5.9 및 6.6 kb 단편을 나타낸다. 이들 단편 둘 모두 neo 유전자 및 CMV 프로모터 서열을 포함하는 2.7kb의 DNA의 삽입으로부터 수득된 결과였다. 두 개의 hEPO 대립 유전자 중에서 한 개만이 표적화되므로, 불변의 hEPO 부위를 반영하는 4.3kb (Bg1II/EcoRI) 또는 10.6kb의 단편들은 이들 스트레인 및 원래의 DNA (레인 HF)에 제시되었다. 이들 결과들은 상동 재조합 사건이 사람 에리트로포이에틴의 생성을 유도하는 새로운 전사 유닛의 생성을 초래하는 hEPO 부위에서 발생하였음을확신케하였다.
표 5. 사람 세포에서 hEPO 발현의 활성화 및 pREPO15의 형질전환
a: 결과를 평균하고 플레이트의 총 수에 외삽하면서, 2개의 플레이트의 클론들을 계산함으로써 얻어지는 수치
b: G418r콜로니를 지닌 플레이트로부터의 배지를 EPO ELISA 분석을 위해 샘플링하고, 5mU/ml 이상의 hEPO 수준을 나타내는 것들은 EFO 활성화 사건으로 계수함.
c: 정량적 hEPO 생산을 사람 섬유아세포 스트레인, HF342-15 또는 HT1080 세포주, HTREPO15-1-6-6으로부터 측정했다.
실시예 8 : 게놈 hEPO 코딩 영역의 CMV 프로모터 1.8 KB 상류의 삽입에 의한 hEPO 융합 유전자의 생성 및 증폭
표적화 플라스미드 pREPO18의 구성:
pREPO18 (도 10)은 pREPO15의 neo 유전자의 5' 말단에 위치한 ClaI 부위에서 dhfr 발현 유니트를 삽입하여 구성하였다. dhfr 발현 유니트를 수득하기 위해 플라스미드 구성 pF8CIS9080 [Eaton et al., Biochemistry 25: 8343-8347(1986)]을 EcoRI 및 SalI로 절단하였다. dhfr 발현 유니트를 포함하는 2kb 단편을 이러한 절단으로부터 정제하고 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하여 블런트를 형성 시켰다. 다음 ClaI 링커 (New England Biolabs)를 블런트 dhfr 단편과 결찰시켰다. 결찰된 생성물은 ClaI 소화된 pREPO15에 결찰된 ClaI으로 소화시켰다. 이 결찰의 일부를 대장균내로 형질전환시키고 임피실린 선택 플레이트에 플레이팅시켰다. 박테리아 콜로니들을 삽입된 dhfr 단편의 배향성을 결정하기 위해 제한 효소의 소화해에 의해 분석했다. neo 유전자의 배향성과 반대되는 전사 배향성에서 dhfr을 갖는 플라스미드를 pREPO18(-)로 나타냈다. neo 유전자의 배향성과 같은 전사 배양성에서 dhfr을 갖는 두 번째 플라스미드를 pREPO18(+)로 나타내었다.
EPO 발현 표적화된 클론들의 세포 배양, 형질전화, 및 확인:
모든 세포를 10%의 송아지 혈청(DMEM/10, 하이클론 연구소)을 포함하는 DMEM에서 5%의 CO2및 98%의 습기, 37℃에 유지시켰다. HT1080 세포의 형질전환을 450volts 및 250㎌에서 DNA 45㎍으로 PBS(GIBCO)에 있는 12×106개의 세포를 처리하여 발생시켰다. 처리된 세포들을 150mm 플레이트당 1×106개의 세포에 시딩했다. 다음날 배지들은 0.8mg/㎖의 G418(GIBCO)을 포함하는 DMEM/10으로 변했다. 14일 동안 선택하였으며, EPO 생산에 대해 배지들을 샘플링 하였다. EPO ELISA(Genzyme inc)에 의해 측정된 것으로서 상당한 hEPO 생산 수준( > 5mU/ml)을 나타내는 플레이트를 트립신 처리하고, 세포들을 클론의 단리를 위해 다시 플레이팅시켰다. hEPO-생산 클론성 세포주의 단리는 제한 희석 (24 웰 플레이트의 웰당 10-15 콜로니(군체)의 풀중의 클론을 1차 플레이팅하고, 96 웰 플레이트의 웰당 1 콜로니 미만인 결과를 낳는 세포 밀도에서의 hEPO-생산 풀로부터 세포를 플레이팅하여)으로 수행하였다. 각각의 클론을 동결, 핵산 단리, 및 EPO 생산의 정량을 위해 배양중에 익스팬딩 시켰다.
메토트렉세이트 선택에 의한 증폭된 dhfr 서열을 함유하는 세포의 단리:
pREPO18로 형질전환한 다음 hEPO를 생산하는 표적화된 G418r세포주를 메토트렉사트(MTX)를 선택하기위해 다양한 세포 밀도에서 플레이팅시켰다. 새로운 클론이 특정 MTX 농도에서 선택을 한 이후 발생됨에 따라, 발명자들은 hEPO 생성에 대해서 분석하고 더 높은 농도의 MTX(일반적으로 이전 농도의 2배)에서의 다양한 세포 밀도에서 재-플레이팅시켰다. 본 방법은 원하는 hEPO 생산 수준이 도달될 때까지 반복시켰다. MTX-저항의 각 단계에서, DNA 및 RNA가 각각의 서던 앤 노던 블롯 분식을 위해 단리시켰다.
EPO 발현 클론의 특성화:
두가지의 다른 dhfr 배양을 갖는 pREPO18을 HT1080 세포로 형질전환시켰다. 형질전환 이전에 pREPO18(+) 및 PREOI18(-)는 XbaI로 절단되어 하기 순서에서(hEPO ATG 스타트 코돈에 관계가있는 -3891부터 -1779까지의) hEPO 엑손 1의 게놈 DNA 상류의 2.1 kb 영역, dhfr 유전자를 포함하는 2 kb 영역, neo 유전자를 포함하는 1.1 kb 영역, hGH 엑손 1에 융해된 CHV 프로모터를 포함하는 1.5 kb 영역, (스플라이스_도너 부위를 포함하는) hEPO 개재배열 1의 10 kb이고 다음이 (EPO ATG 스타트 코돈에 관계가 있는 -1778부터 -678까지의) hEPO 엑손 1의 게놈 DNA 상류의 1.1 kb를 포함하는 7.9 kb 표적화 단편을 방출했다. 두 실험으로부터 형질전환 및 표적화 빈도수를 표 6에 나타내었다. 5개의 일차 G418r클론들을 본 실험으로부터 단리시켰다. 이들을 hEPO 발현의 정량 분석을 위해 배양 조직에서 익스팬딩시켰다(표 7). pREPO18이 dhfr 유전자를 함유함에 따라, 실시예 6에 설명된 MTX를 사용하는 표적화 구성물의 증폭된 복사체를 포함하는 세포를 선택하는 것이 가능하다. 제한효소 및 서던 혼성화 분석에 의해 hEPO 부위에 표적화 되는 것을 확증하는 G418r클론들은 하기에 기술된 것 같이 MTX에서 단계적으로 선택되었다.
표 6 : HT1080 세포에서 pREPO18의 표적화
표 7 : pREPO18을 가지고 표적화된 HT1080 세포주에서 hEPO 생성
실시예 9 : 불멸화된 사람 세포내의 내인성 α-인터페론, GM-CSF, G-CSF 및 FSHβ유전자의 활성화 및 증폭
광범위한 다양성의 내인성 세포 유전자는 본 발명의 방법 및 DNA 구조를 사용하여 활성화되고 증폭될 수 있다. 하기 사람 α-인터페론(백혈구 인터페론), GM-CSF(콜로니 자극 인자-과립백혈구/대식세포), G-CSF(콜로니 자극 인자-과립 백혈구) 및 FSHβ(소포 자극 호르몬 베타 서브유니트) 유전자를 활성화시키고 증폭시키는 일반적인 방법을 기술한다.
α-인터페론
사람 α-인터페론 유전자(진뱅크 서열 HUMIFNAA)은 23 아미노산 시그널 펩티드를 포함한 188 아미노산 전구 단백질을 코딩한다. 도 11은 α-인터페론 유전자를활성화시키는 한 방법을 개략적으로 도시한다. 표적화 구성물은 상기 유전자의 서열 상류에 상동성을 갖는 제 1 표적 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택가능한 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위, 인트론, 스플라이스-억셉터 부위, 및 제 1 표적 서열의 서열 하류에 상응하는 제 2 표적 서열을 포함하도록 구성된다. 제 2 표적 서열은 바람직하지 않은 ATG 개시 코돈을 피하기 위해 정상 개시 코돈에 비해 -107 위치보다 더욱 상류로 연장되지 않아야 한다.
상기 방법에서, 제 1 및 제 2 표적 서열은 정상 표적 유전자내에서 서로 바로 인접해 있으나, 이것이 필수적인 것은 아니다(하기 참조). 선택성 증폭가능한 마아커 유전자 및 선택성 마아커 유전자가 본원에서 기술된다. 증폭가능한 마아커 유저자 및 선택성 마아커 유전자는 동일한 유전자일 수 있으며, 이들의 위치가 바뀔 수 있고, 하나 또는 모두가 표적화 구성물의 인트론에 위치할 수 있다. 선택성 마아커 유전자는 임의적인 것이며, 증폭가능한 마아커 유전자는 증폭이 바람직한 경우에만 요구된다. 특정 CAP 부위의 혼입은 임의적이다. 임의로, 또 다른 유전자로부터의 엑손 서열은 표적화 구성물내에서 3'의 스플라이스-억셉터 부위 및 5'- 제 2 표적 서열을 포함할 수 있다. 조절 영역, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위, 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위는 사람 연장 인자-1α(EF-1α : 유전자 은행 서열 HUMEFIA) 유전자 또는 사이토메갈로바이러스(CMV: 유전자 은행 서열 HEHCMVP1)의 초기 영역(immediate early region)로부터 완전한 유니트로서 분리시킬 수 있으며, 상기 성분은 다른 유전자로부터 분리된 적절한 성분으로부터 어셈블리시킨다.
표적화 서열로서의 용도 및 표적화 구성물의 어셈블리를 위한 α-인터페론유전자의 상류 영역에 상응하는 게놈 DNA는 본 기술분야의 전문가에 공지된 재조합 DNA 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 다수의 선택성 마아커 및 증폭가능한 마아커를 표적화 구성물내에 사용할 수 있으며, 많은 세포-유형에서 활성화 및 증폭화가 수행될 수 있다. 1 차, 2 차 또는 불멸화된 사람 세포의 형질전환 및 α-인터페론을 발현시키는 상동 재조합 세포의 분리는 사람 α-인터페론에 대한 ELISA 검정을 사용하는 실시예 4에서 기술된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다[참조: Biosource International, Camarillo, CA]. 선택적으로, 상동 재조합 세포는 실시예 1g 및 1j에서 기술된 바와 같이 PCR 스크린닝에 의해 확인될 수 있다. 증폭가능한 마아커 유전자 및 활성화된 α-인터페론 유전자좌의 증폭된 복사체를 포함하는 세포의 분리는 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행된다.
상동 재조합 세포에서, 외인성 엑손, 스플라이스-도너 부위, 인트론, 스플라이스-억셉터 부위, 제 2 표적화 서열, 및 사람 α-인터페론 코딩 영역 및 3'의 해독되지 않은 서열(도 11)을 포함하는 mRNA 전구체가 생성된다. 상기 메시지의 스플라이싱으로 해독되어 사람 α-인터페론을 생성시킬 수 있는 기능성 mRNA를 발생시킬 것이다. 인트론의 크기 및 이에 따른 유전자의 코딩 영역에 대한 조절 영역의 위치를 조절 영역의 기능성을 최적화하도록 변화시킬 수 있다. 다수의 엑손이 표적화 구성물내에 존재할 수 있다. 또한, 제 2 표적화 서열은 유전자의 정상 상류 영역 부분이 상동 재조합체상에서 삭제되도록 정상 유전자내의 제 1 표적화 서열에 또는 그 인접부에 바로 인접하여 위치시킬 필요는 없다.
GM-CSF
사람 GM-CSF 유전자(진뱅크 서열 HUMGMCSFG)는 17 아미노산 시그널 펩티드를 포함하는 144 아미노산 전구 단백질을 코딩한다. 상기 유전자는 4개의 엑손 및 3개의 인트론을 포함하며, 전구체의 N-말단 50 아미노산을 제 1 엑손내에서 코딩시킨다. 도 12는 GM-CSF 유전자를 활성화시키기 위한 방법을 개략적으로 도시한 것이다. 상기 방법에서, 표적화 구성물는 유전자 서열 상류와 상동성을 갖는 제 1 표적 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택성 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, GM-CSF의 제 1의 50 아미노산의 서열과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 코딩하는 엑손, 스플라이스-도너 부위 및 제 1 표적 서열의 서열 하류에 상응하는 제 2 표적 서열을 포함하도록 구성된다. 상기 방법에 의해, 상동 재조합 세포는 GM-CFS 유전자의 외인성 엑손 및 스플라이스-도너 부위, 제 2 표적 서열, 제 2 서열 및 개시 코돈사이의 서열, 및 GM-CSF 유전자의 엑손, 인트론 및 3' 해독되지 않은 영역에 해당하는 mRNA 전구체를 생성시킨다(도 11).
상기 메시지의 슬라이싱은 외인성 엑손을, 해독되는 경우에 GM-CSF를 생성시킬 GM-CSF 유전자의 엑손(2)에 융합시킨다.
상기 방법에서, 제 1 및 제 2 표적화 서열은 정상 표적 유전자와 바로 인접하나, 이것의 요구되는 것은 아니다(하기 참조). 선택하기에 적합한 증폭가능한 마아커 유전자 및 선택성 마아커 유전자가 본원에 기술된다. 증폭가능한 마아커 유저자 및 선택성 마아커 유전자는 동일한 유전자이거나, 이들의 위치가 바뀔 수 있다. 선택성 마아커 유전자 및/또는 증폭가능한 마아커 유전자는 표적화 구성물 내에서 스플라이스-도너 부위 및 제 2 표적화 서열사이에 위치시킬 수 있다. 특정 CAP 부위의 혼입은 임의적이다. 조절 영역, CAP 부위 및 스플라이스-도너 부위는 사람 연장 인자-1α(EF-1α; 유전자 은행 서열 HUMEF1A) 유전자 또는 사이토메갈로 바이러스 (CMV; 유전자 은행 서열 HEHCMVP1)의 초기 영역(Immediate early region)로부터 완전한 유니트로서 분리시킬 수 있으며, 상기 성분은 상이한 유전자(예를 들어, mMt-I 프로모터 및 CAP 부위, hGH 또는 hEPO유전자로부터의 엑손(1) 및 스플라이스 도너 부위)로부터 분리된 적합한 성분으로부터 어셈블리할 수 있다.
다른 방법이 사용될 수 있으며 예를 들어, 제 1 및 제 2 표적화 서열은 GM-CSF 유전자의 제 1 인트론내의 서열과 상응할 수 있다. 선택적으로, α-인터페론에 대한 기술된 것과 유사한 표적화 구성물을 사용할 수 있으며, 여기서 표적화 구성물은 GM-CSF 유전자의 서열 상류에 상동성을 갖는 제 1 표적화 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택성 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위, 인트론, 스플라애스 억셉터 부위 및 제 1 표적화 서열의 서열 하류에 상응하는 제 2 표적화 서열을 포함하도록 구성된다.
어떠한 경우에도, 제 2 표적화 서열은 유전자의 정상 상류 영역 부분이 상동 재조합체상에서 삭제되도록 정상 유전자내의 제 1 표적화 서열에 또는 그 인접부에 바로 인접하여 위치시킬 필요는 없다. 또한, 다수개의 비-코딩 또는 코딩 엑손이 표적화 구성물내에 존재할 수 있다. 표적화 서열로서의 용도 및 표적화 구성물의 어셈블리를 위한 사람 GM-CSF 유전자의 인트론 영역에 상응하는 게놈 DNA는 보 기술이 속하는 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 원에서 기술된 바와 같이, 다수의 선택성 마아커 및 증폭가능한 마아커를표적화 구성물내에 사용할 수 있으며, 많은 세포-유형에서 활성화 및 증폭화가 수행될 수 있다. 1 차, 2 차 또는 불멸화된 사람 세포의 형질전환 및 GM-CSF를 발현시키는 상동 재조합 세포의 분리는 사람 GM-CSF에 대한 ELISA 검정을 사용하는 실시예 4에서 기술된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다[참조: R & D Systems, Minneapolis, MN], 선택적으로, 상동 재조합 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 PCR 스크리닝에 의해 확인될 수 있다. 증폭가능한 마아커 유전자 및 활성화된 α-인터페론 유전자좌의 증폭된 복사체를 포함하는 세포의 분리는 상기에서 기술된 바와 같이 수행된다.
G-CSF
사람 G-CSF 유전자 (진뱅크 서열 HUMGCSFG)는 30 아미노산 시그널 펩티드를 포함하는 204-207 아미노산 전구 단백질을 코딩한다. 상기 유전자는 5개의 엑손 및 4개의 인트론을 포함한다. 제 1 엑손은 시그널 펩티드의 13 아미노산을 코딩한다. 도 13은 G-CSF 유전자를 활성화시키기 위한 방법을 개략적으로 도시한다. 상기 표적화 구성물은 유전자 서열 상류와 상동성을 갖는 제 1 표적 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택가능한 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, G-CSF 의 제 1 의 13 아미노산의 서열과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 코딩하는 엑손, 스플라이스-도너 부위 및 제 1 표적 서열의 서열 하류에 상응하는 제 2 표적 서열을 포함하도록 구성된다. 상기 방법에 의해, 상동 재조합 세포는 G-CSF 유전자의 외인성 엑손 및 스플라이스-도너 부위, 제 2 표적 서열, 제 2 서열 및 개시 코돈 사이의 서열, 및 G-CSF 유전자의 엑손, 인트론 및 3' 번역되지 않은 영역에 해당하는 mRNA 전구체를 생성시킨다(도 13). 상기 메시지의 슬라이싱은 외인성 엑손을, 번역되는 경우에 G-CSF를 생성시킬 G-CSF 유전자의 엑손(2)에 융합시킨다. 정상 C-CSF 시그널 펩티드의 제 1의 13 개의 아미노산을 외인성 엑손내에 존재하는 것들로 기능 치환시키는 능력은 어느 하나를 시그널 펩티드를 변형시키고, 이에 따라 단백질내 분비 특성을 변형시킨다.
상기 방법에서, 제 1 및 제 2 표적화 서열은 정상 표적 유전자와 바로 인접하나, 이것이 요구되는 것은 아니다. 제 2 표적화 서열은 유전자의 정상 상류 영역 부분이 상동 재조합체상에서 삭제되도록 정상 유전자내의 제 1 표적화 서열에 또는 그 인접부에 바로 인접하여 위치시킬 필요는 없다. 증폭가능한 마아커 유저자 및 선택성 마아커 유전자는 동일한 유전자이거나, 이들의 위치가 바뀔 수 있다. 선택성 마아커 유전자 및/또는 증폭가능한 마아커 유전자는 표적화 구성물내에서 스플라이스-도너 부위 및 제 2 표적화 서열사이에 위치시킬 수 있다. 특정 CAP 부위의 혼입은 임의적이다. 조절 영역, CAP 부위 및 스플라이스-도너 부위는 사람 연장 인자-1α(EF-1α; 유전자 은행 서열 HUMEFIA) 유전자 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV; 유전자 은행 서열 HEHCMVP1)의 초기 영역(immediate early region)로부터 완전한 유니트로서 분리시킬 수 있으며, 상기 성분은 상이한 유전자(예를 들어, mMt-I 프로모터 및 CAP 부위, hGH 또는 HEPO유전자로 부터의 엑손(1) 및 스플라이스 도너 부위)로 부터 분리된 적합한 성분으로 부터 어셈블리시킬 수 있다. 코딩 또는 비-코딩시키는 다수개의 외인성 엑손은, 스플라이싱시에 성숙된 단백질로 인-프레임로 존재하는 ATG 개시 코돈이 엑손중 어느 하나에 포함되는 한 표적화 구성물에사용될 수 있다.
또 다른 방법이 사용될 수 있으며 예를 들어, 제 1 및 제 2 표적화 서열은 G-CSF 유전자의 제 1 인트론내의 서열과 상응할 수 있다 선택적으로, α-인터페론에 대한 기술된 것과 유사한 표적화 구성물을 사용할 수 있으며, 여기서 표적화 구성물은 G-CSF 유전자의 서열 상류에 상동성을 갖는 제 1 표적화 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택성 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위, 인트론, 스플라이스 억셉터 부위 및 제 1 표적화 서열의 서열 하류에 상응하는 제 2 표적하 서열을 포함하도록 구성된다.
표적화 서열로서의 용도 및 표적화 구성물의 어셈블리를 위한 사람 G-CSF 유전자의 인트론 영역에 상응하는 게놈 DNA는 보 기술이 속하는 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 원에서 기술된 바와 같이, 다수개의 선택성 마아커 및 증폭가능한 마아커를 표적화 구성물내에서 사용할 수 있으며, 많은 세포-유형에서 활성화 및 증폭화가 수행될 수 있다. 1 차, 2 차 또는 불멸화된 사람 세포의 형질전환 및 G-CSF를 발현시키는 상동 재조합 세포의 분리는 사람 S-CSF에 대한 ELISA 검정을 사용하는 실시예 4에서 기술된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다[참조: R & D Systems, Minneapolis, MN]. 선택적으로, 상동 재조합 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 PCR 스크린닝에 의해 확인될 수 있다. 증폭가능한 마아커 유전자 및 활성화된 α-인터페론 유전자좌의 증폭된 복사체를 포함하는 세포의 분리는 상기에서 기술된 바와 같이 수행된다.
FSHβ
사람 FAHβ유전자(진뱅크 서열 HUMGCSH1)는 16개의 아미노산 시그널 펩티드를 포함하는 129개의 아미노산 전구 단백질을 코딩한다. 상기 유전자는 3개의 엑손 및 2개의 인트론을 포함하며, 여기서 제 1 인트론은 비-코딩 엑손이다. FSHβ의 활성화가 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 방법이 도 14에 도시된다. 상기 방법에서, 표적화 구성물은 유전자 서열 상류와 상동성을 갖는 제 1 표적 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택성 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, 엑손, 스플라이스-도너 부위 및 제 1 표적 서열의 서열 하류에 상응하는 제 2 표적 서열을 포함하도록 구성된다. 상기 방법에 의해, 상동 재조합 세포는 FSHβ유전자의 외인성 엑손 및 스플라이스-도너 부위, 제 2 표적 서열, 제 2 서열 및 개시 코돈 사이의 서열, 및 FSHβ유전자의 엑손, 인트론 및 3' 해독되지 않은 영역에 해당하는 mRNA 전구체를 생성시킨다(도 14). 상기 메시지의 스플라이싱은 외인성 엑손을, 번역되는 경우에 FSHβ를 생성시킬 수 있는 FSHβ유전자의 엑손(2)에 융합시킨다. 상기 방법에서, 제 1 및 제 2 표적화 서열은 정상 표적 유전자와 바로 인접하나, 이것이 요구되는 것은 아니다(하기 참조).
또 다른 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 제 1 및 제 2 표적화 서열은 FSHβ유전자의 제 1 인트론내의 서열과 상응할 수 있다. 선택적으로, α-인터페론에 대한 기술된 것과 유사한 표적화 구성물을 사용할 수 있다. 상기 방법에서, 표적화 구성물은 FSHβ 유전자의 서열 상류에 상동성을 갖는 제 1 표적화 서열, 증폭가능한 마아커 유전자, 선택성 마아커 유전자, 조절 영역, CAP 부위, 스플라이스-도너 부위, 인트론, 스플라이스 억셉터 부위 및 제 1 표적화 서열의 서열 하류에상응하는 제 2 표적화 서열을 포함하도록 구성된다. 제 2 표적 서열은 바람직하지 않은 ATG 개시 코돈을 피하기 위해 정상 FSHβ전사 개시 코돈에 대해 -40 위치보다 더 상류로 연장되지 않아야 한다. 상동 재조합 세포에서, 외인성 엑손, 스플라이스-도너 부위, 인트론, 스플라이스-억셉터 부위, 제 2 표적화 서열, 및 사람 FSHβ코딩 엑손, 인트론 및 3'의 번역되지 않은 서열을 포함하는 mRNA 전구체가 생성된다. 상기 메시지의 스플라이싱으로 번역되어 사람 FSHβ 를 생성시킬 수 있는 기능성 mRNA를 발생시킬 것이다. 인트론의 크기 및 이에 따른 유전자의 코딩 영역에 대한 조절 영역의 위치를 조절 영역의 기능성을 최적화하도록 변화시킬 수 있다.
또 다른 활성화 방법에서, 제 2 표적화 서열은 유전자의 정상 상류 영역 부분이 상동 재조합체상에서 삭제되도록 정상 유전자내의 제 1 표적화 서열에 또는 그 인접부에 바로 인접하여 위치시킬 필요는 없다. 또한, 표적화 서열이 유전자의 상류에 존재할 수 있으며, FSHβ유전자의 엑손 또는 인트론내에 존재할 수 있다.
증폭가능한 마아커 유전자 및 선택성 마아커 유전자는 동일한 유전자일 수 있으며, 그들이 위치는 서로 바뀔 수 있고, 하나 또는 두 개 모두가 표적화 구성물의 인트론내에 위치할 수 있다. 선택하기에 적합한 증폭가능한 마아커 유전자 및 선택성 마아커 유전자가 본 원에서 기술된다. 선택성 마아커 유전자는 임의적이며, 증폭가능한 마아커 유전자는 증폭화가 필요한 경우에만 요구된다, 특정 CAP 부위의 혼입은 임의적이다.
임의로, 또 다른 유전자로 부터의 엑손 서열은 표적화 구성물내에서 3' 의스플라이스-억셉터 부위 및 5'-제 2 표적 서열을 포함할 수 있다. 조절 영역, CAP 부위, 엑손, 스플라이스-도너 부위, 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위는 사람 연장 인자-1a(EF-1a; 유전자 서열 은행 HUMEF1A) 유전자 또는 사이토메갈로바이러스(CMV; 진뱅크 서열 HECMVP1)의 초기 영역으로 부터 완전한 유니트로서 분리시킬 수 있으며, 상기 성분은 상이한 유전자로부터 분리된 적합한 성분으로부터 어셈블리시킬 수 있다. 어떠한 경우에서, 외인성 엑손은 정상 FSHβ유전자의 제 1 엑손과 동일하거나 상이할 수 있으며, 다수개의 엑손이 표적화 구성물내에 존재할 수 있다.
표적화 서열로서의 용도 및 표적화 구성물의 어셈블리를 위한 FSHβ유전자의 인트론 영역에 상응하는 게놈 DNA는 본 기술이 곳하는 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 원에서 기술된 바와 같이, 다수개의 선택성 마아커 및 증폭가능한 마아커를 표적화 구성물내에서 사용할 수 있으며, 많은 세포-유형에서 활성화 및 증폭화가 수행될 수 있다. 경우에 따라, 활성화된 FSHβ유전자의 생성물은 사람 당단백질 α-서브유니트를 발현시키는 세포 유형으로 생성시킬 수 있으며, 상기 생성물은 FSHβ유전자 생성물과 이형이합체를 형성한다. 이것은 1 차, 2 차 또는 불멸화된 사람 세포의 형질전환 및 G-CSF를 발현시키는 상동 재조합 세포의 분리는 사람 G-CSF에 대한 ELISA 검정을 사용하는 실시예 4에서 기술된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다[참조: R & D Systems, Minneapolis, MN]. 선택적으로, 상동 재조합 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 PCR 스크리닝에 의해 확인될 수 있다. 증폭가능한 마아커 유전자 및 활성화된 α-인터페론 유전자좌의 증폭된 복사체를 포함하는 세포의 분리는 상기에서 기술된 바와 같이 수행된다.
동등물
당업자들은 본 명세서에 설명된 본 발명의 특정 구체예에 단지 통상적인 실험, 많은 동등물을 사용하여 인식될 수 있거나, 또는 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 하기 청구항에 포함된다.
본 발명에 따라, 상동 재조합에 의한 숙주 세포 염색체 DNA 내로 상기에 설명된 구성물의 도입을 통해 시험관내 또는 생체내 단백질을 생성할 수 있고, 상동 재조합 세포는 전사, 번역 및 분비를 일어나게 하는 조건하에서 유지되어 관심의 단백질을 생성할 수 있다. 또한 본 발명에 따라서, 관심 유전자(정상 유전자의 전사 영역에 바로 융합됨)에 바로 인접한 곳에서부터 30 kbp. (kilobase pairs) 또는 추가로 내인성 유전자의 전사된 영역의 상류, 또는 내인성 유전자의 인트론내에 이르는 많은 위치에서 외인성 조절 서열을 위치화시킴으로써 내인성 유전자를 활성화시키는 능력은 세포안에서의 유전자를 발현시킬 수 있다. 또한 본 발명의 상동 재조합 불멸화된 세포, 또다른 종으로부터의 상동 재조합 세포(상동 재조합 이종 세포), 또는 비조직접합성-대응 도너(상동 재조합 동종 세포)가 사람 또는 동물 질병을 치료하기 위해 또는 농업적인 용도(즉, 육류 및 유제품 생성)을 위해 이식될 수 있고, 치료 처방이 어떠한 이유로 중단되어야 할 때 제거를 위한 세포에 용이한 접근성을 제공함으로써 편리한 단기간(즉, 일시적인) 치료법을 가능케 한다.

Claims (34)

  1. DNA 구성물이 세포의 염색체 DNA내의 표적 부위와 상동재조합되는 경우, 세포내의 표적화된 유전자의 발현을 변형시키며, (a) 표적 부위에 상동성인 표적화 서열; (b) 외인성 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 엑손의 3' 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물로서, 표적화 서열을 표적 부위와 상동재조합시키면, 세포의 염색체 DNA가 표적화된 유전자의 모든 내인성 엑손 이외에 DNA 구성물 유도된 엑손을 포함하며, 표적화된 유전자가 γ-인터페론, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-과립 백혈구(G-CSF), CSF-대식세포(M-CSF), CSF-과립 백혈구/대식세포(GM-CSF), FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루카곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 단백질 키나아제 C, 유로키나아제, 안티트롬빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다아제, 티로신 히드록실라아제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XⅢ, IL-2 길항제 및 용해성 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 DNA 구성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 구성물 유도된 엑손이 표적화된 유전자의 첫 번째 내인성 엑손의 DNA 서열과 다른 DNA 서열로 구성됨을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  3. DNA 구성물이 세포의 염색체 DNA내의 표적 부위와 상동재조합되는 경우, 세포내의 표적화된 유전자의 발현을 변형시키며, (a) 표적 부위에 상동성인 표적화 서열; (b) 외인성 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 엑손의 3' 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물로서, 표적 서열을 표적 부위와 상동재조합시키면, (b) 내지 (d)는 표적화된 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 위치하며, 표적화된 유전자는 γ-인터페론, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-과립 백혈구(G-CSF), CSF-대식세포(M-CSF), CSF-과립 백혈구/대식세포(GM-CSF), FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루카곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 단백질 키나아제 C, 유로키나아제, 안티트롬빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다아제, 티로신 히드록실라아제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XⅢ, IL-2 길항제 및 용해성 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 DNA 구성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 엑손이 표적화된 유전자의 첫 번째 엑손의 DNA 서열과 다른 DNA 서열로 구성됨을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 표적화된 유전자가 α-갈락토시다아제를 코딩함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 구성물 유도된 엑손이 FSHβ유전자의 첫 번째 엑손과 동일함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 수득된 세포가 사람 글리코단백질 α-서브유니트를 발현시킴을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 세포가 외인성 프로모터의 조절하에 사람 글리코단백질 α-서브유니트를 발현시킴을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  9. 제 3 항에 있어서, 표적화된 유전자가 GM-CSF를 코딩함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 구성물 유도된 엑손이 GM-CSF 전구체 단백질의 처음 50개의 아미노산을 코딩함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 구성물 유도된 엑손이 작용성 시그널 펩티드를 포함하는 서열을 코딩함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  12. 제 3 항에 있어서, 표적화된 유전자가 G-CSF를 코딩함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 구성물 유도된 엑손이 G-CSF 시그널 펩티드의 처음 13개의 아미노산을 코딩함을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  14. DNA 구성물이 세포의 염색체 DNA내의 표적 부위와 상동재조합되는 경우, 세포내의 표적화된 유전자의 발현을 변형시키며, (a) 표적 부위에 상동성인 표적화 서열; (b) 외인성 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 엑손의 3' 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물로서,
    표적 서열을 표적 부위와 상동재조합시키면, (b) 내지 (d)는 표적화된 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 위치하며, 외인성 조절 서열이 아데노바이러스 유전자의 조절 서열, 콜라겐 유전자의 조절 서열, 액틴 유전자의 조절 서열, HMC-CoA 환원효소 유전자의 조절 서열 또는 EF-1α 유전자의 조절 서열인 DNA 구성물.
  15. (a) 게놈이 (i)외인성 조절 영역을 갖는 표적화된 유전자 및 (ii)표적 부위를 포함하는 세포를 제공하는 단계;
    (b) (i) 표적 부위에 상동성인 표적화 서열; (ⅱ) 외인성 조절 서열; (ⅲ) 엑손, 및 (ⅳ) 엑손의 3'말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물을 제공하는 단계;
    (c) 세포를 DNA 구성물로 형질전환시켜 형질전환된 세포를 생성시키는 단계;
    (d) 상동재조합에 적합한 조건하에 형질전환된 세포를 유지시켜, 게놈이 표적화된 유전자의 모든 내인성 엑손 이외에 외인성 조절 서열, 구성물 유도된 엑손 및 구성물 유도된 스플라이스-도너 부위를 포함하는 상동재조합 세포를 생성시키는단계 ; 및
    (e) 외인성 조절 서열의 조절하의 전사에 적합한 조건하에서 상동재조합 세포를 유지시켜 구성물 유도된 엑손, 표적화된 유전자, 및 구성물 유도된 엑손과 표적화된 유전자 사이에 존재하는 서열의 전사체를 생성시키는 단계로서, 구성물 유도된 스플라이스-도너 부위에 상응하는 전사체의 RNA가 표적화된 유전자내의 부위에 상응하는 전사체의 스플라이스-억셉터 부위로 스플라이싱되는 단계를 포함하여, 세포에서 표적화된 유전자의 발현을 변형시키는 방법으로서, 표적화된 유전자가 γ-인터페론, 신경 성장 인자, FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루카곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-과립 백혈구(G-CSF), CSF-대식세포(M-CSF), CSF-과립 백혈구/대식세포(GM-CSF), 단백질 키나아제 C, 유로키나아제, 안티트롬빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다아제, 티로신 히드록실라아제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 Ⅹ, 혈액 응고 인자 XⅢ, IL-2 길항제 및 용해성 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, (f) 전사체의 스플라이싱 및 번역에 적합한 조건하에 상동재조합 세포를 유지시키는 단계; 및 (g) 전사체의 번역 생성물이 생성됨을 확인하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  17. (a) 게놈이 (i)외인성 조절 영역을 갖는 표적화된 유전자 및 (ⅱ)표적 부위를 포함하는 세포를 제공하는 단계;
    (b) (i)표적 부위에 상동성인 표적화 서열, (ⅱ)외인성 소절 서열; (ⅲ)엑손; 및 (ⅳ)엑손의 3'말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물을 제공하는 단계;
    (c) 세포를 DNA 구성물로 형질전환시켜 형질전환된 세포를 생성시키는 단계;
    (d) 상동재조합에 적합한 조건하에 형질전환된 세포를 유지시켜, 게놈이 외인성 조절 서열, 구성물 유도된 엑손 및 구성물 유도된 스플라이스-도너 부위를 포함하며, 이들 모두가 표적화된 유전자의 내인성 전사 개시 부위의 상류에 모두 위치하는 상동재조합 세포를 생성시키는 단계; 및
    (e) 외인성 조절 서열의 조절하의 전사에 적합한 조건하에서 상동재조합 세포를 유지시켜, 구성물 유도된 엑손, 표적화된 유전자, 및 구성물 유도된 엑손과 표적화된 유전자 사이에 존재하는 서열의 전사체를 생성시키는 단계로서, DNA 구성물 유도된 스플라이스-도너 부위에 상응하는 전사체의 RNA가 표적화된 유전자내의 부위에 상응하는 전사체의 스플라이스-억셉터 부위로 스플라이싱되는 단계를 포함하여, 세포에서 표적화된 유전자의 발현을 변형시키는 방법으로서, 표적화된 유전자는 γ-인터페론, 신경 성장 인자, FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루카곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-과립 백혈구(G-CSF), CSF-대식세포(M-CSF), CSF-과립 백혈구/대식세포(GM-CSF), 단백질 키나아제 C, 유로키나아제, 안티트롬빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다아제, 티로신 히드록실라아제, 혈액 응고 인자 V,혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XⅢ, IL-2 길항제 및 용해성 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, (f) 전사체의 스플라이싱 및 번역에 적합한 조건하에 상동재조합 세포를 유지시키는 단계; 및 (g) 전사체의 번역 생성물이 생성됨을 확인하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. (a) 게놈이 (i)외인성 조절 영역을 갖는 표적화된 유전자 및 (ⅱ)표적 부위를 포함하는 세포를 제공하는 단계;
    (b) (i)표적 부위에 상동성인 표적화 서열; (ⅱ)외인성 조절 서열; (ⅲ)엑손; 및 (ⅳ)엑손의 3'말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA 구성물을 제공하는 단계;
    (c) 세포를 DNA 구성물로 형질전환시켜 형질전환된 세포를 생성시키는 단계;
    (d) 상동재조합에 적합한 조건하에 형질전환된 세포를 유지시켜, 게놈이 외인성 조절 서열, 구성물 유도된 엑손, 및 구성물 유도된 스플라이스-도너 부위를 포함하며, 이들 모두가 표적화된 유전자의 내인성 진사 개시 부위의 상류에 위치하는 상동재조합 세포를 생성시키는 단계; 및
    (e) 외인성 조절 서열의 조절하의 전사에 적합한 조건하에서 상동재조합 세포를 유지시켜, 구성물 유도된 엑손, 표적화된 유전자, 및 구성물 유도된 엑손과 표적화된 유전자 사이에 존재하는 서열의 전사체를 생성시키는 단계로서, 구성물유도된 스플라이스-도너 부위에 상응하는 전사체의 RNA가 표적화된 유전자내의 부위에 상응하는 전사체의 스플라이스-억셉터 부위로 스플라이싱되는 단계를 포함하여, 세포에서 표적화된 유전자의 발현을 변형시키는 방법으로서, 외인성 조절 서열이 아데노바이러스 유전자의 조절 서열, 콜라겐 유전자의 조절 서열, 액틴 유전자의 조절 서열, 면역글로불린 유전자의 조절 서열, HMG-CoA 환원효소 유전자의 조절 서열 또는 EF-1α유전자의 조절 서열인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, (f) 전사체의 스플라이싱 및 번역에 적합한 조건하에 상동재조합 세포를 유지시키는 단계; 및 (g) 전사체의 번역 생성물이 생성됨을 확인하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 전사 유니트가 게놈으로 통합된 배양된 척추동물 세포로서, 전사 유니트가 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 외인성 엑손의 3' 말단에 있는 스플라이스-도너 부위를 포함하며, 이들 모두는 내인성 유전자의 내인성 전사 개시 부위의 상류에 모두 위치하고, 스플라이스-도너 부위가 내인성 유전자의 두 번째 내인성 엑손의 내인성 스플라이스-억셉터 부위에 기능적으로 연결되어 있으며, 내인성 유전자가 γ-인터페론, 신경 성장 인자, FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루카곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-과립 백혈구(G-CSF), CSF-대식세포(M-CSF), CSF-과립 백혈구/대식세포(GM-CSF), 단백질 키나아제 C, 유로키나아제, 안티트롬빈Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다아제, 티로신 히드록실라아제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XⅢ, IL-2 길항제 및 용해성 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 세포.
  22. 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 외인성 엑손의 3' 말단에 있는 스플라이스-도너 부위를 포함하는 전사 유니트가 게놈으로 통합된 배양된 척추동물 세포로서, 스플라이스-도너 부위가 내인성 유전자의 두 번째 내인성 엑손의 내인성 스플라이스-억셉터 부위에 기능적으로 연결되어 있으며, 세포는 내인성 유전자에 존재하는 모든 내인성 엑손 이외에 외인성 엑손을 포함하며, 내인성 유전자가 γ-인터페론, 신경 성장 인자, FSHβ, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루카곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터루킨 1, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11, 인터루킨 12, CSF-과립 백혈구(G-CSF), CSF-대식세포(M-CSF), CSF-과립 백혈구/대식세포(GM-CSF), 단백질 키나아제 C, 유로키나아제, 안티트롬빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다아제, 티로신 히드록실라아제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 X, 혈액 응고 인자 XⅢ, IL-2 길항제 및 용해성 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 세포.
  23. 제 22 항에 있어서, 세포가 HT1080 세포, HeLa 세포, HeLa 세포의 유도체, MCF-7 유방암세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종 세포, 2780AD 난소 암종 세포, 라지 세포(Raji cell), 주르카트 세포(Jurkat cell), 나말라 세포(Namalwa cell),HL-60 세포, 다우디 세포(Daudi cell), RPMI 8226 세포, U-937 세포, 바우스 흑색종 세포(Bowes melanoma cell), WI-38VA13 서브라인 2R4 세포 및 MOLT-4 세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 배양된 척추동물 세포.
  24. 제 22 항에 있어서, 외인성 조절 서열이 아데노바이러스 유전자의 조절 서열, 콜라겐 유전자의 조절 서열, 액틴 유전자의 조절 서열, 면역글로불린 유전자의 조절 서열, HMG-CoA 환원효소 유전자의 조절 서열 또는 EF-1α 유전자의 조절 서열임을 특징으로 하는 배양된 척추동물 세포.
  25. 내인성 유전자가 단백질을 코딩하는, 제 22 항 내지 제 24 항중의 어느 한 항에 따른 세포를 사람을 제외한 포유동물에 도입시키는 것을 포함하여, 포유동물에 단백질을 제공하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 세포가 사람을 제외한 포유동물에 도입되기 전에 장벽장치 내부에서 외부로 단백질을 통과시킬 수 있는 장벽장치내에 둘러싸임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 장벽장치가, 세포가 장벽장치로부터 유출되는 것을 방지함을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, DNA 구성물이 증폭가능한 마아커를 코딩하는 서열의 다중 복사체를 함유하는 세포를 선택할 수 있는 증폭가능한 마아커를 코딩하는 서열을 추가로 포함하며, 세포를 사람을 제외한 포유동물에 도입시키기 전에, 증폭가능한 마아커를 코딩하는 서열의 다중 복사체를 갖는 세포를 선택할 수 있는 조건하에 세포를 배양시킴을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어시, 증폭가능한 마아커가 디히드로폴레이트 환원효소, 아데노신 탈아미노효소 및 삼작용성 효소 카바모일 포스페이트 신타아제-아스파테이트 트랜스카바밀라아제-디히드로오로타아제(CAD)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 세포가 사람으로부터 기원됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 세포가 일차 또는 이차 세포임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 25 항에 있어서, 세포가 불멸화된 세포임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 25 항에 있어서, 세포가 포유동물 섬유아세포임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 25 항에 있어서, 세포가 사람 섬유아세포로부터 기원된 일차 또는 이차세포임을 특징으로 하는 방법.
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