HUT76844A - Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof - Google Patents

Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
HUT76844A
HUT76844A HU9603144A HU9603144A HUT76844A HU T76844 A HUT76844 A HU T76844A HU 9603144 A HU9603144 A HU 9603144A HU 9603144 A HU9603144 A HU 9603144A HU T76844 A HUT76844 A HU T76844A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
cell
cells
sequence
dna
Prior art date
Application number
HU9603144A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9603144D0 (en
Inventor
Michael W Heartlein
Richard F Selden
Douglas A Treco
Original Assignee
Transkaryotic Therapies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22918596&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUT76844(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Transkaryotic Therapies Inc filed Critical Transkaryotic Therapies Inc
Publication of HU9603144D0 publication Critical patent/HU9603144D0/hu
Publication of HUT76844A publication Critical patent/HUT76844A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
    • C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Kivonat
A találmány tárgyát eljárások képezik terápiásán alkalmazható proteinek^ in vitro előállítására, valamint terápiásán fontos proteinek expressziójának génterápiás befolyásolására .
A találmány tárgyát képező eljárás szerint úgy változtatják meg a sejten belül egy kiválasztott megcélzott gén expresszióját (azaz egy kívánt endogén celluláris gén expresszióját), hogy a celluláris genom egy előre kiválasztott helyére homológ rekombináció útján olyan DNSkonstrukciót juttatnak, amely tartalmaz legalább egy szabályozó szekvenciát, egy exont és egy „splice-donor helyet („splicing = az mRNS-molekula érése). A felsorolt komponenseket úgy juttatják a kromoszómális (genomi) DNS-be, hogy a bejuttatás következtében új transzkripciós egység keletkezik (amelyben a DNS-konstrukcióban jelenlévő szabályozó szekvencia, exon és „splice-donor hely funkcionálisan kapcsolódik az endogén génhez).
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásban alkalmazható célzó DNS-konstrukciók és az ilyen konstrukciókat délzottan genomi DNS-ükbe beépülve tartalmazó rekombináns sejtek is.
Aktaszámunk: 84800-1672/PÁ ···· · · · ·
PSCOMkh
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
Képviselő: Π
Π
DANUBIA-SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.
Homológ rekombinációt előidéző DNS-konstrukció és alkalmazásai
A találmány tárgyát eljárások képezik terápiásán alkalmazható proteinek in vitro előállítására, valamint terápiás proteinek expressziójának génterápiás befolyásolására .
A találmány tárgyát képező eljárás szerint úgy változtatjuk meg a sejten belül egy kiválasztott megcélzott gén expresszióját (azaz egy kívánt endogén celluláris gén expresszióját), hogy a celluláris genom egy előre kiválasztott helyére homológ rekombináció útján olyan DNSkonstrukciót juttatunk, amely tartalmaz legalább egy szabályozó szekvenciát, egy exont és egy „splice-donor helyet („splicing = az mRNS-molekula érése). A felsorolt komponenseket úgy juttatjuk a kromoszómális (genomi) DNS-be, hogy a bejuttatás következtében új transzkripciós egység keletkezik (amelyben a DNS-konstrukcióban jelenlévő szabályozó szekvencia, exon és „splice-donor hely funkcionálisan kapcsolódik az endogén génhez).
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásban alkalmazható célzó DNS-konstrukciók és az ilyen konstrukciókat célzottan genomi DNS-ükbe beépülve tartalmazó rekombináns sejtek is.
Aktaszámunk: 84800-1672/PÁ • · · ·
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható terápiásán fontos proteinek in vitro termeltetésére és endogén gének expressziós sajátságainak génterápiás megváltoztatására .
Amennyiben egy betegség kezeléséhez valamely terápiás hatású protein beadása szükséges, azt jelenleg legelterjedtebben úgy érik el, hogy a terápiás hatású proteint in vitro állítják elő, majd hagyományos gyógyászati úton juttatják be (például intravénásán, szubkután vagy intramuszkuláris injektálással), legújabban azonban a génterápia is elterjedőén van.
A terápiásán alkalmazható proteineket általában úgy állítják elő, hogy a terápiás hatású proteint kódoló exogén DNS-t alkalmas gazdasejtekbe juttatják. Úgy járnak el például, hogy a kívánt terápiás hatású proteint kódoló exogén DNS-t alkalmas sejtekbe juttatják - például halhatatlanná tett sejtekbe -, valamely vektorba építve, például egy plazmidba, amelyről azután a kódolt protein expresszálódik. Felvetették már annak lehetőségét is, hogy endogén celluláris géneket, valamint azok expressziójának mértékét géncélzásos eljárással („gene targeting) módosítani lehet. Ilyen eljárásokra példákat találhatunk az alábbi szabadalmi iratokban: US 5,272,071, valamint WO 91/06666, WO 91/06667 és WO 90/11354.
A jelenleg alkalmazott génterápiás eljárásokban fertőző vektorokat alkalmaznak, például retrovirális vektorokat, és ezek hordozzák az expresszálni kívánt genetikai anyagot. Az ilyen eljárásoknak számos hátránya van, ilyenek ···· ···· például·: replikádéra képes vírusok kialakulásának veszélye a vektor előállítása során; rekombináció lehetősége a terápiás vírus és az endogén retrovirális genomok között, aminek következtében olyan fertőző ágensek keletkezhetnek, melyek eltérő sejtspecifitásúak, eltérő gazdaspektrumúak vagy fokozottan fertőzőek és citotoxikusak; független integrálódás lehetősége nagyszámú sejtbe, ami fokozza a tumorkialakuláshoz vezető inszerciós események kockázatát; az alkalmazott retrovírusok korlátozott klónozási kapacitása (ami korlátozza a terápiás alkalmazhatóságot); valamint a kívánt termék rövid életű in vivő expressziója. Nagy gyakorlati haszna lenne egy géntermékek előállítását célzó új megközelítésmódnak, különösen egy olyan megoldásnak, amely nem járna együtt a jelenleg alkalmazott eljárások korlátáival és kockázataival.
A találmány tárgyát új eljárások képezik terápiásán alkalmazható proteinek in vitro előállítására, valamint terápiás proteinek génterápia útján történő termelésére és célba juttatására. A találmány szerinti eljárásban oly módon változtatjuk meg a sejten belül egy kiválasztott megcélzott gén expresszióját (azaz egy kívánt endogén celluláris gén expresszióját), hogy a celluiáris genom egy előre kiválasztott helyére homológ rekombináció útján olyan DNS-t juttatunk, amely tartalmaz legalább egy szabályozó szekvenciát, egy exont és egy „splice-donor helyet („splicing = az mRNS-molekula érése). A felsorolt komponenseket oly módon juttatjuk a kromoszómális (genomi) DNSbe, hogy a bejuttatás következtében egy új transzkripciós • · · egység keletkezik (amelyben a DNS-konstrukcióban jelenlévő szabályozó szekvencia, exon és „splice-donor hely funkcionálisan kapcsolódik az endogén génhez). Amennyiben a felsorolt komponenseket a kromoszomális DNS-be juttatjuk, a kívánt endogén gén expressziójának mértéke megváltozik.
A leírásban használt értelemben az „expresszió mértékének megváltoztatása kifejezés a következő dolgokat foglalja magában: a természetes sejtben normálisan nem működő (expresszálatlan) gének aktiválása (azaz expressziójának kiváltása); a természetes sejtben fiziológiailag szignifikáns mértékben nem expresszálódó gének expressziójának fokozása; a természetes sejtben expresszálódó gének regulációs vagy indukciós mintázatának megváltoztatása; valamint a természetes sejtben expresszálódó gének expressziójának csökkentése (beleértve az expresszió teljes megszüntetését is.
A találmány tárgyát képezik továbbá a megcélzott gén expressziója mértékének megváltoztatására alkalmas DNSkonstrukciók is. A találmány szerinti DNS-konstrukciók a következő alkotórészeket tartalmazzák: (i) célzó szekvencia; (ii) szabályozó szekvencia; (iii) exon; valamint (iv) pár nélküli „splice-donor hely. A találmány szerinti DNSkonstrukciókban található célzó szekvencia irányítja az (i)-(iv) elemek megcélzott génbe történő integrálódását egy sejten belül oly módon, hogy a (ii)-(iv) elemek funkcionálisan hozzákapcsolódjanak a megcélzott endogén gén szekvenciáihoz. A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja szerint a DNS-konstrukciók a következő összete• · · vöket tartalmazzák: (i) célzó szekvencia; (ii) szabályozó szekvencia; (iii) exon; valamint (iv) „splice-donor hely; (v) intron; valamint (vi) „splice-akceptor hely, amely konstrukció esetén a célzó szekvencia az (i)-(vi) elemek integrálódását oly módon irányítja, hogy a (ii)-(vi) elemek funkcionálisan hozzákapcsolódjanak a megcélzott endogén génhez. A célzó szekvencia homológ a celluláris kromoszómális DNS egy előre kiválasztott helyével, ahol a homológ rekombinációt létre kívánjuk hozni. A találmány szerinti konstrukciókban az exon általában 3'-irányban helyezkedik el a szabályozó szekvenciától, a „splice-donor hely pedig 3' -irányban található az exonhoz viszonyítva.
Az alábbiakban részletesebben ismertetjük a találmány két megvalósítási módját, melyekben a humán eritropoietin (hEPO) 5' -irányban található szekvenciákat oly módon változtatjuk meg, hogy lehetővé váljon a hEPO expressziója olyan elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtekben, melyek természetes, transzfektálatlan állapotukban detektálható mennyiségben nem expresszálnak EPO-t. Az első megvalósítási mód esetén a célzó konstrukció két célzó szekvenciát tartalmaz. Az első célzó szekvencia a második célzó szekvenciától 5' -irányban található szekvenciákkal homológ, és mindkét célzó szekvencia a hEPO kódoló régiójától 5' -irányban található. A célzó konstrukció tartalmaz egy szabályozó régiót is (az mMT-l-promótert) , egy exont [ (a humán növekedési hormon (hGH) 1. exonját] , valamint egy pár nélküli „splice-donor helyet. Az ismertetett célzó konstrukció homológ rekombinációjának eredménye• · · ·
6, · · · ♦ · ········ · · · ·· * ként keletkező szekvenciarészletet az 1. ábrán láthatjuk.
A második ismertetett megvalósítási mód esetén a célzó konstrukció szintén két célzó szekvenciát tartalmaz.
Az első célzó szekvencia az endogén hEPO szabályozó régióban található szekvenciákkal homológ, a második célzó szekvencia pedig a hEPO 1. intronjával homológ. A célzó konstrukció tartalmaz egy szabályozó régiót is (mMT-l-promóter) , egy exont (hGH 1. exon), valamint egy pár nélküli „splicedonor helyet. A második célzó konstrukció homológ rekombinációjának eredményeként keletkező szekvenciarészletet a 2.
ábra szemlélteti.
A bemutatott két megvalósítási mód esetén a rekombinációs események eredményeként kiméra transzkripciós egységek keletkeznek, melyekről olyan érett mRNS-molekuiák keletkeznek, mely molekulákban a hGH-gén 1. exonja 5' irányban található a hEPO-gén 2-5. exonjaitól. A transzkripciós egységről kiinduló transzkripció, splicing és transzláció következtében egy olyan protein keletkezik, amelyben a hEPO szignálpeptidjének 1-4. aminosavai a hGH 13. aminosavaira vannak cserélve. Az ismertetett két megvalósítási mód egyrészt a beépített célzó konstrukció szabályozó szekvenciáinak relatív helyzetében különbözik egymástól, másrész: pedig a végső, érett transzkriptum kialakulásához szükséges érési („splicing) folyamat specifikus mintázatában .
A találmány tárgyát képezi továbbá egy in vitro vagy in vivő eljárás protein előállítására, mely eljárás szerint egy fent leírtak szerinti konstrukciót valamely ··· · gazdasejt kromoszómális DNS-ébe juttatunk homológ rekombináció útján, és ily módon homológ rekombinációt tartalmazó sejtet állítunk elő.
A homológ rekombinációt tartalmazó sejtet ezután olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik a kívánt protein termelődését eredményező transzkripciót, transzlációt és szekréciót.
A találmány tárgyát képezik továbbá transzfektált sejtek, mind primer, mind szekunder transzfektált sejtek (azaz nem halhatatlanná tett sejtek), valamint transzfektált halhatatlanná tett sejtek, melyek alkalmasak proteinek előállítására, különösen terápiás felhasználásra alkalmas proteinek előállítására. A találmány tárgyát képezik az ilyen sejtek előállítására szolgáló eljárások is, továbbá a sejtek alkalmazása in vitro protein-előállításra, valamint génterápiás eljárások. A találmány szerinti sejtek gerinces eredetű sejtek, elsősorban emlőseredetű sejtek, előnyösen emberi eredetű sejtek. A találmány szerinti eljárással előállított sejrek olyan DNS-t tartalmaznak, amely terápiásán alkalmazható terméket kódol, azaz olyan DNS-t, amely önmaga terápiás termék és/vagy olyan DNS-t, amely a transzfektált sejtekben valamely gén expressziójának mértékét fokozza, vagy az expresszió szabályozásának vagy indukálásának mintázatát oly módon változtatja meg, hogy az különbözzék a megfelelő nem transzfektált sejtben tapasztalhatótól.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan eljárások is, amelyek alkalmazásával sejtek - például elsődleges, má«· ···* »· · ·· ·
- 8 sodlagos és halhatatlanná tett sejtek - transzfektálhatók exogén genetikai anyag bevitele útján. A találmány tárgyát képezik klonális sejttörzsek és heterogén sejttörzsek előállítására szolgáló eljárások is, valamint eljárások állatok immunizálására, valamint eljárások ellenanyagok előállítására immunizált állatokban, a találmány szerinti elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett transzfektált sejtek alkalmazásával.
A találmány tárgya elsősorban egy géncélzó vagy homológ rekombinációt kiváltó eljárás eukarióta sejtekben, például gombaeredetű, növényi vagy állati eredetű sejtekben, elsősorban gerinces, előnyösen emlőseredetű, még előnyösebben emberi eredetű sejtekben. A találmány szerinti eljárás alkalmas DNS elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett gerinces eredetű sejtekbe juttatására, homológ rekombináció útján, oly módon, hogy a DNS az elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtek genomi DNS-ébe épül be, egy előre kiválasztott helyre. A célzó szekvenciákat azon genomi hely ismeretében választjuk meg, ahova a célzó DNS-konstrukciót be kívánjuk építeni. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással előállított homológ rekombinációt tartalmazó elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtek is, melyeket a továbbiakban homológ rekombinációt tartalmazó (HR) elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejteknek fogunk nevezni, és a találmány tárgyát képezik a elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett HR-sejtek alkalmazásai is.
··♦ *
A találmány egyik megvalósítási módja szerint, melynek esetén egy gén expresszióját megváltoztatjuk, a kiválasztott gén aktiválódik. Ez azt jelenti, hogy a elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett gerinces eredetű sejtekben található valamely gén, amely normálisan nem expresszálódik az adott sejtben, aktiválódik, és az aktiválódás eredményeként a gén által kódolt protein expresszálódik. E szerint a megvalósítási mód szerint a homológ rekombinációt oly módon alkalmazzuk, hogy a sejt természetes állapotában a kiválasztott génhez kapcsolódó szabályozó régiót kicseréljük, tönkretesszük, vagy megszakítjuk, és egy olyan szabályozó szekvenciát építünk be a helyébe, amely a gént a megfelelő nem transzfektált sejtekhez képest nagyobb mértékben expresszálja.
A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja szerint az aktivált gént tovább amplifikálhatjuk, oly módon, hogy beépítünk egy amplifikálható, szelektálható markergént, melynek olyan sajátsága van, hogy azokat a sejteket, melyek megsokszorozódott kópiaszámban tartalmazzák a szelektálható markergént, ki lehet szelektálni oly módon, hogy a sejteket alkalmas szelekciós ágens jelenlétében tenyésztjük. Ebben az esetben az aktivált endogén gén tandem módon amplifikálódik az amplifikálható szelekciós markergénnel együtt. Az így szelektált sejtek, melyek az aktivált endogén génből számos kópiát tartalmaznak, alkalmasak in vitro protein-előállításra és génterápiára.
A találmány szerinti géncélzó és amplifikációs eljárás különösen alkalmas olyan gének aktiválására és •··· expresszálására, melyek természetes állapotukban olyan transzkripciós egységekben találhatók, hogy izolálásuk és expresszáltatásuk nehézségekbe ütközik, valamint olyan gének aktiválására, melyek esetében a teljes fehérjekódoló régió nem hozzáférhető vagy még nem lett megklónozva.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint egy - a természetes állapotú sejtben expresszálódó - gén expresszióját fokozzuk, vagy szabályozási vagy indukálási mintázatát úgy változtatjuk meg, hogy az különbözzék a megfelelő nem transzfektált sejtekben megfigyelhetőtől. Egy másik megvalósítási mód szerint egy - a természetes állapotú sejtben expresszálódó - gén expressziójának mértékét csökkentjük (azaz az expressziót kisebb mértékűvé tesszük vagy teljesen megszüntetjük). A találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás is, melynek alkalmazásával a homológ rekombinációt használjuk fel valamely génről készülő cDNSmásolat előállítására, mely másolat intronokat nem tartalmaz, és az így előállított cDNS élesztőbe vagy baktériumokba juttatható ín vitro fehérje-előállítás céljából.
A találmány szerinti transzfektált sejtek számos humán és állati alkalmazás szempontjából megfelelők. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti sejteket beültethetjük emberbe vagy állatba, hogy ott proteint termeljenek. Terápiás célokból például szisztémásán vagy lokálisan termeltethető emberben hGH, hEPO, humán inzulinotropin, vagy egyéb terápiás fehérje. Előállíthatok továbbá transzfektált nem-humán sejtek is, melyek növekedési hormont, eritropoietint, inzulinotropint és egyéb nem-humán eredetű proteineket termelnek. Alkalmazhatunk olyan hordozóeszközöket is, melyek tartalmazzák a találmány szerinti transzfektált sejteket, amely sejtek terápiás terméket állítanak eló. Az ilyen hordozóeszközökön keresztül a terápiás termék szabadon közlekedik, az eszköz azonban felhasználható arra, hogy a találmány szerinti sejteket in vivő rögzített pozícióban tartalmazza, vagy arra, hogy a találmány szerinti sejteket elválassza a gazdaszervezet immunrendszerétől. Az ilyen védőjellegű hordozóeszközök különösen hasznosak, és lehetővé teszik, hogy a találmány szerinti transzfektált halhatatlanná tett sejteket, transzfektált xenogén sejteket vagy transzfektált allogén sejteket beültessük valamely humán vagy állati rendellenesség kezelése céljából, vagy mezőgazdasági célokra alkalmazzuk őket (például szarvasmarha növekedési hormon előállítása tejtermelés fokozása céljából). A védő-hordozóeszközök alkalmasak továbbá rövid hatóidejű (azaz tranziens) terápiás kezelésre is, mivel lehetővé teszik, hogy a beültetett sejteket eltávolítsuk, amennyiben a kezelést bármilyen oknál fogva meg kívánjuk szüntetni. Ezen felül, a találmány szerinti transzfektált xenogén és allogén sejtek védőhordozó eszköz nélkül is felhasználhatók rövid ideig tartó génterápiás kezelésre, oly módon, hogy a sejtek által termelt géntermék csak addig fog in vivő termelődni, ameddig a sejteket a gazdaszervezet immunrendszere ki nem löki.
A találmány szerinti transzfektált sejtek alkalmasak ellenanyag-termelődés kiváltására is, vagy emberek és állatok patogén ágensekkel szerben történő immunizálására.
A beültetett transzfektált sejteket felhasználhatjuk immunizáló antigének előállítására, aminek következtében a gazdaszervezet celluláris és humorális immunválaszai stimulálódnak. Ezeket az immunválaszokat megtervezhetjük oly módon, hogy a gazdaszervezet védetté váljék a jövőben bekövetkező fertőzésekkel szemben (azaz vakcinálásra), stimulálhatunk és fokozhatunk egy folyamatban lévő fertőzéssel szembeni ellenállóképességet, de felhasználhatjuk az említett immunválaszokat arra is, hogy a transzfektált sejtek által in vivő termelt antigénnel szemben olyan ellenanyagokat termeltessünk, melyek terápiás vagy diagnosztikai célokra alkalmasak. A sejteket tartalmazó eltávolítható védőhordozóeszközök lehetővé teszik, hogy egyszerű módon megszüntessük az antigén jelenlétét. Eljárhatunk úgy is, hogy olyan sejteket alkalmazunk, melyek végül kilökődnek (xenogén vagy allogén transzfektált sejteket), és ily módon is limitálhatjuk az antigén jelenlétének idejét, mivel az antigéntermelődés meg fog szűnni, amikor a sejtek kilökődnek.
A találmány szerinti eljárások alkalmasak számos terápiásán hasznos termék előállítására képes elsődleges, másodlagos vagy hallhatatlanná tett sejtek előállítására, a találmány szerinti eljárásokkal előállított sejtek például (de nem kizárólag) a következő terápiásán hasznos hatóanyagokat állíthatják elő: hormonok, citokinek, antigének, ellenanyagok, enzimek, véralvadási faktorok, transzportfehérjék, receptorok, szabályozófehérjék, strukturális fehérjék, transzkripciós faktorok, ribozimek és antiszensz RNS-ek.
··· · • · · * * · · · · • · · · · · ········ ·· · ·· ·
Ezen felül, a találmány szerinti eljárások alkalmasak olyan sejtek előállítására, melyek képesek természetben elő nem forduló ribozimeket, fehérjéket vagy nukleinsavakat termelni, melyek alkalmasak lehetnek terápiás termékek in vitro előállítására, vagy génterápiára.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán a hEPO-gén transzkripcionális aktiválásának stratégiáját mutatjuk be egy vázlatos diagrammon. Vastag vonalak: egéreredetű metállotionein-I-promoter, függőlegesen vonalkázott téglalap: a hGH 5' -végi nemtranszlálódó régiója; sötétre satírozott téglalap: a hGH 1. exonja; csíkos téglalap: a hEPO 1. intronjának tíz bázispáros „splice donor szekvenciája; keresztben vonalkázott téglalap: a hEPO 5' -végi nem-transzlálódó régiója; üres számozott téglalapok: a hEPO kódoló szekvenciái; átlósan vonalkázott téglalap: a hEPO 3' -végi nem-transzlálódó szekvenciái; HIII: HindlII-hasítóhely.
A 2. ábrán a hEPO-gén transzkripcionális aktiválásának stratégiáját mutatjuk be egy vázlatos diagrammon, vastag vonalak: egéreredetű metallotionein-I-promóter; függőleges vonalkázott téglalap: a hGH 5' -végi nemtranszlálódó régiója; sötétre satírozott téglalap: a hGH 1. exonja; üres, számozott téglalapok: a hEPO kódoló szekvenciái; átlósan vonalkázort téglalap: a hEPO 3' -végi nemtranszlálódó szekvenciái; HIII: HindlII-hasítóhely.
A 3. ábrán a pXGH5-plazmid vázlatát mutatjuk be, amely plazmid magába foglalja a HGH-gént az egéreredetű • * · · • · · · # · • · ···· ···· metallotionein-promóter szabályozása alatt.
A 4. ábrán a pE3neoEP0-plazmid vázlatát láthatjuk. Az ábrán megjelöltük a humán eritropoietin-gén pozícióját, valamint a neomicin foszfotranszferáz gén (neo) és az ampicillin (amp) rezisztencia gén helyzetét. Az ábrán a nyilak a különböző gének transzkripciójának irányát jelölik. A pmMTl jelölés az egéreredetű metallotioneinpromótert jelzi (amely a hEPO expresszióját vezérli), a pTK jelölés pedig a herpesz szimplex vírus timidin kinázának promóterét jelzi (amely a neo-gén expresszióját vezérli). A plazmidtérkép pontozott régiói a humán hipoxantin-guanin foszforibozil-transzferáz (HPRT) lókuszból származó szekvenciák pozícióit jelölik. Megjelöltük a restrikciós endonukleáz hasítóhelyek relatív pozícióit is.
Az 5. ábrán a pcDNEO-plazmid vázlatát láthatjuk, amely a következő összetevőket tartalmazza: a pCD-plazmid BamHI-helyére inszertált pSV2-neo-plazmidból származó neokódoló régiót (BamHI/BglII-fragmens); a pBR322-plazmid AmpR- és pBR3220ri-szekvenciáit; valamint az SV40-vírus poliA- „16S splice junctions és korai promóter-régióit.
A 6. ábrán a pREP04-plazmid vázlatát mutatjuk be.
A 7. ábrán látható grafikon a megcélzott humán sejtvonal eritropoietin expresszióját mutatja, a sejtvonalat lépésenként 0,02, 0,05, 0,1, 0,2 és 0,4 pmól/l metotrexáttal szelektáltuk.
A 8. ábrán a pREPO15-plazmid vázlatát mutatjuk be. A genomi eredetű hEPO-szekvenciákból származó fragmenseket sötétre satírozott téglalapokkal jelöljük. A BamHI (3537) és a BglII' /HindlII' -helyek közötti szekvenciarészlet megfelel a „GenBank adatbázis „HUMERPALU megjelölésű szekvenciája 1-4008. nukleotidjainak. A BglII' /HindlII' (11463) hasítóhelyek közötti régió szekvenciája megfelel a „GenBank adatbázis „HUMERPALU megjelölésű szekvenciájának 4009-5169. pozíciói közötti szekvenciarészletével. A HindlII (11463) és az Xhol (624) hasítóhelyek közötti régió szekvenciája megfelel a „GenBank „HUMERPA megjelölésű szekvenciája a 7-624. nukleotidjai közötti szekvenciarészletnek. A CMV-promóterszekvenciákat üres téglalappal jelöltük, és ez a szekvencia a „GenBank adatbázis HS5MIEP megjelölésű szekvenciája 546-2105. nukleotidjainak megfelelő szekvenciát tartalmaz. A neo-gént egy nyílban végződő üres téglalap jelöli. A neo-gént vezérlő timidin kináz (tk) promótert vonalkázott téglalappal jelöltük. Az amp-gént tartalmazó pBSIISKt-szekvenciákat vékony vonallal jelöltük.
A 9.A ábrán az endogén hEPO-gén (az ábra felső része) és a pREPO15-plazmidból származó célzó fragmenssel történt homológ rekombináció útján aktiválódott hEPO-gén (az ábra alsó része) restrikciós enzimes térképeit és az enzimes hasítások során belőlük keletkezett fragmenseket ábrázoltuk.
A 9.B ábrán a kezeletlen (HF) és a megcélzott (TI) HF342-15-2elzésű humán fibroblaszt-klón restrikciós enzimes hasításának Southern-hibridizációs képét láthatjuk (lásd:
7. példa).
A 10. ábrán a pREPOl8-plazmid vázlatát mutatjuk be. A genomi eredetű hEPO-szekvenciákból származó fragmenseket sötétre satírozott téglalapokkal jelöljük. A BamHI (3537) és Clal (7554) hasítóhelyek közötti régió szekvenciája megfelel a „GenBank adatbázis „HUMERPALU megjelölésű szekvenciája 1-4008. nukleotidjai közötti szekvenciának. Az ATG-kódon (12246) és a HindiII-hasitóhely (13426) közötti régió szekvenciája megfelel a „GenBank adatbázis „HUMPERPLAU szekvenciájának 4900-5169. nukleotidjai közötti szekvenciarészletnek. A HindlII (13426) és Xhol (624) hasítóhelyek közötti régiószekvenciája megfelel a „GenBank adatbázis „HUMERPA megjelölésű szekvenciája 7-624. nukleotidjai közötti szekvenciának. A CMV-promóterszekvenciákat üres téglalappal jelöltük, és ez a szekvencia megfelel a „GenBank adatbázis HS5MIEP megjelölésű szekvenciája 546-2015. nukleotidjai közötti szekvenciának. A dihidrofolát-reduktáz (dhfr) transzkripciós egységet nyílban végződő csíkozott téglalappal jelöltük. A neo-gént nyílban végződő üres téglalapként ábrázoltuk. A neo-gént vezérlő tk-promótert ferdén vonalkázott téglalappal jelöltük. Az amp-gént tartalmazó pBSIISK+-szekvenciák jelzése: vékony vonal.
A 11. ábrán egy találmány szerinti konstrukció vázlatát mutatjuk, be, amely egy intronmentes gén - az a~ interferon gén - aktiválására és amplifikálására alkalmas, amely konstrukció a következő összetevőket tartalmazza: egy első célzó szekvenciát (1), egy amplifikálható markergént (AM) , egy szelektálható markergént (SM), egy szabályozó szekvenciát, egy CAP-helyet, egy „splice-donor helyet (SD), egy intront (vékony vonalak). Egy „splice-akceptor • · · · ···· ···· helyet (SA) és egy második célzó szekvenciát (2).
A sötétre satírozott téglalap a kódoló DNS-t jelzi, a vonalkázott téglalapok nem-transzlálódó szekvenciákat jelölnek.
A 12. ábrán egy találmány szerinti konstrukció vázlatát mutatjuk be, amely egy olyan endogén gén aktiválására és amplifikálására alkalmas, melynek 1. exonja a szignálpeptidet kódoló szekvenciákat tartalmaz, egy a humán GMCSF-gén, a bemutatott konstrukció a következő összetevőket tartalmazza. Egy első célzó szekvenciát (1), egy amplifikálható markergént (AM) , egy szelektálható markergént (SM) , egy szabályozó szekvenciát, egy „splice-donor helyet (SD) , valamint egy második célzó szekvenciát (2). A sötétre satírozott téglalapok a kódoló DNS-t jelölik, a vonalkázott téglalapok pedig nem-transzlálódó szekvenciákat.
A 13. ábrán szintén egy találmány szerinti konstrukció vázlatát láthatjuk, amely egy olyan endogén gén - a humán G-CSF-gén - aktiválására és amplifikálására alkalmas, melyben az 1 . exon szignálpeptidet kódoló szekvenciákat tartalmaz, a konstrukció a következő összetevőket tartalmazza: egy 1. szignálszekvenciát (1), egy amplifikálható markergént (AM), egy szelektálható markergént (SM) , egy szabályozó szekvenciát, egy CAP-helyet, egy „splice-donor helyet (SD), valamint egy második célzó szekvenciát (2). A sötétre satírozott téglalapok kódoló DNS-t jelölnek, a vonalkázott téglalapok pedig nem-transzlálódó szekvenciákat.
A 14 . ábrán is egy találmány szerinti konstrukció vázlatát láthatjuk, amely egy olyan endogén gén - a humán
FSHÜ-gén - aktiválására és amplifikálására alkalmas, amelyben az 1. exon nem-kódoló szekvenciákat tartalmaz, a konstrukció a következő összetevőket tartalmazza: egy első célzó szekvenciát (1), egy amplifikálható markergént (AM) , egy szelektálható markergént (SM), egy szabályozó szekvenciát, egy CAP-helyet, egy „splice-donor helyet (SD), valamint egy második célzó szekvenciát (2) . A sötétre satírozott téglalapok kódoló DNS-t jelentenek, a vonalkázott téglalapok pedig nem-traszlálódó szekvenciákat.
A találmány szerinti megoldás azon a felismerésen alapul, hogy valamely kívánt endogén gén szabályozását vagy aktivitását valamely sejtben megváltoztathatjuk oly módon, hogy a sejt genomjába - egy előre meghatározott helyre homológ rekombináció útján beépítünk egy DNS-kontrukciót, amely a következő összetevőket tartalmazza: (i) egy célzó szekvenciát; (ii) egy szabályozó szekvenciát; (iii) egy exont; valamint (iv) egy páratlan „splice-donor helyet, amely konstrukció esetén a célzó szekvencia úgy irányítja az (i)-(iv) elemek integrálódását, hogy az (ii)-(iv) elemek funkcionálisan kapcsolódjanak az endogén génhez. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti DNS-konstrukció a következő összetevőket tartalmazza:
(i) egy célzó szekvenciát, (ii) egy szabályozó szekvenciát, (iii) egy exont, (iv) egy „ splice -donor helyet, (v) egy intront, valamint (vi) egy „splice akceptor-helyet, amely konstrukció alkalmazása esetén a célzó szekvencia úgy irányítja az (i)-(vi) elemek integrálódását, hogy az (ii)-(vi) elemek funkcionálisan az endogén gén 1. exonjához kapcso»· ···« • · ···· ···· lódjanak. A szabályozó szekvenciákat annak a helynek megfelelően választjuk meg, ahová a DNS-konstrukciót beépíteni kívánjuk. Mindkét ismertetett megvalósítási mód szerint a célba juttatást úgy használjuk, hogy egy új transzkripciós egység keletkezzék, amely a bejuttatott célzó DNSkonstrukció és az endogén celluláris gén fúziójának terméke. Amint azt a leírásban ismertetjük, az új transzkripciós egység kialakulása lehetővé teszi például transzkripcionálisan „csendes gének (ezek olyan gének, melyek a transzfekciót megelőzően nem expresszálódnak) aktiválódását a gazdasejtekben azáltal, hogy a gazdasejt genomjába egy találmány szerinti DNS-konstrukciót juttatunk be. Amint azt a leírásban szintén ismertetjük, valamely sejtben eredendően expresszálódó endogén gén expressziójának mértékét is megváltoztathatjuk, azaz az expresszié mértékét fokozhatjuk, csökkenthetjük, megszüntethetjük, vagy megváltoztathatjuk a szabályozás vagy indukció mintázatát, a találmány szerinti eljárások és DNS-konstrukciók alkalmazásával.
A találmány tárgyát tehát az elmondottak értelmében eljárások képezik gének vagy DNS célba juttatására eukarióta sejtekben, például gomba, növényi vagy állati sejtekben, mint például gerinces sejtekben, különösen emlős sejtekben, leginkább pedig emberi eredetű sejtekben. A találmány tárgyát tehát homológ rekombinációs DNS célba juttatási eljárások képezik, melyek alkalmasak DNS sejtekbe történő bejuttatására, például elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett gerinces eredetű sejtekben, a DNS-t a sejtek genomi DNS-ébe építjük be, egyelőre kiválasztott • · • · ···· ···· ·· · ·· · helyre. A találmány tárgyát képezik különösen olyan homológ rekombinációs eljárások, melyek végrehajtásakor endogén gének transzkripciós és/vagy transzlációs termékei módosulnak, a találmány szerinti célzó szekvenciákat tartalmazó DNS-konstrukciók alkalmazása folytán, amely konstrukciók tartalmaznak továbbá szabályozó szekvenciát, egy exont és egy „splice-donor helyet. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti eljárással előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejtek, valamint az ilyen homológ rekombinációt tartalmazó sejtek alkalmazásai.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett gerinces eredetű sejtekben található gének aktiválására, mely gének normálisan nem expresszálódnak az illető sejtekben. A találmány szerinti eljárásban a homológ rekombinációt vagy célba juttatást használjuk arra a célra, hogy a sejtek genomjába olyan szekvenciákat építsünk be, melyek a recipiens sejtben a kívánt gén expresszióját kiváltják. A találmány egy további megvalósítási módja szerint valamely kívánt gén expressziójának mértékét fokozzuk, vagy a gén szabályozási vagy indukciós mintázatát megváltoztatjuk, a találmány szerinti DNS-konstrukció bejuttatása útján. A találmány szerinti eljárás végrehajtásának következtében a kiválasztom- gén által kódolt termék a transzfektált sejtekben egyértelműen nagyobb mennyiségben termelődik, mint a megfelelő r.em-transzf ektált sejtekben. A találmány szerinti eljárás és DNS-konstrukciók olyan sejtek előállítására is alkalmasak, melyekben egy kívánt termék expressziója a meg21 felelő nem-transzfektált sejtekhez képest kisebb mértékű. Azaz a transzfektált sejtekben kevesebb fehérje (vagy semennyi fehérje) termelődik, mint a transzfektálatlan sejtekben .
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint egy kívánt gént kódoló normálisan csendes gént aktiválunk a transzfektált elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtekben, és amplifikáljuk azt. Ez a megvalósítási mód egy olyan eljárás, melynek alkalmazásával a genomi DNSsel történő homológ rekombináció útján olyan DNSszekvenciákat építünk be, melyek normálisan nincsenek funkcionálisan hozzá kapcsolva a kiválasztott endogén génhez, és amely szekvenciák (1) a gazdaszervezet genomjába a kiválasztott endogén gén közelébe inszertálva megváltoztatják (például aktiválják) az endogén gén expresszióját, továbbá (2) lehetővé teszik az aktivált endogén gént amplifikálva tartalmazó sejtek szelekcióját. Eljárhatunk úgy is, hogy a sejtben normálisan expresszálódó gén expressziójának mértékét fokozzuk és a gént amplifikáljuk.
Az alábbiakban bemutatjuk a találmány szerinti DNSkonstrukciókat, az eljárásokat, melyekben ezeket a konstrukciókat transzfektált sejtek előállítására használjuk fel, az előállított transzfektált sejteket, valamint az ilyen sejtek alkalmazásait.
DNS-konstrukciók
A találmány szerinti DNS-konstrukciók legalább az alábbi összetevőket tartalmazzák: Egy célzó szekvenciát; egy szabályozó szekvenciát; egy exont; valamint egy párat* ··» · _ 9 9 — ····♦ lan „splice-donor helyet. A DNS-konstrukcióban az exon a szabályozó szekvenciától 3' -irányban helyezkedik el, a páratlan „splice-donor hely pedig az exontól 3' -irányban. Az elmondottakon túl a találmány szerinti DNS-konstrukciók tartalmazhatnak továbbá exonokat és/vagy intronokat, a páratlan „splice donor-hellyel határolt hellyel exontól 5' irányban. Amint azt a leírásban feltárjuk, a találmány szerinti DNS-konstrukciókban gyakran találhatók egyéb összetevők is, például szelektálható markerek vagy amplifikálható markerek.
A találmány szerinti konstrukciókban található DNSt esetenként exogén DNS-nek nevezzük. Az „exogén kifejezést a leírásban olyan DNS-re használjuk, melyet a sejtekbe a találmány szerinti eljárással juttattunk be, ilyenek például a találmány szerinti DNS-konstrukciók. Az exogén DNS szekvenciája lehet azonos a sejtben transzfekció előtt megtalálható endogén DNS szekvenciájával, de lehet attól különböző is.
Célzó szekvencia vagy szekvenciák
A célzó szekvencia vagy szekvenciák olyan DNSszekvenciák, amelyek lehetővé teszik a kiválasztott gént tartalmazó sejtek genomjával történő megfelelő homológ rekombinációt. A célzó szekvenciák általában olyan DNSszekvenciák, melyek homológok (azaz azonosak a celluláris DNS valamely szekvenciarészletével, vagy elegendő mértékben hasonlóak ahhoz, és ennek következtében homológ rekombináció következhet be az exogén DNS és a genomi DNS között) a sejtek genomjában normálisan megtalálható DNS-szek• · · ··«·· ·· · • · · · * · · — 2 3- ·············· venciákkal (ilyen szekvenciák lehetnek például: olyan kódoló vagy nem-kódoló DNS-szekvenciák, melyek a transzkripciós starthelytől 5' -irányban helyezkednek el, vagy a transzkripciós régión belül, vagy pedig a kiválasztott gén transzkripciós stophelyétől 3' -irányban, de lehetnek olyan szekvenciák is, melyek a genomba valamely megelőző módosítás során kerültek be). Az alkalmazni kívánt célzó szekvenciát vagy szekvenciákat azon DNS-hely szekvenciájának függvényében választjuk ki, ahova a találmány szerinti DNSkonstrukciót be kívánjuk építeni.
A találmány szerinti konstrukciókban alkalmazhatunk egy vagy több célzó szekvenciát. Egy cirkuláris plazmád vagy DNS-fragmens például előnyösen egyetlen célzó szekvenciát tartalmaz. Egy lineáris plazmád vagy DNS-fragmens viszont előnyösen két célzó szekvenciát tartalmaz. A célzó szekvencia vagy szekvenciák - egymástól függetlenül elhelyezkedhetnek a kiválasztott génen belül (ilyenek lehetnek például az exon és/vagy intron szekvenciák), elhelyezkedhetnek közvetlenül a kiválasztott gén szomszédságában (azaz oly módon, hogy a célzó szekvencia és a kiválasztott gén kódoló régiója között egyetlen további nukleotid sem található), a kiválasztott géntől 5' -irányban (ilyenek például az 5' -végi nem-kódoló régiók vagy endogén promóterszekver.ciák) , de elhelyezkedhetnek például a géntől 5' irányban egy bizonyos távolságra is (ilyenek például az endogén promótertől 5' -irányban található szekvenciák) . A találmány szerinti célzó szekvencia vagy szekvenciák tartalmazhatják a megcélzott gén olyan régióit, melyek már ismer24 ···· ···· tek, vagy amelyeket már megszekvenáltak és/vagy olyan régiókat, melyek 5' -irányban távolabb helyezkednek el, és amelyek strukturálisan nem jellemzettek, azonban restrikciós enzimes térképezéssel azonosíthatók, és szerkezetük szakember számára meghatározható.
Amint azt a leírásban feltárjuk, a gén célba juttatást használhatjuk különböző génekből izolált szabályozó szekvenciák beépítésére, de bejuttathatunk olyan szabályozó szekvenciákat is, melyeket különböző celluláris és/vagy virális forrásokból izolált komponensekből állítottunk öszsze, de bejuttathatunk génsebészeti módszerekkel szintetizált új szabályozó szekvenciákat is az endogén celluláris génbe, annak közvetlen szomszédságába, attól 5' -irányban, vagy a géntől távolabb. Eljárhatunk ezen felül úgy is, hogy valamely termelődött RNS vagy fehérje szerkezetét vagy stabilitását befolyásoló szekvenciákat kicserélünk, eltávolítunk, beépítünk, vagy másképpen módosítjuk az ilyen szekvenciákat, DNS célba juttatás útján. Módosíthatjuk például az RNS-ek stabilitását meghatározó elemeket, „splicehelyeket és/vagy az RNS-molekulák vezető szekvenciáit oly módon, hogy azok funkcióját, stabilitását és/vagy az RNSmolekula transzlálhatóságát módosítjuk. Megváltoztathatunk proteinszekvenciákat is, például szignálszekvenciákat, propeptid-szekvenciákat, aktív helyeket és/vagy strukturális szekvenciákat, a transzporr, szekréció vagy a fehérje funkcionális sajátságainak módosítása vagy fokozása céljából. A találmány szerinti eljárás végrehajtása folytán az exogén DNS beépítése megváltoztatja valamely gén normális • · • · ········ · · ··· · expressziós sajátságait és/vagy egy protein vagy RNSmolekula strukturális sajátságait.
A szabályozó szekvencia
A találmány szerinti DNS-konstrukció szabályozó szekvenciája állhat egy vagy több promóterből (például konstitutív vagy indukálható promóterből), enhanszerekből, „állványkapcsolódási („scaffold-attachment) régiókból vagy mátrix-kapcsolódási helyekből, negatív szabályozó elemekből, transzkripciós faktor kötőhelyekből, valamint a felsoroltak kombinációiból.
A találmány szerinti szabályozó szekvencia tartalmazhat indukálható promotert, ami azt eredményezi, hogy az ilyen konstrukciók alkalmazásával előállított sejtek önmagukban vagy valamely személybe bejuttatva nem expresszálják a kívánt terméket, de a termék expressziója indukálható bennük (azaz az expressziót a transzfektált sejtek előállítása után, de a sejtek beültetése előtt indukáljuk, vagy pedig a sejtek beültetését követően). A kívánt terméket kódoló DNS-t természetesen úgy is beépíthetjük a sejtekbe, hogy az a beépülést követően azonnal expresszálódjék (például konstitutív promoter vezérlése alatt). A szabályozó szekvenciákat izolálhatjuk celluláris vagy virális genomokból (ilyen szabályozó szekvenciák például a következő gének expresszióját szabályozó szekvenciák: az SV40vírus korai és késői génjei, az adenovírus fő kései génjei, az egéreredetű metallcrioenin-I-gén, az la-típusú elongációs faktor gén, a citomegalovírus-gének, a kollagén gének, az aktingének, az immunglobulin gének, valamint az • · ···· ····
HMG-CoA reduktáz gén) . A találmány szerinti DNSkonstrukciókban alkalmazott szabályozó szekvencia előnyösen tartalmaz transzkripciós faktor kötőhelyeket is, például TATA-boxot, CCAAT-boxot, APl-et, Spl-et, valamint NF-KBkötőhelyeket.
A DNS-konstrukciók további összetevői
A találmány szerinti DNS-konstrukciók tartalmaznak továbbá egy vagy több exont is. Az „exon kifejezést a leírásban olyan DNS-szekvenciákra alkalmazzuk, melyek átíródnak RNS-sé, és megtalálhatók az érett mRNS-molekulában. Az exonok - adott esetben - olyan DNS-t tartalmazhatnak, amely egy vagy több aminosavat kódol és/vagy valamely aminosavat részlegesen kódol (azaz valamely kódon egy vagy két bázisát tartalmazza) . Az is lehetséges, hogy az exon olyan DNS-t tartalmaz, amely 5' -végi nem-kódoló régiónak felel meg. Amennyiben az exogén exon vagy exonok egy vagy több aminosavat és/vagy aminosav-részletet kódolnak, a találmány szerinti DNS-konstrukciót úgy tervezzük meg, hogy a transzkripció és „splicing megtörténte után a leolvasási fázis megegyezzék a megcélzott gén második exonjának vagy kódoló régiójának leolvasási fázisával. A leírásban használt értelemben akkor mondjuk, hogy két exon leolvasási fázisa „megegyező, ha a két exont fuzionáltatva a kódoló nukleotidok olyan módon kapcsolódnak egymáshoz, hogy nem változik meg az mRNS azon részletének leolvasási fázisa, mely a második exonból származik.
Amennyiben a megcélzott gén 1. exonja tartalmazza a transzlációs iniciációs ATG-kódont, a találmány szerinti • · » · · · · ·
DNS-konstrukció exogén exonja előnyösen tartalmaz egy ATGkódont, valamint - kívánt esetben - egy vagy több nukleotidot oly módon, hogy a beépítés után kialakuló mRNS kódoló régió, amely a megcélzott gén második és további exonjait tartalmazza, azonos leolvasási fázisban legyen. Az 1. exonban ATG-kódont tartalmazó megcélzott gének lehetnek például a következő proteinek génjei: hEPO, hGH, humán granulocita/makrofág kolónia stimuláló faktor (hGM-CSF), valamint humán granulocita kolónia stimuláló faktor (hGCSF) .
A „splice-donor hely olyan szekvencia, amely valamely exon másik exonhoz történő kapcsolódását irányítja a „splicing során. Az ilyen kapcsolódás során az 1. exon tipikusan 5' -irányban helyezkedik el a második exonhoz képest, és az 1. exon 3' -végét hátfedő és szegélyező „splice-donor hely képes felismerni a második exon 5' végét szegélyező „splice akceptor-helyet. A „„splicedonor helyeknek jellegzetes konszenzus szekvenciájuk van, amit a következő módon lehet jelölni: (A/C)AG GURAGU (ahol R purin-nukleotidot jelöl), és szükséges, hogy a GUszekvenciarészlet a negyedik és ötödik pozícióban legyen [ Jackson, I.J.: Nucleic Research, 19, 3715 (1991)] . A „splice donor-konszenzus hely első három bázisa az exon utolsó bázisa. A „splice-donor helyeket funkcionálisan úgy definiálhatjuk, hogy képesek megfelelő reakcióba lépni az „mRNS-splicing-reakcióúton.
„Páratlan „splice-donor helynek azokat a találmány szerinti konstrukciókban található „splice-donor he• · • a a a · aa a a a · a« · a
- 28 - *·** *’* ’ lyeket nevezzük, amelyekkel egyidejűleg a konstrukcióban a páratlan „splice-donor helytől 3'-irányban nem található splice akceptor hely. Amennyiben a konstrukcióban páratlan „splice-donor hely található, ez a hely a „splicing során egy endogén „splice-akceptor helyhez fog kapcsolódni.
A „splice-akceptor hely valamely szekvenciában - a „splice-donor helyhez hasonlóan - valamely exon másik exonhoz történő kapcsolódását irányítja a „splicing során.
A szervezett „splicing mechanizmusa a „splice donor és „splice-akceptor helyek segítségével eltávolítja az intronokat. A „splice-donor helyeke szekvenciája jellegzetesen a következő: YYYYYYYYYY-NYAG, ahol Y egy pirimidin nukleotidot, N pedig bármely nukleotidot jelöl [ Jackson, I.J. : Nucleic Acids Research, 19, 3715 (1991)] .
Az „intron olyan szekvencia, amely egy vagy több nukleotidból áll, két exon között található, és a „splicing során a prekurzor RNS molekulából eltávolítódik, és így mRNS molekula keletkezik.
A szabályozó szekvencia például funkcionálisan hozzá van kapcsolva egy ATG-startkódonhoz, amely a transzláció kezdőpontja. Adott esetben egy CAP-hely (egy specifikus mRNS iniciációs hely, amely a szabályozó régióhoz kapcsolódik) is funkcionálisan hozzá lehet kapcsolva a szabályozó szekvenciához és az ATG-startkódonhoz. Eljárhatunk úgy is, hogy a célzó konstrukció nem tartalmaz a szabályozó szekvenciához kapcsolt és azáltal hasznosított CAP-helyet, ebben az esetben a sejt transzkripciós apparátusa új CAPhelyet fog meghatározni. A legtöbb gén esetében a CAP-hely általában kb. 25 nukleotidnyi távolságra, 3' -irányban található a TATA-boxtól. A találmány egy megvalósítási módja szerint a „splice-donor helyet például közvetlenül az ATGkódon mellé helyezzük, ahol az exogén exonban található egy vagy több nukleotid nem kell, hogy azonos leolvasási fázisban legyen a megcélzott gén második exonjával. Előnyösen közvetlenül az ATG-kódon 3' -vége mellé olyan DNSszekvenciát illesztünk, amely egy vagy több aminosavat vagy egy aminosav-részletet azonos fázisban kódol a megcélzott gén kódoló szekvenciájával. E szerint a megvalósítási mód szerint, a „splice-donor helyet közvetlenül a kódoló DNS mellett helyezzük el, annak 3' -végénél.
A „funkcionálisan kapcsolt vagy „funkcionálisan elhelyezett kifejezések a leírásban használt értelemben olyan konfigurációra utalnak, amelyben az exogén szabályozó szekvencia, exon, „splice-donor hely és - adott esetben egy szekvencia és egy „splice-akceptor hely megfelelően vannak elrendezve egy endogén gén megcélzásához úgy, hogy a konstrukció célba jutásakor a szabályozó elem olyan elsődleges RNS-transzkriptum termelődését indukálja, amely egy CAP-helyen kezdődik (adott esetben ezt is a célzó konstrukció tartalmazza), és a következő szekvenciarészleteket foglalja magába: a célzó konstrukció exonjának és „splicedonor helyének megfelelő szekvenciákat, az endogén gén szabályozó régiójától 5' -irányban elhelyezkedő DNS-t (amennyiben van ilyen), az endogén gén szabályozó régióját (amennyiben van ilyen), az endogén gén 5'-végi nemtransziálódó régióját (amennyiben van ilyen), valamint az • ·
- 30 - ···· ···· ’·· ··· endogén gén exonjait és intronjait (amennyiben vannak ilyenek) . Egy funkcionálisan kapcsolt konfiguráció esetén a célzó konstrukció „splice-donor helye olyan „splicingeseményt irányít az endogén gén egyik exonját szegélyező „splice-akceptor hely irányában, melynek következtében a kívánt fehérje termelődhet a „splicing folyamatán átesett teljesen érett transzkriptumról. A találmány egy megvalósítási módja szerint a „splice-akceptor hely endogén, ebben az esetben a „splicing-eseményt egy endogén exon irányítja, például az endogén gén egy exonja. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint - mely esetben a „spliceakceptor helyet a célzó konstrukció tartalmazza - a „splicing-esemény eltávolítja a célzó konstrukció által bevitt intront.
Az alkalmazott kódoló DNS (például a célzó konstrukciói . exon j ában található DNS) adott esetben kódolhat egy vagy több aminosavat, és/vagy tartalmazhatja valamely aminosav kódonjának egy részletét, amely kódolt aminosavat megegyeznek az endogén protein megfelelő aminosavaival. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott kódoló DNSszekvencia megegyezhet például a kívánt géni.exonjával. A kódoló DNS kódolhat azonban egy vagy több olyan aminosavat, vagy tartalmazhatja olyan aminosav kódonjának részletét, mely aminosavat különböznek a kívánt fehérjel.exonjában található aminosavaktól. Az ilyen megvalósítási módok különösen ekkor jelentősek, ha a termeltetni kívánt fehérjei . exonj ának aminosavai nem kritikusak a fehérje aktivitása vagy aktivitásai szempontjából. Például amennyiben az • · endogén hEPO-génben fúziót létrehozó konstrukciókat készítünk, alkalmazhatunk olyan kódoló szekvenciát, amely a hGHl.exonjának megfelelő szekvenciájú. Ebben az esetben a hGHl.exonjának a hEPO második exonjához történő fúziója egy hibrid szignálpeptid keletkezését eredményezi, amely működőképes. Alkalmazhatunk olyan konstrukciókat is, melyek valamely más olyan humán vagy nem humán eredetű exonokat tartalmaznak, melyekben kódolt aminosavat nem gátolják a keletkező hibrid szignálpeptid működőképességét. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a fent ismertetett megoldás alkalmazható valamely célgén mutációjának kijavítására is.
Amennyiben az előállítani kívánt termék egy olyan protein, amely az endogén protein és a célzó konstrukcióban található kódoló szekvenciák fúziójának eredménye, a találmány szerinti eljárásban a sejtekbe juttatandó exogén kódoló DNS olyan DNS-t tartalmaz, amely magába foglal egy vagy több olyan exont vagy cDNS-szekvenciát, amely megfelel a megcélzott endogén génhez fuzionáltatni kívánt transzlációs vagy transzkripciós terméknek. A találmány ezen megvalósítási módja szerint a célba juttatást kiméra- vagy többfunkciós fehérjék előállítására használjuk, amelyekben két vagy több fehérje strukturális, enzimatikus vagy ligandum vagy receptorkötő sajátságai egy polipeptidben kombinálódnak. Az exogén DNS például kódolhat a megcélzott protein számára egy membránba horgonyzó domént, vagy egy szignálpeptidet, amely lehetővé teszi vagy fokozza a kiválasztott fehérje celluláris szekrécióját, de kódolhat az exogén DNS vezető • · · ···· ···· szekvenciákat, enzimsajátságú régiókat, transzmembrán dómén régiókat, kofaktorkötő régiókat vagy egyéb funkcionális régiókat is. A következő fehérjék például olyan fehérjék, melyek normálisan nem szekretálódnak, de hozzájuk lehet fuzionáltatni egy szignálpeptidet, és ily módon szekréciójuk lehetővé válik: dopa dekarboxiláz, transzkripciós szabályozó fehérjék, Ct-galaktozidáz és tirozin hidroxiláz.
Amennyiben a megcélzott géni.exonja valamely nem kódoló régiónak felel meg [ ilyen például a β follikulusz stimuláló hormon (FHSh) génje] , exogén ATG-kódon beépítésére nincs szükség, és előnyösen ezt elhagyjuk.
A célzó konstrukcióban alkalmazott DNS-t kinyerhetjük természetes forrásból, de előállíthatjuk azt génsebészeti eljárásokkal vagy szintetikus módszerekkel is.
A megcélzott gén és a keletkező termék
Amennyiben a találmány szerinti DNS-konstrukciót sejtekbe transzfektáljuk, például elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtekbe, a konstrukció szabályozni képes a kívánt termék expresszióját, például egy fehérje vagy RNS aktív vagy funkcionális részletének expresszióját. A termék lehet például hormon, citokin, antigén, ellenanyag, enzim, véralvadási faktor, transzportfehérje, receptor, szabályozó fehérje, strukturális fehérje, transzkripciós faktor, antiszensz RNS vagy ribozim. Ezenfelül a termék lehet természetben elő nem forduló fehérje vagy nukleinsav is (például fúziós fehérje vagy fúziós nukleinsav).
A találmány szerinti eljárás alkalmas egy vagy több terápiás termék előállítására, ilyen termékek például: az ····· ·· · • · · · · · · • · · · · · eritropoietin, a kalcitonin, a növekedési hormonok, az inzulin, az inzulinotropin, az inzulinszerű növekedési faktorok, a paratiroid hormon, az α-interferon, a β-interferőn, az idegi növekedési faktorok, a β-FSH, a TGF-β, a tumornekrózis faktor, a glukagon, a 2-es számú csontnövekedési faktor, a 7-es számú csontnövekedési faktor, az interleukin-1, az interleukin-2, az interleukin-3, az interleukin-6, az interleukin-11, az interleukin-12, a granulocita-CSF, a makrofág-CSF, a granulocita/makrofágCSF, az immunglobulinok, a katalitikus ellenanyagok, a proteinkináz-C, a glükocerebrozidáz, a szuperoxiddiszmutáz, a szöveti plazminogén aktivátor, az urokináz, a
III. antitrombin, a DN-áz, az Ct-galaktozidáz, a tirozin hidroxiláz, az V. véralvadási faktor, a VII. véralvadási faktor, a VIII. véralvadási faktor, a IX. véralvadási faktor, a X. véralvadási faktor, a XIII. véralvadási faktor, az apolipoprotein-E, az apolipoprotein-A-I, a globinok, a kis sűrűségű lipoprotein receptor, az IL-2-receptor, az IL2-antagonisták, az alfa-l-antitripszin, az immunválaszt módosító hatóanyagok, valamint az oldható CD4.
Szelektálható markerek és amplifikálás
A célba jutás eseményének kimutatását megkönnyíthetjük egy vagy több szelektálható markergén alkalmazásával. Ezeket a markereket beépíthetjük a célzó konstrukcióba is, de jelen lehetnek valamely attól különböző konstrukción is. A szelektálható markereket két kategóriába sorolhatjuk: pozitívan szelektálható és negatívan szelektálható markerek (más szóval pozitív szelekcióra vagy negatív szelekcióra ···· ···· használható markerek). Pozitív szelekció esetén a pozitívan szelektálható markergént expresszáló sejtek képesek túlélni egy bizonyos szelekciós ágenssel végzett kezelést. Ilyen szelektálható markergének például a neo, a xantin-guanin foszforibozil-transzferáz génje (gpt), a dhfr, az adenozin deamináz génje (ada), a puromicin rezisztenciáért felelős gén (pác), a higromicin rezisztenciáért felelős gén (hyg), a CAD, amely karbamoil-foszfát szintetázt kódol, az aszpartát transzkarbamoiláz génje, a dihidro-orotázglutamin szintetáz génje (GS), az első multidrog rezisztencia protein génje (mdrl), valamint a D-hisztidin rezisztenciáért felelős gén (hisD). Ezek a markergének lehetővé teszik azon sejtek kiszelektálását, melyek genomjába a célzó konstrukció beintegrálódott. Negatív szelekció esetén a negatívan szelektálható markergént expresszáló sejtek a szelekciós ágens jelenlétében elpusztulnak. A célba jutás eseményének azonosítását egy vagy több negatívan szelektálható markergén alkalmazásával is megvalósíthatjuk oly módon, hogy a negatívan szelektálható markergént olyan konfigurációban kapcsoljuk az exogén DNS-hez, hogy a negatívan szelektálható markergén a célzó szekvenciát szegélyezze, mégpedig úgy, hogy amennyiben a gazdasejt genomjában kiválasztott szekvenciákkal létrejön a megfelelő homológ rekombinációs esemény, az ne eredményezze a negatívan szelektálható markergén stabil integrálódását [Mansour, S.L. és mtsai.: Natúré, 336, (1988)] . Ilyen célra alkalmazható markergének például a herpesz szimplex vírus timidinkináz génje (TK), valamint a bakteriális gpt-gén.
• · ·
Számos szelektálható markergént beépíthetünk elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtekbe. Alkalmazhatunk például olyan szelektálható markergéneket, melyek expressziója a sejtnek szelektálható fenotípust kölcsönöz, például valamely hatóanyaggal szembeni rezisztenciát, tápanyagfelvételi auxotrófiáját, valamilyen citotoxikus hatóanyaggal szembeni rezisztenciát, vagy valamely felszíni fehérje megjelenését. Alkalmas szelektálható markergének többek között: neo, gpt, dhfr, ada, pác, hyg, CAD, GS, mdrl és hisD. A létrejött szelektálható fenotípus lehetővé teszi, hogy a recipiens sejteket azonosítsuk és izoláljuk.
A szelektálható markereket kódoló ampiifikálható gének (például ada, GS, dhfr és a multifunkcionális CAD gén) további előnyös sajátsága, hogy lehetővé teszik olyan sejtek szelekcióját, melyek a genomba inszertálódott szelektálható markergént nagy kópiaszámban tartalmazzák. Ez a sajátság lehetővé teszi, hogy valamely szomszédos vagy kapcsolt gén kópiaszámát kívánt esetben jelentősen megnöveljük. A találmány szerinti megoldásban alkalmazhatjuk az említett szekvenciák olyan mutált variációit is, melyek javított szelekciós sajátságúak, és alkalmazhatunk egyéb ampiifikálható szekvenciákat is.
A találmány szerinti DNS-konstrukciókban a komponensek sorrendje változhat. Amennyiben a találmány szerinti konstrukció egy cirkuláris plazmid, a kialakított struktúrában az alkalmazott elemek sorrendje például a következő lehet: célzó szekvencia - plazmid DNS (amely olyan szekvenciákat tartalmaz, melyek lehetővé teszik a célzó plazmid ···· ·· · mikrobiális vagy egyéb alkalmas gazdasejtekben történő szelektálását és/vagy replikációját - szelektálható markergén (ek) - szabályozó szekvencia - exon - „splice-donor hely. A célzó szekvenciát és az exogén DNS-elemet tartalmazó plazmidot előnyösen olyan restrikciós enzimmel hasítjuk, amely egy vagy több helyen elhasítja a célzó szekvenciát, és ily módon olyan lineáris vagy megrövidített molekulát állítunk elő a recipiens sejtbe történő bejuttatást megelőzően, melynek szabad DNS-végei fokozzák a találmány szerinti kívánt homológ rekombinációs esemény bekövetkezésének gyakoriságát. Az elmondottakon túl a szabad DNS-végeket exonukleázzal is kezelhetjük, abból a célból, hogy túlnyúló egyszálú 5' - vagy 3' -DNS-végeket alakítsunk ki, melyek jelenléte szintén fokozza a kívánt homológ rekombinációs esemény bekövetkeztének gyakoriságát. A találmány szerinti megoldás említett megvalósítási módja esetén a célzó szekvencia és a celluláris célpont között bekövetkező homológ rekombináció azt fogja eredményezni, hogy a célzó szekvencia két kópiában fog előfordulni a beépült szekvenciában, amely két kópia a bejuttatott plazmidban található további elemeket fogja szegélyezni.
Amennyiben a találmány szerinti konstrukció lineáris, az alkalmazott elemek sorrendje például a következő lehet:1.célzó szekvencia - szelektálható markergén - szabályozó szekvencia - exon - „splice-donor hely - második célzó szekvencia, vagy más esetben:1.célzó szekvencia szabályozó szekvencia - exon - „splice-donor hely - szelektálható markert kódoló DNS - második célzó szekvencia.
• · • ·
Az ilyen konstrukciókat stabilan integráló sejtek túl fogják élni a szelektív hatóanyaggal történő kezelést; és a stabilan transzfektált sejtek egy része homológ módon rekombinálódott sejt lesz. A homológ módon rekombinálódott sejteket számos eljárás alkalmazásával azonosíthatjuk, ilyen eljárások például a PCR, a Southern-hibridizáció és a fenotípusos szkrínelés.
A találmány egy más megvalósítási módja szerint az alkalmazott elemek sorrendje a találmány szerinti konstrukcióban a következő lehet:1.célzó szekvencia - szelektálható markergén - szabályozó szekvencia - exon - „splice-donor hely - intron - „ splice -akceptor hely - második célzó szekvencia.
A találmány szerinti DNS-konstrukcióban az alkalmazott komponensek sorrendje lehet például a következő is:1.célzó szekvencia - első szelektálható markergén - szabályozó szekvencia - exon - „splice-donor hely - második célzó szekvencia - második szelektálható markergén, vagy más esetben: első célzó szekvencia - szabályozó szekvencia
- exon - „splice-donor hely - első szelektálható markergén
- második célzó szekvencia - második szelektálható markergén. Az említett megvalósítási mód szerint a második szelektálható markergén negatív szelekciót tesz lehetővé. Más szóval: a második szelektálható markergén termékének hiányára szelektálhatunk azáltal, hogy a sejteket valamely hatóanyagot tartalmazó alkalmas tápközegben tenyésztjük (a hatóanyag általában egy gyógyszer vagy metabolit-analóg). Az említett esetben az alkalmazott hatóanyag megöli azokat ··« ···· ·»·· a sejteket, amelyek expresszálják a második szelektálható markergént. Ebben az esetben az első szelektálható markergént szegélyező célzó szekvenciák gazdasejt genomjában található homológ szekvenciákkal történő rekombinációjának az lesz a következménye, hogy az első szelektálható markergén célzottan beépül, a második szelektálható markergén viszont nem épül be. Az ilyen rekombinációs események következtében olyan sejtek jönnek létre, melyek stabilan transzfektálva vannak az első szelektálható markergénnel, azonban nincsenek stabilan transzfektálva a második szelektálható markergénnel, és az ilyen sejteket úgy szelektálhatjuk, hogy a transzfektált sejteket olyan tápközegben tenyésztjük, amely tartalmaz egy olyan szelektív hatóanyagot, amely az első szelektálható marker jelenlétére szelektál, valamint tartalmaz egy olyan szelektív hatóanyagot, mely a második szelektálható marker hiányára szelektál .
A találmány szerinti DNS-konstrukció tartalmazhat olyan pozitívan szelektálható markergént is, amely lehetővé teszi olyan sejtek szelektálását, melyek a markergént megnövekedett kópiaszámban tartalmazzák. Az ilyen markergének amplifikálódása a szegélyező DNS-szekvenciák együttes amplifikálódását eredményezi. Az említett megvalósítási mód szerint a találmány szerinti konstrukcióban az alkalmazott elemek sorrendje például a következő lehet: első célzó szekvencia - amplifikálható pozitívan szelektálható markergén - (adott esetben) második szelektálható markergén szabályozó szekvencia - exon - „splice-donor hely - máso·* ···· dik célzó szekvencia.
Az említett megvalósítási mód esetén az aktivált gént tovább amplifikálhatjuk olyan szelektálható markergén alkalmazásával, mely rendelkezik azzal a sajátsággal, hogy a szelektálható markergén amplifikált kópiáit tartalmazó sejteket úgy lehet szelektálni, hogy a transzfektált sejteket megfelelő szelekciós hatóanyag jelenlétében tenyésztjük. Az aktivált endogén gén ebben az esetben együtt fog amplifikálódni a szelektálható markergénnel. Azok a sejtek, melyek sok kópiában tartalmazzák az aktivált endogén gént, képesek lehetnek a kívánt proteint rendkívül nagy mennyiségben termelni, és az ilyen sejtek alkalmasak lehetnek in vitro fehérjetermelésre és génterápiára.
A találmány szerinti megoldás valamennyi megvalósítási módját tekintve nem szükségszerű, hogy a szelektálható és amplifikálható markergének közvetlenül egymás mellett legyenek találhatók a találmány szerinti konstrukcióban.
A találmány szerinti DNS-konstrukció adott esetben tartalmazhat bakteriális replikációs origót is, valamint bakteriális antibiotikum rezisztencia markereket vagy egyéb szelektálható markereket, melyek lehetővé teszik, hogy a találmány szerinti plazmidokat nagy mennyiségben előállítsuk baktériumokban vagy bármely más alkalmas klónozó/gazdarendszerben. Azok a találmány szerinti konstrukciók, melyek szelektálható markert kódoló DNS-t tartalmaznak, további szekvenciákkal együtt, például promóterrel és „splice junction helyekkel együtt alkalmasak arra, hogy a transzfektált sejteknek szelektálható fenotípust kölcsönöz- 40 ···» * · • · • ·· · zenek (ilyen például a pcDNEO-plazmid, melynek vázlatát a 4. ábrán láthatjuk). Az ilyen DNS-konstrukciót kotranszfektálhatjuk elsődleges vagy másodlagos sejtekbe, valamely célzó szekvenciával együtt, a leírásban ismertetett módszerek alkalmazásával.
Transzfekció és homológ rekombináció
A találmány szerinti megoldás alkalmazásakor a konstrukciót sejtekbe - például elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejtekbe - juttatjuk, egyetlen DNSkonstrukció formájában, vagy több különálló DNS-szekvencia formájában, melyek beépülnek a transzfektált sejt kromoszómális vagy magi DNS-ébe.
A célzó szekvenciákat, szabályozó szekvenciát, exont, „splice-donor helyet és szelektálható markergén/eke/t tartalmazó célzó DNS-konstrukciót bejuttathatjuk a sejtekbe egyetlen DNS-konstrukció formájában, vagy több különálló konstrukció formájában. A találmány szerinti DNSkonstrukció teljes hossza a beépített komponensek (például célzó szekvenciák, szabályozó szekvenciák, exonok, szelektálható markergének és egyéb elemek) számától és hosszúságától függően változó. A teljes konstrukció hossza általában legalább kb. 200 nukleotidnyi. A találmány szerinti DNS-konstrukciót bejuttathatjuk lineáris, kettősszálú (egy vagy mindkét végén egyszálú régiókat tartalmazó vagy nem tartalmazó), egyszálú, vagy cirkuláris formában.
A találmány szerinti DNS-konstrukciókat transzfektált sejtek előállítása céljából sejtekbe juttatjuk. A transzfektált sejteket olyan körülmények között tartjuk • I ········ · · · ·· · fenn, melyek lehetővé teszik homológ rekombinációs események bekövetkeztét, ilyen körülmények a technika állása szerint jól ismertek [Capecchi, M.R.: Science, 244, 1288 (1989)] . Amennyiben a homológ módon rekombinálódott sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, melyek alkalmasak a DNS átíródására, a célzó konstrukcióval bejuttatott szabályozó régió - például promóter - aktiválni fogja a transzkripciót .
A találmány szerinti DNS-konstrukciókat számos fizikai vagy kémiai eljárás alkalmazásával bejuttathatjuk a sejtekbe, ilyen módszerek például: az elektroporáció, a mikroinjektálás, a mikrorészecskés bombázás, a kálciumfoszfátos kicsapás, valamint a liposzómákkal, polibrénnel vagy DEAE-dextránnal közvetített traszfekció. Eljárhatunk úgy is, hogy a találmány szerinti DNS bejuttatásához fertőző vektorokat használunk, például retrovirális, herpeszvírus eredetű, adenovírus eredetű, adenovírus-asszociált, mumpsz- vagy poliovírus-vektorokat.
A célzó DNS-konstrukciót adott esetben bejuttathatjuk a sejtbe kettő vagy több különálló DNS-fragmensen is. Amennyiben két különálló fragmenst használunk, a két fragmens tartalmaz egy homológ DNS-szekvenciát (azaz átfed egymással) az egyik fragmens 3'-végénél, és a másik fragmens 5'-végénél, az egyik fragmens tartalmaz egy első célzó szekvenciát, a másik fragmens pedig egy második célzó szekvenciát tartalmaz. Amennyiben a fragmenseket egy sejtbe bejuttatjuk, a két fragmens egymással homológ rekombinációba léphet, és ily módon olyan fragmens keletkezik, amelyben • · · · * « · • · · · · · · • · · · · · ········ · · · ·· · az első és a második célzó szekvencia a két eredeti fragmens átfedő régióját fogja szegélyezni. Az így kialakult fragmens más alkalmas arra, hogy homológ rekombinációba lépjen a celluláris célszekvenciákkal. Alkalmazhatunk kettőnél több fragmenst is, melyeket oly módon kell megtervezni, hogy a fentiek szerint egymással homológ rekombinációba lépjenek, és így végül egy olyan termék alakuljon ki belőlük, amely alkalmas a celluláris célszekvenciákkal történő homológ rekombinációra.
A homológ rekombinációt tartalmazó sejtek
A célba jutási esemény következtében a célzó konstrukció szabályozó szekvenciája beépül a gazdasejt DNS-ébe, és ily módon az endogén gén a szabályozása alá kerül (ilyen esemény például az, amikor egy promoter vagy egy enhanszer vagy mindkettő beépül valamely endogén gén vagy szabályozó régiótól 5' -irányban) . Adott esetben a célba jutási esemény az endogén szabályozó elem delécióját is eredményezheti, például valamely szövetspecifikus negatív szabályozó elem delécióját. A célba jutási esemény folytán valamely létező elem kicserélődhet, például kicserélhetünk egy szövetspecifikus enhanszert egy olyan enhanszerre, melynek szélesebb körű vagy a természetesen előforduló enhanszertől különböző a sejttípus-specifitása, vagy szabályozási vagy indukciós mintázata különbözik a transzfektálatlan sejtben tapasztalhatótól. A találmány ilyen megvalósítási módjai szerint a természetesen előforduló szekvencia deletálódik, és helyére úgy szekvenciák épülnek be. Eljárhatunk úgy is, hogy az endogén szabályozó elemet nem távolítjuk el vagy helyettesít····· · · · « · · · · · · • · · · · · ········ · · ··« · jük, hanem a célba jutási esemény kapcsán a szekvenciát elrontjuk vagy hatástalanítjuk úgy, hogy az exogén célzószekvencia az endogén szabályozó elembe épüljön be.
Miután a DNS-t bejuttattuk a sejtbe, a sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik, hogy a genomi DNS és a bejuttatott DNS egy részlete között homológ rekombináció történjék, az ilyen alkalmas körülmények a technika állása szerint jól ismertek [ Capecchi, M.R. : Science, 244, 1288 (1989)] .
A genomi DNS és a bejuttatott DNS közötti homológ rekombináció olyan homológ rekombinációt tartalmazó sejtet
- például gomba, növényi vagy állati sejtet, különösen elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán vagy emlős eredetű sejtet - eredményez, amelyben az endogén gén expresszióját megváltoztató szekvenciák funkcionálisan hozzá vannak kapcsolva egy bizonyos terméket kódoló endogén génhez, és ily módon olyan új transzkripciós egység jön létre, melynek expressziós és/vagy kódoló képessége különbözik az endogén gén hasonló képességétől. Oltalmi igényünk kifejezetten kiterjed az olyan homológ rekombinációt tartalmazó sejtekre, amelyek egy szabályozó szekvenciát és egy exont tartalmaznak, melyet egy „splice-donor hely szegélyez, amely szekvenciákat a genom egy előre meghatározott helyére juttattuk be egy célzó DNS-konstrukció alkalmazásával, és az említett szekvenciák funkcionálisan hozzá vannak kapcsolva egy endogén gén második exonjához. A találmány szerinti sejtek adott esetben tartalmazhatnak több exogén exont is (kódoló vagy nem kódoló exonokat), valamint intronokat is, az endogén gén bármely exonjához funkcionálisan hozzá kapcsolva. A találmány szerinti homológ rekombinációt tartalmazó sejteket - amennyiben lehetséges olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik az amplifikálható markergén és az új transzkripciós egység amplifikálódását. A találmány szerinti amplifikált vagy amplifikálatlan sejteket a technika állása szerint ismert olyan körülmények között tenyésztjük, melyek alkalmasak a kívánt fehérje expressziójára, ily módon a sejteket a kívánt fehérje in vitro termelésére használhatjuk, de használhatjuk a találmány szerinti sejteket valamely terápiás fehérje in vivő előállítására is (azaz génterápiára).
A leírásban használt értelemben az „elsődleges sejt kifejezés olyan sejtekre utal, melyek valamely gerinces eredetű szövetből izolált sejteket tartalmazó szuszpenzióban találhatók (mielőtt a sejteket szélesztertük volna, azaz valamely tálcán vagy lombikban található szövettenyésztő közegbe juttattuk volna), vagy olyan sejtekre, amely valamely szövetből származó explantátumban találhatók, mindkét említett sejttípusra jellemző, hogy elsőízben vannak szélesztve, és a kifejezés vonatkozik az ilyen szélesztett sejtekből előállított szuszpenziókra is. A „másodlagos sejt vagy „másodlagos sejttörzs kifejezések olyan sejteket jelölnek, amelyek valamely további tenyésztési fázisban találhatók. Azaz az elsóízben szélesztett elsődleges sejteket eltávolítjuk a tápközegből és ismételten szélesztjük azokat (passzálás), a leírás szerinti értelemben a másodlagos sejt kifejezés valamennyi ezt követő passzálás eredményeként kapott sejtekre vonatkozik. A másodlagos sejtek olyan sejttörzsek, melyek egyszer vagy többször passzált másodlagos sejtekből állnak. Az ilyen sejttörzs olyan másodlagos sejteket tartalmaz, melyeket: 1) Egyszer vagy többször passzáltak; 2) tenyészetükben a populáció átlagos megkettőződéseinek száma véges; 3) a sejtekre jellemző a kontakt-gátlásra érzékeny, letapadásfüggő növekedés (a letapadásfüggő növekedés nem vonatkozik azokra a sejtekre, melyeket szuszpenziós tenyészetben növesztünk); és 4) a sejtek nem halhatatlanná tett sejtek.
A „halhatatlanná tett sejtek olyan sejtvonalak (nem sejttörzsek, mivel a „sejttörzs kifejezést fenntartjuk az elsődleges és másodlagos sejtek megnevezésére), melyek legjellemzőbb sajátsága az, hogy tenyészetben látszólag végtelen élettartamúak.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható sejteket négy típusba vagy csoportba sorolhatjuk: 1) olyan sejtek, melyek természet szerint nem termelik vagy tartalmazzák a termeltetni kívánt proteint vagy terméket (a kívánt termék ebben az esetben valamely olyan protein, melyet a sejt természet szerint nem expresszál vagy valamely természetben meg nem található fúziós fehérje), 2) olyan sejtek, melyek termelik vagy tartalmazzák a kívánt proteint vagy terméket, de nem a kívánt mennyiségben (például olyan menynyiségben tartalmazzák a kívánt terméket, amely kisebb, mint az alkalmazott sejt esetén fiziológiásán normális legkisebb mennyiség), 3) olyan sejtek, melyek a kívánt proteint vagy terméket fiziológiásán normális szinten tartalmaz• · • · ···· ···· · zák, de kívánatos, hogy a sejtekben a termék koncentrációja vagy termelődése csökkenjen vagy fokozódjék, és 4) olyan sejtek, melyekben kívánatos, hogy egy adott proteint kódoló gén szabályozási vagy indukciós mintázatát megváltoztassuk.
A találmány szerinti eljárással transzfektálni kívánt elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejteket számos különböző szövetből izolálhatunk, és alkalmas bármely olyan sejt, amely tenyészetben fenntartható.
A találmány szerinti eljárással transzfektálható elsődleges és másodlagos sejtek lehetnek például fibroblasztok, keratinociták, epitélsejtek (például emlő-epitélsejtek, intesztinális epitélsejtek), endotélsejtek, gliasejtek, idegsejtek, a vér alakos elemei (például limfociták, csontvelő sejtek), izomsejtek, valamint a felsorolt szomatikus sejttípusok prekurzorai. Amennyiben a homológ rekombinációt tartalmazó sejteket génterápiás célra ki kívánjuk használni, az elsődleges sejteket előnyösen abból az egyénből izoláljuk, akibe a transzfektált elsődleges vagy másodlagos sejteket be kívánjuk juttatni. Mindazáltal, az elsődleges sejteket izolálhatjuk a recipienstől különböző, valamely azonos fajhoz tartozó donorból is.
A találmány szerinti eljárás alkalmazásával előállíthatunk homológ rekombinációt tartalmazó halhatatlanná tett sejteket is, és azokat felhasználhatjuk fehérjetermelésre vagy génterápiás célra. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható halhatatlanná tett humán sejtvonalak példáiként - igényünk korlátozása nélkül - megemlíthetjük a következőket: HT1080-sejtek (ATCC CCL 121), HeLa-sejtek és
HeLa-sejtszármazékok (ATCC CCL 2, 2.1 és 2.2), MCF-7mellráksejtek (ATCC BTH 22), Κ-562-leukémiasejtek (ATCC CCL 243), KB-karcinómasejtek (ATCC CCL 17), 2780AD-petefészekkarcinóma-sejtek [Van dér Blick, A.M. és mtsai.: Cancer Rés., 48, 5927 (1988)], Raji-sejtek (ATCC CCL 86), Jurkatsejtek (ATCC TIB 152), Namalwa-sejtek (ATCC CRL 1432), HL60-sejtek (ATCC CCL 240), Daudi-sejtek (ATCC CCL 213), RPMI-8226-sejtek (ATCC CCL 155), U-937-sejtek (ATCC CRL 1593), Bowes-féle melanóma-sejtek (ATCC CRL 9607), a WI38VA13-sejtek 2R4-szubklónja (ATCC CLL 75.1), MOLT-4-sejtek (ATCC CRL 1582), valamint heterohibridóma-sejtek, melyeket humán sejtek és más fajhoz tartozó sejtek fúziójával állíthatunk elő. A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk másodlagos humán fibroblaszt törzseket is, ilyen például a
WI-38- (ATCC CCL 75) és az MRC-5-törzs (ATCC CCL 171). Az elmondottakon túl alkalmasak a találmány szerinti eljárásban történő hasznosításban az olyan humán elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett sejtek, valamint az egyéb fajokból származó olyan elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett sejtek, melyek alkalmasak in vitro génamplifikáció létrehozására, az ilyen sejteket felhasználhatjuk mint in vitro fehérjetermelésre, mind pedig génterápiás célra.
Eljárás cDNS-másolat készítésére valamely génről
A találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás is, amely szerint a homológ rekombináció folyamatát használjuk fel valamely gén cDNS-másolattá (intronmentes génné) történő átalakítására. Az előállított cDNS-másolatot bevihetjük élesztőbe vagy baktériumba in vitro fehérjetermelés céljából, de beépíthetjük a cDNS-másolatot valamely emlős sejtbe is in vitro vagy in vivő fehérjetermelés céljából. Amennyiben a cDNS-t mikrobiális sejtekbe kívánjuk bejuttatni, két célzó szekvenciákat tartalmazó egymástól különböző DNSkonstrukciót építünk be homológ rekombináció útján, az egyik konstrukciót a terápiás proteint kódoló humán géptől 5' -irányban, a másik konstrukciót pedig a géntől 3' irányban. Az 5' -irányban beépített DNS-szekvenciák például a következő összetevőket tartalmazhatják: az érett, proceszszált terápiás fehérje első aminosavát kódoló DNS mellett vagy attól 5' -irányban található genomi eredetű DNSszekvenciákat; retrovirális hosszú terminális ismétlődést (LTR); mikrobiális sejtekben történő szelektálásra alkalmas markert kódoló szekvenciákat; mikrobiális sejtekben működőképes szabályozó elemet; valamint egy „splice-donor helyet is tartalmazó szignálszekvenciát kódoló DNS, amely elősegíti a termék mikrobiális sejtekből történő szekrécióját. Az 5'-irányban beépíteni kívánt szekvenciákat az érett, processzált terápiás protein első aminosavát kódoló DNS közelébe, attól 5' -irányban építjük be. A 3' -irányban beépíteni kívánt szekvenciák például a következő összetevőket tartalmazzák: az érett, processzált protein utolsó aminosavát kódoló DNS-től 3' -irányban található genomi DNSszekvenciákat; mikrobiális transzkripciós terminációs szekvenciát; mikrobiális sejtekben replikációt irányítani képes
DNS-szekvenciákat; valamint retrovirális LTR-t. A 3' irányban beépíteni kívánt szekvenciákat közvetlenül az ···· ···· érett, processzált terápiás protein stopkódonjától 3' irányban építjük be.
Miután a két DNS-konstrukciót bejuttattuk a sejtekbe, a sejteket olyan körülmények között tartjuk, melyek lehetővé teszik homológ rekombináció létrejöttét a bejuttatott DNS és a genomi DNS között, és ily módon homológ rekombinációt tartalmazó sejtek jönnek létre. A beépített DNS-konstrukciók egyike vagy mindegyike adott esetben tartalmazhat egy vagy több pozitív vagy negatív szelekciós markert, amely lehetővé teszi a DNS-konstrukciókat tartalmazó sejtek szelekcióját, és miután az egyik vagy mindkét DNS-konstrukciót bejuttattuk a sejtekbe, beiktathatunk egy szelekciós lépést. Eljárhatunk úgy is, hogy a mikrobiális sejtekben történő szelekciós lehetővé tevő markert kódoló DNS-szekvenciákat és a mikrobiális sejtekben történő replikációt vezérlő szekvenciákat tartalmazhatja akár az 5' -irányban, akár a 3' -irányban beépítendő célzó konstrukció, de úgy is eljárhatunk, hogy a mikrobiális sejtekben szelekciót lehetővé tevő markert kódoló szekvenciákat a 3' irányban beépíteni kívánt konstrukció tartalmazza, a mikrobiális sejtekben DNS-replikációt vezérelni képes szekvenciákat pedig az 5' -irányban beépítendő célzó konstrukció. A homológ rekombinációt tartalmazó sejteket ezután olyan körülmények között tenyésztjük, melyek alkalmasak a terápiás proteint kódoló gén RNS-terméke LTR-irányítóttá transzkripciójára, processzálására és reverz transzkripciójára. A reverz transzkripció eredménye egy olyan DNSkonstrukció lesz, amely a terápiás fehérje intronmentes
DNS-másolatát fogja tartalmazni, funkcionálisan hozzákapcsolva a fent leírt két exogén DNS-konstrukcióban található szekvenciákhoz. Az ismertetett eljárással· előállított intromentes DNS-konstrukciót ezután mikrobiális sejtekbe juttatjuk. A mikrobiális sejteket ezután olyan körülmények között tenyésztjük, melyek alkalmasak a terápiás protein expresszálására és szekréciójára.
In vivő fehérjetermelés
A találmány szerinti homológ rekombinációt tartalmazó sejteket felhasználhatjuk a következő formákban: homológ rekombinációt tartalmazó sejtvonalak populációiként; homológ rekombinációt tartalmazó elsődleges vagy másodlagos sejtek populációiként; homológ rekombinációt tartalmazó klonális sejttörzsekként vagy sejtvonalakként; homológ rekombinációt tartalmazó heterogén sejttörzsekként vagy sejtvonalakként; valamint olyan keverékekként, melyekben legalább egy reprezentatív sejt jelen van az előzőekben felsorolt négy homológ rekombinációt tartalmazó sejtkategóriákból. Az említett sejteket felhasználhatjuk valamely bejuttató rendszer alkalmazásával olyan egyedek kezelésére, melyek valamely abnormális vagy nem kívánatos elváltozással rendelkeznek, mely elváltozás reagál egy bizonyos terápiás termék bejuttatására, mely terápiás termék a következők valamelyike lehet: 1) egy terápiás protein (például egy olyan protein, amely az egyedből hiányzik, a fiziológiás szükséghez képest viszonylag kis mennyiségben termelődik, detektív, vagy az egyedben nem megfelelő mértékben vagy nem megfelelő módon hasznosul; valamely új sajátsággal bíró prote• · in, például új enzimatikus vagy transzport sajátsággal), vagy 2) terápiás nukleinsav (például olyan RNS, amely gátolja valamely gén expresszióját vagy saját enzimaktivitással bír). A találmány szerinti terápiás protein vagy nukleinsav előállítására alkalmas eljárás szerint úgy járunk el, hogy a kezelésre vagy megelőzésre szoruló abnormális vagy nem kívánatos rendellenességen szenvedő egyénbe a megfelelő módon és megfelelő mennyiségben homológ rekombinációt tartalmazó elsődleges sejteket, klonális sejttörzseket vagy heterogén sejttörzseket juttatunk, aminek következtében a terápiás protein vagy exogén DNS fiziológiásán releváns mértékben expresszálódik vagy hozzáférhetővé válik. „Fiziológiásán releváns mennyiségnek azt a mennyiséget nevezzük, amely megközelíti a termék testben normálisan termelődő mennyiségét, vagy azt a mennyiséget, amely az abnormális vagy nem kívánatos rendellenesség javulását eredményezi. A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a homológ rekombinációt tartalmazó halhatatlanná tett sejtvonalakat beadhatjuk egy vagy több szemipermeábilis hordozóeszközbe zártan is. A hordozóeszköz permeabilitási sajátságai olyanok, hogy a bezárt sejtek az élőlénybe történt beültetés után az eszközt nem képesek elhagyni, a terápiás termék számára azonban az eszköz szabadon átjárható, és így a terápiás termékek képesek elhagyni a hordozóeszközt, és belépnek az inplantumot körülvevő térbe, vagy a szisztémás keringésbe. Az alábbi fehérjék például terápiásán előnyös módon szisztémásán bejuttathatok emberbe: hGH, hEPO, humán inzulinotropin, hGM-CSF, hG-CSF, • · · • · · · · · · • ··· · « • · · « · ···· ·· · ·· · humán OC-interf erőn és humán FSHh.
A fentiek szerinti határoló-hordozó eszközök különösen előnyösek és lehetővé teszik homológ rekombinációt tartalmazó halhatatlanná tett sejtek, más fajokból származó homológ rekombinációt tartalmazó sejtek (homológ rekombinációt tartalmazó xenogenetikus sejtek), vagy hisztokompatibilitási szempontból nem egyező donorból származó sejtek (homológ rekombinációt tartalmazó allogén sejtek) beültetését humán vagy állati rendellenességek kezelése céljából, vagy mezőgazdasági hasznosításra (például tápanyagelőállítás). A határoló-hordozó eszközök a rövidtávú (azaz átmeneti) kezelést is egyszerűen lehetővé teszik azáltal, hogy a beültetett sejtek így könnyen eltávolíthatók, amennyiben a kezelést bármilyen okból szüneteltetni kell.
Határoló-hordozó eszközt előállíthatunk számos szintetikus, szemiszintetikus vagy természetes anyagból készített szűrőmembránból, ilyen membránok készülhetnek például - igényünk korlátozása nélkül -: cellulózból, cellulóz-acetátból, nitrocellulózból, poliszulfónból, polivinilidin-difluoridból, polivinil-klorid-polimerekből és polivinil-klorid-származékokból készült polimerekből. A határoló-hordozó eszközök lehetővé teszik, hogy valamely más fajból származó elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejteket humán génterápiára alkalmazzunk.
In vitro fehérjetermelés
A találmány szerinti homológ rekombinációt tartalmazó humán és nem humán sejteket felhasználhatjuk in vitro • · • · · » · · ···· ···· ·· · ·· · fehérjetermelésre is. A sejteket a technika állása szerint ismert körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik a fehérje expresszálódását. A találmány szerinti eljárásokkal előállított proteineket tisztíthatjuk sejtlizátumokból vagy a sejtek felülúszóiból, a kívánt fehérje előállításának céljából. A találmány szerinti eljárással előállított proteinek lehetnek többek között terápiás proteinek is, melyeket a technika állása szerint ismert, hagyományos gyógyászati úton juttathatunk be emberekbe vagy állatokba (például orálisan, intravénásán, intramuszkulárisan, intranazálisan vagy szubkután). Ilyen proteinek például a hGH, hEPO, a humán inzulinotropin, a hGM-CSF, a hGCSF, az FSHD és az Ot-interf erőn . Az alkalmazott sejtek lehetnek halhatatlanná tett, elsődleges vagy másodlagos sejtek. A nem humán sejtek alkalmazása olyan esetekben lehet kívánatos, mely esetekben ezen sejtek proteintermelés szempontjából előnyösek, amikor a nem humán protein terápiásán vagy kereskedelmi szempontból hasznos, megemlítjük például a lazaceredetű sejtek alkalmazását lazac-kalcitonin előállítására, a sertéseredetű sejtek alkalmazását sertésinzulin előállítására, valamint a marhaeredetű sejtek alkalmazását marha növekedési hormon előállítására.
A találmány szerinti eljárások, DNS-konstrukciók, sejtek és előállított proteinek a technika állása szerint ismert megoldásokhoz képest számos előnnyel bírnak. Az a lehetőség, hogy valamely endogén gént úgy aktiválunk, hogy egy exogén szabályozó szekvenciát a kívánt génhez képest változó pozícióban bejuttatunk - az exogén szabályozó szék• · · · • · · · · ♦ · • · «· · · · • · · · · · ·*·· ···· ·· · ·· · vencia beépíthető közvetlenül a kívánt gén mellé (azaz közvetlenül fuzionáltatható a normális átíródó régiójához), de bejuttatható a szabályozó szekvencia akár 30 kb-nyira vagy annál is messzebb 5' -irányban az endogén gén átíródó régiójától, vagy beépíthető a szabályozó szekvencia az endogén gén valamely intronjába is - előnyös a sejtekben történő génexpresszió befolyásolása szempontjából. A találmány szerinti eljárás alkalmas például arra, hogy egy szabályozó elemet beépítsünk valamely normálisan csendes régiótól 5' vagy 3' -irányban, vagy negatívan szabályozzunk egy gént.
Egy szabályozó elem beépítése valamely ilyen régiótól 5' vagy 3' -irányban lehetővé teszi, hogy megszűnjenek azok a domináns negatív hatások, melyek normálisan megakadályozzák a transzkripciót. A találmány szerinti célzó konstrukciók alkalmazásával ezen felül deletálhatunk olyan DNS-régiókat is, melyek normálisan gátolják a kívánt gén transzkripcióját, vagy más módon hátrányosan befolyásolják a gén expressziój át.
Továbbá, mivel közismert, hogy a promóterek működését a lokális genetikai környezet erősen befolyásolja, a találmány szerinti megoldás alkalmazásával megvizsgálhatunk egy promóter beépítésével kapcsolatban számos lehetséges pozíciót, és így meghatározhatjuk azt a lokális környezetet, amely a promóter működése szempontjából optimális. El kell azonban mondanunk, hogy mivel az ATG-startkódon az emlős DNS-en belül nagyon gyakran előfordul (kb. 48 bázispáronként található egy ATG-kódon) , a transzkripció nem kezdődhet a kívánt géntől 5'-irányban bármely pozíció55 ···· ··· bán, mivel ilyenkor egy olyan transzkriptum keletkezne, mely a megfelelő ATG-startkódon előtt egy hosszú vezetőszekvenciát tartalmazna, és mivel egy ilyen hosszú vezetőszekvenciában számos ATG-kódon előfordulna, ez megakadályozná a megfelelő géntermék transzlációját, ezért az ilyen mRNS-ek expresszióra alkalmatlanok. Ezért azáltal, hogy a találmány szerinti szabályozó régiót tartalmazó célzó konstrukciókra beépítünk egy exogén exont, egy „splicedonor helyet és adott esetben egy intront és egy „spliceakceptor helyet, lehetővé válik a génexpresszió optimalizálása a szabályozó funkcióhoz optimális környezet azonosításával anélkül, hogy külön törődnünk kellene azzal, hogy elkerüljük, hogy a termelődött mRNS-be nem megfelelő ATGstartkódonok épüljenek be. Ez a sajátság jelentősen megnőtt rugalmasságot biztosít a találmány szerinti konstrukciók beépítésének helyének megválasztásában, és ily módon több gén aktiválására nyílik lehetőség. A találmány szerinti DNS-konstrukciók alkalmasak például olyan eljárásokban történő felhasználásra is, melyek célja rekombináns vagy exogén szekvenciák és endogén szekvenciák által kódolt fúziós proteinek létrehozása.
A fent leírt találmány szerinti géncélzás és amplifikáció különösen alkalmas olyan gének expressziójának megváltoztatására, melyek olyan nagy transzkripciós egységekben találhatók, hogy izolálásuk és expresszálásuk nehézkes, és a találmány szerinti eljárás alkalmas olyan gének aktiválására is, melyek vonatkozásában nem áll rendelkezésre a teljes kódoló régió szekvenciája, vagy amelyeket még ····· · * · « · ··· « · • · · · · · ···· ···· ·· · ·· · nem klónoztak meg. Az elmondottak értelmében tehát a találmány szerinti DNS-konstrukciók alkalmasak exogén szabályozó elemek endogén génekhez történő funkcionális kapcsolására oly módon, amely precízen meghatározza a transzkripciós egységet, rugalmasságot biztosít az exogén szabályozó elemek és az endogén gén relatív pozíciójának megválasztásában. Összefoglalva: a találmány szerinti megoldás egy rendkívül jól szabályozott rendszert szolgáltat terápiásán fontos gének expressziójának kiváltására és szabályozására.
A példák rövid összefoglaló ismertetése
Amint azt az alábbiakban látni fogjuk, igazoltuk, hogy homológ rekombináció útján DNS beépíthető transzfektált sejtek genomjába, például elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett gerinces sejtek genomjába.
Azt is bemutattuk, hogy a beépített exogén DNS a kívánt módon működik a homológ rekombinációt tartalmazó (HR) sejtekben, és azt is kimutattuk, hogy a megfelelő módon célba juttatott konstrukciókat tartalmazó sejteket azonosítani lehet a helyesen célba juttatott DNS-konstrukció által kialakított detektálható fenotípusos sajátság folytán.
Az alábbiakban bemutatjuk egy olyan plazmid előállítását, amely alkalmas a humán genomban található bizonyos lókusz (a K?RT-lókusz) és a homológ rekombinációt tartalmazó sejteket hatóanyagrezisztens fenotípus alapján szelektálni is lehetett (l.a példa). Az előállított plazmid elnevezése pE3Neo, és amennyiben ez a plazmid a celluláris genom HPRT-lókuszába integrálódik, olyan sejtek keletkeznek, melyek fenotípusa hprt , 6-TG-rezisztens és G418»· ···· rezisztens. Azt is kimutattuk, hogy a pE3Neo-konstrukció géncélba juttatás után megfelelően működik egy izolált humán fibroblaszt-sejtvonalban (l.b példa), és a bejuttatott DNS lokalizációját is kimutattuk a transzfektált sejtek HPRT-génjének harmadik exonjában.
Megvalósítottuk ezenfelül a pE3Neo-plazmid géncélba juttatás útján történő beépítését elsődleges és másodlagos humán bőrfibroblaszt-sejtekben (l.c példa). Az alábbiakban azt is bemutatjuk, hogy a célzó konstrukciót tartalmazó DNS végeinek módosítása fokozza a konstrukció genomi DNS-be történő célba jutásának valószínűségét (l.c és l.e példák). Az alábbiakban olyan eljárásokat is bemutatunk, melyek alkalmazásával valamely gént beépíthetünk egy sejt - például elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejt genomjának valamely előre meghatározott helyére géncélba juttatás útján (l.d példa).
Az elmondottakon túl a találmány tárgyát képezi egy eljárás is, a transzfektált sejtekkel történő fehérjetermeltetésre. Az eljárás szerint sejteket - például elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejteket transzfektálunk olyan exogén DNS-sel, amely valamely terápiás terméket kódol, vagy olyan DNS-sel, amely alkalmas arra, hogy megcélozzuk valamely olyan endogén gént, mely terápiás terméket kódol. Az alábbi l.g, l.h, l.j, 1. k, 2., 3., 4. és 6-9. példák például olyan eljárásokat mutatnak be, melyek szerint valamely kiválasztott endogén gén expresszióját megváltoztattuk oly módon, hogy bizonyos DNSszekvenciaelemeket célba juttattunk, és így termeltettünk valamely kiválasztott proteint.
Bemutatunk endogén celluláris gének amplifikálására alkalmas DNS-konstrukciókat és eljárásokat is, amely celluláris géneket géncélzás útján aktiváltunk (3., 6., 8. és 9. példák).
Az l.f-l.h, 2., ., és 6. példák a találmány szerinti megoldás olyan előnyös megvalósítási módjait mutatják be, melyek szerint a humán hEPO-géntől 5' -irányban található normális szabályozó szekvenciákat megváltoztattuk oly módon, hogy lehetővé tegyük a hEPO expresszióját olyan elsődleges vagy másodlagos fibroblaszt-törzsekben, melyek transzfektálatlan állapotban nem expresszálnak EPO-t detektálható mennyiségben. Az egyik bemutatott megvalósítási mód szerint a célba juttatás eredményeként a normális EPOfehérje változatlan megmaradt, de expressziójának szabályozását átvette az egéreredetű metallotionein-promóter. Az
l.i és l.j példákban hasonló célzó konstrukciókat mutatunk be, az endogén növekedési hormon gén elsődleges és másodlagos humán fibroblasztokban történő aktiválására. Az EPOexpresszió humán fibroblasztokban történő aktiválását bemutató további megvalósítási módok szerint a célba juttatási események termékei kiméra transzkripciós egységek, melyekben a humán növekedési hormon géni.exonját a 2-5. EPOexonoktól 5' -irányban építettük be. Az említett megvalósítási módok szerint a transzkripció (melyet az egéreredetű metallotionein-promóter vezérel), az „splicing és a transzláció eredménye egy olyan fehérje, amelyben a hEPO szignálpeptidjének 1-4. aminosavai ki vannak cserélve a hGH ·«·· ··«·
1-3. aminosavaira. Ennek a fehérjének a kiméra részlete - a szignálpeptid - a sejtekből történő szekréciót megelőzően eltávolítódik. Az 5. példában olyan célzó konstrukciókat és eljárásokat mutatunk be, melyek alkalmasak olyan sejtek előállítására, melyek képesek egy intronokat tartalmazó gént átalakítani ugyanazon gén intronokat nem tartalmazható expresszálható cDNS-másolatává, és bemutatjuk az ilyen expresszálható cDNS-molekulák expresszálását mikrobiális (például élesztő vagy bakteriális) sejtekben. A 6. példában egy pREPO4-jelű célzó vektor előállítását mutatjuk be, amely duplán szelektálható, és bemutatjuk olyan sejtek szelektálását is, melyekben a dhfr-gén amplifikálódott. A pREP04-plazmidot a HT1080-sejtek (egy halhatatlanná tett humán sejtvonal) humán EPO (hEPO) lókuszának amplifikálására használtuk fel, az endogén hEPO-gén homológ rekombináció útján történő aktiválását követően. Ahogy azt leírjuk, metotrexát-tartalmú táptalajban történő fokozatos szelekció útján a hEPO-termelés mértékében 70-szeres növekedést értünk el 0,4 pmól/l metotrexátra rezisztens sejtekben .
A 7. és 8. példákban olyan eljárásokat mutatunk be, melyek során a normális EPO-promótertől 5' -irányban szabályozó szekvenciákat építünk be, valamint eljárásokat EPOtermelésre az említett konstrukciók alkalmazásával. A 8.
példában ezen felül bemutatjuk a 7. példa szerint előállított megcélzott EPO-gén amplifikálását is. A 9. példában olyan eljárásokat mutatunk be, melyekben a humán ainterferon-, a GM-CSF-, a G-CSF- és az FSHÖ-géneket céloz*» ·»»· zuk meg olyan sejtek előállításának céljából, melyek alkalmasak a megfelelő fehérjék termelésére.
A példákban tehát olyan eljárásokat mutatunk be, melyek alkalmasak endogén gének géncélzás útján történő akvitálására vagy aktiválására és amplifikálására, és a bemutatott eljárásokban nincs szükség a megcélzott gének fehérjekódoló szekvenciájának manipulálására vagy egyéb felhasználására. A feltárt eljárások és DNS-konstrukciók vagy plazmidok vagy azok szakember számára kézenfekvő módosításai lehetővé teszik, hogy a génexpressziót befolyásoljuk in vitro fehérjetermelésre (például gyógyhatású fehérjék termelésére) alkalmas sejtekben vagy olyan sejtekben, melyek alkalmasak in vivő fehérje termelésre (például génterápiás célból). Az 5. és 6. ábrákon a hEPO-gén transzkripcionális aktiválására alkalmas két különböző stratégiát mutatunk be.
A feltárt eljárások, DNS-konstrukciók, plazmidok és azok szakember számára kézenfekvő módosításainak alkalmazásával lehetővé válik terápiás terméket (például proteint, ribozimot, és antiszensz RNS-t) kódoló exogén DNS bejuttatása gerinces eredetű (például humán és nem humán emlős) elsődleges vagy másodlagos sejtek genomjába történő beépítésére, előre meghatározott helyekre.
Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
··
1. példa
Transzfektált sejttörzsek előállítása géncélzás útján
A géncélzás eseménye akkor következik be, amikor a transzfektáló DNS homológ rekombinációs esemény útján beépül kromoszómális DNS-szekvenciába, esetleg részlegesen helyettesítve bizonyos kromoszómális szekvenciákat. Bár ilyen események történhetnek bármely adott transzfektálási kísérletben, az ilyen események megtörténtét általában elfedi számos egyéb olyan esemény, melyek során a plazmid-DNS a kromoszómális DNS-be integrálódik nem homológ vagy illegitim rekombináció útján.
1. a Humán sejtekben bekövetkező géncélzási események szelektálására alkalmas konstrukció előállítása
A célba jutási eseményekre történő szelektálás egyik lehetséges módja az, hogy a transzfektáló DNS integrálódása következtében megszűnő génműködésre szelektálunk.
A humán HPRT-lókusz a hipoxantin foszforibozil-transzferáz enzimet kódolja. A hprt -sejteket azon az alapon szelektálhatjuk, hogy képesek 6-tioguanint (6-TG-t) tartalmazó tápközegben is növekedni, ahol vad típusú (HPRT+) alléit hordozó sejtek az ilyen tápközegben a 6-TG hatására elpusztulnak, a mutáns (hprt ) alléit hordozó sejtek viszont képesek növekedni. Az elmondottak értelmében tehát lehetőség van arra, hogy a HPRT-gént működésképtelenné tevő homológ rekombinációt tartalmazó sejteket 6-TG-t tartalmazó tápközegben szelektáljuk.
A HPRT-lókuszt megcélozni képes plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a HPRT-szekvencia („GenBank megjelölés:
• ·
HUMHPRTB; Edwards, A. és mtsai.: Genomics, 6, 593 (1990)]
11960-18869. nukleotidjait tartalmazó 6,9 kb-os HindlIIfragmenst, amely a HPRT-gén 2. és 3. exonjait is tartalmazta a pUC12-plazmid HindiiI-hasítóhelyére szubklónoztuk. Az így kialakított plazmidot a HPRT-génfragmens 3. exonjában található egyedi Xhol-hasítóhelyen elhasítottuk, és a pMCINeo-plazmid (Stratagene) neo-génjét tartalmazó 1,1 kbos Sall/XhoI-fragmenst az elhasított Xhol-helyre beépítettük, megszakítva ily módon a 3. exon kódoló szekvenciáját. Az így kialakított plazmidok közül kiválasztottuk azt, amelyek a neo-gént olyan orientációban tartalmazta, hogy a neo-gén transzkripciója a HPRT-gén transzkripciójával ellentétes irányú legyen, és ezt a plazmidot pE3Neoplazmidnak neveztük el. Amennyiben az így kialakított konstrukciót célba juttatjuk, a normális HPRT-gén 3. exonja kicserélődik a neo-gén által elrontott változattal, és ily módon hprt , 6-TG-rezisztens sejteket fenotípusú sejteket kapunk. Az ilyen sejtek G418-rezisztensek is lesznek.
1.b Géncélzás izolált humán fibroblaszt sejtvonalban
A HT1080-jelű (ATCC CCL 121) humán fibroszarkómasejtvonalat elektroporáció útján transzfektáltuk a pE3Neoplazmiddal abból a célból, hogy bemutassuk a géncélzás megvalósíthatóságát halhatatlanná tett sejtvonalakban, valamint annak igazolására, hogy a pE3Neo-konstrukció a terveknek megfelelően alkalmazható géncélzásra. A HP1080-sejteket az elektroporációt megelőzően 15% borjúsavót (Hyclone) tartalmazó, HAT-vel (hipoxantin/aminopterin/xantin) kiegészített DMEM-tápközegben tenyésztettük. Az elektroporáció előtt két nappal a sejteket áthelyeztük a fentivel azonos tápközegbe, amely azonban aminopterint nem tartalmazott. Az exponenciálisan növekedő sejteket tripszinnel kezeltük, majd hígítottuk őket 15% borjúszérumot tartalmazó DMEMtáptalajjal, a sejteket ezután lecentrifugáltuk és PBSpufferben (foszfáttal puffereit sóoldat) felszuszpendáltuk, a szuszpenzió koncentrációját 13,3 millió sejt/ml-re állítottuk be. A pE3Neo-plazmidot ezután HindiII-enzimmel elhasítottuk, a 8 kb-os HPRT-neo-fragmenst elválasztottuk a vektor pUC12-plazmidból származó részétől, az elválasztott fragmenst fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk, és 600 μg/ml-es oldatot készítettünk belőle. Az elektroporációs küvettába (0,4 cm-es elektródhézag; BioRad Laboratories) 50 μΐ fentiek szerint előállított oldatot adtunk (amely 30 μς DNS-t tartalmazott), a sejtszuszpenzióból pedig 750 μΐ-t helyeztünk a küvettába (10 millió sejt). Az elektroporációt 450 V feszültség mellett, 250 pFarad-dal hajtottuk végre (Bio-Rad „Gene
Pulser; Bio-Rad Laboratories) . A küvetta tartalmát ezután rögtön 15% borjúsavót tartalmazó DMEM-tápközegbe ürítettük, és így olyan sejtszuszpenziót állítottunk elő, amely 25 ml tápközegben 1 millió sejtet tartalmazott. Az elektroporációval kezelt sejtszuszpenzió 25 ml-ét ezután 150 ml átmérőjű szövettenyésztő csészékre szélesztettük, és azokat 37 °C-on 5%-os C02-atmoszférában inkubáltuk. Az inkubálás kezdete után 24 órával a csészékhez közvetlenül G418oldatot adtunk úgy, hogy a tenyésztőcsészékben a G418antibiotikum végkoncentrációja 800 μg/ml legyen. 5 nappal »«·· ···· később a tápközeget 15% borjúsavót tartalmazó DMEMtápközegre cseréltük, amely 800 gg/ml G418-at is tartalmazott. Az elektroporáció után 9 nappal a tápközeget 800 μg/ml G418-cal és 15% borjúsavót tartalmazó DMEM-tápközegre cseréltük, amely tartalmazott 10 μιηόΐ/ΐ 6-tioguanint is. Azokat a kolóniákat, melyek mind G418-ra, mind pedig 6-TGre rezisztensek voltak, klónozó hengerek alkalmazásával felvettük, a kettős szelekció megkezdése után 14-16 nappal.
Az alábbi 1. táblázatban öt reprezentatív HT1080sejtekben végrehajtott géncélzási kísérlet összefoglalását mutatjuk be.
. táblázat
Transzfekció A kezelt sejtek A kapott G418*- és
sorszáma száma 6-Tgr-kolóniák száma
1 lxlO7 32
2 lxlO7 28
3 lxlO7 24
4 lxlO7 32
5 lxlO7 66
Az 5. transzfekció esetén olyan kontroll tenyésztőcsészéket is használtunk, melyek lehetővé tették, hogy megállapítsuk a G418r-kolóniák teljes számát, ami alapján meghatároztuk, hogy a kiindulási lxlO7 kezelt sejtből 33700 • · · · · • · · · · * • · · · · ···· ·· ··· ·
G418r-kolónia keletkezett. Ennek alapján elmondhatjuk, hogy a célzott rekombinációs események aránya a nem célzott beintegrálódási eseményekhez képest 66/33700, azaz 1:510. Az öt bemutatott kísérlet alapján megállapíthatjuk, hogy a célba jutási események gyakorisága 3, 6xl06, azaz a kezelt sejtek 0,00036%-ában történik ilyen esemény.
Restrikciós enzimes analízissel és Southernhibridizációval kimutattuk, hogy a neo-gén a HPRT-lókusz előre meghatározott helyére épült be a HPRT-gén 3. exonjába. A Southern-hibridizációhoz a neo- és HPRTgénekból származó hibridizációs próbákat alkalmaztunk.
. c Géncélzás elsődleges és másodlagos humán bőrfibroblasztokban
A pE3Neo-plazmidot megemésztettük HindlII-enzimmel, a keletkezett 8 kb-os HPRT-neo-fragmenst elválasztottuk a plazmid többi - pUC12-plazmidból származó - részétől, és az izolált fragmenst fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. A DNS-ből ezután 2 mg/ml-es oldatot állítottunk elő. Azután 3 millió másodlagos humán fitymafibroblaszt-sejtét elektroporáltunk 0,2 ml térfogatban, 250 V-tal és 960 pFarad mellett, 100 pg HindiII/pE3Neofragmens hozzáadásával (50 μΐ) . Három különböző transzfekciós kísérletet hajtottunk végre, és így összesen 900 millió sejtet kezeltünk. A sejteket az elektroporáció után tenyésztettük és G418-rezisztenciára szelektáltuk. A G418-szelekciót úgy hajtottuk végre, hogy 150 mm átmérőjű szövettenyésztő csészékre egyenként 500 ezer sejtet szélesztettünk. A szelekció megkezdésétől számítva 10 nap el····· · · # • · · · · · · « · · · · · ········ ·· · · · · teltével a tápközeget humán fibroblasztok tenyésztésére alkalmas tápközegre cseréltük, amely tartalmazott 400 pg/ml G418-antibiotikumot és 10 pmól/l TG-t. Ezentúl a szelekciót tíz további napon át folytattuk a két hatóanyag kombinációjával. A tenyésztőcsészéket ezután mikroszkóppal átvizsgáltuk mindkét hatóanyagra rezisztens kolóniák azonosítása céljából. A G418r-, 6-Tgr-fenotípusú kolóniák aránya 4/9 millió kezelt sejt volt. A kétszeresen rezisztens kolóniák az összes kolónia képzésre alkalmas sejtek 0,0001%-át tették ki (azaz 1 millió közül egy kezelt sejt lett kétszeresen rezisztens). Készítettünk kontroll tenyésztőcsészéket annak meghatározására is, hogy összesen hány G418rfenotípusú kolónia keletkezett, és azt találtuk, hogy a kezdeti 9xl0? kezelt sejtből 2850 vált G418-rezisztenssé. Ebben az esetben tehát a célzott és nem célzott rekombinációs események aránya 4/2850, azaz 1/712 volt. Restrikciós enzimes analízissel és Southern-hibridizációs kísérletekkel lokalizáltuk a neo-gént a HPRT-lókuszba, és kimutattuk, hogy a beépülés a négy szelektált klonális sejttörzs esetén a HPRT-gén 3. exonjába történt, ami igazolta a célba jutási esemény megtörténtét. A Southern-hibridizációs kísérletekben a HPRT-génből és a neo-génből származó hibridizációs próbákat használtunk. Elsődleges sejtek transzfektálása után is sikerült olyan kolóniákat izolálnunk, melyek mindkét hatóanyagra rezisztensek voltak (l/3,0xl07).
A 2. táblázatban néhány pE3Neo-célba juttatási kísérlet eredményeit foglaljuk össze. A HindiII-enzimmel hasított pE3Neo-plazmidot vagy közvetlenül transzfektáltuk, vagy a transzfektálást megelőzően exonukleáz-III-enzimmel kezeltük, és ily módon a fragmensen egyszálú túlnyúló 5' végeket hoztunk létre (lásd l.c példa). Olyan DNSpreparátumokat vizsgáltunk, melyek egyszálú régiói 175-930 bázispárosak voltak. Amennyiben a pE3Neo-plazmidot kizárólag HindlII-enzimmel hasítva használtuk, 799 G418rezisztens kolónia közül lehetett kimutatni - restrikciós enzimes és Southern-hibridizációs analízissel -, hogy a neo-gén célzott módon épült be a HPRT-lókuszba (összesen 24 célzott beépülést tartalmazó kiónt izoláltunk). A célba jutási esemény maximális stimulálását (kb. 10-szeres stimulálást) abban az esetben értünk el, ha 175 bázispáros egyszálú régiót tartalmazó fragmenst használtunk. Ebben az esetben 80 G418r-kolónia közül egyben lehetett kimutatni restrikciós analízis útján -, hogy a HPRT-génbe célzott beépülés történt (összesen 9 célzott beépülést tartalmazó kiónt izoláltunk). Elmondhatjuk tehát, hogy a bemutatott körülmények között és a bemutatott rekombináns DNSkonstrukciók alkalmazásával a célba jutási esemény könnyen kimutatható normális humán fibroblasztokban, és a célba jutás gyakorisága (a célba jutási eseményt tartalmazó kiónok száma osztva a G418-rezisztenciával stabilan transzfektált kiónok számával) fokozható oly módon, hogy olyan célzó konstrukcióval hajtjuk végre a transzfektálást, amely egyszálú túlnyúló végeket tartalmaz, az l.e példában leírt eljárás alkalmazásával.
• · · • · · • · · . példa
Géncélzás humán fibroblasztok HPRT-lókuszába
pE3neo-kezelés Végrehajtott ki- Célzott Célzott kiónok
serietek száma klónok/G418r- klónok száma teljes száma
HindiII-emésztés 6 1/799 24
175 bázispáros 1 1/80 9
túlnyúló vég
350 bázispáros 3 1/117 20
túlnyúló vég
930 bázispáros 1 1/144 1
túlnyúló vég
1.d Terápiásán fontos gén humán genomba történő célzott beépítésére szolgáló konstrukció létrehozása, és alkalmazása géncélzásra
A pE3Neo-plazmid egy variánsát - amelyben a terápiásán fontos gént beépítjük a HPRT kódoló régióba, közvetlenül a neo-gén mellé, vagy annak közelébe - felhasználhatjuk egy terápiásán fontos gén célba juttatására valamely recipiens elsődleges vagy másodlagos sejt genomjának egy előre meghatározott pozíciójába. Előállíthatjuk például a pE3Neo-plazmid olyan variánsát, amely alkalmas a hGH-gén HPRT-lókuszba történő célzott bejuttatására.
A 3. ábrán vázlatosan bemutatott pXGH5-plazmidot megemésztettük EcoRI-enzimmel, és izoláltuk a hGH-gént és a • · · · · hozzá kapcsolt egéreredetű metallotionein (mMT) promótert tartalmazó 4,1 kb-os fragmenst. A fragmens EcoRI-hasítás következtében keletkező túlnyúló végeit feltöltöttük az E.coli DNS-polimerázának Klenow-fragmensével. Külön kísérletben, a pE3Neo-plazmidot megemésztettük Xhol-enzimmel, amely a neo-fragmens és a HPRT-gén 3. exonja csatlakozásánál hasít (a 3. exonba történő inszerció 3' -végi csatlakozópontjánál) . A linearizált plazmid Xhol-hasítás során keletkező túlnyúló végeit feltöltöttük az E.coli DNSpolimeráz Klenow-fragmensével, és az így kapott fragmenst hozzáligáltűk a tompavégűvé tett 4,1 kb-os hGH-mMTfragmenshez. A ligációs elegy transzformálása után kapott bakteriális kiónokat restrikciós enzimes analízissel szkríneltük, és olyan plazmidokat izoláltunk, melyek a hGHmMT-fragmenst egy kópiában inszertálódva tartalmazták, mégpedig abban az orientációban, amelyben a hGH-gén a neogénnel azonos irányban íródik át, és az ilyen plazmidokat pE3Neo/hGH-plazmídnak neveztük el. A pE3Neo/hGH-plazmidot elhasítottuk HindlII-enzimmel, és izoláltuk a HPRT-, neoés mMT-hGH-szekvenciákat tartalmazó 12,1 kb-os fragmenst. Az izolált emésztett DNS-t az l.c példában leírtak szerint kezeltük és elsődleges vagy másodlagos humán fibroblasztok transzfektálására használtuk. A transzfektálás után G418r, TGr fenotípusú kolóniákat szelektálunk, és a kiónokat az l.c példában leírtak szerint analizáltuk az mMT-hGH- és neo-szekvenciák HPRT-génbe történő célzott beépülésére. Az előállított kiónokat hGH-expresszióra egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető immunológiai vizsgálati eljárás vég• · • · · ········ ·· · ·· · rehajtására alkalmas reagenskészlettel vizsgáltuk (Nichols
Institute) .
Másodlagos humán fibroblasztokat transzfektáltunk a pE3Neo/hGH-plazmiddal, majd a szelektált tioguaninrezisztens kolóniákat megvizsgáltuk stabil hGHexpresszióra, és a kiónokat restrikciós enzimes és Southern-hibridizációs analízisnek is alávetettük. A megvizsgált tizenhárom TGr-klón közül nyolc esetében azt találtuk, hogy a hGH-gén az endogén HPRT-lókuszba inszertálódott. Mind a nyolc azonosított klón stabilan expresszált jelentős mennyiségű hGH-t, az átlagos expressziós szint 22,7 μg/106 sejt/24 óra értéknek adódott. Amennyiben az EPO-gént kívánjuk a humán HPRT-lókuszba beépíteni, a 4. ábra szerinti pE3Neo-EPO-plazmidot használhatjuk .
A találmány szerinti eljárással homológ rekombináció útján terápiásán fontos géneket beépíthetünk egy kiválasztott sejt genomi DNS-ébe, és ennek az eljárásnak a hatékonysága tovább fokozható terápiás célokra (például gyógyhatású vegyületek előállítása, génterápia) oly módon, ha beépítünk egy olyan gént is, amelynek kópiaszáma a beépítés után megfelelő szelekciós hatóanyag alkalmazásával amplifikálható. A pE3Neo/hGH-plazmidot például (l.d példa) módosíthatjuk oly módon, hogy beleépítjük a dhfr-, ada, vagy CAD-géneket, közvetlenül a pE3Neo/hGH-plazmidban található hGH- vagy neo-gén szomszédságába. Ezután az így előállított plazmiddal elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett sejteket transzfektálhatunk és a • · · ···· ···· transzfektált sejtek közül kiválasztjuk azokat, amelyekben a konstrukció célba jutása megtörtént. Az ilyen kiválasztott sejteket tovább kezeljük a megfelelő hatóanyag egyre növekvő koncentrációival, és ily módon olyan sejteket szelektálunk, melyek a rezisztencia-géneket megnövekedett kópiaszámban tartalmazzák [ a dhfr-gén esetén a szelekciós hatóanyag a metotrexát, a CAD-gén alkalmazása esetén a szelektív hatóanyag N-(foszfonacetil)-L-aszpertát (PALA), az ada-gén alkalmazása esetén pedig a szelektáló hatóanyag egy adenin-nukleozid (például adenozin)] . Amennyiben az elmondottak szerint járunk el, a terápiásán fontos beépített gén együtt fog amplifikálódni azzal a génnel, melynek megnövekedett kópiaszámára szelektálunk. Az elmondottak szerint a terápiásán hasznos géntermékeket termelő sejtek előállításának génsebészeti módszereit pontosan szabályozhatjuk oly módon, hogy a célzó konstrukció beépülésének helyét előre megválasztjuk, és ez a hely azonos lesz azzal a hellyel is, ahol az amplifikált sejtek esetén az amplifikált kópiaszámú gének találhatók lesznek.
.e A DNS-végek módosítása a célba jutási esemény gyakoriságának fokozása céljából
Különböző bizonyítékok arra utalnak, hogy az E. coliban , a bakteriofágokban, az S. cerevisiae-ban és a Xenopus laevis-ben történő bizonyos homológ rekombinációs eseményben szerepet játszanak a 3' -túlnyúló végek. Megfigyelték, hogy Xenopus laevis oocitákban mikroinjektálást követően azok a molekulák, melyeknek néhány száz bázispár hosszúságú 3' -túlnyúló végeik voltak, sokkal hamarabb vet72 ·· ···· ·· tek részt rekombinációs eseményekben, mint a hasonlóképpen bejuttatott olyan molekulák, melyeknek restrikciós enzimes emésztés következtében csak nagyon rövid túlnyúló végeik voltak (4 bázispár). Élesztő esetén a néhány száz bázist tartalmazó 3' -túlnyúló végek keletkezése látszik a sebességmeghatározó lépésnek a meiotikus rekombináció során. A 3' -túlnyúló végek rekombinációban játszott szerepére humán sejtek esetén mindeddig semmilyen bizonyítékot sem közöltek, és egyetlen olyan esetet sem írtak még le, semmilyen faj esetén sem, amelyben bármely módon módosított DNSmolekulák alkalmazása növelte volna a célba jutási események (melyek a homológ rekombináció egy speciális esetét jelentik) előfordulásának gyakoriságát. A jelen példában, valamint az l.c példában bemutatott kísérletek ezzel szemben arra utalnak, hogy az 5' -túlnyúló végek hatékonyan fokozzák a célba jutási események gyakoriságát elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztok esetén .
A technika állása szerint egyetlen olyan beszámoló sem ismert, amely szerint a transzfektálásra használt DNSmolekulák végeinek módosítása fokozta volna valamely célba jutási esemény gyakoriságát. Az alábbiakban közölt példa bizonyítékot szolgáltat arra, hogy lineáris DNS-molekulák végeinek olyan módosítása, mely szerint a kettősszálú végeket egyesszálúvá alakítjuk át, alkalmas arra, hogy elsődleges és másodlagos humán fibroblasztok esetén a genomba történő célba jutási események gyakorisága fokozódjék.
• · · ···· ····
Az l.a példa szerint előállított pE3Neo-plazmid 1100 gg-ját megemésztettük HindiII-enzimmel. Az így előállított emésztett DNS-t fenolos extrakció és etanolos kicsapás után közvetlenül is használhatjuk transzfektálásra, de eljárhatunk úgy is, hogy a kizárólag a HPRT-szekvenciákat és a neo-gént tartalmazó 8 kb-os HindlII-fragmenst gélelektroforézis alkalmazásával elválasztjuk a plazmád pUC12vektorból származó többi részétől. Amennyiben a HindlIIenzimmel emésztett DNS-t ExolII-enzimmel emésztjük, minden szabad 3' -végről a nukleotidok időben előrehaladva egyre nagyobb mértékben le fognak emésztődni, és így a DNS-nek 5' -túlnyúló végei lesznek. Az exonukleázos emésztés mértékét - és ezáltal a keletkező 5' -túlnyúló végek hosszát szabályozhatjuk az ExoIII-emésztés időtartamának változtatásával. A HindlII-enzimmel emésztett pE3Neo-plazmid 100 μς-ját a gyártó utasításai szerint ExoIII-enzimmel emésztettük a következő időtartamokon keresztül: 30 másodperc, 1 perc, 1,5 perc, 2 perc, 2,5 perc, 3 perc, 3,5 perc, 4 perc, 4,5 perc és 5 perc. Az emésztés előrehaladásának mértékét úgy követtük, hogy minden megadott időpontban 1 μg ExoIIIemésztett DNS-t tartalmazó mintát vettünk a reakcióelegyből, és azt a gyártó utasításai szerint „mung bean nukleázzal (Promega) kezeltük, majd a mintákat gélelektroforézissel elválasztottuk. Meghatároztuk azt a méretkülönbséget, amely a kizárólag HindlII-mal emésztett pE3Neo-plazmidból származó molekulák és a mind ExoIII-mal, mind pedig „mung bean nukleázzal emésztett hasonló molekulák tapasztalt méretei között megfigyelhető volt. A mégha• · · · • ·· tározott méretkülönbséget kettővel elosztva megkaptuk az 5' -túlnyúló végek DNS-végenkénti átlagos hosszát. Amennyiben 30 °C -on a fent megadott időtartamokon át végezzük az emésztést, a keletkezett 5' -túlnyúló végek hossza kb. 1001000 bázis közötti.
Az ExolII-enzimmel kezelt DNS (a pE3Neo-plazmid teljes HindlII-emésztménye) 60-60 pg-ját minden egyes fent megadott időpontból megtisztítottuk, és a DNS-t elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán fibroblasztokba elektroporáltuk, az l.c példában leírtak szerint. Az ExoIII-enzimes kezelés célba jutási eseményt fokozó hatását mennyiségileg úgy jellemeztük, hogy megszámoltuk a G418‘-,
6-TGr-klónok számát és összehasonlítottuk ezt a számot azzal a számmal, amit abban az esetben kaptunk, ha a géncélzást ExoIII-mal nem kezelt HindlII-mal emésztett pE3Neoplazmiddal hajtottuk végre.
A 3' -túlnyúló végek hatását a géncélzás hatékonyságának fokozására szintén meghatározhatjuk egy, a fentivel analóg rendszer alkalmazásával. Ebben az esetben a HindlIImal emésztett pE3Neo-plazmidot a T7-bakterofág 6. génje által kódolt exonukleázzal (United States Biochemicals) kezeljük, változó ideig, a gyártó utasításai szerint. Az emésztés mértékét (azaz a 3' -túlnyúló végek molekulavégenként átlagos hosszát) a fent leírtak szerint határozhatjuk meg, és az elektroporációt is a fent leírtak szerint végezhetjük. A T7-bakteriofág 6. génje által kódolt exonukleáz emésztés következtében fellépő célba jutási gyakoriság fokozódásának mértékét úgy határozhatjuk meg, hogy megszámol• · · *··· ···· • · juk a keletkező G418r-, 6-TGr-kolóniák számát, és ezt a számot összehasonlítjuk az olyan célba jutási események számával, melyet T7-bakteriofág 6. génje által kódolt exonukleázos kezelés nélküli HindlII-mal emésztett pE3Neoplazmiddal kaptunk.
Előállíthatunk 5' - és 3' -túlnyúló végeket más módszerekkel is, például úgy, hogy egymással parciálisán átfedő szekvenciájú lineáris DNS-molekulákat először denaturálunk, majd összehibridizálunk, és ily módon olyan molekulakeverék keletkezik, melyekben a molekulák mindkét végükön vagy 3' -túlnyúló végeket vagy 5' -túlnyúló végeket tartalmaznak, de találhatók lesznek a keverékben olyan molekulák is, melyek üjrahibridizálódtak, és ezért a kiindulási lineáris molekuláktól megkülönböztethetetlenek lesznek. A túlnyúló végek hosszát ebben az esetben az határozza meg, hogy milyen hosszú szekvenciarészlet volt eltérő szekvenciájú a két kiindulási molekula esetén.
. f Célzó plazmidok előállítása a humán eritropoietin-gén egéreredetű metallotionein-promóter szabályozása alá helyezésére, elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztokban
Az alábbi példában a találmány egy olyan megvalósítási módját szemléltetjük, amely szerint a humán eritropoietin (hEPO) normális pozitív és negatív szabályozó szekvenciáit úgy változtatjuk meg, hogy lehetővé váljék humán eritropoietin expressziója elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztokban, melyek természetes állapotukban nem expresszálnak jelentős mennyiségű • * • ·♦* · • · * * · • # ·« • · · ««»· ·»·· · hEPO-t.
PCR-eljárasban amplifikáltunk egy a humán EPO kódoló régiójától kizárólag 5' -irányban található szekvenciaszakaszt. Erre a célra három láncindítópárt terveztünk, a publikált humán EPO-szekvencia [ „GenBank megjelölés: HUMERPA; Lin, F-K. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 7580 (1985)] analízisét követően.
A tervezett láncindító párok 609, 603 vagy 590 bázispáros fragmensek amplifikálására alkalmasak.
3. táblázat
Láncindító HUMERPA koordináta Szekvencia Fragmensméret
FI 2 —» 20 5' -AGCTTCTGGGCTTCCAGA (szekv.az.szám: 1)
R2 610 -> 595 5' -GGGGTCCCTCAGCGAC (szekv.az.szám: 2) 609 bázispár
F2 8 —> 24 5'-TGGGCTTCCAGACCCAG (szekv.az.szám: 3)
R2 8 —> 24 5'-GGGGTCCCTCAGCGAC 603 bázispár
F3 21 > 40 5'-ACCAGCTACTTTGCGGAACTC (szekv.az.szám: 4)
R2 610-595 5'-GGGGTCCCTCAGCGAC 590 bázispár
Az amplifikált három fragmens egymással egymást követően átfedő szekvenciájú, és a fent ismertetett célra valamennyi alkalmas. A 690 bázispáros fragmens mindkét végére Clal-linkereket kapcsoltunk. A fragmens szekvenciája megegyezik a transzlációs start-helytől számított -623 —> -14. nukleotidok szekvenciájával (HUMERPA nukleotidpozíciók: 2• ··«« * « ·«· · · _ _ · ··«·· _ 77 _ »·«·.... .. . ·. .
610). A kialakított Clal-linkerrel ligáit fragmenst megemésztettük Clal-enzimmel, majd a pBluescriptIISK/+-plazmid (Stratagene) Clal-hasítóhelyébe ligáltuk, az orientációt úgy választottuk meg, hogy a HUMERPA-szekvencia 610. nukleotidja a plazmid polilinkerében található Sallhasítóhely szomszédságába kerüljön. Az így kialakított plazmidot a p5' -EPO-t két külön kísérletben elhasíthatjuk az egyedi Fspl- vagy Sfil-hasítóhelyek mentén, melyek a humán EPO-tól 5' -irányban jövő szekvenciában találhatók (HUMERPA nukleotidpozíciók sorrendben: 150 és 405) és az elhasított plazmidot az egéreredetű metallotioneinpromóterhez ligálhatjuk. Tipikusan úgy járunk el, hogy az mMT-I-gén 1,8 kb-os 8 EcoRI/BglII-fragmensét tompavégűvé tesszük szakember számára ismert eljárások alkalmazásával, és hozzáligáljuk az Sfil-el emésztett (szintén tompavégűvé tett) vagy Fspl-el emésztett p5' -EPO-plazmidhoz. Az említett fragmens mMT-eredetű kódoló szekvenciákat nem tartalmaz [Hamer, D.H. és Walling, M. : J. Mól. Appl . Gén., 273 (1982)] és ezt a fragmenst úgy is előállíthatjuk, hogy egéreredetű genomi DNS-ből szakember számára ismert PCRamplifikációs eljárással amplifikáljuk azt, olyan PCRláncindítók alkalmazásával, melyeket a publikált mMTszekvenciák alapján tervezünk (GenBank: például MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM). A kialakított új plazmidokban megvizsgáljuk az összeépített fragmensek egymáshoz képesti orientációját, és azt az orientációt választjuk ki, amelyben az mMT-génből származó BglII-hasítóhely közelebb található a plazmid polilinkerének Sall-hasítóhelyéhez, és ezt a konst• · · * · · · · · ········ · · · Μ φ rukciók használjuk fel elsődleges vagy másodlagos humán fibroblasztokban végrehajtott géncélzásra. Ebben az orientációban az mTM transzkripciója a HUMERPA-szekvencia 610. nukleotidjának irányában folyik, a végső konstrukcióban. Az elmondottak szerint előállított plazmidokat p5' -mMTF- és p5' -EPO-mMTS-plazmidnak neveztük el, a plazmidokban az mMTinszerció sorrendben az Fspl- és Sfil-hasítóhelyeken történt .
A célzó konstrukcióba előnyösen további 5' -irányú szekvenciákat építünk be abban az esetben, ha kívánatos a célszekvenciától 5' -irányban található negatív szabályozóelemek vagy enhanszerek módosítása, kiejtése és/vagy kicserélése. Az EPO esetében például kiejthetjük azt a negatív szabályozóelemet, amely gátolja az EPO expresszióját extrahepatikus és extrarenális szövetekben [ Semenza, G.L. és mtsai.: Mól. Cell. Bioi., 10, 930 (1990)] . Úgy járunk el, hogy a 6 kb-os fragmensen belül egy deléciósorozatot készítünk. A kiejtett régiókat széles gazdaspektrumú enhanszerre cserélhetjük [ például egy citomegalovírus (CMV) eredetű enhanszerre] .
A pBluescriptIISK/+-vektorba beépített 609 bázispáros 5' -EPO-fragmensnek azt az orientációját választottuk, amelyben a HUMERPA-szekvenciákat a szekvenciarészlet 5' végénél egy BamHI (távolabbi) és egy HindiII-hasitóhely (közelebbi) előzi meg. Ily módon lehetőség nyílik egy 6 kbos BamHI/HindlII-fragmens genomi DNS-ből történő izolálására - önmagukban ismert eljárások alkalmazásával -, amely normálisan a 609 bázispáros fragmenstől 5' -irányban talál• · ható [ Semenza, G.L. és mtsai.: Mól. Cell. Bioi., 10, 930 (1990)] . A 609 bázispáros, PCR-rel amplifikált fragmenst próbaként használva például bakteriofág-, kozmid- agy élesztő mesterséges kromoszóma könyvtárakat szkrínelhetünk. A kívánt kiónban egy 6 kb-os BamHI/HindiII_fragmens lesz található, és a fragmenst azonosíthatjuk oly módon, hogy restrikciós térképét összehasonlítjuk a humán EPO-gén körüli, önmagában ismert módszerekkel meghatározott restrikciós térképpel. Eljárhatunk úgy is, hogy a humán genomban restrikciós térképet készítünk - a 609 bázispáros fragmenst próbaként használva - az EPO-géntől 5'-irányban található régióról, és ily módon azonosíthatunk olyan restrikciós hasítóhelyeket, melyeknél történő hasítással olyan fragmenst állíthatunk elő, melynek egyik vége a 2-609. HUMERPA koordináták közé esik, másik vége pedig 5' -irányban túlnyúlik a BamHI-hasítóhelyen; az így előállított fragmenst a humán genomi DNS megfelelő emésztése után gélelektroforézissel izolálhatjuk, majd a fragmenst bakteriális vagy élesztőeredetű klónozó vektorba ligálhatjuk. A megfelelő szerkezetű konstrukció hibridizálódni fog a 609 bázispáros 5'-EPO-próbával, és tartalmazni fogja a 6 kb-os BamHI/HindIII-fragmenst. Az izolált 6 kb-os fragmenst azután megfelelő orientációban beépítjük a p5' -EPO-, p5' -EPOmTF- vagy p5' -EPO-mTS-plazmidba (oly módon, hogy a HindlIIhasítóhely közvetlenül a HUMERPA-szekvencia 2. nukleotidja mellé kerüljön. Izolálhatunk további 5' -végi szekvenciákat is önmagukban ismert eljárások alkalmazásával, a „kromoszómaséta („chromosome walking) technikák segítsé• · gével vagy 609 bázispáros 5'-EPO-próbával hibridizáló mesterséges élesztőkromoszómák izolálása útján.
A fentiekben ismertetett klónozási stratégiák lehetővé teszik, hogy az EPO-géntől 5' -irányban elhelyezkedő szekvenciákat ín vitro módosítsuk elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán fibroblasztok célzott transzfektálásának céljára. Az ismertetett stratégiák alkalmazásával lehetséges az mMT-promóter egyszerű beépítése, csakúgy, mint a negatív szabályozó régiók kiejtése, valamint a negatív szabályozó régió deléciója és cseréje széles gazdaspektrumú enhanszerre.
1.g A humán EPO-gén aktiválása és transzfektált elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztok izolálása szkríneléssel
A géncélzást úgy hajtjuk végre, hogy a plazmidkonstrukciókat olyan enzimekkel hasítjuk, melyek a kialakított inszertet kihasítják a plazmid többi részéből. A p5' EPO-mMTS-plazmid esetén a HindlII- és Sall-enzimekkel történő hasítás egy 2,4 kb-os célzó fragmens keletkezését eredményezi, amely tartalmazza az 1,8 kb-os mMT-promótert, melyet 5' - és 3' -irányokban sorrendben 405 bázispáros és 204 bázispáros olyan DNS-szekvenciák szegélyeznek, melyek lehetővé teszik a konstrukciók beépülését a humán EPO-gén szabályozó régiójába. Az említett módon hasított plazmidDNS-t vagy a 2,4 kb-os célzó fragmenst önmagában fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk, és elsődleges vagy másodlagos humán fibroblasztokba transzfektáluk az l.e példában leírtak szerint. A transzfektált sejteket • · _g|_ .............
150 mm átmérőjű tenyésztőcsészékbe szélesztjük, humán fibroblasztok tenyésztésére alkalmas tápközegben. 48 órával később a sejteket 24 rekeszes tálcákba szélesztjük, 10 ezer sejt/cm sűrűséggel [ez rekeszenként körülbelül 20 ezer sejtet jelent; amennyiben a célba jutási esemény 106 klónozható sejt közül egyben történik meg (l.c példa), körülbelül 50 rekeszt kell átvizsgálni ahhoz, hogy egyetlen expresszáló kolóniát találjunk] . Azokban a sejtekben, melyekben a transzfektálásra használt DNS célzott rekombinációval beépül a humán EPO-géntől 5' -irányban található homológ régióba, expresszálni fognak hEPO-t, az mMT-promóter szabályozása alatt. 10 nappal a transzfektálást követően a teljes rekeszek felülúszóját megvizsgáljuk EPOexpresszióra, egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető immunológiai vizsgálati reagenskészlet alkalmazásával (Amgen). A hEPO-t szintetizáló rekeszekben önmagukban ismert eljárással izoláljuk a termelő kiónokat, melyek szerint általában úgy járunk el, hogy a heterogén sejtpopulációt különálló rekeszekbe osztjuk szét, és a pozitív rekeszekből készített frakciókat ismét megvizsgáljuk EPOexpresszióra, majd ezt a lépést szükség szerint többször megismételjük, és végül úgy izoláljuk a homológ rekombinációt tartalmazó kiónt, hogy az EPO-expressziót egy 96mérőhelyes mikrotiter tálcában vizsgáljuk, amelybe mérőhelyenként egy-egy sejtet helyezünk. Eljárhatunk úgy is, hogy egy teljes tenyésztőtálcáról származó sejtekből lizátumot állítunk elő, és ezt PCR-amplifikációval vizsgáljuk, egy mMT-specifikus láncindító és egy olyan láncindító alkalma• · · ·
- 82 - .............
zásával, amely a HUMERPA-szekvencia 1. nukleotidjától 5'irányban hibridizálódik. Ez a láncindító pár olyan DNSfragmenst kell, hogy ampiifikáljon, melynek méretét pontosan meg lehet határozni a DNS-szekvencia ismeretében. A pozitívnak talált rekeszekben a sejteket tripszinnel kezeljük, majd egyre nagyobb hígításokban újra szélesztjük a sejteket, és a DNS-preparálást, valamint a PCR-amplifikációt is annyiszor ismételjük, ahányszor szükséges, a homológ rekombinációt tartalmazó sejtklón izolálása céljából.
A fentiekben ismertetett célzási stratégiákat fölhasználhatjuk hGH-termeltetésére is hagyományos gyógyászati adagolás céljára, oly módon, hogy a hGH-expressziót például a következő sejttípusok valamelyikében aktiváljuk: halhatatlanná tett humán sejtek [ HT1080-sejtek (ATCC CCL 121)] , HeLa-sejtek és HeLa-sejtszármazékok (ATCC CCL 2, 2.1 és 2.2), MCF-7-mellráksejtek (ATCC HBT 22), K-562leukémiasejtek (ATCC CCL 232), KB-karcinómasejtek (ATCC CCL 17), 2780 AD-petefészekkarcinóma-sejtek [Van dér Blick, A.M. és mtsai.: Cancer Rés., 4 8, 5927 (1988)] , Raji-sejtek (ATCC CCL 86), Jurkat-sejtek (ATCC TIB 152), Namalwa-sejtek (ATCC CRL 1432), HL-60-sejtek (ATCC CCL 240), Daudi-sejtek (ATCC CCL 213), RPMI-8226-sejtek (ATCC CCL 155), U-937sejtek (ATCC CRL 1593), Bowes-féle melanómasejtek (ATCC CRL 9607), a WI-38VA13-sejtek 2R4-szubklónja (ATCC CLL 75.1), MOLT-4-sejtek (ATCC CRL 1582), és különböző heterohibridoma-sejtek.
• · ·
- 83 - .............
1.h A humán EPO-gén aktiválása és célzott rekombinációt tartalmazó elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztok izolálása pozitív vagy kombinált pozitív/negatív szelekciós rendszerben
A p5' -ΕΡΟ-mMTF-, a p5' -EPO-mMTS-plazmidok és az 5' végi 6 kb-os BamHI/HindiII-fragmenst is tartalmazó származékaik előállításának bemutatott stratégiáját kiegészíthetjük egy további lépéssel, amely szerint a neo-gént az mMTpromóter közvetlen szomszédságába inszertáljuk. Ezenfelül a pBluescript2SK/+-polilinkerébe klónozott HUMERPA-szekvenciák közvetlen szomszédságába beépíthetünk egy negatív szelekciós markert is, például a gpt-gént [melyet például a pMSG-plazmidból (Pharmacia) vagy egyéb alkalmas forrásból izolálhatunk] . Az első esetben G418r-klónokat izolálunk, és azokat PCR-amplifikációval vagy restrikciós enzimes és Southern-hibridizációs analízissel szkríneljük, a szkrínelésre használt DNS-t különböző klónkeverékekből izoláljuk, és ily módon azonosítjuk a célzott rekombinációt tartalmazó kolóniákat. A második esetben a G418r-kolóniákat olyan tápközegbe helyezzük, amely 6-tioxantint tartalmaz, és ily módon a gpt-gén integrációja ellen szelektálunk [ Besnard, C. és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 7, 4139, (1987)] .
Eljárhatunk úgy is, hogy az inszert gpt-génnel ellentétes oldalára beépítjük a HSV-TK-gént, és ily módon lehetővé válik, hogy neo-rezisztenciára szelektáljunk, valamint a gptés TK-gének ellen, oly módon, hogy a sejteket 400 gg/ml G418-at, 100 gmól/l 6-tioxantint és 25 gg/ml gancyclovir-t tartalmazó humán fibroblasztok tenyésztésére alkalmas táp• · · · közegben tenyésztjük. A kétszeres negatív szelekció közel abszolút szelekciót jelent a célzott rekombinációt tartalmazó sejtekre, és a szelektált sejtekben a célzott rekombináció megtörténtét végül is Southern-blot-analízissel igazolhatjuk .
A fentiekben ismertetett géncélzási stratégiákat felhasználhatjuk hEPO-expresszió aktiválására halhatatlanná tett humán sejtekben, abból a célból, hogy hagyományos gyógyászati alkalmazásra hEPO-t tudjunk termeltetni, alkalmas termelősejtek lehetnek például: halhatatlanná tett humán sejtek [ HT1080-sejtek (ATCC CCL 121)] , HeLa-sejtek és HeLa-sejtszármazékok (ATCC CCL 2, 2.1 és 2.2), MCF-7mellráksejtek (ATCC HBT 22), Κ-562-leukémiasejtek (ATCC CCL 232), KB-karcinómasejtek (ATCC CCL 17), 2780 ADpetefészekkarcinóma-sejtek [Van dér Blick, A.M. és mtsai.: Cancer Rés., 4 8, 5927 (1988)] , Raji-sejtek (ATCC CCL 86), Jurkat-sejtek (ATCC TIB 152), Namalwa-sejtek (ATCC CRL 1432), HL-60-sejtek (ATCC CCL 240), Daudi-sejtek (ATCC CCL 213), RPMI-8226-sejtek (ATCC CCL 155), U-937-sejtek (ATCC
CRL 1593), Bowes-féle melanómasejtek (ATCC CRL 9607), a WI-38VA13-sejtek 2R4-szubklónja (ATCC CLL 75.1), MOLT-4sejtek (ATCC CRL 1582), és különböző heterohibridómasej tek.
1.i Célzó plazmidok előállítása a humán növekedési hormon gén egéreredetű metallotionein-promóter szabályozása alá történő helyezésére elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán fibroblasztokban
Az alábbi példával a találmány szerinti megoldás • · egy olyan megvalósítási módját szemléltetjük, amely szerint a humán növekedési hormon génjétől 5' -irányban elhelyezkedő normális szabályozó szekvenciákat megváltoztatjuk úgy, hogy a humán növekedési hormon expressziója lehetővé váljék elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán fibroblasztokban.
Az l.f példában bemutatott célzó molekulákhoz hasonlóan olyan célzó konstrukciókat állítunk elő, melyek alkalmasak az EPO-gén szabályozó régiójának megcélzására, a hGH-N-gén 5' -végéről származó klónozott DNS-fragmensek alkalmazásával. PCR-eljárással amplifikálunk egy közelítőleg 1,8 kb-os fragmenst, amely a HUMGHCSA („GenBank) szekvencia 3787-5432. nukleotidjait tartalmazza (két EcoNIhasítóhely közötti fragmens, melynek mérete klónozás szempontjából megfelelő, és a két hasítóhely megkönnyíti a fragmenst tartalmazó szubklónok azonosítását), a PCReljárást a HUMGHCSA-szekvencia megfelelő régiójának analízise alapján tervezzük. Az említett szekvenciarégió a hGHN-gén 1. intronjának közepétől kiindulva egészen egy, a transzlációs starthelytől körülbelül 1,4 kb-nyira 5' irányban található pozícióig tart. A pUC12-plazmidot megemésztjük EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel, az emésztett plazmidot tompavégek létrehozása céljából Klenowenzimmel emésztjük, a plazmidot ezután meghígítjuk, és recirkularizáljuk, és ily módon olyan plazmidokat kapunk, melyekből az EcoRI- és BamHI-hasítóhelyek eliminálódtak. Ezt a plazmidot pUC12-XEB-plazmidnak neveztük el. Az amplifikált hGH-fragmenshez HindlII-linkereket ligálunk, • · · · « · · • · ··· · • · · · · ···♦···· ·· · ·· majd a kapott fragmenst HindiII-enzimmel emésztjük, és a pUC12-XEB-plazmid HindlII-helyére ligáljuk. Az így kapott plazmidot - a pUC12-XEB-5' -hGH-t - megemésztjük EcoRI- és BamHI-enzimekkel, és ily módon eltávolítunk egy 0,5 kb-os fragmenst, amely közvetlenül a hGH transzkripciós iniciációs helyétől 5' -irányban található. Az emésztett DNS-t ezután összeligáljuk az mMT-I-gén 1,8 kb-os EcoRI/BglII-fragmensével [ ez a fragmens mMT-eredetű kódoló szekvenciákat nem tartalmaz; Hamer, D.H és Walling, M. : J. Mól. Appl. Gén. 273 (1982); ezt a fragmenst önmagában ismert eljárások alkalmazásával PCR-amplifikációval is előállíthatjuk egéreredetű genomi DNS-könyvtárból kiindulva, olyan PCR-láncindítók alkalmazásával, melyeket a „GenBank adatbázisból hozzáférhető MUSMTI-, MUSMTIP-, MUSMTIPRM-jelű mUMT-szekvenciák analízise alapján terveztünk] . Az így előállított p5' hGH-mMT-plazmid tartalmazza az mMT-promótert, melyet mindkét szélén 5' -végi hGH-szekvenciák szegélyeznek.
A fent leírt klónozási stratégiák lehetővé teszik, hogy a hGH-géntől 5' -irányban található szekvenciákat in vitro úgy módosítsuk, hogy az alkalmassá váljék elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán fibroblasztok célzott transzfektálására. A bemutatott stratégia szerint az mMT-promóter egyszerű inszertálását hajtottuk végre. Megvalósíthatók például olyan más klónozási stratégiák is, melyek szerint a beépített mMT-szekvenciától 5' -irányban beépíthetünk egy széles gazdaspecifitású enhanszerszekvenciát is.
1.j A humán hGH-gén aktiválása, és célzott rekombinációt tartalmazó elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztok izolálása szkríneléssel
A géncélzáshoz a plazmidokat olyan restrikciós enzimekkel hasítjuk, amely enzimek a célzó konstrukciót elválasztják a plazmid többi részétől. A p5' -hGH-mMT-plazmid esetén HindlII-emésztéssel föl tudjuk szabadítani a 2,9 kbos célzó fragmenst, amely az 18 kb-os mMT-promótert tartalmazza 5' - és 3' -végén olyan DNS-szekvenciákkal szegélyezve, melyek alkalmasak a konstrukció beépítésére a hGH-gén szabályozó régiójába. Az emésztett DNS-t vagy az izolált 2,9 kb-os célzó fragmenst megtisztítjuk fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással, majd elsődleges vagy másodlagos humán fibroblasztokba transzfektáljuk, az 1.1 példában leírtak szerint. A transzfektált sejteket ezután 150 mm átmérőjű tenyésztőcsészékbe szélesztjük, humán fibroblasztok tenyésztésére alkalmas tápközegbe. 48 órával később a sejteket 24 rekeszes tenyésztőtálcákba szélesztjük, 10 ezer sejt/cm sűrűséggel [ez rekeszenként körülbelül 20 ezer sejtet jelent; amennyiben a célzott rekombináció 106 klónozható sejt közül egyben bekövetkezik (l.c) példa, akkor egyetlen expresszáló kolónia izolálásához körülbelül 50 rekeszt kell átvizsgálni] . Azok a sejtek, amelyekbe a transzfektálásra használt DNS célzott rekombinációval beépül a hGH-géntől 5'-irányban található homológ régióba, a hGH-gént az mMT-promóter szabályozása alatt fogják expresszálni. 10 nap elteltével a különböző rekeszek felülúszóit megvizsgáljuk hGH-expresszióra, egy kereskedelmi • · · forgalomban beszerezhető immunológiai vizsgálati eljárás végrehajtására alkalmas reagenskészlet alkalmazásával (Nichols). A hGH-szintézist mutató rekeszekből önmagukban ismert eljárások alkalmazásával a termelő kiónokat izoláljuk, tipikusan úgy járunk el, hogy a heterogén sejtpopulációkat szétosztjuk külön rekeszekbe vagy csészékbe, a hGHszintézist detektáljuk, és a pozitív rekeszekből kiindulva szükség szerint az eljárást többször megismételjük, végül a célzott rekombinációt tartalmazó kiónt úgy izoláljuk, hogy az expressziót olyan 96 mérőhelyes mikrotiter tálcában vizsgáljuk, amely mérőhelyenként egy-egy sejtet tartalmaz. Eljárhatunk úgy is, hogy a teljes tenyésztőcsészéből lizátumot készítünk, abból DNS-t izolálunk, és azt PCReljárással vizsgáljuk, amely vizsgálat során azt a DNSmintát tekintjük pozitívnak, amelyről egy mMT-specifikus láncindító és egy HUMGHCSA-szekvencia 5432. nukleotidjától 3' -irányban hibridizálódó láncindító együttes alkalmazásával a megfelelő fragmens amplifikálódik. Az ilyen láncindító pár olyan fragmens amplifikálódását idézi elő, a megfelelő szerkezetű DNS-ről kiindulva, melynek mérete az ismert DNS-szekvencia alapján pontosan kiszámítható. A pozitívnak talált csészékben található sejteket tripszinnel kezeljük, ezután a sejtekből egymást követő lépésekben egyre nagyobb hígításokat készítünk, majd a hígított mintákon megismételjük a fent ismertetett DNS-izolálást és PCR-analízist, egészen addig, míg izolálni nem tudjuk a célzott rekombinációt tartalmazó sejteket.
··«· · « · 4
A jelen példában bemutatott géncélzó stratégiák alkalmasak a hGH-expresszió halhatatlanná tett humán sejtekben történő aktiválására is, hagyományos gyógyászati alkalmazásra szolgáló hGH termelésének céljára. Alkalmas sejtek például: halhatatlanná tett humán sejtek [ HT1080-sejtek (ATCC CCL 121)], HeLa-sejtek és HeLa-sejtszármazékok (ATCC CCL 2, 2.1 és 2.2), MCF-7-mellráksejtek (ATCC HBT 22), K562-leukémiasejtek (ATCC CCL 232), KB-karcinómasejtek (ATCC CCL 17), 2780 AD-petefészekkarcinóma-sejtek [Van dér Blick, A.M. és mtsai. : Cancer Rés., 48, 5927 (1988)] , Raji-sejtek (ATCC CCL 86), Jurkat-sejtek (ATCC TIB 152), Namalwa-sejtek (ATCC CRL 1432), HL-60-sejtek (ATCC CCL 240), Daudi-sejtek (ATCC CCL 213), RPMI-8226-sejtek (ATCC CCL 155), U-937sejtek (ATCC CRL 1593), Bowes-féle melanómasejtek (ATCC CRL
9607), a WI-38VA13-sejtek 2R4-szubklónja (ATCC CLL 75.1), MOLT-4-sejtek (ATCC CRL 1582), és különböző heterohibridoma-sej tek.
1. k A humán hGH-gén aktiválása, és célzott rekombinációt tartalmazó elsődleges, másodlagos és halhatatlanná tett humán fibroblasztok izolálása pozitív vagy kombinált pozitív/negatív szelekciós rendszerben
A p5' -hGH-mMT-plazmid előállításánál bemutatott stratégiát kiegészítjük egy további lépéssel, amelyben a neo-gént beépítjük közvetlenül az mMT-promóter szomszédságába. Ezenfelül a pUC12-polilinkerben található HUMGHCSAszekvenciák közvetlen szomszédságába beépíthetünk egy negatív szelekciós markergént is, például a gpt-gént [ melyet a pMSG-plazmidból izolálhatunk (Pharmacia) , vagy egyéb alkal·♦* · más forrásból] . Az első esetben G418r-kolóniákat szelektálunk, majd azokat PCR-amplifikálással vagy restrikciós enzimes és Southern-hibridizációs analízissel szkríneljük, oly módon, hogy a rezisztens kiónok egy-egy csoportjából DNS-t preparálunk, és a keverék DNS vizsgálatával, majd a szkrínelési lépések többszöri megismétlésével azonosítjuk a célzott rekombinációt tartalmazó kiónokat. Az utóbbi esetben a G418r-klónokat olyan tápközegbe helyezzük, amely tioxatint tartalmaz, és ily módon a gpt-gén integrálódása ellen szelektálunk [ Besnard, C. és mtsai.: Mól. Cell. Bioi., J_, 4139 (1987)] . Az elmondottakon túl az inszert gpt-génnel ellentétes vége mellé beépíthetjük a HSV-TK-gént is, és ily módon lehetővé válik a neo-gén jelenlétére történő szelektálás mellett mind a gpt-, mind pedig a TK-gén irányára történő szelektálás oly módon, hogy a sejteket olyan humán fibroblasztok tenyésztésére alkalmas tápközegben növesztjük, amely tartalmaz 400 gg/ml G418-at, 100 μιτιόΐ 6-tioxantint, valamint 25 μg/ml gancyclovir-t. A kétszeres negatív szelekció közel tökéletes szelekciót jelent, a célzott rekombinációs események megtörténtére. A célzott rex kombináció megtörténtét ezután Southern-hibridizációval igazolhatjuk.
A jelen példában bemutatott géncélzó stratégiák alkalmasak hGH-expresszió aktiválására halhatatlanná tett humán sejtekben is, hagyományos gyógyászati alkalmazásra szánt hGH termelése céljából. Alkalmas sejtek például: halhatatlanná tett humán sejtek [ HT1080-sejtek (ATCC CCL 121)], HeLa-sejtek és HeLa-sejtszármazékok (ATCC CCL 2, 2.1 ···· · · · · és 2.2), MCF-7-mellráksejtek (ATCC HBT 22), K-562leukémiasejtek (ATCC CCL 232), KB-karcinómasejtek (ATCC CCL 17), 2780 AD-petefészekkarcinóma-sejtek [Van dér Blick,
A.M. és mtsai.: Cancer Rés., 48, 5927 (1988)] , Raji-sejtek (ATCC CCL 86), Jurkat-sejtek (ATCC TIB 152), Namalwa-sejtek (ATCC CRL 1432), HL-60-sejtek (ATCC CCL 240), Daudi-sejtek (ATCC CCL 213), RPMI-8226-sejtek (ATCC CCL 155), U-937sejtek (ATCC CRL 1593), Bowes-féle melanómasejtek (ATCC CRL 9607), a WI-38VA13-sejtek 2R4-szubklónja (ATCC CLL 75.1), MOLT-4-sejtek (ATCC CRL 1582), és különböző heterohibridoma-sej tek.
Az l.f és l.i példákban bemutatott és az l.g, l.h és l.j, valamint l.k példákban felhasznált célzott konstrukciókat módosíthatjuk oly módon, hogy tartalmazzanak szelektálhatóan amplifikálható markergént is (például ada-, dhfr-, vagy CAD-gént), ami lehetővé teszi, hogy olyan sejteket szelektáljunk, amelyben az aktivált endogén gén és a szelektálhatóan amplifikálható marker együttesen amplifikálódott. Az ilyen sejteket, melyek valamely terápiás terméket kódoló endogén gént expresszálnak, vagy képesek expresszálni, felhasználhatjuk hagyományos gyógyászati alkalmazásra szánt fehérjék (például hGH és hEPO) termelésére, vagy génterápiára.
1.1 Elsődleges és másodlagos fibroblasztok transzfektálása exogén DNS-sel és szelektálható markergénnel elektroporáció út j án
Exponenciálisan növekedő vagy korai stacionárius fázisban lévő fibroblasztokat tripszinnel kezelünk, és a • · · ···· ···· • · · műanyag felszínről tápközeggel lemossuk őket. Az így kialakított sejtszuszpenzióból mintát veszünk a szuszpenzió sűrűségének meghatározására, a szuszpenzió többi részét pedig lecentrifugáljuk. A felülúszót ezután eltávolítjuk, majd a csapadékot 5 ml elektroporációs pufferben felszuszpendáljuk [20 mmól/1 HEPES (pH=7,3), 137 mmól/1 NaCl, 5 mmól/1 KCl, 0,7 Na2HPO4, 6 mmól/1 dextróz] . A sejteket ezután ismét lecentrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, majd a sejteket 1 mg/ml acetilált marhaszérumalbumint tartalmazó elektroporációs pufferben felszuszpendáljuk. A végső sejtszuszpenzió közelítőleg 3x10° sejtet tartalmaz milliliterenként. Az elektroporációt a sejtek felszuszpendálása után azonnal végrehajtjuk.
0,4 cm-es elektródhézagot tartalmazó steril küvettába (Bio-Rad) kettősszálú „supercoiled plazmid DNS-t adunk. A DNS végkoncentrációja általában legalább 120 pg/ml. Ezután a sejtszuszpenzióból 0,5 ml-t (amely körülbelül l,5xl06 sejtet tartalmaz) a küvettába helyezünk, majd a sejtszuszpenziót óvatosan összekeverjük a DNS-oldattal. Az elektroporációt „Gene-Pulser készülékben (Bio-Rad) hajtjuk végre. A kapacitást és a feszültséget sorrendben 960 pF és 250-300 V értékre állítjuk. A feszültséget növeljük, a túlélő sejtek száma csökkenni fog, de drámaian megnő azoknak a túlélő sejteknek az aránya, melyek stabilan beépítették a bejuttatott DNS-t. Az ismerteiéit paraméterek beállítása mellett körülbelül 14-20 msec pulzusidő figyelhető meg.
Az elektroporált sejteket ezután körülbelül 5 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a küvetta tartalmát óvato• · ···· ···· san kiszívjuk egy steril transzferpipetta alkalmazásával. A sejteket ezután közvetlenül 10 ml előmelegített tápközegbe (lásd fent, 15% borjúsavóval kiegészítve) helyezzük egy 10 cm átmérőjű tenyésztőcsészében, majd a fent leírtak szerint inkubáljuk. A következő napon a tápközeget eltávolítjuk, és 10 ml friss tápközeggel helyettesítjük, majd a tenyésztőcsészéket további 16-24 órán át inkubáljuk. A sejtek szubklónozását - a klónozási hatékonyság megállapítása és G418-rezisztens kiónok szelektálása céljából - a következő napon hajtjuk végre. A sejteket ekkor tripszinnel kezeljük, majd megszámoljuk és szélesztjük őket; a klónozási hatékonyság megállapításához tipikusan 103 sejtet szélesztünk egy 10 cm átmérőjű tenyésztőcsészébe, a G418-szelekció céljából pedig 1-2x10 sejtet szélesztünk egy-egy 10 cm átmérőjű tenyésztőcsészébe.
A humán fibroblasztokat G418-rezisztenciára olyan tápközegben szelektáljuk, amely 300-400 gg/ml G418-at (Geneticin-diszulfátsó, hatékonysága közel 50%-os; Gibco) tartalmazó 15% borjúsavóval kiegészített fibroblasztok tenyésztésére alkalmas tápközegben. A klónozási hatékonyságot G418-antibiotikum hiányában határozzuk meg. A szélesztett sejteket ezután 12-14 napon át inkubáljuk, ezután formaiinnal fixáljuk őket, majd kristályibolya-festés és sejtszámlálás következik (azon csészék esetében, melyeket a klónozási hatékonyság megállapítása céljából szélesztettünk), vagy pedig a sejteket klónozó hengerek alkalmazásával izoláljuk (a G418-at tartalmazó csészékből). Nyúleredetű fibroblasztok elektroporálását és szelektálását lényegé94 • · · · · • · · · · ···· ···· ·· ben a humán fibroblasztok esetén leírtak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy eltérő szelekciós körülményeket használunk. A nyúleredetű fibroblasztokat G418rezisztenciára olyan tápközegben szelektáljuk, amely 1 g/ml
G418-at tartalmaz.
A fibroblasztokat frissen levágott humán fitymákból izoláltuk. A tenyészeteket 10% borjúsavót tartalmazó DMEM2 táptalajban indítottuk, 50 ezer sejt/cm sűrűséggel. Amikor a tenyészetek konfluenssé válnak, a fibroblasztokat tripszines kezelés után begyújtjuk, és elektroporáció útján transzfektáljuk őket. Az alkalmas elektroporációs körülményeket pcDNEO-plazmiddal történő transzfektálás útján állítottuk be (5. ábra). Egy közel optimális körülmények között végrehajtott reprezentatív elektroporációs kísérlet (60 μg pcDNEO-plazmid, elektroporációs feszültség 250 V, kapacitás: 960 μΕ) 588 kezelt sejtenként eredményezett egy G418rezisztens kolóniát (ez az összes kezelt sejtek 0,17%-a), ugyanez az érték klónozható sejtek vonatkozásában 1/71-nek adódott (a klónozható sejtek 1,4%-a lett G418-rezisztens).
Végrehajtottunk kilenc egymástól független elektroporációs kísérletet egymáshoz közeli körülmények között (60 μg pcDNEO-plazmid, elektroporációs feszültség: 300 V, kapacitás: 960 μΕ), és azt találtuk, hogy átlagosan 1899 kezelt sejtből keletkezett egy G418-rezisztens klón (0,05%, a különböző kísérletekben ez az érték 1/882 és 1/7500 között változott). Ez az érték klónozható sejtek vonatkozásában 38 sejtenként 1 G418-sejtet jelent (2,6%).
Alacsonyan passzált elsődlegesen humán fibroblasztokat átalakítottunk hGH-expresszáló sejtekké oly módon, hogy pcDNEO- és pXGH5-plazmidokkal ko-transzfektáltuk őket. Tipikusan a két plazmádra nézve ekvimoláris elegy 60 gg-ját transzfektáltuk optimálishoz közeli körülmények között (elektroporációs feszültség: 300 V, kapacitás: 960 pF) . Egy ilyen kísérlet során 14705 kezelt sejtenként keletkezett egy G418-rezísztens klón.
Az így előállított és azonos transzfekciós körülmények között transzfektált egyéb sejtek hGH-expressziós adatait az alábbiakban foglaljuk össze. Általánosságban elmondható, hogy a G418-rezisztens kiónok 98%-a szaporítható volt, és nagy tömegű tenyészetet is elő lehetett belőlük állítani.
A vizsgált G418r-klónok száma:_ 154
A G418-rezisztens és hGH-t expresszáló kiónok száma: 65
Átlagos hGH-expressziós szint: 2,3 μg hGH/106 sejt/24 óra
A maximális hGH-expressziós szint: 23,0 μg hGH/106 sejt/24 óra
Előállítottunk stabil transzfektánsokat oly módon is, hogy elsődleges vagy másodlagos humán fibroblasztokat pXGH301-plazmiddal transzfektáltunk, ez egy olyan DNSkonstrukció, melyben mind a neo- mind pedig a hGH-gének jelen vannak ugyanazon a plazmidmolekulán. A pXGH301plazmidot egy kétlépéses eljárással állítottuk elő. A pBR322-plazmid Sall/Clal-fragmensét (a pBR322-plazmid 2396
651. nukleotidjai) izoláltuk, és beépítettük a Sáli- és Clal-enzimekkel emésztett pcDNEO-plazmidba, és ily módon egy BamHI-hasítóhelyet építettünk be a pcDNEO-plazmidban található SV40-eredetű korai promóterrégiótól 5' -irányban. Az így kialakított pBNEO-plazmidot BamHI-enzimmel emésztettük és izoláltuk a 2,1 kb-os fragmenst, amely tartalmazta a neo-gént, az SV40-eredetű korai promóter szabályozása alatt, majd az izolált fragmenst a BamHI-enzimmel emésztett pXGH5-plazmidba ligáltuk. Izoláltunk egy plazmidot, amely a 2,5 kb-os BamHI-fragmenst 1-szeresen inszertálva tartalmazta, amely plazmidban a neo- és a hGH-gének egymással azonos irányban íródtak át. Ez a plazmidot pXGH301-nek neveztük el. A transzfektálást tipikusan a következő körülmények között végeztük: 1,5xl06-sejtét elektroporáltunk 60 pg pXGH301-DNS jelenlétében, 300 V-tal és 960 gF-dal. A transzfektált másodlagos fibroblaszt G418-rezisztens kiónokat izoláltunk, l,5xl06 kezelt sejt közül 652-t, azaz 1/2299 kezelt sejt lett G418-rezisztens.
2. példa
Olyan célzó plazmidok előállítása, melyek célzott rekombináció esetén olyan kiméra transzkripciós egységet eredményeznek, amelyben a humán növekedési hormonból származó és eritropoietin eredetű szekvenciák fuzionálva vannak
Az alábbi példával a találmány szerinti megoldás olyan megvalósítási módjait kívánjuk szemléltetni, amely szerint a humán EPO-géntől 5' -irányban található normális szabályozó szekvenciákat úgy változtatjuk meg, hogy lehető• · · · · · • · · · * • · · · · ···· ···* · · ·
- 97 vé váljék hEPO expressziója olyan elsődleges vagy másodlagos fibroblaszt törzsekben, melyek transzfektálatlan állapotban nem expresszálnak hEPO-t kimutatható mennyiségben. Az említett megvalósítási módok szerint a célzott rekombinációs események eredményeként olyan kiméra transzkripciós egységek keletkeznek, melyekben a humán növekedési hormon gén 1. exonja a hEPO-gén 2-5. exonjaitól 5' -irányban található. Az ilyen fúziós gén transzkripciójának, „splicingjának és transzlációjának egy olyan protein az eredménye, amelyben az hEPO-szignálpeptidjének 1-4. aminosavai ki vannak cserélve a hGH 1-3. aminosavaira. Az ismertetésre kerülő két megvalósítási mód egyrészt abban különbözik egymástól, hogy az inszertálandó exogén szabályozó szekvenciák relatív pozíciója más bennük, másrészt különbözik az a specifikus „splicing-mintázat, amelynek be kell következnie a végső, processzált transzkriptum keletkezéséhez.
A pXEPO-1O-plazmidot úgy terveztük, hogy alkalmas legyen arra, hogy a 7. humán kromoszómán található endogén hEPO-gén 1. exonját géncélzás útján kicseréljük a hGH-gén
1. exonjára. A pXEPO-1O-plazmidot az alábbiak szerint állítottuk elő: első lépésben a pT163-jelű intermedier plazmidot állítottuk elő oly módon, hogy a 6 kb-os HindlII/BamHI-fragmenst (lásd l.f példa) beépítettük a HindiII/BamHI-enzimekkel emésztett pBluescriptlISK/+vektorba (Stratagene, La Jolla, Kalifornia) úgy, hogy a hEPO kódoló régiótól 5' -irányban helyezkedjék el. A ligációs terméket megemésztettük Xhol- és HindlIIenzimekkel, és összeligáltuk pMClneoPolyA-plazmid • · · [ Thomas, K. R és Capecchi, M. R.: Cell, 51, 503 (1987), beszerezhetők: Stratagene, La Jolla, Kalifornia] 1,1 kb-os HindlII/XhoI-fragmensével, előállítva ily módon a pT163plazmidot. Ezután a 13.1-, 13-4-jelű oligonukleotidok alkalmazásával polimeráz-láncreakció útján olyan fúziós framgenst állítottunk elő, amelyben az egéreredetű metallotionein-I- (mMT-I-) promoterhez fuzionált hGH 1. exon szekvenciákhoz hozzá fuzionálódott a hEPO-gén 1. intronjának szekvenciája is. Az első lépésben a 13.1- és 13.3-jelű oligonukleotidok alkalmazásával· a pXGH5plazmidból (5. ábra) kiindulva amplifikáltuk a körülbelül 0,73 kb-os mMT-I-promótert és a hGH 1. exonját tartalmazó fragmenst. Ezután a 13.2- és 13.4-jelű oligonukleotidok alkalmazásával humán genomi DNS-ból kiindulva amplifikáltunk egy körülbelül 0,57 kb-os fragmenst, amely elsősorban a hEPO 1. intronjának szekvenciáját tartalmazta. Végül a két előzőek szerint amplifikált fragmenst összekevertük, és újabb amplifikációt hajtottunk végre a 13.1- és 13.4-jelű oligonukleotidok alkalmazásával, és így hoztuk létre a végső fúziós fragmenst (3. fúziós fragmens), amelyet az mMT-Iegység 5' -végénél egy Sall-hasítóhely, a hEPO 1. intron szekvencia 3' -végénél pedig egy Xhol-hasítóhely szegélyezett. A 3. fúziós fragmenst ezután Xhol- és Sall-enzimekkel megemésztettük, majd Xhol-gyel emésztett pTl63-plazmidba ligáltuk. A ligációs elegyet E. coli-ba transzformáltuk, majd izoláltunk egy olyan rekombináns plazmidot, amely a 3. fúziós fragmens inszertet egy példányban tartalmazta, oly módon, hogy az 1 . hEPO-intron 3' -végénél található Xhol99 ···« ···· hasítóhely regenerálódott benne, és az izolált plazmidot ρΧΕΡΟ-10-nek neveztük el.
13.1 5' -TTTTGTCGAC GGTACCTTGG TTTTTAAAAC C
Sáli KpnI (szekvenciaazonosító szám: 5)
13.2 5' -CCTAGCGGCA ATGGCTACAG GTGAGTACTC GCGGGCTGGG CG (szekvenciaazonosító szám: 6)
13.3 5' -CGCCCAGCCC GCGAGTACTC ACCTGTAGCC ATTGCCGCTA GG (szekvenciaazonosító szám: 7)
13.4 5' -TTTTCTCGAG CTAGAACAGA TAGCCAGGCT G
Xhol (szekvenciaazonosító szám: 8)
A 13.1-jelű oligonukleotid nem vastagbetűvel jelölt régiója azonos az mMT-I-promóter szekvenciájával, amelyet 5' -irányban a természetes KpnI-hasítóhely határol. Az oligonukleotid vastagbetűvel szedett régiója egy Sallhasítóhelyet tartalmazó farok, amely az oligonukleotid 5' végét Sall-hasítóhellyé alakítja. A 13.2- és 13.3-jelű oligonukleotidok vastagbetűvel szedett régiói hGH-eredetű szekvenciákat jelölnek, a nem vastagbetűvel szedett régiók pedig a hEPO-gén 1. intronjából származó szekvenciákat. A 13.4-jelű oligonukleotid nem vastagbetűkkel jelölt része azonos a hEPO-gén 1. intronja utolsó 25 bázisának szekvenciájával. A vastagbetűvel szedett régió pedig tartalmaz egy Xhol-helyet magába foglaló farkat, ami az amplifikált fragmens 3' -végét Xhol-hasítóhellyé alakítja.
- 100 • · · • · · ·
A pXEPO-11-plazmidot úgy terveztük, hogy alkalmas legyen az mMT-I-promoter és a hGH-gén 1. exonjának beépítésére a 7. humán kromoszómán található endogén hEPOlókuszba, a hEPO-struktúrgéntől és a promoter régiótól 5' irányban, géncélzás útján. A pXEPO-ll-plazmidot az alább leírtak szerint állítottuk el. A 13.1- és a 13.5-13,7-jelű oligonukleotidok alkalmazásával polimeráz-láncreakció útján olyan fúziós fragmenst állítottunk elő, amelyben az egéreredetű metallotionein-I (mMT-I) promoterhez fúzionált hGHgén 1 . exon szekvenciáihoz hozzá van fuzionáltatva a hEPO kódoló régióhoz viszonyítva -1. és -630. nukleotidok közötti hEPO-szekvencia. Első lépésben a 13.1- és 13.6-jelű oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk az mMT-Ipromótert és a hGH-gén 1. exonját tartalmazó körülbelül 0,75 kb-os fragmenst a pXGH5-plazmidból (5. ábra). Ezután a
13.5- és 13.7-jelű oligonukleotidok alkalmazásával humán genomi DNS-ről kiindulva amplifikáltuk az elsősorban hEPOszekvenciákat tartalmazó 0,65 kb-os fragmenst, amely a hEPO kódoló régiótól számítva -1. és -620. nukleotidok közötti szekvenciát tartalmazta. A 13.5- és 13.6-jelű oligonukleotidok mindegyike tartalmaz egy - a természetes hEPO-gén 1. intronja „splice-donor helyének megfelelő szekvenciájú - kapcsoló szekvenciát, az 1. hGH-intron hEPO-pr or.óter régióban. Utolsó lépésként a két amplifikált fragmenst összekeverjük és újabb amplifikációt hajtunk végre a 13.1- és 13.7-jelű oligonukleotidok alkalmazásával, és így hozzuk létre a végső fúziós fragmenst (6. fúziós fragmes), amelyet az mMT-I-egység 5' -végénél egy Sáli• ··
- 101 • · · · ···· hasítóhely határol, a hEPO-promóter régió 3' -végén pedig egy Xhol-hasítóhely. A 6. fúziós fragmenst Xhol- és Sallenzimmel megemésztettük, majd az Xhol-gyel emésztett pT163plazmidba ligáltuk. A ligációs eleggyel E. coli sejteket transzformáltunk, és kiválasztottunk egy olyan rekombináns plazmidot, amely a 6. fúziós fragmenst egyetlen példányban tartalmazta, és amelyben a hEPO-promóter szekvenciák 3' végénél található Xhol-hasítóhely regenerálódott, és ezt a plazmidot pXEPO-11-plazmidnak neveztük el.
13.5 5' -GACAGCTCAC CTAGCGGCAA TGGCTACAGG TGAGTACTC
AAGCTTCTGG GCTTCCAGAC CCAG (szekv.az.szám: 9)
HindlII
13.6 5' -CTGGGTCTGG AAGCCCAGAA GCTTGAGTAC TCACCTGTAG
HindlII
CCATTGCCGC TAGGTGAGCT GTC (szekv.az.szám: 10)
13.7 5' -TTTTCTCGAG CTCCGCGCCT GGCCGGGGTC CCTC
Xhol (szekv.az.szám: 11)
A 13.5- és 13.6-jelű oligonukleotidok vastagbetűs régiói hGH-szekvenciákat jelölnek. A dőltbetűvel szedett régiók a hEPO-gén 1. intronja első 10 bázispárjának szekvenciájával egyeznek meg. Az oligonukleotidok további része a -620. és -597. nukleotidok közötti hEPO-szekvenciának felel meg (a hEPO-kódoló régiótól számítva). A 13.7-jelű oligonukleotid nem vastagbetűvel szedett régiója azonos a hEPO-kódoló régiótól számított -1. és -24. nukleotidok kö- 102 ···· ···· «· ·· ··» · • · · · • *« β · • · · · ·· ♦ ·· · zötti szekvenciával. A vastagbetűvel szedett régió tartalmaz egy Xhol-hasítóhelyet hordozó farkat, amely az amplifikált fragmens 3' -végét egy Xhol-hasítóhellyé alakítja.
A pXEPO-10-plazmidot úgy használhatjuk fel géncélzásra, hogy megemésztjük BamHI- és Xhol-enzimekkel, amely emésztés felszabadítja az mMT-I/hGH-fúziót tartalmazó 7,3 kb-os fragmenst, a fúziós konstrukciót az említett fragmensen mindkét oldalról hEPO-szekvenciák szegélyezik. Ez a fragmens (1. célzó fragmens) hEPO-kódoló szekvenciát nem tartalmaz, csak olyan szekvenciák találhatók benne, melyek a hEPO-kódoló régiótól 5' -irányban körülbelül a -620.
és -6620. nukleotid között találhatók, valamint tartalmaz a hEPO-gén 1. intronjából származó szekvenciákat is, melyek alkalmasak a fragmens humán EPO-lókuszba irányítására. Az 1. célzó fragmenst elsődleges vagy másodlagos emberi bőrből származó fibroblasztokba transzfektáljuk, az l.c példában leírtak szerint. A kapott G418-rezisztens kolóniákat egyenként egy 96 mérőhelyes mikrotiter tálca különböző mérőhelyeibe helyezzük, és a kiónokat EPO-expresszióra szkríneljük kereskedelmi forgalomban beszerezhető ELISAeljárással (R&D Systems, Minneapolis, MN). Azok a sejtek, melyekben a transzfektáló DNS véletlenszerűen integrálódott a humán genomba, nem képesek EPC-t termelni. Azok a sejtek, melyekben a transzfektáló DNS homológ módon rekombinálódott az endogén hEPO-gén 1. intronjával és a hEPO-géntől 5' irányban található szekvenciákkal, olyan kiméra gént tartalmaznak, amelyben a normális hEPO-promóter és a hEPO-gén • «
- 103 t «··
1. exonja ki van cserélve az mMT-I-promóterre és át nem íródó szekvenciákra, valamint a hGH-gén 1. exonjára és 5'végi nem-traszlálódó szekvenciáira (lásd 1. ábra). Az első célzó fragmensben található nem-hEPO-eredetű szekvenciák a hEPO-eredetű szekvenciákhoz a hEPO-gén 1. intronjától 3'irányban kapcsolódnak. Amennyiben a normális hEPO szabályozó régiót az mMT-I-promóterre cseréljük, az EPO-gén aktiválódni fog olyan fibroblasztokban, melyek normálisan nem expresszálnak hEPO-t. A hEPO-gén 1. exonjának a hGH-gén 1. exonjára történő cseréje egy olyan proteint eredményez, amelyben a hEPO-szignálpeptidjének első négy aminosava ki van cserélve a hGH első három aminosavára, és ily módon egy funkcionális kiméra szignálpeptid keletkezik, amely az érett fehérjéről a poszt-transzlációs feldolgozás során lehasad, és az expresszáló sejtekből szekretálódik.
A pXEPO-11-plazmidot úgy használhatjuk fel géncélzásra, hogy megemésztjük BamHI- és Xhol-enzimekkel, és ily módon felszabadul a mindkét oldalról hEPO-szekvenciákkal szegélyezett mMT-I/hGH fúziós konstrukciót tartalmazó 7,4 kb-os fragmens. Ez a fragmens (2. célzó fragmens) nem tartalmaz hEPO-kódoló szekvenciákat, csak a hEPO-kódoló régiótól 5' -irányban található -1 . és körülbelül -6620. nukleotidok közötti szekvenciákat, mely szekvenciák a fragmenst a humán EPO-lókuszba irányítják. A 2. célzó fragmenst elsődleges vagy másodlagos humán bőreredetű fibroblasztokba transzfektáljuk, az l.g példában leírtak szerint. A G418-rezisztens kiónokat egyenként 96 mérőhelyes mikrotiter tálca különböző mérőhelyeibe helyezzük, és ke-
- 104 reskedelmi forgalomban beszerezhető ELISA-eljárással (R&D Systems, Minneapolis, MN) EPO-expresszióra szkríneljük őket. Azok a sejtek, melyekben a transzfektáló DNS véletlenszerűen integrálódott a humán genomba, nem képesek EPO-t termelni. Azok a sejtek, melyekben a transzfektálódó DNS homológ módon rekombinálódott az endogén hEPO-promóterrel, és 5' -végi szekvenciákkal, olyan kiméragén tartalmaznak, amelyben az mMT-I-promóter és át nem íródó szekvenciák, a hGH-gén 5'-végi nem-transzlálódó szekvenciái és a gén 1. exonja, valamint egy - a hEPO-gén 1. intronjának első tíz bázisát tartalmazó 10 bázispár hosszúságú linker beinszertálódott a hEPO-kódoló régiótól számított -620. pozícióban található HindlII-hasítóhelyre (lásd 2. ábra). A normálisan nem működő hEPO-promótertől 5' -irányban elhelyezkedő mMT-I-promóter elsődleges és másodlagos bőr fibroblasztokban egy olyan mRNS szintézisét fogja kiváltani, amely 5' —> 3' -irányban a következő szekvenciarészleteket tartalmazza: nem-transzlálódó metallotionein és hGH-szekvenciák, 1. hGH-exon, az 1. hEPO-intron első tíz bázisának szekvenciájával megegyező szekvenciájú DNSfragmens, a normális hEPO-promóter és a hEPO 1. exonja (a hEPO-kódoló szekvenciához viszonyítva -623. —» + 13. nukleotidok). A hEPO 1. intronjából származó tíz bázispáros linker szekvencia „splice-donor helyként működik és hozzá fuzionálja a hGH 1. exonját a legközelebbi 3' -irányban elhelyezkedő „spl ice-akceptor helyhez, amely közvetlenül a hEPO-gén 2. exonjától 5' -irányban található. A fent leírt szerkezetű transzkriptum processzálása során ezért a hEPO• · · · • · · · · · · • · · · · ·
- 105 - .:·· ···· ·*·· ·· gén promoter-, 1. exon-, és 1. intron-szekvenciái ki fognak hasadni. A hEPO-gén 1. exonjának a hGH-gén 1. exonjára történő cseréje egy olyan proteint fog eredményezni, amelyben a hEPO-szignálpeptidjének első négy aminosava ki lesz cserélve a hGH első három aminosavjára, aminek következtében egy működőképes kiméra szignálpeptid keletkezik, amely a poszt transzlációs módosítások során az érett fehérjéről lehasad, és az expresszáló sejtekből szekretálódik.
Előállíthatunk számos a pXEPO-10- és pXEPO-11plazmiddal rokonszerkezetű konstrukciót, önmagukban ismert eljárások alkalmazásával. Ezekben a konstrukciókban változtathatjuk az mMT-I-promóter és a hGH-szekvenciák relatív pozícióját, valamint azt a pozíciót, ahová az mMT-I/hGHszekvenciákat beépítjük a hEPO-gén 5' -végi szekvenciáiba, és ily módon alternatív kiméra transzkripciós egységeket hozhatunk létre, melyek hatékonyabbá tehetik a géncélzást, hatékonyabban expresszálhatják a fúziós transzkriptumot vagy egyéb kívánatos sajátságokkal bírnak. Az ilyen konstrukciók a fent leírtakkal hasonló eredményre vezetnek, azaz egy hGH-hEPO fúziós gén a normális hEPO-lókuszban géncélzás útján egy exogén promoter szabályozása alá kerül. Például, a hEPO-géntől 5' -irányban beépített 6 kb-os HindiII/BamHIfragmens (lásd l.f példa) számos olyan restrikciós hasítóhelyet tartalmaz, melyeket felhasználhatunk a neogén, valamint az mMT-I-promóter/hGH fúziós fragmens beépítéséhez. Egy ilyen hasítóhely, a HindlII-hasítóhelytől körülbelül 1,3 kb-nyira 5' -irányban található BglII-hely, ebben a régióban egyedi hasítóhely, és ezért alkalmas egy
- 106 • · · • · · vagy több szelektálható markergén beépítésére, és beépíthetünk ide egy másik génből származó olyan szabályozó régióit is, amely alkalmas a hEPO-expresszió elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán sejtekben történő expresszálására.
Először előállítjuk a pT164 intermedier plazmidot úgy, hogy a 6 kb-os, hEPO-kódoló régiótól 5' -irányban található HindlII/BamHI-fragmenst (1.f példa) beépítjük a HindlII/BamHI-emésztett pBluescriptIISK/+-vektorba (Stratagene, La Jolla, Kalifornia). Ezután a pMClneoPolyAplazmidot [ Thomas, K. R. és Capecchi, M.R. : Cell, 51, 503 (1987), beszerezhető a Stratagene cégtől, La Jolla, Kalifornia] megemésztjük BamHI- és Xhol-enzimekkel, az emésztményt E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmensével tompavégűvé alakítjuk, és a kapott 1,1 kb-os fragmenst izoláljuk. A pTl64-plazmidot ezután megemésztjük BglIIenzimmel, és E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmensével tompavégűvé tesszük. A két említett tompavégűvé tett fragmenst összeligáljuk, és a ligátumot kompetens E. coli sejtekbe transzformáljuk. A transzformánsokból olyan rekombináns plazmidot izolálunk, amely egy példányban tartalmazza az 1,1 kb-os neo-fragmenst, és restrikciós enzimes analízissel kiválasztunk egy olyan rekombináns plazmidot, amelyben a tompavégűvé tett Xhol- és BglII-hasítóhelyek összeligáiása során újrakeletkezett Bgill-hasítóhely a pTl64-plazmidban található HindlII-hasítóhelytől körülbelül 1,3 kb-nyira található. Az így kapott plazmidot (pT165) elhasítjuk az egyedi BglII-hasítóhelyén, amely a neo transz• · • ·
- 107 kripciós egység 5' -végét szegélyezi.
A 13.8- és 13.9-jelű oligonukleotidok alkalmazásával polimeráz-láncreakció útján előállítunk egy olyan fragmenst, amelyben a metallotionein-I (mMT-I) promóterhez fuzionált első hGH-exon szekvenciák hozzá vannak fuzionálva egy „splice-donor helyet tartalmazó 10 bázispáros fragmenshez. Kiválasztott „splice donor hely megfelel a természetes hEPO-gén 1. intronjának „splice-donor helyének, bár alkalmazhatunk több „splice-donor helyet vagy konszenzus szekvenciájú „splice-donor helyeket is. A 13.8és 13.9-jelű oligonukleotidok alkalmazásával a pXGH5plazmidból kiindulva (5. ábra) egy körülbelül 0,73 kb-os fragmenst amplifikálunk, amely tartalmazza az mMT-Ipromóter - 1. hGH-exon konstrukciót. Az amplifikált fragmenst (7. fragmens) megemésztjük BglII-enzimmel, és összeligáljuk a BglII-vel emésztett pTl65-plazmiddal. A ligációs elegyet E. coli sejtekbe transzformáljuk, és izolálunk egy olyan rekombináns plazmidot, amely a 7. fragmenst egyetlen kópiában tartalmazza úgy, hogy az mMT-Ipromóterben található KpnI-hasítóhely közvetlenül a neo-gén 5' -végénél legyen található, és az mMT-I-promóter orientációja olyan legyen, hogy a transzkripció az egyedi HindlIIhasítóhely irányában haladjon, és az így előállított plazmidot ρΧΕΡΟ-12-nek nevezzük.
13.8 5' -AAAAAGATCT GGTACCTTGG TTTTTAAAAC CAGCCTGGAG
BglII KpnI (szekv.az.szám: 12) • ·
- 108 A 13.8-jelű oligonukleotid nem vastagbetűkkel szedett régiójának szekvenciája megegyezik az mMT-I-promóter szekvenciájával, amelyet 5' -végén a természetes Kpnlhasítóhely határol. A vastagon szedett régió egy BglIIhelyet tartalmazó farkat jelöl, ami alkalmas az 5' -vég BglII-hasítóhellyé történő alakítására.
13.9 5' -TTTTAGATCT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT TGCCGCTAGG
BglII (szekv.az.szám: 13)
A 13.9-jelű oligonukleotid a vastagbetűkkel jelzett régiója hGH-eredetű szekvenciákat jelöl. A dőltbetűkkel szedett régió a hEPO 1. intronja első tíz bázisának szekvenciájával egyezik meg. Az aláhúzott BglII-hasítóhelyet plazmidkonstrukciós célokra építettük be.
A pXEPO-12-plazmidot úgy használhatjuk géncélzásra, hogy megemésztjük BamHI- és HindlII-enzimekkel, és ily módon felszabadul a 7,9 kb-os fragmens, amely tartalmazza a neo-gént, valamint az mMT-I/hGH-fúziót, és a fragmenst mindkét oldalon hEPO-szekvenciák szegélyezik. Ez a fragmens (3. célzófragmens) hEPO-kódoló szekvenciákat nem tartalmaz, csak olyan szekvenciákat, melyek a hEPO-kódoló régiótól 5' irányban körülbelül a -620. és 6620. nukleotidok között találhatók, melyek alkalmasak a konstrukció célba juttatására a humán EPO-lókusztól 5'-irányban. A harmadik célzó fragmenst elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán bőr f ibroblasztokba transzfektáljuk, az l.b és l.c
- 109 példákban leírtak szerint. A G418-rezisztens kolóniákat 96 mérőhelyes mikrotiter tálca különböző mérőhelyeibe helyezzük, és kereskedelmi forgalomban beszerezhető ELISAeljárással (R&D Systems, Minneapolis, MN) EPO-expresszióra szkríneljük őket. Azok a sejtek, amelyekben a transzfektáló DNS véletlenszerűen integrálódik a humán genomba, nem képesek hEPO-t termelni. Azok a sejtek, melyekben a transzfektáló DNS homológ módon rekombinálódott az endogén hEPO-promóterrel és 5' -végi szekvenciákkal olyan kiméragént tartalmaznak, amelyben az mMT-I-eredetű promoter és át nem írott szekvenciák, a hGH-gén 5' -végi nem-transzlálódó szekvenciái, a hGH 1. exonja, valamint a hEPO 1. intronja első tíz bázisának megfelelő szekvenciájú 10 bázispáros linker be van inszertálódva a hEPO-kódoló régiótól körülbelül 1920. pozícióban található BglII-hasítóhelyre. A normálisan nem működő hEPO-promótertől 5' -irányban beépített mMT-Ipromóter elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán fibroblasztokban (vagy egyéb humán sejtekben) egy olyan mRNS szintézisét fogja kiváltani, amely 5' —> 3' -irányban a következő összetevőket tartalmazza. Nem transzlálódó metallotionéin és hGH-szekvenciák, 1. hGH-exon, az 1 . hEPOintron első tíz bázisában megegyező szekvenciájú tíz bázispáros DNS-fragmens, 5' -végi hEPO-régió és 1. hEPO-exon (az elmondott szekvenciarészletek az EPO kódoló szekvenciához képest körülbelül a -1920. nukleotidtól a +13. nukleotidig terjednek). A hEPO 1. intronjából származó szekvenciát tartalmazó 10 bázispáros linker „splice-donor helyként működik, és hozzá fuzionáltat j a a hGH 1. exonját egy 3'• ·
- 110 • · · · · irányban elhelyezkedő „splice-akceptor helyhez, amely közvetlenül a hEPO 2. exonjától 5'-irányban található. A keletkező transzkriptum processzálódása során tehát a következő szekvenciarészletek ki fognak hasadni: 5' -végi hEPOszekvenciák, promóterrégió, 1. exon, 1. intron. Amennyiben pXEPO-10-, pXEPO-11- vagy pXEPO-12-plazmidokat használjuk, a homológ rekombinációt tartalmazó sejtekben keletkező mRNS poszt transzkripcionális processzálódását in vitro mutagenezissel javíthatjuk oly módon, hogy eltávolítjuk azokat a „splice-akceptor helyeket, amelyek az 5' -végi hEPO-szekvenciákban találhatók, az mMT-I-promóter és az 1. hEPO-exon között, amey „splice-akceptor helyek csökkentik azon hatékony „splicing-események bekövetkeztének gyakoriságát, melyek a kívánt mRNS-t eredményezik. A hEPO-gén 1. exonjának a hGH-gén 1. exonjára történő cseréje egy olyan proteint eredményez, amelyben a hEPO-szignálpeptid első négy aminosava ki van cserélve a hGH első három aminosavára, és így egy kiméra szignálpeptid keletkezik, amely a poszt transzlációs módosítás során az érett fehérjéről lehasad, és az expresszáló sejtekből szekretálódik.
3. példa
A megcélzott gén 5' -végi szekvenciáinak célzott módosítása, és a megcélzott gén amplifikálása
Azokban a sejtekben, melyek a korábbiakban leírtak szerint aktivált hEPO-gént tartalmaznak, a neo/mMT-I/EPO transzkripciós egység amplifikálható, amennyiben a célzó plazmid tartalmaz egy olyan markergént, amely alkalmas ar- 111 • · · · • · · • · · · · · ra, hogy génamplifikáció útján nagy mennyiségű citotoxikus hatóanyaggal szemben rezisztenssé tegye a gazdasejtet. Az alábbiakban felsorolt szelektálható markergénekről kimutatták, hogy - egyéb gének mellett - amplifikálhatók halhatatlanná tett humán sejtvonalakban: dihidrofolát reduktáz (dhfr; szelektív hatóanyag: metotrexát), a multifunkcionális CAD-gén [ amely karbamoil-foszfát szintázt, aszpartát transzkarbamoilázt és dihidro-orotázt kódol; szelektív hatóanyag: N-(foszfono-acetil)-L-aszpartát(PALA)] glutamin szintáz [ szelektív hatóanyag: metionin szulfoximin (MSX)] , valamint adenozin deamináz [ ada; szelektív hatóanyag valamely adenin-nukleozid; Wright,J.A. és mtsai.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 1791 (1990); Cockett, M.I. és mtsai.: Bio/Technology 8_, 62 (1990)] . Az ismertetett publikációkban számos halhatatlanná tett humán sejtvonalban igazolták a génamplifikáció bekövetkezését. Megfelelő szelekciós körülmények között - többek között - az alábbi sejtvonalak mutatnak amplifikációs sajátságokat: HT1080, HELA, MCF-7mellráksejtek, Κ-562-leukémiasejtek, KB-karcinómasejtek, valamint 27 8 OAD-petefészek-karcinómasej tek.
A pXEPO-10- és pXEPO-ll-plazmidokat módosíthatjuk oly módon, hogy a normális vagy mutáns dhfr-gént beépítjük a plazmidok egyedi HindlII-hasítóhelyébe. Miután a HT1080sejteket a megfelelő DNS-sel transzfektáltuk, kiválasztjuk a neo-gén által kiváltott G418-rezisztenciát hordozó sejteket, ezek közül a sejtek közül azonosítjuk azokat, amelyekben a hEPO-gén aktiválódott a neo-, dhfr- és mMT-I• · ·
- 112 ···· ···· szekvenciákkal végrehajtott géncélzás útján, miáltal ezek a szekvenciák beépültek a megfelelő pozícióban a hEPO-géntől 5' -irányban, majd a kiválasztott sejteket lépésenként szelektáljuk egyre nagyobb mennyiségű metotrexáttal (MTX) és ily módon szelektálunk a dhfr-gén amplifikálódására, valamint a kapcsolt neo-, mMT-I- és hEPO-szekvenciák amplifikálódására [ Kaufman, R.J.: Technique, 2, 221 (1990)] . A metotrexátos szelekciót lépésenként végezzük, a sejteket először kis koncentrációjú MTX-oldattal kezeljük (0,01-0,08 pmól/l), ezután lépésenként egyre nagyobb koncentrációjú MTX-oldatokkal történő kezelés történik, egészen 250 gmól/l MTX-koncentrációig, vagy annál is nagyobb értékig. Hatásos például egy olyan amplifikációs módszer, amely szerint az MTX-koncentrációt 0,04 és 0,08 gmól/l között lineáris lépésekben emeljük, ezután pedig az MTXkoncentrációt minden amplifikációs lépésben kétszeresre növeljük, ezzel az eljárással hatékonyan amplifikálhatunk transzfektált sejtvonalakat, de hatékonyan alkalmazható más olyan módszer is, amely szerint az MTX-koncentrációt az amplifikáció végéig egyenletesen kis mértékben növeljük. Az amplifikálódást a dhfr-gén kópiaszámának vizsgálatával követjük nyomon, és ellenőrzésképpen meghatározzuk az in vitro hEPO-expressziót is. A bemutatott stratégiával a hEPO-fehérje jelentős túltermelődését érhetjük el azáltal, hogy célzott módon módosítunk olyan szekvenciákat, melyek teljes mértékben a hEPO-kódoló régión kívül találhatók.
A hGH-expresszió humán sejtekben történő aktiválásának céljára készített konstrukciókhoz (l.f, l.h, l.i, • · ♦
- 113 l.k, 2. és 7. példák) hasonlóan előállíthatunk olyan konstrukciókat is, melyekbe a dhfr-gént abból a célból építjük be, hogy hGH-proteint túltermelő sejteket állítsunk elő, nem kódoló szekvenciák megcélzása és azt követő amplifikáció útján.
4. példa
A humán EPO-lókusz megcélzása és aktiválása halhatatlanná tett humán fibroblaszt sejtvonalban
A ρΧΕΡΟ-13-célzó konstrukciót abból a célból állítottuk elő, hogy megvizsgáljuk, hogy az endogén hEPO-gén aktiválható-e egy humán fibroblaszt sejtben. Először a pT22.1-plazmidot állítottuk elő, amely a hEPO-gén 1. kódonjától 5'-irányban található 63 bázispáros genomi eredetű hEPO-szekvenciát tartalmazta, az egéreredetű metallotionein-l-promóterhez (mMT-I-promóter) kapcsolva. Az mMT-I- és hEPO-szekvenciák fuzionálását PCR-eljárással hajtottuk végre, a 22.1- és 22.4-jelű oligonukleotidok alkalmazásával. A láncindító oligonukleotidok sajátságai a következők: a 22.1-jelű oligonukleotid egy 21 bázishosszúságú oligonukleotid, amely az mMT-I-génben található Kpnlhelytől 28 bázispárnyira 5' -irányban kezdődő mMT-Ipromóterszegmenssel homológ; a 22.2- és 22.3-jelű oligonukleotidok 58-tagú komplementer láncindítók, melyek alkalmasak a hEPO- és mMT-I-szekvenciák fúziójának létrehozására oly módon, hogy a fúziós termék 28 bázispárnyi hEPOszekvenciát tartalmaz, amely a hEPO-gén 1. kódonjától 35 bázisnyira 5' -irányban kezdődik, és tartalmazza a 22.2-jelű
- 114 «4 · * • «44« « « · a · · • t « · · · ·4 ·· · *· oligonukleotid 29. bázisától kezdődő mMT-I-szekvenciákat, melyek magukban foglalják az mMT-I-gén természetes BglIIhasítóhelyét, és a szekvencia az mMT-I-kódolószekvencia 30. bázisáig terjed; a 22.4-jelű oligonukleotid 21-tagú és a hEPO-gén 1. kódonjától 725 bázispárnyira 3' -irányban kezdődő hEPO-szekvenciákkal homológ. Az ismertetett láncindítók alkalmazásával egy olyan 1,4 kb-os DNS-fragmenst amplifikáltunk, amely a fent ismertetett mMT-I/hEPO-fúziót tartalmazta. A kapott fragmenst megemésztettük Kpnlenzimmel (a PCR-fragmens két KpnI-hasítóhelyet tartalmazott: egy egyedi KpnI-helyet az mMT-I-promóterrégióban és egy másik egyedi természetes KpnI-hasítóhelyet a hEPOszekvenciában), és az emésztett fragmenst tisztítottuk. A pXEPOl-plazmidot szintén megemésztettük KpnI-enzimmel, amelyből így egy 1,4 kb-os és egy 6,4 kb-os fragmens keletkezett. A 6,4 kb-os fragmenst izoláltuk, és hozzáligáltuk az 1,4 kb-os PCR-fúziós KpnI-fragmenshez. Az így kialakított konstrukciót pT22.1-plazmidnak neveztük el. Előállítottunk egy pT22.2-jelű második intermedier plazmidot is, oly módon,hogy a hEPO-struktúrgéntől 5' -irányban található körülbelül 6 kb-os HindlII/BamHI-fragmenst (lásd l.f példa) hozzáligáltuk a BamHI- és HindlII-enzimekkel emésztett pBSIISK+-plazmidhoz (Stratagene, La Jolla, Kalifornia). Előállítottunk egy harmadik intermedier plazmidot is, melynek jelzése pT22.3 volt, oly módon, hogy először kihasítottuk a pMCINEOPolyA-plazmidból (Stratagene, La JolLa, Kalifornia) az 1,1 kb-os Xhol/BamHI-fragmenst, amely a neomicin foszfotranszferáz gént tartalmazta. A fragmens után a DNS- 115 polimeráz-1 Klenow-fragmensével (New England, Biolabs) tompavégűvé alakítottuk. Ezt a fragmenst ezután hozzáligáltuk a HincII-enzimmel emésztett pBSIISKtplazmidhoz (melyet hasonlóképpen tompavégűvé tettünk a DNSpolimeráz-I alkalmazásával), és így állítottuk elő a pT22.3-plazmidot. A pT22.4-jelű negyedik intermedier plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pT22.3-plazmidból izoláltuk a neo-gént tartalmazó 1,1 kb-os XhoI/HindlIIfragmenst, és ezt a fragmenst beligáltuk az Xhol- és HindiiI-enzimekkel hasított pT22.2-plazmidba. Az elmondottak értelmében a pT22.4-plazmid a neo-gént közvetlenül az 5' -végi BamHI/HindlII-hEPO-fragmens HindiII-hasítóhelye szomszédságában tartalmazza. Végül előállítottuk a pXEPO13-plazmidot oly módon, hogy először a pT22.1-plazmidból kihasítottuk a 2,0 kb-os EcoRI/AccI-fragmenst. Ennek a fragmensnek az EcoRI-hasítóhelye az mMT-I-promóter 5' -végét határozza meg, a fragmens Accl-hasítóhelye pedig a hEPO-gén
5. exonjában található. Az izolált AccI/EcoRI-fragmens tehát egy csaknem teljes hEPO expressziós egységet tartalmaz, amelyből csak az 5. exon egy darabja hiányzik, valamint a természetes poliadenilációs szignál. Ezt a 2,0 kb-os EcoRI/AccI-fragmenst tisztítottuk, a DNS-polimeráz Klenowfragmensével tompavégűvé alakítottuk, majd beligáltuk az Xhol-enzimmel emésztett, tompavégűvé alakított pT22.4plazmidba.
A Pvul- és BamHI-enzimekkel emésztett pXEPO-13plazmiddal HT1080-sejteket transzfektáltunk. Az ily módon emésztett pXEPO-13-piazmidból három fragmens keletkezik:
- 116 ···· · · · · • · · egy 1 kb-os vektorfragmens, amely az amp-gén egy részletét tartalmazza, egy 17 kb-os fragmens, amely a további vektorszekvenciákat tartalmazza, és keletkezik egy közel 9 kb-os fragmens, amely a hEPO-, neo- és mMT-I-szekvenciákat tartalmazza. Ez a körülbelül 9 kb-os BamHI/Pvul-fragmens a
BamHI-től kiindulva a következő szekvenciarészleteket tartalmazza: körülbelül 5,2 kb-nyi 5' -végi hEPO-genomi szekvencia, az 1,1 kb-os neo transzkripciós egység, a 0,7 kb-os mMT-I-promóter és a 2,0 kb-os, 5. exonban csonkolt hEPO kódoló szekvenciát tartalmazó fragmens. Az említett módon emésztett pXEPO-13-plazmid 45 gg-ját 12 millió sejt elektroporálására használtuk (az elektroporálást az l.b példában hajtottuk végre). Az elektroporálást 8-szor megismételtük, és ily módon összesen 96 millió sejtet elektroporáltunk. A sejteket ezután tápközeggel kevertük össze, és így olyan sejtszuszpenziót állítottunk össze, mely ml-ként 1 millió sejtet tartalmazott. A sejtszuszpenziót 1 ml-ként szétosztottuk 96 db 150 mm átmérőjű szövettenyésztő csészébe (Falcon), melyek mindegyike minimálisan 35 ml 15% borjúsavóval kiegészített DMEMtápközeget tartalmazott. A következő napon a tápközeget a sejtekről eltávolítottuk, és friss tápközeggel helyettesítettük, amely tartalmazott 0,8 mg/ml G418-at is (Gibco). 10 nap inkubálást követően a csészékben található tápközegekből mintát vettünk, és a mintákat ELISA-eljárással (R&D Systems) megvizsgáltuk hEPO-expresszióra. A 96 csésze közül 6 tartalmazott legalább 10 mE/ml hEPO-t. A tenyésztőcsészék egyikét, a 18-as számút, kiválasztottuk hEPO-expresszáló • · ·
- 117 kiónok tisztítása céljából. Az említett 96 tenyésztőcsésze mindegyike körülbelül 600 db G418-rezisztens kiónt tartalmazott (96 tenyésztőcsészében összesen tehát körülbelül
57600 G418-rezisztens klón volt található) . A 18-as számú csészében található körülbelül 600 kiónt tripszinnel kezeltük, majd 50 sejt/ml sűrűséggel újraszélesztettük egy 364 rekeszes tenyésztőtálcába (Sterilin). Egy hét inkubálás után a 364 rekeszes tenyésztőtálca nagyméretű rekeszeiben egyenként körülbelül 10-10 különálló kolónia volt látható (az említett tenyésztőtálcák 24 nagyméretű rekeszt tartalmaznak, és azokon belül 16-16 kisméretű rekeszt). Ebben az időpontban minden egyes rekeszt megvizsgáltunk hEPOexpresszióra. A nagy rekeszek közül kettő tápközege tartalmazott legalább 20 mE/ml hEPO-t. Az A2-jelű rekeszben 16 kiónt találtunk, melyek a 16 kis rekesz között oszlottak meg. A kis rekeszekben található valamennyi kiónt tripszinnel kezeltük, és a sejteket átvittük egy 96 mérőhelyes mikrotiter tálca különböző mérőhelyeibe. A sejteket ezután hét napig inkubáltuk, majd a különböző mérőhelyekben található tápközegekből mintákat vettünk, és azokat ELISAvizsgálattal analizáltuk hEPO-expresszióra. Csak egyetlenegy mérőhelyben - a 10-es számúban - találtunk hEPO-termelő sejteket. Ezt a sejttörzset HT165-18A2-10-jellel láttuk el, és tenyészetben elszaporítottuk kvantitatív hEPO-analízis, RNS-izolálás, és DNS-izolálás céljára. A hEPO-termelés kvantitatív meghatározása alapján a következő értéket kaptuk: 2500 mE/millió sejt/24 óra.
- 118 A HTl65-18A2-10-sejtekből izolált RNS-t egy 0,2 kbos DNS-próba alkalmazásával vizsgáltuk, melynek szekvenciája a hEPO-gén 5. exonjában található Accl-hasítóhelytől a 3' -nem-transzlálódó régióban található BglII-hasítóhelyig tartott. A pXEPO-13-jélű célzó konstrukció, amely az 5. exonban található Accl-hasítóhelyen csonkolva van, nem tartalmazza ezeket az AccI/BglII-szekvenciákat, ezért az alkalmazott DNS-hibridizációs próba alkalmas a célzó konstrukció hEPO-lókuszba történő célba jutásának kimutatására. Csak azok a sejtek képesek az AccI/BglII-szekvenciákkal homológ szekvenciájú hEPO-mRNS-t termelni, melyekben a célzó konstrukció homológ módon rekombinálódott a természetes hEPO-szekvenciákkal. A HT165-18A2-10-sejttörzsről kimutattuk, hogy olyan mRNS-t expresszál, melynek mérete megegyezik a várttal, és Northern-blot kísérletekben hibridizálódik a 32-P-jelzett AccI/BglII-hEPO-próbával. Restrikciós enzimes és Southern-blot analízissel kimutattuk, hogy a neo-gén és az mMT-I-promóter célzott rekombinációval beépült a hTl65-18A2-10-sejtek két hEPO-allélje közül az egyikbe.
Ezek az eredmények igazolják, hogy a homológ rekombináció jelensége felhasználható valamely olyan gén szabályozó régiójának megcélzására, amely normálisan nem expresszálódik humán fibroblasztokban, és ily módon megvalósíthatón a kiválasztott gén funkcionális aktiválása.
• ·
- 119 • · · · · · · * « · · · · ········ ·· · ·· ·
22.1 5' -CACCTAAAAT GATCTCTCTG G (szekv.az.szám: 14)
22.2 5' -CGCGCCGGGT GACCACACG GGGGCCCTAG ATCTGGTGAA
GCTGGAGCTA CGGAGTAA (szekv.az.szám: 15)
22.3 5' -TTACTCCGTA GCTCCAGCTT CACCAGATCT AGGGCCCCCG
GTGTGGTCAC CCGGCGCG (szekv.az.szám: 16)
22.4 5' -GTCTCACCGT GATATTCTCG G (szekv.az.szám: 17)
5. példa
Intronmentes gének előállítása
A géncélzást felhasználhatjuk arra is, hogy intronmentes, processzált géneket állítsunk elő, amelyek alkalmasak élesztőbe vagy baktériumba juttatásra, génexpresszió céljából, valamint in vitro fehérjetermelésre. Az alább ismertetett eljárás például alkalmas hGH élesztőben történő termeltetésére.
Két különböző célzó konstrukciót állítunk elő. Az első célzó konstrukció (TC1) tartalmaz egy retrovirális LTR-szekvenciát, például a Moloney-féle egér leukémiavírusból (MoMLV) származó LTR-szekvenciát, egy humán sejtek szelektálására alkalmas markergént (például a TN5transzpozonból származó neo-gént), egy élesztősejtek szelektálására alkalmas markergént (például az élesztőeredetű URA3-gént), egy olyan szabályozó régiót, amely képes élesztőben gének expresszióját vezérelni (például a GAL4promóter) , és adott esetben egy olyan szekvenciát, amely a
- 120 • · · · hGH-génhez fuzionálva lehetővé teszi a hGH élesztősejtekből történő szekretálódását (szignálszekvencia). A vektor tartalmazhat olyan DNS-szekvenciát is, amely lehetővé teszi a retrovírus-részecskék humán sejtekben történő becsomagolódását. A konstrukciót úgy hozzuk létre, hogy a fent felsorolt szekvenciákat mindkét oldalról genomi eredetű hGHszekvenciák szegélyezzék, melyek a genomi hGH-N-gén szekvenciájával történő homológ rekombináció útján képesek beépíteni a TTl-konstrukcióban található exogén szekvenciákat közvetlenül a hGH-N-gén 1. kódonjától 5' -irányban (amely kódon az érett, processzált protein első aminosavát kódolja) . Az említett célzó konstrukció integrálódását követően a különböző szekvenciaelemek sorrendje a következő lesz: 5' -végi és szabályozó hGH-szekvenciák, neo-gén, LTR, URA3gén, GAL4, élesztő szignálszekvencia, valamint az érett hGH-fehérje első aminosavát kódoló és attól 3' -irányban található szekvenciák. A 2. célzó konstrukció (TC2) a következő szekvenciaösszetevőket tartalmazza: a plazmid élesztőben történő replikálódásához szükséges szekvenciák (például
2-mikronos- vagy ARS-szekvenciák) , élesztőeredetű transzkripciós terminációs szekvencia, virális LTR-szekvencia, valamint egy humán sejtek szelektálására alkalmas markergén (például a bakteriális gpt-gén) . A konstrukciót úgy állítjuk elő, hogy a fent felsorolt szekvenciákat mindkét oldalról genomi eredetű hGH-szekvenciák szegélyezzék, melyek a genomi hGH-N-gén szekvenciájával történő homológ rekombináció útján képesek a TC2-ben találhatón exogén szekvenciákat közvetlenül a hGH-N-gén stopkódonjától közvetlenül 3'• · «
- 121 irányban beintegrálni. A TC2-konstrukció beépülését követően a szekvenciaelemek sorrendje a következő lesz: az 5. hGH-exonból származó szekvenciák, élesztőeredetű transzkripciós terminációs szekvenciák, élesztőplazmid-eredetű replikációs szekvenciák, LTR, gpt-gén, a hGH-gén 3' -végi nem-transzlálódó szekvenciái.
A TC1- és TC2-konstrukciókból kialakított lineáris fragmenseket egymást követően juttatjuk célba a megfelelő pozíciókba, melyek a hGH-gént szegélyezik. Amennyiben az ilyen sejteket helper retrovírussal felülfertőzzük, a megcélzott régión keresztül haladó, LTR_által vezérelt transzkripció olyan RNS-t fog eredményezni, melynek mindkét végén
LTR-szekvenciák lesznek találhatók. Az említett RNS érése („splicing) során olyan molekula fog keletkezni, amelyből a normális hGH-intronok el lesznek távolítva. A processzált transzkriptum reverz transzkripciója olyan kettősszálú DNSkópiák felhalmozódását fogja eredményezni, melyek a proceszszált hGH fúziós gént fogják tartalmazni. Ezután a kétszeresen megcélzott retrovirálisan fertőzött sejtekből DNS-t izolálunk, és a DNS-t olyan enzimmel hasítjuk, amely a transzkripciós egységen belül egyszer hasít, az LTRrégióban. Az emésztett DNS-t ezután olyan körülmények között ligáljuk, melyek kedveznek a cirkularizációnak, a ligátumot élesztősejtekbe juttatjuk, és a sejteket ezt követően URA3-gén jelenlétére szelektáljuk. A szelekciós körülmények között csak azok a sejtek képesek növekedni, melyek felvették az URA3-gént (amely hozzá van kapcsolódva a TC1- és TC2-konstrukciók által bejuttatott szekvenciákhoz,
- 122 • · • · · valamint a processzált hGH-génhez. Az ilyen sejtek olyan plazmidot tartalmaznak, melyek galaktóz indukcióra hGHproteint expresszálnak, és a hGH-proteint a sejtekből a fuzionáltatott élesztőeredetű szignálszekvencia következtében szekretálják, amely szignálszekvencia a szekréció során lehasad, és ily módon az érett, biológiailag aktív hGHmolekula keletkezik.
Bakteriális sejtekben történő expresszió céljára a TC1- és TC2-konstrukciókban egyszerűen kicseréljük az élesztőeredetű URA3-gént a ampicillinrezisztencia-génre, pBR322-plazmidból izolált az élesztőeredetű GAL4promótert a tac-promóterre [ deBoer és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 21 (1983)] , az élesztőeredetű szignálszekvenciát egy bakteriális szignálszekvenciára, a 2-mikronos kör- vagy ARS-szekvenciát a pBR322-plazmid replikációs origójára, és az élesztőeredetű transzkripciós terminációs szekvenciát egy bakteriális terminációs szekvenciára [ például a trpA transzkripciós terminátorára; Christie,
G.E. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 4180 (1981)] . A fent leírtakhoz hasonló módon hEPO-t is expresszálhatunk élesztő- vagy baktériumsejtekben oly módon, hogy a hGH-t célzó szekvenciákat egyszerűen kicseréljük hEPO-t célzó szekvenciákra, úgy, hogy az élesztőeredetű vagy bakteriális szignálszekvencia közvetlenül a hEPO 1. kódonjától (amely az érett, processzált fehérje 1. aminosavát kódolja) 5' irányban helyezkedjék el.
• ·
- 123 6. példa
Az EPO-gén aktiválása és amplifikálása halhatatlanná tett humán sejtvonalban
Amennyiben a pXEPO-13-plazmid egyedi HindlIIhasítóhelyére beépítjük a dhfr-expressziós egységet (lásd 4. példa), olyan új célzó vektort kapunk, amely kétszeres szelekciót tesz lehetővé, és lehetővé válik olyan sejtek szelektálása is, melyekben a dhfr-gén amplifikálódott. A pXEPO-plazmidban található egyedi HindlII-hasítóhely a neogén és a humán EPO-géntől természetes állapotban 5' irányban található genomi szekvenciák kapcsolódási pontján helyezkedik el. Amennyiben a dhfr-gént erre a helyre beépítjük, egy olyan konstrukciót kapunk, amelyben a neo- és dhfr-gének körülveszik a természetes hEPO-lókuszból származó DNS-szekvenciákat. A pXEPO-13-plazmid, valamint annak dhfr-gén beépítése útján előállított származékai alkalmasak a hEPO-lókusz homológ rekombináció útján történő megcélzására. A 6. ábrán bemutatunk egy ilyen konstrukciót, melyet pREP0-4-nek neveztünk el. Ez a plazmád tartalmazza a humán EPO-gén első négy exonját, valamint 5. exonjának egy részletét, valamint a hEPO-kódoló régiótól 5' -irányban található HindlII/BamHI-fragmenst. A pSVe-, pTK- és pmMT-Ijelölések sorrendben a következő régiókból származó promótereket jelölik: SV4C korai régiók, herpesz szimplex vírus (HSV), timidin kináz (tk) gén és egéreredetű metallotionein-I-gén. A bemutatott plazmidot a következőképpen állítottuk elő: izoláltuk a HindlII-enzimmel emésztett pXEPO-13-plazmidot, és a DNS-polimeráz-I Klenow- 124 -
fragmensével tompavégűvé alakítottuk. A dhfr-expressziós egységet úgy állítottuk elő, hogy a pF8CIS9080-jelű plazmid konstrukciót [Eaton és mtsai.: Biochemistry, 25, 8343 (1986)] megemésztettük EcoRI- és Sall-enzimekkel. Ezután izoláltuk a dhfr-expressziós egységet tartalmazó 2 kb-os fragmenst, majd azt DNS-polimeráz-I Klenow-fragmensével tompavégűvé alakítottuk. Ezt a dhfr-t tartalmazó fragmenst a pXEP0-13-plazmid tompavégűvé alakítottuk HindlIIhasítóhelyébe ligáltuk. A ligációs elegy egy részletét E. coli sejtekbe transzformáltuk, és a transzformált sejteket ampicillin-tartalmú szelekciós táptalajra szélesztettük. Egy éjszakán át történő 37 °C-os inkubálást követően egyedi baktériumklónokat izoláltunk, azokat új táptalajra vittük át és növesztettük. Az így kapott tenyészetekből miniplazmid-preparátumokat készítettünk, és a kapott plazmid-DNS-eket megemésztettük először BglI- és HindlIIenzimekkel, majd Sfil-enzimmel, a beépült dhfr-fragmens orientációjának meghatározása céljából. Az egyik plazmidpreparátum a megfelelő orientációban tartalmazta a 2 kb-os dhfr-fragmenst. Ebben a plazmidban a dhfr-expressziós egység transzkripciójának iránya a szomszédos neo-gén transzkripciójáéval ellentétes. Az így előállított konstrukciót neveztük pREPO-4-plazmidnak.
A pREP0-4-plazmid alkalmazásával először aktiváltuk az endogén hEPO-gént homológ rekombináció útján, majd amplifikáltuk a hEPO-lókuszt. Amennyiben ezzel a konstrukcióval génaktiválást hajtunk végre, lehetővé válik a fokozott dhfr-expresszióra történő szelektálás metotrexát (MTX) • · • ·
- 125 - .............
alkalmazásával. A megnövekedett mértékű dhfr-expresszió általában együtt már a gén kópiaszámának DNS-amplifikáció útján történő megnövekedésével. Az amplifikáció eredménye az lesz, hogy az aktivált hEPO-gén együtt amplifikálódik a dhfr-szekvenciákkal. Az EPO-lókusz ko-amplifikációja az EPO-expresszió mértékének fokozódását eredményezi.
A pREPO-4-konstrukcióval a géncélzási kísérleteket HT1080-sejtekben hajtottuk végre. Izoláltunk egy hEPO-t expresszáló HTREPO-52-jelű sejtvonalat. Kvantitatívan meghatároztuk, hogy ez a sejtvonal mennyi EPO-t termel, és a sejteket Southern- és Northern-blot analízissel is megvizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a géncélzást követően a sejtekbe egy kópia dhfr/neo/mMT-I-egység épült be. 0,8 ml/mg G418cal végrehajtott szelekció során az expressziós szint körülbelül 1300 mE/millió sejt/nap volt. Mivel a megcélzott EPO-lókusz tartalmazott egy dhfr-expressziós egységet is, lehetővé vált a dhfr-gén fokozott mértékű expressziójára szelektálni, a metotrexát nevű antifolát hatóanyaggal. A sejttörzset tehát lépésenkénti szelekciónak vetettük alá, 0, 02, 0, 05, 0, 1, 0,2 majd 0,4 μιηόΐ/l MTX alkalmazásával. A sejttörzs kezdeti szelekciójának eredményét a 4. táblázatban foglaljuk össze és a 7. ábrán mutatjuk be.
• «
- 126 4. táblázat
Sejtvonal· MTX (μιηόΐ/ΐ) mE/millió sejt/24 óra
52C20-5-0 0 1368
52C20-5-.01 0, 01 1744
52C20-5-.02 0, 02 11643
52C20-5-0.05 0,05 24449
52-3-5-0.10 0,1 37019
52-3-2-0.20 0,2 67867
52-3-2-0.4B 0,4 99919
A táblázat adataiból látható, hogy a fokozódó menynyiségű MTX-szel végrehajtott szelekció sikeres volt a hEPO-expresszió mértékének fokozására a HTREPO-52-sejtvonal esetén, mivel a 0,4 μιηόΐ/l metotrexátra rezisztens sejtvonal 70-szeres mértékben termelt EPO-t. A hEPO-lókusz amplifikálódását Southern-blot analízissel igazoltuk az MTX-rezisztens sejtvonalban, mely analízissel kimutattuk, hogy ebben a sejtvonalban a szülői (célzó konstrukciót nem tartalmazó) sejtvonalhoz képest a hEPO-lókusz körülbelül
10-szeresen amplifikálódott.
7. példa
Egy hEPO fúziós gén előállítása a CMV-promóter hEPO kódoló régiótól 1,8 kb-nyira 5' -irányban történő beépítése útján
A pREPO15-jelű célzó plazmid előállítása
A pREPO15-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy elő- 127 • · ·«· · • · · · « ········ ·· · ·· szőr PCR-amplifikáció útján a CMV-promótert fuzionáltattuk a hGH-gén 1. exonjával. Egy 1,6 kb-os fragmenst amplifikáltunk a pXGH308-jelű hGH-expressziós konstrukcióból kiindulva, mely konstrukció a következő szekvenciaelemeket tartalmazta: a „GenBank adatbázis HS5MIEP-szekvenciájának 546-2105. nukleotidjai közötti CMVpromóter régiót, hozzáfúzionálva a „GenBank adatbázis HUMGHCSA-szekvenciájának 5225-7322. nukleotidjai közötti hGH-szekvenciákhoz. Az amplif ikációt a 25. és 35. oligonukleotidok alkalmazásával hajtottuk végre. A 20. oligonukleotid (35-tagú, szekv.az.szám: 18) a CMV-promóter CAP-helyétől számított -614. nukleotiddal kezdődő szekvenciához hibridizálódott („GenBank, HEHCMVPl-szekvencia), és tartalmazott egy Sall-hasítóhelyet az 5' -végén. A 35. oligonukleotid (42-tagú, szekv.az.szám: 19) a CMV-promóter + 966. nukleotidj ához és az azt követő szomszédos 1. hGHexonhoz hibridizálódott, és tartalmazta a hEPO 1. intronjának első tíz bázisát (amely tartalmazta a „splicedonor hely egy részletét, valamint egy HindiII-hasítóhelyet az 5' -végén. A kapott PCR-fragmenst megemésztettük HindlIIés Sall-enzimekkel és gélből tisztítottuk. A pT163plazmidot (2. példa) megemésztettük Xhol- és HindlIIenzimekkel és a neo-expressziós egységet tartalmazó közelítőleg 1,1 kb-os fragmenst gélből tisztítottuk. Ezután az
1,6 kb-os CMV-promóter/hGH-I-exon/„splice-donor helyfragmenst és az 1,2 kb-os neo-fragmenst összeligáltuk, és a kapott fragmenst beépítettük a pBSIISK+-plazmid (Stratagene, Inc.) HindlII-hasítóhelyébe. Az így előállí·· ··♦·
- 128 tott intermedier plazmid (pBNCHS) a neo-expressziós egységet a CMV-promóter/hGH-I-exon/„splice-donor hely fragmenssel ellentétes transzkripciós orientációban tartalmazta. Előállítottunk egy pREPO5AHindIII-jelű második intermedier plazmidot is, úgy, hogy először a pREP05plazmidot megemésztettük HindlII-enzimmel. Az emésztés következtében két fragmens keletkezett, egy 1,9 kb-os és egy
8,7 kb-os, és az EPO-eredetű célzó szekvenciákat tartalmazó
8,7 kb-os fragmenst gélből tisztítottuk, majd önmagához történő ligálással cirkularizáltűk. A kapott pREP05AHindIII-plazmid csak nem kódoló genomi eredetű DNSszekvenciákat tartalmazott, melyek normálisan a hEPO-géntől 5' -irányban találhatók. Tartalmazta többek között az 1. EPO-exonhoz képest -5786. és -1. nukleotidok közötti szekvenciát. Ezután a pBNCHS-plazmidból HindlII-emésztéssel kihasítottuk a 2,8 kb-os fragmenst, amely a következő szekvenciákat tartalmazta: neo-gén, CMV-promóter, 1. hGH-exon, „splice-donor hely, és a fragmenst gélből tisztítottuk. Ezt a fragmenst a DNS-polimeráz-I enzim Klenow-fragmensével (New England Biolabs Inc.) tompavégűvé alakítottuk, majd beligáltuk a BglII-vel hasított és tompavégűvé alakított pREPO5AHindIII-plazmidba. A BglII-enzim a pREPO5AHindIIIplazmidot a hEPO 1. exonjától 5' -irányban a -1779. pozícióban hasítja. A kapott konstrukció - jele pREPO15 (8. ábra) - a következő szekvenciákat tartalmazza: a hEPO-kódoló régióhoz képest -5786. és -1779. nukleotidok közötti 5'végi EPO-szekvenciák, neo-expressziós egység, CMV-promóter, 1. hGH-exon, „splice-donor hely, valamint a hEPO-kódoló «·« · régióhoz viszonyítva -1778. és -1. nukleotidok közötti szekvencia. A felsorolt szekvenciaeleinek a plazmidban az 5' -végi hEPO-régióhoz viszonyítva a felsorolás sorrendjében 5' —> 3' -irányban helyezkednek el. Humán sejtek transzfektálása céljára a pREPO15-konstrukciót Not-I- és Pvu-I-enzimekkel hasítottuk, és ily módon abból egy 8,6 kbos célzó fragmens szabadult fel. A célzó fragmens tartalmazott egy első és egy második célzó szekvenciát, melyek mérete sorrendben 4,0 kb és 1,8 kb volt. A célzó szekvenciák a hEPO-géntől 5' -irányban található szekvenciarészletekkel voltak homológok.
Sejttenyésztés, transzfektálás, és az EPO-t expresszáló, célzott rekombinációt tartalmazó klónok azonosítása
A sejteket 37 °C-on 5% CO2 atmoszférában és 98% nedvességtartalom mellett 10% borjúsavót tartalmazó DMEM táptalajban tartottuk fenn (DMEM/10, HyClone Laboratories). A másodlagos humán fitymafibroblasztok transzfektálását 12szer 10° sejt elektroporálásával végeztük PBS-pufferben (Gibco), 100 μg DNS-sel, 250 V és 960 μΕ értékek mellett. A kezelt sejteket 150 mm átmérőjű csészékbe szélesztettük lxlO6 sejt/csésze sűrűséggel. Az elektroporációt követő napon a tápközeget lecseréltük 0,8 mg/ml G418-at (Gibco) tartalmazó DMEM/10 táptalajra. A sejtek szelektálása 14 napig tartott, és ezalatt az idő alatt a tápközegből mintákat vettünk az EPO-termelés meghatározására. Azokat a kiónokat, melyek jelentős mennyiségű hEPO-t termeltek (> mint 5 mE/ml) - EPO-ELISA-eljárással (Genzyme Inc.) meghatározva steril üvegből készült klónozó hengerekkel izoláltuk a te• · I. »r « · 9 9
- · *«♦
- 130 ,·«*·«·· « · * · » nyésztőcsészékből (Bellco), majd egy 96 mérőhelyes mikrotiter tálca különböző mérőhelyeibe vittük át a kiónokat. Ezután a kiónokat 1-2 napig inkubáltuk, majd a kiónokat tartalmazó mérőhelyeket ELISA-eljárással megvizsgáltuk hEPO-termelésre. A kapott hEPO-termelő sejttörzseket tenyészetben elszaporítottuk fagyasztás, nukleinsav izolálás és az EPO-termelés mennyiségi meghatározása céljára.
A HT1080-sejtek (ATCC CCL 121) transzfektálását úgy hajtottuk végre, hogy 12xl06 sejtet PBS-pufferben (Gibco) 45 gg DNS-sel kezeltünk 450 V és 250 gF értékek mellett. A sejtek tenyésztését és a termelő kiónok azonosítását ugyanúgy végeztük, ahogy azt a korábbiakban másodlagos humán fityma fibroblasztok esetén leírtuk. A hEPO-t termelő klonális sejtvonalakat határhígításos eljárással izoláltuk. Ezt úgy végeztük, hogy a kezdeti szelekciós tenyésztőcsészékből a kiónokat egy 24 rekeszes tenyésztőtálcába vittük át, rekeszenként 10-15 klón sűrűséggel. A hEPO-t termelő rekeszekből a kiónokat átvittük egy 96 mérőhelyes mikrotiter tálca mérőhelyeibe, < 1 klón/mérőhely sűrűséggel. A különálló kiónokat további analízis céljára elszaporítottuk, a humán fitymafibroblasztok esetén leírtak szerint .
Az EPO-termelő kiónok jellemzése hEPO-kódoló szekvenciák nem azmidban található neo/CMVdonor-célzó konstrukcióval exonját, megindul a hEPOA pREPO15-plazmidban találhatók. Amennyiben a pl promóter/1. hGH-exon/,, splice megcélozzuk a hEPO-gén 1.
expresszió, a transzkripció a CMV-promóterről iniciálódik, • ·
- 131 • · · · · · ········ ·· · ·· · és olyan elsődleges transzkriptum keletkezik, amely a következő szekvenciákat tartalmazza: CMV-szekvenciák, 1. hGHexon és „ splice-donor hely, 1,8 kb-nyi 5' -végi hEPOszekvenciák, normális hEPO-exonok, intronok és 3' -végi nemtranszlálódó szekvenciák. Az ismertetett transzkriptum érése során a hGH 1. exonjával szomszédos „splice-donor hely hozzá fog kapcsolódni a 3' -irányban található legközelebbi „splice-akceptor helyhez, amely a 2. hEPO-exon közvetlen szomszédságában található. Az ilyen kapcsolódás során egy új intron keletkezik, ami a következő szekvenciákat tartalmazza: a hEPO-géntől 5' -irányban található szekvenciák, a normális hEPO-promóter, az 1. hEPO-exon és az 1. hEPOintron. Az érett transzkriptumban az 1. hEPO-exon az 1. hGH-exonra fog cserélődni. Az 1. hEPO-exon csak az első 4 1/3 aminosavat kódolja a 26 aminosavhosszúságú szignálpeptidből, amely szignálpeptid a prekurzor proteinről a sejtekből történő szekréciót megelőzően lehasad. Az 1. hGHexon a hGH-szignálpeptidjének első 3 1/3 aminosavát kódolja, és ez a szignálszekvencia is lehasad a prekurzor proteinről a sejtekből történő szekréciót megelőzően. Amennyiben tehát egy olyan mRNS transzlálódik, amelyben az 1 . hGHexont helyettesíti az 1. hEPO-exont, olyan protein keletkezik, melynek szignálpeptidje egy hGH- és egy hEPOszekvenciákból összetevődő kiméra. Amennyiben ez a szignálpeptid a normális poszt transzlációs hasadás során eltávolitódik, olyan érett hEPO-molekula keletkezik, melynek elsődleges szekvenciája a természetes proteintől megkülönböztethetetlen .
• · • · · · · · · • · · · · · — 132 — ·.·· ···· *··* · ·.
A pREPO15-konstrukció humán fibroblasztokba történő transzfektálása azt eredményezte, hogy a sejtek EPOtermelőkké váltak. A humán fibroblasztokban és HT1080sejtekben pREP015-tel végrehajtott géncélzási kísérletek eredményeit az 5. táblázatban foglaljuk össze. A célba jutási gyakoriságot normális humán fibroblasztok esetén 1/264 G418r-klón értéknek találtuk, ugyanez a gyakoriság HT1080sejtek esetén 1/450 G418r-klón értékűnek adódott. Az előállított sejttörzsek hEPO-termelésének mértékét mennyiségileg meghatároztuk. A humán fibroblasztok transzfektálásával kapott egyik hEPO-termelő klón 7679. mE/106 sejt/nap hEPO-t termelt (5. táblázat). Egy HT1080-eredetű aktivált hEPOtermelő sejtvonal 12582 mE/106 sejt/nap hEPO-t termelt (5. táblázat) . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a hEPOlókusz aktiválását hatékonyan hajtottuk végre, és a hEPOtermelődés konstitutív módon, viszonylag nagy mértékben történt. Restrikciós enzimes és Southern-hibridizációs analízissel igazoltuk, hogy a hEPO-lókuszban célzott rekombináció történt .
Végrehajtottuk a pREP015-konstrukcióval célzott humán fibroblaszt és HT1080-klónok Southern-blot analízisét is. A 9. a ábrán bemutatjuk a kiindulási és a megcélzott hEPO-lókusz restrikciós térképét, a 9.b ábrán pedig egy humán fibroblaszt klón restrikciós enzimes és Southernhibridizációs analízisét láthatjuk. A hEPO-lókuszban bekövetkezett célzott rekombináció következtében a BglII/EcoRIés Bamhl-es emésztés sorrendben 5, 9 és 6,6 kb-os fragmenseket eredményezett (Tl-sávok). Mindkét említett • ·
- 133 • · · · · · ··<····· ·· « ·· · fragmens mérete annak a következménye, hogy egy 2,2 kb-os DNS-fragmens beépült, amely a neo-gént és CMVpromóterszekvenciákat tartalmazott. Mivel a két hEPO-allél közül csak az egyikben következett be célzott rekombináció, a célzott rekombinációt tartalmazó törzsekben - csakúgy, mint a kiindulási DNS-ben - megtalálható volt egy 4,3 kb-os (BglII/EcoRI) és egy 10,6 kb-os (BamHI) fragmens is, melyek a rekombinációt nem tartalmazó hEPO-lókuszból származtak.
Ezek az eredmények igazolják azt, hogy a hEPO-lókuszban olyan homológ rekombinációs esemény történt, amely egy új transzkripciós egység kialakulását eredményezte, amely transzkripciós egység képes volt humán eritropoietin termelődését előidézni.
5' -TTTTCTCGAG TCGACGACAT TGATTATTGA CTAGT (szekvenciaazonosító szám: 18)
5' -TTTTAAGCTT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT GGTGGATCCC GT (szekvenciaazonosító szám: 19)
5. táblázat
Humán sejtek transzfektálása a pREPO15-konstrukcióval, és a hEPO-expresszió aktiválása
Transzfek- “a1t sejttípus Kezelt sej - tek száma “Kapott G418r- klónok ’épT- expresszáló cseszek szar. a hEPO- expresszió klónok/G418r- klónok hEPű-expresz- száló klónok/ke- zelt sejtek “hEPl - expressz;: (raE /1:' sejt/24 óra,
Humán íibroblasz- tok 3,3xl07 264 1/264 1/3, 3xl07 7675
HT1080- sejtek 3,lxlO7 2700 6 1 /450 1/5,2x10* 12,582
- 134 • · · · · · · • · · · · · • · · · · · ······«· ·· · ·· · becsült érték, melyet úgy kaptunk, hogy a kiónokat két csészében megszámoltuk, az eredményt átlagoltuk, és a tenyésztő csészék teljes számára extrapoláltuk az értéket;
b a G418r-klónokat tartalmazó csészékből a tápközeget EPOELISA-analízisnek vetettük alá, és azokat a csészéket neveztük EPO-termelő kiónt tartalmazó csészének, amelyben az EPO-mennyiség nagyobb volt, mint 5 mE/ml;
c a hEPO-termelés mennyiségi meghatározását a HF342-15-jélű humán fibroblaszt-törzsből és a HTREPO15-l-6-6-jelű HT1080-eredetű sejtvonalban hajtottuk végre.
8. példa
Egy hEPO fúziós gén előállítása és amplif ikálása a CMVpromóter genomi hEPO kódoló régiótól 1,8 kb-nyira 5' irányban történő beépítése útján
A pREPO18-jelű célzó plazmid előállítása
A pREP018-plazmidot (10. ábra) úgy állítottuk elő, hogy a pREPO15-plazmidban található neo-gén 5'-végénél található Clal-hasítóhelybe beépítettük a dhfr-expressziós egységet. A dhfr-expressziós egységet úgy állítottuk elő, hogy a pF8CIS9080-jelű plazmidkonstrukciót [Eaton és mtsai.: Biochemistry, 25, 8343 (1986)] megemésztettük
EcoRI- és SálI-enzimekkel. Az emésztés után izoláltuk a dhfr-expressziós egységet tartalmazó 2 kb-os fragmenst, és a DNS-polimeráz-I Klenow-fragmensével tompavégűvé alakítottuk. Ezután a tompavégűvé alakított dhfr-fragmenshez Clallinkert ligáltunk (New England Biolabs) . A ligálási reakció termékét megemésztettük Clal-enzimmel,és a kapott fragmenst
- 135 a pREP015-plazmid Clal-helyébe ligáltuk. A ligálási reakcióelegy egy részletével E. coli sejteket transzformáltunk, majd a transzformált sejteket ampicillin-tartalmú szelekciós táptalajra szélesztettük. A kapott transzformáns kiónokat restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk, a beépült dhfr-fragmens orientációjának megállapítása céljából. Kiválasztottunk egy plazmidot, amelyben a dhfr-expressziós egység transzkripciójának orientációja a neo-génével ellentétes irányú volt, és ezt a plazmidot pREP018(-)-nak neveztük el. Egy másik plazmidot is kiválasztottunk, amelyben a dhfr-expressziós egység transzkripciós orientációja a neogénével megegyező volt, ezt a plazmidot pREP018(+)-nak neveztük .
Sejttenyésztés, transzfekció és EPO-t expresszáló, célzott rekombinációt tartalmazó kiónok azonosítása
A sejteket 37 °C-on 5%-os C02 atmoszférában 98% nedvességtartalom mellett 10% borjúsavót tartalmazó DMEMtápközegben (DMEM/10, HyClone Laboratories). A HT1080sejtek transzfektálását (ATCC CCL 121) 12xl06 sejt PBSpufferben (Gibco) történő kezelésével hajtottuk végre, a transzfektáláshoz 45 gg DNS-t használtunk és 450 V és 250 gF érték mellett végeztük. A kezelt sejteket 150 mm átmérőjű tenyésztőcsészékbe szélesztettük, lxlO6 sejt/csésze sűrűséggel. Az elektroporálást követő napon a tápközeget olyan DMEM/10-tápközegre cseréltük, amely tartalmazott 0,8 mg/ml G418-at is (Gibco). A szelekciót 14 napon keresztül végeztük, és a 14 nap elteltével a tápközeget hEPOtermelésre vizsgáltuk. A jelentős mennyiségű hEPO-t
- 136 (> 5 mE/ml) - hEPO-ELISA-val (Genzyme Inc.) meghatározva termelő csészékben a sejteket tripszinnel kezeltük, majd klónizolálás céljából újra szélesztettük őket. A hEPOtermelő klonális sejtvonalakat határhígításos eljárással izoláltuk, és a kiónokat először egy 24 rekeszes tenyésztőtálcára szélesztettük, rekeszenként 10-15 klón sűrűséggel. A hEPO-termelő rekeszekben található sejteket ezután kisebb, mint 1 klón/mérőhely sűrűséggel 96 mérőhelyes mikrotiter tálcákba szélesztettük. A termelő kiónokat elszaporítottuk fagyasztás, nukleinsavizolálás és a hEPOtermelés mennyiségi meghatározása céljára.
Amplifikált dhfr-szekvenciákat tartalmazó sejtek izolálása metotrexátos szelekcióval
A pREPO18-konstrukcióval transzfektált, célzott rekombinációt tartalmazó, hEPO-t termelő G418r-sejteket a transzfektálást követően különböző sűrűséggel szélesztettük, metotrexátos (MTX) szelekció céljára. Amint egy bizonyos MTX-koncentrációval végrehajtott szelekciót követően új kiónok keletkeztek, a kiónokat megvizsgáltuk hEPOtermelésre, majd különböző sejtsűrűséggel újraszélesztettük őket, és a szelekciót nagyobb MTX-koncentrációval folytattuk (általában az előző MTX-koncentráció kétszeresét alkalmaztuk) . Ezt az eljárást addig ismételtük, amíg elértük a kívánt mértékű hEPO-termelést. Minden egyes MTX-szelekciós lépés után a rezisztens klónokból DNS-t és RNS-t izoláltunk Southern- és Northern-blotos analízis céljára.
- 137 Az EPO-termelő kiónok, jellemzése
A dhfr-expressziós egységet két különböző orientációban tartalmazó pREP018-plazmidot HT1080-sejtekbe transzfektáltuk. A transzfekciót megelőzően a pREPO18( + )és pREPO18(-)-plazmidokat Xbal-enzimmel emésztettük, az emésztés következtében a plazmidból felszabadult egy 7,9 kb-os fragmens, amely sorrendben a következő szekvenciaelemeket tartalmazta: az 1. hEPO-exontól 5' -irányban található 2,1 kb-os genomi DNS-régió (a hEPO-gén ATGstartkódonjától számítva -3891. és -1779. nukleotidok közötti szekvencia), a dhfr-gént tartalmazó 2 kb-os régió, a neo-gént tartalmazó 1,1 kb-os régió, az 1. hGH-exonhoz fuzionált CMV-promótert tartalmazó 1,5 kb-os régió (az 1. hEPO-intron 10 bázispárja, amely tartalmaz egy „splice donor helyet), valamint az 1. hEPO-exontól 5'-irányban található 1,1 kb-os genomi DNS-régió (az EPO-gén ATGstartkódonjától számítva a -1778. és -678. nukleotidok közötti szekvencia). A transzfekciós és célzott rekombinációs gyakorisági értékeket két kísérlet vonatkozásában a 6. táblázatban foglaljuk össze. Ezekben a kísérletekben öt elsődleges G418r-klónt izoláltunk. Ezeket a kiónokat tenyészetben felszaporítottuk, a hEPO-expresszió mennyiségi meghatározása céljából (7. táblázat). Mivel a pREP018-konstrukció tartalmazta a dhfr-gént, lehetővé vált, hogy a 6. példában leírtak szerint MTX-szel végzett szelekció útján olyan sejteket izoláljunk, melyek a célzó konstrukciót megnövekedett kópiaszámban tartalmazzák. Azokat a G418*-klónokat, melyekről restrikciós enzimes és Southern-hibridizációs analízis- 138 sel igazoltuk, hogy a hEPO-lókuszban célzott rekombinációt tartalmaznak, a korábbiakban leírtak szerint MTX alkalmazásával lépésenkénti szelekciónak vetettük alá.
6. táblázat
A pREP018-konstrukció célba juttatása HT1080-sejtekben
Konstruk- ció Emésztő enzim Kezelt sejtek száma G418r- kiónok száma hEPO-t termelő csészék száma hEPO-t termelő kiónok/G4 18r-klónok Analizált elsődle- ges kiónok száma
pREPO18(-) Xbal 36x10* 16,980 39 1/435 1
pREPO18(+) Xbal 36x10° 19,290 41 1/470 4
7. táblázat hEPO-termelés pREP018-konstrukciót célzottan beépülve tartalmazó HT1080-sejtekkel
Sej tvonal Konstrukció hEPO-termelés (mE/10° sejt/24 óra)
18B3-147 pREPOl8 ( + ) 24759
18B3-181 pREPO18(+) 20831
18B3-145 pREPO18(+) 17856
18B3-168 pREPO18 ( + ) 5293
18A3-119 pREPO18(-) 2881
- 139 9. példa
Az endogén α-interferon-, GM-CSF-, GCS- és FSH-fi-gének. aktiválása és amplifikálása halhatatlanná tett humán sejtekben
A találmány szerinti eljárások és DNS-konstrukciók alkalmazásával számos endogén celluláris gén aktiválható és amplifikálható. Az alábbiakban olyan általános stratégiákat ismertetünk, melyek alkalmasak a humán a-interferon-gén (leukocita-interferon), a GM-CSF-gén (kolóniastimuláló faktor: granulocita/makrofág), a GCSF-gén (kolóniastimuláló faktor: granulocita) és az FSH3-gén (follikulusz-stimuláló hormon β alegysége) aktiválására és amplifikálására.
g-interferon
A humán α-interferon-gén („GenBank megjelölés: HUMIFNAA) egy 188 aminosav hosszúságú prekurzor proteint kódol, amely egy 23 aminosav hosszúságú szignálpeptidet tartalmaz. A génben intronok nem találhatók. A 11. ábrán vázlatosan bemutatunk egy stratégiát, ami alkalmas az ainterferon-gén aktiválására. A. célzó konstrukciót úgy tervezzük meg, hogy a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: a géntől 5' -irányban található szekvenciákkal homológ első célzó szekvencia, amplifikálható markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAP-hely, „splice-donor hely, intron, „splice-akceptor hely, valamint az első célzó szekvenciától 3' -irányban található szekvenciákkal homológ 2. célzószekvencia. A második célzó szekvenciának nem szabad a normális startkódonhoz viszonyítva a -107. nukleotidnál tovább nyúlnia, a nem kívánatos ATG- 140 ·· ·· ·«·. ·*·«« · » · ··« · « • · · · < · • ut «ι«· Β · · · < « startkódonok kialakulásának elkerülése végett.
A bemutatott célzó stratégia szerint az 1. és második célzó szekvenciák közvetlenül szomszédosak egymással a természetes célgénben, ez azonban nem szükséges, hogy így legyen (lásd alább). Az alábbiakban ismertetjük a konstrukcióban alkalmazható amplifikálható markergéneket és szelektálható markergéneket. Az amplifikálható markergén és a szelektálható markergén lehet ugyanaz a gén is, pozíciójuk a konstrukcióban felcserélhető, és egyikük vagy mindkettőjük elhelyezhető a célzó konstrukcióban található intronban is. A szelektálható markergén alkalmazása elhagyható, és az amplifikálható markergén alkalmazása csak abban az esetben szükséges, ha az aktivált gént amplifikálni is kívánjuk. A specifikus CAP-hely beépítése is elhagyható. Adott esetben a célzó konstrukcióban elhelyezhetünk egy másik génből származó exon-szekvenciákat is, a „splice-akceptor helytől 3' -irányban és a második célzó szekvenciától 5' -irányban. A szabályozó régiót, GAP-helyet, „splice-donor helyet, intront, és „splice-akceptor helyet összefüggő egységként is izolálhatjuk a humán elongációs Ια-faktor-génből (EF-la; „GenBank megjelölés: HUMEF1A) vagy a citomegalovírus közvetlen korai régiójából (CMV; „GenBank megjelölés: HEHCMVP1), de eljárhatunk úgy is, hogy a konstrukciót különböző génekből izolált megfelelő komponensekből állítjuk össze.
Az α-interferon-gén 5' -végi régiójának megfelelő genomi eredetű DNS-szekvenciákat célzó szekvenciaként szakember számára ismert eljárások alkalmazásával izolálhatjuk,
-141és ugyancsak ismert rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával összeállítható a célzó konstrukció is. Ahogy azt a korábbiakban már ismertettük, a célzó konstrukciókban számos szelektálható és amplifikálható markergént alkalmazhatunk, és a génaktiválás és amplifikálás számos különböző sejttípusban végrehajtható. Az elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán sejtek transzfektálása és az ainterferont termelő homológ rekombinációt tartalmazó sejtek izolálása végrehajtható a 4. példában bemutatott eljárások alkalmazásával, humán α-interferonra specifikus ELISAeljárás alkalmazásával (Biosource International, Camarillo, Kalifornia). Eljárhatunk úgy is, hogy a homológ rekombinációt tartalmazó sejteket az l.g és l.j példában leírtak szerint PCR-eljárással azonosítjuk. Az amplifikálható markergénből és az aktivált α-interferon-lókuszból sok kópiát tartalmazó sejteket a 6. példában leírtak szerint izolálhatunk .
A fentiek szerint előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejtekben egy olyan mRNS-prekurzor keletkezik, amely a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: exogén exon, „splice-donor hely, intron, „splice-akceptor hely, második célzó szekvencia, humán α-interferon-kódoló régió és 3' -végi nem-transzlálódó szekvenciák (11. ábra) . Az említett mRNS érése során olyan funkcionális mRNS fog keletkezni, melynek transzlációja során humán α-interferon keletkezik.
A beépített intron hosszúságát - és ezáltal a szabályozó régió és a gén kódoló régiója közötti távolságot • · • · · ·
- 142 ···· · · » · változtathatjuk, a szabályozó régió működésének optimalizálása céljából. A célzó konstrukcióba több exont is beépíthetünk. Azt is elmondhatjuk, hogy a második célzó szekvenciának nem muszáj közvetlenül az első célzó szekvencia szomszédságában, vagy annak közelében elhelyezkedni a normális génben, ilyen esetekben a gén természetes 5' -végi régiójából a homológ rekombináció következtében bizonyos részletek deléciót fognak szenvedni.
GM-CSF
A humán GM-CSF-gén („GenBank megjelölés: HUMGMCSFG) egy 144 aminosav hosszúságú prekurzor proteint kódol, amely tartalmaz egy 17 aminosav hosszúságú szignálpeptidet. A génben négy exon és három intron található, és a fehérjeprekurzor 50 N-terminális aminosavát az 1. exon kódolja. A 12. ábrán vázlatosan bemutatunk egy GMCSF-gén akvtiválására alkalmas célzási stratégiát. A bemutatott stratégia szerint a célzó konstrukció a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: a géntől 5' -irányban található szekvenciákkal homológ első célzó szekvencia, amplifikálható markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAP-hely, egy exon, amely a GM-CSF első ötven aminosavát vagy azzal funkcionálisan ekvivalens szekvenciát kódol, „splice-donor hely, valamint az első célzó szekvenciától 3' -irányban található szekvenciákkal homológ második célzó szekvencia. E szerint a stratégia szerint a homológ rekombinációt tartalmazó sejtek olyan mRNS prekurzort fognak termelni, amely a következő szekvencíaelemeket tartalmazza: exogén exon és „splice-donor hely, második célzó ····· · · · • · · · · · · • · · · · ········ ·· · ·· ·
- 143 szekvencia, a második célzó szekvencia és a GM-CSF-gén startkódonja közötti szekvenciák, a GM-CSF-gén exonjai, intronjai és 3' -végi nem-transzlálódó régiója (11. ábra). Az ismertetett mRNS érése során az exogén exon az endogén GM-CSF-gén 2. exonjához fog fuzionálódni, és az érett mRNS transzlációja GM-CSF-proteint fog eredményezni.
A bemutatott stratégia szerint az 1. és második célzó szekvencia egymással közvetlenül szomszédos a természetes célgénben, ez azonban nem szükséges, hogy így legyen (lásd alább). A korábbiakban már ismertettük a stratégia szerint alkalmazható amplifikálható markergéneket és szelektálható markergéneket. Az amplifikálható markergén és a szelektálható markergén lehet egyazon gén is, de pozíciójukat a konstrukción belül fel is lehet cserélni. A szelektálható markergén alkalmazása elhagyható, és az amplifikálható markergénre csak abban az esetben van szükség, ha az aktivált gént amplifikálni is kívánjuk. A szelektálható és/vagy amplifikálható markergént a „splicedonor hely és a második célzó szekvencia közé építhetjük be a célzó konstrukcióban. A specifikus CAP-hely beépítése elhagyható. A szabályozó régiót, a CAP-helyet és a „splicedonor helyet egyetlen egységként is izolálhatjuk a humán elongációs Ια-faktor génjéből (EF-Ια; „GenBank megjelölés: HUMEF1A) vagy a citomegalovírus közvetlen korai régiójából (CMV; „GenBank megjelölés: HEHCMVP1), de ezt a konstrukciót különböző génekből izolált megfelelő komponensekből is összeállíthatjuk (alkalmazhatjuk például az mMT-I-promótert és CAP-helyet, és a hGH- és hEPO-génekből izolált 1. exont
- 144 és egy „splice-donor helyet).
Alkalmazhatunk más megközelítési módokat is, az 1. és második célzó szekvencia például lehet homológ a GM-CSFgén 1. intronjában található szekvenciákkal is. Eljárhatunk úgy is, hogy az ot-interf erőn gén esetén leírt célzó konstrukcióhoz hasonló konstrukciót alkamazunk, amelyet úgy építünk fel, hogy első célzó szekvenciája a GM-CSF-géntől 5' irányban található szekvenciákkal legyen homológ, és a következő szekvenciaelemeket tartalmazza ezen kívül:
amplifikálható markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAP-hely, „splice-donor hely, intron, „splice-akceptor hely, valamint az első célzó szekvenciától 3'-irányban található szekvenciákkal homológ második célzó szekvencia.
A második célzó szekvencia semmilyen esetben sem szükséges, hogy a természetes génben közvetlenül szomszédos legyen az első célzó szekvenciával, vagy annak közelében legyen található, ilyen esetekben a természetes gén 5'-végi régiójából a homológ rekombináció következtében bizonyos részletek kiesnek. A célzó konstrukcióba beépíthetünk több nem-kódoló vagy kódoló exont is. A humán GM-CSF-gén intronrégióitól 5' -irányban található genomi DNSszekvenciákat szakember számára ismert rekombináns DNSeljárások alkalmazásával izolálhatunk, és a célzó konstrukció összeállítása is önmagukban ismert eljárások alkalmazásával történik. A korábbiakban elmondottak szerint a célzó konstrukciókban számos különböző szelektálható és amplifikálható markergént alkalmazhatunk, és a gének akti- 145 ···· · · · · válása számos különböző sejttípusban végrehajtható. Az elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán sejtek transzfektálását, valamint a homológ rekombinációt tartalmazó, GM-CSF-gént expresszáló sejtek izolálását a 4. példában leírt eljárások alkalmazásával hajthatjuk végre, egy humán GM-CSF-re specifikus ELISA-eljárás alkalmazásával (R&D Systems Minneapolis, MN) . Eljárhatunk úgy is, hogy a homológ rekombinációt tartalmazó sejteket PCR-es szkríneléssel azonosítjuk, a korábbiak leírtak szerint. Az ampiifikálható markergénből és az aktivált GM-CSF-lókuszból több kópiát tartalmazó sejteket a fent leírtak szerint izolálhatunk .
G-CSF
A humán G-CSF-gén („GenBank megjelölés: HUMGCSFG) egy 204-207 aminosavhosszúságú prekurzorproteint kódol, amely 30 aminosavhosszúságú szignálpeptidet tartalmaz. A gén 5 exont és 4 intront tartalmaz. Az 1 . exon a szignálpeptid első 13 aminosavát kódolja. A 13. ábrán vázlatosan bemutatunk egy G-CSF-gén aktiválására alkalmas célzó stratégiát. A célzó konstrukciót úgy tervezzük, hogy a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: a géntől 5' irányban elhelyezkedő szekvenciákkal homológ első célzó szekvencia, ampiifikálható markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAP-hely, a G-CSFszignálpeptid első 13 aminosavát, vagy azzal funkcionálisan ekvivalens aminosav-szekvenciát kódoló exon, „splice-donor hely, az első célzó szekvenciától 3' -irányban található szekvenciákkal homológ második célzó szekvencia. Az ismer• · ·
- 146 ···· ···· tetett stratégia szerint előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejtek egy olyan mRNS prekurzort termelnek, amely a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: exogén exon és „splice-donor hely, második célzó szekvencia, a második célzó szekvencia és a G-CSF-gén startkódonja között található szekvenciák, valamint a G-CSF-gén exonjai, intronjai és 3' -végi nem-transzlálódó régiója (13. ábra). Az említett mRNS érése következtében az exogén exon hozzáfuzionálódik az endogén G-CSF-gén 2. exonjához, és a molekuláról a transzláció során G-CSF-molekula fog termelődni. Az a lehetőség, hogy mód van a G-CSF-szignálpeptidjének első 13 aminosavját az exogén exon által kódolt aminosavakra cserélni, alkalmat ad arra, hogy a szignálpeptidben módosításokat hajtsunk végre, és így a termelt fehérje szekréciós sajátságait befolyásoljuk.
A bemutatott stratégia szerint a természetes génben az első és második célzó szekvencia közvetlenül szomszédos egymással, ez azonban nem szükségszerű. Nem szükséges, hogy a második célzó szekvencia közvetlenül szomszédos legyen a természetes génben az első célzó szekvenciával, vagy annak közelében legyen található. Ha a két célzó szekvencia nem közvetlenül szomszédos egymással, akkor a gén természetes régiójának bizonyos részletei a homológ rekombináció következtében deléciót fognak szenvedni. Az amplifikálható markergén és a szelektálható markergén lehet egyazon gén is, vagy pozícióikat fel is cserélhetjük. A szelektálható markergén alkalmazása elhagyható és amplifikálható markergén alkalmazására csak abban az esetben van szükség, • · · • · · · · · • · ·
- 147 ha az aktivált gént amplifikálni is kívánjuk. A szelektálható és/vagy amplifikálható markergént elhelyezhetjük a „splice-donor hely és a második célzó szekvencia közé is a célzó konstrukcióban. A specifikus CAP-hely beépítése elhagyható. A szabályozó régiót, CAP-helyet és a „splicedonor helyet egyetlen egységként is izolálhatjuk a humán elongációs Ια-faktor-génből (EF-Ια; „GenBank megjelölés: HUMEF1A) vagy a cítomegalovírus közvetlen korai régiójából (CEMV; „GenBank megjelölés: HEHCMVP1), de eljárhatunk úgy is, hogy a megfelelő komponenseket különböző génekből izoláljuk, majd összeépítjük (összeépíthetjük például az mMTI-promótert és CAP-helyet, valamint a hGH- vagy EPOgénekből származó 1. exont és „splice-donor helyet). A célzó konstrukcióba beépíthetünk több kódoló vagy nem kódoló exogén exont is, de úgy kell eljárnunk, hogy valamelyik beépített exon tartalmazzon egy ATG-startkódont, amely az mRNS érése során az érett fehérje kódoló régiójával azonos leolvasási fázisba kerül.
Alkalmazhatunk egyéb megközelítési módokat is, az első és második célzó szekvencia például homológ lehet a GCSF-gén 1. intronjában található szekvenciákkal is. Eljárhatunk úgy is, hogy az α-interferon esetén leírt célzó konstrukcióhoz hasonló konstrukciót állítunk elő, amely a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: a G-CSF-géntől 5'-irányban elhelyezkedő szekvenciákkal homológ első célzó szekvencia, amplifikálható markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAP-hely, „splice-donor hely, intron, „splice-akceptor hely, valamint az első célzó
- 148 szekvenciától 3' -irányban elhelyezkedő szekvenciákkal homológ második célzó szekvencia.
A humán G-CSF-gén 5' -végi vagy intronrégiójának megfelelő genomi eredetű DNS-szekvenciákat a szakember számára ismert rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával izolálhatunk, és a célzó konstrukció összeállítását is önmagukban ismert eljárások alkalmazásával végezzük. Amint azt a korábbiakban már leírtuk, számos szelektálható és amplifikálható markergént alkalmazhatunk a célzó konstrukciókban, és a gének aktiválását számos különböző sejttípusban megvalósíthatjuk. Az elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán sejtek transzfektálását, valamint a GCSF-gént expresszáló homológ rekombinációt tartalmazó sejtek izolálását a 4. példában leírtak szerint hajthatjuk végre, a humán G-CSF-re specifikus ELISA-eljárás alkalmazásával (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Eljárhatunk úgy is, hogy a homológ rekombinációt tartalmazó sejteket PCR-es szkríneléssel azonosítjuk a fent leírtak szerint. Az amplifikálható markergén és az aktivált α-interferon lókusz több kópiáját tartalmazó amplifikált sejteket szintén a korábbiakban leírtak szerint izolálhatjuk.
FSHE
A humán FSHh-gén („GenBank megjelölés: HUMFSH1) egy 129 aminosavat tartalmazó prekurzor proteint kódol, ami tartalmaz egy 16 aminosav hosszúságú szignálpeptidet is, a gén három exont és két intront tartalmaz, az 1. exon egy nem-kódoló exon. Az FSHB-gén aktiválását számos stratégia szerint végrehajthatjuk. Egy ilyen stratégiát a 14. ábrán
- 149 ·· ·· ·· *· ♦··· ····· ·· · • · · · · · · • · · · · · ········ ·· · ·· * mutatunk be. A bemutatott stratégia szerint a célzó konstrukció a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: a géntől 5' -irányban található szekvenciákkal homológ első célzó szekvencia, amplifikálható markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAP-hely, exon, „splice-donor hely, valamint az első célzó szekvenciától 3'-irányban található szekvenciákkal homológ második célzó szekvencia. Az ilyen stratégiával előállított, homológ rekombinációt tartalmazó sejtek olyan mRNS-prekurzort termelnek, amely a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: exogén exon és „splice-donor hely, második célzó szekvencia, a második célzó szekvencia és az FSHE-startkódonja között található szekvenciák, valamint az FSHb-gén exonjai, intronjai és 3' végi nem-transzlálódó régiói (14. ábra). Az említett mRNSprekurzor érése során az exogén exon az endogén FSHb-gén 2. exonjához fuzionálódik, és a molekula transzlációja során FSHh-molekula keletkezik. A bemutatott stratégia szerint az első és második célzó szekvencia a természetes génben közvetlenül egymás mellett található, ez azonban nem szükséges, hogy így legyen (lásd alább).
Alkalmazhatunk más megközelítési módokat is, az első és a második célzó szekvencia például homológ lehet az FSHh-gén 1. intronjában található szekvenciákkal is. Eljárhatunk úgy is, hogy az α-interferon esetén leírt célzó konstrukcióhoz hasonló konstrukciót alkalmazunk. E szerint a stratégia szerint a célzó konstrukció a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: az FSHB-gén 5' -végi szekvenciáival homológ első célzó szekvencia, amplifikálható ·· ··· ·
- 150 a · · ···· ···· markergén, szelektálható markergén, szabályozó régió, CAPhely, „splice-donor hely, intron, „splice-akceptor hely, valamint az első célzó szekvenciától 3' -irányban található szekvenciákkal homológ második célzó szekvencia. A második célzó szekvencia nem nyúlhat tovább 5' -irányban a természetes FSHE-gén transzkripciós startpontjához viszonyítva a 40. nukleotidnál, a nem-kívánt ATG-startkódonok kialakulásának elkerülése végett. Az ily módon előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejtekben egy olyan mRNS-prekurzor molekula keletkezik, mely a következő szekvenciaelemeket tartalmazza: exogén exon, „splice-donor hely, intron, ,, splice-akceptor hely, második célzó szekvencia, valamint a humán FSHB kódoló exonjai, intronjai és 3' -végi nemtranszlálódó szekvenciái. Az említett prekurzor molekula érése során olyan érett mRNS fog keletkezni, melynek transzlációja humán FSHh-proteint eredményez. A szabályozó régió működésének optimalizálása céljából a beépített intron méretét változtathatjuk, és ily módon változik a szabályozó régió és a gén kódoló régiója közötti távolság is.
Bármely aktiválási stratégiát alkalmazunk is, nem szükséges, hogy a második célzó szekvencia közvetlenül az első szekvencia mellett legyen található a természetes génben, amennyiben a két célzó szekvencia nem közvetlenül szomszédos egymással, a természetes gén 5' -végi régiójának bizonyos részletei deléciót fognak szenvedni a homológ rekombináció következtében. Elkészíthetjük a célzó konstrukciót úgy is, hogy az egyik célzó szekvencia a géntől 5' « 9
9*9» *99
- 151 irányban található szekvenciával legyen homológ, a másik pedig az FSHE-gén egy exonjában vagy intronjában található szekvenciákkal.
Az amplifikálható markergén és a szelektálható markergén lehet egyazon gén is, de pozícióikat egymással fel is cserélhetjük, és ezen gének egyike vagy mindegyike elhelyezhető a célzó konstrukcióba beépített intronon belül is. Alkalmas amplifikálható és szelektálható markergéneket a korábbiakban ismertettünk. A szelektálható markergén alkalmazása elhagyható, az amplifikálható markergén alkalmazására pedig csak akkor van szükség, ha az aktivált gént amplifikálni is kívánjuk. A specifikus CAP-hely beépítése elhagyható. Eljárhatunk úgy is, hogy valamely más génből származó exonszekvenciákat beépítünk a „splice-akceptor helytől 3' -irányban és a második célzó szekvenciától 5' irányban. A szabályozó régiót, CAP-helyet, exont, „splicedonor helyet, intront, és „splice-akceptor helyet egy egységként is izolálhatjuk a humán elongációs Ια-faktor génjéből (EF-Ια; „GenBank megjelölés: HUMEF1A) vagy a citomegalovírus közvetlen korai régiójából (CMV; „GenBank megjelölés: HEHCMVP1), de a különböző komponenseket izolálhatjuk különböző génekből is, majd azokat összeszereljük. Bármelyik megközelítési mód szerint az exogén exon lehet azonos a természetes FSH3-gén 1. exonjával, de lehet attól különböző is, és a célzó konstrukcióba több exont is beépíthetünk .
Az FSHÉ-gén 5'-végi régiójának megfelelő genomi eredetű DNS-szekvenciákat izolálhatunk a szakember számára » · · · i • «« * * — 1R0— ·*···.· ismert rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával, és a célzó konstrukciók összeállítását is önmagukban ismert eljárások alkalmazásával valósíthatjuk meg. Ahogy azt a korábbiakban ismertettük, számos szelektálható és amplifikálható markergént alkalmazhatunk a célzó konstrukciókban, és a gének aktiválását számos különböző sejttípusban végrehajthatjuk. Kívánt esetben az aktivált FSHB-gén termékét olyan sejttípusban is termelhetjük, amely a humán glikoprotein aalegységét is expresszálja, amely géntermék az FSHfi-gén termékével heterodimert képes létrehozni. Ez lehet valamely természetesen előforduló sejttörzs vagy sejtvonal. Eljárhatunk úgy is, hogy a humán glükoprotein α-alegység-génjét („GenBank megjelölés: HUMGLYCA1) együtt expresszáltatjuk az FSHE-gén termékével, az ilyen ko-expresszálást úgy hajtjuk végre, hogy a humán glükoprotein α-alegységének génjét vagy cDNS-ét alkalmas promoter vezérlése alatt expresszáltatjuk, vagy a humán glükoprotein a-alegységének génjét a találmány szerinti eljárással aktiváljuk. Az elsődleges, másodlagos vagy halhatatlanná tett humán sejtek transzfektálását, valamint FSHB-t termelő, homológ rekombinációt tartalmazó sejtek izolálását a fent leírtak szerint végezhetjük, humán FSHB-ra specifikus ELISA-eljárás alkalmazásával (Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY). Eljárhatunk úgy is, hogy a homológ rekombinációt tartalmazó sejteket PCR-es szkríneléssel azonosítjuk, a fent leírtak szerint. Az aktivált α-interferon-lókusz és az amplifikálható markergén több kópiáját tartalmazó sejteket is a korábbiakban leírtak szerint izolálhatjuk.
• ·
- 153 • · · · · · ········ ·· · ·· ·
Szakember számára kézenfekvő, hogy az elvárható mennyiségű kísérletezésnél nem több kísérletezés alapján megvalósítható a találmány szerinti megoldás bemutatott megvalósítási módjainak számos ekvivalense. Az ilyen ekvivalensek beletartoznak az alábbi szabadalmi igénypontokban megfogalmazott oltalmi körbe.
- 154 -

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. DNS-konstrukció, amely kromoszómális DNS-be integrálódva alkalmas egy megcélzott gén expressziójának megváltoztatására, és amely DNS-konstrukció (i) célzószekvenciát (és adott esetben egy második célzószekvenciát);
    (ii) szabályozó szekvenciát;
    (iii) exont; és (iv) (a) páratlan „splice-donor helyet; vagy (b) „splice-donor helyet, intront és „spliceakceptor helyet tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti konstrukció, amelyben az exon tartalmaz továbbá a) egy CAP-helyet; és/vagy b) egy ATG-kódont; és/vagy c) a megcélzott gén kódoló régiójának egy részletét azonos leolvasási fázisban, amely lehet például azonos a megcélzott gén 1. exonjának DNSszekvenciájával, de lehet attól különböző is.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti konstrukció, amelyben a célzó szekvencia(k) adott esetben homológ(ok) egy, a megcélzott génen belül található szekvenciarészlettel, vagy egy, a megcélzott géntől vagy annak valamely endogén szabályozó régiójától 5' -irányban található szekvenciarészlettel.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti konstrukció, amely megcélzott génként adott esetben terápiás protein, hormon, citokin, antigén, ellenanyag, enzim, véralvadási faktor, transzportfehérje, receptor, szabályozó • ·
    - 155 • · ······«· · · · ·· · protein, strukturális protein, transzkripciós faktor, eritropoietin, kalcitonin, növekedési hormon (például humán növekedési hormon), inzulin, inzulinotropin, inzulinszerű növekedési faktorok, paratiroid hormon, β-interferon, γinterferon, idegi növekedési faktorok, FSHB, TGF-β, tumor nekrózis faktor, glukagon, 2. csontnövekedési faktor, 7. csontnövekedési faktor, TSH-β, 1., 2., 3., 6., 11. vagy 12. interleukin, granulocita-CSF (G-CSF), makrofág-CSF, granulocita/makrofág-CSF (GM-CSF), immunglobulin, katalitikus ellenanyag, proteinkináz-C, glükocelebrozidáz, szuperoxid-diszmutáz, szöveti plazminogén aktivátor, urokináz, antitrombin-3, DN-áz, α-galaktozidáz, tirozin hidroxiláz, V., VII., VIII., IX., X. vagy XIII. véralvadási faktor, apolipoproteint-E vagy apolipoprotein-A-I, globinok, kis sűrűségű lipoprotein receptor, IL-II-receptor, IL-IIantagonisták, alfa-l-antitripszin, immunválasz-módosítók vagy oldható CD4 expressziójának megváltoztatására alkalmas .
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti konstrukció, amelyben a szabályozó szekvencia adott esetben tartalmaz egy promótert és/vagy enhanszert és/vagy vázszerkezethez kapcsoló (scaffold-attachment ) régiót és/vagy transzkripciós faktor kötőhelyet, például egy promótert és/vagy egy további szabályozó szekvenciát (például egy enhanszert), amely szabályozó szekvencia például az egéreredetű metallotionein-I-gén, vagy egy SV-40-gén, vagy egy citomegalovírus-gén, vagy egy kollagén-gén, vagy egy aktingén, vagy egy immunglobulin-gén, vagy a HMG-CoA reduktáz • ·
    - 156 gén vagy az EF-lot-gén szabályozó szekvenciája.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti konstrukció, amely adott esetben tartalmaz egy vagy több szelektálható markergént és/vagy amplifikálható markergént is.
  7. 7. Eljárás homológ rekombinációt tartalmazó sejt és/vagy kívánt protein előállítására, amely sejtben egy megcélzott gén (például 4. igénypont szerinti megcélzott gén) expressziója módosítva van, azzal jellemezve, hogy (i) egy sejtet 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNSkonstrukcióval transzfektálunk; majd (ii) a transzfektált sejtet homológ rekombináció bekövetkeztére alkalmas körülmények között tartjuk fent, és adott esetben;
    (iii) az (ii) pont szerint előállított rekombináns sejtet proteintermelésre alkalmas körülmények között tartjuk fent (például a 4. igénypont szerinti protein termelésére alkalmas körülmények között), amely (i) pont szerinti sejt adott esetben:
    a) eukarióta-, például gomba-, növényi vagy állati eredetű sejt (például gerinces-, azon belül például humán sejt);
    b) elsődleges vagy másodlagos emlőssejt (például humán sejt);
    c) halhatatlanná tett emlőssejt (például humán sejt);
    vagy
    d) Bowes-féle melanómasejt, Daudi-sejt, HeLa-sejt, HL60-sejt, HT1080-sejt, Jurkat-sejt, KB-karcinómasejt, Κ-562-leukémiasejt, MCF-7-mellráksejt, MOLT• ·
    - 157 ········ · · · · · ·
    4-sejt, Namalwa-sejt, Raji-sejt, RPMI-8226-sejt, U837-sejt, a WI-38VA13-sejtvonal 2R4-szubklónjához tartozó sejt, vagy 2780AD-petefészek-karcinómasejt, vagy ezek származéka;
    vagy az eljárás szerint előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejt, protein (például 4. igénypont szerinti protein) vagy egy endogén gén által kódolt aminosavakat is tartalmazó fúziós protein (az endogén gén adott esetben lehet a humán eritropoietin-gén, és a fúziós protein tartalmazhatja például a humán növekedési hormon 1-3. aminosavait és a humán eritropoietin 6-165. aminosavait).
  8. 8. Homológ rekombinációt tartalmazó sejt, amely tartalmaz egy exogén szabályozó szekvenciát, egy exogén exont és „splice-donor helyet, funkcionálisan hozzá kapcsolva egy megcélzott endogén gén 2. exonjához (amelynek 1. exonja például deletálva lehet), ahol az exogén szabályozó szekvencia, exogén exon és „splice-donor hely adott esetben az endogén gén kódoló régiójától vagy endogén szabályozó szekvenciájától (amely például deletálva is lehet) 5' irányban helyezkedik el, ahol például
    a) az exogén exon és/vagy a megcélzott gén és/vagy a szabályozó szekvencia 2., 4., vagy 5. igénypont szerinti; és/vagy
    b) a sejt 7. igénypont szerinti; és/vagy
    c) a sejt a megcélzott gént expresszálja.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti sejt, amely olyan fúziós proteint expresszál, amely az exogén exon és az endogén gén által egyaránt kódolt aminosavakat tartalmaz, ahol az endo- 158 • · ·· ·· ·· ···« « · · · 9 · · <
    * 9 · · * * · • · · · · ·
    99999999 9 9 9 · · · gén gén például eritropoietin, a fúziós protein pedig tartalmazza például a humán növekedési hormon 1-3. aminosavait, és a humán eritropoietin 6-165. aminosavait.
  10. 10. Eljárás egy gén expressziójának megváltoztatására egy sejtben (például proteintermeltetés céljából), azzal jellemezve, hogy (i) egy sejtet az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNSkonstrukcióval transzfektálunk, és így transzfektált sejtet állítunk elő;
    (ii) a transzfektált sejtet homológ rekombináció lejátszódására alkalmas körülmények között tartjuk fent, ily módon homológ rekombinációt tartalmazó sejtet állítunk elő; és (iii) a homológ rekombinációt tartalmazó sejtet génexpresszióra alkalmas körülmények között tartjuk fent (amely körülmények például alkalmasak proteintermelésre) , ahol a sejt adott esetben 7. igénypont szerinti sejt, vagy az eljárással egy protein (például 4. igénypont szerinti protein) vagy fúziós protein állítható elő, amely egy endogén gén által kódolt aminosavakat is tartalmaz (a fúziós protein adott esetben a humán növekedési hormon 1-3. aminosavaiból és a humán eritropoietin 6-165. aminosavaiból áll) .
  11. 11. A pREPO18-jelű DNS-piazmid.
  12. 12. Homológ rekombinációt tartalmazó sejt, amely
    a) szabályozó szekvenciát, exont, „splice-donor helyet, intront és „splice-akceptor helyet tartalmaz homológ re• ·
    - 159 ···· ><·· · ♦ · *· · kombináció útján bejuttatva egy megcélzott gén kódoló régiójától 5' -irányban található régióba, ahol a megcélzott gén például az α-interferon vagy az eritropoietin génje; vagy b) a dhfr-gént, a neo-gént, a CMV-promótert, a hGH 1. exonját és egy páratlan „splice-donor helyet tartalmaz, amely célzottan van beépítve az endogén eritropoietin szabályozó régiójától 5' -irányban, amely sejt adott esetben a pREP018-plazmidból származó DNS beépítése útján is előállítható.
  13. 13. Eljárás olyan homológ rekombinációt tartalmazó sejt előállítására, melyben egy megcélzott gén (például az α-interferon vagy az eritropoietin génje) expressziója meg van változtatva, azzal jellemezve, hogy (i) egy sejtet az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukcióval transzformálunk, DNS-konstrukcióként (I) célzó szekvenciát;
    (II) szabályozó szekvenciát;
    (III) exont;
    (IV) „splice-donor helyet;
    (V) intront; és (VI) „splice-akceptor helyet tartalmazó DNSkonstrukciót alkalmazunk, amely célzó szekvencia a 11-VI. elemeket 5' -irányban építi be oly módon, hogy azok funkcionálisan a megcélzott gén 1. exonjához kapcsolódnak; és (ii) a transzfektált sejtet homológ rekombináció bekövetkezésére alkalmas körülmények között tartjuk, és adott esetben;
    ·«· ·
    - 160 (iii) a (ii) lépés szerint előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejteket proteintermelésre alkalmas körülmények között tartjuk;
    vagy az eljárás szerint előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejt vagy protein.
  14. 14. Eljárás egy gén (például az α-interferon vagy eritropoietin-gén) expressziójának megváltoztatására egy sejtben (például protein előállítása céljából), azzal jellemezve, hogy (i) egy sejtet 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNSkonstrukcióval transzfektálunk, DNS-konstrukcióként (I) célzó szekvenciát, (II) szabályozó szekvenciát;
    (III) exont;
    (IV) „splice-donor helyet;
    (V) intront; és (VI) „ splice-akceptor helyet tartalmazó DNSkonstrukciót alkalmazunk, amely célzó szekvencia a II-VI. elemeket 5' -irányban építi be oly módon, hogy azok funkcionálisan a megcélzott gén 1. exonjához kapcsolódjanak; és (ii) a transzfektált sejtet homológ rekombináció bekövetkezésére alkalmas körülmények között tartjuk fenn, ily módon homológ rekombinációt tartalmazó sejtet állítunk elő; és (iii) az előállított homológ rekombinációt tartalmazó sejtet a gén expresszálódására alkalmas körülmények között tartjuk fent (például proteintermelődésre alkalmas
    999 *
    - 161 9 9 » 9 9 9 *··· ···· W* * ·< · körülmények között);
    vagy az eljárás szerint előállított protein.
  15. 15. Eljárás az eritropoietin-gén emlős (például humán) sejtben történő megcélzására, azzal jellemezve, hogy a sej tét
    a) az eritropoietin-génben található szekvenciával; vagy
    b) az eritropoietin-gén ATG-kódonjától 5' -irányban található szekvenciával (például az eritropoietin-gén ATG-kódonjától 5' -irányban mintegy 5 kb-nyira és mintegy 30 kb-nyira lévő pozíciók között található
    DNS-szekvenciával);
    vagy a b) pont szerinti eljárásban alkalmazható, az eritropoietin-gén ATG-kódonjától 5' -irányban mintegy 5 kbnyira és 30 kb-nyira lévő pozíciók között található DNSszekvenciával homológ DNS-konstrukcióval transzfektáljuk.
    A meghatalmazott:
    danubia .
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft / 46.
    L
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    I
    ΙΡ96 03144 c
    o
    X <u z O CL
    O LU 0. 4= LU (Z) -C -Q) in
    Qí c
    o
    X
    0)
    X -C 0 </> C -Φ
    O
    Q.
    LU
    I
    Ed
    1/15 s
    £i <0
    C
    3:2 o
    •0 JC N □ •® υ
    0.
    LU •c -o S 5» 'Φ .<u CT b O - -0 m C (Λ UJ Ό σ>
    c .2 Ö υ Q_ Q.LLÍ ‘C x:
    MN ·— <0 '<0 C > Π3 +* v
    H <ü
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    2/15
    Hm mMT-1-promóter
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144 3/15
    3. ábra
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    4/15
    4. ábra
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    5/15
    5. ábra
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    6. ábra
    KÖZZÉTÉTELI E ν; . λ :
    PÉLDÁNY
    7/15
    Ρ96 03144
    EPO-termelődés a megcélzott HT1080-52-sejtvonalban MTX szelekció közben
    Metotrexát (μΜ)
    7. ábra
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    8/15
    8. ábra
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY ··· · ···· ····
    P96 03144
    9/15 endogén EPO-gén Próba
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144 • · · · • · • · ···· ·>»· • · · • · · · · ·
    10/15
    Hamm BglU/EcoRI TI HF TI HF
    1 2 3 4 6
    9B ábra
    KÖZZÉTÉTELI ? :·· ·'.'··'/ _r r ···· ···· ·· ♦ ·· ·
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    11/15
    10. ábra
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY szabályozó a-lnterferon szekvencia . _ _
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    13/15
    o Q. c CJ o u < • o X u Φ CL CM ω
    c •Φ <31 c
    •Φ
    Ol o
    Ό c
    Φ π ©
    A «ο
    KÖZZÉTÉTELI 2222 :
    PÉLDÁNY
    P96 03144 . „
    14/15 λ_
    -Ω '03
    CO
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY
    P96 03144
    15/15
HU9603144A 1994-05-13 1995-05-11 Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof HUT76844A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/243,391 US5641670A (en) 1991-11-05 1994-05-13 Protein production and protein delivery

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9603144D0 HU9603144D0 (en) 1997-01-28
HUT76844A true HUT76844A (en) 1997-11-28

Family

ID=22918596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9603144A HUT76844A (en) 1994-05-13 1995-05-11 Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5641670A (hu)
EP (1) EP0759082A1 (hu)
JP (1) JPH10500570A (hu)
KR (1) KR100379356B1 (hu)
AU (1) AU709058B2 (hu)
BR (1) BR9507874A (hu)
CA (1) CA2190289A1 (hu)
CZ (1) CZ295115B6 (hu)
FI (1) FI964536A (hu)
HU (1) HUT76844A (hu)
IL (1) IL113708A0 (hu)
MX (1) MX9605542A (hu)
NO (1) NO964802L (hu)
NZ (1) NZ285945A (hu)
RU (1) RU2267533C2 (hu)
SK (1) SK146196A3 (hu)
UA (1) UA34493C2 (hu)
WO (1) WO1995031560A1 (hu)
ZA (1) ZA953879B (hu)

Families Citing this family (324)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US6852313B1 (en) 1989-10-16 2005-02-08 Amgen Inc. Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
WO1991005795A1 (en) * 1989-10-16 1991-05-02 Amgen Inc. Stem cell factor
US20040181044A1 (en) * 1989-10-16 2004-09-16 Zsebo Krisztina M. Method of stimulating growth of epithelial cells by administering stem cell factor
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5981730A (en) 1994-04-13 1999-11-09 The General Hospital Corporation RPS gene family, primers, probes, and detection methods
US7597886B2 (en) * 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7820798B2 (en) * 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
AU4085297A (en) * 1996-08-23 1998-03-06 Chiron Corporation Human polyhomeotic 1(hphl) acts as a tumor suppressor
AU4424497A (en) 1996-09-13 1998-04-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Therapy for alpha-galactosidase a deficiency
EP0966521A1 (en) * 1996-09-13 1999-12-29 Novo Nordisk Biotech, Inc. Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide
ATE552341T1 (de) 1996-10-01 2012-04-15 Geron Corp Katalytische untereinheit der menschlichen telomerase
US6136566A (en) * 1996-10-04 2000-10-24 Lexicon Graphics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
US7332338B2 (en) 1996-10-04 2008-02-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Vectors for making genomic modifications
US6855545B1 (en) 1996-10-04 2005-02-15 Lexicon Genetics Inc. Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
US20040072243A1 (en) * 1996-10-11 2004-04-15 Lexicon Genetics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
JP4771563B2 (ja) 1996-12-06 2011-09-14 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ−１媒介疾患を処置するためにｉｌ−１インヒビターを使用する組合せ療法
JP2001505783A (ja) * 1996-12-11 2001-05-08 カイロン コーポレイション 分泌ヒトタンパク質
US20020168718A1 (en) * 1997-04-03 2002-11-14 California Institute Of Technology Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering
CN1227363C (zh) 1997-05-16 2005-11-16 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 具有脯氨酰二肽氨肽酶活性的多肽和编码该多肽的核酸
US6639050B1 (en) * 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US7378506B2 (en) * 1997-07-21 2008-05-27 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
DE59813913D1 (de) * 1997-07-23 2007-04-05 Roche Diagnostics Gmbh Identifizierung humaner zellinien zur produktion humaner proteine durch endogene genaktivierung
AU776280B2 (en) * 1997-07-23 2004-09-02 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
EP0986644B1 (de) * 1997-07-23 2006-10-04 Boehringer Mannheim GmbH Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
PT986644E (pt) 1997-07-23 2007-01-31 Roche Diagnostics Gmbh Preparação de eritropoietina por activação genética endógena com promotores virais
JP2001511341A (ja) 1997-07-23 2001-08-14 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー ヒト細胞におけるヒト変異型タンパク質の相同的組換えによる生産
KR100622203B1 (ko) * 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
US6548296B1 (en) * 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
JP5377806B2 (ja) * 1997-09-26 2013-12-25 アサーシス，インコーポレイテッド ベクター構築物の細胞ｄｎａとの非相同組換えによる内因性遺伝子の発現
US7316923B1 (en) 1997-09-26 2008-01-08 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US6897066B1 (en) 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
ZA989497B (en) * 1997-10-20 2000-04-19 Roche Diagnostics Gmbh Positive-negative selection in homologous recombination.
KR20010031713A (ko) 1997-11-03 2001-04-16 벤슨 로버트 에이치. 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제
WO1999028346A1 (de) * 1997-12-03 1999-06-10 Roche Diagnostics Gmbh Erythropoietin mit hoher spezifischer aktivität
EP1056858B1 (en) 1998-02-19 2004-12-08 Eastern Virginia Medical School RECOMBINANT ACTIVE HUMAN ZONA PELLUCIDA PROTEIN 3 (hZP3)
US7037663B2 (en) * 1998-02-19 2006-05-02 Eastern Virginia Medical School Human zona pellucida protein 3 and uses thereof
WO1999044625A1 (en) 1998-03-03 1999-09-10 John Hopkins University Smallpox inhibitor of complement enzymes (spice) protein and methods of inhibiting complement activation
EP1093457B8 (en) 1998-03-19 2011-02-02 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like
US6808921B1 (en) * 1998-03-27 2004-10-26 Lexicon Genetics Incorporated Vectors for gene mutagenesis and gene discovery
US6436707B1 (en) * 1998-03-27 2002-08-20 Lexicon Genetics Incorporated Vectors for gene mutagenesis and gene discovery
AU766620B2 (en) * 1998-05-07 2003-10-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Modifying the expression of the fsh beta gene by homologous recombination
CZ299460B6 (cs) * 1998-05-07 2008-08-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. DNA konstrukt, izolovaná molekula nukleové kyseliny, homologne rekombinantní bunka a její použití azpusob produkce G-CSF
CA2328459A1 (en) * 1998-05-07 1999-11-11 Transkaryotic Therapies, Inc. Genomic sequences upstream of the coding region of the ifn-alpha2 gene for protein production and delivery
AU4213999A (en) * 1998-05-27 1999-12-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
JP4220673B2 (ja) 1998-07-21 2009-02-04 ミリポア・コーポレイション 遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｃｏｅ）を含むポリヌクレオチド
US7241730B2 (en) 1998-08-27 2007-07-10 Universitat Zurich Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering: fibrin formulations with peptides
US7601685B2 (en) * 1998-08-27 2009-10-13 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US6894022B1 (en) 1998-08-27 2005-05-17 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
SE9803099D0 (sv) 1998-09-13 1998-09-13 Karolinska Innovations Ab Nucleic acid transfer
AU1316200A (en) 1998-10-15 2000-05-01 Chiron Corporation Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6416975B1 (en) 1998-11-12 2002-07-09 Gliatech, Inc. Human glycine transporter type 2
CA2354325C (en) 1998-12-07 2011-08-16 Zymogenetics, Inc. Growth factor homolog zvegf3
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
PT1141331E (pt) 1998-12-16 2008-12-22 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinase dependente de ciclina humana (hpnqalre)
WO2000049162A2 (en) * 1999-02-19 2000-08-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
WO2000050620A2 (en) 1999-02-26 2000-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Human endokine alpha and methods of use
WO2000051623A2 (en) 1999-03-05 2000-09-08 The Trustees Of University Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide-induced clinical conditions
US6849605B1 (en) * 1999-03-05 2005-02-01 The Trustees Of University Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections
AU3731400A (en) * 1999-03-05 2000-09-21 Trustees Of University Technology Corporation, The Methods and compositions useful in inhibiting apoptosis
WO2000051625A1 (en) * 1999-03-05 2000-09-08 The Trustees Of University Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of herpes viruses
EP1165791B1 (en) 1999-03-09 2007-10-31 ZymoGenetics, Inc. Human cytokine as ligand of the zalpha receptor and uses thereof
EP2278016B1 (en) 1999-03-22 2012-09-26 Novozymes Inc. Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof
US7112341B1 (en) 1999-04-13 2006-09-26 Nektar Therapeutics Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
EP1255848A2 (en) * 1999-06-15 2002-11-13 Genetrol Biotherapeutics Methods for enhancing the production of cytokines in cell cultur e
IL147336A0 (en) 1999-07-07 2002-08-14 Zymogenetics Inc Human cytokine receptor
EP2275559A3 (en) 1999-09-28 2011-03-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
EP1305412A2 (en) 1999-10-14 2003-05-02 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
AU784477B2 (en) * 1999-11-19 2006-04-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nucleic acid construct for optimized production of products
EP1232175B1 (en) 1999-11-22 2009-07-08 ZymoGenetics, Inc. Method of forming a peptide-receptor complex with zsig33 polypeptides.
US6951839B1 (en) 1999-11-30 2005-10-04 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
US8168178B2 (en) 1999-11-30 2012-05-01 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
AU1647501A (en) 1999-12-10 2001-06-18 Cytos Biotechnology Ag Replicon based activation of endogenous genes
CA2395369C (en) 1999-12-23 2014-07-08 Zymogenetics, Inc. Cytokine zcyto18
ES2311016T3 (es) 2000-01-10 2009-02-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Genes expresados diferencialmente en cancer de mama.
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US6569681B1 (en) 2000-03-14 2003-05-27 Transkaryotic Therapies, Inc. Methods of improving homologous recombination
US20030084471A1 (en) 2000-03-16 2003-05-01 David Beach Methods and compositions for RNA interference
EP1728862A1 (en) 2000-03-16 2006-12-06 Genetica, Inc. Methods and compositions for RNA interference
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20020077775A1 (en) * 2000-05-25 2002-06-20 Schork Nicholas J. Methods of DNA marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20030195707A1 (en) * 2000-05-25 2003-10-16 Schork Nicholas J Methods of dna marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
AU2001282856A1 (en) 2000-06-15 2001-12-24 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
GB0018876D0 (en) * 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US7138262B1 (en) * 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
IL154596A0 (en) 2000-08-25 2003-09-17 Basf Plant Science Gmbh Plant polynucleotides encoding novel prenyl proteases
CA2422060A1 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Genetrol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of human cytokines and methods of producing the same
US20020150541A1 (en) * 2000-09-12 2002-10-17 Gene Trol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
US20030129162A1 (en) * 2000-09-12 2003-07-10 Lau Allan S. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
US7381713B2 (en) * 2000-12-04 2008-06-03 Sioan-Kettering Institute For Cancer Research Treatment of cancer by reduction of intracellular energy and pyrimidines
CA2436847A1 (en) * 2000-12-04 2002-06-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Treatment of cancer by reduction of intracellular energy and pyrimidines
WO2002049673A2 (en) 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
JP4656814B2 (ja) * 2000-12-20 2011-03-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー エリスロポエチンコンジュゲート
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
WO2002059337A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Georgetown University School Of Medicine Anti-apoptopic gene scc-s2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002250032B2 (en) 2001-02-09 2008-06-05 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor (CCR5) HDGNR10
ES2328796T3 (es) 2001-03-14 2009-11-18 Myriad Genetics, Inc. Interaccion tsg101-gag y uso de la misma.
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081640A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene shinc-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081639A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081641A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
DK1385864T3 (da) 2001-04-13 2010-08-16 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2-antistoffer
US7309783B2 (en) * 2001-05-09 2007-12-18 The University Of Connecticut Mammalian early developmental regulator gene
WO2002091999A2 (en) * 2001-05-09 2002-11-21 Geron Corporation Treatment for wounds
EP2293067B1 (en) 2001-06-26 2016-04-20 Senomyx, Inc. T1R hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
CA2452337A1 (en) 2001-07-10 2003-01-23 Senomyx, Inc. Use of specific t2r taste receptors to identify compounds that block bitter taste
US6867189B2 (en) * 2001-07-26 2005-03-15 Genset S.A. Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders
US7148021B2 (en) * 2001-08-02 2006-12-12 Eastern Virginia Meical School Human zona pellucida proteins and methods of their use in diagnosing male infertility
US7285631B2 (en) * 2001-08-10 2007-10-23 Serono Genetics Institute S.A. Human cDNAs and proteins and uses thereof
US20050064587A1 (en) * 2001-09-07 2005-03-24 Lawrence Rosenberg Pancreatic small cells and uses thereof
ES2624547T3 (es) 2001-11-14 2017-07-14 Janssen Biotech, Inc. Anticuerpos anti il 6, composiciones, métodos y usos
WO2003046180A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Genset S.A. Human cdnas and proteins and uses thereof
US7247609B2 (en) * 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
ES2329666T3 (es) * 2001-12-19 2009-11-30 The University Of Chicago Proteinas fluorescentes de maduracion rapida y procedimientos de uso de las mismas.
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
EP1463751B1 (en) 2001-12-21 2013-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DK1476541T3 (da) 2002-01-18 2008-11-03 Zymogenetics Inc Cytokin (zcytor17-ligand)
EP1471928A1 (en) 2002-02-07 2004-11-03 Delta Biotechnology Limited Hiv inhibiting proteins
AU2003211128A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 American Integrated Biologics, Inc. Transgenic production in saliva
DE60316124T3 (de) * 2002-03-15 2018-03-22 Cellectis Hybride and einzelkettige meganukleasen und deren anwendungen
WO2009095742A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
US20100151556A1 (en) * 2002-03-15 2010-06-17 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
US7244565B2 (en) * 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7138512B2 (en) * 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2003231028A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 Novozymes Biotech, Inc. Methods for increasing homologous recombination of a nucleic acid sequence
NZ536361A (en) 2002-04-25 2008-05-30 Shire Human Genetic Therapies Treatment of alpha-galactosidase a deficiency
US20030228317A1 (en) * 2002-05-22 2003-12-11 Prafulla Gokhale Gene BRCC-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2003254016A1 (en) 2002-07-19 2004-02-09 Catholic Healthcare West Methods and compositions relating to chimeric nicotinic receptor subunits
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CN101497908B (zh) 2002-11-18 2014-05-21 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子变体
ATE540129T1 (de) * 2002-11-22 2012-01-15 Univ Johns Hopkins Target zur therapie kognitiver behinderungen
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
WO2004050683A2 (en) * 2002-12-02 2004-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
AU2003291884A1 (en) * 2002-12-10 2004-06-30 Ottawa Health Research Institute Modulation of stem cell differentiation by modulation of caspase-3 activity
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
CA2513251C (en) 2003-01-14 2013-03-19 Dana-Farber Cancer Institute Cancer therapy sensitizer
EP1585815A4 (en) * 2003-01-21 2006-02-22 Bristol Myers Squibb Co A NEW ACYL-COENZYME A, MONOCLYLGLYCERIN ACYLTRANSFERASE-3 (MGAT3), CODING POLYNUCLEOTIDE, AND USES THEREOF
AU2004208031B2 (en) * 2003-01-28 2009-10-08 Cellectis Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof.
WO2004072275A2 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Transkaryotic Therapies, Inc. Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other using a formylglycine generating enzyme (fge)
WO2004098634A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Protein arginine n-methyltransferase 2 (prmt-2)
US20060252120A1 (en) * 2003-05-09 2006-11-09 Kieliszewski Marcia J Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
NZ544335A (en) * 2003-06-11 2009-01-31 Biogen Idec Inc Method to increase protein production in culture
WO2005041684A2 (en) 2003-08-06 2005-05-12 Senomyx Inc. Novel flavors, flavor modifiers, tastants, taste enhancers, umami or sweet tastants, and/or enhancers and use thereof
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
AU2004278685A1 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for defining gene function
JP2007513083A (ja) * 2003-11-10 2007-05-24 アンジオテック インターナショナル アーゲー 医療用移植片および繊維誘発剤
WO2005052140A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament and uses thereof
CA2565173A1 (en) * 2003-12-03 2005-06-16 Delta Biotechnology Limited Interleukin-11 fusion proteins
ES2460671T3 (es) * 2003-12-19 2014-05-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Uso de eritropoyetina en el tratamiento de alteraciones de la distribución del hierro en enfermedades intestinales inflamatorias crónicas
US20060148680A1 (en) * 2004-01-14 2006-07-06 Kieliszewski Marcia J Glycoproteins produced in plants and methods of their use
JP4755174B2 (ja) 2004-04-07 2011-08-24 ザ ユニヴァーシティー オヴ シカゴ 単量体赤色蛍光タンパク質
EP1751177A4 (en) 2004-04-19 2008-07-16 Univ Ohio NETWORKABLE GLYCOPROTEINS AND METHOD FOR THEIR PRODUCTION
AU2005249434A1 (en) * 2004-05-26 2005-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Cancer treatment method by inhibiting mage gene expression or function
CA2576193A1 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Taj in neuronal function
WO2006033859A2 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP1828244A2 (en) * 2004-12-22 2007-09-05 Kuros Biosurgery AG Michael-type addition reaction functionalised peg hydrogels with factor xiiia incorporated biofactors
KR20070082597A (ko) 2004-12-30 2007-08-21 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 유전자
WO2006073711A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Kuros Biosurgery Ag Use of a matrix comprising a contrast agent in soft tissues
US8575101B2 (en) 2005-01-06 2013-11-05 Kuros Biosurgery Ag Supplemented matrices for the repair of bone fractures
MX2007008319A (es) * 2005-01-06 2007-10-04 Kuros Biosurgery Ag Matrices suplementadas para la reparacion de fracturas oseas.
CA2597757C (en) 2005-02-10 2016-06-28 Regents Of The University Of Minnesota Vascular/lymphatic endothelial cells
US20060194740A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Ulevitch Richard J NOD1 as an anti-tumor agent
US20060234973A1 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Kevin Fitzgerald Transcription factor RNA interference reagents and methods of use thereof
JO3058B1 (ar) 2005-04-29 2017-03-15 Applied Molecular Evolution Inc الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها
US20070011752A1 (en) * 2005-05-06 2007-01-11 American Integrated Biologics, Inc. Production of human proteins in transgenic animal saliva
US20070054360A1 (en) 2005-05-12 2007-03-08 Zeren Gao Compositions and methods for modulating immune responses
HUE042561T2 (hu) 2005-06-30 2019-07-29 Janssen Biotech Inc Anti-IL-23-ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások
US20080242834A1 (en) * 2005-07-08 2008-10-02 Ohio University Methods of Predicting Hyp-Glycosylation Sites For Proteins Expressed and Secreted in Plant Cells, and Related Methods and Products
WO2007008604A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Bristol-Myers Squibb Company Single nucleotide polymorphisms associated with dose-dependent edema and methods of use thereof
US20070202512A1 (en) * 2005-08-19 2007-08-30 Bristol-Myers Squibb Company Human single nucleotide polymorphisms associated with dose-dependent weight gain and methods of use thereof
WO2007030820A2 (en) 2005-09-09 2007-03-15 The Johns Hopkins University Manipulation of regulatory t cell and dc function by targeting neuritin gene using antibodies, agonists and antagonists
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
CA2626082C (en) 2005-10-13 2017-04-11 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
EP1937718B1 (en) 2005-10-20 2017-12-06 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
WO2007060495A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
US7749704B2 (en) 2005-11-01 2010-07-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Promoter polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods
AU2006311827A1 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Redpoint Bio Corporation High throughput screening assay for the TRPM5 ion channel
ES2517420T3 (es) 2005-12-29 2014-11-03 Janssen Biotech, Inc. Anticuerpos anti-IL-23 humanos, composiciones, procedimientos y usos
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
ES2391657T3 (es) 2006-02-07 2012-11-28 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Composiciones estabilizadas de proteínas que tienen un resto tiol libre
WO2007100870A2 (en) * 2006-02-28 2007-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for compact aggregation of dermal cells
DK2004683T3 (en) * 2006-03-24 2016-08-22 Biogen Hemophilia Inc PC5 AS A FACTOR IX PROPEPTID PROCESSING ENZYM
ES2640453T3 (es) 2006-04-21 2017-11-03 Senomyx, Inc. Procesos para preparar composiciones saborizantes sólidas
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
CN101534847A (zh) 2006-08-04 2009-09-16 普罗龙药品公司 修饰型促红细胞生成素
JP5256199B2 (ja) * 2006-08-07 2013-08-07 テヴァ バイオファーマシューティカルズ ユーエスエー，インコーポレーティッド アルブミン−インスリン融合タンパク質
JP2008044926A (ja) * 2006-08-14 2008-02-28 Trustees Of Columbia Univ In The City Of New York Ｗｎｔ信号伝達に関係した分泌タンパク質
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
US20080234194A1 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Harold Brem Growth factor mediated cosmeceuticals and use thereof to enhance skin quality
US8673859B2 (en) * 2007-03-20 2014-03-18 New York University GM-CSF cosmeceutical compositions and methods of use thereof
WO2008125655A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Kuros Biosurgery Ag Polymeric tissue sealant
PL2137655T3 (pl) 2007-04-16 2012-12-31 Momenta Pharmaceuticals Inc Zdefiniowane produkty glikoproteinowe i powiązane sposoby
AR067537A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
AR067536A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
WO2009015063A2 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Centocor Methods and compositions for treating fibrosis related disorders using il-17 antagonists
WO2009025793A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Senomyx, Inc. Human t2r bitterness receptors and uses thereof
US8679749B2 (en) * 2007-11-01 2014-03-25 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
WO2009073511A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polymorphisms of the blys gene and use in diagnostic methods
EP2227263A2 (en) * 2007-12-28 2010-09-15 Kuros Biosurgery AG Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
WO2009089380A2 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for p2ry5 mediated regulation of hair growth and mutants thereof
WO2009137613A2 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
KR20160116056A (ko) 2008-08-14 2016-10-06 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 항-ｉｌ-12/ｉｌ-23 항체
AU2009308935B2 (en) 2008-10-31 2015-02-26 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
CN102596992B (zh) 2009-02-12 2015-09-09 詹森生物科技公司 基于ⅲ型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
EP3488837A1 (en) 2009-07-15 2019-05-29 NewSouth Innovations Pty Limited Electroporation apparatus for providing agents to the cochlea
RU2733466C2 (ru) 2009-07-28 2020-10-01 Шайр Хьюман Дженетик Терапиз Композиции и способы для лечения болезни гоше
ES2902229T3 (es) 2009-08-28 2022-03-25 Icahn School Med Mount Sinai Terapia de sustitución de la enzima de escalado de la dosis para el tratamiento de la deficiencia de esfingomielinasa ácida
US8883739B2 (en) 2010-01-19 2014-11-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
PE20130192A1 (es) 2010-03-30 2013-02-27 Centocor Ortho Biotech Inc Anticuerpos il-25 humanizados
SI2616101T1 (sl) 2010-09-14 2014-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za čiščenje pegiliranega eritropoetina
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
EP2646558B1 (en) 2010-11-30 2016-07-20 Novozymes, Inc. Promoters for expressing genes in a fungal cell
WO2012075412A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Michael Verneris Generation of natural killer cells and lymphoid tissue inducer-like (lti-like) nk-22 cells
MX2013006455A (es) 2010-12-07 2013-10-25 Vnomics Corp Sistema y metodo para medir y reducir el desperdicio de combustible del vehiculo.
WO2012083081A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Novozymes, Inc. Promoters for expressing genes in a fungal cell
EP2658970B1 (en) 2010-12-31 2016-09-28 Bioatla LLC Express humanization of antibodies
WO2012101671A1 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
ES2676878T3 (es) 2011-03-03 2018-07-25 Zymeworks Inc. Diseño de armazón de heteromultímero multivalente y constructos
WO2012123028A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Kuros Biosurgery Ag Pharmaceutical formulation for use in spinal fusion
RU2495933C2 (ru) * 2011-05-30 2013-10-20 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТКАНЕВОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА (ТАП) ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ) ИЛИ [-1]МЕТИОНИЛ-ФРАГМЕНТ ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ)
WO2013013017A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modifying the glycosylation of lysosomal storage disorder therapeutics
KR20140138850A (ko) 2012-03-02 2014-12-04 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Ｉｉｉ형 고셔병을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2013177287A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 Georgia Regents University Methods and vectors for gene targeting with inducible specific expression
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
WO2014016873A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a
CN103864913A (zh) 2012-12-18 2014-06-18 联亚生技开发股份有限公司 重组蛋白
WO2014128257A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
EP2769732A1 (en) 2013-02-22 2014-08-27 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
EP2851086A1 (en) 2013-09-20 2015-03-25 Sanofi Serpins: methods of therapeutic ß-cell regeneration and function
EP2970420A4 (en) 2013-03-15 2016-08-17 Apotex Inc STABILITY OF THE ENHANCED LIQUID FORMULATION OF ERYTHROPOIETIN ALPHA VIA A PURIFICATION TREATMENT
WO2014152497A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
AU2014262566A1 (en) 2013-05-08 2015-11-12 Zymeworks Inc. Bispecific HER2 and HER3 antigen binding constructs
US11013917B2 (en) 2013-06-21 2021-05-25 Newsouth Innovations Pty Limited Method and apparatus for close-field electroporation
US10563225B2 (en) * 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
WO2016116966A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
EP3347486A4 (en) 2015-09-09 2019-06-19 The Trustees of Columbia University in the City of New York REDUCTION OF ER-MAM-LOCALIZED APP-C99 AND METHOD FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER DISEASE
GB2558131B (en) 2015-09-21 2021-05-19 Surface Oncology Inc Anti-CD47 antibodies and methods of use
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
US11594135B2 (en) 2015-11-02 2023-02-28 Memgen, Inc. Methods of CD40 activation and immune checkpoint blockade
US10765724B2 (en) 2016-03-29 2020-09-08 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis with increased interval dosing of anti-IL12/23 antibody
BR112019000683A2 (pt) 2016-07-15 2019-04-24 Poseida Therapeutics Inc receptores de antígeno quiméricos e métodos para uso
ES2841648T3 (es) 2016-07-15 2021-07-08 Hoffmann La Roche Procedimiento para purificar eritropoyetina PEGilada
JP2019528044A (ja) 2016-07-15 2019-10-10 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｍｕｃ１に特異的なキメラ抗原受容体（ｃａｒｓ）およびその使用方法
CA3105873A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
US20190119636A1 (en) 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
CA3037961A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating psoriasis with anti-il23 specific antibody
KR102447083B1 (ko) 2016-10-06 2022-09-26 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 유도성 카스파제 및 사용 방법
JP2020502261A (ja) 2016-11-16 2020-01-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ２３特異的抗体で乾癬を治療する方法
KR20240038146A (ko) 2017-01-30 2024-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 건선성 관절염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
CN110418652A (zh) 2017-02-07 2019-11-05 詹森生物科技公司 用于治疗活动性强直性脊柱炎的抗tnf抗体、组合物和方法
CN110650743B (zh) 2017-03-13 2023-12-29 波赛达治疗公司 用于选择性消除和替换造血干细胞的组合物和方法
JP2020532987A (ja) 2017-09-08 2020-11-19 ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド キメラリガンド受容体（ｃｌｒ）介在性の条件遺伝子発現のための組成物および方法
TW201922780A (zh) 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
MA51208A (fr) 2017-12-01 2020-10-07 Seattle Genetics Inc Anticorps (masqués) contre cd47 et leurs utilisations pour le traîtement du cancer
MX2020006689A (es) 2017-12-20 2020-11-06 Poseida Therapeutics Inc Composiciones de vcar y metodos de uso.
CN111801120A (zh) 2017-12-29 2020-10-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法
KR102497097B1 (ko) 2017-12-29 2023-02-06 에프. 호프만-라 로슈 아게 페길화 단백질 조성물의 제공 방법
EP3731871B1 (en) 2017-12-29 2023-10-04 F. Hoffmann-La Roche AG Process for providing pegylated protein composition
CA3092551A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn's disease with anti-il23 specific antibody
BR112020018049A2 (pt) 2018-03-07 2020-12-29 Poseida Therapeutics, Inc. Composições de cartirina e métodos para uso
LT3781943T (lt) 2018-04-20 2022-07-11 Janssen Biotech, Inc. Chromatografinės kolonos kvalifikavimas gamybinių metodų, skirtų pagaminti anti-il-12/il-23 antikūnų kompozicijas, metu
WO2020016838A2 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Janssen Biotech, Inc. Sustained response predictors after treatment with anti-il23 specific antibody
EP3847197A1 (en) 2018-09-05 2021-07-14 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
DK3883606T5 (da) 2018-09-24 2024-01-02 Janssen Biotech Inc Sikker og effektiv fremgangsmåde til behandling af colitis ulcerosa med anti-il12/il23-antistof
KR20210093973A (ko) 2018-11-20 2021-07-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-il23 특이적 항체로 건선을 치료하는 안전하고 효과적인 방법
WO2020128864A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating lupus with anti-il12/il23 antibody
JP2022513507A (ja) 2018-12-20 2022-02-08 ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド ナノトランスポゾン組成物および使用方法
MX2021008537A (es) 2019-01-15 2021-11-12 Janssen Biotech Inc Composiciones de anticuerpos anti-tnf y métodos para el tratamiento de la artritis idiopática juvenil.
KR20210118878A (ko) 2019-01-23 2021-10-01 얀센 바이오테크 인코포레이티드 건선성 관절염의 치료 방법에 사용하기 위한 항-tnf 항체 조성물
JP2022526881A (ja) 2019-03-14 2022-05-27 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｔｎｆ抗体組成物を産生するための方法
EP3938384A4 (en) 2019-03-14 2022-12-28 Janssen Biotech, Inc. METHODS OF MANUFACTURING FOR PRODUCING ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY COMPOSITIONS
MA55282A (fr) 2019-03-14 2022-01-19 Janssen Biotech Inc Procédés de fabrication pour la production de compositions d'anticorps anti-tnf
US20220153829A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 Janssen Biotech, Inc. Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
BR112021018441A2 (pt) 2019-03-18 2023-02-28 Janssen Biotech Inc Método para tratamento de psoríase em indivíduos pediátricos com anticorpo anti-il12/il23
MX2021014302A (es) 2019-05-23 2022-01-04 Janssen Biotech Inc Metodo para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino con una terapia de combinacion de anticuerpos contra il-23 y tnf alfa.
CA3142580A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
WO2020245676A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions, and methods for the treatment of psoriatic arthritis
TW202112354A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 遮蔽抗體調配物
US20220306727A1 (en) 2019-06-05 2022-09-29 Seagen Inc. Methods of Purifying Masked Antibodies
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
JP2022545917A (ja) 2019-08-27 2022-11-01 トニックス ファーマ リミテッド 修飾ｔｆｆ２ポリペプチド
CA3149892A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Eric M. Ostertag Allogeneic cell compositions and methods of use
US20230079955A1 (en) 2019-12-20 2023-03-16 Poseida Therapeutics, Inc. Anti-muc1 compositions and methods of use
KR20220149588A (ko) 2020-03-04 2022-11-08 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 대사성 간 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
EP4118107A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
KR20230011295A (ko) 2020-04-14 2023-01-20 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 암 치료에 사용하기 위한 조성물 및 방법
WO2022087148A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
AU2022227607A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
EP4298205A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
US20240182921A1 (en) 2021-03-04 2024-06-06 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of hemophilia
EP4305062A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriatic arthritis patients with inadequate response to tnf therapy with anti-il23 specific antibody
US20220298236A1 (en) 2021-03-12 2022-09-22 Janssen Biotech, Inc. Safe and Effective Method of Treating Psoriatic Arthritis with Anti-IL23 Specific Antibody
IL309996A (en) 2021-07-09 2024-03-01 Janssen Biotech Inc Production methods for the production of anti-TNF antibody compositions
CN117916260A (zh) 2021-07-09 2024-04-19 詹森生物科技公司 用于制备抗il12/il23抗体组合物的制造方法
AU2022306144A1 (en) 2021-07-09 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
EP4370211A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Seagen Inc. Antibody masking domains
WO2023049825A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
KR20240099249A (ko) 2021-10-04 2024-06-28 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 트랜스포사제 및 이의 용도
AU2022360244A1 (en) 2021-10-04 2024-04-11 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon compositions and methods of use thereof
KR20240099352A (ko) 2021-10-29 2024-06-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-il23 특이적 항체로 크론병을 치료하는 방법
AU2022388887A1 (en) 2021-11-15 2024-07-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn's disease with anti-il23 specific antibody
US20230159633A1 (en) 2021-11-23 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Method of Treating Ulcerative Colitis with Anti-IL23 Specific Antibody
WO2023141576A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2023164573A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified cells and methods of use thereof
WO2023223265A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Janssen Biotech, Inc. Method for evaluating and treating psoriatic arthritis with il23 antibody
WO2024036273A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric cd8-alpha co-receptor compositions and methods of use
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte
WO2024110898A1 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Janssen Biotech, Inc. Method of treating ulcerative colitis with anti-il23 specific antibody
WO2024129459A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 University Of Rochester Repairmen! of barrier dysfunction in esophagus

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
AU572108B2 (en) * 1983-01-19 1988-05-05 Genentech Inc. Human tpa production using vectors coding for dhfr protein
US4680174A (en) * 1984-05-24 1987-07-14 Damon Biotech, Inc. Induction of immune response by immunization with encapsulated antigen-producing cells
US4822736A (en) * 1984-07-05 1989-04-18 Baylor College Of Medicine Amplification of adenosine deaminase genes in mammalian cells using adenosine, alanosine, uridine, and deoxycoformycin
JP2703893B2 (ja) * 1985-07-05 1998-01-26 ホワイトヘッド・インスティテュ−ト・フォ−・バイオメディカル・リサ−チ 外来遺伝子物質を発現する上皮細胞
DE3789678T2 (de) * 1986-02-27 1994-08-11 Snow Brand Milk Prod Co Ltd Herstellung von erythropoietinproduzierenden Zellen und Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin mit Verwendung dieser Zellen.
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
GB8615942D0 (en) * 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
DE3855681T2 (de) * 1987-05-01 1997-05-28 The General Hospital Corp., Boston, Mass. Transkaryotische Einpflanzung
GB8718779D0 (en) * 1987-08-07 1987-09-16 Grosveld F G Dna sequence & expression vector
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5043270A (en) * 1989-03-31 1991-08-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intronic overexpression vectors
AU636630B2 (en) * 1989-06-23 1993-05-06 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Efficient method for identifiable expression of non-selectable genes
CA2045175C (en) * 1989-11-06 2003-03-18 Arthur I. Skoultchi Production of proteins using homologous recombination
US5272071A (en) * 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
DE779362T1 (de) * 1989-12-22 2001-04-05 Applied Research Systems DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen
WO1991013151A1 (en) * 1990-02-22 1991-09-05 Biogen, Inc. Improved expression of polypeptides
IT1241123B (it) * 1990-04-19 1993-12-29 Consiglio Nazionale Ricerche Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali,loro preparazione e loro impiego
AU654284B2 (en) * 1990-06-12 1994-11-03 Baylor College Of Medicine Method for homologous recombination in animal and plant cells
DE69133557D1 (de) * 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
AU650085B2 (en) * 1990-11-13 1994-06-09 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
DE69131015T2 (de) * 1990-12-07 1999-11-18 Univ Florida Rekombinante zellen, die stark chromosomal-integrierte heterologe gene exprimieren
JPH06507550A (ja) * 1991-05-06 1994-09-01 セル　ジェネシス，インコーポレイティド ゲノム性要素を使用する遺伝子の操作および発現
EP0539573A4 (en) * 1991-05-15 1993-12-29 Cell Genesys, Inc. Genomic modifications with homologous dna targeting
WO1993004169A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
MX9305183A (es) * 1992-08-27 1994-05-31 Us Agriculture Intron portatil, molecula de adn genomico viral, virus vivo y vacuna que los contiene y metodo para su obtencion.
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery

Also Published As

Publication number Publication date
KR100379356B1 (ko) 2003-06-09
SK146196A3 (en) 1998-02-04
FI964536A (fi) 1997-01-09
IL113708A0 (en) 1995-08-31
AU2550495A (en) 1995-12-05
CZ325896A3 (en) 1997-12-17
BR9507874A (pt) 1997-08-19
MX9605542A (es) 1998-05-31
CZ295115B6 (cs) 2005-05-18
HU9603144D0 (en) 1997-01-28
CA2190289A1 (en) 1995-11-23
NZ285945A (en) 1998-03-25
UA34493C2 (uk) 2001-03-15
JPH10500570A (ja) 1998-01-20
AU709058B2 (en) 1999-08-19
EP0759082A1 (en) 1997-02-26
FI964536A0 (fi) 1996-11-12
US5641670A (en) 1997-06-24
NO964802D0 (no) 1996-11-12
WO1995031560A1 (en) 1995-11-23
RU2267533C2 (ru) 2006-01-10
ZA953879B (en) 1996-01-18
KR970703429A (ko) 1997-07-03
NO964802L (no) 1997-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT76844A (en) Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof
EP0672160B1 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
US6537542B1 (en) Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy and protein production
US6565844B1 (en) Protein production and protein delivery
US6924365B1 (en) Optimized messenger RNA
US20140350089A1 (en) Optimized messenger rna
JPH11502122A (ja) タンパク質生産および輸送
WO2002064799A2 (en) Optimized messenger rna
US20050129669A1 (en) DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
EP1325138A2 (en) Optimized messenger rna
AU726446B2 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
AU738395B2 (en) DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
US20130034875A1 (en) Dna construct, and process for production of recombinant cho cell using same

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees