JP4220673B2 - 遍在性クロマチンオープニングエレメント(ucoe)を含むポリヌクレオチド - Google Patents
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Description
本発明は、LCR由来ではない遍在性クロマチンオープニングエレメント(ubiquitous chromatin opening element)(UCOE)を含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞、治療およびアッセイにおけるこのポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用、ならびにUCOEを同定する方法に関する。
【0002】
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」に組織化されていると仮定している(DillonおよびGrosveld、1994)。クロマチンドメインは、ヒトβ−グロビンファミリー(Grosveldら、1993)のように厳密な組織特異的様式で発現される遺伝子、ヒトTBP/C5遺伝子座(Trachtulec,Z.ら、1997)のような遍在的に発現される遺伝子、またはマウスγ/δTCR/dad−1遺伝子座(Hongら、1997;Ortizら、1997)ならびにヒトα−グロビン遺伝子座(Vyasら、1992)のような組織特異的に発現される遺伝子および遍在的に発現される遺伝子の混合物、の群からなり得る。2つの異なる組織特異性を有する遺伝子もまた、密接に連鎖され得る。例えば、ヒト成長ホルモンおよび絨毛性体乳腺発育ホルモン遺伝子(Jonesら、1995)。クロマチンドメインは、閉鎖した「凝縮された」転写的にサイレントな状態、または「非凝縮性の」開かれかつ転写的に能力を有する立体配置のいずれかで存在すると予見される。DNase I感受性、DNAの低メチル化およびヒストンの高アセチル化によって特徴付けられる開いたクロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始に対する先行条件であると考えられる。
【0003】
遺伝子座調節領域(LCR)として公知の組織特異的転写調節エレメントの発見は、転写的に能力を有する開いたクロマチンドメインが、特定の症例において確立および維持される機構に対して新規の見識を提供した。LCRは、シス(cis)で連結された遺伝子に対して、特に単一コピーの導入遺伝子として(Ellisら、1996;Raguzら、1998)、宿主細胞型で制限された、組み込み部位とは独立した、コピー数依存性の遺伝子発現を付与するそれらの能力によって規定される(Grosveldら、1987;Langら、1988;Greavesら、1989;Diazら、1994;CarsonおよびWiles、1993;Boniferら、1990;Montoliuら、1996;Raguzら、1998;EP−A−0 332 667)。LCRは、ヘテロクロマチンの展開(spread)を妨げ得、そして位置効果の多様化を予防し得る(Festensteinら、1996;Milotら、1996)。LCRによって付与されるこの発現のパターンは、これらのエレメントが、強力なクロマチンリモデリング能力を保有し、そして転写的に能力を有する開いたクロマチンドメインを確立および維持し得ることを示唆する。さらに、LCRは、それらの同属のプロモーターとは独立して、組織特異的遺伝子発現を付与することを可能にする固有の転写活性化能力を保有することが見出されている(Blom van Assendelftら、1989;Collisら、1990;AntoniouおよびGrosveld、1990;Greavesら、1989)。
【0004】
すべてのLCRは、顕著な組織特異的成分または組織を制限された成分を有する遺伝子ドメインと関連し、そして一連のDNase I高感受性部位(hypersensitive site)(これは、それらが調節する遺伝子の5’(Grosveldら、1987;CarsonおよびWiles、1993;Boniferら、1994;Jonesら、1995;Montoliuら、1996)、または3’(Greavesら、1989)のいずれかに位置し得る)と関連する。さらに、LCRエレメントは、近接で隔てられた遺伝子間に存在することが近年見出された(Hongら、1997;Ortizら、1997)。LCR様エレメントはまた、遺伝子内にイントロンの位置を有することが報告されている(Aronowら、1995)。研究されたいくつかの場合において、これらのエレメントは、組織特異的転写因子結合部位および遍在性転写因子結合部位の大きなクラスターに対応する(Talbotら、1990;Philipsenら、1990;Pruzinaら、1991;Lakeら、1990;Jarmanら、1991;Aronowら、1995)。
【0005】
LCRの発見は、所定のクロマチンドメインからの組織特異的遺伝子発現を制御する調節エレメントが、階層様式で組織化されていることを示唆する。LCRは、マスタースイッチとして作用するようであり、ここでは、この活性化が、いかなる遺伝子発現にも先行する必要がある開いたクロマチン構造の確立をもたらす。次いで、生理学的に要求されるレベルでの転写が、LCRと個々の遺伝子の局所的プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントとの間で、介在DNAのルーピングを介した直接的クロマチン相互作用を通して達成され得る(Hanscombeら、1991;Wijgerdeら、1995;Dillonら、1997)。
【0006】
上記のように、LCRの本質的特徴は、その組織特異性である。LCRの組織特異性は、Ortizら(1997)によって研究されており、ここではT細胞レセプターα(TCRα)LCRの多くのDNase I高感受性部位が欠失され、そして多くの組織においてクロマチンを開かせるLCR由来のエレメントが同定された。Talbotら(1994、NAR 22:756−766)は、多くの組織において連鎖遺伝子の発現を可能にすると考えられるLCR様エレメントを記載する。しかし、この連鎖遺伝子の再現可能な(reproducible)発現は得られていない。この発現レベルは、遺伝子コピーあたりの基準(per−gene−copy basis)(ここで、遺伝子は発現され、導入遺伝子のコピー数は3つ以上である)に対する平均値から74%の間の標準偏差を有するとして示される。コピー数が1または2である場合、遺伝子発現レベルは10倍低く、そして遺伝子コピーあたりの基準(ここで、遺伝子は発現される)に対する平均値から49%の標準偏差を有する。Talbotらによって開示されたエレメントは、連鎖した遺伝子の再現可能な発現を与えない。このことおよびこの系の高度な可変性は、この系の用途を明らかに限定する。
【0007】
遺伝的に遺伝された障害の遺伝子治療による長期矯正は、治療的価値を有するに十分な高レベルでの、転写単位の維持および持続発現を必要とする。これは、2つのアプローチのうちの1つによって達成され得る。最初に、転写単位は、例えば、レトロウイルスベクター(Miller、1992;Millerら、1993)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(Muzyczka、1992;Kotin、1994;FlotteおよびCarter、1995)を使用して、宿主細胞ゲノム内に安定的に組みこまれ得る。あるいは、治療用遺伝子は、EBV由来(Yatesら、1985)、ヒトパポバウイルスBK由来(De BenedettiおよびRhoads、1991;CooperおよびMiron、1993)およびBPV−1由来(Piirsooら、1996)の複製起点のようなウイルス性複製起点を含む自己複製エピソームベクター内に組み込まれ得る。
【0008】
不幸なことに、ゲノム内に組みこまれる遺伝子から通常見られる発現のレベルは、大半の場合には治療的価値があるには非常に低すぎるかまたは持続期間が短すぎる。これは、「位置効果」として一般的に公知のものに起因する。導入される遺伝子の転写は、競合する活性化エレメント(プロモーター/エンハンサー)またはより頻繁には抑制エレメント(クロマチンサイレンシング)のいずれかの影響下になるその組み込み部位に依存する。位置効果は、レトロウイルス起源およびアデノ随伴ウイルス(AAV)起源の組み込み型ウイルスに基づくベクターの治療的効力に対して、実質的な拘束を課し続ける。ウイルス転写調節エレメントは、組み込み部位の近傍におけるクロマチンエレメントによるサイレンシングに対して周知なように感受性である。ウイルス構築物の一部として高度に発現される遺伝子由来の伝統的なプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含ませることは、この主要な問題点を解決しなかった(Daiら、1992;Leeら、1993)。
【0009】
転写単位の一部として十分に機能的なLCRを含ませることは、この欠陥を克服する。なぜなら、このエレメントは、特定の細胞型における所望の遺伝子の予想可能で、生理学的で、かつ持続された発現レベルを駆動するために使用され得るからである(YeomanおよびMellor、1992;BrinesおよびKlaus、1993;Needhamら、1992および1993;Tewariら、1998;Zhumabekovら、1995を参照のこと)。この発現の予測可能性の程度は、安全かつ首尾良い遺伝子治療ストラテジーのために重要である。
【0010】
複製型エピソームベクター(REV)の使用は、長期間の遺伝子発現を生成する組み込み型ウイルスベクターに対して魅力的な代替を提供する。最初に、REVは、ウイルスベクターが要求するのと同じような、治療用の転写単位に対する大きさの制限を要求せず、300kbを超える挿入物が可能である(Sunら、1994)。第2に、エピソームであるので、REVは、組み込み型ウイルスベクターに伴う固有の問題である挿入性変異誘発に関連する潜在的危険性を被らない。最後に、REVは、ウイルスベクターを用いる場合よりも安価なスケールで生成され得る非ウイルス送達系を使用して、標的細胞内に導入される。
【0011】
非複製性の一過的にトランスフェクトされるプラスミド(Reevesら、1985;Archerら、1992)およびREV(Reevesら、1985;Smithら、1993)の両方が、ヌクレオソームを構築することが実証された。REV上でのアセンブリは、より組織化されており、そして天然のクロマチンに類似する。一方、一過的プラスミド上でのヌクレオソームは、あまり十分に順序付けられておらず、そして標的配列への転写因子の幾分かの接近を可能にし得るが、遺伝子発現は阻害され得る(Archerら、1992)。LCRは、REV内からの長期間の組織特異的遺伝子発現を付与し得ることが、近年実証された(国際特許出願WO98/07876)。
【0012】
高レベルの治療用タンパク質産物を生成する培養哺乳動物細胞株の産生は、主要な発展産業である。クロマチンの位置効果は、これを困難で、時間がかかり、かつ高価なプロセスにさせる。このような哺乳動物の「細胞工場」の産生に対して最も一般に使用されるアプローチは、薬物耐性遺伝子(例えば、DHFR、グルタミンシンテターゼ(Kaufman、1990))および高い有毒薬物濃度(これは、常時維持されていなければならない)との組み合わせによって誘導される遺伝子増幅に依存する。高度に発現された遺伝子ドメイン由来のLCRを保有するベクターの使用は、これらの細胞株の産生を非常に単純化する(Needhamら、1992;Needhamら、1995)。
【0013】
LCRの使用に伴う問題は、LCRが組織特異的であり、そして再現可能な発現が特定の細胞型においてのみ得られるということである。従って、LCRが存在しない1つの組織型または多くの組織型において、再現可能な発現は獲得され得ない。従って、LCR由来ではないUCOEについての必要性が存在する。
【0014】
上記のように、Ortizら(1997)は、多くの組織においてクロマチンを開かせるLCR由来のエレメントを開示する。Ortizら(1997)のLCR由来のエレメントに伴う多くの問題が存在する。特に、このエレメントは、LCRの必須領域を含むために、組換えDNA技術を使用して注意深く構築されなければならない。そしてまた、このエレメントは、特にこのエレメントが1または少数(3未満)の導入遺伝子コピー数である場合に、異なる組織型の細胞において連鎖した遺伝子の再現可能なレベルの発現を与えない。
【0015】
二方向性プロモーターおよびメチル化されていないCpG島を含むエレメントが、開示されている;しかし、このエレメントがクロマチンを開くか、または開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも2つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは、全く開示も指摘もされていない。
【0016】
ヒトSurfeit遺伝子座は、およそ60kbにわたり、そして染色体9q34.2に位置する。この遺伝子座は、SURF5遺伝子とSURF3遺伝子との間、およびSURF1遺伝子とSURF2遺伝子との間に二方向性プロモーターを含む(Huxleyら、Mol.Cell.Biol.10、605−614、1990;Duhigら、Genomics 52、72−78、1998;Williamsら、Mol.Cell.Biol.6、4558−4569、1986)。これらの領域が、クロマチンを開くかまたは開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも2つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは全く指摘されていない。
【0017】
二方向性プロモーターはまた、鳥類のGPAT遺伝子とAIRC遺伝子との間で、Braytonら(J.Biol.Chem.,269:5313−5321、1994)によって開示されている。重ねて、この領域が、クロマチンを開くかまたは開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも2つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは全く指摘されていない。
【0018】
二方向性プロモーターは、ミトコンドリアのシャペロニン(chaeronin)60遺伝子とシャペロニン10遺伝子との間で、Ryanら(Gene、196、9−17、1997)によって開示されている。重ねて、この領域が、クロマチンを開くかまたは開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも2つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは全く指摘されていない。
【0019】
マウスHTF9遺伝子と結合した二方向性プロモーターもまた、開示される。重ねて、この領域がクロマチンを開くか、またはクロマチンを開いた状態に維持し、そして少なくとも2つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするという指摘は存在しない。
【0020】
Palmiterら(PNAS USA、95、8428〜8430、1998)および国際特許出願WO 94/13273は、メタロチオネイン遺伝子と結合したエレメントを開示する。このエレメントは、プロモーターと結合しないDNase I高感受性部位を含む。さらに、このエレメントがクロマチンを開かないか、またはクロマチンを開いた状態に維持せず、そして少なくとも2つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることを示す証拠は存在しない。
【0021】
複製せず、一過的にトランスフェクトされたプラスミドが、トランスフェクトした細胞による遺伝子発現を達成する使用は、周知である。短期間発現(一般的に72時間未満)のみが複製せず一過的にトランスフェクトされたプラスミドを使用して達成されることもまた、公知である。短期間の発現は、一般的に、プラスミドの分解または細胞からのプラスミドの損失に起因すると考えられている。この分解を考慮すると、このようなプラスミドの使用は制限される。
【0022】
本発明は、クロマチンを開くか、またはクロマチンを開いた状態に維持するかして、少なくとも2つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするUCOEを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで、このポリヌクレオチドは、遺伝子座調節領域に由来しない。
「遺伝子座調節領域」(LCR)は、真核生物宿主細胞の組織特異的遺伝子座から得られ、そして目的の遺伝子に連結されて宿主細胞の染色体に導入された場合に目的の遺伝子に対して組織特異的で、組み込み部位とは独立な、コピー数依存性の発現を、目的の遺伝子に対して付与する遺伝的エレメントとして規定される。LCRに由来するポリヌクレオチドは、LCRの1つまたは複数の任意の部分であり得る。好ましくは、LCRに由来するポリヌクレオチドは、クロマチンを開くように機能するLCRの任意の部分である。LCRは、プロモーターと結合しない1つ以上のDNase I高感受性(HS)部位と結合する。そして、UCOEが、プロモーターと結合しないHS部位を含まないことが好ましい。HS部位は、当業者に周知であり、そして標準的技術に基いて同定され得る。そのような標準技術は、本明細書中に記載される。
【0023】
用語「再現可能な発現を容易にする」とは、UCOEが、作動可能に連結された遺伝子の転写の再現可能な活性化を容易にする能力をいう。このプロセスは、UCOEが、この遺伝子(または少なくとも転写因子結合部位)を包含するクロマチンの領域を、転写因子と接近可能にする能力に関与すると考えられている。再現可能な発現とは、好ましくは、このポリヌクレオチドが、発現可能な遺伝子に作動可能に連結された場合に、そのクロマチン環境とは無関係に、好ましくは細胞組織型とは無関係に、作動可能に連結された遺伝子の実質的に同レベルの発現を生じることを意味する。好ましくは、実質的に同レベルの発現とは、遺伝子コピーあたりの基準に対して、平均値から、48%未満、より好ましくは40%未満、そして最も好ましくは25%未満の標準偏差を有する発現のレベルを意味する。あるいは、実質的に同レベルの発現とは、好ましくは、発現のレベルが、遺伝子コピーあたりの基準に対して、10倍未満、より好ましくは5倍未満、そして最も好ましくは3倍未満変化することを意味する。発現のレベルは、好ましくは、トランスジェニック動物において測定された発現のレベルである。UCOEが、1または低(3未満)コピー数で存在する場合に、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることが、特に好ましい。
【0024】
本明細書中で使用された場合に、「連結された」とは、遺伝子およびUCOEが同一の核酸分子上にシス(cis)関係で存在するシス連結をいう。用語「作動可能に連結された」とは、遺伝子がUCOEにより容易にされた発現に供されたシス連結をいう。
【0025】
開いたクロマチンまたは開いた状態のクロマチンは、非凝縮状態にあるクロマチンをいい、そしてまた真正クロマチンとも言われる。凝縮したクロマチンはまた、ヘテロクロマチンとも言われる。上述のように、閉じた(凝縮した)状態のクロマチンは、転写的にサイレントである。開いた(非凝縮性の)状態のクロマチンは、転写的に能力がある。開いたクロマチン構造の確立は、DNase I感受性、DNAの低メチル化およびヒストンの高アセチル化により特徴付けられる。開いたクロマチンを同定する標準的方法は、当業者に周知であり、そしてWu、1989、Meth.Enzymol.170、269〜289;Crane−Robinsonら、1997、Methods、12、48〜56;Reinら、1998、N.A.R.26、2255〜2264に記載されている。
【0026】
用語「2つ以上の組織型の細胞」とは、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも4つ、そしてより好ましくは全ての、以下の異なる組織型の細胞をいう:心臓、腎臓、肺、肝臓、腸、骨格筋、性腺、脾臓、脳、および胸腺組織。好ましくは、ポリヌクレオチドは、非組織特異的に、すなわち、組織特異性なしで、再現可能な発現を容易にする。本発明のポリヌクレオチドが、活性な遺伝子が生じる組織型の少なくとも50%、そしてより好ましくはすべてにおいて再現可能な発現を容易にすることがさらに好ましい。
【0027】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、生理学的レベルで、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする。生理学的レベルにより、細胞、細胞の集団または患者での発現が生理学的効果を示す遺伝子発現のレベルが意味される。好ましくは、この生理学的レベルは、所望の結果に依存して最適の生理学的レベルである。好ましくは、この生理学的レベルは、対応する内在性遺伝子の発現のレベルに等価である。
【0028】
本発明のUCOEは、任意のエレメントであり得、このエレメントは、クロマチンを開くかまたはクロマチンを開いた状態に維持するかして、少なくとも2つの異なる組織型の細胞における作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするが、ただしこのエレメントは、LCRに由来しない。好ましい実施態様において、UCOEは、伸長したメチル化していないCpG島を含む。CpG島は、バルクDNAにおける平均40%と比較して、平均GC含量約60%を有する。当業者は、標準技術を使用して(例えば、CおよびG配列に特異的な制限酵素を使用して)CpG島を容易に同定し得る。このような技術は、Larsenら、1992およびKolstoら、1986に記載されている。伸長したメチル化していないCpG島とは、1より多い転写開始部位を包含する領域にわたって伸長し、そして/または300bpを超えて、そして好ましくは500bpを超えて伸長する、メチル化していないCpG島である。
【0029】
好ましくは、UCOEは、その天然の内在性の位置において、遍在して発現される遺伝子と結合し、より好ましくはそれに隣接して位置付けられる配列に由来する。UCOEは、少なくとも1つの転写因子結合部位を包含することが、さらに好ましい。転写因子結合部位は、プロモーター配列およびエンハンサー配列を含む。好ましくは、UCOEは、多岐に転写される、二重プロモーターまたは二方向性プロモーターを含む。二重プロモーターは、互いに独立している2つ以上のプロモーターであり、その結果、そのプロモーターのうちの1つが、他のプロモーターに影響することなく活性化または不活化され得るとして、本明細書中で規定される。二方向性プロモーターとは、両方の方向でプロモーターとして作用し得るが、1つの方向のみでは活性化または不活化され得ない領域として、本明細書中で規定される。好ましくは、UCOEは、二重プロモーターを包含する。好ましくは、UCOEは、多岐に転写し(すなわち、反対方向の転写を導き得)、そしてその天然の内在性位置が遍在して発現される遺伝子と結合する、二重または二方向性プロモーターを含む。好ましくは、UCOEは、多岐に転写する二重プロモーターを含む。UCOEは、異種プロモーター(すなわち、UCOEの他の配列と天然には結合しないプロモーター)を含み得る。例えば、hnRNP A2およびHP1H−γプロモーターと結合したUCOEを伴ってCMVプロモーターを使用することが可能であり、これは、以下にさらに考察される。従って、本発明はまた、1つ以上の異種プロモーターを含むUCOEを提供する。異種プロモーター(単数または複数)は、UCOEの1つ以上の内在性プロモーターを置換し得るか、またはUCOEの1つ以上の内在性プロモーターに加えて使用され得る。異種プロモーターは、組織特異的プロモーター(例えば、腫瘍特異的プロモーターおよび遍在性プロモーター)を含む任意のプロモーターであり得る。好ましくは、異種プロモーターは、実質的に遍在性のプロモーターであり、そして最も好ましくはCMVプロモーターである。
【0030】
好ましくは、UCOEは、Laviaら、EMBO J.,6,2773〜2779(1987)に記載されるように、HpaIIの小さいフラグメント(HTF)島HTF9の二方向性プロモーターを含む、3725bpのEcoRIフラグメントではない。
【0031】
好ましくは、UCOEは、Surfeit遺伝子座(Williamsら、Mol.Cell.Biol.13、4784〜4792、1993)のマウスSURF1遺伝子とSURF2遺伝子との間に位置する800bp BamHIゲノムフラグメント内に位置する149bpのMES−1エレメントではない。好ましくは、UCOEは、Surfeit遺伝子座(Williamsら、Mol.Cell.Biol.13、4784〜4792、1993)のSURF5遺伝子とSURF3遺伝子との間に位置する二方向性プロモーターではない。UCOEは、Duhigら、Genomics、52、72〜78(1998)に規定されるように、60kbにわたりそして染色体9q34.2に位置するヒトsurfeit遺伝子の遺伝子座、または対応するマウス遺伝子座(Huxleyら、Mol.Cell.Biol.10、605〜614、1990)に由来しない。
【0032】
好ましくは、UCOEは、GenBankデータベースに寄託された1350bp SmaIフラグメント(登録番号L12533)(Gavalasら、Mol.Cell.Biol.13、4784〜4792、1993)に含まれる、鳥類GPAT遺伝子とAIRC遺伝子との間に位置する二方向性プロモーター領域、または対応するヒトの等価物(Braytonら、J.Biol.Chem.269、5313〜5321、1994)ではない。
【0033】
好ましくは、UCOEは、ラットのミトコンドリアシャペロニン60遺伝子およびシャペロニン10遺伝子を含む13894bpゲノムDNAフラグメント(GenBank登録番号U68562)ではない。UCOEが、ラットのミトコンドリアシャペロニン60遺伝子とシャペロニン10遺伝子との間の遺伝子間領域に位置する二方向性プロモーター(Ryanら、Gene 196、9−17、1997)を含む581bpフラグメントではないこともまた、好ましい。
【0034】
本発明の好ましい実施態様において、UCOEは、ヒトTATA結合タンパク質(TBP)遺伝子ならびに各々12kbの5’隣接配列および3’隣接配列にわたる44kbのDNAフラグメント、またはその機能的ホモログもしくはフラグメントである。
【0035】
本発明のさらに好ましい実施態様において、UCOEは、30kbの5’隣接配列および20kbの3’隣接配列を伴ってヒトhnRNP A2遺伝子に広がる、60kb DNAフラグメント、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントである。さらに好ましい実施態様において、UCOEは、ヌクレオチド1から6264の間の図21の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、hnRNP A2プロモーター(ヌクレオチド5636〜6264)、およびHP1H−γプロモーターを含む5.5kbの5’隣接配列を包含する。
【0036】
本発明のさらに好ましい実施態様において、UCOEは、1kbの5’隣接配列および5kbの3’隣接配列を伴ってヒトTBP遺伝子に広がる、25kbのDNAフラグメント、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントである。
【0037】
さらに好ましい実施態様において、UCOEは、5kbの5’隣接配列および1.5kbの3’隣接配列を伴ってヒトhnRNP A2遺伝子に広がる、16kbのDNAフラグメント、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントである。
【0038】
さらに好ましい実施態様において、UCOEは、ヌクレオチド1と5636との間の図21の配列(hnRNP A2プロモーターの5.5kbの5’隣接配列)およびCMVプロモーター、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。
【0039】
さらに好ましい実施態様において、UCOEは、ヌクレオチド4102と8286との間の図21の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、hnRNP A2プロモーターおよびHP1H−γプロモーターの両方を包含する。
【0040】
さらに好ましい実施態様において、UCOEは、ヌクレオチド1と7627との間の図21の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、hnRNP A2プロモーターおよびHP1H−γプロモーターならびにhnRNP A2遺伝子のエキソン1の両方を包含する。
【0041】
さらに好ましい実施態様において、UCOEは、ヌクレオチド1と9127との間の図21の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、hnRNP A2プロモーターおよびHP1H−γプロモーター、ならびにhnRNP A2プロモーターの3’隣接配列(hnRNP A2遺伝子のエキソン2までだが、このエキソン2を含まない)の両方を包含する。
【0042】
本発明のUCOEが、図20または図21のヌクレオチド配列、あるいはその機能的フラグメントまたはホモログを有することが、さらに好ましい。
【0043】
用語「機能的ホモログまたはフラグメント」とは、本明細書中で使用される場合、クロマチンを開くかまたはクロマチンを開いた状態に維持して、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする、ホモログまたはフラグメントを意味する。好ましくは、このホモログは、同定されたUCOEに対応する種ホモログであるか、あるいは他の遍在して発現される遺伝子と結合するホモログである。配列比較がUCOE間でなされて、他のUCOEの同定および合成を可能にする保存配列モチーフが同定され得る。このような配列比較を実施するに適切なソフトウェアパッケージは、当業者に周知である。配列比較を実施するに好ましいソフトウェアパッケージは、PCGENE(Intelligenetics,Inc.USA)である。機能的フラグメントは、既知のUCOEのフラグメントを組織的に生成し、そして機能について試験することにより、容易に同定され得る。保存配列モチーフの同定もまた、機能的フラグメントの同定を補助する。なぜなら、この保存配列モチーフを含むフラグメントは、機能的であると思われるからである。機能的ホモログはまた、改変されたUCOE(ここで、このUCOEのエレメントは、類似のエレメントにより置換されている(例えば、UCOEの1つ以上のプロモーターを異なる異種プロモーターで置換する))を包含する。上記のように、異種プロモーターは、組織特異的プロモーター(例えば、腫瘍特異的プロモーターおよび遍在性プロモーター)を含む任意のプロモーターであり得る。好ましくは、この異種プロモーターは、強力な、かつ/または実質的に遍在性プロモーターであり、そして最も好ましくはCMVプロモーターである。
【0044】
本発明の別の実施態様において、少なくとも2つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするUCOEを同定する方法が提供される。この方法は、以下を包含する:
1.少なくとも2つの異なる組織型の細胞を、マーカー遺伝子に作動可能に連結された候補UCOEを含むベクターでトランスフェクトすることにより、候補UCOEを試験する工程;および
2.そのマーカー遺伝子の再現可能な発現が、2つ以上の異なる組織型の細胞において得られるか否かを決定する工程。
【0045】
好ましくは、本発明のUCOEを同定する方法は、遍在して発現される遺伝子、二重または二方向性プロモーター、および伸長したメチル化していないCpG島のうちの1つ以上と結合する候補UCOEを選択するさらなる工程を包含する。
【0046】
好ましくは、このマーカー遺伝子の再現可能な発現は、このマーカー遺伝子に連結された単一コピーのUCOEを含む細胞において決定される。
【0047】
本発明は、本発明の方法をさらに提供する。この方法において、候補UCOEが、以下の工程によって試験される:マーカー遺伝子に作動可能に連結された候補UCOEを含むベクターを含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を生成する工程、およびこのマーカー遺伝子の再現可能な発現が、2つ以上の異なる組織型の細胞において得られるか否かを決定する工程。好ましくは、この非ヒトトランスジェニック動物はF1、または、より遠い世代の非ヒトトランスジェニック動物である。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は、齧歯類、より好ましくはマウスである。
【0048】
本発明は、遍在して発現される遺伝子に結合するかまたは隣接する核酸配列に由来し得るUCOEを提供する。好ましくは、この核酸配列は、伸長した、メチル化していないCpG島を含む。この核酸配列が、少なくとも1つの転写因子結合部位を含むことがさらに好ましい。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写される、二重または二方向性プロモーターを含む。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写される、二重プロモーターを含む。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写され、そして遍在的に発現される遺伝子に結合した、二重または二方向性プロモーターを含む。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写され、そして遍在的に発現される遺伝子に結合した、二重プロモーターを含む。
【0049】
本発明はまた、他のUCOEを同定するためのアッセイにおける、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの使用を提供する。好ましくは、保存配列または保存構造モチーフを含むポリヌクレオチドのフラグメントが、使用される。このようなアッセイを実施する方法は、当業者に周知である。
【0050】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このベクターは、好ましくは、このポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現可能な遺伝子を含む。この発現可能な遺伝子は、以下のような遺伝子発現を可能にする必要なエレメントを含む:適切なプロモーター、エンハンサー、スプライスアクセプター配列、内部リボソーム侵入部位配列(IRES)および転写終止部位。遺伝子発現を可能にするに適切なエレメントは、当業者に周知である。遺伝子発現を可能にするに適切なエレメントは、この遺伝子に結合した天然の内在性エレメントであり得るか、あるいは内在性遺伝子と比較して異なるレベルまたは異なる組織分布の遺伝子発現を得るために使用される異種エレメントであり得る。好ましくは、このベクターは、発現可能な遺伝子と作動可能に結合したプロモーターおよびそのポリヌクレオチドを含む。このプロモーターは、発現可能な遺伝子の天然の内在性プロモーターであり得るか、あるいは異種プロモーターであり得る。異種プロモーターは、組織特異的プロモーター(例えば、腫瘍特異的プロモーターおよび遍在性プロモーター)を含む任意のプロモーターであり得る。好ましくは、この異種プロモーターは、強力かつ/または実質的に遍在性のプロモーターであり、そして最も好ましくはCMVプロモーターである。
【0051】
このベクターは、細胞にDNAを移入し得る任意のベクターであり得る。好ましくは、このベクターは、組み込み型ベクターまたはエピソームベクターである。
【0052】
好ましい組み込み型ベクターは、組換えレトロウイルスベクターを含む。組換えレトロウイルスベクターは、その部分が標的細胞に感染し得るレトロウイルスゲノムの少なくとも一部のDNAを含む。用語「感染」とは、ウイルスがその宿主または標的細胞に遺伝物質を移入するプロセスを意味するために使用される。好ましくは、本発明のベクターの構築において使用されるレトロウイルスはまた、複製欠損性にされて、標的細胞のウイルス複製の効果が除かれる。このような場合、この複製欠損ウイルスゲノムは、従来の技術に従って、ヘルパーウイルスによりパッケージされ得る。一般的に、感染性および機能的遺伝子移入の能力の上記の基準を満たす任意のレトロウイルスが、本発明の実施において使用され得る。
【0053】
適切なレトロウイルスベクターとしては、pLJ、pZip、pWeおよびpEMが挙げられるが、これらに限定されず、当業者に周知である。複製欠損レトロウイルスに適切なパッケージングウイルス株としては、例えば、ΨCrip、ΨCre、Ψ2およびΨAmが挙げられる。
【0054】
本発明において有用な他のベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40ウイルス、ワクシニアウイルス、HSVウイルスおよびポックスウイルスベクターが挙げられる。好ましいベクターは、アデノウイルスである。アデノウイルスベクターは、当業者に周知であり、そして多数の細胞型(気道上皮、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む)に遺伝子を送達するために使用されている(Hitt,MM、Addison CLおよびGraham,FL(1997)Human adenovirus vectors for gene transfer into mammalian cells. Advances in Pharmacology 40:137〜206;ならびにAnderson WF(1998)Human gene therapy.Nature 392(6679補遺):25〜30)。
【0055】
さらに好ましいベクターは、アデノ随伴(AAV)ベクターである。AAVベクターは、当業者に周知であり、そしてヒトTリンパ球、線維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および造血幹細胞を、遺伝子治療適用のために安定に形質導入するために使用されている(Philipら、1994、Mol.Cell.Biol.14、2411〜2418;Russellら、1994、PNAS USA、91、8915〜8919;Flotteら、1993、PNAS USA、90、10613〜10617;Walshら、1994、PNAS USA、89、7257〜7261;Millerら、1994、PNAS USA、91、10183〜10187;Emerson、1996、Blood、87、3082〜3088)。国際特許出願WO 91/18088は、特定のAAVベースのベクターを記載している。
【0056】
好ましいエピソームベクターには、ウイルスの複製起点由来の機能を有する、一過性の非複製エピソームベクターおよび自己複製性エピソームベクター(例えば、EBV、ヒトパポバウイルス(BK)およびBPV−1由来のベクター)が含まれる。このような組み込みおよびエピソームベクターは、当業者に周知であり、そして当業者に周知である文献の本文に十分に記載されている。特に、適切なエピソームベクターは、WO98/07876に記載されている。
【0057】
哺乳動物人工染色体もまた、本発明における使用のための好ましいベクターである。哺乳動物人工染色体の使用は、Calos(1996,TIG,12,463−466)によって議論される。
【0058】
好ましい実施態様において、本発明のベクターはプラスミドである。そのプラスミドが、非複製、非組み込みプラスミドであることは、さらに好ましい。
【0059】
本明細書中で使用される場合、用語「プラスミド」とは、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸分子をいい、これには、線状核酸、環状核酸、および二本鎖核酸または一本鎖酢酸が含まれる。この核酸は、DNAまたはRNAであり得、そして改変されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得、そしてメチル化あるいは保護基またはキャップ構造もしくはテール構造を含むことのような手段によって化学的に改変され得る。
【0060】
非複製、非組み込みプラスミドは、宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、複製せず、そして宿主細胞ゲノムに特異的に組み込まれることがない(すなわち、高頻度で組み込まれず、そして特定の部位に組み込まれない)核酸である。
【0061】
複製プラスミドは、Ustavら、EMBO J.,10,449−457,1991の標準的な複製アッセイを含む標準的なアッセイを使用して同定され得る。
【0062】
好ましくは、非複製、非組み込みプラスミドは、ゲノムDNA複製と独立して、細胞に安定に維持され得ないプラスミドであり、そして細胞中のプラスミドのコピー数の有意な損失(すなわち、所定の細胞分裂間での子孫細胞におけるプラスミド分子の平均約50%より多い損失を伴うこと)なしでは、3回以上の細胞分裂の間、子孫細胞において持続されないプラスミドである。一般的に、自己複製ベクターにおいて、自己複製機能は、ウイルスの複製起点を使用すること、および特定のウイルス起点によって媒介される複製のために必要とされる1つ以上のウイルス複製因子を提供することによって提供される。自己複製ベクターは、WO98/07876に記載される。本明細書中において、用語「一過的にトランスフェクトする、非組み込みプラスミド」は、上記の用語「非複製、非組み込みプラスミド」と同じことを意味する。
【0063】
好ましくは、そのプラスミドは、裸の核酸である。本明細書中で使用される場合、用語「裸の」とは、共有結合か、または水素結合かに関わらず、タンパク質、脂質、炭水化物、またはプロテオグリカンと直接的物理的に結合していない核酸分子をいう。この用語は、改変された核酸分子もしくはリボヌクレオチド、または、メチル化あるいは保護基またはキャップ構造もしくはテール構造を含むことのような手段による、核酸分子のすべてまたは一部の化学修飾の存在または非存在をいうのではない。
【0064】
好ましくは、本発明のベクターは、ヌクレオチド1と7627との間である図20の配列(hnRNP A2プロモーターおよびHP1H−γプロモーターの両方を含む)、CMVプロモーター、多重クローニング部位、ポリアデニル化配列、および適切な制御エレメント下で選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む。好ましくは、本発明のベクターは、図49に模式的に示すCET200ベクターまたはCET210ベクターである。
【0065】
本発明はまた、本発明のベクターを用いてトランスフェクトした宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および哺乳動物細胞のような任意の細胞であり得る。好ましくは、この宿主細胞は哺乳動物細胞であり、そしてCHO細胞株、293細胞株、およびNS0細胞のような哺乳動物細胞株に由来し得る。
【0066】
好ましくは、作動可能に連結された遺伝子は、治療用核酸配列である。本発明において使用され得る、治療的に有用な核酸配列には、レセプター、酵素、リガンド、調節因子、ホルモン、抗体もしくは抗体フラグメント、および構造タンパク質をコードする配列が挙げられる。治療用核酸配列にはまた、核タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、血清タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生生物抗原、および寄生生物抗原をコードする配列が挙げられる。本発明に従って有用な核酸配列にはまた、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、リンタンパク質、および核酸(例えば、RNAまたはアンチセンス核酸)をコードする配列が挙げられる。治療用核酸配列によってコードされ得るタンパク質またはポリペプチドには、ホルモン、増殖因子、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、レセプター、エリトロポイエチン、治療抗体またはそのフラグメント、薬物、オンコジーン、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、ウイルス抗原、寄生生物抗原、および細菌抗原が挙げられる。これらの化合物の特定の例には、プロインスリン、成長ホルモン、アンドロゲンレセプター、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、上皮増殖因子、トランスホーミング増殖因子α、トランスホーミング増殖因子β、血小板由来増殖因子、血管新生因子(酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、およびアンジオゲニン(angiogenin))、マトリックスタンパク質(IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、ラミニン)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オンコプロテイン(oncoprotein)(例えば、ras、fos、myc、erb、src、neu、sis、junによってコードされるもの)、HPV E6またはHPV E7オンコプロテイン、p53タンパク質、Rbタンパク質、サイトカインレセプター、IL−1、IL−6、IL−8、ならびにウイルス、細菌、および寄生生物由来のタンパク質(これらを使用して免疫学的応答を誘導し得る)、ならびに体内で有用な有意性の他のタンパク質が挙げられる。組み込まれる遺伝子の選択は、それをコードする核酸配列の利用可能性に限定されるのみである。当業者は、より多くのタンパク質およびポリペプチドが同定されるほど、それらは本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得、そして発現され得ることを容易に認識する。
【0067】
本発明のポリヌクレオチドがプラスミド中に含まれる場合、例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィーの処置において、およびDNAワクチン投与方法および免疫化方法において、一遺伝子の遺伝子治療においてそのプラスミドが使用されることが好ましい。
【0068】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、遺伝子産物の投薬量を増加させるために、宿主細胞においてすでに発現している遺伝子(すなわち、ネイティブな遺伝子または相同遺伝子)を発現されるために使用され得る。しかし、相同遺伝子の発現は、調節解除された発現を生じ得、細胞中でのその過剰発現に起因してUCOEによる制御に供されないかもしれないことに留意すべきである。
【0069】
本発明のポリヌクレオチドは、内在性(ネイティブ)遺伝子と作動可能に結合する位置で、細胞のゲノムに挿入され得、それによって内在性遺伝子の発現の増加をもたらす。特定の部位においてゲノム中にエレメントを挿入する方法は、当業者に周知であり、そしてUS−A−5,578,461およびUS−A−5,641,670に記載される。あるいは、ゲノムのその内在性(ネイティブ)位置における本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に結合する位置に挿入された遺伝子を有し得、その結果、その遺伝子の発現が起こる。また、特定の部位においてゲノムに遺伝子を挿入するための方法は当業者に周知であり、そしてUS−A−5,578,461およびUS−A−5,641,670に記載される。
【0070】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供して、内在性遺伝子の発現を増加させ、ここでこの使用は、内在性遺伝子と作動可能に結合する位置において、細胞のゲノムにこのポリヌクレオチドを挿入し、それによってその遺伝子の発現のレベルを増加させる工程を包含する。
【0071】
本明細書中に記載されるベクターを細胞に送達するための、本発明に従う多数の技術が公知かつ有用であり、これらの方法には、核酸縮合剤の使用、エレクトロポレーション、以下:アスベスト、ポリブレン、DEAEセルロース、Dextran、リポソーム、カチオン性リポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチンを用いる複合体化、パーティクルボンバードメント、および直接マイクロインジェクションが挙げられる(KucherlapatiおよびSkoultchi,Crit.Rev.Biochem.16:349−379(1984);Keownら、Methods Enzymol.185:527(1990)によって概説される)。
【0072】
本発明のベクターは、非特異的にまたは特異的に(すなわち、宿主細胞の指定されたサブセットに対して)、ウイルス性の送達手段または非ウイルス性の送達手段を介して、宿主細胞に送達され得る。ウイルス起源の好ましい送達方法は、ウイルスパッケージングシグナル(例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびパポバウイルスのシグナル)が操作された、本発明のベクターのためのトランスフェクションレシピエントとしてのウイルス粒子産生パッケージング細胞株を含む。好ましいウイルスに基づかない遺伝子送達手段および方法もまた本発明において使用され得、そして直接的な裸の核酸注入、核酸縮合ペプチドおよび非ペプチド、カチオン性リポソーム、およびリポソーム中でのカプセル化を包含する。
【0073】
組織へのベクターの直接送達が記載されており、そしていくらかの短期的な遺伝子発現が達成されている。筋肉(Wolffら、Science,247,1465−1468,1990)、甲状腺(Sykesら、Human Gene Ther.,5,837−844,1944)、メラノーマ(Vileら、Cancer Res.,53,962−967,1993)、皮膚(Henggeら、Nature Genet,10,161−166,1995)、肝臓(Hickmanら、Human Gene Therapy,5,1477−1483,1994)への、および気道上皮の曝露後(Meyerら、Gene Therapy,2,450−460,1995)の、ベクターの直接送達は、先行技術において明確に記載される。
【0074】
ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列由来の種々のペプチドは、ポリリジンDNA複合体とともに同時投与される場合に、遺伝子移入において使用され得る(Plankら、J.Biol.Chem.269:12918−12924(1994));Trubetskoyら、Bioconjugate Chem.3:323−327(1992);WO 91/17773;WO 92/19287;およびMackら、Am.J.Med.Sci.307:138−143(1994)は、カチオン性脂質を有するポリリジン結合体の同時濃縮は、遺伝子移入効率の改善をもたらし得ることを示唆する。国際特許出願WO 95/02698は、カチオン性脂質遺伝子移入の効率を増加させることを試みるウイルス成分の使用を開示する。
【0075】
本発明において有用な核酸縮合剤には、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カチオン性ペプチド、カチオン性非ペプチド(例えば、ポリエチレンイミン(PEI)およびポリリジン)が挙げられる。スペルミン誘導体とは、スペルミンのアナログおよび誘導体をいい、そしてこれは、国際特許出願WO 93/18759(1993年9月30日公開)において示されるような化合物を含む。
【0076】
ジスルフィド結合は、送達ビヒクルのペプチド性成分を連結するために使用されてきた(Cottenら、Meth.Enzymol.217:618−644(1992);Trubetskoyら(前出)もまた参照のこと)。
【0077】
細胞へのDNA構築物の送達のための送達ビヒクルは、当該分野において公知であり、そして例えば、WuおよびWu、J.Biol.Chem.263:14621(1988);Wilsonら、J.Biol.Chem.267:963−967(1992);および米国特許第5,166,320号に記載されるように、細胞表面レセプターについて特異的な、DNA/ポリカチオン複合体を含む。
【0078】
核酸縮合ペプチドを使用する本発明に従うベクターの送達が意図される。ベクターを縮合し、そして細胞にそのベクターを送達するために特に有用な核酸縮合ペプチドが、WO 96/41606に記載される。官能基が、WO 96/41606に記載されるように、本発明に従うベクターの送達に有用なペプチドに結合し得る。これらの官能基は、特異的な細胞型を標的とするリガンド(例えば、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、または糖)を含み得る。従って、このリガンドは、非特異的な様式において、または細胞型に関して制限される特異的な様式において、細胞を標的化し得る。
【0079】
その官能基はまた、脂質(例えば、パルミトイル、オレイル、またはステアロイル);中性親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、またはポリビニルピロリドン(PVP));fusogenicペプチド(例えば、インフルエンザウイルスのHAペプチド);またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含み得る。この官能基はまた、細胞内輸送タンパク質(例えば、核局在化配列(NLS)、およびエンドソームエスケープ(escape)シグナル、または細胞質にタンパク質を直接方向付けるシグナル)を含み得る。
【0080】
本発明はまた、治療における使用のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を提供する。
【0081】
好ましくは、そのポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、遺伝子治療において使用される。
【0082】
本発明はまた、遺伝子治療における使用のための組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。
【0083】
本発明はまた、処置方法を提供し、この方法は、そのような処置の必要がある患者に有効な用量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与する工程を包含する。好ましくは、その患者は遺伝子治療によって処置可能な疾患に罹患している。
【0084】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を、薬学的に受容可能なレシピエントと組み合わせて含む、薬学的組成物を提供する。
【0085】
本発明はまた、所望の遺伝子産物を得るための、細胞培養系中において、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。適切な細胞培養系は、当業者に周知であり、そして当業者に公知である文献の本文に十分に記載されている。
【0086】
本発明はまた、トランスジェニック植物遺伝学を作り出す際の、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。増加した収量、耐性などを有するトランスジェニック植物の生成は、当業者に周知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。
【0087】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【0088】
本発明の薬学的組成物は、疾患を処置するか、または好都合なタンパク質または機能を有する特定の組織の細胞を提供する治療のために、所望される場合、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含み得る。
【0089】
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞、あるいは薬学的組成物は、全身、筋肉内、静脈内、エアロゾル、経口(固体形態または液体形態)、局所的、眼的、坐剤として、腹腔内、および/または鞘内、ならびに局所的直接注入を含む経路を介して投与され得る。
【0090】
正確な投薬量レジメは、当然、個々の患者に対して個々の臨床医によって決定される必要があり、次にこれは、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質の正確な性質および処置のために標的化されている組織型によって制御される。
【0091】
投薬量はまた、疾患の指標および投与の経路に依存する。有利には、処置の期間は、一般的に、継続的であるか、または細胞が死滅するまでである。用量の回数は、疾患、および臨床試験からの効力のデータに依存する。
【0092】
本発明に従う効果的な遺伝子治療のために送達されるポリヌクレオチドまたはベクターDNAの量は、好ましくは、約50ng〜1000μgのベクターDNA/kg体重の間の範囲;より好ましくは、約1〜100μgベクターDNA/kgの間の範囲にある。
【0093】
本発明に従って、インビボの細胞取り込みのために、哺乳動物にポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与することが好ましいが、エキソビボアプローチが利用され得、それによって細胞が動物から取り除かれ、ポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質導入され、次いでその動物に再移植される。例えば、肝臓は、動物から肝細胞を取り除く工程、インビトロで肝細胞に形質導入する工程、および形質導入された肝細胞をその動物に再移植する工程による、エキソビボアプローチによってアクセスされ得る(例えば、ウサギについては、Chowdhuryら、Science 254:1802−1805,1991、または、ヒトにおいては、Wilson,Hum.Gene Ther.3:179−222,1992に記載されるように)。このような方法はまた、循環またはリンパ系における細胞の種々の集団(例えば、赤血球、T細胞、B細胞、および造血幹細胞)への送達について有効であり得る。
【0094】
本発明の別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を使用する遺伝子治療の組織特異性および/または効力を決定するための哺乳動物モデルが提供される。この哺乳動物モデルは、その細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を含む。トランスジェニックのマウス(Gordonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380(1980);Harbersら、Nature 293:540(1981);Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5016(1981);およびWagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6376(1981))、ヒツジ、ブタ、ニワトリ(Hammerら、Nature 315:680(1985)を参照のこと)などの作製方法は、当該分野において周知であり、そして本発明に従う使用のために意図される。このような動物は、ヒトにおける臨床試験の前の試験を可能にする。
【0095】
本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物はまた、目的のタンパク質の長期的な産生のために使用され得る。
【0096】
本発明はまた、機能的な遺伝学の適用における本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能的な遺伝学は、主に、特定の細胞型または疾患状態において特異的に発現される遺伝子の配列決定に関し、現在、薬物発見または遺伝子治療目的のための、何千もの潜在的に目的の新規な遺伝子配列を提供する。新規な治療の開発のためにこの情報を使用することにおける主要な問題は、これらの遺伝子の機能をいかにして決定するかということにある。UCOEは、遺伝子配列の機能を決定するために、多数の機能的ゲノム適用において使用され得る。本発明の機能的ゲノム適用には、以下が含まれるがこれらに限定されない:
(1)本発明のポリヌクレオチドを使用して、その遺伝子配列のアンチセンスバージョンまたはリボザイムノックダウンライブラリーの持続した発現を達成することであって、それによって細胞表現型に対する遺伝子を不活化する効果を決定すること。
【0097】
(2)本発明のポリヌクレオチドを使用して、その遺伝子配列についての発現ライブラリーを調製し、その結果、細胞への送達が、その遺伝子配列の、信頼できる、再現可能な、持続する発現を生じること。その遺伝子配列を発現する、得られる細胞は、この遺伝子配列を発現しており、機能決定および薬物発見に対する種々のアプローチにおいて使用され得る。例えば、その遺伝子産物の活性を中和するために、その遺伝子産物に対する抗体を惹起すること;構造的研究、機能的研究、または薬物スクリーニング研究;あるいは細胞に基づく薬物スクリーニングにおける使用のための、遺伝子それ自体のタンパク質産物の迅速な精製。
【0098】
(3)マウス胚幹(ES)細胞およびトランスジェニックマウスを含むアプローチにおいて本発明のポリヌクレオチドを使用すること。最も強力な機能的遺伝学アプローチの1つは、構築物のマウスES細胞における遺伝子への無作為挿入を含む。この構築物は、発現された遺伝子への挿入後に薬物選択を可能にするのみであり、そして配列決定のために容易にレスキューされ得る(G.Hicksら、Nature Genetics,16,338−334)。次いで、新規な配列を有する遺伝子にノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスが、それらの機能を探査するために容易に作製され得る。現在のところ、この技術は、マウスES細胞において良好に発現される10%のマウスの遺伝子について良好に機能する。UCOEの組み込み構築物への取り込みは、この技術が、マウスで発現されるすべての遺伝子を同定するために拡張されることを可能にする。
【0099】
以下の実施例は、図面を参照して、例示のために提供され、そしていかなる様式においても本発明を限定することを意図しない。本発明のいくつかの代表的なポリヌクレオチドの調製、試験、および分析は、以下に詳細に記載される。当業者は、本発明の他のポリヌクレオチドの調製および試験のためにこれらの手順を適合させ得る。
【0100】
(実施例)
(材料および方法)
(ライブラリースクリーニング)
ヒトTBPおよびhnRNP A2遺伝子座にかけてのゲノムクローンを、P1由来人工染色体(pCYPAC−2)ライブラリー(CING−1;Ioannouら、1994)から単離した。スクリーニングは、細菌溶解物のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によった。
【0101】
(TBPに対するプライマー)
プライマーを、Chalutら(1995)に記載される部分ゲノム配列を使用して設計し、そしてこれらは、以下のとおりであった:
TB3[5’ATGTGACAACAGTGCATGAACTGGGAGTGG3’](−605)およびTB4[5’CACTTCCTGTGTTTCCATAGGTAAGGAGGG3’](−119)は、TBP遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)にハイブリダイズし、そしてヒト遺伝子のみから486bpのPCR産物を生じる(結果を参照のこと)。括弧内の数は、Petersonら(1990)によって定義されたmRNA CAP部位に関する。
【0102】
TB5[5’GGTGGTGTTGTGAGAAGATGGATGTTGAGG3’](1343)およびTB6[5’GCAATACTGGAGAGGTGGAATGTGTCTGGC3’](1785)は、3’UTR由来の領域を増幅し、そしてこの領域における有意な配列相同性に起因して、ヒトDNAおよびマウスDNAの両方から415bpの産物を生成する。括弧内の数は、Petersonら(1990)によって定義されたcDNA配列に関する。
【0103】
(hnRNP A2に対するプライマー)
hnRNP A2に対するプライマーを、Biamontiら(1994)によって記載されたゲノム配列から設計した。
【0104】
Hn1[5’ATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCGC3’](−309)およびHn2[5’CATTGATTTCAAACCCGTTACCTCC3’](199)は、5’UTRにおいて508bpのPCR産物を生じる。Hn3[5’GGAAACTTTGGTGGTAGCAGGAACATGG3’](7568)およびHn4[5’ATCCATCCAGTCTTTTAAACAAGCAG3’](8176)は、最後から2番目のエキソン(番号10)における領域を増幅し、607bpのPCR産物を生じる。括弧内の数は、Biamontiら(1994)によって定義された転写開始点に関する。
【0105】
(PCRプロトコル)
PCRを、各25mMのdATP、dGTP、dCTP、dTTP、1×反応緩衝液(50mM Tris−HCl[pH 9.1]、16mM(NH4)2SO4、3.5mM MgCl2、150μg/mlウシ血清アルブミン)、2.5ユニットのTaq Supremeポリメラーゼ(Fermentas)および各1μMのプライマーを含む、総反応容量25μlの反応液中で、1μlのプールしたクローン材料を使用して行った。サイクル条件は、以下であった:94℃で1分間、62℃で1分間、72℃で1分間の4サイクル、続いて、94℃で1分間、58℃で1分間、72℃で1分間の30サイクル。ポジティブ同定されたクローンを、30μg/mlのカナマイシンを含むTブロス(1リットル滅菌水あたり12g トリプトン、24g 酵母抽出物(両方ともDifco)、23.1g KH2PO4、125.4g K2HPO4、0.4% グリセロール;TartofおよびHobbs、1987)において増殖させた。この細菌の永久保存物は、1×保存緩衝液(3.6mM K2HPO4、1.3mM KH2PO4、2.0mM クエン酸ナトリウム、1mM MgSO4、4.4% グリセロール)中の個々の懸濁物を、−80℃で冷凍することによって調製した。
【0106】
(CYPAC−2 DNA単離)
プラスミドDNAを、改変アルカリ溶解法(BirnboimおよびDolly、1979)を使用して、以下のように単離した。1リットルのTブロスを含むバッフルした(baffled)2リットルのガラスフラスコに、細菌のシングルコロニーを播種し、そして一定攪拌で37℃、16時間インキュベートした。細菌を、Beckman J6遠心分離機において4200rpm(5020×g、以後全ての工程についても同様)で10分間の遠心分離によって収集した。ペレットをボルテックスし、15mM Tris−HCl[pH 8.0]、10mM EDTA、10μg/ml RNaseA(200ml)中に再懸濁し、そして室温で15分間インキュベートした。溶解液(0.2M NaOH、1% SDS;200ml)を、2分間緩やかに混合しながら添加し、その後、200mlの中和溶液(3M 酢酸カリウム[pH 5.5])をさらに5分間緩やかに混合しながら添加した。細菌細片を、4℃で1時間沈殿させて、次いで、15分間の遠心分離および滅菌ガーゼによる上清の濾過によって除去した。イソプロパノール(400ml;40%最終濃度)を添加して、室温で1時間プラスミドDNAを沈殿させた。15分間の遠心分離およびそのペレットの70%エタノール中での洗浄後、DNAを、1×TNE(50mM Tris−HCl[pH 7.5]、5mM EDTA、100mM NaCl)、0.1% SDSおよび0.5mg/mlプロテイナーゼK(Cambio)の4ml溶液に再懸濁して、残存タンパク質を除去した。55℃で1時間のインキュベーションおよびその後のフェノール:クロロホルム(1:1 v/v)抽出後、DNAを、1容量の100%エタノールまたはイソプロパノールで沈殿させ、そして2mlのTE緩衝液(10mM Tris−HCl[pH 8.0]、1mM EDTA)中に巻き取った。50μg/mlの収率が、慣用的に得られた。
【0107】
(制限酵素マッピング)
制限酵素マッピングを、pCYPAC−2およびTBP遺伝子の両方の配列に由来するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化した上記クローン化DNAのサザンブロット(Southern,1975)に対してハイブリダイズさせることによって行った。ゲノムフラグメントがクローン化されるBamHI部位にちょうど近接する、pCYPAC−2配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用し、その配列は、以下であった。
【0108】
【化1】
NotIによるpCYPAC−2からのいずれのゲノム挿入物の切除は、この放出されたフラグメントが、各側の少量のプラスミド配列を保持することを意味する。EY2側において、この配列は、30bpであり、切除されたフラグメント内のEY2配列の大部分を占める。従って、このオリゴヌクレオチドのNotI消化したpCYPAC−2クローンへのハイブリダイゼーションは、サザンブロット分析上のこの放出されたゲノムのバンドを強調する。189側では、この切除されたフラグメントは、39bpのプラスミド配列を含み、そして189オリゴヌクレオチド配列の大半は、pCYPAC−2内のNotI部位の3’側にある。従って、このオリゴヌクレオチドは、pCYPAC−2クローンのNotI消化物上で、ベクターにハイブリダイズする。約100ngのプラスミドDNAを、製造者の推奨条件(Fermentas)を使用する、制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、その後、0.5×TAE緩衝液(20mM Tris−酢酸[pH 8.0]、1mM EDTA、0.5μg/mlエチジウムブロマイド)中の0.7%アガロースゲル上、またはパルスフィールドゲル上で電気泳動した。パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)は、CHEF−DRIIシステム(Biorad)上で、1% PFGEアガロース(FMC)/0.5×TAEゲル上、6V/cm、1秒〜30秒の切換え時間によって、14時間で行った。同一条件を、本研究全体の全てのPFGE分析に使用した。ゲルを、紫外光下での写真撮影前に、1μg/mlのエチジウムブロマイド溶液中で染色した。
【0109】
サザンブロット分析のための調製において、最初にこのアガロースゲルを254nmの紫外光(UVPクロスリンカー(UVP)中で、180,000μJ/cm2)に曝露し、次いでその後、0.5M NaOH、1.5M NaCl中で40分間(20分後に溶液を交換する)の浸漬によって変性することによって、DNAを脱プリン化した。このDNAを、16時間の新鮮容量の変性溶液中での毛管作用によって、HYBOND−Nナイロン膜(Amersham)へ転写した。核酸のナイロンへの架橋は、120,000μJ/cm2での254nm紫外光への曝露によって達成された。膜を、0.5M Tris−HCl[pH 7.5]、1.5M NaCl中、20分間で中和し、そして使用前に2×SSCでリンスした。(1×SSCは、150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウム[pH 7.0]である)。
【0110】
オリゴヌクレオチドプローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび32P−γATPで5’末端標識し、サザンブロット上の特定のフラグメントの検出を可能にした。各実験は、製造者の指定緩衝液中2μlの32P−γATP(>4000Ci/mmol;10mCi/ml、Amersham)標識した、100ngのオリゴヌクレオチドを使用した。37℃で2時間のインキュベーション後、取り込まれなかったヌクレオチドを、水で平衡化したSephadex G50カラム(Pharmacia)上でのクロマトグラフィーによって除去した。末端標識プローブは、比活性>1×108dpm/μgで代表的に標識された。
【0111】
ハイブリダイゼーションを、25mlの予熱したハイブリダイゼションミックス(1mM EDTA [pH 8.0]、0.25M Na2HPO4[pH 7.2]、7% SDS;ChurchおよびGilbert、1984)および100μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含むガラスボトル(Hybaid)内で、ナイロンメッシュの間に膜を挟んで行った。65℃で1時間のプレハイブリダイゼーション後、溶液をデカントし、そして標識プローブを含む同一の溶液で置換した。最適なハイブリダイゼーション温度は、実験的に決定され、そしてTE緩衝液中のオリゴヌクレオチドについてのTm(Tm=59.9+41[%GC]−[675/プライマーの長さ]として計算される)より20℃低いことが見出された。16時間後、ハイブリダイゼーション膜を取り出し、6×SSC、0.1% SDSでの2分間での洗浄を3回行い、その後X線フィルム(BioMAX Kodak)に露光した。
【0112】
(DNA構築物)
TBP遺伝子(12kbの5’および3’の両方の隣接配列を含む)にわたる44kbのゲノムDNA領域を、pCP2−TNN pCYPAC−2クローン(図9を参照のこと)から、NotIフラグメントとして誘導した。これを、コスミドベクターpWE15(Clontech)内にクローン化し、pWE−TSNを生成した(図9)。pCYPAC−2プラスミドは、真核生物細胞トランスフェクション研究用の選択可能なマーカーを含んでいないため、ベクター交換が必要であった。pCP2−TNNのNotIでの消化は、ゲノム挿入物の5’末端からTBPの最後のエキソンの12kb下流に位置するゲノム配列中に存在するNotI部位までに及ぶ、44kbフラグメントを遊離する(図9を参照のこと)。さらに、このクローン中の3’隣接配列の残りの20kbおよびpCYPAC−2ベクターを含むフラグメントを生成する。連結反応を、上記条件を使用する10μlの反応液中で、約1μgのNotI消化したpCP2−TNNおよび200ngの同様に切断したpWE15を使用して行った。T4 DNAリガーゼの熱不活化の後、完了した連結混合物を、Gigapack Gold III(Stratagene)を用いて感染λファージ粒子内にパッケージした。組換えバクテリオファージを、SM緩衝液(500μlの、50mM Tris−HCl、100mM NaCl,8mM MgSO4、0.01%(w/v) ゼラチン、2% クロロホルム)中で保存した。感染を以下のように行った:5mlのE.coli DH5αの一晩培養物を遠心分離(3000×g、5分)し、そしてこの細菌を、2.5mlの10mM MgCl2に再懸濁した。等量のパッケージした材料およびE.coliを混合して、25℃で15分間インキュベートし、その後200μlのLブロスを添加して、そしてこの混合物を37℃でさらに45分間インキュベートした。この懸濁物を、LB−アンピシリン寒天プレート上にプレートし、シングルコロニーを、その次の日、微量調製物として分析した。大量のpWE−TSNを、pCYPAC−2クローンの場合と同様に、1リットル培養物から調製した。
【0113】
(pCYPAC−2 DNAサブクローニング方法)
以下の手順を使用して、pCYPAC−2クローン由来の小さい(10kb未満)制限酵素フラグメントをサブクローン化した。DNAを制限酵素消化し、そして0.6%の低融点アガロースゲル(FMC)上で電気泳動し、全ての紫外光写真撮影を、エチジウムブロマイド染色したDNAのニックを最小化するために、365nmの波長で行った(Hartman、1991)。所望の範囲のサイズのフラグメントを含むゲル領域を、このゲルから切除し、68℃で10分間融解し、そして37℃でさらに5分間平衡化させた。プラスミドベクターpBluescriptKS(+)(Stratagene)を、同様に制限酵素消化し、pCYPAC−2由来のDNAに適合可能な末端を与え、自己連結を最小化するために10ユニットの仔ウシ腸ホスファターゼ(Fermentas)で1時間処理し、そしてフェノール:クロロホルム(1:1 v/v)抽出、それに引き続くエタノール沈殿によって精製した。融解ゲル切片を、4:1を超えるフラグメント対ベクター分子のモル濃度を与えながら、50ngのこのベクター調製物と混合した。T4 DNAリガーゼ(10ユニット;Fermentas)を、指定の緩衝液と共に添加し、この混合物を16℃で16時間インキュベートし、その後形質転換効率を改善するために、この酵素を熱不活化(65℃で20分間)した(Michelson、1995)。塩化カルシウム法のコンピテントDH5α E.coliの調製および引き続く形質転換を、確立された手順(Sambrookら、1989)を用いて行った。形質転換は、この連結混合物を37℃に融解および平衡化し、その後100μlのコンピテント細胞を、0.02%未満の最終アガロース濃度を維持しながら添加することによって達成した。細菌を、2時間氷上でインキュベートし、続いて37℃で5分間、熱ショックを与え、そしてその後1mlのSOC培地(1リットル滅菌水あたり20g トリプトン;5g 酵母抽出物;0.5g NaCl;20mM グルコース[pH 7.0];Sambroolら、1989)を添加した。37℃でのさらに1時間後、細胞を、50μlの選択溶液(36mg/ml Xgal、0.1M IPTG)と混合し、20μg/mlアンピシリンを含む、適切なLB−抗生物質プレート(1リットル滅菌水あたり10g NaCl[pH 7.0]、10g トリプトン、5g 酵母抽出物、20g 寒天)上にプレートした。37℃で16時間のインキュベーション後、組換えプラスミドを含む細菌コロニーを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子活性の破壊に起因する、これらの白色(青色に対する)によって同定した。選択されたコロニーを、シングルコロニーの微量調製物から単離されたDNAの制限消化によって分析した。この手順を使用して、20kbまでの大きさのフラグメントを、pBluescriptKS(+)ベクターにサブクローン化することが可能であった。
【0114】
PCR増幅産物を、以下の手順を用いてクローン化した。50μl容量中1ngのpCYPAC−2由来クローンDNAをテンプレートとして使用する標準的なPCR反応後、10ユニットのT4 DNAポリメラーゼ(Fermentas)を、その反応液に添加し、37℃で30分間インキュベートした。ポリメラーゼ酵素の不活化(96℃、20分)後、7μlのこのPCR産物を、最終容量10μlにおいて、50ngのEcoRV消化したpBluescriptKS(+)ベクターに連結した。T4 DNAポリメラーゼを使用してこのPCR産物の末端を平滑化することにより、高比率の組換えクローンを生じた(データは示さず)。
【0115】
(pBL3−TPO−puroの生成)
pBL3−TPO−puroは、pBL3ベクター内にサブクローン化された、約1.2kbの5’隣接配列および約4.5kbの3’隣接配列ならびにピューロマイシン耐性遺伝子カセットを有する全体で19kbのTBP遺伝子を含む。これは、3つの連続するクローニング工程によって達成された。
【0116】
最初に、pCP2−TLNプラスミド中のヒトTBP遺伝子の3’末端に隣接する4.5kbの配列を、pCP2−TLNからNotI−SacIIフラグメントとしてサブクローン化した。このフラグメントは、TBP遺伝子の3’UTRにおけるSacII部位からpCYPAC−2ベクター内のOL189−近接のNotI部位に及ぶ。このフラグメントを、SacIIおよびNotI消化したpBL3内にクローン化し、そしてMA426と命名した。残りのTBP遺伝子配列は、19kbのSacIIフラグメント上に存在し、これは、mRNAキャップ部位の約1.2kb上流から3’−UTRにおけるSacII部位に及ぶ。このフラグメントを、SacIIで直鎖化したMA426内に連結し、正確な方向についてクローンをスクリーニングした。
【0117】
(DNA配列決定およびコンピューター配列分析)
DNAを、Flexi−Prep系(Pharmacia)を使用して調製し、そして自動蛍光配列決定は、BaseClear(Netherlands)のサービスとして提供された。dBESTおよび非重複性Genbankデータベースを、以前に記載の検索ツール(Altschulら、1997)を使用して照会した。本研究において使用した全ての発現配列タグクローンは、I.M.A.G.E.コンソーシアム(Lennonら、1996)を通して入手した。公知のDNA配列の複数の配列アライメントおよび制限酵素消化パターンの予測は、プログラムPCGENE(Intelligenetics Inc.,USA)を使用して実行した。CpGジヌクレオチド頻度のプロットは、VectorNTIソフトウェア(Informax Inc.,USA)を使用して作製した。
【0118】
(トランスジェニック動物の作製)
(マイクロインジェクションのためのTBPフラグメントの調製)
TBP/PSMB1遺伝子領域を含む90kbのゲノムフラグメント(TLN)を、pCP2−TLNクローンのNotI消化によって単離し、そして改変塩化ナトリウム勾配法(DillonおよびGrosveld,1993)を使用するマイクロインジェクションのために調製した。最初に、細菌リポポリサッカリド(LPS)を、LPS除去キット(Quiagen)を製造者の説明に従って使用して、標準的なpCP2−TLN大量調製物から除去した。次いで、約50μgのDNAを、70ユニットのNotI(Fermentas)で1時間消化し、少量のアリコートを、PFGEによって分析して完全消化を確認した。3mM EDTA存在下の14mlの5〜30%の塩化ナトリウム勾配を、市販の勾配形成剤(Life Technologies)を使用して超遠心分離管(Beckman)中に調製した。消化したDNAを広孔ピペットチップを使用して剪断を最小化しながら、この勾配の上に層化し、この勾配を、SW41Tiスイングアウトローター(Beckman)中で、5.5時間(25℃で)、37,000rpmで遠心分離した。約300μlの画分を、この勾配の底(最高密度)から、1mlの80%エタノールを含む別個の微量遠心管内に順に取り出し、その後−20℃で1時間インキュベートした。DNA沈殿物を、遠心分離(14900×g、15分)によって収集した。ペレットを、70%エタノールで洗浄し、20μlのトランスジェニックマイクロインジェクション緩衝液(10mM Tris−HCl[pH 7.4]、0.1mM EDTA)中に溶解し、そして交換画分からの5μlのアリコートをゲル電気泳動によって分析し、ベクターおよび染色体DNAの混入を評価した。これらの画分(このような混入物を有さないような)をプールし、そのDNA濃度を、260nmの吸光度により評価した。
【0119】
40kbのゲノムフラグメント(TSN)を、NotI消化および以前に記載のエレクトロエリューション法(Sambrookら、1989)を使用する精製によって、pWE−TSNから単離した。エレクトロエリューション後、DNAを、TE緩衝液飽和フェノール、フェノール:クロロホルム(1:1 v/v)、および水飽和n−ブタノール(2回)での連続抽出によって精製し、残存するエチジウムブロマイドを除去した。DNAを、2容量の100%エタノールで沈殿させ、そしてマイクロインジェクション緩衝液中に再懸濁した。フラグメントの完全性を、PFGEによって評価し、260nmでの吸光度により濃度を決定した。25kbゲノムフラグメント(TPO)を、pBL3−TPOから、この挿入物をSalIでの消化によってこのベクターから遊離したことを除き、同じ手順を使用して単離した。
【0120】
(マイクロインジェクションのためのhnRNP A2フラグメントの調製) hnRNP A2遺伝子領域を含む160kbのゲノムフラグメント(MA160)を、pCP2−HLNのNruI消化(図13A)および上記のような塩化ナトリウム勾配超遠心分離によって、マイクロインジェクションのために単離および調製した。
【0121】
60kbのゲノムフラグメント(HSN;図13B)を、AatII消化および上記のようなPFGEによる精製によって、MA160から単離した。この60kbのバンドを、ゲルから切除し、切片に切断した。各切片を65℃で融解し、そして30μlをPFGEによって分析した。この60kbフラグメントの最も純粋なサンプルを示す画分を保持した。この融解ゲル容量を測定し、Gelase緩衝液で1×にして、42℃で10分間平衡化し、そして500μlあたり1ユニットのGelase酵素(Epicentre Technologies)を添加した。サンプルを42℃で一晩インキュベートし、次いで、4℃で30分間遠心分離した。この上清を、広孔チップでデカントし、10cmペトリ皿における0.25μmフィルター上で、15mlのトランスジェニックマイクロインジェクション緩衝液に対して、4時間滴下透析(drop−dialyse)した。この透析溶液を微量遠心管に移し、4℃で30分間スピンさせた。フラグメントの完全性をPFGEによって評価し、260nmでの吸光度により濃度を測定した。
【0122】
(トランスジェニックマウスの作製)
トランスジェニックマウスを、C57/B16マウスの受精卵の前核注入によって作製した。各DNAフラグメントを、トランスジェニック緩衝液中1ng/μlの濃度で注入した。これは、標準的な技術を使用するUMDS Transgenic Unit(St Thomas’s Hospital,London)によるサービスとして行った。トランスジェニックの創始者を、以下のように単離した尾部生検DNAのPCRスクリーニングを使用して同定した。10〜15日齢マウスからの約0.5cmの尾部生検を、500μl尾部緩衝液(50mM Tris−HCl[pH 8.0]、0.1M EDTA、0.1M NaCl、1% SDS、0.5mg/ml プロテイナーゼK)中、37℃で16時間インキュベートした。この加水分解物を、等量のフェノール:クロロホルム(1:1 v/v)での緩やかな反転、その後の遠心分離(14900×g、15分)によって抽出した。このDNAを、2容量の100%エタノールの添加によって水相から沈殿させ、70%エタノール中で洗浄した。DNAを巻き取って、100μlのTE緩衝液中に溶解した。260nmでの吸光度測定によって測定されるように、代表的に、50〜200μgのDNAが得られた。PCR反応のための条件は、テンプレートとしての100ngの尾部生検DNAおよびTB3/TB4のプライマーセットを使用する、pCYPAC−2ライブラリーのスクリーニングについて記載される通りであった。陽性の創始者を、野生型C57/B16マウスへの戻し交配によって交配し、完全なトランスジェニックF1の子孫を作製した。
【0123】
(導入遺伝子の完全性およびコピー数)
導入遺伝子のコピー数および完全性を、BamHI、BglII、EcoRIおよびHindIII消化した尾部生検DNAのサザンブロット分析によって評価した。約10μgのDNAを、20〜30ユニットの特定の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして0.7%アガロース/0.5×TBE(45mM Tris−ホウ酸[pH 8.0]、1mM EDTA)ゲル上、1.5V/cmで16時間電気泳動した。染色およびDNAのナイロン膜への転写は、正に荷電したマトリクス(HYBOND N+,Amersham)を使用することを除き、プラスミドのサザンブロットと同様であった。
【0124】
DNAプローブを、いずれのクローニングベクター配列をも除去するために、制限酵素消化によって調製し、そしてGene−Cleanシステム(Bio101,USA)を使用して低融点アガロースから精製した。このプローブの100ngサンプルの放射性標識を、市販のキット(Amersham)ならびに各200pmolのdCTP、dGTP、dTTPおよび3μlのα−P32−dATP(比活性>3000Ci/mmol、10mCi/ml、Amersham)を使用する、ニックトランスレーションによって行った。標準緩衝溶液中0.5ユニット DNAポリメラーゼI/10pg DNaseIからなる酵素溶液を添加して、そしてこの反応液を15℃で2.5時間インキュベートした。プローブを、Sephadex G−50クロマトグラフィーによって精製し、そしてそれらの使用直前に5分間煮沸した。代表的に、>1×108cpm/μgの比活性を得た。
【0125】
ハイブリダイゼーションを、上記のプラスミドサザンブロットについてと同様に行った。メンブレンを、15mlの、100μg/mlの変性サケ精子DNAを含む予備ハイブリダイゼーション溶液(3×SSC、0.1%SDS、5×デンハルト溶液(100×デンハルト溶液は、1リットルの蒸留水あたり、2%Ficoll(Type400、Pharmacia)、2%ポリビニルピロリドン、2%ウシ血清アルブミン(画分V、Sigma)である))中で65℃で1時間インキュベートした。次いで、この溶液を、15mlの、100μg/mlのサケ精子DNAおよび熱加熱放射標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液(予備ハイブリダイゼーション溶液と同様で、デキストラン硫酸を10%加える)に置き換えた。65℃で16時間のハイブリダイゼーションの後、メンブレンを2×SSC/1%SDSで各々30分間で3回洗浄し、そしてPhosphorImager(Molecular Dynamics)スクリーンまたはX線フィルムに対して−80℃で曝露した。これらのブロットが再分析されるべき場合、結合したプローブを、0.2M NaOH中で、20分間浸し、次いで上記のように中和することによって除去した。
【0126】
本研究において使用したプローブの大部分は、配列情報が利用可能でないゲノムクローンの領域(例えば、pCP−TLN末端フラグメントプローブおよびTBPイントロン性領域に由来するもの)に由来する。多数のプローブが、ヒトゲノムDNAに非特異的にハイブリダイゼーションした。このことは、反復配列エレメントの存在を示す。この問題を除去するために、プローブDNAのアリコートを個々に、多数の制限酵素で消化し、電気泳動し、そしてサザンブロットした。短い認識部位を有する酵素(これは、DNA内に非常に頻繁に生じるはずである)を、多数のより小さなフラグメントにそのプローブを消化するように選択した。放射標識したヒトC0t−1 DNAを、反復配列を含むそれらのフラグメントを示すためのプローブとして使用した。この手順を用いて、反復エレメントを含む全てのプローブについて、C0t−1プローブにハイブリダイズしない500bp未満のフラグメントを得ることが可能であった。
【0127】
(コスミドDNAの調製および単一コピーのL細胞クローンの生成)
pWE−TSN DNAを、上記のように、イソプロパノール沈降段階まで、1リットルの培養物のアルカリ溶解によって調製した。25℃で1時間インキュベートした後、そのペレットを300μlのTE中に再懸濁し、次いで10mlのSephaglas FP DNA結合マトリクス(Pharmacia)との連続混合によって添加した。この溶液を、10分間定常的に反転させ、そしてマトリクス結合したDNAを、遠心分離(280×g、1分)によって収集した。このペレットを、まず、WS緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)、2mM EDTA、60%エタノール)で洗浄し、遠心分離で収集し、70%エタノールで洗浄し、そして再遠心分離した。DNAを、ペレットを2mlのTE緩衝液中に再懸濁し、そして70℃で10分間周期的な混合によってインキュベートすることによって、マトリクスから溶出した。この溶液を、遠心分離(1100×g、2分)し、そして、DNAを含む上清を、2つの微量遠心管中に等量に分割した。残りのSephaglassを、遠心分離(14950×g、15分)によって除去し、その上清をプールし、そしてDNAを、2容量のエタノールを用いて沈降させた。スプールしたDNAを、70%エタノール中で一回洗浄し、そして1μg/μlの滅菌水中に再懸濁した。凡そ75〜100μgの純粋なコスミドDNAをこの手順を用いて入手した。これは、Sephaglas精製なしに得たDNAの60〜80%の収率にあたる。
【0128】
接着マウスL細胞(Earleら、1943)のトランスフェクションを、以下のとおりに行った。10%の熱非働化した胎仔ウシ血清(PAA laboratories)、2mM L−グルタミンを含むDMEM中に増殖させたおよそ1×107細胞を、1μgの、SalIで直鎖状にしたpWE−TSN DNAと混合し、そして氷上で10分間置いた。DNAを、Biorad Gene−Pulserにおいて960μF,250Vの設定でのエレクトロポレーション(Chuら、1987)によって細胞中に導入した。トランスフェクトした細胞を、400μg/mlのジェネティシン硫酸(G418、Life Technologies Inc.)を含む同じ培地において選択し、そして維持した。個々のクローンを、クローニングリング(Freshney,1994)を用いて単離した。厚壁のステンレス鋼クローニングリング(Life Technologies Inc.)を、シリコングリースにおいてオートクレーブし、そして組織培養プレートへと移して、その結果そのコロニーを単離した。トリプシンの溶液(300μlの0.25%トリプシン(pH7.6)(Difco)、0.25M Tris−HCl(pH8.0)、0.4% EDTA(pH7.6)、0.12M NaCl、5mM グルコース、2.4mM KH2PO4、0.84mM NaH2PO4・12H2O、1%フェノールレッド)を添加し、そしてそのプレートを37℃で5分間インキュベートした。細胞を24ウェルプレートに移し、そしてクローン化細胞株を樹立した。クローンを以下のように保存した。およそ1×107細胞を遠心分離で採取し、0.75mlの凍結混合液(70%の標準的な培地であるが20%の仔ウシ血清および10%DMEMを含む)中に再懸濁し、そして液体窒素保存に移す前に1時間ドライアイスで瞬間凍結した。
【0129】
ゲノムDNAをこれらのL細胞クローンから、標準的な手順(Sambrookら、1989)を用いて調製した。T75フラスコ中の細胞を、コンフルエントにまで増殖させ(およそ4×107)、その培地を除去し、そしてそのフラスコをPBS(2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4、0.51mM MgCl2、136.89mM NaCl、8.1mM Na2HPO4(pH7.3))で洗浄し、そして2mlの溶解緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM EDTA,10mM NaCl、0.5% SDS、1mg/mlプロテイナーゼK)を添加した。細胞を掻き取りによって培養フラスコから剥がし、そして15mlの遠沈管に、広い穴のピペットの尖端を用いて移した。溶解を、68℃で16時間進行させ、その後、その溶液をフェノール:クロロホルム(1:1、v/v)で一回抽出し、そしてそのDNAを等容量のイソプロパノールを用いて沈降させた。70%のエタノール中での洗浄後、そのDNAを1mlのTE緩衝液中に再懸濁し、そして濃度を260nmでの吸光度によって評価した。
【0130】
トランスフェクトされた遺伝子コピー数を、BglII消化したゲノムDNAのサザンブロット分析によって決定した。ヒトTBPを、C5遺伝子(TBP転写開始領域の5’側の4kb)中に配置される(そして、4.2kbフラグメントを検出する)特異的なプローブ(1.4HX)、を用いて検出した(図10を参照のこと)。さらに、ブロットを、内在性マウスvav遺伝子座(Ogilvyら、1998)由来の1kb NcoIフラグメント(これは、5.2kbバンドを与え、そして単一コピーの参照標準として作用する)を用いて同時にプロービングした。ヒトTBP導入遺伝子のコピー数を、PhosphorImagerによるブロットの分析の後、3コピーのトランスジェニックマウス系統TLN8を用いて、得られたvavシグナルに対するTBPとの比を比較することによって確認した。
【0131】
総RNAを、1mlの3M LiCl、6M尿素中での選択的な沈降(AuffreyおよびRougeon、1980、Antoniou、1991を参照のこと)によっておよそ4×107細胞から調製した。
【0132】
(DNアーゼI超感受性部位分析)
これを、以前に記載(Forresterら、1987;Reitmannら、1993)されるように行った。核を、約1×109 K562細胞(LozzioおよびLozzio、1975)から調製した。採取した細胞をPBS中で洗浄し、そして4mlの氷冷RSB(10mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM NaCl、3mM MgCl2)中で再懸濁し、そして緩い乳棒を装着したガラスダンス型ホモジナイザー中に置いた。1mlの0.5%NP40/RSBの添加後、その細胞を、10〜20ストロークに亙ってゆっくりホモジナイズし、そして核を、50mlのRSBの添加および4℃での遠心分離(640×g、5分)によって回収した。その上清を捨て、そして核を1mlの、1mMCaCl2を含むRSB中に再懸濁した。即座に100μlのアリコート(これは、およそ1×108の核にあたる)を取り、そしてDNAを、以下のように精製して、単離の手順の間の内在性ヌクレアーゼ活性について制御下。
【0133】
DNアーゼI消化を、以下のとおりに行った。ある範囲のアリコート(0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10μl)の0.2mg/ml DNアーゼI(Worthington)を、100μlの核を含む個々の遠沈管に加え、そして37℃で4分インキュベートした。その消化を100μlの2×終結混合液(20mM Tris−HCl(pH8.0)、10mM EDTA、600mM NaCl、1% SDS)、10μlのプロテイナーゼK(10mg/ml濃度)の添加および55℃で60分のインキュベートによって終結させた。DNAを、フェノール:クロロホルム(1:1、v/v)抽出およびエタノール沈降によって精製した。サンプルを、0.7%アガロース/0.5×TBEゲル上で電気泳動し、そして32P放射標識したプローブを用いた分析のためにサザンブロットした。
【0134】
(RNA調製)
成体マウス(10週齢〜40週齢)を、頚脱臼によって屠殺し、そして全組織を単離し、液体窒素中で瞬間凍結し、そして−80℃で必要となるまで保存した。総RNAを3M LiCl、6M尿素での選択的沈降(AuffrayおよびRougeon、1980)によって調製した。組織を、1mlのLiCl−尿素溶液を含む14mlの管に移し、そしてUltra−Turrax T25(Janke & Kunkel)を用いて30秒間ホモジナイズした。次いで、サンプルを、3回の30秒間のパルスの超音波処理(Cole−Parmer Instrument Co.,USA)に供し、そのホモジネートを滅菌した微小遠沈管に移し、そしてRNAを16時間4℃で沈降させた。そのRNAを、遠心分離(4℃、14900×g、20分間)によって収集し、500μlのLiCl−尿素溶液中で洗浄し、そして500μl TES(10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.5% SDS)中に再懸濁した。フェノール:クロロホルムでの抽出後、サンプルを酢酸ナトリウムを用いて0.3Mにし、そしてRNAを1mlの100%エタノールの添加および−20℃での少なくとも1時間の保存によって沈降した。そのRNAを遠心分離によって収集し、そして20μlの滅菌水に再懸濁し、そして260nmでの吸光度によって濃度を評価した。
【0135】
(競合RT−PCRに基づくアッセイ)
(ヒトTBP発現の分析)
改変された競合RT−PCRアプローチ(Gillilandら、1990)を用いて、マウスバックグラウンドでのヒトTBPおよびPSMB1の遺伝子発現を正確に定量した。トランスジェニックマウス組織または細胞株からの総RNA(1μg)を25μlの反応物(1×RT緩衝液(25mM Tris−HCl(pH8.3)、25mM KCl、5mM MgCl2、5mM DTT,0.25mMスペルミジン)中の1μMの逆向きプライマー(TB14またはC5R)を伴う、10ユニットのトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)の逆転写酵素(Promega)、10mM DTT、各々2.5mMのdNTP、25ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター(Fermentas))中で逆転写した。cDNAの合成を、42℃で1時間、続いて、52℃でさらに1時間進行させ、そして95℃で5分間その酵素を熱不活化した。PCR反応物は、尾生検スクリーニングのために記載され、そして問題の配列について特異的なプライマーセット(上記に詳述される。これらのうちの一つは、上記のプロトコルを用いて末端標識された)を含む反応物を用いて増幅された、1μlのcDNAを含んだ。プライマーを2回のSephadexG25クロマトグラフィー(Pharmacia)を用いて精製し、そして80%の回収が推定された。PCR条件は、5と30との間のサイクル数の94℃で1分間、58度で1分間および72℃で1分間であった。
【0136】
ヒトPCR産物とマウスPCR産物との間を識別するために、2〜10μlの各々のサンプルを5ユニットの適切な制限酵素とともに37℃で2時間インキュベートした。この反応を、大(250μl)容量で行って、PCR緩衝液に由来する塩および界面活性剤を希釈し、制限酵素活性の阻害を防いだ。(コントロール実験は、これが実際にそうであったことを実証した)。消化されたサンプルおよび消化されていないサンプルを、共沈剤としての25μgの酵母tRNA(Sigma)の存在下で沈降させ、遠心分離によって収集し、そして5μlのゲルロード緩衝液(5mM Tris−ホウ酸(pH8.3)、1mM EDTA、7M尿素、0.1%キシレンシアノール、0.1%ブロモフェノールブルー)中に再懸濁した。サンプルを、予め泳動した5%ポリアクリルアミドゲル上で、変性剤としての7M尿素(National Diagnostics)および0.5×TBE緩衝液の存在下で分析した。40V/cmで1時間の電気泳動の後、そのゲルを切断して、キシレンシアノール色素の前面の下に泳動する、残りの取り込まれていないヌクレオチドを除き、乾燥させ、そしてX線フィルムまたはPhosphorImagerスクリーンに曝露した。
【0137】
(ヒトhnRNP A2発現の分析)
類似の競合的RT−PCRアプローチ(Gillilandら、1990)を用いて、マウスバックグランドにおけるヒトHnRNP A2遺伝子発現を正確に定量した。逆転写後、cDNAサンプルを、プライマーセットHn9およびHn12(5’−CTCCACCATATGGTCCCC−3’)(このうち一方は、上記のプロトコルを用いて末端標識された)を用いたPCRによって増幅した。ヒトhnRNP A2 PCR産物とマウスhnRNP A2 PCR産物との間を識別するために、2〜10μlの各サンプルを、5ユニットのHindIIIを用いて37℃で2時間消化し、精製し、5%変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして結果を上記のように定量した。
【0138】
(クローンの配列決定および生物情報学的(bioinformatic)分析)
TBP(ヌクレオチド1〜9098、図20)およびhnRNP A2(ヌクレオチド1〜15071、図21)の両方の遺伝子座のHindIIIゲノムクローンを、Baseclear、Leiden、NLによって配列決定した。公知の配列に対して作製されたプライマーを用いて開始されるプライマーウォーキング戦略を用いて、未知の配列の領域(TBPはヌクレオチド1〜5642、およびhnRNP A2はヌクレオチド1〜3686)を作製した。これらの配列を以前に公知の配列データを用いてともにスプライスし、次いで生物情報学的分析において使用した。
【0139】
標準的なSmith−Waterman検索を用いて、TBP配列とhnRNPA2配列との間の直接の比較を行った。これは、図19に示されるようないくつかのAlu反復以外の相同性の明らかな領域を示さない。これらの反復をマスクすることおよびGCGベストフィットプログラムを用いた比較を行うことは、以下のような相同な2つの短い領域のを生じた:
RNP3868−3836:TBP 8971−9003 長さ=33、%同一性=75.758
RNP 3425−3459:TBP 9049−9083 長さ=35 %同一性=74.286
CpG島もまた、同定され、そしてこれを図19に示す。ヌクレオチド位置は以下のとおりである。
RNP 4399−5491、5749−6731
TBP 5285−5648、6390−6966。
【0140】
配列決定研究を上記のように行って、RNP遺伝子およびTBP遺伝子の直ぐ上流の領域からのより多くの配列データを提供した。
【0141】
図20および21に与えられる配列データは、5’HindIII部位に始まり、そしてともにスプライスされた、Baseclearで生成された配列およびすでに公開された配列データを含む。TBP配列の場合において、Baseclear配列を大文字で示す。
【0142】
これらの配列の分析は、以前に特徴付けられた遺伝子であるHP1H−γの存在すなわち、RNP遺伝子のHγ上流のヘテロクロマチン関連タンパク質の存在を示す(図19および22)。この遺伝子はまた、ヒト組織ドットブロット分析によって(データは示さず)普遍的に発現されることが示されている。
【0143】
生物情報学分析および配列の比較は、遺伝子座の間の明らかな配列相同性を示さなかった。しかし、このデータのまとめを図19に示す。理解され得るように、いくつかの推定Sp1転写因子結合部位がこの2つの遺伝子座の二方向性のプロモーター領域において位置する。CpGメチル化遊離島もまた示す。両方の遺伝子座は、普遍的に発現された遺伝子のクラスターを含む二方向性の構造を示す。
【0144】
(hnRNP A2 EGFPレポーター構築物の構築)
CMV−EGFP−IRESを、KpnIおよびNotIを用いてpEGFP−N1(Clontech)を消化して、EGFP配列を遊離することによって構築し、次いで、これを、KpnIおよび次いでNotIを用いて部分的に消化したpIRESneo(Clontech)中に連結させた。これは、CMVプロモーターの3’側におよびIRESneoの5’側にEGFP遺伝子を有するベクター(CMV−EGFP−IRES)を作製した。
【0145】
CMVプロモーターをRNPプロモーターについて交換して、図22においてRNPと称する構築物を作製した。CMV−EFGP−IRESを、AgeIで消化し、T4 DNAポリメラーゼ(50mM Tris pH7.5、0.05mM MgCl2、0.05mM DTT、1mM dNTP、1ユニットのT4 DNAポリメラーゼ/μgDNA)で平滑化し、次いでNruIで切断して、CMVプロモーターを放出してEGFP−IRESを与えた。RNPプロモーターを8kb hnRNPA2 HindIIIクローン(8kb Hind BKS)(これは、プロモーターおよびRNPA2およびHP1Hγ遺伝子の最初のエキソンを含む)から取り出した。8kb Hind BKSをBspEIおよびTth111Iで切断し(630bpプロモーターを放出する)、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し、そしてEGFP−IRESに単離したRNPプロモーターを連結させた。
【0146】
5.5RNPを、EGFP−IRESカセットを8kb Hind BKSに挿入して、その結果、EGFPの発現を、RNPプロモーターの制御下に置くことによって構築した。8kb Hind BKSを、Tth111Iで部分的に消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し、次いでSalIで消化し、これは、RNPプロモーターの3’側の全ての配列を除去した。EGFP−IRESカセットを、AgeIでの消化によってCMV−EGFP−IRESから取り出し、そしてXhoIでの消化の前に平滑化した。次いで、これを、制限処理した8kb Hind BKSに連結させた。
【0147】
5.5CMVを、CMV−EGFP−IRESカセットを8kb Hind BKS中に挿入すること、続いてRNPプロモーターを除去することによって構築した。8kb Hind BKSを、BspEIで切断し、平滑化し、次いでSalIで消化して、RNPプロモーターおよびそのプロモーターの3’側の全ての配列を除去した。CMV−EGFP−IRESカセットを、CMV−EGFP−IRESから、NruIおよびXhoIを用いた消化によって取り出し、そして消化した8kb Hind BKSへと連結させた。
【0148】
およそ4kbのDNAを、5.5RNPから除去し、そのRNPプロモーターの5’側に1.5kb残し、1.5RNPを作製した。これは、BamHIで5.5RNPを消化することによって達成した。この消化は、4kb、2.9kbおよび5kbのフラグメントを与えた。次いで、この2.9kbフラグメントおよび5kbフラグメントを単離し、そして再連結して1.5RNPを作製し、このとき、2.9kbフラグメントは、正確な配向で挿入された。
【0149】
この5.5RNP構築物を、そのRNPプロモーターの3’側のhnRNPA2配列を含むように拡張し(構築物7.5RNPおよび8.5RNP)、この領域は、hnRNPA2の最初のエキソンおよびイントロンを含んだ。EGFP−IRESレポーターがこれらの構築物に含まれるために、エキソン2のhnRNPA2スプライスアクセプター配列を、EGFP遺伝子とインフレームに配置し、その結果、hnRNPA2の最初のエキソンがEGFP遺伝子へとスプライスされ得、それゆえEGFP発現がRNPプロモーターによって駆動され得ることが必要であった。hnRNPA2スプライスアクセプターを含む2つの構築物を作製し、これらは、第二のエキソンの5’側の80bpおよび約1kbの配列を含み、これらの配列は、PCRによって、MA160(これは、hnRNPA2ゲノム配列全体を含む)から得られた。80bpの配列を、PCR(20mM Tris−HCl pH8.4、50mM KCl、1μM Primer、2mM MgCl2、0.2mM dNTP 3.5μg MA160 DNA、5U Platinum Taq DNA Polymerase)によって、プライマー(5’ACCGGTTCTCTCTGCAAAGGAAAATACC3’)および(5’GGTACCCTCTGCCAGCAGGTCACCTC3’)を用いて単離し、1kbのフラグメントを、プライマー(5’ACCGGTTCTCTCTGCAAAGGAAAATACC3’)および(5’GGTACCGAGCATGCGAATGGAGGGAGAGCTCCG3’)を用いて単離した。これらのプライマーは、そのPCR産物がKpnIおよびAgeI部位がそれぞれ5’末端および3’末端に含むように設計した。次いで、PCR産物をTAクローニングベクターpCR3.1(Invitrogen)にクローニングした。
【0150】
80kbのフラグメントおよび1kbのフラグメントを、pCR3.1から、KpnI−AgeIフラグメントとして単離し、そしてKpnIで部分消化し、次いでAgeIで切断したCMV−EGFP−IRESに連結させた。これは、EGFP遺伝子とのスプライスアクセプター(SA)のインフレーム融合物を作製した。
【0151】
7.5RNPを、8kb Hind BKSをClaIで消化すること、T4 DNAポリメラーゼで平滑化すること、次いでSalIで消化することによって構築した。この80bpのSA−EGFP−IRESカセットを、KpnIでの部分消化に続いて、T4DNAポリメラーゼでの平滑化およびXhoI消化によって単離した。これを、ClaI−SalI消化した8kb Hind BKS中に連結させた。
【0152】
8.5RNPを、8kb Hind BKSのSphI部分消化、続いてSalIでの消化によって構築し、この1kb SA−EGFP−IRESカセットを、同様に、SphI部分消化に続いてXhoIでの制限処理によって単離した。このカセットを、8kb Hind BKSに連結して8.5RNPを作製した。
【0153】
4.0CMVを、4kbフラグメントを8kb Hind BKSから、BamHI/HindIII/BstEII消化によって切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、クレノウおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端充填した。
【0154】
pEGFP−N1(Clontech)をAseIで直鎖状とし、上記のように末端を平滑化し、次いでウシ腸ホスファターゼ(CIP)を用いて処置した。次いで両方のフラグメントを一晩連結させた。
【0155】
p7.5CMVを、8.3kbのフラグメントをp8kb Hind BKSからHindIII消化を用いて切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、クレノウおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端を充填した。pEGFP−N1(Clontech)をAseIで直鎖状とし、その末端を上記のように平滑化し、次いでウシ腸ホスファターゼ(CIP)を用いて処置した。次いで両方のフラグメントを一晩連結させた。得られたクローンをその8.3kb UCOEインサートの順配向および逆配向の両方についてスクリーニングした。
【0156】
p16CMVを、16kbフラグメントを、MA551(hnRNPA2ゲノムクローン(これは、5kbの5’側の配列および1.5kbの3'側の配列を含み、これは、コード領域全体(図13Cに示す16kbフラグメント)を含む))からSalI消化によって切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、クレノウおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端充填した。pEGFP−N1(Clontech)を、AseIを用いて直鎖状とし、末端を、上記のように平滑化し、次いでウシ腸ホスファターゼ(CIP)を用いて処理した。次いで、両方のフラグメントを一晩連結させた。得られたクローンを16kb UCOEインサートの順配向および逆配向の両方についてスクリーニングした。
【0157】
(CHOトランスフェクション)
CHO細胞を、無血清培地に2×107細胞/mlで回収した。1トランスフェクション当たり1×107細胞(0.5ml)を、1μg(5μl)の線状DNAおよび50μg(5μl)のサケ精子キャリアDNAと共に使用した。DNAおよび細胞を混合し、そして10分間氷上に置いた。BioRad Gene Pulser IITMを975μF/250Vで使用して、細胞をエレクトロポレーションし、次いで、10分間氷上に置いた。次いで、この混合物を、10mlの完全培地(HF10)上に積層し、そして1400rpmで5分間遠心分離した。この上清を取り除き、そしてペレットを、5mlのHF10中に再懸濁した。次いで、これらの細胞を、5×104または1×104にて10cmディッシュに、およびT225フラスコ当たり2×106細胞にてプレートした。24時間後に、これらの細胞を、選択(最初は、300μg/ml G418、次いで、4日後に、600μg/ml G418)下に置いた。トランスフェクションの10日後に、コロニーを、メチレンブルー(50%エタノールからなる2%溶液)を用いて染色し、そして計数した。二連のプレートを、制限されたプールとしてか、または単一の細胞コロニーとしてのいずれかで、培養物中に維持した。
【0158】
(トランスフェクトしたCHOクローンにおけるGFP発現の分析)
トランスフェクトした細胞を、600μg/mlでのG418選択上で維持した。細胞を、GFP発現分析のために、6ウェルプレートにて剥ぎ取った。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS;GIBCO)を用いて洗浄し、そしてそれらがプレートの表面から剥がれるまで、トリプシン/EDTA(Sigma)中でインキュベートした。10%ウシ胎仔血清(FCS;Sigma)で補充した過剰の栄養混合F12(HAM)培地(Gibco)を、これらの細胞に添加し、そしてこれらの細胞を、5mlのポリスチレン丸底チューブに移した。次いで、これらの細胞を、親細胞集団の自己蛍光と比較する、GFP発現の検出のためにBecton−Dickinson FACscanで分析した。19個のRNPクローン、24個の5.5RNPクローン、21個のCMVクローンおよび12個の5.5CMVクローンを分析し、そして平均を、全ての陽性クローンの蛍光の中央値から求めた。
【0159】
(トランスフェクトしたCHOプールにおけるGFP発現の分析)
G418での選択を受けた、トランスフェクトされたCHO細胞のコロニーを、T225組織培養フラスコから剥ぎ取り、そして10cmのペトリ皿にプレートして、およそ100コロニー/プレートを得た。これらのコロニーが成長した時に、これらの細胞を剥ぎ取り、そしてトランスフェクトされた細胞のこの制限されたプールを、GFP発現について分析した。GFP発現を、3〜4日毎に1:10に分割したプールを用いて、定期的にモニターした。細胞を、常に、分析する日の前に、これらの細胞が分析の日にほぼ50%のコンフルエントであるように、24ウェルプレートに分割した。次いで、これらの細胞を、24ウェルプレートから剥ぎ取り、そして前節と同じ様式にて分析した。経時的な発現について、マーカー領域(M1)を設定し、これは、細胞の陽性集団の低い割合のみを含み、そして最初のレベルからのGFP発現の任意の損失を経時的に調査するために使用された。
【0160】
(単一コピー数/低いコピー数の組み込み体のFISH分析)
(40kb TBPコスミドpWE−TSNまたはpBL3−TPO−プロ(puro)を使用するFISH分析)
DMEM−10%ウシ胎仔血清中で増殖したマウスLtk細胞を、40kb TBPコスミドpWE−TSN(図9)または25kbのプラスミドpBL−TPO−プロを用いてエレクトロポレーションした。これらのトランスフェクト体を、200mg/mlのG418(TSN)または5mg/mlのプロマイシン(TPO)のいずれかを用いて選択し、そして単一コピーまたは低コピーのクローンを、先に概説したように作製した。これらの選択されたコロニーに由来する対数的に増殖している細胞を、0.4mg/mlのコルヒチンを用いて1時間処理して、回収した。次いで、細胞を、0.056M KCl中に低張的で膨張させ、3:1のメタノール−酢酸で固定し、そして顕微鏡用スライド上に薄く広げ、中期染色体を得た。このスライドを、2×SSC(1×SSCは、0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウムである)中の1ml当たり100mgのRNaseAを用いて37℃で1時間予め処理し、2×SSC中で洗浄し、そしてエタノール脱水シリーズ(70、90、および100%エタノール)を行った。これらの染色体を、70%ホルムアミド−2×SSC中にて70℃で5分間変性させ、氷冷70%エタノール中に沈め、そして上記のように脱水した。100ngのTBPプローブ(TBP遺伝子を含む25kbのヒトゲノムDNAを保有するTPOプラスミド全体)および50ngのマウスγサテライトプローブ(Horzら、Nucl.Acids Res.9;683〜696、1981)を、ジゴキシゲニン−11−dUTPおよびビオチン−16−dUTPをそれぞれ用いて、製造業者の使用説明書に従ってニックトランスレーション(Boehringer)によって標識した。標識したプローブを、1mgのcot−1 DNAおよび5mgのニシン精子DNAを用いて沈澱させ、50%ホルムアミド−2×SSC−1% Tween20−10% デキストラン硫酸中に再懸濁し、75℃で変性させ、TBPプローブを、37℃で30分間予めアニールさせ、そしてプールし、そしてスライドに適用した。ハイブリダイゼーションを、37℃で一晩実行した。これらのスライドを、50%ホルムアミド−2×SSC中にて45℃で4回(各回3分間)、2×SSC中にて45℃で4回(各回3分間)、および0.1×SSC中にて60℃で4回(各回3分間)洗浄した。4×SSC−0.1% Tween 20中で5分間洗浄した後に、これらのスライドを、4×SSC−5%低脂肪スキムミルク中で5分間ブロックした。ビオチン標識したプローブを、以下の各々を用いて、37℃で30分間のインキュベーションによって検出した:アビジン結合体化Texas Red(Vector Laboratories Inc、USA)、続いてビオチン化抗アビジン(Vector Laboratories Inc、USA)およびアビジン結合体化Texas Red(Vector Laboratories Inc、USA)。ジゴキシゲニン標識プローブを、以下の各々を用いるビオチン検出と同時に検出した:抗ジゴキシゲニン−フルオレセイン(FITC、Boehringer)、続いてマウス抗FITC(DAKO)およびウマフルオレセイン結合体化抗マウスIgG(Vector Laboratories Inc、USA)。2回の各インキュベーションの間に、これらのスライドを、4×SSC−0.1% Tween 20中にて3回(各回2分間)洗浄した。これらのスライドを、DAPI(4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)を用いて対比染色し、そしてVectashield(Vector Laboratories Inc、USA)にマウントした。画像を、蛍光顕微鏡で、油浸100×対物レンズ(oil 100×objective)を用いて試験した。これらの画像を、Photometrics冷却電荷結合デバイスおよびVysis Smartcaptureソフトウェアを使用して、取り込んだ。
【0161】
(16RNP−EGFP構築物を使用するFISH分析)
16RNP−EGFPベクターを、EGFP−IresNeo発現カセットおよび8.5RNPに由来するいくつかのRNP 5’配列をMA551に挿入することによって構築した。8.5RNPをXhoIを用いて消化し、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、次いでPacIで消化して、得られたフラグメントを、NheIで切断され平滑化され次いでPacIで消化されたMA551中に連結した。8.5RNPを用いる場合、発現は、RNPプロモーターにより駆動され、RNPの第1エキソンとEGFPとのインフレーム(in−frame)融合を生じる。
【0162】
16RNP−EGFPでトランスフェクトされたマウスLTK-細胞のクローンを、DMEM−10%ウシ胎仔血清および200μg/ml G418中にて増殖させた。対数的に増殖している細胞を、回収する前に、1時間0.4μg/mlのコルヒチンを用いて処理した。細胞を、0.056M KCl中にて低張的に膨張させ、3:1のメタノール−酢酸中にて固定し、そして顕微鏡用スライド上に薄く広げ、中期染色体を得た。このスライドを、2×SSC(1×SSCは、0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウムである)中の1ml当たり100mgのRNaseAを用いて37℃で1時間予め処理し、2×SSC中で洗浄し、そしてエタノール脱水シリーズ(70、90、および100%エタノール)を行った。これらの染色体を、70%ホルムアミド−2×SSC中にて70℃で5分間変性させ、氷冷70%エタノール中に沈め、そして上記のように脱水した。100ngの16RNP−EGFPおよび50ngのマウスγサテライト(Horzら、Nucl.Acids Res.9;683〜696、1981)を、ジゴキシゲニン−11−dUTPおよびビオチン−16−dUTPをそれぞれ用いて、製造業者の使用説明書に従ってニックトランスレーション(Boehringer)によって標識した。標識したプローブを、5μgのニシン精子DNAを用いてエタノール沈澱させ、そしてRNPプローブを、1μgのcot−1 DNAを用いて沈澱させ;50%ホルムアミド−2×SSC−1% Tween20−10% デキストラン硫酸中に再懸濁し;75℃で変性させ、RNPプローブを、37℃で30分間予めアニールさせ;そしてプールし;そしてスライドに適用した。ハイブリダイゼーションを、37℃で一晩実行した。これらのスライドを、50%ホルムアミド−2×SSC中にて45℃で4回(各々3分間)、2×SSC中にて45℃で4回(各回3分間)、および0.1×SSC中にて60℃で4回(各回3分間)洗浄した。4×SSC−0.1% Tween 20中で5分間洗浄した後、これらのスライドを、4×SSC−5%低脂肪スキムミルク中で5分間ブロックした。ビオチンを、以下の各々を用いて、37℃で30分間のインキュベーションによって検出した:アビジン結合体化Texas Red(Vector Laboratories)、続いてビオチン化抗アビジン(Vector Laboratories)およびアビジン結合体化Texas Red(Vector Laboratories)。ジゴキシゲニンを、以下の各々を用いてビオチンと同時に検出した:抗ジゴキシゲニン−フルオレセイン(FITC、Boehringer)、続いてマウス抗FITC(DAKO)およびウマフルオレセイン結合体化抗マウスIgG(Vector Laboratories)。2回の各インキュベーションの間に、これらのスライドを、4×SSC−0.1% Tween 20中にて3回(各回2分間)洗浄した。これらのスライドを、DAPI(4’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)を用いて対比染色し、そしてVectashield(Vector)にマウントした。画像をOlympusBX40蛍光顕微鏡で油浸100×対物レンズを用いて試験した。これらの画像を、Photometrics冷却電荷結合デバイスおよびVysis Smartcaptureソフトウェアを使用して、取り込んだ。
【0163】
(コピー数の決定)
ゲノムDNAを、標準的な手順(Sambrookら、1989)によって細胞クローンから調製した。トランスフェクトした遺伝子のコピー数を、HincIIで消化したゲノムDNAのサザンブロット分析によって決定した。導入遺伝子を、16RNP−EGFPに由来する1kpbフラグメント(製造業者の使用説明書(Megaprime DNA標識系、Amercham)に従って[α−32P]dCTPを用いて標識したネオマイシン耐性カセットを含む)へのハイブリダイゼーションによって、2.5kbpのバンドとして検出した。正規化のために、ブロットを、マウスvav遺伝子座(Ogilvyら、1998)に由来する、上記のように標識した1kbpのNcoIフラグメントを用いて同時にハイブリダイズし、これにより1.4kbpのバンドが得られた。コピー数の標準物として、いくつかのpWE−TSNクローンに由来するDNAを、PstIで消化し、そして上記のプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナルの定量を、Cyclone PhorsphorImager(Packard)を用いて実行した。
【0164】
(トランスフェクトしたLtkクローンにおけるGFP発現の分析)
トランスフェクトされた細胞を、200μg/mlでのG418選択上で維持した。80〜100%コンフルエントな細胞を、GFP発現の分析のために6ウェルプレートに剥ぎ取った。細胞をPBSで洗浄し、そしてそれらがプレートの表面から剥がれるまで、トリプシン/EDTA(Sigma)中にてインキュベートした。10%ウシ胎仔血清(Sigma)で補充した過剰のDMEM(Gibco)を、これらの細胞に添加し、、5mlのポリスチレン丸底チューブに移した。次いで、これらの細胞を、トランスフェクトしていないコントロールの自己蛍光と比較して、GFP発現の検出のためにBecton−Dickinson FACscanで分析した。
【0165】
(EBVレポーター構築物の産生)
サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、増強した緑色蛍光タンパク質(EGFP)およびシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化配列を含むDNAフラグメントを、製造業者の推奨する条件(NEB)を使用するAse IおよびAfl IIでの制限エンドヌクレアーゼ消化によって、ベクターpEGFP−N1(Clontech)から取り除いた。このDNAを0.5%アガロースゲル上で電気泳動し、ベクター骨格からこのフラグメントを分離した。このDNAフラグメントを、ゲルから切り出し、そして標準的なグラスミルク(glass milk)精製技術を使用して、ゲルスライスより精製した。このフラグメントを、製造業者の条件に従ってT4 DNAポリメラーゼ(NEB)を使用して、平滑化し、そしてフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)での1:1(v/v)の抽出、続いてエタノール沈澱によって精製した。
【0166】
次いで、レポーターカセットを、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)ベクターp220.2(国際特許出願WO 98/07876に記載される)中にクローニングした。p220.2を、HindIII(ベクターのマルチクローニング配列(MCS)中の独特の部位)でエンドヌクレアーゼ消化し、平滑化し、そして上記と同じ様式にて精製した。このレポーターカセットを、T4 DNAリガーゼ(Promega)を使用して、p220.2中にライゲーションした。ライゲーション反応を、1×ライゲーション緩衝液(Promega)中の200ngの線状化p220.2およびモル等量または5モル過剰のいずれかのCMV−EGFP−SV40pAフラグメントを使用して、10μl容量中で実行した。この反応を、室温で一晩インキュベートした。2.5μlのライゲーション液を、2.5kV、400Ω、25μFでのエレクトロポレーションによって、電気的にコンピテントな(electrocompetent)DH5α細胞中に形質転換し、続いて900μlのSOB培地を添加し、そして37℃で1時間インキュベートした。形質転換液の各々の200μlを、LBアンピシリンアガープレートにプレートし、そして37℃で一晩インキュベートした。
【0167】
得られたコロニーを、CMVおよびEGFP配列中のDNAプライマーを用いるコロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、Taqポリメラーゼ(Advanced Biotechnologies)を、製造業者の標準的な条件で使用して、レポーターカセットの存在についてスクリーニングした。陽性コロニーを、LBアンピシリン培地にて一晩増殖させ、そしてアルカリ溶解DNAミニプレパレーション(Qiagen)として分析した。DNAを、BamHI制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して、正確な配向のフラグメントについてスクリーニングした。得られた構築物を、p220.EGFPと名付けた。
【0168】
p220.EGFPは、以下に記載されるのと本質的に同じ方法を使用して、K562細胞中へのエレクトロポレーションの後に、Becton−Dickinson FACscanでの分析によって、EGFPを発現することが実証された。
【0169】
(hnRNPA2 16kb(RNP16)UCOEフラグメントを含むEBVレポーター構築物の生成)
SalI部位を、SalIを有するベクターの部分的制限エンドヌクレアーゼ消化、続いて、このベクターの平滑化および再ライゲーションによって、p220.EGFPから取り除き、それによってベクターの多重クローニング部位(MCS)中の唯一のSalI部位を取り去り、これは、16kbのRNPフラグメントのクローニングに利用され得る。得られたベクターを、SalIで制限エンドヌクレアーゼ消化し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理し(ライゲーションの間のベクターの再環状化を防ぐため)、そしてフェノール:クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。
【0170】
16kb RNPフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼSalIを使用して、ベクターMA551から除去し、そして平滑化し、電気溶出によって精製し、そして線状化されたベクター中にライゲーションした。ライゲーション反応を、上記と同じ様式にて(等モル量のフラグメントを使用して)設定し、続いて形質転換し、そしてこのフラグメントの存在についてコロニーをスクリーニングした。コロニーを、DNAミニプレパレーションとしてスクリーニングした。ここで陽性クローンを、アガロースゲル電気泳動分析によって確認した。16kb RNPフラグメントの正確な配向を、NotIを使用する制限エンドヌクレアーゼ分析によって決定した。得られた構築物を、p220.RNP16と名付けた。
【0171】
(Hela細胞中へのEBVレポーター構築物のトランスフェクション)
Hela細胞を、国際特許出願WO98/35984に記載され、かつ以下に記載される、CL22ペプチド媒介性送達系を使用して、p220.EGFPおよびp220.RNP16とともに、6ウェルプレート中にトランスフェクトした。24時間の培養後に、ハイグロマイシンB(Calbiochem)選択を、400μg/mlの最終濃度まで添加した。細胞のハイグロマイシンB耐性コロニーを、培養物中にて維持し、そしてBecton−Dickinson FACScanにおいてGFPの発現を定期的に分析した。細胞を、分析前日に24ウェルプレート中に、分析日におよそ50%コンフルエントになるように慣用的に分割した。経時的な発現のために、細胞のGFP発現集団を含むマーカー領域を、設定し、そしてこのマーカーを使用して、経時的なGFP発現の安定性を調査した。トランスフェクトされたHela細胞をまた、ハイグロマイシンB選択から取り出し、選択圧をなしにして、UCOEの非存在/存在下で、GFP発現の安定性を調査した。
【0172】
(CET200のクローニング)
PEGFPN1を、NheI/NotIIを用いて制限処理し、そして以下のオリゴを、アニールさせ、そして挿入して、多重クローニング部位(MCS)を作製した:
5’CTAGCGTTCGAAGTTTAAACGC3’
5’GGCCGCGTTTAAACTTCGAACG3’。
【0173】
得られたプラスミドを、AseIで制限処理し、平滑化し、そして8.3kbのHindIIIフラグメント平滑化RNP A2フラグメントを、挿入した。次いで、得られた配向を決定し、最終的なベクターCET2000を作製した(図49を参照のこと)。
【0174】
(CET201のクローニング)
pUC19を、EcoRI/ArIで制限処理し、そして平滑化し、1つのPvuI部位を取り除き、それによって環状化のための唯一のPvuI部位を作製した(pUC19Δ)。MCSを、NheI/AgeIでの消化によってpEGFPN1から取り除き、そして平滑化した。このことは、NheI部位を作製する。CMV EGFP SV40カセットを、AflII平滑AseIフラグメントとして取り除き、そしてPvuIIで消化されているpUC19Δ中に挿入した。そしてpGKプロbGH(pGKプロBKSに由来する)を、NdeIで挿入した。次いで、得られたベクターを、NheI/NotIで制限処理し、EGFPを取り除き、そしてMCSを、上記のように挿入した。次いで、MCS含有ベクターを、HindIIIで制限処理し、そして8.3kbのRNP HindIIIフラグメントを挿入し、最終的なベクターCET210を作製した(図49を参照のこと)。
【0175】
(UCOEを含むプラスミドの調製)
(RNP−UCOE含有レポーター構築物のクローニング)
p8kb Hind BKSは、RNP遺伝子座の8.3kb HindIIIゲノムフラグメントを含み、このフラグメントは、RNPA2およびHP1H−γ遺伝子のプロモーターおよび第1エキソンを含んだ。
【0176】
pCMV EGFP−IRESを、pEGFP−N1(Clontech、CMV−EGFPと同じ。図35)をKpnIおよびNotIで消化することによって構築し、EGFP配列を解離した。次いで、これを、KpnI次いでNotIで部分消化されたpIRESneo(Clontech)中にライゲーションした。このことは、CMVプロモーターに対して3’およびIRESneoに対して5’のEGFP遺伝子を有するベクターを作製した。
【0177】
イントロンA−CMVを、NruI(平滑カッター)およびHindIIIを用いて、pTX0350(pUCベースのCMV イントロンA−MAGE1プラスミド)から1.5kbのイントロンA−CMVフラグメントを取り出すことによってクローニングした。pEGFP−NIを、AseIを用いて消化し、次いで、このフラグメントの末端を、KlenowおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端充填した。次いで、これをHindIIIで消化して、4.2kbのフラグメントを得た。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。
【0178】
p4.0CMVを、BamHI/HindIII/BstEII消化を用いて、p8kb Hind BKSから4kbのフラグメントを切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、KlenowおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端充填した。
【0179】
pEGFP−N1(Clontech)を、AseIで線状化し、上記のように末端を平滑化し、次いで、仔ウシ腸ホスファターゼ(CIP)で処理した。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。得られたクローンを、順方向および逆方向の両方の配向の4kb UCOEインサートについてスクリーニングした。
【0180】
p7.5CMVを、HindIII消化を用いて、p8kb Hind BKSから8.3kbのフラグメントを切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、KlenowおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端充填した。pEGFP−NI(Clontech)を、AseIで線状化し、この末端を、上記のように平滑化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ(CIP)で処理した。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。得られたクローンを、順方向および逆方向の両方の配向の8.3kb UCOEインサートについてスクリーニングした。
【0181】
p16CMVを、SalI消化によって、MA551(コーディング領域全体を含む5kbの5’配列および1.5kbの3’配列を含むhnRNP A2ゲノムクローン)から16kbフラグメントを切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、KlenowおよびT4 DNAポリメラーゼを用いて末端充填した。pEGFP−NI(Clontech)を、AseIで線状化し、この末端を、上記のように平滑化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ(CIP)で処理した。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。得られたクローンを、順方向および逆方向の両方の配向の16kb UCOEインサートについてスクリーニングした。
【0182】
(CL22ペプチドを使用するHela細胞のトランスフェクション)
CL22ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する:
NH2−KKKKKKGGFLGFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK−COOH。
【0183】
CL22ペプチドを、WO 98/35984に記載される方法に従って、トランスフェクト剤として使用した。
【0184】
HeLa細胞を、EF10培地中にて慣用的に培養し、3〜4日毎にコンフルエントフラスコ1:10に分割した。トランスフェクションの24時間前に、細胞を、1ウェル(6ウェルプレート)当たり5×104で播種した。複合体を、等容量のDNA:CL22(これは、Hepes緩衝化生理食塩水(10mM Hepes pH7.4、150mM NaCl)中にて、それぞれ、40μg/mlおよび80μg/mlの濃度である)を混合することによってトランスフェクションの1時間前に形成させ、そして室温にて1時間インキュベートした。培地を、細胞から取り除き、次いで、これを1%リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。次いで、2.5μgのDNA:複合体(125μl)を、細胞に添加し、そして容量を、RAQ(RPMI培地(Sigma)、0.1%ヒトアルブミン、137μM クロロキン(新鮮に添加))で1mlに増量し、このことは、120μMの最終濃度のクロロキンを与えた。細胞および複合体を、37℃で5時間インキュベートした。次いで、この複合体を除去し、そしてEF10培地(最小必須培地(Sigma)、10%仔ウシ血清、100ユニット/ml ペニシリン/0.1mg/mlストレプトマイシン、1×非必須アミノ酸(Sigma))で置換した。
【0185】
(トランスフェクトされたHeLa細胞におけるGFP発現の分析)
GFPの発現分析のために、細胞を6ウェルプレートから剥ぎ取った。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS;Gibco)で洗浄し、そしてプレートの表面から剥離するまで、トリプシン/EDTA(Sigma)中でインキュベートした。10%ウシ胎仔血清(FCS;Sigma)を補充した過剰なEF10培地(Gibco)を細胞に添加し、そして細胞を5mlのポリスチレン丸底チューブに移した。次いで、細胞を、親細胞集団の自己蛍光と比較して、GFP発現を検出するためにBecton−Dickinson FACscanにて分析した。
【0186】
(総DNAサンプルの調製)
トランスフェクトされた集団のエピソームDNA含量を調べるために、細胞DNAの総調製物を作製した。細胞をPBSで洗浄し、次いで溶解緩衝液(新鮮なプロテイナーゼK 1mg/ml F/Cを添加した10mM tris pH7.5、10mM EDTA pH8.0、10mM NaClおよび0.5% Sarcosyl)で溶解した。細胞溶解物を、プレートから剥ぎ取り、そして口径の広いピペットを用いてエッペンドルフチューブに移した。65℃での一晩のインキュベーションに続いて、この細胞溶解物をフェノール/クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿を行なった。このDNAペレットをTE pH8.0中に再懸濁した。
【0187】
(総ゲノムDNAサンプル中のエピソームDNAの検出)
トランスフェクションの7日後のトランスフェクトされた細胞から調製した総ゲノムDNAを、トランスフェクションに使用したDNA構築物を直鎖化し、従ってサンプル中に存在するいかなるエピソームDNAも直鎖化するエンドヌクレアーゼを用いて制限エンドヌクレアーゼ消化した。Apa LI(NEB)をモックに使用し、CMV−EGFP、IntronA−CMVならびに4.0CMVを順方向および逆方向サンプルに使用した。BspLU11 I(Boehringer)を、7.5CMV順方向および逆方向サンプルに使用した。10μl(サンプルの20%)の総ゲノムDNAを、30ユニットの制限エンドヌクレアーゼを用いて16時間、製造者の推奨する条件に従って消化した。サンプルを、100pgまたは4ngの直鎖プラスミドコントロールとともに、0.6%アガロースゲル上で、400ボルト/時間電気泳動した。次いで、ゲルをサザンブロッティングにより、Hybond−N Hybridisation転写メンブレン(Amersham)に転写した。手短に言えば、ゲルを15分間0.25M HCl中でインキュベートしてDNAを脱プリン化し、次いで、45分間、1.5M NaCl/0.5M NaOH中で変性させ、そして45分間、1.5M NaCl/0.5M Tris−Cl pH7.0中で中和した。次いで、DNAを、20× SSC(3M NaCl、0.3M Na3C6H5O7−2H2O、pH7.0)中で、16時間キャピラリーブロッティングによりゲルからメンブレンに転写した。フィルターを、1時間風乾し、そしてUVP CL−100紫外線クロスリンカー(GRI)を用いて、2分間1200のエネルギー設定にて架橋させた。メンブレンを、「Church ハイブリダイゼーション条件」を用いて、放射性EGFPプローブを使用して探索した。メンブレンを、65℃にて2時間より長く、0.5MのNaPi pH7.2、1% SDS中でプレハイブリダイズした。DNAのEGFPフラグメントを、pEGFP−N1(Clontech)から、Bgl II/Not I(NEB)を用いる制限エンドヌクレアーゼ消化により取りだし、電気泳動により分離し、そしてゲル切片から、GFXTM PCR DNAおよびGel Band Purificationキット(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。50ngのEGFPフラグメントを、Megaprime DNA標識キット(Amersham)を用いて、α−32P dCTP(3000Ci/mmol;Amersham)で標識した。標識したプローブを、100μlの10mg/mlサケ精子DNAと混合し、95℃にて10分間インキュベートし、そして氷上に置いた後、ハイブリダイゼーションに添加した。メンブレンを、16時間65℃にてハイブリダイズさせ、次いで、65℃にて2回、30分間、40mM NaPi pH7.2、1% SDS中で洗浄した。次いで、放射性標識されたメンブレンを、高解像度蛍光体スクリーンに曝露した後、Cyclone保存蛍光体システム(Packard)上で分析した。
【0188】
(蛍光顕微鏡)
6ウェルプレート中で培養したトランスフェクトされた細胞を、Zeiss Axiovert S100倒立顕微鏡を用いて、蛍光下にて観察した。写真撮影を、Zeiss MC100カメラおよびFujichrome Provia 400ASAフィルムを用いて、通常の時間で行なった。
【0189】
(実施例1:ヒトTBP遺伝子座の分析)
(TBP遺伝子ドメインのマッピング)
ヒトTBP遺伝子は、20kbの長さであり(Chalutら、1995)、6q27−tel染色体上に位置し(Hengら、1994)、そして遍在性プロテオソームの部分を形成するプロテインC5をコードする遺伝子に密接に連鎖する(図1AおよびC;Trachtulec,Zら、1997)。C5遺伝子は、TBPのキャップ部位から1kb上流の位置から、多岐に転写される。従って、TBPおよびC5は、二重プロモーターを含み得る。これは、TBPに基づく発現ベクターの構築に関して重要な問題を有する。なぜなら、二重プロモーターは、両方の方向に同じ効率で必ずしも機能しないからである(GavalasおよびZalkin、1995を参照のこと)。
【0190】
配列分析は、TBP/C5プロモーター領域が、3.4kbのメチル化されていないCpG島内に含まれることを明らかにした。これは、C5のイントロン1内のFspI部位およびTBPのイントロン1内のHindIII部位から伸長し、そして両方の遺伝子の最初のイントロンの最も5’よりの1kbの配列、およびそれらの転写開始部位間の1.4kbの領域を包含する(図1B)。
【0191】
ヒトTBP遺伝子座は、3つの密接に連鎖した遺伝子から構成される。PSMB1遺伝子(本明細書中でC5とも呼ばれる)は、TBPのキャップ部位から1kb上流の位置から多岐に転写される。最近同定された遺伝子の3’末端のPDCD2は、TBPの5kb下流に位置する。これらの3つの転写単位は、全てで50kbにわたる。セントロメアに向かってPSMB1遺伝子の下流には、同一の構造遺伝子を有さない反復配列DNAのブロックから構成される少なくとも80kbの領域が存在する。テロメアに向かってPDCD2遺伝子の上流には、反復配列、非コード配列、次いで有望な新転写単位の30kbのストレッチが存在する。PDCD2遺伝子は、テロメア反復領域の開始から約150kbである。これは、TBP遺伝子座を、第6染色体の長腕上のテロメアから第1の構造遺伝子クラスターにさせる。
【0192】
(TBPドメインからの遺伝子発現のパターン)
TBP遺伝子クラスター内からの発現の組織分布を、広範なヒトの組織および細胞型に由来するポリ(A)+−RNAを用いて調製された、市販のドットブロットを用いて評価した(図35A)。適切なプローブを用いたこのドットブロットのハイブリダイゼーションは、PSMB1遺伝子(図35B)、PDCD2遺伝子(図35C)およびTBP遺伝子(図35D)が、全て遍在的に発現されることを示した。これらのデータは、TBP座が、全面的に、遍在的に発現されるクロマチンドメインから構成されることを確認した。
【0193】
(マウス保有pCP2−TLNにおける導入遺伝子完全性のマッピング)
90kb長のpCYPAC−2に由来するpCP2−TLNクローン(図1)を使用して、トランスジェニックマウスを作製した。このクローンは、C5遺伝子の46kb下流の位置(TBPの5’側の65kb)で開始し、そしてTBPの3’側の4.5kbで終結する。従って、このクローンは、それらの全体においてC5遺伝子およびTBP遺伝子の両方を保有する。
【0194】
pCP2−TLNを有する3つのトランスジェニック系統を生成した。pCP2−TLNの末端に由来するプローブを用いる最初のサザンブロット分析は、TLN:3系統が、頭−尾立体配置(図3a、レーンTLN:3)における導入遺伝子の2つのコピー(図2a、b レーンTLN−3)を保有することを示した。しかし、1つのコピーは、TBPプロモーターにおよぶ5’欠失を受けているようである(図4、レーンTLN:3)。末端フラグメント分析によりTLN:8系統は、pCP2−TLNの3つのコピーを保有するようであった(図2a、b レーンTLN−8)。TLN:28系統は、複数の組み込み部位でいくつかのコピーを保有するようであった(図3a、レーンTLN:28)。
【0195】
これらのTLNマウスにおける導入遺伝子のコピー数および完全性の最初の分析のまとめを図3Bに示す。
【0196】
pCP2−TLNを用いて生成されるトランスジェニック系統のさらなる分析は、TLN:3系統が、2つの欠失されたpCP2−TLNのコピーを含有し、その結果TBP遺伝子およびPSMB1遺伝子の1つの機能的なコピーがインタクトなままであることをここで示した(図3C、TLN:3)。TLN:8系統は、pCP2−TLNの2つの直列に組みこまれたコピーを保有する(図3C、TLN:8)。TLN:28系統は、pCP2−TLNの4つの直列に配置されたコピーを保有する(図4、TLN:28)。TLN:8およびTLN:28における導入遺伝子の直列アレイの5’末端および3’末端における欠失でさえ、PSMB1遺伝子およびTBP遺伝子をインタクトなままで残している。
【0197】
予期されたように、メチル化されていないTBP/C5の島は、CpGリッチドメインを保有する他の遺伝子の5’領域において観察されたように(例えば、マウスThy−1;Kolstoら、1986)、トランスジェニックマウスにおいて保存されている(データ示さず)。
【0198】
(マウスにおけるpCP2−TLNに対するTBP導入遺伝子およびC5導入遺伝子の発現分析)
内在性のマウスおよびヒトの導入遺伝子であるTBPおよびC5メッセージの両方を同時に検出する、RT−PCRに基づくアッセイを開発した。このRT−PCR反応のためのプライマー(TB−14およびTB−22)を、ヒトのTBP cDNA配列とマウスのTBP cDNA配列との間の相同性領域から選択した(図5b)。これは、1対のプライマーによって、284bpのRT−PCR産物が、両方のmRNAから生成されることを可能にする。ヒトTBP産物とマウスTBP産物との間を識別するために、制限酵素部位の存在に変化をもたらす少数の塩基差異を利用した。Bsp1407Iでの消化は、ヒトPCR産物を切断して、221ヌクレオチド(nt)のフラグメントを生じさせる(図6a)。同様に、ヒトC5 cDNA配列とマウスC5 cDNA配列との間の相同性領域(図5a)からは、両方の配列から350ntのRT−PCR産物を生成することを可能にする。PstIでの切断は、マウスC5 mRNA由来の産物の大きさを173ntに減少させた(図7a)。
【0199】
TB14プライマー(図5b)およびC5RTFプライマー(図5a)は、32Pで末端標識されて、PCR反応後に放射性産物の生成をもたらす。これらの産物を、最終的に、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離する(図6b〜cおよび7b)。
【0200】
トランスジェニックマウス系統であるTLN:3、TLN:8、およびTLN:28の種々の組織由来の総RNA(1μg)を、上記の分析手順に供し、そしてPhosphorImager分析によって定量化した(図8)。すべてのマウスが、これら2つの遺伝子のインタクトな単一のコピーを保有する、分析されたすべての組織(TLN:3を含む)において、ヒトのTBP導入遺伝子およびC5導入遺伝子の両方の有意なレベルの発現を示した。最も重要なことには、特にC5について、所定のマウス系統内の組織間において再現可能なレベルの発現が観察された。このことは、おそらくTLNクローンが、遍在性のクロマチンを開く能力を保有することを示す。しかし、導入遺伝子コピー数あたりの発現レベルにおける幾分の変動が、マウス系統間で観察された。さらに、TLN:8系統における組織間のTBP発現もまた、5〜40%変動した。これらの結果は、TLNがクロマチンを開く能力を保有するが、C5そして特にTBPプロモーターには正および負の転写干渉をする傾向があることを示唆する。このことは、同様に、このクローンのTBP領域およびC5領域の固有の転写活性化能力が弱く、従って位置効果を超える優性効果を常には発揮し得ないことを意味する。このことは、この領域のクロマチンを開くUCOE効果であるように思われるものとは対照的であり、これは強力で、そしてこのような位置効果を無効にするように思われる。この仮説は、例えば、TLN:8系統におけるC5についてのプロモーターを有する脾臓と筋肉との間のTBPレベルの比率と比較して、より弱いTBPプロモーターが、より可変性である傾向があるという観察によって支持される(図8)。
【0201】
先に記載されたような導入遺伝子発現分析を、2ヶ月齢と6ヶ月齢との間であるマウス由来の組織を用いて実施した。導入遺伝子の発現の安定性をまた、TLN:3系統およびTLN:8系統由来の23ヶ月齢のマウスにおいて、PSMB1 mRNAを分析することによって評価した。より若い動物で得られたものと比較して、類似の結果が両方の系統において観察された。これらの結果はさらに、この導入遺伝子が、転写的に能力のある開いたクロマチン構造を維持することを実証する。
【0202】
(TBP遺伝座の40kbサブクローンの発現分析)
トランスジェニックマウスにおける、pCP2−TLNクローンによって与えられる再現可能で生理学的なレベルの発現は、これが、遍在性のクロマチンを開く能力を保有することを示す。この活性を担うDNAの領域の詳細なマッピングに対する最初の工程として、本発明者らは、ヒトTBP遺伝座の40kbのサブクローン(pCP2−TSN;図1a)を分析することを開始した。このpCP−TSNクローンは、TBP遺伝子の周辺に12kbの5’隣接配列および3’隣接配列の両方を保有する。結果として、これは、完全なTBP遺伝子および3’を短縮化したC5の変異体のみを保有する。
【0203】
ヒトβ−グロビンLCRでの以前の研究は、LCR活性の存在についての最初の指標が、単一コピーの導入遺伝子を保有する安定にトランスフェクトされた組織培養細胞クローン間で発現レベルを比較することによって獲得され得ることを実証した。LCRエレメントがより完全であればある程、個々のクローン間での発現の再現可能性の程度がより高いことが見出された。pCP2−TSNの発現分析を、LCR型の活性の存在について評価するためにこのストラテジーを使用して行った。
【0204】
pCP2−TSNを、最初に、ネオマイシン耐性遺伝子を保有するコスミドベクターpWE15(Clontech)(図9)内にクローン化した。次いで、得られたpWE−TBP構築物を使用して、安定にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞L細胞のクローンを産生した。次いで、23クローンの導入遺伝子コピー数を、サザンブロット分析によって決定した(図10)。次いで、一定範囲のコピー数を表す多くのクローンを選択し、そしてトランスジェニックマウスについて上記されたように、導入遺伝子の発現について分析した。結果を図11に要約する。この結果は、8つの数までの導入遺伝子コピーによって、生理学的なレベル以上の発現が得られることを示す。20以上のコピー数では、導入遺伝子あたりの発現レベルは、野生型の30〜40%まで減少する。
【0205】
これらのデータは、再現可能で生理学的なレベルの発現が、単一および複数の導入遺伝子コピー数の両方でpCP2−TSNによって生成され得ることを実証する。このことは、このゲノムクローンが、遍在性のクロマチンを開く能力を保有することを強力に示唆する。導入遺伝子コピーあたりの生理学的レベルよりも著しく高い発現レベルを生じる明白な「正の」位置効果を示す多くのクローン(例えば、番号4、33、および6)が、明らかに存在する。このことは、既に開いた活性なクロマチン内で導入遺伝子の組み込みが行なわれる特定の場合において予期される結果である。これらの状況下で、強力な転写エンハンサーの付近での存在は、本質的に弱いTBPプロモーターに対して刺激効果を有することが予期される。
【0206】
構築物の発現の安定性を、60日の期間にわたり試験した。発現レベルは、一定に維持されることが見出された(図36)。これは、薬物選択圧が取り除かれた場合でさえ事実であった(図36、G418と印付けられたレーン)。さらに、発現は、薬物選択圧が維持されているか否かとは無関係に、首尾良い細胞の凍結および融解サイクルを通して安定を維持した。
【0207】
(TBP遺伝子座の25kbのサブクローンの発現分析)
1kbの5’隣接配列および5kbの3’隣接配列を伴うTBP遺伝子にわたる25kbのゲノムクローン(TPO)(図1C)を、プロマイシン耐性遺伝子を保有する改変pBluescriptベクターのポリリンカー領域内にクローン化して、上記のようにpBL−TPO−puroを得た。この構築物を使用して、マウス繊維芽細胞L細胞の安定にトランスフェクトされたクローンを生成した。
【0208】
pBL−TPO−puro構築物は、TSN構築物を用いて得られた結果と類似の結果を与えた(図37)。このデータは、再現可能な生理学的レベルの発現が、単一および複数の導入遺伝子コピー数で、TSNおよびTPOの両方によって、生成され得ることを実証する。このデータは、遍在性のクロマチンを開く能力を保有するゲノムクローンと一致する。この推測はさらに、TPOクローン番号7(2コピー)、29(単一コピー)、および34(2コピー)が動原体性の組み込み事象である(データを以下に示す)という知見によってさらに増強され、そしてこれは、ゲノムフラグメントがヘテロクロマチン環境内から発現される能力を有することを実証する
導入遺伝子コピーあたりの生理学的レベルよりも著しく高い発現レベルを生じる明白な「正の」位置効果を示す、多数のクローン(例えば、図37、クローン11)が明らかに存在する。このことは、既に開いた活性なクロマチン内で導入遺伝子の組み込みが行なわれる特定の場合において予期される結果である。これらの状況下で、強力な転写エンハンサーの付近での存在は、本質的に弱いTBPプロモーターに対して刺激効果を有することが予期される。
【0209】
類似の結果は、CHO細胞の代わりにHela細胞を使用しても得られた(データは示さず)。
【0210】
(DNase I高感受性部位のマッピング)
すべての既知のLCRエレメントは、高度に組織特異的なDNase I高感受性の領域であることが見出されており、これは、これらのエレメントが生成すると考えられる非常に開いたクロマチン立体配置を暗示する。従って、本発明者らは、ヒトTBP遺伝子内およびこの周辺の両方でDNase I高感受性(HS)部位の存在について分析することを開始した。図12は、ヒト骨髄性白血病K562細胞株由来の核を用いる一連の実験を要約する。これは、TBP遺伝子の12kbの5’から開始し、そして3’を4.5kb伸長する40kbの領域にわたって、DNase I HS部位をマッピングする。この領域全体を通して明らかであるHS部位のみが、C5遺伝子およびTBP遺伝子の隣接したプロモーター領域にマッピングされる(図12、上パネル、HindIII消化/HindIII−XbaIプローブ)。これらのHS部位は、一過的トランスフェクションアッセイによって決定されたような、以前に同定されたTBP遺伝子発現およびC5遺伝子発現について重要なプロモーターエレメントと非常に相関する(Tumara,T.ら、1994;FouldsおよびHawley、1997)。しかし、LCR型エレメントがこの遺伝子座内に存在する場合、それらは、TBP遺伝子およびC5遺伝子の両方の転写開始部位からかなり遠いように思われる。これは、遍在性のクロマチンを開く能力の最初の指標を与えた、TBP遺伝子にわたる40kbのクローンの外側に、いかなるLCR型エレメントをも配置する。
【0211】
(FISH分析)
ヒトTBP導入遺伝子の1〜2のコピーを保有する全34個のクローンをFISHにより分析した。γサテライトまたは主なサテライトである、TBP導入遺伝子およびマウス動原体のヘテロクロマチン成分を、それぞれフルオレセインおよびテキサスレッドで検出した。これは、導入遺伝子が染色体のアームに組込まれたクローンにおいて緑色および赤色の蛍光シグナルを発生した(図39Aを参照のこと)。しかし、動原体組み込みの場合、共存するシグナルおよび両色の混合物の両方を、黄色の蛍光シグナルとして検出し得る。pWE−TSNを用いて生成した18個のうちの2個のクローン(344−6および344−37)は、動原体領域中で導入遺伝子シグナルを示した。クローン344−6では、TBP導入遺伝子は、ロバートソニアン染色体の動原体中に組込まれ、一方クローン344−37は、典型的なマウス末端動原体型染色体中に組込まれた。
【0212】
pBL3−TPO−puroを用いて生成した16個のうちの3個のクローン(440−7、440−29、および440−34)は、典型的な末端動原体型染色体中で動原体組み込みを示した。TBP導入遺伝子の単一の複製を保有したクローン440−29は、ヘテロクロマチンサテライト配列により明らかに囲まれたTBPシグナルを示した(図39BおよびCを参照のこと)。これらのクローンは、選択の非存在下で少なくとも12〜14週間生理学的レベルでTBPを発現し続けることをさらに示した(データは示さず)。
【0213】
これらの結果は、TBP遺伝子座(TPO)の25kbフラグメントの単一の複製が、ヘテロクロマチンの位置(すなわち、動原体の組み込み)の文脈においてさえ、生理学的発現を保証し得、従って、クロマチンを開く正式な証拠を提供することを示す(Sabbattini P、Georgiou A、Sinclair C、Dillon N(1999)Analysis of mice with single and multiple copies of transgenes reveals a novel arrangement for the λ5−VpreB1 locus control region、Molecular and Cellular Biology 19:671−679)。
【0214】
(実施例2)
(ヒトhnRNP A2座の分析)
(hnRNP A2遺伝子ドメインのマッピング)
hnRNP A2遺伝子は、10kbにわたる12のエキソンからなり、そしてそのコード配列およびイントロン/エキソンの構造全体においてhnRNP−A1遺伝子に対して高度に相同であり、このことは、遺伝子複製により生じ得ることを示す(Biamontiら、1994)。しかし、A1遺伝子とは異なり、A2特異的偽遺伝子は、見出されていない(Burdら、1989;Biamontiら、1994)。さらに、A1遺伝子およびA2遺伝子は、それぞれヒト染色体12q13.1(Sacconeら、1992)および7p15(Biamontiら、1994)上で遺伝的に連結されていない。図13Aは、クローンMA160に由来する160kbのpCYPAC−2上に存在するヒトhnRNP A2座の遺伝子地図を示す。このゲノムフラグメントは、110kbの5’隣接配列および50kbの3’隣接配列を保持する。hnRNP−A2の公知の転写開始部位の上流の4.5kb領域のDNA配列を決定した。これは、約1〜2kbのhnRNP−A2 cap部位の5’の位置から多岐して転写される、ヘテロクロマチン関連タンパク質HP1γについての遺伝子の位置を同定した(図13C)。サザンブロット分析は、HP1γ遺伝子全体が10kbの領域内に含まれることを示す(データは示さず)。
【0215】
従って、TBPおよびhnRNP−A2遺伝子座は、緊密に連結した、多岐して転写されるプロモーターの一般的特徴を共有する。
【0216】
ヒト組織内のHP1γ遺伝子の発現パターンを、広範なヒトの組織および細胞型由来のポリ(A)+−RNAで調製したドットブロットで評価した。この結果(図38)は、hnRNP−A2のような遺伝子もまた遍在的に発現されることを示す。従って、この2つの遺伝子は、TBP遺伝子座の遍在的に発現される遺伝子ドメインと類似した遍在的に発現される遺伝子ドメインを形成するようであり得る。
【0217】
(トランスジェニックマウスにおけるhnRNP A2遺伝子座の機能解析)
MA160(図13A)を用いて、トランスジェニックマウスを作製した。F1段階を経て育種された二匹の創始者のサザンブロット分析は、これらの系統がその導入遺伝子の1〜2の複製を保有することを示した(データは示さず)。
【0218】
TBPについて使用されるアッセイと類似したRT−PCRに基づくアッセイを用いて、ヒトhnRNP A2導入遺伝子の発現を分析した。マウスhnRNP A2のcDNA配列は公知でない。従って、本発明者らは、RT−PCR増幅についての配列比較により、ヒトhnRNP A2とマウスhnRNAP A2との間の相同性領域を選択し得ない。本発明者らは最初に、2つのプライマーHn9およびHn11(これは、ヒトhnRNP A2のエキソン10および12内の配列にそれぞれ対応し(図14A)、そして270bpのRT−PCR産物を生じる)を選択した。しかし、本発明者らは、これらの2つのプライマーがヒトおよびマウスの両方のRNA調製物から同一サイズの産物を与えることを見出した(図14B)。これは、これらの2つの種間の相同性領域を示す。制限酵素の範囲を用いた試験によりまた、HindIIIは、マウス産物を切断して170bpのフラグメントを生じ得た(図14B、レーンHindIII M)が、ヒト産物(図14B、レーンHindIII H)では生じ得なかった。
【0219】
系統Hn35およびHn55のF1トランスジェニックマウスの種々の組織から調製された全RNA(1μg)を、次いで、32P末端標識化5’Hn9を用いて上記の方法を使用して分析した(図16)。PhosphorImager分析を用いてマウスRT−PCR産物に対するヒトRT−PCR産物の割合を定量した。この結果(図17A)は、再現可能な、導入遺伝子の複製数あたりの発現の生理学的レベルを、分析した全て組織型において得ることを示す。
【0220】
(トランスジェニックマウスにおけるhnRNP A2遺伝子座の60kbのサブクローンの分析)
MA160 pCYPAC由来クローンを用いて得られデータは、このゲノムフラグメントが遍在性のクロマチンを開く能力を有することを示す。この活性の原因であるDNA領域の位置をさらに決定するために、MA160から得られた60kbのAatIIサブフラグメント(Aa60)を用いてトランスジェニックマウスを作製した(図13B)。このフラグメントは、hnRNPA−2遺伝子の周りに30kbの5’隣接配列および20kbの3’隣接配列を有する。これまでに、Aa60フラグメントを有する三匹のトランスジェニックマウス(Aa7、Aa23およびAa31)が作製されており、うち二匹(Aa23および31)は、育種されて系統が確立している。導入遺伝子の推定複製数は、Aa7が3個;Aa23が1〜2個;Aa31が1〜2個である。
【0221】
ある範囲の組織からの全RNA(1μg)を、上記のように導入遺伝子の発現について分析した。その結果を図15に示し、そしてPhosphorImagerにより定量した(図17B)。これらのデータは、全てのトランスジェニックマウスが、全ての分析した組織において導入遺伝子の複製数当たりの再現可能なレベルで発現することを示す。これは、MA160により示される遍在性のクロマチンを開く能力がAa60のサブフラグメントにおいて保存されることを示す。
【0222】
(DNase I高感受性性部位のマッピング)
ヒトhnRNP A2遺伝子の転写開始点の5’側の20〜25kbの領域にわたりDNase I HS部位をマッピングするための予備実験の結果を、図18に示す。AatIIおよびClaIを用いる二重の制限酵素消化においてエキソン2からの766bpのプローブは、一連の3つのHS部位(図18、上方のパネル)を与え、これは、hnRNP A2遺伝子の5’側の−1.1kb、−0.7kb、および−0.1kbの位置に対応した(図18、下方のパネル)。本発明者らはまた、hnRNP−A2および同定されていないさらなるHS部位の転写開始の12〜13kb下流まで分析を広げた。
【0223】
TBP/C5座の場合のように、3つのHS部位は、hnRNP A2のプロモーターとHP1H−γ遺伝子との間の1〜2kbの領域に対応する。LCR型HS部位は検出されなかった。このことは、この座のクロマチンを開く能力はこの型のエレメントと関連しないことを示す。
【0224】
示されたデータは、本発明者らが、再現可能な、遍在性の、トランスジェニックマウスの全ての組織における2つの異なる遺伝子座(TBPおよびhnRNP
A2)での発現の生理学的レベルを入手し得ていることを、明らかに示す。これはLCRに由来しない、遍在性のクロマチンを開く能力を有する遺伝子制御エレメントが実際に存在することを示す。
【0225】
本明細書中に示されるデータは、他の遍在的に発現される遺伝子(例えば、ヒトβ−アクチン(例えば、Ray,P.ら、1991;Yamashitaら、1993;Deprimoら、1996を参照のこと)、マウスヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼ(Mehtaliら、1990)、マウスアデノシンデアミナーゼ(Winstonら、1992および1996)、ヒトオルニチンデカルボキシラーゼ(Halmekytoら、1991)およびマウスホスホグリセレートキナーゼ−1(Mcburneyら、1994))からのプロモーター−エンハンサーの組合わせを用いて、以前に公開された結果と全く異なる機能を実証していることに注目することが重要である。これらの初期の研究において、高度なレベルの発現が、組織のサブセットのみにおいて観察され、そしてクロマチンを開く機能は、実証も試験もされなかった。
【0226】
TBP遺伝子の場合、組織培養細胞からの発現データ(図11)は、この遍在性のクロマチンを開く能力が12kbの5’および3’の隣接配列を有する40kbのゲノムフラグメント(pCP2−TSN、図1a)内に含まれることを示す。
【0227】
hnRNP A2遺伝子にわたる60kbのフラグメント(Aa60;図13B)を有するトランスジェニックマウスのデータは、遍在性のクロマチンを開く能力を有する領域がこのフラグメントに含まれることを示す(図15〜17)。
【0228】
これまでにこれらの領域にマッピングされたDnase I HS部位のみは、LCR型エレメントよりもむしろ古典的なプロモーターに対応する。従って、遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)として作用するDNAの領域は、LCRエレメント(これは、組織特異的または制限的様式において発現される遺伝子と関連する)の定義と一致しない。従って、UCOEおよびそれらの活性は、LCRおよびKCR由来のエレメントと明らかに区別され得る。
【0229】
(発現ベクターの開発)
60kbのRNP領域のサブフラグメントを、レポーターに基づくアッセイを使用してUCOE活性についてアッセイする。
【0230】
RNPとHP1H−γとの間の二重プロモーター領域に位置するサブフラグメントを含む発現ベクターを、GFPおよびNeoRレポーター遺伝子の両方を用いて、上記のようにおよび図22に示されるように設計した。これらは、GFP/Neo発現を駆動するRNPプロモーターを有するコントロールベクター(RNP)、RNPプロモーター領域の上流の5.5kbのフラグメントおよびRNPプロモーターを含むベクター(5.5RNP)、スプライスアクセプター戦略を用いて構築したベクター(ここで、このスプライスアクセプター/分岐コンセンサス配列(RNP遺伝子のエキソン2由来)は、GFP遺伝子の前でクローン化された(これにより、RNPイントロン1からの配列を含むCpG島全体が同じレポーターに基づくアッセイにおいて試験され得ることを確認する))を含む。これは、前のGFP遺伝子の7.5kb RNP遺伝子を保有するGFP(7.5RNP)の上流のエキソン1/イントロン1の一部、およびRNPプロモーター領域の上流の1.5kbフラグメントおよびRNPプロモーターを含むベクター(1.5RNPプロモーター)を生じる。
【0231】
異種プロモーターCMVを含む発現ベクターはまた、上記に記載されそして図23に示される。これらは、内部リポソーム結合部位を有するGFP/Neo発現を駆動するCMPプロモーターを有するコントロールベクター(CMV−EGFP−IRES)および内部結合部位を有さないGFP/Neo発現を駆動するCMPプロモーターを有するコントロールベクター(CMV−EGFP)、RNPプロモーター領域の上流の5.5kbフラグメントおよびGFP/Neo発現を駆動するCMVプロモーターを含むベクター(5.5CMV)、RNPおよびHP1H−γのプロモーター、ならびにGFP/Neo発現を駆動するCMVプロモーターを含む4.0kbの配列を含むベクター(4.0CMV)、ならびにエキソン1およびイントロン1の一部を含むRNP遺伝子、およびGFP−Neo発現を駆動するCMVプロモーターの7.5kbの配列を含むベクターを含む。
【0232】
これらの構築物を、上記のように、エレクトロポレーションによりCHO細胞中にトランスフェクトした。RNPプロモーター前の5.5領域付加は、G418Rコロニーの数の3.5倍の増大を生じた(図24)。これらの同じ構築物の、核酸縮重ペプチド送達戦略を用いたCOS7細胞中へのトランスフェクションは、7倍近いコロニー数の増加を示した(データは示されず)。
【0233】
1.5倍のコロニー数の増加はまた、CMVに基づくベクターのCHO細胞中へのトランスフェクション(すなわち、CMV 対 5.5CMV)後に観察された(図24)。
【0234】
これらのトランスフェクションから得られるコロニーの環状クローニングは、次いでGFP発現レベルについて分析され得る、安定したG418R細胞株を生じた。FACSデータを図25に示す。上流配列の付加は、内在性プロモーター(RNP対5.5RNP)でアッセイされる場合、GFP発現において3.5倍の増加を生じた。GFP発現における増加はまた、異種CMVプロモーターの前に5.5kbの配列の付加とともに見られる(CMV対5.5CMV)。メチル化フリー島全体を含む構築物の伸長は、5.5RNPと比較してG418Rの数を増加させなかったが、GFP蛍光の平均中央値の増大が存在した(5.5RNP、7.5RNP;図26を参照のこと)
個々のクローンおよび制限プール(約100コロニー)のGFP発現をG418選択して/なしで細胞を培養して、経時的に追跡した。RNPプロモーター単独で生成されるクローンは、GFP発現細胞の割合が、時間が経るにつれて迅速に減少するとともに劇的な不安定性を示した。5.5RNP構築物からGFPを発現するクローンは、比較して、3ヶ月以上安定であった。CMV−GFPプールは最初、より良い安定性を示すが、完全に安定したままであった5.5CMV集団と比較して、G418の非存在下で培養して増殖させた後のGFP発現細胞数の減少は明らかであった。図27および図28は、これらの集団のFACプロフィールを示し、これは、左へのシフト、すなわちCMV−GFP構築物を有する非蛍光細胞の割合の増大を明らかに示している。対照的に、5.5CMV−GFPプールは、長い間安定した、発現の均一なピークを示す。低いまたは非発現細胞の割合は、ゲート集団M1から計算する。
【0235】
RNP座に対する研究は、RNP遺伝子およびHP1H−γ遺伝子の二重プロモーターをカバーする5.5kbの領域上に狭まっている。3’方向におけるこのフラグメントの伸長(7.5RNPまたは8.5RNP)は、遺伝子発現のレベルにおける増強を示し、そしてインタクトなメチル化フリー島を維持することに関連し得る。5.5kb配列の1.5kb領域(1.5RNP、図23)への極小化は、G418Rコロニーの数およびFAC分析により決定される発現の両方の点で、レポータートランスフェクションの研究の結果に劇的に影響を与えない(図29)こともまた見出された。しかし、1.5RNPは、5.5RNPおよび7.5RNPにより示されるような遺伝子発現の安定性を付与しない。図30は、GFP発現細胞の割合が、68日間にわたって迅速に減少することを示す。
【0236】
構築物4.0CMVを設計し、その結果CpGメチル化フリー島を提示する4kbの配列全体はインタクトなままであった。さらに、このカセットをCMV−EGFP(4.0CMV−EGFP−F(順方向)および4.0CMV−EGFP−R(逆方向))の前に両方向で挿入した。図31は、標準CMV−GFP構築物、CMV−EGFPと比較して、GFP中央値蛍光の劇的な増大(10倍より大きい)を示す。GFP発現のこのブーストは、4kbのカセットが順方向および逆方向の両方である場合に生じることもまた示す。
【0237】
遺伝子発現の安定性の点において、上流の5.5kbRNP配列を含むベクターは、CHO細胞中へトランスフェクトしそして経時的に追跡した場合、明確な利点を示す。最も重要なことには、この安定性は、内在性プロモーターに限定されるだけでなく、異種のおよび広く用いられるCMVプロモーターに安定性の利点をも付与する。
【0238】
図32は、CMVベース構築物4.0CMVおよび7.5CMVを示し、コントロールベクターCMV−EGFPは、CHO細胞中へトランスフェクトされ、かつG418選択後のトランスフェクション後13日めに分析された。中央値蛍光の実質的な増加(15〜20倍)は、CMPプロモーターの前のRNP座由来の4.0または7.5kbのフラグメントを付加することによって、見られ得る。この増加は、そのフラグメントの方向と独立している(データは示さず)。
【0239】
図33は、図32中の同じG418選択プールにおけるGFP発現細胞の割合を示す。4.0および7.5kbのフラグメントの封入は、G418選択集団におけるGFp陽性細胞の割合を増大させることが見られ得る。さらに、以前の実験から、CMV−EGFPの不安定性は、培養において約60日後にのみ明らかであることが明白であるが、この集団は、長い間比較的安定しているようである。
【0240】
図34は、等モル量の種々の構築物でCHO細胞をトランスフェクションした後のコロニー数を示す。7.5CMV構築物は、コントロールベクターCMV−EGFPより約2.5倍多いコロニーを示す。これらの知見は、7.5CMV−Fが確実に生産的な組み込み事象の数を増大させたことと一致し、従って、7.5kbフラグメントに対してクロマチンを開く能力/維持する能力が存在する。
【0241】
(UCOEを含むアデノウイルスベクター)
現在、アデノウイルス(Ad)は、遺伝子治療のための目的の多くの細胞型へ遺伝子の最も有効な送達をもたらすベクター系である。臨床開発における最も有望な遺伝子治療の多くは、このベクター系、とりわけ、サブタイプ5型Ad由来のベクターを使用する。ヒトの遺伝子治療のためのAdの有用性は、2つの主要な方法における治療用遺伝子の発現の改善により実質的に増加され得る。第1の方法は、最小の用量で最大の効果を得るため導入遺伝子発現のレベルを増加する工程を含み、これによりどんなプロモーターが使用されることも適用する。第2の方法は、特異性を保持しながら、受容される細胞においてより強力な発現を得るように、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターを改善する工程、を含む。特定の組織または腫瘍型に良好な特異性を与えるいくつかのプロモーターが公知であるが、許容される細胞においてそれらのプロモーターが与える発現のレベルは、一般に、現実の治療上の利益となるには弱すぎる。この例は、マウスのαフェトプロテイン(AFP)遺伝子のプロモーターである。これは肝細胞種(肝癌)細胞に対して弱いが非除に特異的である発現を与える(Buiら、1997、Human Gene Therapy、8、2173〜2181)。このような腫瘍特異的プロモーターは、癌についての遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法(Gene−Directed Enzyme Prodrug Therapy:(GDEPT))に特に興味深い。GDEPTは、標的化化学療法を成し遂げるために遺伝子送達を利用する。GDEPTにおいてプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子は、例えば、腫瘍への送達ベクターの注射により、腫瘍細胞に送達される。相対的に無害なプロドラッグの引き続く投与は、プロドラッグを、インサイチュで酵素を発現する細胞を殺傷する強力な細胞傷害性薬物に変換する。1つの例は、酵素ニトロリダクターゼ(NTR)およびプロドラッグCB1954(Bridgewaterら、1995、Eur.J.Cancer,31A2362〜2370)に関する。アデノウイルスベクターは、例えば、腫瘍への直接注射により、このような酵素をコードする遺伝子の最も有効な送達を得る。
【0242】
(AFPプロモーターおよびUCOEからNTRを発現するAdの構築)
4kb RNP UCOE(図20のヌクレオチド4102〜8286の配列)に続くAFPプロモーターからNTR遺伝子を発現する組換えの5型アデノウイルスベクターを作製した。4kb UCOEをまず、pTXO379へのPmelフラグメントとしてクローニングした。pTXO379は、AFPプロモーターに続くNTR遺伝子を保有する中間ベクターであり(Buiら、1997、Human Gene Therapy,8、2173〜2182)、そして、AFPプロモーターの5’に位置するCla1部位への平滑末端結合により、Ad5配列(1〜359、3525〜10589)に隣接する。制限消化を用いて単一のUCOEコピーの存在を確認し、そしてUCOEの方向を確立する。次いで、組換えAd構築物を、逆方向にUCOEフラグメントを含むプラスミドpTXO384およびAdパッケージング細胞株Per.C6(Introgeneにより開発され、そして供給される)を用いて生成した(Fallauxら、1998、Human Gene Therapy,9,1909〜1917)。Intorogenにより提供されるこの手順を、ウイルスのレスキューに用いた。本質的に、pTXO384を、Swa1を用いて直線化し、そしてSwa1直線化骨格ベクターpPS1160とともにPer.C6細胞に同時トランスフェクトした。ベクターpPS1160は、Ad5の右端およびpTXO384との重複領域を保有し、この結果、組換えAdを相同組換えにより生成する。トランスフェクトされた細胞において相同組換えにより生成されたウイルスをプールし、CTL208と名付けた。
【0243】
(インビトロでの細胞株におけるNTR発現)
CTL208および2つの他の組換えAdウイルスについて標準的手順を用いて、より大きいスケールのウイルス調製を行った。これら他の2つは、AFPプロモーターおよび最小エンハンサーに続くNTR遺伝子を保有するが、UCOEフラグメントを保有しないCTL203、およびCMVプロモーターに続くNTR遺伝子を保有するCTL102であった。このCMVプロモーターを、通常、組換えAdベクターにおいて用い、広範囲の組織および腫瘍型において強力な発現を得た。CTL203およびCTL102は、CTL208と同じAd5骨格を共有し、そしてNTR遺伝子の転写に用いられるエレメントを除いてCTL208と同一である。
【0244】
次いで、CTL203、208および102を用いて、インビトロにおいて2つの細胞株を形質導入し、NTR発現のレベルおよび特異性を研究する。2つの細胞株は、AFPを発現する原発性ヒト肝細胞癌細胞株HepG2、およびKLN205(AFPを発現しないマウス扁平上皮癌細胞株)であった。指数関数的に増殖する細胞を短時間のトリプシン処理により組織培養プレートから収集し、1.25×104/mlの生存細胞で感染培地に再懸濁し、6ウェルプレートにプレートした。ウイルスを、50の多重度で、そしてCTL203についてはまた100および500の多重度で、付着前にウェルに添加した。90分後、ウシ胎仔血清濃度を10%に調整調製し、そしてその細胞を計24時間インキュベートした。細胞溶解物を低張溶解により感染細胞から作製し、次いでエッペンドルフチューブでの遠心分離により細胞細片を排除した。ELISAを行い上清中のNTRタンパク質を定量した。これは、組換えNTRを用いるNunc−Immuno Maxisorp Assay Plateコーティング工程、二連で1ウェルあたり各50μlの低張溶解液を添加する工程、および4℃での終夜のインキュベート工程を含んでいた。次いで、このサンプルをPBS中0.5%Tweenで3×洗浄し、そしてヒツジ抗NTRポリクローナル抗血清(1ウェルあたり100μlのPBS/Tween中2000倍希釈)で30分間室温でインキュベートした。過剰の一次抗体を洗浄除去後、ロバ抗ヒツジである、HRP結合体化二次抗体を適用した(1ウェルあたり100μlのPBS/Tween中5000倍希釈)。さらに30分のインキュベーション後、サンプルをPBSで洗浄し、その後、1ウェルあたり100μlのTMB基質(10mlあたり、1ml TMB溶液(DMSO中1mg/ml)+9mlの0.05M リン酸−クエン酸緩衝液+2μlの30%v/v H2O2)を用いて、室温で10分間展開した。1ウェルあたり25μlの2MのH2SO4の添加により反応を停止し、そしてプレートリーダーを用いて450nmで読み取った。
【0245】
図46は、これらのELISAの結果を示す。これは、CTL203(AFPプロモーター/エンハンサーから発現されたNTR有する)が、弱いが特異的なNTR発現(AFP陽性細胞株でのみ検出可能)をもたらすこと示す。CTL102(CMVプロモーターから発現されたNTRを有する)は、より高くかつ非特異的な発現をもたらす。これは両方の細胞株において非常に類似のレベルのNTRである。著明に、CTL208に感染したAFP陽性HepG2細胞(UCOE+AFPプロモーター(NTRの発現を駆動する))は、CTL102に感染した細胞よりも高いレベルでNTRを発現し、一方、CTL208に感染したAFP陰性KLN205細胞は、CTL102に感染したそれらよりも有意に低いNTRを発現した。これらのデータは、UCOEがAdの状況で、特異性を部分的に保持しながら、発現を劇的に増強することを示す。
【0246】
(インビボにおけるNTR発現および抗腫瘍効果)
腫瘍特異的プロモーターは、安全性の観点から癌の遺伝子治療のための非特異的プロモーターに好ましい。なぜなら、それらのプロモーターは、正常組織における導入遺伝子のより低い発現を与えるからである。これはAdに基く遺伝子治療には特に重要である。なぜなら、腫瘍への注射後、いくつかのウイルスは腫瘍から逃れる傾向であり、そして以後の全身的伝播が正常組織を形質導入する傾向であるからである。詳細には、Adは、肝細胞の非常に効果的な形質導入を与え、その結果、肝臓の損傷は通常、Adの遺伝子治療に用量制限的な毒性である。GDEPTの場合、正常組織において発現を生じ得る強力なプロモーター(例えばCMVプロモーター)の使用は、NTRを発現する正常な肝臓細胞の殺傷を導き得る。この問題は、腫瘍細胞において抗腫瘍効果を得るのに十分強力な発現をさせるのに有利な腫瘍特異的プロモーターを用いて、潜在的に、回避されるか、または減縮され得る。従って、CTL208を、マウスの腫瘍への注射後、腫瘍細胞および肝細胞におけるNTR遺伝子発現について、および抗腫瘍効果についてCTL102と比較した。先天性の無胸腺ヌードマウス系統BALB/c nu/nuを用いた。このマウスは、特定の病原体がない雄性であり、実験開始時点で8〜12週齢であり、そしてこれを上部フィルターを備えたマイクロアイソレーターで飼育した。インビトロで培養した指数関数的に増殖するHepG2細胞を、腫瘍接種材料として用いた。この細胞を振盪フラスコ中で培養し、トリプシン処理および800gで5分間の遠心分離により収集し、洗浄し、そして滅菌生理食塩水溶液に再懸濁した。細胞の生存度をトリパンブルー色素排除により評価し、そして90%より大きい生存度の単一細胞懸濁液のみを用いた。2.0mlのキシリジン(Chanelle Animal Health Ltd,Liverpool,UK)およびケタミン(Willows Francis Veterinary,Crawley,UK)の混合物(それぞれ、1mg/mlおよび10mg/mlの濃度)の腹腔内注射で導入した全身麻酔下で、マウスのわき腹に2.5〜106細胞を皮下注射した。最初の実験で、CTL102またはCTL208を、ヌードマウスにおいて増殖している25〜60mm2のサイズ(サイズは、最長直径とそれに垂直な最大直径との積により決定される表面積として表す、長さ×幅=mm2)の皮下のHepG2腫瘍に注射した。単一用量の7.5×109粒子をそれぞれのウイルスについて用いた。動物を48時間後に屠殺し、その腫瘍および肝臓を摘出し、24時間、4%ホルマリン/PBS緩衝液中で固定し、そして標準的なプロトコールを用いて、パラフィン包埋および切片化のために処理した。連続の3μm切片を切断し、そして免疫染色して、ヒツジ抗NTR抗血清(Polyclonal Antibodies Ltd)およびVECTASTAIN Elite ABC キット(Vector Labs)を用いる間接的イムノペルオキシダーゼ染色によりNTRを発現する細胞を検出した。これらの組織学的切片を標準的顕微鏡装置を用いて検査し、そして全肝臓および腫瘍中のNTR発現細胞のパーセンテージを顕微鏡により見積もった。図47は、それぞれのマウスについての結果を示す。UCOEは(そうでなければ弱い)AFPプロモーターと組み合わせて、マウスにおいてAFP陽性腫瘍中で強力なNTR発現を与え、その結果、CTL208は平均して、腫瘍への注射後、CTL102で検出可能なレベルときわめて類似の数のNTRを発現する腫瘍細胞を得ることを示す。しかし、CTL102の腫瘍内注射は、CTL102については、6匹の動物のうち5匹について肝臓において検出可能なNTR発現を導くが、CTL208については6匹のうち0匹である。この結果は、CTL208において、UCOE−AFPプロモーターの組み合わせが、AFP陽性腫瘍細胞においてはCMVプロモーターと類似かまたはより強力な発現を与えるが、正常な(AFP陰性の)組織においてはより少ない発現を示すことを確認する。
【0247】
UCOEがAFPプロモーターからの発現を治療上有用なレベルまで上昇することを確認するために、CTL208およびCTL102を、プロドラッグCB1954と組み合わせて抗腫瘍効果を付与する能力について比較した。25〜60mm2のサイズの皮下HepG2腫瘍を保有するヌードマウスに、7.5×109または2×1010のいずれかの粒子の用量で、CTL102またはCTL208の単回注射を与えた。48時間後、マウスへのCB1954投与を開始する。CB1954(Oxford Asymmetry,Oxford,UK)をDMSO(Sigma,St Louis,Mo,USA)に溶解して、20mg/mlの濃度を得た。投与の直前に、この溶液を滅菌生理食塩水溶液に1:5に希釈して、4mg/mlの最終濃度を得た。麻酔なしで、マウスに5回、等量を毎日腹腔内投与した。マウスのコントロール群のために、プロドラッグ投与を開始する48時間前に、ウイルスの代わりにPBSを腫瘍に注射した。その後27日間、副尺付きカリパス(ノギス)を用いて毎日、腫瘍のサイズを測定した。図48は、その結果を示す。CB1954もウイルスも投与しないコントロール群については、7/7の腫瘍が迅速に増殖し続けた。腫瘍の退行をNTR発現ウイルスおよびCB1954の両方を投与されたすべての群においていくつかのマウスで観察した。CTL102での退行は、低い方の用量を投与したマウスで3/8に観察され、そして高い方の用量を投与したマウスで4/8に観察された。CTL208での退行は、それぞれ5/8マウス、6/8マウスで観察された。これらの結果により、CTLにおいて、UCOEは、許容的な腫瘍細胞におけるAFPプロモーターからのNTR発現を、強力なCMVプロモーターにより得られる発現を超えるレベルまで上昇させること、そしてこれがGDEPTのための臨床状態のマウスモデルにおいて優れた抗腫瘍効果を生じることが確認される。
【0248】
これらの結果は、UCOEの2つの重要かつ有用な特性を実証する。この特性は、第1に、遺伝子治療において大きな可能性を有する非組み込み型ベクターであるAdの場合、実質的に発現を改善する。第2に、弱いが特異的なプロモーターから、有用な特異性を保持しながら、より大きい有用なレベルまで、発現を上昇させる。
【0249】
(FISH分析)
コピー数をマウスLtk細胞における31の16RNP−EGFPクローンにおいて決定した。トランスフェクションに用いられる少量のDNA(0.5〜1.0μg)に起因して、単一コピーのクローンのパーセンテージは非常に高かった(83%)。さらに、EGFP発現は、単一コピークローン内で2倍を超えて変化した。このことは、導入遺伝子が陽性の位置および陰性の位置の影響を受けやすいことを示す。それにもかかわらず、3つの単一コピークローンが動原体性の異種クロマチンに組み込まれた(図42)。このことは、この構築物がクロマチンを開き得ることを示す。クローンF1およびG6は、16RNP−EGFP導入遺伝子が、Robertsonian転移により開始される中部動原体染色体の動原体の1つに組み込まれていることを示し(図B、C)、一方、クローンI3において、組み込みは、局所的マウス末端動原体型染色体の動原体に生じた(図D)。
【0250】
(ベクターCET300およびCET301におけるエリスロポエチン(EPO)の発現)
(EPO発現ベクターCET300およびCET301の構築)
エリスロポエチン(EPO)コード配列を、ヒト胎児肝臓Quick−CloneTM cDNAライブラリー(Clontech,Palo Alto,US.)から、プライマーEP2(5’−CAGGTCGCTGAGGGAC−3’)およびプライマーEP4(5’−CTCGACGGGGTTCAGG−3’)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。得られる705bpの産物(オープンリーディングフレーム全体を含んだ)を、Eukaryotic TAクローニングキット(Invitrogen,Groningen,The Netherlands)を用いて、ベクターpCR3.1にサブクローニングし、ベクターpCR−EPOを作製した。EPO配列を両方の鎖上の自動DNA配列決定により確認した。EPOコード配列を含む790bpのNheI−EcoRVフラグメントを、pCR−EPOから切り出し、そしてベクターCET200およびCET201(それぞれ、順方向および逆方向に7.5kbのRNPフラグメントを含む)のNheI部位とPmeI部位との間にサブクローニングし、それぞれベクターCET300およびCET301を生成した。NheI−NotIフラグメントとしてpEGFP−N1からEGFPコード配列を切り出すこと、およびそれをEPOコード配列を含有するpCR−EPO由来のNheI−NotIフラグメントで置換することにより、コントロールベクターpCMV−EPOを生成した。
【0251】
(CHO細胞におけるエリスロポエチンの発現)
プラスミドであるCET300、CET301およびpCMV−EPOを制限エンドヌクレアーゼDraIIIを用いて直線化した。次いで、制限されたDNAをフェノール−クロロホルムでの抽出、続くエタノール沈殿により精製した。DNAを滅菌水に再懸濁し、そして等モル量のプラスミドをCHO細胞にエレクトロポレーションした。生存細胞を225cm3の培養フラスコにプレートし、そして、0.6mg/ml G418を含有する完全培地での24時間後の培地交換により、安定に形質転換した細胞を選択した。G418耐性コロニーが出現するまで(エレクトロポレーション後約10日)この培地中で細胞を増殖させた。次いで、フラスコから剥離し、そして細胞を1mlの完全培地を含有する6ウェルシャーレ中で106細胞/ウェルに播種した。48時間後、培地を除去し、そして、Quantikine(登録商標)IVD(登録商標)Human EPOイムノアッセイキット(R&D システム、Minneapolis,US)を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、培地中のエリスロポエチンのレベルを定量した。構築物CET300、CET301およびpCMV−EPOにより産生されたEPOのレベルは、それぞれ1780 U/ml、1040 U/mlおよび128 U/mlであった(図40)。従って、順方向および逆方向に7.5kbのRNPフラグメントを含有する構築物、CET300およびCET301は、上記の実験において、EPOの発現を駆動する強力な遍在性のCMVプロモーターを含むコントロールのプラスミドpCMV−EPOよりも、それぞれ約14倍および8倍高いレベルでEPOを産生した。
【0252】
(hnRNPA2の16kbのUCOEフラグメントを有するかまたは有さないEBVレポーター構築物でトランスフェクトしたHela細胞におけるGFP発現)
ハイグロマイシン選択で維持された細胞を用いる最初の実験で、RNP 16 UCOE含有構築物(p220.RNP 16)は、23日でEGFPの高レベルの均質の発現を得たが、一方、p220.EGFP(UCOEを有さない構築物)では、EGFP発現のより不均質なパターンが観察された。p220.EGFPでトランスフェクトしたプールにおけるEGFP発現は、徐々に失われ、一方p220.RNP16でトランスフェクトしたプールでは、発現は、160日間安定に維持された。
【0253】
3つの反復実験により、p220.RNP16でトランスフェクトしたプールにおける高レベルの均質なEGFP発現の同じパターンが実証された。これは、p220.EGFPでトランスフェクトしたプールにおいて再度観察された不均質な発現をともなった。最初の実験と同様に、EGFPの発現は、RNP16 UCOEで安定であり、そしてUCOEなしでは不安定であった。これは30〜40日までの劇的な発現の低下を伴った(図43)。
【0254】
ハイグロマイシン選択を27日目に除く、さらなる実験を行った。この結果は、選択がなくとも、EGFP発現が、RNP16UCOEの存在で安定であり、そしてUCOEがなければ不安定であることを示す(図44)。
【0255】
(実施例3)
(UCOEを含有するプラスミド)
図50は、生成された構築物、およびhnRNPA2内在性遺伝子座との比較に用いられるフラグメントを示す。
【0256】
図51は、一過的にトランスフェクトされたHeLa集団の蛍光中央値を用いるFACs分析のグラフを示す。この細胞を上記のように示されるCL22ペプチド凝縮レポータープラスミドを用いてトランスフェクトした。コントロールのCMV−GFPレポーター構築物の発現の持続期間が短期であり、そしてトランスフェクト後24〜48時間で劇的に短縮されることが見られ得る。
【0257】
コントロールと対照的に、UCOE含有プラスミド7.5CMV−Fは、トランスフェクション後少なくとも9日の長期間にわたって有意なGFP発現を示し続ける。反復した試験において、GFP発現は、トランスフェクション後14日で見られ得る。
【0258】
図52は、一過的にトランスフェクトしたHeLa細胞集団の例示的な低い倍率の視野を示す。このデータは、FACs分析と相関し、そして類似の時間経過後、細胞を可視的にする。トランスフェクション後24時間で、コントロールのCMV−GFPおよび7.5CMVの一過性の集団の両方において、多数のGFP陽性細胞が可視である(図52AおよびB)。実際、7.5CMVでトランスフェクトした集団よりも、コントロール集団において、GFP陽性細胞がより存在したことが24時間で見られ得る。これは、両方の場合においてインプットされるDNAの量が遺伝子量について補正されておらず、1トランスフェクションあたり有意により多いコピーのコントロールプラスミドを生じるという事実に起因する。しかし、トランスフェクション後6日に、なんらかの陽性蛍光細胞がCMV−EGFPコントロール集団に残存することは、たとえあったとしてもごくまれである(図52C)。対照的に、トランスフェクション6日後、7.5CMVでトランスフェクトしたHela細胞は、多数のGFP発現細胞を示し続けた(図52D)。実際、トランスフェクション後14日でさえ陽性に蛍光を発する細胞は容易に検出可能であった(データ示さず)。
【0259】
実験を通じて、総DNAを異なる時間点で回収し、直線化し、ゲル上で泳動し、そしてブロットした(「材料および方法」を参照のこと)。興味深いことに、GFPの発現がわずかであるか、または検出されない細胞のコントロール集団においてさえ、6日目に、プラスミドは、組み込まれていない状態で容易に検出され得た(データ示さず)。これは、CMV−GFPコントロールプラスミド内でみられる遺伝子発現の迅速な消失がプラスミド鋳型の慢性的消失に起因するのではなく、むしろ遺伝子発現のクロマチンシャットダウンの機構に起因することを示唆する。
【0260】
(エリスロポエチン発現ベクターを有するCHO細胞の一過的トランスフェクション)
プラスミドCET300、CET301およびCMV−EPOのスーパーコイル化形態を、標準的条件(975μF、250V)を用いてCHO細胞にエレクトロポレーションした。次いで、生存細胞を1mlの完全CHO培地を含有する6−ウェルシャーレに106細胞で播種した。次いで、この培地を24時間間隔で取り出し、1mlの新鮮培地で置換した。培地サンプルを9日間この様式で収集し、次いで、Quantikine(登録商標)IVD(登録商標)Human EPOイムノアッセイキット(R&D systems,Minneapolis,US)を用いるELISAにより、エリスロポエチンレベルを定量した。添付の図は、CET300、CET301およびCMV−EPOプラスミドでトランスフェクトした細胞によるエリスロポエチン発現の時間経過を示す。エリスロポエチン発現は、全ての細胞集団において48時間上昇し続けた。その後、CMV−EPOでトランスフェクトした細胞によるエリスロポエチン発現は、日毎に低下した。一方、CET300またはCET301でトランスフェクトした細胞によるEPO発現のレベルは、9日間を通じて上昇し続けた(図45)。
【0261】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1は、ヒトTBP遺伝子座を示す。A:本研究において使用したヒトTBP遺伝子を含むpCYPAC−2クローンの概略図。同定されていない遺伝子の位置を示し得るNotI制限部位およびSacII制限部位の位置が、印を付けて示される。
【図1B】 図1は、ヒトTBP遺伝子座を示す。B:5’TBP/C5領域にわたるCpG島の図示。CpGジヌクレオチド残基の密度は、メチル化されていない島が3.4kb長であり、そしてC5のイントロンI内のFspI部位と、TBPの第1のイントロン内のHindIII部位との間に及ぶことが、意味される。
【図1C】 図1は、ヒトTBP遺伝子座を示す。C:TBP/C5領域由来のクローンのさらなる概略図。この遺伝子の配置は、図1Aにおいて与えられるものと逆転している。C5遺伝子はまた、PSMB1遺伝子ともいわれることに注意すること。接近して連結する遺伝子の3側の位置を有する第6q染色体の末端小粒由来の257kbの連続する領域および関連する制限部位を示す(B,BssHII;N,NotI;S,SacII)。これらの指定された名称を有するPACクローンが示される。サブクローンであるpBL3−TPO−puroもまた、示される。PDCD2の第1のエキソン内のNotI部位と、末端小粒反復の開始との間の距離は、約150kbである。
【図2A】 図2は、TLN:3トランスジェニックマウスおよびTLN:8トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検DNAサンプルのサザンブロット分析を、(a)導入遺伝子の3’末端、(b)5’末端、(c)プロモーター、(d)TBP mRNA CAP部位からの−7.7kb、(e)TBP mRNA CAP部位からの−12kb、に位置する小DNAフラグメントでプローブした。TLN:3についての結果(a、b)は、両末端プローブを有する1つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において1つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル(c)は、プロモータープローブを用いて、2つのバンドが、この系統に存在する第2の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。(a)におけるTLN:8の分析は、6kbで導入遺伝子コンカテマーバンド、および7.8kbで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント2倍の強度であるので、これは、この系統について3のコピー数を示す。(b)におけるハイブリダイゼーションの欠失は、3つのコピー全ての5’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル(d)および(e)は、この導入遺伝子がTBP遺伝子に対して5’の12kbまでインタクトであるようであることを示す。
【図2B】 図2は、TLN:3トランスジェニックマウスおよびTLN:8トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検DNAサンプルのサザンブロット分析を、(a)導入遺伝子の3’末端、(b)5’末端、(c)プロモーター、(d)TBP mRNA CAP部位からの−7.7kb、(e)TBP mRNA CAP部位からの−12kb、に位置する小DNAフラグメントでプローブした。TLN:3についての結果(a、b)は、両末端プローブを有する1つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において1つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル(c)は、プロモータープローブを用いて、2つのバンドが、この系統に存在する第2の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。(a)におけるTLN:8の分析は、6kbで導入遺伝子コンカテマーバンド、および7.8kbで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント2倍の強度であるので、これは、この系統について3のコピー数を示す。(b)におけるハイブリダイゼーションの欠失は、3つのコピー全ての5’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル(d)および(e)は、この導入遺伝子がTBP遺伝子に対して5’の12kbまでインタクトであるようであることを示す。
【図2C】 図2は、TLN:3トランスジェニックマウスおよびTLN:8トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検DNAサンプルのサザンブロット分析を、(a)導入遺伝子の3’末端、(b)5’末端、(c)プロモーター、(d)TBP mRNA CAP部位からの−7.7kb、(e)TBP mRNA CAP部位からの−12kb、に位置する小DNAフラグメントでプローブした。TLN:3についての結果(a、b)は、両末端プローブを有する1つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において1つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル(c)は、プロモータープローブを用いて、2つのバンドが、この系統に存在する第2の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。(a)におけるTLN:8の分析は、6kbで導入遺伝子コンカテマーバンド、および7.8kbで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント2倍の強度であるので、これは、この系統について3のコピー数を示す。(b)におけるハイブリダイゼーションの欠失は、3つのコピー全ての5’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル(d)および(e)は、この導入遺伝子がTBP遺伝子に対して5’の12kbまでインタクトであるようであることを示す。
【図2D】 図2は、TLN:3トランスジェニックマウスおよびTLN:8トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検DNAサンプルのサザンブロット分析を、(a)導入遺伝子の3’末端、(b)5’末端、(c)プロモーター、(d)TBP mRNA CAP部位からの−7.7kb、(e)TBP mRNA CAP部位からの−12kb、に位置する小DNAフラグメントでプローブした。TLN:3についての結果(a、b)は、両末端プローブを有する1つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において1つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル(c)は、プロモータープローブを用いて、2つのバンドが、この系統に存在する第2の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。(a)におけるTLN:8の分析は、6kbで導入遺伝子コンカテマーバンド、および7.8kbで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント2倍の強度であるので、これは、この系統について3のコピー数を示す。(b)におけるハイブリダイゼーションの欠失は、3つのコピー全ての5’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル(d)および(e)は、この導入遺伝子がTBP遺伝子に対して5’の12kbまでインタクトであるようであることを示す。
【図2E】 図2は、TLN:3トランスジェニックマウスおよびTLN:8トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検DNAサンプルのサザンブロット分析を、(a)導入遺伝子の3’末端、(b)5’末端、(c)プロモーター、(d)TBP mRNA CAP部位からの−7.7kb、(e)TBP mRNA CAP部位からの−12kb、に位置する小DNAフラグメントでプローブした。TLN:3についての結果(a、b)は、両末端プローブを有する1つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において1つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル(c)は、プロモータープローブを用いて、2つのバンドが、この系統に存在する第2の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。(a)におけるTLN:8の分析は、6kbで導入遺伝子コンカテマーバンド、および7.8kbで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント2倍の強度であるので、これは、この系統について3のコピー数を示す。(b)におけるハイブリダイゼーションの欠失は、3つのコピー全ての5’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル(d)および(e)は、この導入遺伝子がTBP遺伝子に対して5’の12kbまでインタクトであるようであることを示す。
【図3A】 図3Aは、TLN:28マウスの分析を示す。TLN:28 DNAのサザンブロットを、導入遺伝子遺伝子座の極めて3’末端に位置するプローブにハイブリダイズした。複数のバンドが、このプローブにハイブリダイズすることを観察し、これは、複数の組み込み事象を示唆した。しかし、鋭いコンカテマーバンドが、頭−尾組み込み事象について予測された位置において見られる。このフラグメントと末端フラグメントとの間のシグナル強度の比較は、この系統において約4のコピー数を示唆した。
【図3B】 図3Bは、TLNマウス系統における導入遺伝子構成の要約を示す。TLN:3は、頭−尾配置において2つのコピーの導入遺伝子を含有する。欠失は、このアレイの5’末端および3’末端の両方で生じた。5’欠失は、このコピーにおいてC5遺伝子を完全に欠失する、TBPの5’隣接領域へ伸長する。3’末端において、欠失は、TBPの3’UTRへ伸長し、C5遺伝子インタクトを残す。従って、この動物は、C5遺伝子の単一コピーおよびTBP遺伝子の単一機能のコピーを有する。TLN:8は、3つのコピーの頭−尾配置を含む。各コピーは、極めて5’領域で欠失を有するようであり、この欠失の程度は現在知られていないが、ヒトC5 mRNAがこの系統において検出されるので、C5遺伝子まで伸長していない。TLN:28は、頭−尾立体配置において5コピーを含むが、観察される多くのさらなるフラグメントもまた存在し、このアレイがより複雑であり得ることを示す。
【図3C】 図3Cは、TLNマウス系統における導入遺伝子構成の、更新された概要を示す。この図は、各々のマウス系統におけるTLN導入遺伝子アレイの予測される構成を示す。機能的遺伝子のみが示され、そしてTLN:3マウスの3つの可能な配置のうち1つのみを示す。
【図4】 図4は、TLN:3マウスにおける欠失の分析を示す。一連のプローブを、TLN:3 DNAのサザンブロットにハイブリダイズした。最も遠い5’プローブのみが、単一バンドを与え、これは、欠失されたコピーがこの配列を含まなかったことを示す。欠失は、主要なTBP mRNA CAP部位、Ets因子結合部位およびDNase I高感受性部位の上流の領域にマッピングされる。全体の5’領域がこのコピーにおいて欠失されているか、または小さな内部欠失が生じているか否かは、現在のところ未知である。
【図5A】 図5は、ヒトおよびマウス由来のTBP mRNA配列とC5 mRNA配列との比較を示す。(a)nt.358〜708のヒトC5 mRNA配列(Gengank登録番号D00761)は、nt.355〜705のマウス配列(Genbank登録番号X80686)と有意な相同性を示す(垂直の棒によって示される)。ヒトmRNAおよびマウスmRNA両方のRT−PCR増幅は、両方の種由来の350bpのDNA分子の混合物を生成する。プライマーの位置(強調されている、5’プライマーC5RTF、3’プライマーC5R)は、多くのエキソンにわたり、ゲノムDNAの夾雑に由来するPCR増幅からの誤差を除去するように配置される。ヒト遺伝子またはマウス遺伝子のいずれかのイントロン/エキソン構造は制限されるが、プライマー間の距離は、それらが異なるエキソンにおいて配置されるような距離である。マウスPCR産物およびヒトPCR産物は、マウス配列のみを切断するPstIとともにインキュベーションすることによって区別され得る。C5RTFプライマーの放射性標識化は、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した場合に、173ntの生成物を与える。(b)エキソン5中のnt.901からエキソン7中のnt.1185のヒトTBP mRNA(Genbank登録番号M55654)および655位〜939位のマウスTBP mRNA配列(Genbank登録番号D01034)についての同様の分析。あるエキソン由来の最後のヌクレオチドおよびその次のエキソン由来の最初のヌクレオチドは、赤色で示される。使用されるプライマー(強調表示されている)は、5’TB−22および3’TB−14であった。示されるプライマー(四角で囲まれる)を有する両方の種由来の増幅された生成物のサイズは、284bpである。PCR産物の5’末端由来のBsp14071部位の63ntは、ヒト転写物およびマウス転写物を区別することを可能にする。放射性標識されたTB−14を有するポリアクリルアミドゲル上のヒト特異的産物のサイズは、221ntである。
【図5B】 図5は、ヒトおよびマウス由来のTBP mRNA配列とC5 mRNA配列との比較を示す。(a)nt.358〜708のヒトC5 mRNA配列(Gengank登録番号D00761)は、nt.355〜705のマウス配列(Genbank登録番号X80686)と有意な相同性を示す(垂直の棒によって示される)。ヒトmRNAおよびマウスmRNA両方のRT−PCR増幅は、両方の種由来の350bpのDNA分子の混合物を生成する。プライマーの位置(強調されている、5’プライマーC5RTF、3’プライマーC5R)は、多くのエキソンにわたり、ゲノムDNAの夾雑に由来するPCR増幅からの誤差を除去するように配置される。ヒト遺伝子またはマウス遺伝子のいずれかのイントロン/エキソン構造は制限されるが、プライマー間の距離は、それらが異なるエキソンにおいて配置されるような距離である。マウスPCR産物およびヒトPCR産物は、マウス配列のみを切断するPstIとともにインキュベーションすることによって区別され得る。C5RTFプライマーの放射性標識化は、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した場合に、173ntの生成物を与える。(b)エキソン5中のnt.901からエキソン7中のnt.1185のヒトTBP mRNA(Genbank登録番号M55654)および655位〜939位のマウスTBP mRNA配列(Genbank登録番号D01034)についての同様の分析。あるエキソン由来の最後のヌクレオチドおよびその次のエキソン由来の最初のヌクレオチドは、赤色で示される。使用されるプライマー(強調表示されている)は、5’TB−22および3’TB−14であった。示されるプライマー(四角で囲まれる)を有する両方の種由来の増幅された生成物のサイズは、284bpである。PCR産物の5’末端由来のBsp14071部位の63ntは、ヒト転写物およびマウス転写物を区別することを可能にする。放射性標識されたTB−14を有するポリアクリルアミドゲル上のヒト特異的産物のサイズは、221ntである。
【図6A】 図6は、TLNトランスジェニックマウスにおけるヒトTBP発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総RNA(1μg)を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、K562細胞由来のヒトRNA、および非トランスジェニックマウスRNAもまた、使用した。(a)TB22/14 RT−PCR産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。(b)種々の組織におけるTLN:3発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。(c)TLN:8についての同様の分析。(d)TLN:28の分析は、ヒトTBP mRNAのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。
【図6B】 図6は、TLNトランスジェニックマウスにおけるヒトTBP発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総RNA(1μg)を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、K562細胞由来のヒトRNA、および非トランスジェニックマウスRNAもまた、使用した。(a)TB22/14 RT−PCR産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。(b)種々の組織におけるTLN:3発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。(c)TLN:8についての同様の分析。(d)TLN:28の分析は、ヒトTBP mRNAのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。
【図6C】 図6は、TLNトランスジェニックマウスにおけるヒトTBP発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総RNA(1μg)を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、K562細胞由来のヒトRNA、および非トランスジェニックマウスRNAもまた、使用した。(a)TB22/14 RT−PCR産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。(b)種々の組織におけるTLN:3発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。(c)TLN:8についての同様の分析。(d)TLN:28の分析は、ヒトTBP mRNAのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。
【図6D】 図6は、TLNトランスジェニックマウスにおけるヒトTBP発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総RNA(1μg)を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、K562細胞由来のヒトRNA、および非トランスジェニックマウスRNAもまた、使用した。(a)TB22/14 RT−PCR産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。(b)種々の組織におけるTLN:3発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。(c)TLN:8についての同様の分析。(d)TLN:28の分析は、ヒトTBP mRNAのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。
【図7】 図7は、TLNトランスジェニックマウスにおけるヒトC5発現の発現分析を示す。分析は、図6におけるように実施した。上のパネル(a)は、C5RTF/C5R RT−PCR産物内のマウス特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置を示す。(b)TLNトランスジェニックの種々の組織におけるC5発現の分析が観察され、ヒト発現のレベルが、試験された全ての組織において生理学的である。
【図8】 図8は、TLNトランスジェニックマウスにおける(a)ヒトTBP遺伝子発現および(b)ヒトC5遺伝子発現の定量の概略を示す。
【図9】 図9は、pWE−TSNコスミドの概略図を示す。
【図10】 図10は、pWE−TSN L細胞クローンの導入遺伝子のコピー数決定を示す。マウスL細胞を、pWE−TSNコスミドでトランスフェクトし、DNAを、サザンブロットを生成するために単離および使用した。ブロットを、2つのコピーのマウスvav遺伝子座由来のDNAフラグメントおよびTBP遺伝子由来の−7kbに位置されるプローブを用いてプローブした。コピー数は、3コピーのTLN:8コントロールの比から決定し、そして各レーンの下部に示した。コピー数は、1〜60の範囲であった。
【図11】 図11は、マウスL細胞におけるpWE−TSNコスミドクローンの発現の概略を示す。
【図12】 図12は、ヒトTBP遺伝子座のDNase I高感受性部位分析を示す。TBP遺伝子周囲の40kb領域にわたって配置されるプローブを使用して、増加する濃度のDNase Iで消化されたK562核のサザンブロットをプローブした。PSMB1遺伝子およびTBP遺伝子のプロモーターにおいて2つの高感受性部位のみが見出された。DNase Iの濃度の増加は、すべての場合において左から右へ示される。
【図13A】 図13Aは、大きな160kbのpCYPAC由来クローンMA160を示すヒトhnRNP A2遺伝子座の概略図を示す。逆向きの矢印は、HP1H−γ遺伝子を示す。2つのSac II部位(これらは、メチル化を有さない島の存在を示し得る)は、四角で囲まれる。
【図13B】 図13Bは、MA160由来の60kbのAatIIサブフラグメントを示す。これらの両方は、トランスジェニックマウスの産生のために使用されている。
【図13C】 図13Cは、hnRNP A2遺伝子の5’末端に及ぶCpG島(赤棒)の程度を示す。CpG残基は、垂線で示される。数字は、hnRNP A2遺伝子(実線矢印)の転写開始部位(+1)に関係する。破線矢印は、分岐的に(divergently)転写されたHP1H−γ遺伝子の位置を示す。インタクトなhnRNP A2遺伝子を含む16kbのサブフラグメントもまた、示される。
【図14A】 図14は、ヒトおよびマウスhnRNP A2遺伝子発現の定量を示す。ヒト(K562)およびマウスRNAを、hnRNPA2遺伝子のエキソン12に対するプライマーを用いて逆転写した。続いて、サンプルを、PCRによって、エキソン10から12に及ぶプライマーHn9およびHn11によって増幅した。次いで、生成された産物を、各々の種に対して固有の切断部位を見出すためにランダムな酵素で消化した。マウスの産物は、ヒトの産物において存在しないHindIIIを含むことが見出され得る。
【図14B】 図14は、ヒトおよびマウスhnRNP A2遺伝子発現の定量を示す。ヒト(K562)およびマウスRNAを、hnRNPA2遺伝子のエキソン12に対するプライマーを用いて逆転写した。続いて、サンプルを、PCRによって、エキソン10から12に及ぶプライマーHn9およびHn11によって増幅した。次いで、生成された産物を、各々の種に対して固有の切断部位を見出すためにランダムな酵素で消化した。マウスの産物は、ヒトの産物において存在しないHindIIIを含むことが見出され得る。
【図15A】 図15は、Aa60フラグメント(図13B)を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスにおけるヒトhnRNP A2発現の分析を示す。種々の組織由来の総RNAは、図15において記載されるように分析された。RT−PCRの後、サンプルは、未処理(−)かまたはHindIIIを用いて消化(+)されるかのいずれかであり、次いで、ヒト(H)産物およびマウス(M)産物を分離するためにポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、PhosphorImager分析によって測定した。
【図15B】 図15は、Aa60フラグメント(図13B)を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスにおけるヒトhnRNP A2発現の分析を示す。種々の組織由来の総RNAは、図15において記載されるように分析された。RT−PCRの後、サンプルは、未処理(−)かまたはHindIIIを用いて消化(+)されるかのいずれかであり、次いで、ヒト(H)産物およびマウス(M)産物を分離するためにポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、PhosphorImager分析によって測定した。
【図15C】 図15は、Aa60フラグメント(図13B)を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスにおけるヒトhnRNP A2発現の分析を示す。種々の組織由来の総RNAは、図15において記載されるように分析された。RT−PCRの後、サンプルは、未処理(−)かまたはHindIIIを用いて消化(+)されるかのいずれかであり、次いで、ヒト(H)産物およびマウス(M)産物を分離するためにポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、PhosphorImager分析によって測定した。
【図16A】 図16は、160kbのNruIフラグメント(図13A)を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスによるヒトhnRNP A2発現の分析を示す。トランスジェニックマウスを解剖し、そして総RNAを組織から抽出した。このRNAを、Hn11によって逆転写し、次いで、プライマーHn9およびHn11を用いるPCRによって増幅させた。このHn9を、32Pで末端を放射性標識した。サンプルは、未処理(−)かまたはHindIIIを用いて消化(+)されるかのいずれかであり、次いで、ヒト(H)産物およびマウス(M)産物を分離するために、変性剤として8Mの尿素の存在下での5%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、PhosphorImager分析によって測定した。
【図16B】 図16は、160kbのNruIフラグメント(図13A)を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスによるヒトhnRNP A2発現の分析を示す。トランスジェニックマウスを解剖し、そして総RNAを組織から抽出した。このRNAを、Hn11によって逆転写し、次いで、プライマーHn9およびHn11を用いるPCRによって増幅させた。このHn9を、32Pで末端を放射性標識した。サンプルは、未処理(−)かまたはHindIIIを用いて消化(+)されるかのいずれかであり、次いで、ヒト(H)産物およびマウス(M)産物を分離するために、変性剤として8Mの尿素の存在下での5%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、PhosphorImager分析によって測定した。
【図17A】 図17は、hnRNP A2導入遺伝子発現の定量を示す。種々のマウス組織におけるヒトhnRNP A2導入遺伝子発現の分析を、PhosphorImagerによって定量した。レベルは、導入遺伝子のコピー数基準に対するマウスhnRNP A2発現の割合として示される。A:MA160を有するマウス(図15を参照のこと)。
【図17B】 図17は、hnRNP A2導入遺伝子発現の定量を示す。種々のマウス組織におけるヒトhnRNP A2導入遺伝子発現の分析を、PhosphorImagerによって定量した。レベルは、導入遺伝子のコピー数基準に対するマウスhnRNP A2発現の割合として示される。B:Aa60を有するマウス(図16を参照のこと)。
【図18】 図18は、ヒトhnRNP A2遺伝子座のDNase I高感受性部位マッピングを示す。K562細胞由来の核を、増加する濃度のDNase Iで消化した。続いて、これらの核由来のDNAを、AatIIおよびNcoI制限エンドヌクレアーゼの組合せで消化し、そしてサザンブロットした。次いで、このブロットを、hnRNP A2遺伝子のエキソンII由来の766bpのEcoRI/NcoIフラグメントでプローブした。3つの高感受性部位を、hnRNP A2転写開始部位の5’の−1.1、−0.7、および−0.1kb位に対応させて同定した。
【図19】 図19は、hnRNP A2遺伝子座とTBP遺伝子座との間の生物情報的分析および配列比較を示す。
【図20】 図20は、5’HindIII部位で始まるTBP遺伝子座のゲノムクローンのヌクレオチド配列(ヌクレオチド1〜9098)を示す。
【図21】 図21は、図22において示される5’HindIII部位で始まるhnRNP遺伝子座のゲノムクローンのヌクレオチド配列(ヌクレオチド1〜15071)を示す。
【図22】 図22は、GFPレポーター遺伝子およびNeoRレポーター遺伝子の両方を使用して設計された、RNPとHP1H−γとの間の二重(dual)プロモーター領域に配置されるサブフラグメントを含む発現ベクターを示す。これらのベクターは、以下である:GFP/Neo発現を駆動するRNPプロモーターを有するコントロールベクター(RNP);RNPプロモーター領域の上流の5.5kbのフラグメントおよびRNPプロモーターを含むベクター(5.5RNP);スプライスアクセプターストラテジーを使用して構築されたベクターであって、ここで、このスプライスアクセプター/分枝コンセンサス配列(RNP遺伝子のエキソン2に由来する)を、GFP遺伝子の前にクローニングし、その結果、GFPの上流のエキソン1/イントロン1の一部を生じる、ベクター(7.5RNP、GFP遺伝子の前に約7.5kbのRNP遺伝子を保有する);およびRNPプロモーター領域の上流の1.5kbのフラグメントおよびRNPプロモーターを含むベクター(1.5RNP)。
【図23】 図23は、GFPレポーター遺伝子およびNeoRレポーター遺伝子の両方を使用して設計された、RNPとHP1H−γとの間の二重(dual)プロモーター領域に配置されるサブフラグメントを含む発現ベクターを示す。これらのベクターは、異種CMVプロモーターを含む。これらのベクターは、以下である:(a)内部リボソーム進入部位配列を用いてGFP/Neo発現を駆動するCMVプロモーターを有するコントロールベクター(CMV−EGFP−IRES)、ならびに(b)内部リボソーム進入部位配列を有さず、そしてNeoRレポーター遺伝子の上流のSV40プロモーターを用いてGFP/Neo発現を駆動するCMVプロモーターを有するコントロールベクター(CMV−EGFP);内部リボソーム進入部位配列を用いてGFP/Neo発現を駆動する、RNPプロモーター領域の上流の5.5kbフラグメントおよびCMVプロモーターを含むベクター(5.5CMV);RNPプロモーターおよびHP1H−γプロモーター、ならびにNeoRレポーター遺伝子の上流のSV50プロモーターを用いてGFP/Neo発現を駆動するCMVプロモーターを包含する4.0kb配列を含むベクター(4.0CMV);ならびに、エキソン1およびイントロン1の一部を含むRNP遺伝子、ならびにNeoRレポーター遺伝子の上流のSV40プロモーターを用いてGFP−Neo発現を駆動するCMVプロモーターの7.5kbの配列を含むベクター(7.5CMV)。
【図24】 図24は、RNP構築物およびCMV構築物をCHO細胞へトランスフェクトすることによって産生されるG418Rコロニーの数を示す。
【図25】 図25は、エレメントの上流を有するか、または有さない、RNP構築物およびCMV構築物を用いてトランスフェクトしたG418選択CHOコロニーにおけるGFP発現の比較を示す。
【図26】 図26は、40日の期間にわたって、エレメントの上流を有するか、または有さない、RNP構築物を用いてトランスフェクトしたG418選択CHOクローンにおけるGFP蛍光レベルの平均中央値を示す。
【図27】 図27は、G418の非存在下で培養された後、103日の期間にわたるCMV−GFPプールのGFP発現のFACSプロフィールを示す。
【図28】 図28は、G418の非存在下で培養された後、103日の期間にわたる5.5CMV−GFPプールのGFP発現のFACSプロフィールを示す。
【図29】 図29は、68日間の時間経過にわたって減少する、GFPを発現するトランスフェクト細胞の割合を示す。
【図30】 図30は、66日間の時間経過にわたってCMV構築物でトランスフェクトされたG418選択細胞の蛍光の中央値を示す。
【図31】 図31は、66日間の時間経過にわたってCMV構築物でトランスフェクトされた陽性G418選択細胞の割合を示す。
【図32】 図32は、トランスフェクション後13日目においてCMV構築物でトランスフェクトされたG418選択細胞の蛍光の中央値を示す。
【図33】 図33は、27日間の時間経過にわたってCMV構築物でトランスフェクトされた陽性G418選択細胞の割合を示す。
【図34】 図34は、種々のCMV構築物を用いるCHO細胞のトランスフェクション後のコロニー数を示す。
【図35A】 図35は、ヒトPSMB1、PDCD2およびTBP mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するTBPクラスター内の遺伝子由来のmRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngにおいて示される)を用いて負荷される。ドットブロットを、(B)PSMB1 cDNA、(C)部分的PDCD2遺伝子を含む4.7kbのゲノムフラグメント(MA445)および(D)TBP cDNAを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ(E)は、規格化プロセスが首尾よく、そしてRNAがインタクトであることを実証した。
【図35B】 図35は、ヒトPSMB1、PDCD2およびTBP mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するTBPクラスター内の遺伝子由来のmRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngにおいて示される)を用いて負荷される。ドットブロットを、(B)PSMB1 cDNA、(C)部分的PDCD2遺伝子を含む4.7kbのゲノムフラグメント(MA445)および(D)TBP cDNAを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ(E)は、規格化プロセスが首尾よく、そしてRNAがインタクトであることを実証した。
【図35C】 図35は、ヒトPSMB1、PDCD2およびTBP mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するTBPクラスター内の遺伝子由来のmRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngにおいて示される)を用いて負荷される。ドットブロットを、(B)PSMB1 cDNA、(C)部分的PDCD2遺伝子を含む4.7kbのゲノムフラグメント(MA445)および(D)TBP cDNAを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ(E)は、規格化プロセスが首尾よく、そしてRNAがインタクトであることを実証した。
【図35D】 図35は、ヒトPSMB1、PDCD2およびTBP mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するTBPクラスター内の遺伝子由来のmRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngにおいて示される)を用いて負荷される。ドットブロットを、(B)PSMB1 cDNA、(C)部分的PDCD2遺伝子を含む4.7kbのゲノムフラグメント(MA445)および(D)TBP cDNAを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ(E)は、規格化プロセスが首尾よく、そしてRNAがインタクトであることを実証した。
【図35E】 図35は、ヒトPSMB1、PDCD2およびTBP mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するTBPクラスター内の遺伝子由来のmRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngにおいて示される)を用いて負荷される。ドットブロットを、(B)PSMB1 cDNA、(C)部分的PDCD2遺伝子を含む4.7kbのゲノムフラグメント(MA445)および(D)TBP cDNAを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ(E)は、規格化プロセスが首尾よく、そしてRNAがインタクトであることを実証した。
【図36A】 図36は、pWE−TSNクローンに対する長期間の培養の効果を示す。多くのpWE−TSNマウスL細胞クローンを、60世代について連続的に増殖させた。凍結/融解については、RNAを収集し、そして次のサイクルのために細胞を凍結させる前に、クローンを少なくとも2日間液体窒素中で保存し、融解し、そして1週間培養した。実験を、培地中でG418を存在させて、および存在させずに、実施した。TBP発現を、本明細書に記載されるように、TB14オリゴヌクレオチドおよびヒト特異的制限エンドヌクレアーゼ(+によって示されるように)を使用することによってアッセイした。全てのサンプルを、酵素を用いずに分析し、そして同定した。代表的な(−)サンプルもまた示す。
【図36B】 図36は、pWE−TSNクローンに対する長期間の培養の効果を示す。多くのpWE−TSNマウスL細胞クローンを、60世代について連続的に増殖させた。凍結/融解については、RNAを収集し、そして次のサイクルのために細胞を凍結させる前に、クローンを少なくとも2日間液体窒素中で保存し、融解し、そして1週間培養した。実験を、培地中でG418を存在させて、および存在させずに、実施した。TBP発現を、本明細書に記載されるように、TB14オリゴヌクレオチドおよびヒト特異的制限エンドヌクレアーゼ(+によって示されるように)を使用することによってアッセイした。全てのサンプルを、酵素を用いずに分析し、そして同定した。代表的な(−)サンプルもまた示す。
【図37】 図37は、pBL3−TPO−puroクローンにおけるTBP遺伝子発現の分析を示す。TBP遺伝子発現についての分析を、本明細書に記載されるように、pBL3−TPO−puro構築物を用いてトランスフェクトされたマウスL細胞から単離された総RNAとともにTB14プライマーを使用して実施した。(+)上のレーンは、PCR産物がヒト特異的酵素で消化されたことを示し、(−)は、消化されていない(コントロール)ことを示す。ヒト(K562)およびマウス(非トランスジェニック肺)RNAコントロールもまた、RNAなしのコントロール(dH2O)と同様に示される。矢印は、切断されていない(ヒトおよびマウスまたはマウス)およびヒト特異的産物の位置を示す。発現の値を、コピー数について補正し、その結果、100%の発現は、導入遺伝子の単一コピーが2つの内在性マウス遺伝子の1つと同じレベルで発現していることを意味する。全コピー数は1〜2で変化し、そしてこれは各棒の上に示される。
【図38A】 図38は、(B)ヒトHP1γ mRNA発現および(C)ヒトhnRNP A2 mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するhnRNP A2クラスター内からのHP1γ mRNAおよびhnRNP A2 mRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngで示される)を用いて負荷される。ブロットを、(B)HP1γ cDNA配列由来の717ntのPCRフラグメントを用いて、および(C)hnRNP A2の発現について、PCRプライマー5’GCTGAAGCGACTGAGTCCATG3’および5’CCAATCCATTGACAAAATGGGC3’を使用することによって生成された1237ntのPCRプローブを用いてハイブリダイズした。
【図38B】 図38は、(B)ヒトHP1γ mRNA発現および(C)ヒトhnRNP A2 mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するhnRNP A2クラスター内からのHP1γ mRNAおよびhnRNP A2 mRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngで示される)を用いて負荷される。ブロットを、(B)HP1γ cDNA配列由来の717ntのPCRフラグメントを用いて、および(C)hnRNP A2の発現について、PCRプライマー5’GCTGAAGCGACTGAGTCCATG3’および5’CCAATCCATTGACAAAATGGGC3’を使用することによって生成された1237ntのPCRプローブを用いてハイブリダイズした。
【図38C】 図38は、(B)ヒトHP1γ mRNA発現および(C)ヒトhnRNP A2 mRNAのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のmRNAドットブロットを使用するhnRNP A2クラスター内からのHP1γ mRNAおよびhnRNP A2 mRNAの組織分布:各セグメントは、所定の量のポリ(A)+RNA(A,各組織の下にngで示される)を用いて負荷される。ブロットを、(B)HP1γ cDNA配列由来の717ntのPCRフラグメントを用いて、および(C)hnRNP A2の発現について、PCRプライマー5’GCTGAAGCGACTGAGTCCATG3’および5’CCAATCCATTGACAAAATGGGC3’を使用することによって生成された1237ntのPCRプローブを用いてハイブリダイズした。
【図39】 図39は、マウスLtk細胞へ組み込まれたTBP導入遺伝子のFISH分析の結果を示し、これは、動原体のヘテロクロマチン上での組み込みを実証する。(A)は、非動原体性組み込み、(B)および(C)は、2つの別々の動原体性組み込みを示す。
【図40】 図40は、RNPとHP1H−γとの間の二重プロモーター領域に配置される7.5kbのサブフラグメント、CMVプロモーターおよびEPOをコードする遺伝子を含むCET300構築物およびCET301構築物を用いて安定にトランスフェクトされたCHO細胞プールにおけるエリトロポイエチン(EPO)発現を示す。
【図41】 図41は、16RNP−EGFPを用いてトランスフェクトされたマウスLtk細胞クローンの蛍光EGFP発現およびコピー数に対するその関連を示す。クローンF1、G6およびI3は、マウス動原体のへテロクロマチンと共存した16RNP−EGFPを有する。
【図42A】 図42は、16RNP−EGFPを用いてトランスフェクトされたマウスLtk細胞のFISH分析を示す。(A)は、非動原体性組み込みを有するクローンH4を示す。(B、C、およびD)は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンG6、F1およびI3を示す。tは、16RNP−EGFPであり、そしてcは、マウス動原体である。
【図42B】 図42は、16RNP−EGFPを用いてトランスフェクトされたマウスLtk細胞のFISH分析を示す。(A)は、非動原体性組み込みを有するクローンH4を示す。(B、C、およびD)は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンG6、F1およびI3を示す。tは、16RNP−EGFPであり、そしてcは、マウス動原体である。
【図42C】 図42は、16RNP−EGFPを用いてトランスフェクトされたマウスLtk細胞のFISH分析を示す。(A)は、非動原体性組み込みを有するクローンH4を示す。(B、C、およびD)は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンG6、F1およびI3を示す。tは、16RNP−EGFPであり、そしてcは、マウス動原体である。
【図42D】 図42は、16RNP−EGFPを用いてトランスフェクトされたマウスLtk細胞のFISH分析を示す。(A)は、非動原体性組み込みを有するクローンH4を示す。(B、C、およびD)は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンG6、F1およびI3を示す。tは、16RNP−EGFPであり、そしてcは、マウス動原体である。
【図43】 図43は、41日間の期間にわたってハイグロマイシンBの存在下で培養された16RNPを含むEBVを用いてトランスフェクトされたHela細胞のEGFP発現のFACSプロフィールを示す。
【図44】 図44は、全体にわたってハイグロマイシンBの存在下で培養される場合、およびハイグロマイシンBが27日目に除去される場合の、16RNPを含むEBVを用いてトランスフェクトされたHela細胞のEGFP発現のFACSプロフィールを示す。
【図45】 図45は、CET300、CET301およびCMV−EPOを用いて一過的にトランスフェクトされた細胞におけるEPO産生を示す。
【図46】 図46は、HepG2(AFP+ve)細胞およびKLN205(AFP−ve)細胞における種々のAFP構築物についてのNTR発現を検出するELISAの結果を示す。
【図47】 図47は、CTL102/CTL208を用いる腫瘍内注射後のHepG2腫瘍および宿主マウス肝臓におけるNTR発現を示す。
【図48】 図48は、CTL102/CTL208を用いる腫瘍内注射およびCB1954投与後のHepG2腫瘍の増殖阻害を示す。
【図49】 図49は、ベクターCET200およびCET210の構造の概略図である。
【図50】 図50は、hnRNP A2内在性ゲノム遺伝子座に対する比較において生成される構築物および使用されるフラグメントを示す。
【図51】 図51は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたHeLa集団の蛍光の中央値を用いるFACS分析のグラフを示す。
【図52A】 図52は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたHeLa細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。
【図52B】 図52は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたHeLa細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。
【図52C】 図52は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたHeLa細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。
【図52D】 図52は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたHeLa細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。
Claims (28)
- 単離されたポリヌクレオチドであって、以下:
a.メチル化していないCpG島であって、該メチル化していないCpG島は、
(i)各々12kbの5’隣接配列および3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のTATA結合タンパク質遺伝子にわたる44kbのCpG島、またはその1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント;
(ii)1kbの5’隣接配列および5kbの3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のTATA結合タンパク質遺伝子にわたる25kbのCpG島、またはその1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント;
(iii)30kbの5’隣接配列および20kbの3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のhnRNP A2遺伝子にわたる60kbのCpG島、またはその1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント;および
(iv)5kbの5’隣接配列および1.5kbの3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のhnRNP A2遺伝子にわたる16kbのCpG島、またはその1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント
からなる群より選択される、メチル化していないCpG島;
b.発現可能な核酸であって、該発現可能な核酸は該メチル化していないCpG島に作動可能に連結され、そしてさらに該発現可能な核酸は、該メチル化していないCpG島に天然では連結されていない、発現可能な核酸;および
c.該発現可能な核酸に作動可能に連結されたプロモーターであって、該プロモーターは、該メチル化していないCpG島に天然では作動可能に連結されていない、プロモーター
を含むポリヌクレオチドであって、ここで該発現可能な核酸の2つ以上の組織型における再現可能な転写の活性化が該メチル化していないCpG島によって達成されるものである、ポリヌクレオチド。 - 前記メチル化していないCpG島が、少なくとも1つの内在性プロモーターを含む、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記メチル化していないCpG島が、多岐に転写する内在性二重プロモーターを含む、請求項2に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記メチル化していないCpG島が、多岐に転写する内在性二方向性プロモーターを含む、請求項2に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記メチル化していないCpG島が、1つまたは複数の転写開始部位にまたがって300bpより長く広がっている、請求項1〜4のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記メチル化していないCpG島が、500bpより長く広がっている、請求項1〜4のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記メチル化していないCpG島が、
(a)各々12kbの5’隣接配列および3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のTATA結合タンパク質遺伝子にわたる44kbのCpG島、または
(b)その1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント
である、請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 前記メチル化していないCpG島が、
(a)1kbの5’隣接配列および5kbの3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のTATA結合タンパク質遺伝子にわたる25kbのCpG島、または
(b)その1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント
である、請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドであって、以下のヌクレオチド配列:
- 前記メチル化していないCpG島が、
(a)30kbの5’隣接配列および20kbの3’隣接配列を有するヒトゲノム由来のhnRNP A2遺伝子にわたる60kbのCpG島、または
(b)その1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント
である、請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 前記メチル化していないCpG島が、
(a)5kbの5’隣接配列および1.5kbの3’隣接配列を有するヒトゲノム由来hnRNP A2遺伝子にわたる16kbのCpG島、または
(b)その1もしくは数個の核酸の欠失を有するDNAフラグメント
である、請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドであって、以下のヌクレオチド配列:
- 請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、以下の配列
- 請求項1〜13のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 発現可能な核酸がクローン化され得る多重クローニング部位をさらに含む、請求項14に記載のベクター。
- 前記多重クローニング部位に作動可能に連結されたポリアデニル化部位をさらに含む、請求項15に記載のベクター。
- CMVプロモーターを含む、請求項14〜16のいずれかに記載のベクター。
- 前記ベクターがエピソームベクターである、請求項14〜17のいずれかに記載のベクター。
- 前記ベクターが組み込み型ベクターである、請求項14〜17のいずれかに記載のベクター。
- 前記ベクターがプラスミドである、請求項14〜17のいずれかに記載のベクター。
- 前記発現可能な核酸が治療用核酸である、請求項14〜20のいずれかに記載のベクター。
- 請求項14〜21のいずれかに記載のベクターであって、以下の配列:
- 請求項14〜22のいずれかに記載のベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
- 遺伝子治療における使用のための、請求項1〜13のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 遺伝子治療における使用のための組成物の製造における、請求項1〜13のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
- 有効用量の請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- 薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- 所望の遺伝子産物を得るための細胞培養系における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
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