본 발명은 염색질을 개방시키거나 염색질을 개방 상태로 유지하여 2 이상의 상이한 조직 타입의 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진하는 UCOE를 포함하는, 위치 조절 영역으로부터 유래하지 않은 폴리뉴클레오티드를 제공하고자 한다.
본 발명은 염색질을 개방시키거나 염색질을 개방 상태로 유지하여 2 이상의 상이한 조직 타입의 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진하는 UCOE를 포함하는, 위치 조절 영역으로부터 유래하지 않은 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
"위치 조절 영역" (Locus control region: LCR)은 진핵 숙주 세포의 조직 특 이적 위치로부터 수득된 것으로서, 목적 유전자에 연결되고 숙주 세포의 염색체에 통합될 때 목적 유전자에 대해 조직 특이적이고, 통합 부위 독립적인, 복제 횟수(copy number) 의존적 발현을 부여하는 유전자 성분으로 정의된다.
LCR에서 유래한 폴리뉴클레오티드는 LCR의 일부 또는 일부들일 수 있다. 바람직하게는, LCR에서 유래한 폴리뉴클레오티드는 염색질을 개방하는 기능을 수행하는 LCR의 일부이다. LCR은 프로모터와 결합하지 않은 1종 이상의 DNaseI 과민성 (HS) 부위와 결합하고, UCOE는 프로모터와 결합하지 않은 HS 부위를 포함하지 않는 것이 바람직하다. HS 부위는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 본원에서 설명되는 바와 같은 표준 기술을 기초로 하여 확인될 수 있다.
용어 "재현성 있는 발현(reproducible expression)을 촉진하는"은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사의 재현성 있는 활성화를 촉진할 수 있는 UCOE의 능력을 나타낸다. 이 과정은 전사 인자에 접근가능한 유전자 (또는 적어도 전사 인자 결합 부위)를 둘러싸는 염색질의 영역을 제공하는 UCOE의 능력을 포함하는 것으로 믿어진다. 재현성 있는 발현은 바람직하게는 발현가능한 유전자에 작동가능하게 연결될 때 폴리뉴클레오티드가 그의 염색질 환경에 무관하게 및 바람직하게는 세포 조직 타입과 무관하게 작동가능하게 연결된 유전자의 발현과 실질적으로 동일한 수준을 제공하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 동일한 발현 수준은 유전자 복제 당 기준으로(per-gene-copy basis) 48% 이하, 더 바람직하게는 40% 이하, 가장 바람직하게는 25% 이하의 평균값으로부터의 표준 편차를 갖는 발현 수준을 의미한다. 별법으로, 실질적으로 동일한 발현 수준은 바람직하게는 발현 수준 이 유전자 복제 기준으로 10배 이하, 더 바람직하게는 5배 이하, 가장 바람직하게는 3배 이하로 변하는 것을 의미한다. 발현 수준은 바람직하게는 트랜스제닉 동물에서 측정된 발현 수준이다. UCOE가 단일 또는 낮은 (3 이하) 복제수로 존재할 때 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진하는 것이 특히 바람직하다.
본원에서 사용되는 "연결된(linked)"은 유전자와 UCOE가 동일 핵산 분자 상에서 시스 관계로 존재하는 시스-연결(cis-linkage)을 나타낸다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 유전자가 UCOE에 의해 촉진된 발현을 받게되는 시스-연결을 나타낸다.
개방 염색질 또는 개방 상태의 염색질은 탈응축 상태의 염색질을 나타내며 또한 진핵염색질 (euchromatin)으로 불린다. 응축 염색질은 또한 헤테로염색질으로 불린다. 상기 지적한 바와 같이, 밀폐 (응축) 상태의 염색질은 전사 침묵한다. 개방 (탈응축) 상태의 염색질은 전사 가능하다. 개방 염색질 구조의 확립은 DNase I 민감성, DNA 하이포메틸화 및 히스톤 하이퍼아세틸화에 의해 특징지워진다. 개방 염색질을 확인하는 표준 방법은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있고 문헌[Wu, 1989, Meth. Enzymol., 170, 269-289; Ciane-Robinson 등, 1997, Methods, 12, 48-56; Rein 등, 1998, N.A.R., 26, 2255-2264]에 기재되어 있다.
용어 "2종 이상의 조직 타입의 세포"는 다음: 심장, 신장, 폐, 간, 장, 골격근, 생식선, 비장, 뇌 및 흉선 조직의 상이한 세포형 중 2종 이상, 바람직하게는 4종 이상, 더 바람직하게는 모두의 세포를 나타낸다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오 티드는 재현성 있는 발현을 조직 비특이적으로, 즉, 조직 특이성 없이 촉진시킨다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 활성 유전자 발현이 일어나는 조직 타입의 50%이상, 더 바람직하게는 모두에서 재현성 있는 발현을 촉진하는 것이 더욱 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생리학적인 수준에서 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진한다. 생리학적인 수준은 세포, 세포군 또는 환자에서의 발현이 생리학적인 효과를 나타내는 유전자 발현 수준을 의미한다. 바람직하게는, 생리학적인 수준은 원하는 결과에 따라 최적 생리학적인 수준이다. 바람직하게는, 생리학적인 수준은 균등한 내재 유전자의 발현 수준과 동일하다.
본 발명의 UCOE는 염색질을 개방시키거나 염색질을 개방 상태로 유지시키고, LCR로부터 유래되지 않은 것이라면 2종 이상의 상이한 조직 타입의 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진하는 임의의 성분일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, UCOE는 연장된 메틸화-없는(메틸화되지 않은: methylation-free) CpG-아일랜드 (island)를 포함한다. CpG-아일랜드는 벌크 DNA에서 평균 40%인 것에 비해 약 60%의 평균 GC 함량을 갖는다. 당업계의 숙련인은 C 및 G 서열에 특이적인 제한 효소를 사용하는 것과 같은 표준 기술을 이용하여 CpG-아일랜드를 쉽게 확인할 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Larsen 등 1992; 및 Kolsto 등, 1986]에 기재되어 있다. 연장된 메틸화되지 않은 CpG 아일랜드는 하나 이상의 전사 개시 부위를 둘러싼 영역을 거쳐(across) 연장하고(하거나) 300bp를 초과하여, 바람직하게는 500bp를 초과하여 연장된 메틸화되지 않은 CpG 아일랜드이 다.
바람직하게는, UCOE는 그의 원래의 내재 위치에서 도처에서 발현하는 유전자와 연합되어 있는, 더 바람직하게는 그에 인접하게 위치하는 서열에서 유래된다. UCOE가 적어도 하나의 전사 인자 결합 부위를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
전사 인자 결합 부위는 프로모터 서열과 인헨서 서열을 포함한다. 바람직하게는 UCOE는 다르게(divergently) 전사되는 이중(dual) 또는 2방향성 프로모터를 포함한다. 이중 프로모터는 본원에서 프로모터 중 하나가 다른 프로모터(들)에 영향을 끼치지 않으면서 활성화 또는 불활성화(deactivation)될 수 있도록 서로 독립적인 2개 이상의 프로모터로서 정의한다. 2방향성 프로모터는 본원에서 양 방향으로 프로모터로서 작용할 수 있지만, 한 방향으로만 활성화되거나 불활성화될 수 없는 영역으로 정의한다. 바람직하게는, UCOE는 이중 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, UCOE는 다르게 전사하고 (즉, 반대 방향으로의 전사를 이끌 수 있고), 그들의 원래의 내재 위치에서 도처에서 발현하는 유전자와 연합되어 있는 이중 또는 2방향성 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, UCOE는 다르게 전사되는 이중 프로모터를 포함한다. UCOE는 이종(heterologous) 프로모터, 즉, 원래 UCOE의 다른 서열과 연관(associate)되어 있지 않은 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들면, CMV 프로모터를 hnRNP A2 및 HP1H-γ 프로모터와 연관된 UCOE와 함께 사용하는 것이 가능하며, 이를 이하에서 논의한다. 따라서, 본 발명은 또한 하나 이상의 이종 프로모터를 포함하는 UCOE를 제공한다. 이종 프로모터(들)은 UCOE의 하나 이상의 내인성 프로모터(endogenous promoter)를 교체할 수 있거나, UCOE의 하나 이상의 내인 성 프로모터 외에 추가로 사용될 수 있다. 이종 프로모터는 도처에 있는 프로모터 및 종양-특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터를 포함하는 임의의 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 이종 프로모터는 실질적으로 도처에 있는 프로모터이고, 가장 바람직하게는 CMV 프로모터이다.
바람직하게는, UCOE는 문헌[Lavia 등, EMBO J., 6, 2773-2779 (1987)]에 설명된 바와 같이 HpaII 소단편(HTF) 아일랜드 HTF9의 2방향성 프로모터를 포함하는 3725bp EcoRI 단편이 아니다.
바람직하게는, UCOE는 Surfeit 좌(locus) [Williams 등, Mol. Cell. Biol., 13, 4784-4792, 1993]의 쥐 SURF1 및 SURF2 유전자들 사이에 위치하는 800bp BamHI 게놈 단편 내에 위치하는 149bp MES-1 성분이 아니다. 바람직하게는, UCOE는 Surfeit 좌 [Williams 등, Mol. Cell. Biol., 13, 4784-4792, 1993]의 SURF5 및 SURF3 유전자들 사이에 위치하는 2방향성 프로모터가 아니다. UCOE가 문헌[Duhig 등, Genomics, 52, 72-78 (1998)]에 정의된 바와 같이 크로모좀 9q34.2 상에 위치하는 60kb에 걸친 인간 surfeit 유전자 좌, 또는 상응하는 쥐의 좌 [Huxley 등, Mol. Cell. Biol., 10, 605-614, 1990]로부터 유래되지 않는 것이 더욱 바람직하다.
바람직하게는, UCOE는 GenBank 데이타베이스 (수탁 번호 L12533)에 기탁된 1350bp SmaI 단편에 포함된 새의 GPAT 및 AIRC 유전자들 사이에 위치하는 2방향성 프로모터 영역 [Gavalas 등, Mol. Cell. Biol., 13, 4784-4792, 1993], 또는 상응하는 인간 균등물 [Brayton 등, J. Biol. Chem., 269, 5313-5321, 1994]이 아니다.
바람직하게는, UCOE는 래트 미토콘드리아 차페로닌(chaperonin) 60 및 차페로닌 10 유전자들을 포함하는 13894bp 게놈 DNA 단편 (GenBank 수탁 번호 U68562)이 아니다. UCOE가 래트 미토콘드리아 차페로닌 60 및 차페로닌 10 유전자들 사이의 유전자내 영역에 위치하는 2방향성 프로모터를 포함하는 581bp 단편이 아닌 것이 또한 바람직하다 [Ryan 등, Gene, 196, 9-17, 1997].
본 발명의 바람직한 실시태양에서, UCOE는 인간 TATA 결합 단백질(TBP) 유전자와 12kb의 각 5' 및 3' 측면 서열(flanking sequence)들에 걸친(spanning) 44kb DNA 단편, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 30kb 5' 측면 서열과 20 kb 3' 측면 서열을 갖는 인간 hnRNP A2 유전자에 걸치는 60kb DNA 단편, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편이다. 다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 뉴클레오티드 1 내지 6264 사이의 도 21의 서열, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 포함한다. 이 서열은 hnRNP A2 프로모터 (뉴클레오티드 5636 내지 6264)와, HP1H-γ 프로모터를 포함하는 5.5kb 5' 측면 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 1kb 5' 및 5kb 3' 측면 서열들을 갖는 인간 TBP 유전자에 걸치는 25kb DNA 단편, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편이다.
다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 5kb 5' 및 1.5kb 3' 측면 서열들을 갖는 인간 hnRNP A2 유전자에 걸치는 16kb DNA 서열, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편이다.
다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 뉴클레오티드 1 내지 5636 사이의 도 21의 서열 (hnRNP A2 프로모터의 5.5kb 5' 측면 서열)과 CMV 프로모터, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 포함한다.
다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 뉴클레오티드 4102 내지 8286 사이의 도 21의 서열, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 포함한다. 이 서열은 hnRNP A2와 HP1H-γ 프로모터들을 모두 포함한다.
다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 뉴클레오티드 1 내지 7627 사이의 도 21의 서열, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 포함한다. 이 서열은 hnRNP A2와 HP1H-γ 프로모터들 모두와 hnRNP A2 유전자의 엑손 1을 포함한다.
다른 바람직한 실시태양에서, UCOE는 뉴클레오티드 1 내지 9127 사이의 도 21의 서열, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 포함한다. 이 서열은 hnRNP A2와 HP1H-γ 프로모터들 모두, 및 hnRNP A2 유전자의 엑손 2까지(이를 포함하지는 않음)의 hnRNP A2 프로모터의 3' 측면 서열을 포함한다.
본 발명의 UCOE가 도 20 또는 도 21의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 상동체 또는 단편을 갖는 것이 또한 바람직하다.
본원에서 사용하는 용어 "기능적 상동체 또는 단편"은 염색질을 개방시키거나 염색질을 개방 상태로 유지시키고 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진하는 상동체 또는 단편을 의미한다. 바람직하게는, 상동체는 확인된 UCOE들에 상응하는 종 상동체이거나, 다른 도처에서 발현하는 유전자와 연관된 상동체이다. 다른 UCOE들의 확인 또는 합성을 가능하게 하는 보존 서열 모티 프(motif)를 확인하기 위해, UCOE들 사이에서 서열 비교를 할 수 있다. 이러한 서열 비교를 수행하기에 적합한 소프트웨어 패키지는 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 서열 비교를 수행하기에 바람직한 소프트웨어 패키지는 PCGENE (Intelligenetics, Inc. 미국)이다. 기능적 단편은 공지 UCOE들의 단편들을 방법적으로 생산하고 기능을 시험함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 보존 서열 모티프를 포함하는 단편은 유사하게 기능적일 것이므로, 보존 서열 모티프의 확인은 또한 기능적 단편의 확인을 도울 것이다. 기능적 상동체는 또한, UCOE의 성분들을 유사한 성분들로 교체시킨, 예를 들면, UCOE의 하나 이상의 프로모터들을 다른 이종 프로모터들로 교체시킨 변형 UCOE들을 포함한다. 상기 지적한 바와 같이, 이종 프로모터는 도처에 있는 프로모터 및 종양-특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터를 포함하는 임의의 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 이종 프로모터는 우세한 및(또는) 실질적으로 도처에 있는 프로모터이고, 가장 바람직하게는 CMV 프로모터이다.
본 발명의 다른 실시태양에서,
1. 2종 이상의 상이한 조직 타입의 세포를 마커 유전자에 작동가능하게 연결된 후보 UCOE를 포함하는 벡터로 트랜스펙션시켜 후보 UCOE를 시험하고;
2. 2종 이상의 상이한 조직 타입의 세포에서 마커 유전자의 재현성 있는 발현이 얻어지는지를 측정하는 것을 포함하는, 2종 이상의 상이한 조직 타입의 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 재현성 있는 발현을 촉진시키는 UCOE를 확인하기 위한 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 UCOE 확인 방법은 도처에서 발현하는 유전자, 이중 또는 2방향성 프로모터, 및 연장된 메틸화 없는 CpG-아일랜드 중 하나 이상과 연관되는 후보 UCOE들을 선별하는 추가 단계를 포함한다.
바람직하게는, 마커 유전자의 재현성 있는 발현은 마커 유전자에 연결된 UCOE의 단일 복사체를 포함하는 세포 내에서 측정한다.
본 발명은 또한, 마커 유전자에 작동가능하게 연결된 후보 UCOE를 포함하는 벡터를 함유하는 세포를 갖는 인간외 트랜스제닉 동물을 생산하고, 마커 유전자의 재현성 있는 발현이 2종 이상의 상이한 조직 타입의 세포에서 얻어지는지를 측정함으로써, 후보 UCOE를 시험하는 본 발명의 방법을 제공한다. 바람직하게는, 인간외 트랜스제닉 동물은 F1 세대 또는 더 먼 세대의 인간외 트랜스제닉 동물이다. 바람직하게는 인간외 트랜스제닉 동물은 설치류, 더 바람직하게는 마우스이다.
본 발명은 도처에서 발현하는 유전자와 연관되거나 그에 인접한 핵산 서열에서 유래가능한 UCOE를 제공한다. 바람직하게는, 핵산 서열은 연장된 메틸화 없는 CpG-아일랜드를 포함한다. 핵산 서열이 하나 이상의 전사 인자 결합 부위를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 바람직하게는, 핵산 서열은 다르게 전사되는 이중 또는 2방향성 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열은 다르게 전사되는 이중 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열은 다르게 전사되고, 도처에서 발현되는 유전자와 연관되어 있는 이중 또는 2방향성 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열은 다르게 전사되고, 도처에서 유전자와 연관되어 있는 이중 프로모터를 포함한다.
또한, 본 발명은 다른 UCOE를 확인하는 분석에서의 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편의 용도를 제공한다. 바람직하게는 보존 서열 또는 구조 모티프를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편을 사용한다. 이런 분석을 수행하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 발현가능한 유전자가 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 상태로 포함되는 것이 바람직하다. 이 발현가능한 유전자는 적절한 프로모터, 인핸서, 스플라이스 수용 서열, 내부 리보솜 진입 부위 서열 (IRES) 및 전사 중지 부위 등의 유전자 발현을 가능하게 하는 데 필요한 성분을 포함하고 있는 것이다. 유전자 발현을 가능하게 하는 데 적절한 성분은 당업자에게 잘 알려져 있다. 유전자 발현을 가능하게 하는 적절한 성분으로는 유전자와 결합되어 있는 천연 내인성 성분이거나, 내인성 유전자와 비교할 때 유전자 발현양이나 발현 조직 분포를 달리하게 위해서 사용되는 이종(異種) 성분일 수 있다. 바람직하게는 발현가능한 유전자 및 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결합된 프로모터가 벡터에 포함된다. 이 프로모터는 상기 발현가능한 유전자의 천연 내인성 프로모터이거나 이종 프로모터일 수 있다. 이종 프로모터로는 종양 특이적 프로모터 등의 조직 특이적 프로모터 및 도처에 있는 프로모터를 비롯해서 어떤 프로모터이든 가능하다. 바람직하게는 상기 이종 프로모터가 강력한 프로모터 및(또는) 실질적으로 도처에 있으며, 가장 바람직하게는 CMV 프로모터이다.
상기 벡터는 DNA를 세포로 전달할 수 있는 것이면 어떤 벡터라도 될 수 있 다. 바람직하게는 통합성 벡터 또는 에피솜 벡터이다.
바람직한 통합성 벡터로는 재조합 레트로바이러스 벡터를 들 수 있다. 재조합 레트로바이러스 벡터는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 하나 이상의 레트로바이러스 게놈 부위의 DNA를 포함할 것이다. "감염"이란 용어는 벡터가 유전 물질을 숙주 또는 표적 세포로 전달하는 과정을 의미하는 말로 사용된다. 본 발명의 벡터를 제조하는 데 사용되는 레트로바이러스 벡터는 복제능 결핍성인 것이어서, 표적 세포에서 바이러스 복제가 일어나지 않도록 하는 것이 바람직하다. 이런 경우에 복제능 결핍 바이러스 게놈은 통상적인 기술에 따라서 헬퍼 바이러스에 의해 패키징될 수 있다. 일반적으로는, 기능성 유전자의 감염 및 이송능의 상기 기준을 충족시키는 모든 레트로바이러스가 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다.
적합한 레트로바이러스 벡터에는 당업계의 숙련가에게 잘 알려진 pLJ, pZip, pWe 및 pEM이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 복제능 결핍 레트로바이러스를 위한 적합한 패키징 바이러스주는 예를 들어 ψCrip, ψCre, ψ2 및 ψAm을 포함한다.
본 발명에 유용한 다른 벡터는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, SV40 바이러스, 박시니아 바이러스, HSV 및 폭스 바이러스 벡터를 포함한다. 바람직한 벡터는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 기도 상피, 근육, 간, 뇌 및 피부를 포함하여 많은 세포 종류에 유전자를 전달하기 위해 사용되어 왔다 (Hitt, MM, Addison CL and Graham, FL (1997) Human adenovirus vectors for gene transfer into mammalian cells. Advances in Pharmacology 40: 137-206; 및 Anderson WF (1998) Human gene therapy. Nature 392 (6679 Suppl)25-30).
또 다른 바람직한 벡터는 아데노 관련 (AAV) 벡터이다. AAV 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 유전자 요법 적용을 위해 인간 T-임파구, 섬유아세포, 비강 폴립, 골격근, 뇌, 적혈구계 및 조혈간세포를 안정적으로 형질도입시키기 위해 사용되어 왔다 (Philip et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 2411-2418; Russell et al., 1994, PNAS USA, 91, 8915-8919; Flotte et al., 1993, PNAS USA, 90, 10613-10617; Walsh et al., 1994, PNAS USA, 89, 7257-7261; Miller et al., 1994, PNAS USA, 91, 10183-10187; Emerson, 1996, Blood, 87, 3082-3088). 국제 특허 출원 공개 제WO 91/18088호는 특정 AAV 기재 벡터를 설명하고 있다.
바람직한 에피솜 벡터는 바이러스 복제 개시점에서 유래된 기능을 갖는 일시 비복제성 에피솜 벡터 및 자가복제성 에피솜 벡터, 예를 들어 EBV, 인간 파포바바이러스 (BK) 및 BPV-1에서 유래한 벡터를 포함한다. 상기 통합성 및 에피솜 벡터는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 문헌에도 상세하게 기재되어 있다. 특히, 적합한 에피솜 벡터는 WO 98/07876에 기재되어 있다.
또한, 포유동물 인공 염색체가 본 발명에 사용하기 바람직한 벡터이다. 포유동물 인공 염색체의 사용은 문헌 [Calos, 1996, TIG, 12, 463-466]에 기재되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 플라스미드이다. 플라스미드는 비복제성, 비통합성 플라스미드가 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "플라스미드"는 발현가능 유전자를 코딩하는 임의의 핵산을 의미하고, 직선형 또는 환형 핵산 및 이중가닥 또는 단일가닥 핵산을 포함한다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 변형 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 메틸화 또는 보호기 또는 캡(cap) 또는 테일 (tail) 구조체를 포함시켜 화학적으로 변형시킬 수 있다.
비복제성, 비통합성 플라스미드는 숙주 세포에 도입되었을 때 복제하지 않으며, 숙주 세포의 게놈 내로 특이적으로 통합되지 않는 (즉, 높은 빈도로 통합되지 않고 특정 부위에 통합되지 않는) 핵산이다.
복제성 플라스미드는 문헌 [Ustav et al., EMBO J., 10, 449-457, 1991]의 표준 복제 분석법을 포함한 표준 분석법을 사용하여 확인할 수 있다.
바람직하게는, 비복제성, 비통합성 플라스미드는 게놈 DNA 복제와는 무관하게 세포에서 안정적으로 유지될 수 없고, 세포에서 플라스미드 복사체수의 큰 상실없이 3회 이상의 세포 분열 동안 자손 세포에서 존속할 수 없는, 즉 소정의 세포 분열 사이에 자손 세포에서 플라스미드 분자가 평균적으로 약 50%를 초과하여 상실되는 플라스미드이다. 일반적으로, 자기복제성 벡터에서, 자기복제 기능은 바이러스 복제 개시점을 사용하고 특정 바이러스 개시점에 의해 매개되는 복제에 필요한 1종 이상의 바이러스 복제 인자를 제공함으로써 달성된다. 자기복제성 벡터는 WO 98/07876에 기재되어 있다. 용어 "일시 트랜스펙션성, 비통합성 플라스미드"는 상기 정의한 용어 "비복제성, 비통합성 플라스미드"와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 플라스미드는 네이키드(naked) 핵산이다. 본원에서 사용된 용어 "네이키드"는 공유결합 또는 수소결합에 의해 단백질, 지질, 탄수화물 또는 프로테오글리칸과 직접적으로 결합되지 않은 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 변형 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 메틸화 또는 보호기 또는 캡 또는 테일 구조체의 포함과 같은 수단에 의해 핵산 분자의 전부 또는 일부의 화학적 변형의 존재 유무를 의미하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터는 뉴클레오티드 1과 7627 사이에 도 20의 서열 (hnRNP A2 및 HP1H-γ프로모터를 모두 포함), CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위, 폴리아데닐화 서열 및 적합한 조절 성분 하에 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 벡터로는 도 49에 개략적으로 도시한 CET200 또는 CET210 벡터가 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 포유동물 세포와 같은 임의의 세포일 수 있다. 숙주 세포는 포유동물 세포가 바람직하고, CHO 세포주, 293 세포주 및 NS0 세포로부터 유래한 것일 수 있다.
바람직하게는, 작동가능하게 연결된 유전자는 치료 활성을 갖는 핵산 서열이다. 본 발명에 사용될 수 있는 치료에 유용한 핵산 서열은 수용체, 효소, 리간드, 조절 인자, 호르몬, 항체 또는 항체 단편 및 구조 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 치료 활성을 갖는 핵산 서열은 또한 핵 단백질, 세포질 단백질, 미토콘드리아 단백질, 분비 단백질, 멤브레인 결합 단백질, 혈청 단백질, 바이러스 항원, 세균 항원, 원생동물 항원 및 기생충 항원을 코드하는 서열을 포함한다. 또한, 본 발명에 유용한 핵산 서열은 단백질, 펩티드, 지질단백질, 당단백질, 인단백질을 코딩하는 서열 및 핵산 (예를 들어 RNA 및 안티센스 핵산)을 포함한다. 치료 활성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드는 호르몬, 성장 인자, 효소, 응혈 인자, 아포리포단백질, 수용체, 에리트로포이에틴, 치료 활성을 갖는 항체 또는 그의 단편, 약물, 종양 유전자, 종양 항원, 종양 억제제, 바이러스 항원, 기생충 항원 및 세균 항원을 포함한다. 이들 화합물의 구체적인 예는 프로인슐린, 성장 호르몬, 안드로겐 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 I, 인슐린 유사 성장 인자 II, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질, 표피 성장 인자, 형질전환 성장 인자-알파, 형질전환 성장 인자-베타, 혈소판 유래 성장 인자, 혈관생성 인자 (산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 혈관 상피 성장 인자 및 안지오제닌), 매트릭스 단백질 (타입 IV 콜라겐, 타입 VII 콜라겐, 라미닌), 페닐알라닌 히드록실라제, 티로신 히드록실라제, 종양단백질 (예를 들어 byras, fos, myc, erb, src, neu, sis, jun에 의해 코딩되는 단백질), HPV E6 또는 E7 종양 단백질, p53 단백질, Rb 단백질, 시토킨 수용체, IL-1, IL-6, IL-8 및 면역학적 반응의 유도에 사용될 수 있는 바이러스, 세균 및 기생충 유기체로부터 유래한 단백질 및 다른 체내에 유용한 단백질을 포함한다. 도입되는 유전자의 선택은 단지 그의 핵산 서열의 유용성에 의해서만 제한될 뿐이다. 당업계의 숙련가는 더욱 많은 단백질 및 폴리펩티드가 확인되었기 때문에 이들이 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 도입되어 발현될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드가 플라스미드에 포함될 경우, 플라스미드는 Duchenne 근육 위축증의 치료 및 DNA 백신 처리 및 면역화 방법에서와 같은 단일 유전자 치료법에서 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 유전자 산물의 양을 증가시키기 위해 숙주 세포에서 이미 발현되고 있는 유전자 (예를 들어 천연 또는 상동 유전자)를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 상동 유전자의 발현은 조절되지 않은 방식으로 발현되고, 이것은 그의 세포에서의 과다 발현에 반응하는 UCOE에 의해 조절되지 않을 수 있다는 것을 알아야 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 내인성 (천연) 유전자와 작동가능하게 결합된 위치에서 세포의 게놈에 삽입되어 내인성 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전자 성분을 게놈의 특정 부위에 삽입하는 방법은 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있고, US-A-5,578,461 및 US-A-5,641,670에 기재되어 있다. 별법으로, 게놈의 내인성 (천연) 위치에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자가 발현되도록 작동가능하게 결합된 위치에 삽입된 유전자를 가질 수 있다. 다시, 게놈의 특정 부위에 유전자를 삽입하는 방법은 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있고, US-A-5,578,461 및 US-A-5,641,670에 기재되어 있다. 본 발명은 내인성 유전자와 작동 가능하게 연결된 위치에서 세포의 게놈으로 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 유전자 발현 수준을 증가시키는 단계를 포함하는 내인성 유전자의 발현을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
핵산 응축제, 전기천공, 아스베스토를 사용한 착화, 폴리브렌, DEAE, 셀룰로스, 덱스트란, 리포좀, 양이온 리포좀, 리포폴리아민, 폴리오르니틴, 입자 폭격 및 직접 마이크로 주입의 사용을 포함하여 본원에서 설명하는 벡터를 세포에 전달하기 위한 많은 기술이 공지되어 있고, 본 발명에 유용하게 사용할 수 있다 (Kucherlapati and Skoultchi, Crit. Rev. Biochem. 16:349-379 (1984); Keown e t al., Methods Enzymol. 185:527 (1990)).
본 발명의 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 전달 수단을 통해 비특이적으로 또는 특이적으로 (즉, 숙주 세포의 지정된 하위군에) 숙주 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 바이러스 개시점의 전달 방법은 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 파포바바이러스에서 유래한 것과 같은 바이러스 패키징 신호가 그 내부에 도입되는, 본 발명의 벡터의 트랜스펙션 수용체로서 바이러스 입자 생성 패키징 세포주를 포함한다. 바람직한 비바이러스 기재 유전자 전달 수단 및 방법은 또한 본 발명에 사용될 수 있으며, 네이키드 핵산 직접 주입, 핵산 응축 펩티드 및 비펩티드, 양이온 리포좀 및 리포좀 내 봉입을 포함한다.
조직 내로 벡터를 전달하는 것은 문헌에 기재되어 있으며, 일부 단기간 유전자 발현이 달성된다. 벡터의 근육 (Wolff et al., Science, 247, 1465-1468, 1990), 갑상선 (Sykes et al., Human Gene Ther., 5, 837-844, 1994), 흑색종 (Vile et al., Cancer Res., 53, 962-967, 1993), 피부 (Hengge et al., Nature Genet, 10, 161-166, 1995), 간 (Hickman et al., Human Gene Therapy, 5, 1477-1483, 1994) 내로의 전달 및 기도 상피의 노출 후 전달(Meyer et al., Gene Therapy, 2, 450-460, 1995)은 선행 기술에 분명하게 기재되어 있다.
바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열에서 유래한 다양한 펩티드는 폴리리 신 DNA 복합체와 동시 투여될 때 유전자 전달에 사용되었고 (Plank et al., J. Biol. Chem. 269:12918-12924 (1994); Trubetskoy et al., Bioconjugate Chem. 3:323-327 (1992); WO 91/17773; WO 92/19287; 및 Mack et al., Am. J. Med. Sci. 307:138-143 (1994)), 폴리리신 컨쥬게이트와 양이온 지질의 동시 응축은 유전자 전달 효능을 개선시킬 수 있음을 시사한다. WO 95/02698은 양이온 지질 유전자 전달의 효능을 증가시키기 위해 바이러스 성분을 사용함을 개시하고 있다.
본 발명에 유용한 핵산 응축제는 스페르민, 스페르민 유도체, 히스톤, 양이온 펩티드, 양이온 비펩티드, 예를 들어 폴리에틸렌이민 (PEI) 및 폴리리신을 포함한다. 스페르민 유도체는 스페르민의 유사체 및 유도체를 의미하고, WO 93/18759 (공개일: 1993년 9월 30일)에 개시된 화합물을 포함한다.
디술피드 결합은 전달 비히클의 펩티드 성분을 연결시키기 위해 사용되었다 (Cotten et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1992), 및 Trubetskoy et al. 상기 문헌 참조).
DNA 구조체를 세포에 전달하기 위한 전달 비히클은 당업계에 공지되어 있으며, 세포 표면 수용체에 특이적인 DNA/폴리양이온 착체를 포함한다 (Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621 (1988); Wilson et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); 및 미국 특허 제5,166,320호 참조).
본 발명에 따른 벡터의 전달은 핵산 응축 펩티드를 이용하는 것을 고려할 수 있다. 벡터를 응축시키고, 그 벡터를 세포에 전달하는데 특히 유용한 핵산 응축 펩티드는 WO 96/41606호에 기재되어 있다. WO 96/41606호에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 벡터의 전달에 유용한 펩티드에 기능성 기를 결합시킬 수 있다. 이러한 기능성 기에는 모노클론 항체, 인슐린, 트랜스페린(transferrin), 아시알로글리코프로틴(asialoglycoprotein) 또는 당과 같이 특이적 세포형을 표적으로 하는 리간드가 포함된다. 따라서, 이 리간드는 비특이적인 방식이나, 세포형에 대해 제한된 특이적인 방식으로 세포를 표적화한다.
또한, 기능성 기는 팔미토일, 올레일 또는 스테아로일과 같은 지질; 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리비닐피롤리딘(PVP)과 같은 중성 소수성 중합체; 인플루엔자 바이러스의 HA 펩티드와 같은 융합성(fusogenic) 펩티드; 또는 재조합 효소(recombinase) 또는 통합효소 (integrase)를 포함할 수 있다. 또한, 기능성 기는 핵 위치화 서열(nuclear localisation sequence; NLS) 및 엔도좀 탈출 (endosome escape) 신호나 단백질을 직접 세포질로 유도하는 신호와 같은 세포내 중계 단백질(trafficking protein)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료 요법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 제공한다.
바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포가 유전자 치료 요법에 사용된다.
또한, 본 발명은 유전자 치료 요법에 사용하기 위한 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 치료를 요하는 환자에 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 바 람직하게는 상기 환자가 유전자 치료 요법으로 치료가능한 질병을 앓고 있다.
또한, 본 발명은 약제학상 허용되는 부형제와 혼합된, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 원하는 유전자 산물을 얻기 위한 세포 배양 시스템에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다. 적합한 세포 배양 시스템은 당업계 숙련자들에게 잘 공지되어 있고, 당업계 숙련자들에게 알려진 문헌의 본문에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 트랜스제닉 식물의 제조에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 수율 및 내성 등이 증가된 트랜스제닉 식물의 생성은 당업계 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포가 포함된 트랜스제닉 식물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포가 포함된, 인간 이외의 트랜스제닉 동물을 제공한다.
필요한 경우, 본 발명의 제약 조성물은 약제학상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합된, 질병을 치료하거나 유익한 단백질 또는 기능이 있는 특정 조직의 세포를 제공하기 위한 치료 요법용인 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포, 또는 제약 조성물은 전신 근육내 투여, 정맥내 투여, 에어로졸, 경구(고상 또는 액상 형태) 투여, 국소 투여, 안내 투여, 좌약으로서 투여, 복막내 투여 및(또는) 경막내 투여, 및 국부 직접 주사를 포함하는 경로를 통해 투여될 수 있다.
물론, 정확한 투여량은 개별 환자에 따라 각 임상학자에 의해 결정될 필요가 있다. 바꾸어 말하자면, 해당 유전자에 의해 발현된 단백질의 정확한 성질 및 치료의 표적이 되는 조직 타입에 따라 투여량이 조절될 것이다.
또한, 투여량은 질병의 징후 및 투여 경로에 따라 좌우될 것이다. 유리하게도, 치료 기간은 통상 연속적이거나 세포가 죽을 때까지 지속된다. 투여 회수는 질병 및 임상 시험의 효능 데이타에 따라 좌우될 것이다.
본 발명에 따른 효과적인 유전자 치료 요법을 위해 전달되는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 DNA의 양은 체중 1kg 당 벡터 DNA 약 50ng-1000㎍의 범위가 바람직할 것이며, 더욱 바람직하게는 kg 당 벡터 DNA 1-100㎍의 범위이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 생체내 세포 유입으로 포유동물에 투여하는 것이 바람직하기는 하지만, 동물로부터 세포를 분리하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 트랜스펙션시킨 후 동물에 다시 이식하는 생체외 접근법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 동물로부터 간세포를 분리하여 상기 간세포를 시험관 내에서 트랜스펙션시킨 후 동물(토끼의 경우 [Chowdhury et al., Science 254:1802-1805, 1991], 인간의 경우 [Wilson, Hum. Gene Ther. 3:179-222, 1992] 참조)에 다시 이식하는 생체외 접근법에 의해 간에 투여할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 적혈구, T 세포, B 세포 및 조혈 간세포와 같은 순환계 또는 림프계의 다양한 세포 집단에 전달하는데 효과적일 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙 주 세포를 이용하여 조직-특이성 및(또는) 유전자 치료 요법의 효능을 측정하는 포유동물 모델이 제공된다. 상기 포유동물 모델은 트랜스제닉 동물을 포함하는데, 이 동물의 세포는 본 발명의 벡터를 함유하고 있다. 트랜스제닉 마우스(Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380(1980); Harbers et al., Nature 293:540(1981); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5016(1981); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376(1981) 참조), 양, 돼지 및 닭(Hammer et al., Nature 315:680(1985) 참조) 등의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본 발명에 따라 이용하는 것을 고려할 수 있다. 이러한 동물들은 인간에서 임상 시험하기 이전의 시험용이다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 트랜스제닉 동물은 해당 단백질의 장기간 제조에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 기능 유전체학(functional genomics) 분야에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 기능 유전체학은 주로 특정 세포형 또는 질병 상태에서 특이적으로 발현되는 유전자의 서열에 관한 것이며, 그 결과 현재는 신약 개발 또는 유전자 치료 요법 목적을 위해 잠재적으로 흥미있는 신규 유전자 서열 수천가지를 제공하고 있다. 신규 치료 요법의 개발에 이러한 정보를 이용하는데 있어서의 주요 문제점은 이러한 유전자의 기능을 결정하는 방법에 있다. UCOE는 유전자 서열의 기능을 결정하기 위해 기능 유전체학의 여러 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명의 기능 유전체학 분야에는 하기의 내용이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
(1) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 유전자의 안티센스 서열 또는 리보자임 녹다운 라이브러리를 지속적으로 발현함으로써, 유전자를 불활성화시켜 세포 표현형 상에 나타나는 효과를 측정한다.
(2) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 해당 유전자 서열의 발현 라이브러리를 제조하고, 이를 세포에 전달하면 유전자 서열의 확실하고 재현가능하며 지속적인 발현을 초래할 것이다. 해당 유전자 서열을 발현하는 결과의 세포를 기능 결정 및 신약 개발을 위한 다양한 접근법에 이용할 수 있다. 예를 들면, 유전자 산물의 활성을 중화시키기 위해 항체를 만들거나; 구조 연구, 기능 연구 또는 약물 스크리닝 연구에 사용하기 위해 유전자 자체의 단백질 산물을 속성으로 정제하거나; 또는 세포-기재의 약물을 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
(3) 마우스 배아 간(embryonic stem; ES)세포 및 트랜스제닉 마우스에 관련된 접근법에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용한다. 가장 강력한 기능 유전체학의 접근법 중 하나는, 발현되는 유전자에 삽입 후 약물 선별을 가능하게 하는 구조체을 마우스 ES 세포의 유전자에 무작위로 삽입하는 것과 관련되어 있으며, 이 구조체은 서열 분석을 위해 쉽게 복구할 수 있다(G. Hicks et al., Nature Genetics, 16, 338-334). 이후에, 신규 서열이 포함된 유전자가 녹아웃 돌연변이화된 트랜스제닉 마우스를 쉽게 제조하여 그 유전자의 기능을 증명할 수 있다. 현재 이 기술은 마우스 ES 세포에서 잘 발현되는 10%의 마우스 유전자에 대해 잘 작동한다. UCOE의 통합 구조체로의 혼입은 이 기술을 확장시켜 마우스에서 발현되는 모든 유전자를 확인할 수 있게 한다.
본 발명은 LCR로부터 유래하지 않은 도처에 있는 염색질 개방 요소(UCOE)를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 치료 및 분석방법에서 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 사용하는 방법, 및 UCOE들을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 UCOE는 염색질을 개방하거나 또는 염색질을 개방된 상태로 유지하고 그리고 적어도 두 가지의 상이한 조직 타입들의 세포들에서 작동가능하게 연결된 유전자의 복제성 발현을 촉진한다.
도면을 참조로 하는 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 여러 가지 대표적인 폴리뉴클레오티드의 제조, 시험 및 분석 방법은 하기에 상세히 기재될 것이다. 당업계의 기술 중 하나가 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드를 제조 및 시험하는 상기 방법을 개조시킬 수 있다.
재료 및 방법
라이브러리 스크리닝
인간 TBP 및 hnRNPA2 좌에 걸쳐 있는 게놈 클론을 P1-유도된 인공염색체 (pCYPAC-2) 라이브러리로부터 분리하였다 (CING-1; Ioannou et al., 1994). 선별은 세균성 용해물의 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 수행하였다.
TBP
에 대한
프라이머
프라이머는 문헌 [Chalut et al., (1995)]에 기술된 부분 게놈서열을 사용하여 고안하였으며, 다음과 같았다:
TB3 [5'ATGTGACAACAGTGCATGAACTGGGAGTGG3'] (-605) 및 TB4 [5'CACTTCCTGTGTTTCCATAGGTAAGGAGGG3'] (-119)는 TBP 유전자의 5' 비번역부위 (5'UTR)에 혼성화하여 인간 유전자 만으로부터의 486bp PCR 생성물을 생성시킨다 (결과 참조). 괄호 안의 수는 문헌 [Peterson et al., (1990)]에서 정의된 mRNA CAP 부위에 관한 것이다.
TB5 [5'GGTGGTGTTGTGAGAAGATGGATGTTGAGG3'] (1343) 및 TB6 [5'GCAATACTGGAGAGGTGGAATGTGTCTGGC3'] (1785)은 3'UTR로부터 유래하는 영역을 증폭시키고 이 영역에서의 상당한 서열 상동성에 기인하여 인간 및 마우스 DNA 둘다로부터 415bp 생성물을 생성시킨다. 괄호 안의 수는 문헌 [Peterson et al., (1990)]에서 정의된 cDNA 서열에 관한 것이다.
hnRNP
A2에 대한
프라이머
hnRNP A2에 대한 프라이머는 문헌 [Biamonti et al., (1994)]에 기술된 게놈서열로부터 고안하였다.
5'UTR에서 Hn1 [5'ATTTCAAACTGCGCGACGTTTCTCACCGC3'] (-309) 및 Hn2 [5'CATTGATTTCAAACCCGTTACCTCC3'] (199)는 508bp의 PCR 생성물을 생성시킨다. Hn3 [5'GGAAACTTTGGTGGTAGCAGGAACATGG3'] (7568) 및 Hn4 [5'ATCCATCCAGTCTTTTAAACAAGCAG 3'] (8176)는 끝에서 두번째 엑손 (10번) 내의 영역을 증폭시켜 670bp의 PCR 생성물을 생성시킨다. 괄호 안의 수는 문헌 [Biamonti et al., (1994)]에서 정의된 개시점에 관한 것이다.
PCR
프로토콜
PCR은 총반응 용적 25㎕ 중에 각각 25mM씩의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1×반응완충액 (50mM 트리스-HCl [pH 9.1], 16mM (NH4)2SO4, 3.5mM MgCl2, 150㎍/㎖ 소혈청알부민), 2.5유니트 Taq 슈프림 (Supreme) 폴리머라제 (Fermentas) 및 각각 1 μM 씩의 프라이머를 함유하는 반응액 중에서 저장된 클론물질 1㎕를 사용하여 수행하였다. 사이클 조건은 다음과 같다: 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 되는 4 사이클, 이어서 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 되는 30 사이클. 양성으로 확인되는 클론을 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 T-브로스(증류수 1 리터 당, 트립톤 12g, 효모추출물 24g (둘다 Difco), KH2PO4 23.1g, K2HPO4 125.4g, 글리세롤 0.4%; Tartof and Hobbs, 1987). 세균의 영구저장물은 1×저장완충액 (3.6mM K2HPO4, 1.3mM KH2PO4, 2.0mM 구연산나트륨, 1mM MgSO4, 4.4% 글리세롤) 중의 각각의 현탁액을 -80℃에서 동결시킴으로써 제조하였다.
CYPAC
-2
DNA
단리
플라스미드 DNA는 다음과 같은 변형된 알칼리성 용해방법 (Birnboim and Dolly, 1979)을 사용하여 단리하였다. 1 리터의 T-브로스를 함유하는 2 리터 배플 (baffled) 유리플라스크를 단일 세균 콜로니로 접종하고 일정하게 교반하면서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 세균은 베크만 (Beckman) J6 원심분리기에서 4200 rpm (5020×g, 모든 후속단계에서도 유사함)으로 10분 동안 원심분리시킴으로써 수 거하였다. 펠릿을 와동시키고 15mM 트리스-HCl [pH 8.0], 10mM EDTA, 10㎍/㎖ RNaseA (200㎖)에 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 용해용액 (0.2M NaOH, 1% SDS; 200㎖)을 2분 동안 온화하게 혼합하면서 가하고, 이어서 200㎖의 중화용액 (3M 칼륨아세테이트 [pH 5.5])을 온화하게 혼합시키면서 추가로 5분 동안에 첨가하였다. 세균 파편(debris)을 4℃에서 1시간에 걸쳐 침전시킨 다음에, 15분 동안 원심분리하고 상등액을 멸균가제를 통해서 여과함으로써 제거하였다. 이소프로판올 (400 ㎖; 최종농도 40%)을 가하여 실온에서 1시간 동안 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 15분 동안 원심분리하고 펠릿을 70% 에탄올 중에서 세척한 후에, DNA를 1× TNE (50mM 트리스-HCl [pH 7.5], 5mM EDTA, 100mM NaCl), 0.1% SDS 및 0.5㎎/㎖ 프로테이나제-K (Cambio)의 용액 4㎖에 재현탁시켜 잔류 단백질을 제거하였다. 이어서 55℃에서 1시간 동안 배양하고 페놀:클로로포름 (1:1, v/v)으로 후속 추출한 후에, DNA를 1 용적의 100% 에탄올 또는 이소프로판올로 침전시키고, 2㎖의 TE 완충액 (10mM 트리스-HCl [pH 8.0], 1mM EDTA) 내로 스풀하였다. 통상적으로 50㎍/㎖의 수율이 수득되었다.
제한효소
맵핑
제한효소 맵핑은 pCYPAC-2 및 TBP 유전자 서열 둘다로부터 유도된 올리고뉴클레오티드를 상술한 바와 같이 제한효소 소화된 클로닝된 DNA의 써던 블롯 (Southern, 1975)에 혼성화시킴으로써 수행하였다. 게놈 단편이 클로닝되는 BamHI 부위에 바로 근접한 pCYPAC-2 서열에 혼성화한 올리고뉴클레오티드를 사용하였으며, 그의 서열은 다음과 같았다:
EY2: [5'-TGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGG-3']
189: [5'-GGCCAGGCGGCCGCCAGGCCTACCCACTAGTCAATTCGGGA-3']
NotI에 의해 pCYPAC-2로부터 게놈 삽입물을 절단하는 것은 유리된 단편이 각 측면에 소량의 플라스미드 서열을 보유하는 것을 의미한다. EY2 측면에서 이것은 절단된 단편 내에 대부분의 EY2 서열을 갖는 30bp가 될 것이다. 따라서, NotI 소화된 pCYPAC-2 클론에 대한 이 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 써던 불롯 분석 상의 유리된 게놈 밴드를 두드러지게 하여야 한다. 189 측면에서는, 절단된 단편이 플라스미드 서열의 39bp를 함유하며 189 올리고뉴클레오티드 서열의 대부분은 pCYPAC-2 내의 NotI 부위에 대해 3'이다. 따라서, 이 올리고뉴클레오티드는 pCYPAC-2 클론의 NotI 소화물 상의 벡터에 혼성화할 것이다. 약 100ng의 플라스미드 DNA를 제조자가 추천한 조건 (Fermentas)을 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 소화시키고, 이이서 0.5×TAE 완충액 (20mM 트리스-아세테이트 [pH 8.0], 1mM EDTA, 0.5㎍/㎖ 에티듐브로마이드) 중의 0.7% 아가로즈겔 상에서 또는 펄스된 전기장 겔 상에서 전기영동시켰다. 펄스된 전기장 겔 전기영동 (PFGE)은 스위치 시간을 1초 내지 30초로하여 14시간 동안 6V/㎝에서 1% PFGE 아가로즈 (FMC)/0.5×TAE 겔 상의 CHEF-DRII 시스템 (Biorad) 상에서 수행하였다. 본 연구 전체에 걸쳐서 모든 PFGE 분석에는 동일한 조건을 사용하였다. 겔은 자외선 하에서 사진을 찍기 전에 1㎍/㎖ 에티듐브로마이드 용액 중에서 염색시켰다.
써던 블롯 분석을 위한 준비로, 우선 아가로즈겔을 254㎚ 자외선 (UVP 교차링커 중에서 180,000μJ/㎠, UVP)에 노출시킨 다음, 이어서 20분 후에는 용액을 바 꾸어 주면서 40분 동안 0.5M NaOH, 1.5M NaCl에 침지시켜 변성시킴으로써 DNA를 탈퓨린화시켰다. DNA를 새로운 용적의 변성용액 중에서 모세관작용에 의해 16시간에 걸쳐 HYBOND-N 나일론막 (Amersham) 상에 전이시켰다. 나일론에 대한 핵산의 교차결합은 120,000μJ/㎠에서 254㎚ 자외선에 노출시킴으로써 이루어졌다. 막을 0.5M 트리스-HCl [pH 7.5], 1.5M NaCl 중에서 20분 동안 중화시키고 사용하기 전에 2×SSC 중에서 세정하였다 (1×SSC는 150mM NaCl, 15mM 구연산나트륨 [pH 7.0]이다).
올리고뉴클레오티드 프로브는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 32P-γATP로 5' 말단에서 표지하여 써던 불롯 상에서 특정단편의 검출을 가능하게 만들었다. 각각의 실험은 제조자에 의해 지정된 완충액 중에 2㎕ 32P-γATP (>4000 Ci/mmol; 10mCi/㎖, Amersham) 및 10유니트의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (Fermentas)를 함유하는 반응액 중에서 표지된 100ng의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후에, 혼입되지 않은 뉴클레오티드는 물로 평형화된 세파덱스 (Sephadex) G50 칼럼 (Pharmacia) 상에서 크로마토그래피시킴으로써 제거하였다. 말단-표지된 프로브는 일반적으로 비활성 >1×108 dpm/㎍으로 표지하였다.
혼성화는 25㎖의 예온된 혼성화 혼합물 (1mM EDTA [pH 8.0], 0.25M Na2HPO4 [pH 7.2], 7% SDS; Church and Gilbert, 1984) 및 100㎍/㎖의 변성된 절단한 연어정소 DNA를 함유하는 유리병 (Hybaid) 내부의 나일론 메쉬 사이에 샌드위치된 막을 사용하여 수행하였다. 65℃에서 1시간 동안 예비-혼성화시킨 후에, 용액을 경사시 키고 표지된 프로브를 함유하는 동일한 용액으로 치환시켰다. 최적 혼성화 온도는 실험적으로 결정하였으며 TE 완충액 내의 올리고뉴클레오티드에 대한 Tm은 20℃ 이하인 것으로 확인되었으며, Tm = 59.9+41[%GC] - [675/프라이머 길이]로 계산된다. 16시간 후에 혼성화막을 분리하여 6×SSC, 0.1% SDS의 2분 세척을 3회 수행하고, 이어서 X-선 필름 (BioMAX, Kodak)에 노출시켰다.
DNA
구조체
5' 및 3' 측면 서열 둘다의 12kb를 갖는 TBP 유전자에 걸쳐 있는 44kb 게놈 DNA 영역은 pCP2-TNN pCYPAC-2 클론 (참조 도9)으로부터 NotI 단편으로서 유도하였다. 이것을 코스미드 벡터 pWE15 (Clontech)에 클로닝시켜 pWE-TSN (도 9)을 생성시켰다. pCYPAC-2 플라스미드가 진핵세포 트랜스펙션 시험을 위한 선택성 마커를 함유하지 않기 때문에 벡터 교환이 필요하였다. NotI에 의한 pCP2-TNN의 소화로 게놈 삽입물의 5' 말단으로부터 TBP의 마지막 엑손의 12kb 하류에 위치하는 게놈서열 내에 존재하는 NotI 부위까지 연장하는 44kb 단편을 생성시킨다 (참조 도 9). 또한, 이 클론 내의 3' 측면서열의 나머지 20kb 및 pCYPAC-2 벡터를 함유하는 단편이 생성된다. 상술한 바와 같은 조건을 사용하여 10㎕의 반응액 중에서 약 1㎍의 NotI 소화된 pCP2-TNN 및 200ng의 유사하게 절단된 pWE15를 사용하여 연결반응을 수행하였다. T4 DNA 리가제를 열불활성화시킨 후에 완전 연결반응 혼합물을 지가팩 골드 (Gigapack Gold) III (Stratagen)을 사용하여 감염성 람다 파아지에 충전시켰다. 재조합 박테리오파아지는 SM 완충액 (500㎕의 50mM 트리스-HCl, 100mM NaCl, 8mM MgSO4, 0.01% (w/v) 젤라틴, 2% 클로로포름) 내에 저장하였다. 감염은 다음과 같이 수행하였다: E. coli DH5α의 밤새 배양물 5 ㎖를 원심분리 (3000×g, 5분)시키고, 세균을 2.5㎖의 10mM MgCl2에 재현탁시켰다. 동일 용적의 충전된 물질과 E. coli를 혼합시키고 25℃에서 15분 동안 배양한 후에 200㎕의 L-브로스를 가하고, 혼합물을 37℃에서 추가로 45분 동안 배양하였다. 현탁액을 LB-암피실린 한천 플레이트 상에 도말하고, 다음날 단일 콜로니를 미니 (mini) 제제로서 분석하였다. pCYPAC-2 클론에 관하여는 1 리터의 배양물로부터 대량의 pWE-TSN을 제조하였다.
pCYPAC
-2
DNA
서브클로닝
방법
pCYPAC-2 클론으로부터 유도된 작은 (10kb 미만) 제한효소 단편을 서브클로닝하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용하였다. DNA를 제한효소 소화시키고, 0.6% 저융점 아가로즈겔 (FMC) 상에서 전기영동하였으며, 여기에서 모든 자외선 사진술은 365㎚의 파장에서 수행하여 에티듐브로마이드 염색된 DNA의 닉킹 (nicking)을 최소화하였다 (Hartman, 1991). 목적하는 크기 범위의 단편을 함유하는 겔 영역을 겔로부터 절단하여 68℃에서 10분 동안 용융시키고 추가로 5분 동안 37℃로 평형화시켰다. 플라스미드 벡터 pBluescriptKS(+) (Stratagene)를 유사하게 제한효소 소화시켜 pCYPAC-2 유도된 DNA와 화합성인 말단들을 생성시키고, 10 유니트의 송아지 장포스파타제 (Fermentas)로 1시간 동안 처리하여 자체-연결반응을 최소화시키고, 페놀-클로로포름 (1:1 v/v) 추출에 이어서 에탄올 침전시킴으로써 정제하였다. 용 융된 겔 절편을 50ng의 이 벡터제제와 혼합시켜 단편 대 벡터분자 4:1의 몰과량이 되도록 하였다. 지정된 완충액과 함께 T4 DNA 리가제 (10 유니트; Fermentas)를 가하고, 혼합물을 16℃에서 16시간 동안 배양한 후에, 효소를 열불활성화 (65℃에서 20분 동안)시켜 형질전환 효율을 개선시켰다 (Michelsen, 1995). 염화칼슘 수용성 (competent) DH5α E. coli의 제조 및 그후의 형질전환은 설정된 방법을 사용하여 수행하였다 (Sambrook et al., 1989). 형질전환은 연결반응 혼합물을 37℃로 용융시키고 평형화시킨 후에, 0.02% 이하의 최종 아가로즈 농도를 유지하면서 100㎕의 수용성 세포를 첨가하였다. 세균을 얼음 상에서 2시간 동안 배양하고, 이어서 37℃에서 5분 동안 열충격을 주고, 계속해서 1㎖의 SOC 배지 (1 리터의 증류수 당, 20g 트립톤; 5g 효모추출물; 0.5g NaCl; 20mM 글루코즈, [pH 7.0]; Sambrook et al., 1989)를 첨가하였다. 37℃에서 추가로 1시간 후에 세포를 50㎕의 선택용액 (36㎎/㎖ Xgal, 0.1M IPTG)과 혼합시키고, 20㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 적절한 LB-항생제 플레이트 (증류수 리터 당, 10g NaCl [pH 7.0], 10g 트립톤, 5g 효모추출물, 20g 한천) 상에 도말하였다. 37℃에서 16시간 후에, 재조합 플라스미드를 함유하는 세균 콜로니는 β-갈락토시다제 유전자 활성의 붕괴에 기인하여 이들이 백색 (청색에 반대됨)을 나타내는 것으로 확인하였다. 선택된 콜로니는 단일 콜로니 미니 제제로부터 분리된 DNA의 제한소화에 의해서 분석하였다. 이 방법을 사용하여 pBluescriptKS(+) 벡터 내에 20kb 이하의 단편을 서브-클로닝할 수 있었다.
PCR 증폭된 생성물은 다음과 같은 방법을 사용하여 클로닝하였다. 주형으로서 1ng의 pCYPAC-2 유도된 클론 DNA를 사용하여 50㎕ 용적으로 표준 PCR 반응을 수 행한 후, 반응액에 10 유니트의 T4 DNA 폴리머라제 (Fermentas)를 가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 폴리머라제 효소를 불활성화 (96℃, 20분)시킨 후에, 7㎕의 PCR 생성물을 최종용적 10㎕ 중에서 50ng의 EcoRV 소화된 pBluescriptKS(+) 벡터에 연결시켰다. PCR 생성물의 말단을 블런트화시키는 T4 DNA 폴리머라제의 사용으로 고비율의 재조합 클론이 유도되었다 (데이타는 제시되지 않음).
pBL3
-
TPO
-
puro
의 생성
pBL3-TPO-puro는 약 1.2kb의 5' 및 4.5kb의 3' 측면서열 및 푸로마이신 내성 유전자 카세트와 함께 전체 19kb TBP 유전자를 함유하며, pBL3 벡터 내에 서브-클로닝되었다. 이것은 3개의 연속적인 클로닝 단계에 의해서 이루어졌다.
우선, pCP2-TLN 플라스미드 내의 인간 TBP 유전자의 3' 말단에 인접한 4.5 kb의 서열을 pCP2-TLN으로부터 NotI-SacII 단편으로서 서브-클로닝하였다. 이 단편은 TBP 유전자의 3' UTR 내의 SacII 부위로부터 pCYPAC-2 벡터 내의 OL189-근위 NotI 부위 까지에 걸친 것이다. 이 단편을 SacII 및 NotI 소화된 pBL3 내에 클로닝시키고 MA426으로 명명하였다. 나머지 TBP 유전자 서열은 mRNA 캡 (cap) 부위의 1.2kb 상류로부터 3'-UTR 내의 SacII 부위 까지에 걸쳐 있는 19kb SacII 단편 상에 위치한다. 이 단편을 SacII에 의해 선형화된 MA426에 연결시키고, 클론을 정확한 배향을 위해서 선별하였다.
DNA
서열화 및 컴퓨터 서열분석
DNA는 베이스클리어 (BaseClear; Netherlands)로부터의 서비스로서 제공된 플렉시-프레프 (Flex-Prep) 시스템 (Pharmacia) 및 자동화 형광성 서열화을 사용하 여 제조하였다. 전술한 조사수단을 사용하여 dBEST 및 비-중복성 진뱅크 (Genbank) 데이타베이스를 의문시하였다 (Altschul et al., 1997). 이 연구에서 사용된 모든 발현된 서열 태그 (tag) 클론은 I.M.A.G.E, 컨소시움을 통해서 수득하였다 (Lennon et al., 1996). 공지의 DNA 서열의 다수의 서열 정렬 및 제한효소 소화패턴의 예상은 프로그램 PCGENE (Intelligenetics Inc., USA)을 사용하여 수행하였다. CpG 디뉴클레오티드 빈도수의 플롯은 VectorNTI 소프트웨어 (Informax Inc., USA)를 사용하여 생성시켰다.
트랜스제닉
동물의 생성
미세주입를
위한
TBP
단편의 제조
TBP/PSMB1 유전자 영역을 함유하는 90kb 게놈 단편 (TLN)은 pCP2-TLN을 NotI 소화시킴으로써 분리하여, 변형된 염화나트륨 구배방법 (Dillon and Grosveld, 1993)을 사용하여 미세주입를 위해 제조되었다. 우선, 표준 pCP2-TLN 맥시 제제로부터 LPS 제거 키트 (Quiagen)를 제조자의 지침에 따라 사용하여 세균성 지질다당류 (LPS)를 제거하였다. 그후, 약 50㎍의 DNA를 70 유니트의 NotI (Fermentas)로 1시간 동안 소화시키고, 소량을 분취액을 PFGE에 의해 분석하여 완전소화 여부를 조사하였다. 3mM EDTA의 존재하에서 14㎖의 5-30% 염화나트륨 구배는 시판 구배형성기 (Life Technologies)를 사용하여 초청정 원심분리관 (Beckman) 내에서 준비하였다. 소화된 DNA를 전단을 최소화시키기 위해서 광구경 (wide-bore) 파이펫 팁을 사용하여 구배의 상부에 적층하고, 구배를 SW41Ti 스윙-아웃 로터 (swing-out rotor) (Beckman) 내에서 5.5시간 동안 (25℃에서) 37,000rpm으로 원심분리하였다. 구배의 하부 (최고밀도)로부터 시작하여 약 300㎍의 분획을 1㎖의 80% 에탄올을 함유하는 개개 미량원심분리관 내로 분리시키고, 이어서 -20℃에서 1시간 동안 배양하였다. DNA 침전을 원심분리 (14900×g, 15분)에 의해 수거하였다. 펠릿을 70% 에탄올 내에서 세척하고 20㎕의 트랜스제닉 미세주입 완충액 (10mM 트리스-HCl [pH 7.4], 0.1mM EDTA)에 용해시키고, 각각의 분획으로부터 5㎕ 씩의 분취액을 겔 전기영동에 의해서 분석하여 벡터 및 염색체 DNA의 오염을 평가하였다. 이러한 오염이 없는 것으로 보이는 분획들을 모아서, 260㎚에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 평가하였다.
40kb 게놈 단편 (TSN)을 NotI 소화 및 전술한 바와 같은 전기용출을 이용한 정제 (Sambrook et al., 1989)에 의해 pWE-TSN으로부터 분리하였다. 전기용출 후에, DNA를 TE 완충액-포화 페놀, 페놀:클로로포름 (1:1 v/v)로 및 물 포화된 n-부탄올로 2회 연속 추출하여 정제하여 잔류 에티듐브로마이드를 제거하였다. DNA를 2 용적의 100% 에탄올로 침전시키고 미세주입 완충액에 재현탁시켰다. 단편 통합성은 PFGE 및 260㎚에서의 흡광도에 의해 결정된 농도에 의해 평가하였다. 25kb 게놈 단편 (TPO)은, 삽입물을 SalI에 의한 소화에 의해서 벡터로부터 유리시키는 것을 제외하고는 동일한 방법을 사용하여 pBL3-TPO로부터 분리시켰다.
미세주입를
위한
hnRNP
A2 단편의 제조
hnRNP A2 유전자를 함유하는 160kb 게놈 단편 (MA160)을 pCP2-HLN의 NruI 소화 (도 13a) 및 상술한 바와 같은 염화나트륨 구배 초원심분리에 의해 분리하고 미세주입를 위해서 준비하였다.
60kb 게놈 단편 (HSN; 도 13b)은 AatII 소화 및 상술한 바와 같은 PFGE에 의한 정제에 의해서 MA160으로부터 분리하였다. 60kb 밴드를 겔로부터 절단하여 절편으로 절단하였다. 각각의 절편을 65℃에서 용융시키고 30㎕를 PFGE에 의해서 분석하였다. 60kb 단편의 가장 순수한 샘플인 것으로 나타난 분획을 보유하였다. 용융된 겔 용적을 측정하고 겔라제 (Gelase) 완충액으로 1×으로 만들고, 42℃에서 10분 동안 평형화시킨 다음 500㎕ 당 1 유니트의 겔라제 효소 (Epicentre Technologies)를 가하였다. 샘플을 42℃에서 밤새 배양한 다음 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 광구경 팁을 사용하여 경사시키고 10㎝ 페트리디쉬 내의 0.25㎛ 필터 상에서 15㎖의 트랜스제닉 미세주입 완충액에 대하여 4시간 동안 점적-투석하였다. 투석된 용액을 미량원심분리관에 옮기고, 4℃에서 30분 동안 회전시켰다. 단편 통합성은 PFGE, 및 260㎚에서의 흡광도에 의해 결정된 농도에 의해서 평가하였다.
트랜스제닉
마우스의 생성
트랜스제닉 마우스는 C57/B16 마우스의 수정된 난자의 전핵주사에 의해서 생산하였다. 각각의 DNA 단편을 트랜스제닉 완충액 중에서 1ng/㎕의 농도로 주사하였다. 이것은 표준기술을 사용하여 UMDS 트랜스제닉 유니트 (Transgenic Unit) (St. Thomas's Hospital, London)에 의한 서비스로서 수행되었다. 트랜스제닉 생성자 (founder)는 다음과 같이 분리된 꼬리 조직생검 DNA의 PCR 선별을 이용하여 확인하였다. 10-15일된 마우스로부터 얻은 약 0.5㎝의 꼬리 조직생검을 500㎕의 꼬리 완충액 (50mM 트리스-HCl [pH 8.0], 0.1M EDTA, 0.1M NaCl, 1% SDS, 0.5㎎/㎖ 프로테이나제-K) 중에서 16시간 동안 37℃에서 배양하였다. 가수분해물을 동일용적의 페놀:클로로포름 (1:1 v/v)으로 온화하게 전환시키고, 이어서 원심분리 (14900×g, 15분)시킴으로써 추출하였다. 2 용적의 100% 에탄올을 첨가하여 수성상으로부터 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하였다. DNA를 분리하여 100㎕의 TE 완충액에 용해시켰다. 일반적으로, 260㎚에서의 흡광도 측정에 의해 결정된 것으로서 50-200㎍의 DNA가 수득되었다. PCR 반응을 위한 조건은 주형으로서 100ng 꼬리 조직생검 DNA 및 TB3/TB4 프라이머 셋트를 사용하여, pCYPAC-2 라이브로리의 선별을 위해서 기술한 바와 같이 하였다. 양성 생성자는 야생형 C57/B16 마우스에 역교배시킴으로써 번식시켜 완전한 트랜스제닉 F1 자손을 생성시켰다.
트랜스제닉
통합성 및
복사체수
트랜스제닉 복사체수 및 통합성은 BamHI, BglII, EcoRI 및 HindIII 소화된 꼬리 조직생검 DNA의 써던 불롯 분석에 의해서 평가하였다. 약 10㎍의 DNA를 20-30 유니트의 특정 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, 0.7% 아가로즈/0.5×TBE (45mM 트리스-보레이트 [pH 8.0], 1mM EDTA) 겔 상에서 16시간 동안 1.5 V/㎝로 전기영동하였다. 염색 및 DNA의 나일론막에 대한 전이는 양으로 하전된 매트릭스 (HYBOND N+, Amersham)을 사용하는 것을 제외하고는 플라스미드 써던 불롯과 동일하였다.
DNA 프로브는 제한효소 소화에 의해서 클로닝 벡터서열을 제거함으로써 제조하여 젠-클린 (Gene-Clean) 시스템 (Bio101, USA)을 사용하여 저융점 아가로즈로부터 정제하였다. 100ng의 프로브 샘플의 방사성 표지는 시판품으로 이용할 수 있는 키트 (Amersham) 및 각각 200pmol 씩의 dCTP, dGTP, dTTP 및 3㎕의 α-P32-dATP (비활성 >3000 Ci/mmol, 10 mCi/㎖, Amersham)를 사용하여 닉 번역에 의해서 수행하였다. 표준완충액 중의 0.5 유니트 DNA 폴리머라제 I/10pg DNase I로 구성된 효소용액을 가하고, 반응액을 15℃에서 2.5시간 동안 배양하였다. 프로브를 세파덱스 G-50 크로마토그라피에 의해서 정제하고 사용하기 직전에 5분 동안 비등시켰다. 일반적으로 >1×108 cpm/㎍의 비활성이 수득되었다.
혼성화는 상술한 플라스미드 써던 불롯에 대해서와 같이 수행하였다. 막을 100㎍/㎖ 변성된 연어정소 DNA를 함유하는 15㎖의 예비-혼성화 용액 (3×SSC, 0.1% SDS, 5×덴하르트 용액 [100×덴하르트 용액은 증류수 리터 당, 2% 피콜 (Ficoll) (타입 400, Pharmacia), 2% 폴리비닐피롤리돈, 2% 소혈청알부민 (분획 V, Sigma)이다]) 중에서 65℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 용액을 100㎍/㎖ 변성 연어정소 DNA 및 열변성된 방사성표지된 프로브를 함유하는 15㎖의 혼성화 용액 (덱스트란 설페이트를 10%로 첨가한 예비-혼성화 용액)으로 대체시켰다. 65℃에서 16시간 동안 혼성화시킨 후에, 막을 매회 30분 씩 2×SSC/0.1% SDS 중에서 2회 세척하고, -80℃에서 포스포이메이져 (PhosphorImager; Molecular Dynamics) 스크린 또는 X-선 필름에 노출시켰다. 재분석될 블럿 결합된 프로브를 0.2M NaOH에 20분 동안 침지시키고, 이어서 상술한 바와 같이 중화시킴으로써 분리하였다.
이 시험에서 사용된 프로브의 대부분은 서열정보를 이용할 수 있는 게놈 클론의 영역으로부터 유도되었다 (예를들어, pCP2-TLN 말단-단편 프로브 및 TBP 인트 로성 영역으로부터 유도된 것). 다수의 프로브는 비특이적으로 인간 게놈 DNA에 혼성화하는데, 이것은 반복성 서열요소의 존재를 시사한다. 이 문제를 회피하기 위하여 프로브 DNA의 분취량을 개별적으로 다수의 제한효소로 소화시켜 전기영동하고 써던 불롯 분석하였다. 프로브를 더 작은 다수의 단편으로 소화시키기 위해서 짧은 인식부위 (이것은 DNA 내에서 매우 빈번하게 나타나야 한다)를 갖는 효소를 선택하였다. 이들 단편이 반복성 서열을 함유하였음을 확인하기 위하여 프로브로서 방사성표지된 인간 C0t-1 DNA를 사용하였다. 이 방법을 사용하여 반복성 요소를 함유하는 모든 프로브의 경우에 C0t-1 프로브에 대해 혼성화하지 않는 >500bp 단편을 수득할 수 있었다.
코스미드
DNA
의 제조 및 단일 복사체 L-세포 클론의 생성
상술한 바와 같은 1 리터 배양물의 알칼리성 용해를 이소프로판올 침전단계 까지 수행하여 pWE-TSN DNA를 제조하였다. 25℃에서 1시간 동안 배양한 후에 펠릿을 300㎕ TE에 재현탁시킨 다음, 연속적으로 혼합시키면서 10㎖의 세파글라스 (Sephaglas) FP DNA 결합매트릭스 (Pharmacia)에 첨가하였다. 용액을 10분 동안 일정하게 전화시키고, 매트릭스-결합된 DNA를 원심분리 (280×g, 1분)에 의해 수거하였다. 펠릿을 우선 WS 완충액 (20mM 트리스-HCl [pH 7.5], 2mM EDTA, 60% 에탄올)으로 세척하고, 원심분리하여 수거한 다음, 70% 에탄올로 세척하고 재원심분리하였다. 펠릿을 2㎖ TE 완충액에 재현탁시키고 주기적으로 혼합하면서 70℃에서 10분 동안 배양함으로써 DNA를 매트릭스로부터 용출시켰다. 용액을 원심분리 (1100×g, 2분)하고, DNA 함유 상등액을 두개의 미량 원심분리관에 나누었다. 잔류 세파글라스를 원심분리 (14950×g, 15분)에 의해 제거하고, 상등액을 모아 2 용적의 에탄올로 DNA를 침전시켰다. 뽑아 낸 DNA를 70% 에탄올로 1회 세척하고 멸균수에 1 ㎍/㎕ 농도로 재현탁시켰다. 약 75-100㎍의 순수한 코스미드 DNA를 이 방법을 사용하여 수득하였으며, 이것은 세파글라스 정제없이 수득된 DNA의 60-80% 수율을 나타낸다.
부착성 마우스 L-세포 (Earle et al., 1943)의 트랜스펙션은 다음과 같이 수행하였다. 10% 열불활성화된 태아 송아지혈청 (PAA Laboratories), 2mM L-글루타민을 함유하는 DMEM 내에서 증식시킨 약 1×107 세포를 SalI로 선형화된 1㎍의 pWE-TSN DNA와 혼합시키고, 얼음 상에서 10분 동안 배양하였다. DNA는 바이오래드 젠-펄서 (Biorad Gene-Pulser) 내에서 960μF, 250V의 셋팅을 사용하는 전기천공(Chu et al., 1987)에 의해 세포 내로 도입시켰다. 트랜스펙션된 세포를 선택하여 400㎍/㎖ 제네티신 설페이트 (G418; Life Technologies Inc.)를 함유하는 동일배지 내에 유지시켰다. 개개 클론을 클로닝링을 사용하여 분리시켰다 (Freshney, 1994). 벽이 두꺼운 스테인레스강 클로닝 링 (Life Technologies Inc.)을 실리콘 그리스 내에서 고압멸균하고 조직배양 플레이트에 옮겨서 콜로니를 분리시켰다. 트립신 용액 (300㎕의 0.25% 트립신 [pH 7.6] (Difco), 0.25M 트리스-HCl [pH 8.0], 0.4% EDTA [pH 7.6], 0.12M NaCl, 5mM 글루코즈, 2.4 mM KH2PO4, 0.84 mM Na2HPO4.12H2O, 1% 페놀레드)을 가하고, 플레이트를 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 세포를 24 웰 플레이트에 옮기고 클론성 세포주를 확보하였다. 클론은 다음과 같이 보존시켰다. 약 1×107 세포를 원심분리에 의해 수거하여 0.75 ㎖의 동결혼합물 (20% 태아송아지혈청 및 10% DMSO를 함유하는 70% 표준성장배지) 내에 재현탁시키고, 액체질소 저장에 옮기기 전에 1시간 동안 드라이아이스 상에서 급속동결시켰다.
이들 L-세포 클론으로부터 표준방법 (Sambrook et al., 1989)을 사용하여 게놈 DNA를 제조하였다. T75 플라스크 내의 세포를 컨플루언시로(약 4×107) 생장시키고, 배지를 제거하고 플라스크를 PBS (2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4, 0.51mM MgCl2, 136.89 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4 [pH 7.3])로 세척하고, 2 ㎖의 용해완충액 (10 mM 트리스-HCl [pH 7.5], 10mM EDTA, 10mM NaCl, 0.5% SDS, 1㎎/㎖ 프로테이나제-K)을 가하였다. 세포를 배양플라스크로부터 긁어서 탈락시키고 광구경 파이펫 팁을 사용하여 15㎖ 원심분리관에 옮겼다. 용해를 68℃에서 16시간 동안 진행시키고, 그후에 용액을 페놀:클로로포름 (1:1 v/v)으로 1회 추출하고 동용적의 이소프로판올로 DNA를 침전시켰다. 70% 에탄올 중에서 세척한 후에 DNA를 1㎖의 TE 완충액에 재현탁시키고 260㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 평가하였다.
트랜스펙션된 유전자 복사체수는 BglII 소화된 게놈 DNA의 써던 불롯 분석에 의해 결정하였다. 인간 TBP는 C5 유전자 내에 위치하며 TBP 전사개시영역의 4kb 5'이고 4.2kb 단편을 검출하는 특정의 프로브 (1.4HX)를 사용하여 검출하였다 (참조 도 10). 또한, 블럿을 5.2kb 밴드를 제공하며 단일복사체 대조표준으로서 작용 하는 내인성 쥐 vav 좌 (Ogilvy et al., 1998)로부터 유도된 1kb NcoI 단편으로 동시에 프로브하였다. 인간 TBP 트랜스제닉 복사체수는 포스포이메이져에 의한 블럿의 분석 후에 3 복사체 트랜스제닉 마우스주 TLN:8에 의해 수득된 TBP 대 vav 시그날의 비율을 비교함으로써 확인하였다.
총 RNA는 1㎖의 3M LiCl, 6M 우레아 내에서의 선택적 침전에 의해 약 4×107 세포로부터 제조하였다 (Auffrey and Rougeon, 1980; 참조 Antoniou, 1991).
DNase
I 과민성 부위 분석
이것은 전술한 바와 같이 수행하였다 (Forrester et al., 1987; Reitmann et al., 1993). 핵은 약 1×109 K562 세포로부터 제조하였다 (Lozzio and Lozzio, 1975). 수거된 세포를 PBS 중에서 세척하고 4㎖의 빙냉 RSB (10mM 트리스-HCl [pH 7.5], 10mM NaCl, 3mM MgCl2)에 재현탁시켜 헐거운 유봉이 장착된 유리 다운스 (dounce) 균질화기 내에 놓았다. 1㎖의 0.5% NP40/RSB를 첨가한 후에 세포를 10-20 스트록 (stroke) 동안 서서히 균질화시키고, 50㎖의 RSB를 첨가하고 4℃에서 원심분리 (640×g, 5분)함으로써 핵을 회수하였다. 상등액을 버리고 핵을 1mM CaCl2를 함유하는 1㎖의 RSB에 재현탁시켰다. 즉시, 100㎕의 분취액 (약 1×108 핵을 나타냄)을 취하여 후술하는 바와 같이 DNA를 정제하여 분리과정 중의 내인성 뉴클레아제 활성에 대해 조절하였다.
DNase I 소화는 다음과 같이 수행하였다. 0.2㎎/㎖ DNase I (Worthington) 의 분취액 범위 (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10㎕)를 100㎕의 핵을 함유하는 개개 미량원심분리관에 가하여 37℃에서 4분 동안 배양하였다. 100㎕의 2×정지혼합물 (20mM 트리스-HCl [pH 8.0], 10mM EDTA, 600mM NaCl, 1% SDS) 및 10㎕의 프로테이나제-K (10㎎/㎖ 농도)를 첨가하고 55℃에서 60분 동안 배양함으로써 소화를 중지시켰다. DNA를 페놀:클로로포름 (1:1 v/v) 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 샘플을 0.7% 아가로즈/5×TBE 겔 상에서 전기영동하고, 32P-방사성 표지된 프로브를 사용하여 분석을 위해서 사우던 블럿을 수행하였다.
RNA
제조
10-40 주령의 성숙한 마우스를 경부탈구시켜 치사시키고, 전체조직을 분리하여 액체질소 중에서 급속동결시켜 필요할 때 까지 -80℃에서 저장하였다. 총 RNA는 3M LiCl, 6M 우레아 중에서 선택적 침전시킴으로써 제조하였다 (Auffray and Rougeon, 1980). 조직을 1㎖의 LiCl-우레아 용액을 함유하는 14㎖ 관에 옮기고 울트라-투락스 (Ultra-Turrax) T25 (Janke & Kunkel)를 사용하여 30초 동안 균질화시켰다. 그후, 샘플을 30-초 펄스의 초음파처리 (Cole-Parmer Instrument Co., USA)에 3회 적용하고, 균질물을 멸균 미량원심분리관에 옮겨 RNA를 4℃에서 16시간 동안 침전시켰다. RNA를 원심분리 (4℃, 14900×g, 20분)에 의해 수거하여 500㎕의 LiCl-우레아 용액 중에서 세척하고 500㎕의 TES (100mM 트리스-HCl [pH 7.5], 1mM EDTA, 0.5% SDS)에 재현탁시켰다. 페놀:클로로포름으로 추출한 후에, 샘플을 나트륨아세테이트를 사용하여 0.3M로 만들고, 100% 에탄올을 가하여 RNA를 침전시키고 적어도 1시간 동안 -20℃에서 저장하였다. 원심분리에 의해 RNA를 수거하고, 20㎕의 멸균수에 재현탁시켜 260㎚에서의 흡광도에 의해 농도를 평가하였다.
경쟁적
RT
-
PCR
기초 시험
인간
TBP
발현의 분석
변형된 경쟁적 RT-PCR 방법 (Gilliland et al., 1990)을 사용하여 마우스 백그라운드에서 인간 TBP 및 PSMB1 유전자 발현을 정확하게 정량하였다. 트랜스제닉 마우스 조직 또는 세포주로부터 수득한 총 RNA (1㎍)를 1×RT 완충액 (25mM 트리스-HCl [pH 8.3], 25mM KCl, 5mM MgCl2, 5mM DTT, 0.25mM 스페르미딘) 중의 1μM 역전 프라이머 (TB14 또는 C5R)과 함께 10 유니트의 조류 골수아구증 바이러스 (Avian Myeloblastosis Virus; AMV) 역전사효소 (Promega), 10mM DTT, 2.5mM의 각각의 dNTP, 25 유니트의 리보뉴클레아제 억제제 (Fermentas)로 구성된 25㎕의 반응액 중에서 역전사시켰다. cDNA의 합성은 42℃에서 1시간 동안 진행시킨 다음, 이어서 52℃에서 추가로 1시간 동안 진행시키고, 효소를 95℃에서 5분 동안 열불활성화시켰다. PCR 반응은 꼬리 조직생검 선별을 위해 기술되고 문제의 서열에 대한 특정의 프라이머 셋트 (상기에서 상세히 기술한 바와 같으며, 이들 중의 하나는 상술한 프로토콜을 사용하여 말단-표지되었다)를 함유하는 반응혼합물을 사용하여 증폭된 1㎕ cDNA를 함유하였다 프라이머를 2회의 세파덱스-G25 크로마토그라피 (Pharmacia)에 의해 정제하였으며, 80%의 회수율이 추정되었다. PCR 조건은 94℃에서 1분, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 하였으며, 사이클 수는 5 내지 30이 었다.
인간과 마우스 PCR 생성물을 구별하기 위하여 2-10㎕의 각각의 샘플을 5 유니트의 적절한 제한효소와 함께 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이 반응은 대용적 (250㎕)으로 수행하여 PCR 완충액으로부터의 염 및 세정제를 희석시켜 제한효소 활성의 억제를 방지하였다 (대조실험으로 이 경우가 실제임을 입증하였다). 소화 및 미소화된 샘플을 고침전제로서 25㎍의 효모 tRNA (Sigma)의 존재하에서 에탄올 침전시키고, 원심분리에 의해 수거하여 5㎕의 겔부하 완충제 (5mM 트리스-보레이트 [pH 8.3], 1mM EDTA, 7M 우레아, 0.1% 크실렌시아놀, 0.1% 브로모페놀블루)에 재현탁시켰다. 샘플을 변성제로서 7M 우레아 (National Diagnostics) 및 0.5×TBE 완충액의 존재하에 예비 5% 폴리아크릴아미드겔 상에서 분석하였다. 40V/㎝에서 1시간 동안 전기영동한 후에 겔을 절단하여 크실렌시아놀 염료 전방의 아래 쪽에서 나타나는 잔류하는 비혼입 뉴클레오티드를 제거하고, 건조시키고 X-선 필름 또는 포스포이메이져 스크린에 노출시켰다.
인간
hnRNP
A2 발현의 분석
유사한 경쟁적 RT-PCR 방법 (Gilliland et al., 1990)을 사용하여 마우스 백그라운드에서 인간 HnRNP A2 유전자 발현을 정확하게 정량하였다. 역전사시킨 후에, cDNA 샘플을 프라이머 셋트 Hn9 및 Hn12 [5'-CTCCACCATATGGTCCCC-3'] (이들 중의 하나는 상술한 프로토콜을 사용하여 말단-표지되었다)를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 인간 및 마우스 hnRNP A2 PCR 생성물을 구별하기 위하여, 2-10㎕의 각각의 샘플을 5 유니트의 HindIII로 37℃에서 2시간 동안 소화시키고, 정제하여 5% 변성 폴리아크릴아미드겔 상에서 분할하여(resolved) 생성물을 상술한 바와 같이 정량하였다.
클론의 서열화 및 생물정보 분석
TBP (뉴클레오티드 1-9098, 도 20) 및 hnRNPA2 (뉴클레오티드 1-15071, 도 21) 둘다의 HindIII 게놈 클론은 베이스클리어 (Baseclear, Leiden, NL)에 의해 서열화을 하였다. 공지의 서열로 만들어진 프라이머를 출발물질로 하는 프라이머 워킹 전략을 이용하여 미지의 서열의 영역인 TBP 뉴클레오티드 1-5642 및 hnRNPA2 뉴클레오티드 1-3686을 생성시켰다.
이들 서열을 이미 공지되어 있는 서열 데이타와 함께 조합한 다음에 생물정보 분석에서 사용하였다.
표준 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 조사를 사용하여 TBP와 hnRNPA2 서열 간의 직접적인 비교를 수행하였다. 이것은 도 19에서 보여지는 바와 같이 몇개의 Alu 반복부 이외에는 상동성이 명백한 영역을 나타내지 않았다. 이들 반복부위를 차폐시키고 GCG 최적 프로그램을 사용한 비교를 수행하여 다음과 같은 두개의 짧은 상동성 영역을 확인하였다:
RNP 3868-3836 : TBP 8971-9003 길이 = 33, 동일성 % = 75.758
RNP 3425-3459 : TBP 9049-9083 길이 = 35, 동일성 % = 74.286
CpG-아일랜드를 또한 확인하였으며 도 19에서 나타내었다. 뉴클레오티드 부위는 다음과 같다:
RNP 4399-5491, 5749-6731
TBP 5285-5648, 6390-6966
서열화 시험은 RNP 및 TBP 유전자의 바로 상부의 부위로부터 더 다량의 서열 데이타를 제공하기 위하여 상술한 바와 같이 수행하였다.
도 20 및 21에 주어진 서열 데이타는 5' HindIII 부위에서 시작하며, 베이스클리어 생성된 서열 및 함께 조합된 것으로 이미 공지된 서열 데이타를 포함한다. TBP 서열의 경우에, 베이스클리어 서열은 대문자로 나타내었다.
이들 서열의 분석으로 이미 특정화된 유전자, HP1H-γ, 또는 RNP 유전자의 상부에 이질염색질 결합된 단백질 H-감마의 존재가 입증되었다 (도 19 및 22). 이 유전자는 또한, 인간 조직 닷트블럿분석 (dot blot analysis)에 의해 도처에서 발현되는 것으로 나타났다 (데이타는 제시되지 않음).
생물정보 분석 및 서열 비교로 좌들 사이에 명백한 서열 상동성을 나타나지 않았다. 그러나, 데이타는 도 19에서 요약하여 나타내었다. 여기에서 볼 수 있는 바와 같이, 두개의 좌의 양방향성 프로모터 영역에는 몇개의 잠정적 Sp1 전사인자가 위치한다. CpG 메틸화-없는 아일랜드도 또한 확인되었다. 두개의 좌는 도처에서 발현된 유전자의 클러스터를 함유하는 양방향성 구조를 나타낸다.
hNRNP
A2
EGFP
리포터 구조체의 제작
CMV-EGFP-IRES는 pEGFP-N1 (Clontech)을 KpnI 및 NotI으로 소화시켜 EGFP 서열을 유리시킴으로써 작제하였으며, 그후에 이것을 KpnI 및 그 다음에는 NotI으로 부분적으로 소화된 pIRESneo (Clontech)에 연결시켰다. 이렇게 하여 CMV 프로모터 쪽으로 3' 및 IRESneo 쪽으로 5'인 EGFP 유전자를 갖는 벡터를 생성시켰다 (CMV- EGFP-IRES).
CMV 프로모터를 RNP 프로모터로 치환시켜 도 22에서 RNP로서 언급되어 있는 구조체을 생성시켰다. CMV EGFP-IRES를 AgeI로 소화시키고 T4 DNA 폴리머라제 (50mM 트리스 pH 7.5, 0.05mM MgCl2, 0.05mM DTT, 1mM dNTP, 1u T4 DNA 폴리머라제/㎍ DNA)로 블런트하게 만든 다음, NruI로 절단하여 CMV 프로모터를 유리시켜 EGFP-IRES를 생성시켰다. RNP 프로모터는 프로모터 및 RNPA2 및 HP1H-γ 유전자의 첫번째 엑손을 함유하는 8kb hnRNPA2 HindIII 클론 (8kb Hind BKS)으로부터 분리시켰다. 8kb Hind BKS를 BspEI 및 Tth111I로 절단하고 (630bp 프로모터를 유리시키기 위해서), T4 DNA 폴리머라제로 블런트화시키고, 분리된 RNP 프로모터를 EGFP-IRES에 연결시켰다.
5.5RNP는 EGFP의 발현이 RNP 프로모터의 조절하에서 이루어지도록 8kb Hind BKS 내에 EGFP-IRES 카셋트를 삽입시킴으로서 작제하였다. 후자를 부분적으로 Tth111I로 소화시키고 T4 DNA 폴리머라제에 의해 블런트화시킨 다음, SalI로 소화시켜 RNP 프로모터에 대한 모든 3' 서열을 제거하였다. CMV-EGFP-IRES를 AgeI로 소화시킨 후에 XhoI로 소화시켜 EGFP-IRES 카셋트를 분리하였다. 이것을 그후에 제한된 8kb Hind BKS에 연결시켰다.
5.5CMV는 CMV-EGFP-IRES 카셋트를 8kb Hind BKS 내에 삽입시킨 다음에 RNP 프로모터를 제거함으로써 작제하였다. 8kb Hind BKS를 BspEI 절단하고, 블런트화시킨 다음, SalI로 소화시켜 RNP 프로모터 및 프로모터에 대한 모든 3' 서열을 제 거하였다. NruI 및 XhoI로 소화시켜 CMV-EGFP-IRES로부터 CMV-EGFP-IRES 카셋트를 분리한 다음, 소화된 8kb Hind BKS에 연결시켰다.
약 4 kb의 DNA를 5.5RNP로부터 제거하여 RNP 프로모터 쪽으로 1.5 kb 5'를 남겨 1.5RNP를 생성시켰다. 이것은 5.5RNP를 BamHI로 소화시켜 4, 2.9 및 5 kb의 단편을 생성시킴으로써 이루어졌다. 그후, 2.9 및 5 kb 단편을 분리하여 재연결시켜 2.9 kb 단편이 정확한 배향으로 삽입되었을 때 1.5RNP를 생성시켰다.
5.5RNP 구조체을 RNP 프로모터 쪽으로 hnRNPA2 서열 3' (구조체 7.5 RNP 및 8.5 RNP)를 포함하도록 연장시켰으며, 이 부위는 hnRNPA2의 첫번째 엑손 및 인트론을 포함하였다. 이들 구조체 내에 EGFP-IRES 리포터를 포함시키기 위하여, EGFP 유전자를 갖는 골격 내에 엑손 2의 hnRNPA2 스플라이스 (splice) 수용체 서열을 위치시킴으로써 hnRNPA2의 첫번째 엑손이 EGFP 유전자에 접합할 수 있고, 따라서 EGFP 발현이 RNP 프로모터를 제거할 수 있도록 구동시키는 것이 필요하였다. hnRNPA2 스플라이스 수용체를 포함하는 두개의 구조체을 제조하였으며, 이들은 두번째 엑손 쪽으로 80 bp 및 약 1 kb의 서열 5'를 함유하였으며, 이들 서열은 전체 hnRNPA2 게놈 서열을 포함하는 MA160으로부터 PCR에 의해 수득하였다. 80 bp 서열은 프라이머 [5'ACCGGTTCTCTCTGCAAAGGAAAATACC3'] 및 [5'GGTACCCTCTGCCAGCAGGTCACCTC3']를 사용하여 PCR (20 mM 트리스-HCl pH 8.4, 50 mM KCl, 1 μM 프라이머, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 3.5 ㎍ MA160 DNA, 5U 백금 Taq DNA 폴리머라제)에 의해 분리하였으며, 1 kb 단편은 프라이머 [5'ACCGGTTCTCTCTGCAAAGGAAAATACC3'] 및 [5'GGTACCGAGCATGCGAATGGAGGGAGAGCTCCG3']를 사용하여 분리하였다. 프라이머는 PCR 생성물이 5' 및 3' 말단에 각각 KpnI 및 AgeI 부위를 함유하도록 고안하였다. 그후에 PCR 생성물을 TA 클로닝 벡터 pCR3.1 (Invitrogen) 내에 클로닝하였다.
80 bp 및 1 kb 단편을 KpnI-AgeI 단편으로서 pCR3.1로부터 분리하고, KpnI에 의해 부분적으로 소화시킨 다음 AgeI로 절단한 CMV-EGFP-IRES에 연결시켜 EGFP 유전자와 스플라이스 수용체 (SA)의 골격내 융합물을 생성시켰다.
7.5RNP는 8 kb Hind BKS를 ClaI로 소화시키고 T4 DNA 폴리머라제로 평활화시킨 다음, SalI로 소화시킴으로써 작제하였다. 80 bp SA-EGFP-IRES 카셋트는 KpnI 부분소화에 이어서 T4 DNA 폴리머라제에 의한 평활말단화 및 XhoI 소화에 의해 분리하였다. 이것을 ClaI-SalI 소화된 8 kb Hind BKS에 연결시켰다.
8.5RNP는 8 kb Hind BKS의 SphI 부분소화에 이어서 SalI에 의한 소화에 의해 작제하였으며, 1 kb SA-EGFP-IRES 카셋트는 SphI 부분소화에 이어서 XhoI에 의한 제한에 의해 유사하게 분리되었다. 이 카셋트를 8 kb Hind BKS에 연결시켜 8.5RNP를 생성시켰다.
4.0CMV는 BamHI/HindIII/BstEII 소화에 의해 8 kb Hind BKS로부터 4 kb 단편을 절단함으로써 작제하였다. 그후, 단편의 말단을 클레노우 (Klenow) 및 T4 DNA 폴리머라제에 의해 말단-충전시켰다.
pEGFP-NI (Clontech)을 AseI로 선형화시키고, 말단을 상술한 바와 같이 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 그후 두개의 단편 을 밤새 연결시켰다.
p7.5CMV는 HindIII 소화에 의해서 p8kb Hind BKS로부터 8.3 kb 단편을 절단함으로써 작제하였다. 그후, 단편의 말단을 클레노우 및 T4 DNA 폴리머라제로 말단충전시켰다. pEGFP-NI (Clontech)를 AseI로 선형화하고 말단을 상술한 바와 같이 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 그후, 두개의 단편을 밤새 연결시켰다. 생성된 클론을 8.3 kb UCOE 삽입물의 정 및 역배향 둘다에 대해 선별하였다.
p16CMV는 SalI 소화에 의해서 MA551 (전체 코드화 부분 (도 13c에 도시된 16 kb 단편)을 포함하는 5 kb 5' 및 1.5 kb 3' 서열을 함유하는 hnRNPA2 게놈 클론)로부터 16 kb 단편을 절단함으로써 작제하였다. 그후, 단편의 말단을 클레노우 및 T4 DNA 폴리머라제로 말단충전시켰다. pEGFP-NI (Clontech)를 AseI로 선형화하고 말단을 상술한 바와 같이 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 그후, 두개의 단편을 밤새 연결시켰다. 생성된 클론을 16 kb UCOE 삽입물의 정 및 역배향 둘다에 대해 선별하였다.
CHO
트랜스펙션
CHO 세포는 무혈청 배지 내에서 2×107 세포/㎖로 수거하였다. 트랜스펙션 당, 1×107 세포 (0.5 ㎖)를 1 ㎍ (5 ㎕)의 선형 DNA 및 50 ㎍ (5 ㎕)의 연어정자 캐리어 DNA와 함께 사용하였다. DNA 및 세포를 혼합하여 10분 동안 얼음위에 방치하였다. 세포를 975 uF/250 V에서 바이오래드 젠펄서 (BioRad Gene Pulser) IITM을 사용하여 전기천공시킨 다음, 10분 동안 얼음위에 방치하였다. 그후, 혼합물을 10 ㎖의 완전배지 (HF10) 상에 적층시키고 1400 rpm에서 5분 동안 회전시켰다. 상등액을 제거하고, 펠릿을 5 ㎖의 HF10에 재현탁시켰다. 그후, 세포를 10 ㎝ 디쉬에 5×104 또는 1×104의 비율 및 T225 플라스크 당, 2×106의 비율로 도말하였다. 24시간 후에, 세포를 우선 300 ㎍/㎖ G418에서 선택한 다음, 4일 후에 600 ㎍/㎖ G418에서 선택하였다. 트랜스펙션시킨지 10일 후에 콜로니를 메틸렌블루 (50% 에탄올 중에서 제조된 2% 용액)로 염색하여 계수하였다. 한쌍의 플레이트를 제한된 저장물로서 또는 단일 세포클론으로서 배양물 중에 유지시켰다.
트랜스펙션된
CHO
클론 내에서
GFP
발현의 분석
트랜스펙션된 세포를 600 ㎍/㎖에서 G418 선택에 대해 유지시켰다. 세포를 GFP 발현분석을 위해서 6-웰 플레이트로부터 떼어내었다. 세포를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS; Gibco)로 세척하여, 이들이 플레이트의 표면으로부터 떨어질 때 까지 트립신/EDTA (Sigma) 중에서 배양하였다. 10% 태아송아지혈청 (FCS; Sigma)이 보충된 과량의 영양소 혼합물 F12 (HAM) 배지 (Gibco)를 세포에 가하고, 세포를 5 ㎖ 폴리스티렌 환저관에 옮겼다. 그후, 세포를 모세포 집단의 자가형광과 비교하여 GFP 발현을 검출하기 위해서 벡톤-디킨슨 (Becton-Dickinson) FAC스캔 상에서 분석하였다. 19개의 RNP 클론, 24개의 5.5RNP 클론, 21개의 CMV 클론 및 12개의 5.5CMV 클론을 분석하였으며, 평균은 양성클론의 형광 중앙값으로 채택하였다.
트랜스펙션된
CHO
저장물
내에서
GFP
발현의 분석
G418에 대한 선택이 수행된 트랜스펙션된 CHO 세포의 콜로니를 T225 조직배양 플라스크로부터 떼어내어, 10 ㎝ 페트리디쉬 상에 약 100 콜로니/플레이트가 제공되도록 도말하였다. 콜로니가 성장하면, 세포를 떼어내고 이 트랜스펙션된 세포의 제한된 저장물을 GFP 발현에 대하여 분석하였다. GFP 발현은 매 3-4일 마다 저장물을 1:10으로 나누어서 규칙적 기준으로 모니터하였다. 세포는 항상 분석하기 전날에 24-웰 플레이트로 분할하여 세포가 분석 당일에 약 50% 유합하도록 하였다. 그후, 세포를 24-웰 플레이트로부터 떼어내고, 전항목에서와 동일한 방식으로 분석하였다. 시간에 따른 발현의 경우에는, 단지 작은 비율의 양성 세포클러스터 만을 함유하는 마커부분 (M1)을 고정시키고 초기수준으로부터 시간의 경과에 따른 GFP 발현의 손실을 조사하기 위해서 사용하였다.
단일/
저복사체수
통합체 (
integrant
)의
FISH
분석
40
kb
TBP
코스미드
pWE
-
TSN
또는
pBL3
-
TPO
-
puro
를 사용한
FISH
분석
DMEM-10% 태아송아지혈청 중에서 성장한 마우스 Ltk-세포를 40 kb TBP 코스미드 pWE-TSN (도 9) 또는 25 kb 플라스미드 pBL3-TPO-puro를 사용하여 전기천공시켰다. 트랜스펙션체는 200 ㎎/㎖ G418 (TSN) 또는 5 ㎎/㎖ 푸로마이신 (TPO)을 사용하여 선택하였으며, 단일 또는 저복사체 클론을 개략적으로 전술한 바와 같이 생성시켰다. 선택된 클론으로부터 대수적으로 성장하는 세포를 수거하기 전에 1 시간 동안 0.4 ㎎/㎖ 콜히친으로 처리하였다. 그후, 세포를 0.056 M KCl 중에서 저장성으로 팽윤시키고 3:1 메탄올-아세트산 중에서 고정시키고, 현미경 슬라이드 상에 전연시켜 중기 염색체를 수득하였다. 슬라이드를 2×SSC (1×SSC는 0.15 M NaCl, 0.015 M 나트륨시트레이트이다) 중의 100 ㎎의 RNaseA/㎖로 37℃에서 1시간 동안 전처리하고, 2×SSC 중에서 세척하여 일련의 에탄올 탈수과정 (70, 90 및 100% 에탄올)을 거치게 하였다. 염색체를 70% 포름아미드-2×SSC 중에서 70℃에서 5분 동안 변성시키고, 빙냉 70% 에탄올에 도입시켜, 앞에서와 같이 탈수시켰다. 100 ng의 TBP 프로브 (TBP 유전자를 함유하는 25 kb의 인간 게놈 DNA를 수반하는 전체 TPO 플라스미드) 및 50 ng의 마우스 감마-위성 프로브 (문헌 [Horz et al., Nucl. Acids Res. 9: 683-696, 1981]에 기술된 바와 같음)를 제조자의 지침에 따라 닉해독 (Boehringer)에 의해 각각 디곡시게닌-11-dUTP 및 비오틴-16-dUTP로 표지하였다. 표지된 프로브를 1 ㎎의 cot-1 DNA 및 5 ㎎의 청어정자 DNA로 침전시키고, 50% 포름아미드-2×SSC-1% 트윈 20-10% 텍스트란 설페이트에 재현탁시키고, 75℃에서 변성시킨 다음, TBP 프로브를 37℃에서 30분 동안 전어니일링시키고, 모아서 슬라이드에 적용하였다. 혼성화는 37℃에서 밤새 수행하였다. 슬라이드를 45℃에서 50% 포름아미드-2×SSC 중에서 매회 3분 씩 4회, 45℃에서 2×SSC 중에서 매회 3분 씩 4회, 및 60℃에서 0.1×SSC 중에서 매회 3분 씩 4회 세척하였다. 4×SSC-0.1% 트윈 20 중에서 5분 동안 세척한 후에 슬라이드를 4×SSC-5% 저지방 탈지유 중에서 5분 동안 차단시켰다. 비오틴 표지된 프로브는 다음 각각과 함께 37℃에서 30분 배양함으로써 검출하였다: 아비딘-컨쥬게이트된 텍사스레드 (Vector Laboratories Inc., USA), 이어서 비오티닐화 안티-아비딘 (Vector Laboratories Inc., USA) 및 아비딘-컨쥬게이트된 텍사스레드 (Vector Laboratories Inc., USA). 디곡시게닌-표지된 프로브는 다음 각각을 사용하여 비오틴 검출과 동시에 검출하였다: 안티- 디곡시게닌-플루오레세인 (FITC, Boehringer), 이어서 마우스 안티-FITC (DAKO) 및 말 플루오레세인-컨쥬게이트된 안티-마우스 IgG (Vector Laboratories Inc., USA). 매 두개의 배양 사이에, 슬라이드를 매회 2분 씩, 4×SSC-0.1% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 슬라이드를 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 대비염색하고 벡타쉴드 (Vectashield) (Vector Laboratories Inc., USA)에 장착하였다. 이메지 (image)는 형광현미경 상에서 오일 100× 대물렌즈를 사용하여 검사하였다. 이메지는 포토메트릭스 (Photometrics) 냉각된 전하-커플 장치 카메라 및 바이시스 스마트캡쳐 (Vysis Smartcapture) 소프트웨어를 사용하여 포착하였다.
16
RNP
-
EGFP
구조체을
사용한
FISH
분석
16RNP-EGFP 벡터는 EGFP-IresNeo 발현카셋트 및 8.5RNP로부터의 일부의 RNP 5' 서열을 MA551에 삽입시킴으로써 작제하였다. 8.5RNP를 XhoI로 소화시키고 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단으로 만든 다음, PacI로 소화시키고, 생성된 단편을 NheI로 절단되고 평활말단으로 만든 다음 PacI로 소화시킨 MA551에 연결시켰다. 8.5RNP 발현에 따라 RNP 프로모터가 제거되어 RNP의 엑손 1과 EGFP의 골격내 융합물이 생성된다.
16 RNP - EGFP로 트랜스펙션된 마우스 LTK 세포의 클론을 DMEM-10% 태아송아지혈청 및 200 ㎍/㎖ G418 내에서 성장시켰다. 대수적으로 성장하는 세포를 수거하기 전에 1시간 동안 0.4 ㎍/㎖ 콜히친으로 처리하였다. 세포를 0.056 M KCl 중에서 저장성으로 팽윤시키고 3:1 메탄올-아세트산 중에서 고정시키고, 현미경 슬라이드 상에 전연시켜 중기 염색체를 수득하였다. 슬라이드를 2×SSC (1×SSC는 0.15 M NaCl, 0.015 M 나트륨시트레이트이다) 중의 100 ㎍의 RNase A/㎖로 37℃에서 1시간 동안 전처리하고, 2×SSC 중에서 세척하여 일련의 에탄올 탈수과정 (70, 90 및 100% 에탄올)을 거치게 하였다. 염색체를 70% 포름아미드-2×SSC 중에서 70℃에서 5분 동안 변성시키고, 빙냉 70% 에탄올에 도입시켜, 앞에서와 같이 탈수시켰다. 100 ng의 16 RNP - EGFP 및 50 ng의 마우스 감마-위성 프로브 (Horz et al., Nucl. Acids Res. 9: 683-696, 1981)를 제조자의 지침에 따라 닉해독 (Boehringer)에 의해 각각 디곡시게닌-11-dUTP 및 비오틴-16-dUTP로 표지하였다. 표지된 프로브를 5 ㎍의 청어정자 DNA로 에탄올 침전시키고 RNP 프로브를 1 ㎍의 cot-1 DNA로 침전시켜 50% 포름아미드-2×SSC-1% 트윈 20-10% 텍스트란 설페이트에 재현탁시키고, 75℃에서 변성시킨 다음, RNP 프로브를 37℃에서 30분 동안 전어니일링시키고, 모아서 슬라이드에 적용하였다. 혼성화는 37℃에서 밤새 수행하였다. 슬라이드를 45℃에서 50% 포름아미드-2×SSC 중에서 매회 3분 씩 4회, 45℃에서 2×SSC 중에서 매회 3분 씩 4회, 및 60℃에서 0.1×SSC 중에서 매회 3분 씩 4회 세척하였다. 4×SSC-0.1% 트윈 20 중에서 5분 동안 세척한 후에 슬라이드를 4×SSC-5% 저지방 탈지유 중에서 5분 동안 차단시켰다. 비오틴은 다음 각각과 함께 37℃에서 30분 배양함으로써 검출하였다: 아비딘-컨쥬게이트된 텍사스레드 (Vector Laboratories), 이어서 비오티닐화 안티-아비딘 (Vector Laboratories) 및 아비딘-컨쥬게이트된 텍사스레드 (Vector Laboratories). 디곡시게닌은 다음 각각을 사용하여 비오틴 검출과 동시에 검출하였다: 안티-디곡시게닌-플루오레세인 (FITC, Boehringer), 이어서 마우스 안티-FITC (DAKO) 및 말 플루오레세인-컨쥬게이트된 안티-마우스 IgG (Vector Laboratories). 매 두개의 배양 사이에, 슬라이드를 매회 2분 씩, 4×SSC-0.1% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 슬라이드를 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 대비염색하고 벡타쉴드 (Vector)에 장착하였다. 이메지는 올림푸스 (Olympus) BX-40 형광현미경 상에서 오일 ×100 대물렌즈를 사용하여 검사하였다. 이메지는 포토메트릭스 냉각된 전하-커플 장치 카메라인 및 바이시스 스마트캡쳐 소프트웨어를 사용하여 포착하였다.
복사체수
결정
게놈 DNA는 표준방법 (Sambrook et al., 1989)에 의해 세포 클론으로부터 제조하였다. 트랜스펙션된 유전자 복사체수는 HincII 소화된 게놈 DNA의 써던 불롯 분석에 의해 결정되었다. 트랜스젠은 제조자의 치침에 따라 [α-32P] dCTP로 표지 (Megaprime DNA labelling system, Amersham)된 네오마이신 내성유전자를 함유하는 16RNP-EGFP로부터의 1 kpb 단편에 혼성화시킴으로써 2.5 kbp 밴드로서 검출되었다. 규격화를 위해서, 블럿을 상기와 같이 표지되고 1.4 kbp 밴드를 제공하는 쥐 vav 좌 (Ogilvy et al., 1998)로부터 유도된 1 kbp NcoI 단편과 동시에 혼성화시켰다. 복사체수 표준으로서, 몇개의 pWE-TSN 클론으로부터의 DNA를 PstI으로 소화시키고 상기의 프로브에 혼성화시켰다. 혼성화 시그날의 정량은 사이클론 포스포이메이져 (Cyclone PhosphorImager; Packard)을 사용하여 수행하였다.
트랜스펙션된
Ltk
클론 내에서
GFP
발현의 분석
트랜스펙션된 세포를 200 ㎍/㎖에서 G418 선택에 대해 유지시켰다. 80-100% 컨플루언시인 세포를 GFP 발현분석을 위해서 6-웰 플레이트로부터 떼어내었다. 세포를 PBS로 세척하여, 이들이 플레이트의 표면으로부터 떨어질 때 까지 트립신/EDTA (Sigma) 중에서 배양하였다. 10% 태아송아지 혈청 (Sigma)이 보충된 과량의 DMEM (Gibco)을 세포에 가하고, 5 ㎖ 폴리스티렌 환저관에 옮겼다. 그후, 세포를 비트랜스펙션된 대조군의 자가형광과 비교하여 GFP 형광을 측정하기 위해서 벡톤-디킨슨 FAC스캔 상에서 분석하였다.
EBV
리포터 구조체의 생성
사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 및 시미안 바이러스 40 (SV40) 폴리아데닐화 서열을 함유하는 DNA 단편을 제조자가 추천한 조건 (NEB)을 사용하여 AseI 및 AflII에 의한 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 벡터 pEGFP-NI (Clontech)로부터 분리하였다. DNA를 0.5% 아가로즈겔 상에서 전기영동하여 벡터 골격으로부터 단편을 분리시켰다. DNA 단편을 겔로부터 절단해 내고 표준 유리우유 정제기술을 사용하여 겔 절편으로부터 정제하였다. 단편을 제조자의 조건에 따라 T4 DNA 폴리머라제 (NEB)를 사용하여 평활말단으로 만들고, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (25:24:1)로 1:1 (v/v) 추출하고 이어서 에탄올 침전시킴으로써 정제하였다.
그후, 리포터 카셋트를 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus; EBV) 벡터 p220.2 (국제특허출원 제 WO 98/07876호에 기술됨)에 클로닝시켰다. p220.2를 HindIII (벡터의 다중 클로닝 서열 (MCS) 내의 독특한 부위)로 제한 엔도뉴클레아제 소화시키고, 평활말단으로 만들어 상술한 바와 동일한 방식으로 정제하였다. 리포터 카셋트를 T4 DNA 리가제 (Promega)를 사용하여 p220.2에 연결시켰다. 연결반응은 1×연결완충액 (Promega) 중에서 200 ng의 선형화된 p220.2 및 몰당량 또는 5 몰과량의 CMV-EGFP-SV40pA 단편을 사용하여 10 ㎕ 용적으로 수행하였다. 반응액을 실온에서 밤새 배양하였다. 2,5 ㎕의 연결반응액을 2.5 kV, 400 Ω, 25 μF에서 전기천공하고 이어서 900 ㎕의 SOB 배지를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써 전기수용성 (electrocompetent) DH5α E.coli 세포에 형질전환시켰다. 200 ㎕의 형질전환체 각각을 LB-암피실린 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
생성된 콜로니를 제조자의 표준조건으로 Taq 폴리머라제 (Advanced Biotechnologies)를 사용하여 CMV 및 EGFP 서열 내의 DNA 프라이머에 의한 콜로니 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 리포터 카셋트의 존재에 관하여 선별하였다. 양성 콜로니를 LB-암피실린 배지에서 밤새 성장시키고 알칼리성-용해 DNA 미니제제 (Qiagen)로서 분석하였다. DNA는 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 소화를 사용하여 단편의 정확한 배향에 관하여 선별하였다. 생성된 구조체은 p220.EGFP로 명명하였다.
p220.EGFP는 K562 세포내로 전기천공시킨 후에 후술하는 것과 필수적으로 동일한 방법을 사용하여 벡톤-디킨슨 FAC스캔 상에서 분석함으로써 EGFP를 발현하는 것으로 입증되었다.
hnRNPA2
16
kb
(
RNP16
)
UCOE
단편을 함유하는
EBV
리포터 구조체의 생성
SalI 부위를 SalI에 의한 벡터의 부분 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해서 p220.EGFP로부터 분리시키고, 이어서 평활말단화시키고 벡터를 재연결시킴으로써 벡터의 다중 클로닝부위 (MCS) 내에 16 kb RNP 단편의 클로닝을 위해 이용될 수 있는 독특한 SalI 부위를 남기게 된다. 생성된 벡터를 SalI로 제한 엔도뉴클레아제 소화시키고, 송아지 장포스파타제로 처리하고 (연결반응 중에 벡터의 재환형성을 방지하기 위함), 페놀:클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다.
16 kb RNP 단편을 제한 엔도뉴클레아제 SalI를 사용하여 벡터 MA551로부터 분리시키고, 평활말단으로 만들어 전기용출에 의해 정제하고 선형화된 벡터에 연결시켰다. 연결반응은 전술한 바와 동일한 방식으로 설정하고 (동몰량의 단편을 사용), 이어서 형질전환시키고 단편의 존재에 관하여 콜로니를 선별하였다. 콜로니는 DNA 미니제제로서 선별되었으며, 양성 콜로니는 아가로즈겔 전기영동 분석에 의해서 확인되었다. 16 kb RNP 단편의 정확한 배향은 NotI를 사용한 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의해서 결정하였다. 생성된 구조체은 p220.RNP16으로 명명하였다.
Hela
세포 내로
EBV
리포터 구조체의
트랜스펙션
Hela 세포를 국제특허출원 제 WO 98/35984호에 기술되고 후술하는 CL22 펩타이드-매개된 전달시스템을 사용하여 6-웰 플레이트 내에서 p220.EGFP 및 p220.RNP16으로 트랜스펙션시켰다. 24시간 동안 배양한 후에, 하이그로마이신 B (Calbiochem) 선택을 400 ㎍/㎖의 최종농도로 가하였다. 세포의 하이그로마이신 B-내성 콜로니를 배양액 중에 유지시키고 벡톤-디킨슨 FAC스캔 상에서 GFP 발현에 관하여 주기적으로 분석하였다. 세포는 분석하기 전날에 24-웰 플레이트에 통상적으로 분할하여 가해서 이들이 시험 당일에 약 50% 컨플루언시가 되도록 하였다. 시간에 따른 발현의 경우에는, 세포의 GFP-발현 집단을 함유하는 마커부분을 고정시켰으며, 이 마커를 사용하여 시간의 경과에 따른 GFP 발현의 안정성을 조사하였다. 트랜스펙션된 Hela 세포는 또한 하이그로마이신 B 선택을 제거하여, 선택압력 없이 UCOE의 부재/존재 하에서 GFP 발현의 안정성을 조사하였다.
CET200
의
클로닝
PEGFPN1을 NheI/NotII로 제한시키고 다음과 같은 올리고를 어니일링시키고 삽입시켜 다중 클로닝부위 (MCS)를 생성시켰다:
5'CTAGCGTTCGAAGTTTAAACGC3'
5'GGCCGCGTTTAAACTTCGAACG3'
생성된 플라스미드를 AseI로 제한시키고 평활말단화하여, 8.3 kb HindIII 단편 평활말단화된 RNP A2 단편을 삽입하였다. 그후, 생성된 배향을 측정하여 최종 벡터 CET200을 생성시켰다 (참조 도 49).
CET201
의
클로닝
pUC19를 EcoRI/ArI로 제한시키고 하나의 PvuI 부위를 제거하여 평활말단화시켜 선형화를 위한 독특한 PvuI 부위를 생성시켰다 (pUC19Δ). MCS는 NheI/AgeI로 소화시킴으로써 pEGFN1로부터 분리시키고 평활말단화하였다. 이것은 NheI 부위를 생성시킨다. CMV EGFP SV40 카셋트를 AflII-평활 AseI 단편으로서 분리하여 PvuII로 제한된 pUC19Δ에 삽입시키고, NdeI에 의해 pGK puro bGH (pGK-puro-BKS로부터)를 삽입하였다. 그후, 생성된 벡터를 NheI/NotI로 제한하여 EGFP를 제거하고 상술한 바와 같이 MCS를 삽입시켰다. 그후, MCS 함유 벡터를 HindIII로 제한하고 8.3 kb RNP HindIII 단편을 삽입시켜 최종 벡터 CET210을 생성시켰다 (참조 도 49).
UCOE
를 함유하는 플라스미드의 제조
RNP
-
UCOE
함유 리포터 구조체의
클로닝
p8kb Hind BKS는 RNPA2 및 HP1H-γ 유전자의 프로모터 및 첫번째 엑손를 함유하는 RNP 좌의 8.3 kb HindIII 게놈 단편을 함유하였다.
pCMV EGFP-IRES는 pEGFP-NI (Clontech, CMV-EGFP와 동일, 도 35)를 KpnI 및 NotI로 소화시켜 EGFP 서열을 유리시킴으로써 작제하였으며, 이것은 그후에 KpnI 및 그후에 NotI로 부분적으로 소화된 pIRESneo (Clontech) 내에 연결시켰다. 이렇게하여 CMV 프로모터 쪽으로 EGFP 유전자 3' 및 IRESneo 쪽으로 5'를 갖는 벡터를 생성시켰다.
인트론A-CMV는 NruI (평활절단제) 및 HindIII를 사용해서 pTX0350 (pUC 기본 CMV 인트론A-MAGE1 플라스미드)으로부터 1.5 kb 인트론A-CMV 단편을 취하여 클로닝하였다. pEGFP-NI를 AseI로 소화시킨 다음, 단편의 말단을 클레노우 및 T4 DNA 폴리머라제로 말단충전시켰다. 그후, 이것을 HindIII로 소화시켜 4.2 kb 단편을 수득하였다. 그후에 두개의 단편은 밤새 연결시켰다.
p4.0CMV는 BamHI/HindIII/BstEII 소화에 의해서 p8kb Hind BKS로부터 4 kb 단편을 절단함으로써 작제하였다. 그후, 단편의 말단을 클레노우 및 T4 DNA 폴리머라제로 말단-충전시켰다.
pEGFP-NI (Clontech)는 AseI로 선형화하여 말단을 상술한 바와 같이 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 그후, 두개의 단편 을 밤새 연결시켰다. 생성된 클론을 4 kb UCOE 삽입물의 정 및 역 배향에 대해 선별하였다.
p7.5CMV는 HindIII 소화에 의해서 p8kb Hind BKS로부터 8.3 kb 단편을 절단함으로써 작제하였다. 그후, 단편의 말단을 클레노우 및 T4 DNA 폴리머라제로 말단-충전시켰다. pEGFP-NI (Clontech)는 AseI로 선형화하여 말단을 상술한 바와 같이 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 그후, 두개의 단편을 밤새 연결시켰다. 생성된 클론을 8.3 kb UCOE 삽입물의 정 및 역 배향에 대해 선별하였다.
p16CMV는 SalI 소화에 의해서 MA551 (전체 코드화 부분을 포함하여 5 kb 5' 및 1.5 kb 3' 서열을 함유하는 hnRNPA2 게놈 클론)로부터 16 kb 단편을 절단함으로써 작제하였다. 그후, 단편의 말단을 클레노우 및 T4 DNA 폴리머라제로 말단-충전시켰다. pEGFP-NI (Clontech)는 AseI로 선형화하여 말단을 상술한 바와 같이 평활말단으로 만든 다음, 송아지 장포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 그후, 두개의 단편을 밤새 연결시켰다. 생성된 클론을 16 kb UCOE 삽입물의 정 및 역 배향에 대해 선별하였다.
CL22
펩타이드를
사용한
HeLa
세포의
트랜스펙션
CL22 펩타이드는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다:
NH2-KKKKKKGGFLGFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK-COOH
CL22 펩타이드는 WO 98/35984에 기술된 방법에 따라서 트랜스펙션제로서 사 용되었다.
HeLa 세포를 매 3 내지 4 일 마다 컨플루언시 플라스크를 1:10으로 분할하면서 EF10 배지 중에서 통상적으로 배양하였다. 트랜스펙션시키기 24시간 전에 세포를 웰 (6-웰 플레이트) 당, 5×104의 비율로 접종하였다. 트랜스펙션시키기 1시간 전에 Hepes 완충된 식염수 (10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl) 중에서 각각 40 ㎍/㎖ 및 80 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 DNA:CL22를 동용적으로 혼합시켜 복합체를 형성시키고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포로부터 배지를 제거한 다음, 1% 포스페이트 완충된 식염수로 세척하였다. 그후, 세포에 2.5 ㎍의 DNA:복합체 (125 ㎕)를 가하고, 120 μM의 클로로퀸 최종농도를 제공하는 RAQ (RPMI 배지 (Sigma), 0.1% 인간 알부민, 137 μM 클로로퀸 (신선하게 첨가))로 용적을 1 ㎖로 만들었다. 세포와 복합체를 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그후, 복합체를 제거하고 EF10 배지 (최소필수배지 (Sigma), 10% 태아송아지혈청, 100 유니트/㎖ 페니실린/0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 1×비필수 아미노산 (Sigma))로 대체시켰다.
트랜스펙션된
HeLa
세포 내에서
GFP
발현의 분석
세포를 GFP의 발현분석을 위해서 6-웰 플레이트로부터 떼어내었다. 세포를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS; Gibco)로 세척하고, 이들이 플레이트의 표면으로부터 떨어질 때 까지 트립신/EDTA (Sigma) 중에서 배양하였다. 10% 태아송아지혈청 (FCS; Sigma)이 보충된 과량의 EF 배지 (Gibco)를 세포에 가하고, 세포를 5 ㎖ 폴리스티렌 환저관에 옮겼다. 그후, 세포를 모세포클러스터의 자가형광과 비교하 여 GFP 발현을 검출하기 위해서 벡톤-디킨슨 FAC스캔 상에서 분석하였다.
총
DNA
샘플의 제조
트랜스펙션된 클러스터의 에피좀성 DNA 함량을 조사하기 위하여 세포성 DNA의 총제제를 제조하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 용해완충액 [10 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM NaCl, 및 신선한 프로테이나제 K 1 ㎎/㎖ F/C가 첨가된 0.5% 사르코실]으로 용해시켰다. 세포용해물을 플레이트로부터 긁어내어 광구경 파이펫을 사용해서 에펜도르프관에 옮겼다. 밤새 65℃에서 배양한 후에 세포용해물을 페놀/클로로포름 추출하고 에탄올 침전시켰다. DNA 펠릿은 TE pH 8.0에 재현탁시켰다.
총게놈
DNA
샘플 내에서
에피좀성
DNA
의 검출
트랜스펙션된 세포로부터 트랜스펙션시킨지 7일 후에 제조된 총게놈 DNA를, 트랜스펙션에 사용된 DNA 구조체 및 이에 따라 샘플 내에 존재하는 에피좀성 DNA를 선형화시키는 엔도뉴클레아제를 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 소화시켰다. Apa LI (NEB)는 모사 CMV-EGFP, 인트론A-CMV 및 4.0CMV 정방향 및 역방향 샘플을 위해서 사용하였다. 7.5CMV 정방향 및 역방향 샘플을 위해서는 BspLU11I (Boehringer)를 사용하였다. 10 ㎕ (샘플의 20%)의 총게놈 DNA를 제조자가 추천한 조건에 따라 30 유니트의 제한 엔도뉴클레아제로 16시간 동안 소화시켰다. 샘플을 100 pg 또는 4 ng의 선형화된 플라스미드 대조군과 함께 0.6% 아가로즈겔 상에서 400 볼트/시간으로 전기영동하였다. 그후, 겔을 써던 불롯에 의해 하이본드 (Hybond)-N 혼성화 전달막 (Amersham)에 옮겼다. 간략하면, 겔을 0.25 M HCl 중에서 15분 동안 배양 하여 DNA를 탈퓨린화시키고, 이어서 1.5 M NaCl/0.5 M NaOH 중에서 45분 동안 변성시킨 다음, 1.5 M NaCl/0.5 M 트리스-Cl, pH 7.0 중에서 45분 동안 중화시켰다. 그후, DNA를 20×SSC (3 M NaCl, 0.3 M Na3시트레이트-2H2O, pH 7.0) 중에서 16시간 동안 모세관 블럿형성에 의해 겔로부터 막으로 옮겼다. 필터를 1시간 동안 공기건조시키고, 1200의 에너지 셋팅에서 UVP CL-100 자외선 교차결합제 (GRI)를 사용하여 2분 동안 교차결합시켰다. 막은 "쳐치 (Church) 혼성화 조건"을 사용하는 방사성 EGFP 프로브를 사용하여 프로브화하였다. 막을 65℃에서 2시간 이상 동안, 0.5 M NaPi pH 7.2, 1% SDS 중에서 전혼성화시켰다. DNA의 EGFP 단편을 BglII/NotI (NEB)에 의한 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 pEGFP-NI (Clontech)로부터 분리시키고, 전기영동에 의해 분리하고, GFXTM PCR DNA 및 겔밴드 정제키트 (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 겔 절편으로부터 정제하였다. 50 ng의 EGFP 단편을 메가프라임 DNA 표지키트 (Amersham)를 사용하여 α-32P dCTP (3000 Ci/mmol; Amersham)로 표지하였다. 표지된 프로브를 100 ㎕의 100 ㎎/㎖ 연어정자 DNA와 혼합시키고, 95℃에서 10분 동안 배양하여 얼음위에 놓은 다음 혼성화에 첨가하였다. 막을 65℃에서 16시간 동안 예비-혼성에서 40 mM NaPi pH 7.2, 1% SDS 중에서 30분 씩 2회 세척하였다. 그후, 방사성표지된 막을 초분할(super resolution) 포스포르 스크린에 노출시킨 후에 사이클론 저장 포스포르 시스템 (Cyclone storage phosphor system; Packard) 상에서 분석하였다.
형광현미경검사
6-웰 플레이트에서 배양된 트랜스펙션된 세포를 자이스 악시오버트 (Zeiss Axiovert) S100 전환현미경 (inverted microscope)을 사용하여 형광하에서 관측하였다. 사진술은 처음부터 끝까지 자이스 (Zeiss) MC100 카메라 및 후지크롬 프로비아 (Fujichrome Provia) 400ASA 필름을 사용하여 규칙적인 시점에서 수행하였다.
실시예
1
인간
TBP
유전자 좌의 분석
TBP
유전자 도메인
맵핑
인간 TBP 유전자는 길이가 20kb(Chalut 등 1995) 이고, 염색체 6q27-tel 위에 위치하며(Heng 등, 1994), 도처에 있는 프로테오좀(proteosome)의 일부를 형성하는 단백질 C5를 코드하는 유전자에 밀접하게 연결된다(도 1a 및 c; Trachtulec, Z 등, 1997). C5 유전자는 TBP의 캡 부위로부터 위쪽으로 1kb 부위로부터 분기하여 전사된다. TBP 및 C5는 그 결과 이중의 프로모터를 포함한다. 이러한 사실은 TBP에 기초한 발현 벡터의 구조에 관해서는 매우 중요한 결과인데, 이중 프로모터는 양방향 모두에서 동일한 능률로 작용할 필요가 없기 때문이다(Gavalas and Zalkin, 1995 참조).
서열 분석을 통해 TBP/C5 프로모터 영역은 3.4kb의 메틸화-없는 CpG-아일랜드 내에 포함되는 것을 알아냈다. 이것은 C5의 인트론 1의 FspI 및 TBP의 인트론 1 내의 HindⅢ로부터 연장되고, 상기 두 개의 유전자의 전사 시작 부위 사이의 1.4kb 영역뿐만 아니라 상기 두 개의 유전자의 첫 번째 인트론의 대부분의 5' 1kb 서열을 포함한다(도 1b).
인간 TBP 유전자 좌는 3개의 밀접하게 연결된 유전자로 이루어진다. PSMB1 유전자(또한 본 명세서에서는 C5로 칭함)는 TBP의 캡 부위로부터 위쪽으로 1kb 부위에서 분기하여 전사된다. 최근 확인된 유전자의 3' 말단인 PDCD2는 TBP의 아래쪽 5kb에 위치한다. 이들 3개의 전사 유니트는 총 50kb를 만들어 내었다. 중심립 방향으로 PSMB1 유전자의 아래쪽으로는 알 수 없는 구조 유전자를 갖는 반복적인 서열의 DNA로 이루어진 적어도 80kb의 영역이 있다. 말단 소립 방향으로 PDCD2 유전자의 위쪽으로는 반복적이고, 코드화 되지 않은 서열 다음에 잠재적으로 새로운 전사 유니트의 30kb의 영역이 있다. PDCD2 유전자는 말단 소립 반복 영역의 시작점으로부터 거의 150kb이다. 이것은 TBP 좌를 염색체 6의 긴 암 위의 말단 소립으로부터의 첫 번째 구조 유전자 클러스터으로 만든다.
TBP
도메인으로부터의 유전자 발현 양식
TBP 유전자 클러스터 내에서의 조직 분배의 발현은 광범위한 인간 조직 및 세포 타입에서 유래되는 폴리(A)+-RNA로 제조된 시판되는 도트-블럿(dot-blot)을 사용하여 평가된다(도 35a). 적당한 프로브를 이용한 상기 도트-블럿 혼성화는 PSMB1(도 35b), PDCD2(도 35c) 및 TBP(도 35d) 유전자는 모두 도처에서 발현된다는 것을 나타냈다. 이러한 데이터는 TBP 좌는 도처에서 발현되는 염색질 영역으로만 이루어진다는 것을 확신한다.
pCP2
-
TLN
을 장착하는 마우스에서의 트랜스유전자 통합
맵핑
길이가 90kb인 pCYPAC-2 유도된 클론 pCP2-TLN(도 1)은 트랜스제닉 마우스를 만들기 위하여 사용되었다. 상기 클론은 C5 유전자의 아래쪽의 46kb에서 시작되고(TBP의 65kb 5'), TBP의 4.5kb 3'에서 종료된다. 이러한 클론은 그 결과 이들 전체에서 C5 및 TBP 모두를 포함한다.
pCP2-TLN을 갖는 세 개의 트랜스제닉 라인(transgenic lines)를 생산하였다. pCP2-TLN의 말단에서부터 유도된 프로브를 이용하는 초기 써던 블롯(Southern blot) 분석은 라인 TNL:3은 헤드-대-테일(head-to-tail) 구조에서(도 3a, 레인 TLN:3)에서 두 개의 트랜스유전자 복사체를 갖는 것을 나타냈다(도 2a, b 레인 TLN-3). 그러나, 하나의 복사체는 5' 삭제를 갖고, 이것은 TBP 프로모터로 연장된다(도 4, 에인 TLN:3). 말단 단편 분석에 의해 라인 TLN:8은 3개의 pCP2-TLN의 복사체가 장착하는 것을 나타냈다(도 2a, b 레인 TLN-8). 라인 TLN:28은 다중 통합 부위에서 여러개의 복사체가 장착하는 것을 나타냈다(도 3a, 레인 TLN:28).
상기 TLN 마우스에서의 트랜스 유전자의 복사체 개수 및 통합의 초기 분석에 대한 요약을 도 3b에 나타냈다.
pCP2-TLN을 이용하여 생산되는 트랜스제닉 라인의 추가적인 분석은 라인 TLN:3은 pCP2-TLN의 두 개의 삭제 복사체를 포함하고, 그 결과 TBP의 단일 기능 복사체 및 PSMB1 유전자는 손상되지 않은채로 있다는 것을 새롭게 나타내고 있다(도 3c, TLN:3). 라인 TLN:8은 cCP2-TLN의 두 개의 직렬 통합 복사체를 장착한다(도 3c, TLN:8). 라인 TLN:28은 pCP2-TLN의 4개의 직렬 배열 복사체를 갖는다(도 4, TLN:28). TLN:8 및 TLN:28에서의 5' 및 3' 말단에서의 삭제는 PSMB1 및 TBP 유전자를 여전히 손상되지 않은 채로 남게 한다. 예상되는 바와 같이, CpG가 풍부한 영 역(예를 들면 뮤린의 Thy-1; Kolsto 등, 1986)을 장착하는 다른 유전자의 5' 영역에 대하여 관찰되어지는 바와 같이, TBP/C5의 메틸화-없는 아일랜드가 트랜스제닉 마우스에서 보존된다(데이터를 기재하지 않음).
마우스에서의
pCP2
-
TLN
위에서의
TBP
및
C5
트랜스유전자의 발현 분석
인간 트랜스유전자 뿐만 아니라 내인성 뮤린의 TBP 및 C5 메시지 모두를 동시에 검출할 수 있는 RT-PCR에 기초한 분석이 발달되었다. RT-PCR 반응에 대한 프라이머(TB-14 및 TB-22)는 인간 및 마우스 TBP cDNA 서열 사이의 상동 영역에서 선택되었다(도 5a). 이것은 284bp의 RT-PCR 산물이 프라이머 단일쌍에 의해 mRNA 모두로부터 생산될 수 있게 한다. 인간과 마우스 TBP를 구별하기 위하여, 제한 효소 부위에서의 존재하에서 변화로 결과되는 작은 편의 염기를 이용한다. Bsp 1207I을 이용하는 소화는 인간 PCR 산물을 절단시키면서, 221개의 뉴클레오타이드(nt) 단편을 생성한다(도 6a). 유사하게, 인간 및 마우스 C5 cDNA 서열 사이의 상동 영역으로부터(도 5a), 이 두 개의 서열로부터 350nt의 RT-PCR 산물의 생성을 허용하였다. PstI을 이용한 절단은 뮤린의 C5 및 mRNA로부터 유도된 산물의 크기를 173nt로 줄인다(도 7a).
프라이머 TB14(도 5b) 및 C5RFT(도 5a)는 PCR 반응 후에 방사선 산물을 생성하는 32P로 말단 표지 되었다. 이들 산물은 변성 폴리아크릴아미드 겔 위에서 전기영동에 의해 최종적으로 용해된다(도 6b-c 및 7b).
트랜스제닉 마우스 라인 TLN:3, TLN:8 및 TLN:28의 다양한 조직으로부터의 총 RNA(1㎍)은 상기 분석 절차에 의해 분석되고, 포스포이미저 분석 (PhosphorImager analysis)에 의해 정량화 된다(도 8). 모든 마우스는 TLN:3를 포함하는 분석된 모든 조직에서 상당한 수준으로 인간 TBP 및 C5 트랜스유전자 모두가 발현됨을 나타냈고, TLN:3는 상기 두 개의 유전자의 단일의 손상되지 않은 복사체를 장착한다. 보다 중요하게는, 재현성 있는 수준의 발현은 주어진 마우스 라인에서, 특히 C5 대하여 조직 사이에서 관찰 되었다. 이것은 TLN 클론은 아마 도처에 있는 염색질 개방 능력을 갖는 것을 나타낸다. 그러나, 트랜스유전자 복사체 수당 발현 수준에서의 몇몇 편차가 마우스 라인에서 관찰되었다. 또한, 조직 사이에서의 라인 TLN:8에서의 TBP 발현이 또한 5 내지 40%로 달라졌다. 이러한 결과들은 비록 TLN은 염색질 개방 능력을 갖고 있지만, C5와 특히 TBP 프로모터는 양성 및 음성으로 전사를 방해하는 경향이 있다는 것을 제시한다. 이것은 상기 클론 위에서의 TBP 및 C5 영역의 고유의 전사 활성 잠재력이 약하고, 그 결과 부위 효과에 관하여 항상 지배적인 효과를 발휘할 수 있는 것은 아니라는 것을 의미한다. 이것은 무엇이 이 영역의 염색질 개방 UCOE 효과인 것처럼 보이는 지와 현저히 다르고, 상기 영역은 강하고, 이러한 부위 효과를 무효로 한다. 이러한 가설은 보다 약한 TBP 프로모터가 보다 변하기 쉬운 경향이 있다는 관찰에 의해 지지된다; 예를 들면 라인 TLN:8에서의 C5에 대한 비를 이용하여 비장과 근육에서의 TBP 수준의 비를 비교해보시오(도 8).
상기에 기재된 바와 같이 트랜스유전자 발현 분석은 2개월 내지 6개월 된 마우스로부터의 조직을 사용하여 수행된다. 트랜스유전자의 안정성은 PSMB1 mRNA를 분석하는 것에 의하여 라인 TLN:3 및 TLN:8로부터 23개월된 마우스에서 평가되었다. 유사한 결과가 보다 어린 동물을 이용하여 얻어진 결과와 비교하여 두 라인 모두에서 얻어졌다. 이 결과는 또한 트랜스유전자는 전사적으로 충분한 개방 염색질 구조를 유지하는 것을 증명한다.
TBP
좌의 40
bp
서브-클론(
sub
-
clone
)의 발현 분석
트랜스제닉 마우스에서 pCP2-TLN에 의해 제공되는 재현성 있는, 생리적인 발현은 상기 클론이 도처에 있는 염색질 개방 능력을 갖는 것을 나타낸다. 이러한 활성의 원인인 DNA의 영역의 정밀한 맵핑을 위한 첫 번째 단계로서, 인간 TBP 좌의 40 kb 서브 클론(pCP2-TSN; 도 1a)을 분석하기 시작했다. pCP2-TSN 클론은 TBP 유전자를 둘러싸는 12kb의 5' 및 3' 모두의 측면 서열을 포함한다. 그 결과, 상기 클론은 완전한 TBP 유전자 및 3'에서 끝이 잘린 C5 돌연변이체만을 장착한다.
인간 β-글로빈 LCR을 이용한 종래의 연구는 LCR 활성의 존재에 대한 초기 표시는 트랜스유전자를 안정한 트랜스펙션 조직 배양 세포 클론 사이에서의 발현 수준을 비교하는 것에 의해 얻어질 수 있다. LCR 요소이 보다 완전할수록, 독립적인 클론 사이에서의 발현의 재현 정도가 높아진다는 사실을 알아냈다. pCP2-TSN의 발현 분석은 상기 방법을 사용하여 수행되어 LCR-타입 활성의 존재에 대하여 평가한다.
pCP2-TSN는 처음에는 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 코스미드 벡터 pWE15로 클론화 되었다. 결과 pWE-TBP 구조체는 이어서 뮤린 섬유아세포 L-세포의 안정한 트랜스펙션 클론을 생산하기 위해 사용되었다. 23개 클론의 트랜스유전자 복사체 개수는 써던 블롯 분석에 의하여 결정되었다(도 10). 일정 범위의 복사체 개수를 나타내는 다수의 클론은 이어서 선택되었고 상기 트랜스제닉 마우스에 대해 기재된 바와 같이 트랜스유전자에 대하여 분석하였다. 이 결과는 도 11에 요약되고, 생리적 수준 또는 그 이상의 발현이 8까지 트랜스유전자의 복사체로 얻어진다는 것을 나타낸다. 20 이상의 복사체 수를 가지게 되면, 트랜스유전자 당 발현 수준은 원래 타입의 30 내지 40%로 줄어든다.
상기 데이터는 재현성 있는, 생리적 수준의 발현은 단일 및 다중 트랜스유전자 복사체 수 모두에서 pCP2-TSN에 의해 생성될 수 있다는 것을 증명한다. 상기 게놈 클론은 도처에 있는 염색체 개방 능력을 갖는다는 것을 강하게 지지한다. 분명하게 다수의 클론이 있고(예를 들면, 4, 33 및 6), 이것은 트랜스유전자 복사체 당 생리적 수준 보다 상당히 큰 발현 수준을 발생시키는, 상당한 "양성" 부위 효과를 나타낸다. 이것은 트랜스유전자의 통합이 이미, 개방된 활성 염색체 내에서 일어나는 어떤 경우에서 예상된 결과일 수 있었다. 이러한 환경 하에서 강한 전사 인핸서의 가까운 존재는 원래 약한 TBP 프로모터에 대한 자극 효과를 갖을 것으로 예상될 수 있었다.
구조체의 발현의 안전성은 60일 동안에 걸쳐 실험되었다. 발현 수준은 일정하게 유지되는 것으로 발견되었다(도 36). 이것은 약물 선택적 압력이 제거되는 경우에서도 그러했다(도 36, G418으로 표시된 레인). 또한 발현은 약물 선택 압력이 유지되는지에 개의치 않고 연속적인 동결 및 해동의 세포 사이클을 통해 안정하게 유지되었다.
TBP
좌의 25
bp
서브-클론의 발현 분석
1kb 5' 및 5kb 3' 측면 서열(도 1c)을 이용하여 TBP 유전자를 만들어 내는 25kb의 게놈 클론(TPO)이 푸로마이신 내성 유전자를 장착하는 개선된 pBluescript 벡터의 폴리링커 영역으로 클론화되어 상기한 바와 같은 pBL-TPO-puro를 제공하였다. 이 구조체는 뮤린 섬유아세포 L-세포의 안정한 세포감염 클론을 생산하기 위하여 사용되었다.
pBL-TPO-puro 구조체는 TSN 구조체을 사용하여 얻어진 것에 대하여 유사한 결과를 제공하였다(도 37). 이 데이터는 재현성 있는 생리적 수준의 발현은 단일 및 다중 트랜스유전자 복사체 수에서 TSN 및 TPO 양자 모두에 의해 생산될 수 있다는 것을 증명한다. 이 데이터는 도처에 있는염색질 개방 능력을 갖는 게놈 유전자를 게놈 클론과 일치한다. 이러한 추측은 또한 TPO 수 7(두개의 복사체), 29(단일 복사체) 및 34(두개의 복사체)는 게놈 단편은 이형염색질 환경 내에서부터 발현하기 위한 능력을 갖는 것을 증명하는 중심립 통합 결과(데이터를 나타내지 않음)라는 것을 발견하는 것에 의해 강화된다.
분명하게 다수의 클론이 있고(예를 들면, 도 37, 클론 11), 이것은 트랜스유전자 복사체 당 생리적 수준 보다 상당히 큰 발현 수준을 발생시키는, 상당한 "양성" 부위 효과를 나타낸다. 이것은 트랜스유전자의 통합이 이미, 개방된 활성 염색체 내에서 일어나는 어떤 경우에서 예상된 결과일 수 있었다. 이러한 환경 하에서 강한 전사 인핸서의 가까운 존재는 원래 약한 TBP 프로모터에 대한 자극 효과를 갖을 것으로 예상될 수 있었다.
유사한 결과가 또한 CHO 세포 대신에 Hela 세포를 사용하여 얻어졌다(데이터를 나타내지 않음).
DNase
I 과민성 부위
맵핑
모든 공지된 LCR 요소는 이들이 생산할 것으로 생각되는, 매우 개방된 염색질 구조를 나타내는, 높은, 조직-특이 DNase I 과민성의 영역이라는 것이 발견되어졌다. 따라서 인간 TBP 유전자 내와 그 주위 모두에서 DNase I 과민성(HS) 부위의 존재에 대하여 분석하는 것을 착수하였다. 도 12는 12kb 5'에서 시작하여 TBP 유전자의 4.5kb 3'을 뻗쳐나가는 40KB 영역에 걸쳐 DNase I 부위를 맵핑하는, 인간 골수생성 백혈병 세포주 K562으로부터의 TBP 유전자의 세포핵을 사용하는 일련의 실험을 요약하고 있다. 이 영역을 통해 명백한 HS 부위만이 C5 및 TBP 유전자의 인접한 프로부터 영역에 대하여 맵핑한다(도 12, 상단, HindⅢ 소화/HindⅢ-baⅠ프로브). 이러한 HS 부위는 순간순간염 분석(Tumara, T 등, 1994; Foulds와 Hawley, 1997)에 의해 결정된 바와 같은 TBP 및 C5에 대하여 중요한 앞에서 확인한 프로모터 요소에 대해서 서로 잘 관련되어 있다. 그러나, 만약 LCR-타입 요소이 이 좌 내에 존재하는 경우, 이들은 TBP 및 C5 모두의 전사 시작 위체로부터 상당히 멀리 떨어져 있다는 것을 나타낼 수 있었다. 이것은 도처에 있는 염색질 개방 능력의 초기 표시을 제공하는 TBP를 만들어내는 40kb 클론의 외부에 임의의 LCR-타입 요소을 위치시킨다.
피쉬
(
FISH
) 분석
인간 TBP 트랜스유전자의 1-2 복사체를 행하는 총 34개 클론은 피쉬에 의해 분석되었다. 마우스 중심립의 TBP 트랜스유전자 및 이형염색질 요소, 감마 또는 주요한 스탤리트(satelite)는 각각 플루오레세인 및 텍사스 레드에 의해 검출되었다. 이것은 클론에서 녹색 및 적색 형광 신호를 생성했는데, 여기서 트랜스유전자는 염색체 암으로 통합되었다(도 39a 참조). 그러나 중심립 통합의 경우에는, 함께 집중된 신호 및 두 가지 색상의 혼합은 황색 형광 신호로서 검출될 수 있었다. pWE-TSN을 이용하여 생산된 18이외의 두 개의 클론, 즉 344-6 및 344-37은 중심립 영역에서의 트랜스제닉 신호를 나타냈다. 클론 344-6에서는, TBP 트랜스유전자는 로베르트소니안 염색체(Robertsonian chromosome)의 중십립에 통합되었던 반면에, 클론 344-37에서의 통합은 전형적인 말단 중심 염색체(acrocentric chromosome)에 있다.
pBL3-TPO-puro를 이용하여 생성된 16이외의 세 개의 클론, 즉 440-7, 440-29 및 440-34는 전형적인 말단 중심 염색체에서의 중심립 통합을 나타냈다. TBP 트랜스유전자의 단일 복사체에 의하여 수행된 클론 440-29은 이형염색 종자 서열에 의해 분별하게 둘러싸여진 TBP 신호를 나타냈다(도 39b 및 c 참조). 또한 이들 클론은 선택의 부재 하에 적어도 12 내지 14주 동안 생리적 수준에서 TBP 발현을 계속했다는 것을 나타내었다(데이터를 나타내지 않음).
이러한 결과들은 TBP 좌(TPO)의 25kb의 단링 복사체가 이형염색 부위(즉, 중심립 통합)의 상황에서 조차도 생리적 발현을 확실하게 할 수 있고, 따라서 염색질 개방의 형식적인 증거(Sabbattini p, Georgiou A, Sinclair C, Dillon N(1999), 트랜스유전자의 단일 또는 다중 복사체를 이용하는 마우스 분석은 λ5-V preB1 좌 제어 영역에 대한 신규한 배열을 나타낸다. Molecular and Cellular Biology 19: 671-679)를 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예
2
인간
hnRNP
A2 유전자 좌의 분석
hnRNP
유전자 영역
맵핑
hnRNP A2 유전자는 10kb를 만들어내는 12개의 엑손으로 이루어지고, 코드 서열 및 유전자 복제(Biamomti 등, 1994)에 의해 발생할 수 있는 인트론/엑손 구조에서 hnRNP-A1 유전자와 매우 유사하다. 그러나, A1 유전자와는 달리 A2-특이 유사유전자는 발견되지 않았다(Burd 등, 1989; Biamonti 등, 1994). 또한, A1 및 A2 유전자는 각 인간 염색체 12q13.1(Saccone 등, 1992) 및 7p15(biamonti 등, 1994)에서 유전적으로 결합되어 존재되지 않는다. 도 13a는 160kb pCYPAC-2 유도 클론 MA160에서 존재하는 인간 hnRNP A2의 유전자 지도를 묘사한다. 이 게놈 단편은 110kb 5' 및 50kb의 3' 측면 서열을 포함한다. hnRNP-A2의 공지된 전사 시작 부위의 위쪽의 4.5kb 영역의 DNA 서열을 결정하였다. 이것은 대략 1-2kb 5'의 hnRNP-A2 캡 부위 부위로부터 분기하여 전사되는 이형염색질-관련 단백질 HP1γ에 대한 유전자 부위를 확인하였다(도 13c). 써던 블롯 분석은 전체 HP1γ 유전자는 10kb 영역 내에 포함되는 것을 나타낸다(데이터를 나타내지 않음).
따라서 TBP 및 hnRNP-A2 유전자 좌는 밀접하게 연결되어, 분기하여 전사되는 프로모터의 일반적인 특징을 갖는다.
인간 조직 내에서의 HP1γ의 발현 양상은 광범위한 인간 조직 및 세포 타입 에서 유래된 폴리(A)+-RNA를 이용하여 제조된 도트-블롯에서 평가되었다. 이 결과(도 38)는 hnRNP-A2에 대한 것과 같이 유전자는 또한 도처에서 발현된다. 두 개의 유전자는 그 결과 TBP 좌의 경우와 유사하게 도처에서 발현된 유전자 영역을 형성하는 것으로 나타내어 질 수 있다.
트랜스제닉
마우스에서의
hnRNP
의 기능 분석
MA160(도 13a)는 트랜스제닉 마우스를 생산하기 위하여 사용되었다. F1 단계 내내 번식되어지는 두 개의 창조자(founders)의 써던 블롯 분석은 이러한 라인이 1-2개의 트랜스유전자 복사체를 포함하는 것을 나타내고 있다(데이터를 나타내지 않음).
TBP에 대하여 사용되었던 유사한 RT-PCR에 기초한 분석이 인간 hnRNP 트랜스유전자의 발현을 분석하기 위해 사용되었다. 뮤린 hnRNP A2의 cDNA 서열은 공지되지 않았다. 따라서, RT-PCR 증폭에 대한 서열 비료에 의한 인간 및 마우스 hnRNP A2 사이의 상동 영역을 선택할 수 없었다. 인간 hnRNP A2의 각 엑손 10 및 12 내의 서열에 해당하는 두 개의 프라이머 Hn9 및 Hn11을 초기에 선택하여(도 14a), 270bp의 RT-PCR 산물을 발생시킨다. 그러나, 두 개의 프라이머는 인간 및 마우스 종에서 상동 영역을 나타내는 인간 및 마우스 RNA 제조(도 14b) 모두에서 동일한 크기의 산물을 제공한다는 것을 발견하였다. 일정 범위의 제한 효소를 이용하는 실험은 또한 HindⅢ은 170bp 단편을 제공하도록 쥣과의 생성물은 자를 수 있지만(도 14b, 레인 HindⅢ M), 인간에 대해서는 그렇지 않다(도 14b, 레인 HindⅢ H)라는 것을 또 한 나타내었다.
라인 Hn35 및 Hn 55의 F1 트랜스제닉 마우스의 다양한 조직으로부터 제조된 총 RNA(1㎍)는 이어서 32P-말단 표지 5' Hn9을 이용하는 상기 방법을 사용하여 분석하였다(도 16). 포스포이미저 분석은 인간 대 마우스 RT-PCR 산물의 비를 정량화하기 위해 사용되었다. 이 결과(도 17a)는 트랜스유전자 복사체 수 당 재현성 있는, 생리적 수준의 발현이 분석된 모든 타입의 조직에서 얻어진다는 것을 나타낸다.
트랜스제닉
마우스에서의
hnRNP
A2의 60
kb
서브클론의 분석
MA160 pCYPAC-유도 클론을 이용하여 얻어진 데이터는 이 게놈 단편이 도처에 있는 염색질 개방 능력을 갖는 것을 나타낸다. 이러한 활성에 원인이 되는 DNA 영역의 부위로 추가로 정의하기 위하여, MA160으로부터 얻어진 60kb AatⅡ 서브-단편(Aa60)을 이용하여 트랜스제닉 마우스를 생산하였다(도 13b). 이러한 단편은 hnRNPA-2 유전자 주위에 30kb 5' 및 20kb 3' 측면 서열을 갖는다.
세 개의 트랜스제닉 마우스(Aa7, Aa3 및 Aa31)는 Aa60 단편을 이용하여 생산되었고, (Aa23 및 31)의 두 개는 내내 번식되어 라인을 만들어내었다. 평가된 트랜스유전자 복사체 수는 Aa7, 3; Aa23, 1-2; Aa31, 1-2.
일정 범위로부터의 총 RNA(1㎍)는 상기한 바와 같이 트랜스유전자 발현에 대하여 분석되었다. 이 결과는 도 15에 나타냈고, 포스포이미저에 의해 정량화 되었다(도 17b). 이들 데이터는 모든 트랜스제닉 마우스는 분석된 모든 조직에서 트랜스유전자 복사체 수 당 재현형 있는 수준에서 발현한다는 것을 나타낸다. 이것은 MA160에 의해 나타내어 지는 도처에 있는염색질 개방 능력이 Aa60 서브-단편에서 보존되는 것을 나타내었다.
DNase
I 과민성 부위
맵핑
5' 인간 hnRNP A2 유전자의 전사 시작점의 20-25kb 영역에 걸쳐 DNase I HS 부위를 맵핑하기 위한 예비적인 실험 결과를 도 18에 나타냈다. AatⅡ및 ClaⅠ를 사용하는 이중 제한 효소 소화에서 엑손 2로부터 766bp 프로브는 5' hnRNP A2 유전자(도 18, 하단)의 부위 -1.1, -.0.7 및 -0.1kb 에 해당하는 일련의 3개의 HS 부위(도 18, 상단)를 제공한다. hnRNP-A2의 전사 시작의 아래쪽 12-13kb와 더 이상 HS가 확인되지 않는 부위에 대하여 분석을 또한 확장하였다.
TBP/C5 좌의 경우에서와 같이, 이들 HS 부위는 hNRNP A2 및 HP1H-γ 유전자의 프로모터 사이의 1-2kb에 해당한다. 어떠한 LCR-타입 HS 부위는 검출되지 않았고, 이것은 상기 좌의 염색질 개방 능력이 이러한 타입의 요소과 관련이 없다는 것을 나타낸다.
이 데이터는 트랜스제닉 마우스의 모든 조직에서 두가지 다른 유전자 좌(TBP 및 hnRNP A2)를 이용하는 재현성 있는, 도처에 있는 생리적인 수준의 발현을 얻을 수 있다는 것을 분명하게 나타낸다. 이것은 LCR로부터 유도된 것이 아니라, 염색질 개방 능력을 이용하는 유전자 제어 요소가 실로 존재한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 데이터가 인간 β-액틴(예를 들면 Ray, P 등, 1991; Yamashita 등, 1993; Deprimo 등, 1996), 뮤린의 히드록시-메틸글루타릴 CoA 환원효소(Mehrali 등, 1990), 뮤린의 아데노신 탈아미노효소(Winston 등, 1992 및 1996), 인간 오르니틴(ornithine) 탈카로보닐효소(Halmekyto등) 및 뮤린 포스포글리서레이트(phosphiglycerate) 키나제-1(McBurney 등, 1994) 등의 다른 도처에 있는 발현 유전자로부터 프로모터-인핸서 조합을 사용하는 종래의 알려진 결과에 대하여 전적으로 다른 기능을 한다는 것을 증명하는 것에 주목하는 것은 매우 중요하다. 상기와 같은 초기 연구에서, 고수준의 발현은 단지 조직의 일부에서만 관찰되었고, 염색질 개방 기능은 증명되지도 실험되지도 않았다.
TBP 유전자의 경우에는, 조직 배양 세포(도 11)로부터의 발현 데이터는 이러한 도처에 있는염색질 개방 능력은 12kb의 5' 및 3' 측면 서열(pCP2-TSN, 도 1a)을 이용하여 14kb 게놈 단편 내에 포함된다는 것을 나타낸다.
hnRNP A2 유전자를 만들어내는 60kb 단편(Aa60; 도 13b)을 이용하는 트랜스제닉 마우스 데이터는 도처에 있는 염색질 개방 능력을 이용하는 영역이 상기 단편에 포함된다는 것을 나타낸다(도 15-17).
지금까지 이들 영역에 대해 맵핑해 온 DNase I HS 부위만이 LCR-타입 요소이라기보다는 오히려 전형적인 프로모터에 해당한다. 따라서, 펴재하는 염색질 개방 요소(UCOEs)으로서 작용하는 DNA 영역은 조직-특이 또는 제한 방법으로 발현되는 유전자와 관련된 LCR 요소의 정의를 충족시키지 않는다. UCOEs 및 그의 활성은 그 결과 LCRs 및 LCR 유도 요소을 분명하게 구별할 수 있다.
발현 벡터 개발
60kb RNP 영역의 서브-단편은 리포터 분석 방법에 기초하여 UCOE에 대하여 분석한다.
RNP 과 HP1H-γ의 이중 프로모터 영역에 위치한 서브-단편을 포함하는 발현 벡터는 상기되고, 도 22에 기재된 바와 같이, GFP 및 NeoR 리포터 유전자를 사용하여 고안되었다. 이들은 GFP/Neo 발현하는 RNP 프로모터(RNP)를 이용하는 제어 벡터, RNP 프로모터 영역 및 RNP 프로모터(5.5RNP)의 위쪽의 5.5kb 단편으로 이루어지는 벡터, 슬라이스 수용체/분지 교감 서열(RNP 유전자의 엑손 2으로부터 유도됨)은 GFP 유전자(RNP 인트론 1으로부터의 서열을 포함하는 전체 CpG는 동일한 리포터에 기초한 분석을 확신한다)의 앞에서 클론화 되는 방법을 사용하고, 슬라이스 수용체 GFP(7.5RNP)의 위쪽의 인트론 1의 엑손 1/부로 되고, GFP 유전자에 우선하는 7.5 bp의 RNP 유전자를 운반하도록 구성된 벡터, 및 RNP 프로모터 영역 및 RNP 프로모터(1.5RNP)의 위쪽의 1.5kb 단편으로 이루어지는 벡터를 포함한다.
이종 구조의 프로모터 CMV로 이루어지는 발현 벡터는 또한 상기에 기재되어 있고, 도 23에 나타냈다. 이들은 내부 리보좀 결합 부위(CMV-EGFP-IRES)를 갖거나, 내부 결합 부위(CMV-EGFP)를 갖지 않는 GEP/Neo 발현하는 CMV 프로모터를 갖는 제어 벡터, RNP 프로모터 영역 위쪽의 5.5kb 단편 및 GFP/Neo 발현하는 CMV 프로모터로 이루어지는 벡터(5.5CMV) 및, RNP 및 HP1H-γ 프로모터를 둘러싸는 4.0kb와 GFP/Neo 발현하는 CMV 프로모터로 이루어지는 벡터(4.0CMV)로 이루어지는 벡터, 엑손 1 및 인트론 1의 일부를 포함하는 RNP 유전자의 7.5kb 서열 및 GFP/Neo 발현하는 CMV 프로모터로 이루어지는 벡터를 포함한다.
이들 구조체는 상기된 바와 같은 전기영동에 의해 CHO 세포로 트랜스펙션되 었다. RNP 프로모터의 앞에서 5.5kb 영역의 첨가는 G418R 콜로니 수로 3.5배 증가하였다(도 24). 핵산 농축 펩티드 전달 방법을 사용하는 상기 동일한 구조체의 COS7으로의 트랜스펙션은 7배에 가까운 콜로니수의 증가는 나타냈다(데이터를 나타내지 않음).
콜로니수에서의 1.5배의 증가는 또한 CMV-rP 벡터(즉 CMV 대 5.5CMV)의 CHO 세포로의 트랜스펙션 후에 또한 관찰되었다(도 24).
상기 트랜스펙션으로부터의 콜로니의 링 클로닝은 이어서 GFP 발현 수준에 대하여 분석될 수 있는 안정한 G418R 세포 라인을 나타냈다. FACS 데이터를 도 25에 나타냈다. 내인성 프로모터(RNP 대 5.5 RNP)를 이용하여 분석되는 경우, 위쪽 서열의 첨가는 GFP 발현에서 3.5배 증가를 나타냈다. GFP 발현의 증가는 또한 이종성 CMV 프로모터의 앞쪽에 5.5kb 서열을 첨가하여 나타날 수도 있다(CMV 대 5.5CMV).
전체 메틸화가 없는 아일랜드를 포함하는 구조체의 연장은 5.5RNP와 비교하여 C418R 콜로니의 수가 증가하지 않지만, 평균 중앙 GFP 형광은 증가하였다(5.5RNP cf. 7.5RNP; 도 26 참조).
개개의 클론 및 제한 풀(대략 100개의 콜로니)의 GFP 발현은 G418 선택을 갖거나 갖지 않는 세포를 규정 시간 이상의 배양에 의한 결과로서 일어났다. RNP 프로모터 만을 이용하여 생성된 클론은 극적인 불안정성을 나타내고, GFP 발현 세포의 비율은 규정 시간이 지남에 따라 빠르게 감소한다. 비교하여 5.5RNP 구조체로부터 클론 발현 GFP는 3개월 이상 안정하였다. 비록 CMV-GFP 풀은 초기에 보다 나은 안정성을 나타냄에도 불구하고, G418의 부재 하에서의 연장된 배양 후에는, 완전히 안정하게 있는 5.5CMV 콜로니과 비교하여 CFT 발현 세포의 수의 감소는 명백했다. 도 27 및 28은 왼쪽으로의 이동, 즉 CMV-GFP 구조체을 갖는 비형광성 세포의 증가된 비율을 분명하게 나타내는 이들 콜로니의 FACs 프로파일을 나타낸다. 대조하여, 5.5CMV-GFP 풀은 규정 시간 이상에서 안정한 일정한 발현 피크를 나타낸다. 낮거나 또는 발현을 나타내지 않은 세포의 비는 상투적인 콜로니 M1으로부터 평가된다.
RNP 좌에 대한 연구는 RNP 및 HP1H-γ 유전자의 이중 프로모터에 걸친 5.5kb 영역으로 좁혀졌다. 3' 방향(7.5RNP 또는 8.5RNP)으로의 상기 단편의 연장은 유전자 발현의 수준에서의 증가는 나타내고, 메틸화-없는 아일랜드를 손상없이 유지하는 것과 관련될 수 있다. 1.5kb 영역에 대한 5.5kb 서열의 최소화(1.5RNP, 도 23)는 FACs 분석(도 29)에 의해 결정되는 바와 같은 G418R 콜로니 및 발현의 수 모두의 형태에서, 리포터 트랜스펙션의 결과에 극적으로 영향을 미치지 않는다. 그러나, 1.5RNP 및7.5RNP에 의해 나타내지는 바와 같이 유전자 발현의 안정성을 가져오지 않는다. 도 30은 GFP 발현 세포의 비가 68일 이상에서 빠르게 감소하는 것을 나타낸다.
구조체 4.0CMV은 CpG 메틸화-없는 아일랜드를 나타내는 전체 4kb의 서열이 손상되지 않게 유지되도록 고안되었다. 또한, 카세트가 앞 방향 및 그 역방향 모두에서 CMV-EGFP(4.0CMV-EGFP-F(앞방향) 및 4.0CMV-EGFP-R(역방향)의 앞쪽에 삽입되었다. 도 31은 표준 CMV-GFP 구조체, CMV-EGFP와 비교하여, GFP 중앙 형광의 극적인 증가(10배 이상)를 나타낸다. 이러한 GFP 발현의 상승은 4kb가 앞쪽과 그 역방 향 모두에 있을 경우에 일어난다는 사실을 또한 발견하였다.
유전자 발현의 안정성에 의하여, CHO 세포로 트랜스펙션되고, 규정 시간 이상으로 되는 경우의, 위쪽으로 5.5kb RNP 서열을 포함하는 벡터는 제한된 이점을 갖는다. 매우 중요하게 이 안정성은 내인성 프로모터에 한정되지 않을 뿐만 아니라 이종 구조에 대하여 유리한 안정성을 가져다 주고, 광범위하게 CMV 프로모터에 사용된다.
도 32는 제어 벡터 CMV-EGFP를 갖는 CMV계 구조체인 4.0CMV 및 7.5CMV는 CHO 세포로 감염되고, 13일에 후감염을 분석한 다음 G418 선택하는 것을 나타낸다. 중앙의 형광에서 연속적인 증가(15-20배)는 CMV 프로모터 앞에 RNP 좌으로부터 4,0 또는 7,5kb 단편을 첨가하는 것에 의하여 나타날 수 있다. 이러한 증가는 단편의 방향에 독립적이었다(데이터를 나타내지 않음).
도 33은 도 32에 나타낸 바와 같은 동일한 G418 선택 풀에서 GFP 발현 세포의 비를 나타낸다. 4.0 및 7.5kb 단편의 함유물은 G418 선택 콜로니에서 GFP 양성 세포의 비를 증가하는 것을 나타낼 수 있다. 또한, 이전의 실험으로부터 CMV-EGFP 불안정성은 배양에서 대략 60일 후에 단지 명확하다해도, 콜로니는 규정 시간 이상에서 상대적으로 안정하게 나타난다.
도 34는 등가의 몰양을 갖는 다양한 구조체을 갖는 CHO 세포로 트랜스펙션 후에 콜로니수를 나타낸다. 7.5CMV 구조체는 CMV-EGFP 보다 대략 2.5배 이상의 콜로니를 나타낸다. 이러한 관찰은 생산적인 통합 결과의 증가된 수를 확실하게 하는 7.5CMV-F와 일치하고, 그 결과 7.5kb 단편에 대한 염색질 개방/유지 능력이 잇다는 것과 일치한다.
UCOE
를 포함하는
아데노바이러스
벡터
현재 아데노바이러스(Ad)는 유전자 치료에 관심 있는 많은 세포 타입에 대한 유전자의 가장 유효한 전달을 제공하는 벡터 시스템이다. 임상 개발에서 대다수의 가장 유망한 유전자 치료는 상기 벡터를 이용하고, 특히 Ad 서브타입 5에서 유도된 벡터를 사용한다. 인간 유전자 치료에 대한 Ad의 이용은 두 가지 주된 방법에서 치료 유전자의 발현을 향상시키는 것에 의해 실질적으로 증가될 수 있었다. 첫 번째 방법은 최소 복용량을 이용하여 최대 효과를 이용하기 위하여 트랜스유전자 발현의 수준을 증가하는 것을 포함하고, 이것은 어떠한 프로모터를 사용하더라도 적용된다. 두 번째 방법은 조직 특이 또는 종양 특이 프로모터를 향상시키고, 그 결과 임의의 세포에서 보다 강한 발현을 제공하는 이외에도 특이성을 유지한다. 비록 특정한 조직 또는 종양 타입에 대하여 뛰어난 특이성을 제공하는 여러 가지 프로모터가 공지되어 있지만, 임의의 세포에서 제공되는 발현 수준은 일반적으로 너무 약해서 실제의 이득을 갖지 않는다. 이러한 예는 마이스 알파-태아단백질(alpha-foetoprotein; AFP) 유전자의 프로모터이고, 이것은 약하지만, 간종양(간암)에 대하여 뛰어난 특이성을 갖는다(Bui 등, 1997, Human Gene Therapy, 8, 2173-2182). 이러한 종양-특이 프로모터는 암에 대한 유전자 배향 효소 프로드럭 치료(Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy; GDEPT)에 대하여 특히 관심이 모아지고 있고, 이러한 치료법은 표적 화학요법에 이르기 위한 유전자 전달을 이용한다. GDEPT에서, 효소를 전화하는 프로드럭를 코드화하는 유전자는 예를 들면 종양으로의 전달 벡터를 주입하는 것에 의해 종양 세포에 전달된다. 상대적으로 유해하지 않은 프로드럭의 연속적인 투약은 상기 유전자를, 그 부위에서 효소를 발현하는 세포를 사멸하는 상기 유전자를 잠재적인 세포파괴 약물로 전환한다. 일예로 니트로환원효소 (NTR) 및 프로드럭 CB1954를 들 수 있다 (Bridgewater 등, 1995, Eur. J. Cancer, 31A, 2362-2370). 아데노신바이러스는 예를 들면 종양으로의 직접적인 주입에 의해 상기 효소를 코드화하는 유전자의 가장 효과적인 전달을 제공한다.
AFP
프로모터 및
UCOE
로부터의
NTR
을 발현하는
Ad
구조체
재조합 타입 5 아데노신바이러스 벡터는 4kb RNP UCOE(도 20의 뉴클레오티드 4102 및 8286사이 서열)에 의해 우선된 AFP로부터 NTR 유전자를 발현하도록 만들었다. 4kb RNP UCOE는 Pme1 단편으로서 AFT 프로모터에 대하여 Cla1 부위에 있는 5'으로 블런트(blunt) 말단 결찰에 의해 pTXO379로 클론화되고, 상기 벡터는 AFP 프로모터(Bui 등, 1997, Human Gene Therapy, 8, 2173-2182)에 의해 우선되고, Ad5 서열(1-359, 3525-10589)에 의해 접하여 위치된 NTR을 운반하는 중간 벡터이다. 제한 소화는 단일 UCOE 복사체의 존재를 확신하고, UCOE의 배향을 정하기 위하여 사용되었다. 재조합 Ad 구조체는 이어서 역방향의 배향에서 UCOE 단편과 Ad 패킹 세포주 Per.C6를 포함하는 플라스미드 pTXO384를 사용하여 생성되고, 상기 구조체는 인트로유전자에 의하여 진화되고 공급된다(Fallaux 등, 1998, Humman Gene Therapy, 9, 1909-1917). 인트로유전자에 의해 공급되는 이 절차는 바이러스 구조(viral rescue)를 위하여 사용되었다. pTXO384는 Swa1을 이용하여 반드시 선형화 되어야 하고, Swa1-선형 백본 벡터 pPS1160을 이용하여 Per.C6 세포로 함께 트랜스 펙션되고, pTXO384를 이용하여 Ad5의 오른쪽 말단 및 겹친 영역을 운반하여, 그 결과 재조합 Ad는 상동의 재조합에 의해 생성된다. 트랜스펙션된 세포에서 상동 재조합에 의해 생산된 바이러스는 합해지고 CLT208을 나타내었다.
생체 밖 세포 라인에서의
NTR
발현
보다 큰 규모의 바이러스 제조는 CTL208에 대한 표준 절차와 두 개의 다른 재조합 Ad 바이러스를 사용하여 만들었다. UCOE 단편이 없는 AFP 프로모터와 최소의 인핸서에 의해 우선된 NTR을 운반하는 CTL203과 CMV 프로모터에 의해 우선된 NTR 유전자를 운반하는 CTL102가 있다. CMV 프로모터는 광범위한 조직 및 종양 타입에서 강한 발현을 제공하는 재조합 Ad 벡터에서 일반적으로 사용된다. CTL203 및 CTL102는 CTL208에서와 같은 동일한 Ad5 백본을 공유하고 NTR 유전자의 전사에 대하여 사용되는 요소이라는 것을 제외하고는 동일하다.
CTL203, 208 및 102는 이어서 NTR 발현의 수준 및 특이성을 연구하기 위하여 생체 밖의 두 개의 세포 라인을 형질 도입하기 위하여 사용되었다. 이들은 AFP 및 KLN205을 발현하는 제 1 인간 간종양 세포주HepG2, 발현하기 않는 마우스 비늘모양 세포 암종 라인인 KLN205 이었다. 지수함수적으로 자라는 세포는 단순한 트립신화(trypsinisation)에 의하여 조직 배양 플레이트로부터 수거되고, 1.25×104 생존가능 세포/㎖의 농도의 감염 배지에서 재현탁 되고, 6웰 플레이트에 평판한다. 이 바이러스는 다수의 50에서, CTL 203에 대해서는 또한 다수의 100 및 500에서 부착 전에 웰에 첨가되었다. 90분 후에, 우태아 혈성 농도는 10%로 조절되었고, 세포는 총 24시간 동안 배양되었다. 세포 용해물은 저장성 세포 용해에 의해 감염 세포로부터 만들어지고, 이어서 세포 잔해는 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에서 원심분리에 의해 제거된다. ELISA는 상청 중 NTR 단백질을 정량하기 위하여 수행되었다. 이것은 재조합 NTR을 이용하는 넌크-이뮤노 맥시소르프 분석 플레이트(Nunc-Immuno Maxisorp Assay Plates)를 피복하고, 복제에서 웰 당 50ℓ의 각 저장성 용해물을 첨가하고, 4℃에서 철야로 배양하는 것을 포함한다. 이 시료는 이어서 PBS 중 0.5% Tween으로 3X 세척되고, 양 항-NTR 폴리크로날 항혈청(PBS/Tween에서 2000배 희석하여 웰 당 100ℓ)을 이용하여 실온에서 30분 동안 배양하였다. 세척하여 과량의 제 1 항체 HRP-결합 제 2 항체를 공급한 후에, 이것은 보조의 항-양(donkey anti-sheep)(PBS/Tween에서 5000배 희석하여 웰 당 100ℓ) 이었다. 추가의 30분의 배양 후에, 이 시료를 PBS로 세척한 다음 TMB 기질(TMB 용액 1㎖, DMSO 중 1㎎/㎖+0.05M 인산-구연산 완충액 9㎖+10㎖ 당 30%v/v H2O2 2㎕)의 웰 당 100ℓ로 10분 동안 실온에서 전개시켰다. 이 반응은 웰 당 2M H2SO4 25㎕의 첨가에 의해 중단되고, 플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 읽었다.
도 46은 상기 ELISA의 결과를 나타낸다. 이것은 AFP 프로모터/인핸서로부터 발현된 NTR을 갖는 CTL203는 AFP 양성 세포 라인에서만 검출 가능한 약하지만 특이 NTR 발현을 제공하였다는 것을 나타낸다. CTL102(CMV 프로모터로부터 발현된 NTR을 갖는다)는 보다 강하고 비특이적인 발현을 제공하고, 양 세포 모두에서 매우 유사한 NTR 수준을 갖는다. 현저하게, CTL208(UCOE+NTR을 발현하는 AFP 프로모터)로 감 염된 AFP 양성 HepG2 세포는 보다 높은 그때의 CTL 102 감염 세포에서 NTR을 발현하는 반면, CTL 208 감염 AFP 음성 KLN205 세포는 CTL102로 감염된 것보다 상당히 낮은 NTR을 발현하였다. 이들 데이터는 UCOE는 특이성을 부분적으로 보유하여 Ad 환경에서 발현을 극적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다.
생체 내에서의
NTR
발현 및 항-종양 효과
종양-특이 프로모터는 통상적인 조직에서 트랜스유전자의 발현을 보다 낮게 나타낼 것이기 때문에, 상기 프로모터는 안정성의 관점에서 암 유전자 치료를 위해서 비특이 프로모터가 보다 바람직하다. 이것은 종양으로 주입 후에 바이러스의 일부는 종양으로부터 빠져 나오는 경향이 있고, 다음의 전신 보급은 통상의 조직을 형질 도입하는 경향이 있기 때문에, Ad계 유전자 치료에 대하여 특히 중요하다. 특히, Ad는 매우 효과적인 간 세포의 형질 도입을 제공하고, 그 결과 간 손상은 Ad 유전자 치료에 대하여 일반적으로 복용량-한계(dose-limiting) 독성이 있다. GDEPT의 경우에서, CMV 프로모터 등의, 통상 조직에서 발현할 수 있는 강한 프로모터의 사용은 NTR을 발현하는 통상적인 간 세포를 사멸할 수 있다. 이러한 문제는 종양-특이 프로모터를 사용하여 잠재적으로 피하거나 또는 최소화 될 수 있고, 만약 상기 프로모터가 종양 세포에서 충분히 강하게 발현하여 항-종양 효과는 나타낸다면 매우 바람직할 것이다. CTL208은 그 결과 마우스의 종양으로 주입된 후에 종양 세포 및 간 세포에서의 NTR 유전자 발현에 대하여, 그리고 항-종양 효과에 대하여 CTL102와 비교되었다. 선천적인 흉선 없는 마우스 라인 BALB/c nu/nu을 사용하였다. 이 마우스는 실험 시작 시에 특이 병원체가 없는 8 내지 12주령의 수컷이었고, 필터 탑이 설치된 미생물이 없는 우리에서 키워졌다. 생체 밖에서 배양된 지수함수적으로 자라는 HepG2 세포는 종양 접종물로서 사용되었다. 이 세포는 진동 플라스크에서 배양되었고, 트립신화 되고, 800g로 5분 동안 원심분리 되어 수거되고, 세척되고, 멸균 식염수 용액에서 재현탁 되었다. 세포 생존 능력은 트립판 청색 염료 배제(trypa blue dye exclusion)에 의해 평가되었고, 단지 90% 이상의 생존 능력의 단일 세포 현탁물만을 사용하였다. 각각 농도가 1㎎/㎖ 및 10㎎/㎖인 자일리진(xylizine)(Chanelle Animal Health Ltd, Liverpool, UK)과 케타민(Willow Francis Veterinary, Crawley, UK)의 혼합물 2㎖의 마우스의 복강 내 주입에 의해 유도된 2-5×106 세포를 일반적인 마취 하에서 마우스의 측면에서 피하주사 하였다. 첫 번째 실험에서, CTL102 또는 CTL 208을 흉선 없는 마우스에서 자라는 크기가 25-60㎟인 피하의 HepG2 종양에 주사하였다(표면적으로서 표현되는 크기는 가장 긴 직경에 그것의 가장 수직인 직경을 곱하는 것에 의해 결정되었다, 길이×폭=㎟). 7.5×109 입자의 단일 복용량이 각 바이러스에 대하여 사용되었다. 이 동물은 48시간 후에 교살되고, 그의 종양 및 간이 적출된 다음 완충 4% 포르말린/PBS에서 24시간 동안 고정되고, 파라핀에 묻은 다음 표준 프로토콜을 사용하여 절개하였다. 일련의 3㎛의 절편으로 잘라내었고, 면역 착색하여(immunostained) 양 항-NTR 항혈청(Polyclonal Antibodies Ltd) 및 VECTASTAIN 엘리트 ABC 킷(Vector Labs)을 사용하여 간접적인 면역과산화효소 착색에 의해 NTR을 발현하는 세포를 검출하였다. 이러한 조직학적인 절편은 표준 현미경 장치를 사용하여 실험하였고, 전체 간 및 종 양에서 NTR을 발현하는 세포의 비는 현미경의 사용에 의해 평가되었다. 도 47은 각 마우스에 대한 결과를 나타낸다. 이것은 (반면에 약한) AFP 프로모터와 조합된 UCOE는 마우스의 AFP 양성 종양에서 강한 NTR 발현을 나타내고, 그 결과 평균적으로 CTL208은 종양으로 주입한 다음 CTL102에서와 같이 검출되는 수준에서 NTR 발현하는 매우 유사한 수의 종양 세포를 제공한다는 것을 증명하였다. 그러나, CTL102의 내부-종양 주입은 CTL102에 대해서 6마리 동물 중 5마리에 대하여 간에서 검출 가능한 NTR 발현이 있었고, CTL208에 대해서는 6마리 중에서 하나도 없었다. 이러한 결과는 CTL208에서 UCOE-AFP 프로모터 조합이 CMV 프로모터 와 유사하거나 보다 강한 AFP 양성 종양에서 발현되지만, (AFP 음성인) 통상적인 조직에서 훨씬 더 적은 발현을 나타낸다는 것을 확신한다.
UCOE는 AFP 프로모터로부터 치료적으로 유용한 수준의 CTL208 및 CTL102로의 발현을 높이는 것을 확신하는 것은 프로드럭 CB1954와 조합하여 항-종양 효과를 주기 위하여 그들의 능력에 대하여 비교하였다. 25 내지 60㎟ 크기의 피하 HepG2 종양을 갖는 흉선 없는 마우스는 각 7.5×109 또는 2×1010 입자의 복용량으로, CTL102 또는 CTL208의 단일 주입을 하였다. 48시간 후에 마우스에 CB1954의 투여가 시작되었다. CB1954(Oxford Asymmetry, Oxford, UK)를 DMSO(Sjgma, St Louis, Mo, USA)에 용해하여 20㎎/㎖의 농로를 만들었다. 이 용액을 투약하기 바로 직전에 멸균 식염수 용액으로 1:5로 희석하여 최종 농도 4㎎/㎖로 만들었다. 마취 없이 마우스의 복강 내로 매일 5회의 동량의 복용량으로 주입하였다. 마우스 대조군에 대해 서는, 프로드럭 투여를 시작하기 48시간 전에 바이러스 대신에 PBS를 주입하였다. 종양 크기는 다음 27일동안 부척 달린 캘리퍼 (vernier calipers)를 사용하여 매일 측정하였다. 도 48은 이 결과를 나타낸다. 대조군에 대하여 제공된 CB1954 및 바이러스, 7/7 종양 어느 것도 계속해서 빨리 자라지 않는다. 종양의 퇴화는 NTR 발현 바이러스 및 CB1954 양자 모두에서 주어진 모든 군의 마우스의 일부에서 관찰될 수 있다. 낮은 복용량이 제공된 3/8 마우스 및 높은 복용량이 제공된 4/8 마우스에서 CTL102 퇴화가 관찰되었다. 5/8 및 6/8 마우스 각각에서 CTL208 퇴화가 관찰되었다. 이러한 결과는 CTL208에서, UCOE는 임의의 종양 세포에서의 AFP 프로모터로부터 강한 CMV 프로모터에 의해 제공되는 그들을 초과하는 수준까지 NTR 발현을 높이는 것을 확신하고, 이것은 GDEPT에 대한 임상 상황의 마우스 모델에서 보다 뛰어난 항-종양 효과를 나타낸다.
이러한 결과는 UCOE의 두 개의 중요하고 유용한 성질을 증명한다. 첫째, 유전자 치료에서 매우 잠재력이 큰 비통합 벡터인 Ad 환경에서의 발현을 실질적으로 향상시킨다. 둘째, 이것은 약하지만 특이 프로모터로부터 유용한 특이성을 갖는 보다 유용한 수준으로 발현을 상승시킨다.
FISH
분석
복제수는 마우스 Ltd 세포에서의 31 16 RNP-EGFP 클론에서 결정되었다. 트랜스펙션에 사용된 적은 양의 DNA(0.5-1.0㎍)에 기인하여, 단일 복제의 비는 매우 높았다(83%). 또한, EGFP 발현은 단일 복제 클론 내에서 2배 이상으로 변화하였고, 이것은 트랜스유전자는 양성 및 음성 위치 효과에 민감하다는 것을 나타냈다. 그럼 에도 불구하고, 세 개의 단일 복제 클론은 중심립 이형염색질에서 통합되었고(도 42), 이것은 상기 구조체이 염색질을 개방할 수 있다는 것을 나타낸다. 클론 F1 및 G6은 16RNP-EGFP 트랜스유전자는 로버트소니안 전좌에 의해 유래되는 경심 염색체의 중심립의 하나에서 통합되었고(도 b, c), 반면에 클론 I3에서는 통합이 전형적인 마우스 단부착사형(acrocentric) 염색체의 중심립에서 일어났다(도 d).
벡터
CET300
및
CET301
에서의 에리스로포이에틴(
EPO
)의 발현
벡터
CET300
및
CET301
에서의 에리스로포이에틴(
EPO
)의 구조체
에리스로포이에틴(EPO) 코드 서열은 프라이머 EP2(5'-CAGGTCGCTGAGGGAC-3') 및 EP4(5'-CTCGACGGGGTTCAGG-3')를 사용하여 인간 태아 간 퀵-클론TM cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, US)로부터의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었다. 전체 개방 리딩 프레임을 포함하는 결과 705bp 산물은 성숙핵 TA 클로닝 킷(Eukaryotic TA cloning kit)(Invitrogen, Griningen, The Netherlands)을 사용하여 벡터 pCR3.1로 서브 클론화하여 벡터 pCR-EPO를 생산하였다. EPO 서열은 양 스트랜드에서 자동 DNA 서열화에 의하여 확인되었다. EPO 코드 서열을 포함하는 790bp NheI-EcoRV 단편은 pCR-EPO에서 절단(切除)되고, 벡터 CET200과 CET201(각각 앞쪽 방향과 그 역 방향에서 7.5kb RNP 단편을 포함)의 NheI 및 PmeI 사이에서 서브 클론화되어, 각각 CET300 및 CET301 벡터를 생성하였다. 대조 벡터, pCMV-EPO는 NheI-NotI 단편으로서 pEGFP-N1으로부터 EGFP 코드 서열을 절단하고, EPO 코드 서열을 포함하는 pCR-EPO로부터 NheI-NotI으로 대체하여 생성되었다.
CHO
세포에서의 에리스로포이에틴의 발현
플라스미드 CET300, CET301 및 pCMV-EPO는 제한 엔도뉴클레아제 DraⅢ을 사용하여 선형화 되었다. 제한 DNA는 이어서 페놀 클로로포름 다음에 에탄올 침전에 의하여 정제되었다. DNA는 멸균수에 재현탁되고, 동량의 플라스미드를 CHO 세포로 일렉트로포레인션 되었다. 생존 가능한 세포는 225㎤ 배양 플라스크에 평판하고, 안정한 트랜스펙션 세포가 0.6㎎/㎖ G418을 포함하는 완전한 배지에 대하여 24시간 후에 배지를 대신하는 것에 의해 선택되었다. 세포는 G418-내성 콜로니가 존재할 때까지(일렉트로포레이션 후에 약 10일) 상기 배지에서 자랐다. 이어서 상기 플라스크를 비우고, 1㎖ 완전한 배지를 포함하는 6웰 접시에서 106 세포/웰로 세포를 뿌렸다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, Quantikine® IVD® 인간 EPO 면역 분석 킷(R & D systems, Minneapolis, US)을 사용하여 에리스로포이에틴의 수준을 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 정량화 하였다. 구조체 CET300, CET301 및 pCMV-EPO에 의해 생산된 EPO 수준은 각 1780U/㎖, 1040U/㎖ 및 128U/㎖ 이었다(도 40). 따라서, 앞방향 및 그 역방향에서 7.5kb RNP를 포함하는 구조체 CET300 및 CET301은 상기 실험에서 EPO를 발현하는 강한 도처에 있는 CMV 프로모터를 포함하는 대조 플라스미드 pCMV-EPO 보다, 거의 각각 14배와 8배 더 높은 수준에서의 EPO를 생성하였다.
hnRNP A2의 16 kb UCOE 단편이 있거나 또는 없는 EBV 리포터 구조체로 트랜스 펙션된 Hela 세포에서의 GFP 발현
하이그로마이신(hygromycine) 선택에 대해 유지되는 세포를 이용하는 초기 실험에서, RNP16 UCOE-포함 구조체(p220.RNP16)은 23일까지 EGFP의 고수준의 균질한 발현을 나타내는 반면, 보다 이질적인 EGFP 발현 양상은 p220.EGFP(UCOE가 없는 구조체)을 이용하여 관찰되었다. p220.EGFP-트랜스펙션 풀에서의 EGFP 발현은 점차적으로 잃게 되는 반면, 발현은 p220.RNP16-트랜스펙션 풀을 이용해서 160일 동안 안정하게 유지되었다.
세 번의 반복적인 실험은 다시 p220.EGFP-트랜스펙션 풀에서 관찰되는 이질적인 발현을 이용하여, p220.RNP16-트랜스펙션 풀에서의 동일한 양상의 고수준의 균질한 EGFP 발현을 증명하였다. 초기 실험을 이용하는 경우에서와 같이 EGFP 발현은 RNP16 UCOE가 있는 경우 안정하였고, UCOE가 없는 경우에는 불안정하였으며, 이 발현은 30-40일까지 극적으로 감소했다(도 43).
추가의 실험이 하이그로마이신 선택이 27일에서 제거되는 경우에 수행되었다. 이 결과는 선택이 없는 경우에도 EGFP 발현이 RNP16 UCOE가 있는 경우 안정하고 UCOE가 없는 경우 불안정하다는 것을 나타냈다(도 44).
실시예
3
UCOE
를 포함하는 플라스미드
도 50은 hnRNPA2 내인성 게놈좌와 비교하여 생성된 구조체과 사용된 단편을 나타낸다.
도 51은 순간적으로 트랜스펙션된 Hela 콜로니의 중앙 형광을 이용하여 FACs 분석의 그래프를 나타낸다. 이 세포는 상기된 바와 같은 CL22 펩티드 농축 리포터 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션되었다. 대조 CMV-GFP 리포터 구조체의 발현의 존속은 단기간이고, 24 내지 48 시간 후-트랜스펙션으로부터 극적으로 감소되었다.
대조와 대비하여, 플라스미드 7.5CMV-F를 포함하는 UCOE는 적어도 9일에서의 후 트랜스펙션에서, 확장된 시간에 걸쳐 상당한 GFP 발현을 나타내기 위하여 계속된다. 반복적인 실험에서, GFP 발현은 14일에서의 후 트랜스펙션에서 볼 수 있다.
도 52는 순간적으로 트랜스펙션된 HeLa 세포 콜로니의 관찰의 대표적인 낮은 확대 범위를 나타낸다. 이 데이터는 FACs 분석과 상관관계를 갖고, 세포를 유사한 시간 경로에 따를 수 있게 한다. 24시간에서의 후-트랜스펙션에서 상당한 수의 GFP 양성 세포는 CMV-GFP 및 7.5CMV 순간적 콜로니 모두에서 생존 가능하다(도 52a 및 b). 사실, 24시간에서 7.5CMV 트랜스펙션 콜로니에서 보다 대조 콜로니서 보다 많은 GFP 양성 세포가 있다는 것을 알 수 있다. 이것은 두 경우에서의 입력 DNA의 정량화는 정정된 유전자 투여량이 아니라는 사실에 기인하는 것이고, 트랜스펙션 당 대조 플라스미드의 상당히 많은 복제를 나타낸다. 그러나, 6일에서의 후-트랜스펙션에서, 양성 형광 세포가 거의 없고, 만일 있다고 하더라도 CMV-EGFP 대조 콜로니에 남는다(도 52c). 대비하여, 6일에서의 후-트랜스펙션에서, 7.5CMV 트랜스펙션 Hela 세포는 상당한 수의 GFP 발현 세포를 계속해서 나타냈다(도 52d). 사실 트랜스펙션 후 14일에서도 양성적으로 형광 세포가 쉽게 검출될 수 있었다(데이터를 기재하지 않음).
총 DNA는 전체 실험을 통해 여러 가지 시점들로부터 얻어지고, 선형화 되고, 겔에서 전개되고 블럿되었다(Matetrials and Method 참조). 흥미 있게도 6일에서 GFP의 발현이 거의 없거나 없는 세포의 대조 콜로니에서조차도 검출되었고, 이 플라스미드는 통합되지 않은 상태에서 용이하게 검출될 수 있었다(데이터를 기재하지 않음). 이것은 CMV-GFP 대조 플라스미드를 이용하여 나타내는 유전자 발현에서 빠른 손실은 플라스미드 주형의 장기적인 손실에 기인하지 않고, 오히려 유전자 발현의 염색질 일시 정시 메카니즘에 기인한다는 것을 지지하였다.
에리스로포이에틴 발현 벡터를 이용하는
CHO
세포의 순간
트랜스펙션
엄청나게 꼬여진 형태의 플라스미드 CET300, CET301 및 CMV-EPO는 표준 조건(975μF, 250V)을 사용하여 CHO 세포로 일렉트로포레이션 되었다. 생존 가능한 세포를 1㎖ 완전한 CHO 배지를 포함하는 6웰 접시에서 106 세포/웰로 뿌렸다. 배지는 이어서 24시간의 간격 후에 제거되고, 1㎖의 신선한 배지로 대신하였다. 배지 시료를 9일 동안 상기 방식으로 모았고, 에리스로포이에틴 수준을 Quantikine® IVD® 인간 EPO 면역 분석 킷(R & D systems, Minneapolis, US)을 사용하여 정량화 하였다. 첨부된 특징은 CET300, CET301 및 CMV-EPO 플라스미드를 이용하는 트랜스펙션된 세포에 의한 시간 경로의 에리스로포이에틴 발현을 나타낸다. 에리스로포이에틴 발현은 계속되어 모든 세포 콜로니에서 48시간 동안 올라갔다. 또한, CMV-EPO으로 트랜스펙션된 세포에 의한 에리스로포이에틴 발현은 매일의 근거에 대하여 떨어졌다. 반면, CET300 또는 CET301으로 트랜스펙션된 세포에 의하여 EPO 발현의 수준은 9일 동안을 통해 계속해서 올라갔다(도 45).