JP2009102331A - 遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｃｏｅ）を含むポリヌクレオチド - Google Patents

遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｃｏｅ）を含むポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

【課題】ＬＣＲ由来ではない遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドの提供。
【解決手段】単離されたポリヌクレオチドであって、ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位が、該ポリヌクレオチドがクロマチンを開くかまたはクロマチンを開いた状態に維持して作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするという点で特徴付けられるプロモーターと関連付けられる場合を除いて、該ポリヌクレオチドはメチル化されていない広範なＣｐＧ島を含み、そして該ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位を欠失する、ポリヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＬＣＲ由来ではない遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞、治療およびアッセイにおけるこのポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用、ならびにＵＣＯＥを同定する方法に関する。
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」に組織化されていると仮定している（ＤｉｌｌｏｎおよびＧｒｏｓｖｅｌｄ、１９９４）。クロマチンドメインは、ヒトβ−グロビンファミリー（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、１９９３）のように厳密な組織特異的様式で発現される遺伝子、ヒトＴＢＰ／Ｃ５遺伝子座（Ｔｒａｃｈｔｕｌｅｃ，Ｚ．ら、１９９７）のような遍在的に発現される遺伝子、またはマウスγ／δＴＣＲ／ｄａｄ−１遺伝子座（Ｈｏｎｇら、１９９７；Ｏｒｔｉｚら、１９９７）ならびにヒトα−グロビン遺伝子座（Ｖｙａｓら、１９９２）のような組織特異的に発現される遺伝子および遍在的に発現される遺伝子の混合物、の群からなり得る。２つの異なる組織特異性を有する遺伝子もまた、密接に連鎖され得る。例えば、ヒト成長ホルモンおよび絨毛性体乳腺発育ホルモン遺伝子（Ｊｏｎｅｓら、１９９５）。クロマチンドメインは、閉鎖した「凝縮された」転写的にサイレントな状態、または「非凝縮性の」開かれかつ転写的に能力を有する立体配置のいずれかで存在すると予見される。ＤＮａｓｅ Ｉ感受性、ＤＮＡの低メチル化およびヒストンの高アセチル化によって特徴付けられる開いたクロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始に対する先行条件であると考えられる。
遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）として公知の組織特異的転写調節エレメントの発見は、転写的に能力を有する開いたクロマチンドメインが、特定の症例において確立および維持される機構に対して新規の見識を提供した。ＬＣＲは、シス（ｃｉｓ）で連結された遺伝子に対して、特に単一コピーの導入遺伝子として（Ｅｌｌｉｓら、１９９６；Ｒａｇｕｚら、１９９８）、宿主細胞型で制限された、組み込み部位とは独立した、コピー数依存性の遺伝子発現を付与するそれらの能力によって規定される（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、１９８７；Ｌａｎｇら、１９８８；Ｇｒｅａｖｅｓら、１９８９；Ｄｉａｚら、１９９４；ＣａｒｓｏｎおよびＷｉｌｅｓ、１９９３；Ｂｏｎｉｆｅｒら、１９９０；Ｍｏｎｔｏｌｉｕら、１９９６；Ｒａｇｕｚら、１９９８；ＥＰ−Ａ−０ ３３２ ６６７）。ＬＣＲは、ヘテロクロマチンの展開（ｓｐｒｅａｄ）を妨げ得、そして位置効果の多様化を予防し得る（Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎら、１９９６；Ｍｉｌｏｔら、１９９６）。ＬＣＲによって付与されるこの発現のパターンは、これらのエレメントが、強力なクロマチンリモデリング能力を保有し、そして転写的に能力を有する開いたクロマチンドメインを確立および維持し得ることを示唆する。さらに、ＬＣＲは、それらの同属のプロモーターとは独立して、組織特異的遺伝子発現を付与することを可能にする固有の転写活性化能力を保有することが見出されている（Ｂｌｏｍ ｖａｎ Ａｓｓｅｎｄｅｌｆｔら、１９８９；Ｃｏｌｌｉｓら、１９９０；ＡｎｔｏｎｉｏｕおよびＧｒｏｓｖｅｌｄ、１９９０；Ｇｒｅａｖｅｓら、１９８９）。
すべてのＬＣＲは、顕著な組織特異的成分または組織を制限された成分を有する遺伝子ドメインと関連し、そして一連のＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）（これは、それらが調節する遺伝子の５’（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、１９８７；ＣａｒｓｏｎおよびＷｉｌｅｓ、１９９３；Ｂｏｎｉｆｅｒら、１９９４；Ｊｏｎｅｓら、１９９５；Ｍｏｎｔｏｌｉｕら、１９９６）、または３’（Ｇｒｅａｖｅｓら、１９８９）のいずれかに位置し得る）と関連する。さらに、ＬＣＲエレメントは、近接で隔てられた遺伝子間に存在することが近年見出された（Ｈｏｎｇら、１９９７；Ｏｒｔｉｚら、１９９７）。ＬＣＲ様エレメントはまた、遺伝子内にイントロンの位置を有することが報告されている（Ａｒｏｎｏｗら、１９９５）。研究されたいくつかの場合において、これらのエレメントは、組織特異的転写因子結合部位および遍在性転写因子結合部位の大きなクラスターに対応する（Ｔａｌｂｏｔら、１９９０；Ｐｈｉｌｉｐｓｅｎら、１９９０；Ｐｒｕｚｉｎａら、１９９１；Ｌａｋｅら、１９９０；Ｊａｒｍａｎら、１９９１；Ａｒｏｎｏｗら、１９９５）。
ＬＣＲの発見は、所定のクロマチンドメインからの組織特異的遺伝子発現を制御する調節エレメントが、階層様式で組織化されていることを示唆する。ＬＣＲは、マスタースイッチとして作用するようであり、ここでは、この活性化が、いかなる遺伝子発現にも先行する必要がある開いたクロマチン構造の確立をもたらす。次いで、生理学的に要求されるレベルでの転写が、ＬＣＲと個々の遺伝子の局所的プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントとの間で、介在ＤＮＡのルーピングを介した直接的クロマチン相互作用を通して達成され得る（Ｈａｎｓｃｏｍｂｅら、１９９１；Ｗｉｊｇｅｒｄｅら、１９９５；Ｄｉｌｌｏｎら、１９９７）。
上記のように、ＬＣＲの本質的特徴は、その組織特異性である。ＬＣＲの組織特異性は、Ｏｒｔｉｚら（１９９７）によって研究されており、ここではＴ細胞レセプターα（ＴＣＲα）ＬＣＲの多くのＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位が欠失され、そして多くの組織においてクロマチンを開かせるＬＣＲ由来のエレメントが同定された。Ｔａｌｂｏｔら（１９９４、ＮＡＲ ２２：７５６−７６６）は、多くの組織において連鎖遺伝子の発現を可能にすると考えられるＬＣＲ様エレメントを記載する。しかし、この連鎖遺伝子の再現可能な（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ）発現は得られていない。この発現レベルは、遺伝子コピーあたりの基準（ｐｅｒ−ｇｅｎｅ−ｃｏｐｙ ｂａｓｉｓ）（ここで、遺伝子は発現され、導入遺伝子のコピー数は３つ以上である）に対する平均値から７４％の間の標準偏差を有するとして示される。コピー数が１または２である場合、遺伝子発現レベルは１０倍低く、そして遺伝子コピーあたりの基準（ここで、遺伝子は発現される）に対する平均値から４９％の標準偏差を有する。Ｔａｌｂｏｔらによって開示されたエレメントは、連鎖した遺伝子の再現可能な発現を与えない。このことおよびこの系の高度な可変性は、この系の用途を明らかに限定する。
遺伝的に遺伝された障害の遺伝子治療による長期矯正は、治療的価値を有するに十分な高レベルでの、転写単位の維持および持続発現を必要とする。これは、２つのアプローチのうちの１つによって達成され得る。最初に、転写単位は、例えば、レトロウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２；Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２；Ｋｏｔｉｎ、１９９４；ＦｌｏｔｔｅおよびＣａｒｔｅｒ、１９９５）を使用して、宿主細胞ゲノム内に安定的に組みこまれ得る。あるいは、治療用遺伝子は、ＥＢＶ由来（Ｙａｔｅｓら、１９８５）、ヒトパポバウイルスＢＫ由来（Ｄｅ ＢｅｎｅｄｅｔｔｉおよびＲｈｏａｄｓ、１９９１；ＣｏｏｐｅｒおよびＭｉｒｏｎ、１９９３）およびＢＰＶ−１由来（Ｐｉｉｒｓｏｏら、１９９６）の複製起点のようなウイルス性複製起点を含む自己複製エピソームベクター内に組み込まれ得る。
不幸なことに、ゲノム内に組みこまれる遺伝子から通常見られる発現のレベルは、大半の場合には治療的価値があるには非常に低すぎるかまたは持続期間が短すぎる。これは、「位置効果」として一般的に公知のものに起因する。導入される遺伝子の転写は、競合する活性化エレメント（プロモーター／エンハンサー）またはより頻繁には抑制エレメント（クロマチンサイレンシング）のいずれかの影響下になるその組み込み部位に依存する。位置効果は、レトロウイルス起源およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）起源の組み込み型ウイルスに基づくベクターの治療的効力に対して、実質的な拘束を課し続ける。ウイルス転写調節エレメントは、組み込み部位の近傍におけるクロマチンエレメントによるサイレンシングに対して周知なように感受性である。ウイルス構築物の一部として高度に発現される遺伝子由来の伝統的なプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含ませることは、この主要な問題点を解決しなかった（Ｄａｉら、１９９２；Ｌｅｅら、１９９３）。
転写単位の一部として十分に機能的なＬＣＲを含ませることは、この欠陥を克服する。なぜなら、このエレメントは、特定の細胞型における所望の遺伝子の予想可能で、生理学的で、かつ持続された発現レベルを駆動するために使用され得るからである（ＹｅｏｍａｎおよびＭｅｌｌｏｒ、１９９２；ＢｒｉｎｅｓおよびＫｌａｕｓ、１９９３；Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９２および１９９３；Ｔｅｗａｒｉら、１９９８；Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖら、１９９５を参照のこと）。この発現の予測可能性の程度は、安全かつ首尾良い遺伝子治療ストラテジーのために重要である。
複製型エピソームベクター（ＲＥＶ）の使用は、長期間の遺伝子発現を生成する組み込み型ウイルスベクターに対して魅力的な代替を提供する。最初に、ＲＥＶは、ウイルスベクターが要求するのと同じような、治療用の転写単位に対する大きさの制限を要求せず、３００ｋｂを超える挿入物が可能である（Ｓｕｎら、１９９４）。第２に、エピソームであるので、ＲＥＶは、組み込み型ウイルスベクターに伴う固有の問題である挿入性変異誘発に関連する潜在的危険性を被らない。最後に、ＲＥＶは、ウイルスベクターを用いる場合よりも安価なスケールで生成され得る非ウイルス送達系を使用して、標的細胞内に導入される。
非複製性の一過的にトランスフェクトされるプラスミド（Ｒｅｅｖｅｓら、１９８５；Ａｒｃｈｅｒら、１９９２）およびＲＥＶ（Ｒｅｅｖｅｓら、１９８５；Ｓｍｉｔｈら、１９９３）の両方が、ヌクレオソームを構築することが実証された。ＲＥＶ上でのアセンブリは、より組織化されており、そして天然のクロマチンに類似する。一方、一過的プラスミド上でのヌクレオソームは、あまり十分に順序付けられておらず、そして標的配列への転写因子の幾分かの接近を可能にし得るが、遺伝子発現は阻害され得る（Ａｒｃｈｅｒら、１９９２）。ＬＣＲは、ＲＥＶ内からの長期間の組織特異的遺伝子発現を付与し得ることが、近年実証された（国際特許出願ＷＯ９８／０７８７６）。
高レベルの治療用タンパク質産物を生成する培養哺乳動物細胞株の産生は、主要な発展産業である。クロマチンの位置効果は、これを困難で、時間がかかり、かつ高価なプロセスにさせる。このような哺乳動物の「細胞工場」の産生に対して最も一般に使用されるアプローチは、薬物耐性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０））および高い有毒薬物濃度（これは、常時維持されていなければならない）との組み合わせによって誘導される遺伝子増幅に依存する。高度に発現された遺伝子ドメイン由来のＬＣＲを保有するベクターの使用は、これらの細胞株の産生を非常に単純化する（Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９２；Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９５）。
ＬＣＲの使用に伴う問題は、ＬＣＲが組織特異的であり、そして再現可能な発現が特定の細胞型においてのみ得られるということである。従って、ＬＣＲが存在しない１つの組織型または多くの組織型において、再現可能な発現は獲得され得ない。従って、ＬＣＲ由来ではないＵＣＯＥについての必要性が存在する。
上記のように、Ｏｒｔｉｚら（１９９７）は、多くの組織においてクロマチンを開かせるＬＣＲ由来のエレメントを開示する。Ｏｒｔｉｚら（１９９７）のＬＣＲ由来のエレメントに伴う多くの問題が存在する。特に、このエレメントは、ＬＣＲの必須領域を含むために、組換えＤＮＡ技術を使用して注意深く構築されなければならない。そしてまた、このエレメントは、特にこのエレメントが１または少数（３未満）の導入遺伝子コピー数である場合に、異なる組織型の細胞において連鎖した遺伝子の再現可能なレベルの発現を与えない。
二方向性プロモーターおよびメチル化されていないＣｐＧ島を含むエレメントが、開示されている；しかし、このエレメントがクロマチンを開くか、または開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは、全く開示も指摘もされていない。
ヒトＳｕｒｆｅｉｔ遺伝子座は、およそ６０ｋｂにわたり、そして染色体９ｑ３４．２に位置する。この遺伝子座は、ＳＵＲＦ５遺伝子とＳＵＲＦ３遺伝子との間、およびＳＵＲＦ１遺伝子とＳＵＲＦ２遺伝子との間に二方向性プロモーターを含む（Ｈｕｘｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０、６０５−６１４、１９９０；Ｄｕｈｉｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５２、７２−７８、１９９８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６、４５５８−４５６９、１９８６）。これらの領域が、クロマチンを開くかまたは開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは全く指摘されていない。
二方向性プロモーターはまた、鳥類のＧＰＡＴ遺伝子とＡＩＲＣ遺伝子との間で、Ｂｒａｙｔｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：５３１３−５３２１、１９９４）によって開示されている。重ねて、この領域が、クロマチンを開くかまたは開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは全く指摘されていない。
二方向性プロモーターは、ミトコンドリアのシャペロニン（ｃｈａｅｒｏｎｉｎ）６０遺伝子とシャペロニン１０遺伝子との間で、Ｒｙａｎら（Ｇｅｎｅ、１９６、９−１７、１９９７）によって開示されている。重ねて、この領域が、クロマチンを開くかまたは開いた状態にクロマチンを維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることは全く指摘されていない。
マウスＨＴＦ９遺伝子と結合した二方向性プロモーターもまた、開示される。重ねて、この領域がクロマチンを開くか、またはクロマチンを開いた状態に維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするという指摘は存在しない。
Ｐａｌｍｉｔｅｒら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９５、８４２８〜８４３０、１９９８）および国際特許出願ＷＯ ９４／１３２７３は、メタロチオネイン遺伝子と結合したエレメントを開示する。このエレメントは、プロモーターと結合しないＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位を含む。さらに、このエレメントがクロマチンを開かないか、またはクロマチンを開いた状態に維持せず、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることを示す証拠は存在しない。
複製せず、一過的にトランスフェクトされたプラスミドが、トランスフェクトした細胞による遺伝子発現を達成する使用は、周知である。短期間発現（一般的に７２時間未満）のみが複製せず一過的にトランスフェクトされたプラスミドを使用して達成されることもまた、公知である。短期間の発現は、一般的に、プラスミドの分解または細胞からのプラスミドの損失に起因すると考えられている。この分解を考慮すると、このようなプラスミドの使用は制限される。
項目１ ＵＣＯＥを含む、ポリヌクレオチドであって、クロマチンを開くかまたはクロマチンを開いた状態で維持し、そして、少なくとも２つの異なった組織型の多細胞における作動可能に連結した遺伝子の再現可能な発現を促進し、ここで、該ポリヌクレオチドは、遺伝子座制御領域に由来しない、ポリヌクレオチド。
項目２ 組織非特異的に、作動可能に連結した遺伝子の再現可能な発現を促進する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
項目３ 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、全ての組織型における作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を促進する、ポリヌクレオチド。
項目４ 生理学的レベルで、作動可能に連結した遺伝子の発現を促進する、項目１〜３に記載のポリヌクレオチド。
項目５ 前記ＵＣＯＥが伸長されたメチル化されていないＣｐＧ島を含む、項目１〜４に記載のポリヌクレオチド。
項目６ 項目１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ＵＣＯＥが、その天然の内因性の位置において、遍在的に発現する遺伝子と結合している配列から誘導される、ポリヌクレオチド。
項目７ 項目１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ＵＣＯＥが、二重プロモーターまたは二方向プロモーターである、ポリヌクレオチド。
項目８ 前記ＵＣＯＥが、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質遺伝子ならびに各々１２ｋｂの５’隣接配列および３’隣接配列にわたる４４ｋｂのＤＮＡフラグメントで、またはその機能的フラグメントを含む、項目１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項目９ 前記ＵＣＯＥが、５’隣接領域の３０ｋｂおよび３’隣接領域の２０ｋｂを伴う、ヒトｈｎＲＮＰＡ２遺伝子に及ぶ６０ｋｂ ＤＮＡフラグメント、またはその機能的ホモログまたはフラグメントである、項目１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
項目１０ 前記ＵＣＯＥが、１〜６２６４の間に、図２１の配列またはそれらの機能的ホモログまたはフラグメントを含む、項目１〜項目７のいずれか１項に記載の、ポリヌクレオチド。
項目１１ 前記ＵＣＯＥが、１〜５６３６の間に、図２１の配列およびＣＭＶプロモーター、またはそれらの機能的ホモログまたはフラグメントを含む、項目１〜項目７のいずれか１項に記載の、ポリヌクレオチド。
項目１２ 前記ＵＣＯＥが、４１０２〜８２８６の間に、図２１の配列またはそれらの機能的ホモログまたはフラグメントを含む、項目１〜項目７のいずれか１項に記載の、ポリヌクレオチド。
項目１３ 前記ＵＣＯＥが、１〜７６２７の間に、図２１の配列、またはそれらの機能的ホモログまたはフラグメントを含む、項目１〜項目７のいずれか１項に記載の、ポリヌクレオチド。
項目１４ 前記ＵＣＯＥが、１〜９１２７の間に、図２１の配列またはそれらの機能的ホモログまたはフラグメントを含む、項目１〜項目７のいずれか１項に記載の、ポリヌクレオチド。
項目１５ 前記ポリヌクレオチドが、１ｋｂの５’隣接配列および５ｋｂの３’隣接配列を伴うヒトＴＢＰ遺伝子にわたる２５ｋｂのＤＮＡフラグメントまたはその機能的フラグメントを含む、項目１〜項目７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
項目１６ 項目１〜項目７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＵＣＯＥが、５ｋｂの５’隣接配列および１．５ｋｂの３’隣接配列を伴うヒトＨｎＲＮＰ Ａ２遺伝子にわたる１６ｋｂのＤＮＡフラグメントまたはその機能的フラグメントである、項目１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項目１７ 項目１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記ＵＣＯＥが図２０または図２１のヌクレオチド配列、またはそれらの機能的フラグメントまたはホモログを含む、ポリヌクレオチド。
項目１８ 前記ＵＣＯＥの１以上のプロモーターが外因性プロモーターである、項目１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項目１９ 他のＵＣＯＥを同定するためのアッセイにおける、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
項目２０ ＵＣＯＥを同定するための方法であって、該ＵＣＯＥは、少なくとも２つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結した遺伝子の再現可能な発現を容易にし、該方法は、以下：
１．少なくとも２つの異なる組織化の細胞をマーカー遺伝子に作動可能に連結した候補ＵＣＯＥでトランスフェクトすることによって、該候補ＵＣＯＥを試験する試験する工程；
２．該マーカー遺伝子の再生可能な発現が２以上の異なる組織型の細胞において取得される工程
を包含する、方法。
項目２１ 項目１〜１８のいずれかに１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。項目２２ 前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した発現可能な遺伝子をさらに含む、請求項２１に記載のベクター。
項目２３ 前記ベクターがエピソームベクターである、項目２１または２２に記載のベクター。
項目２４ 前記ベクターがプラスミドである、項目２１または２２に記載のベクター。
項目２５ 前記作動可能に連結された遺伝子が治療用核酸である、項目２２〜２４のいずれかに記載のベクター。
項目２６ 請求項２１に記載のベクターであって、ヌクレオチド１と７６２７との間に、図２０に記載の配列、ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位、ポリアデニル化配列、および適切な制御エレメントの下にある選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む、ベクター。
項目２７ 図４９に図解して説明される、ＣＥＴ２００ベクター。
項目２８ 図４９に図解して説明される、ＣＥＴ２１０ベクター。
項目２９ 項目２１〜２８のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
項目３０ 遺伝子治療における使用のための組成物の製造において、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目２１〜２８のいずれかに記載のベクター、または項目２９に記載の宿主細胞の使用。
項目３１ 遺伝子治療における使用のための組成物の製造における、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目２１〜２８のいずれかに記載のベクター、または項目２９に記載の宿主細胞の使用。
項目３２ 処置方法であって、有効用量の項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２１〜２８のいずれか１項に記載のベクター、または項目２９に記載の宿主細胞を、そのような処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、処置方法。
項目３３ 薬学的に受容可能な賦形剤との組み合わせにおいて、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目２１〜２８のいずれか１項に記載のベクター、または項目２９に記載の宿主細胞を含む、薬学的組成物。
項目３４ 所望の遺伝子産物を得るための細胞培養系における、項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２１〜２８のいずれか１項に記載のベクター、または項目２９に記載の宿主細胞の使用。
項目３５ 内在性遺伝子の発現を増加させるための、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用であって、該内在性遺伝子と作動可能に連結される位置で細胞のゲノム中に該ポリヌクレオチドを挿入し、それにより該遺伝子の発現レベルを増加させる工程を包含する、使用。
項目３６ 項目１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、非ヒトトランスジェニック動物。
項目３７ アンチセンス遺伝子配列の発現を得て、対応する遺伝子配列の発現を不活化するための、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
項目３８ 発現ライブラリーの調製における、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
項目３９ 非ヒト動物において発現可能な遺伝子を同定するための方法における、項目１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用であって、該方法は、非ヒト動物の胚幹細胞内に該ポリヌクレオチドを含む 構築物を挿入する工程を包含し、ここで、該構築物は、発現される遺伝子内への挿入後に薬物選択を可能にする、使用。
本発明は、クロマチンを開くか、またはクロマチンを開いた状態に維持するかして、少なくとも２つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするＵＣＯＥを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで、このポリヌクレオチドは、遺伝子座調節領域に由来しない。
「遺伝子座調節領域」（ＬＣＲ）は、真核生物宿主細胞の組織特異的遺伝子座から得られ、そして目的の遺伝子に連結されて宿主細胞の染色体に導入された場合に目的の遺伝子に対して組織特異的で、組み込み部位とは独立な、コピー数依存性の発現を、目的の遺伝子に対して付与する遺伝的エレメントとして規定される。ＬＣＲに由来するポリヌクレオチドは、ＬＣＲの１つまたは複数の任意の部分であり得る。好ましくは、ＬＣＲに由来するポリヌクレオチドは、クロマチンを開くように機能するＬＣＲの任意の部分である。ＬＣＲは、プロモーターと結合しない１つ以上のＤＮａｓｅ Ｉ高感受性（ＨＳ）部位と結合する。そして、ＵＣＯＥが、プロモーターと結合しないＨＳ部位を含まないことが好ましい。ＨＳ部位は、当業者に周知であり、そして標準的技術に基いて同定され得る。そのような標準技術は、本明細書中に記載される。
用語「再現可能な発現を容易にする」とは、ＵＣＯＥが、作動可能に連結された遺伝子の転写の再現可能な活性化を容易にする能力をいう。このプロセスは、ＵＣＯＥが、この遺伝子（または少なくとも転写因子結合部位）を包含するクロマチンの領域を、転写因子と接近可能にする能力に関与すると考えられている。再現可能な発現とは、好ましくは、このポリヌクレオチドが、発現可能な遺伝子に作動可能に連結された場合に、そのクロマチン環境とは無関係に、好ましくは細胞組織型とは無関係に、作動可能に連結された遺伝子の実質的に同レベルの発現を生じることを意味する。好ましくは、実質的に同レベルの発現とは、遺伝子コピーあたりの基準に対して、平均値から、４８％未満、より好ましくは４０％未満、そして最も好ましくは２５％未満の標準偏差を有する発現のレベルを意味する。あるいは、実質的に同レベルの発現とは、好ましくは、発現のレベルが、遺伝子コピーあたりの基準に対して、１０倍未満、より好ましくは５倍未満、そして最も好ましくは３倍未満変化することを意味する。発現のレベルは、好ましくは、トランスジェニック動物において測定された発現のレベルである。ＵＣＯＥが、１または低（３未満）コピー数で存在する場合に、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にすることが、特に好ましい。
本明細書中で使用された場合に、「連結された」とは、遺伝子およびＵＣＯＥが同一の核酸分子上にシス（ｃｉｓ）関係で存在するシス連結をいう。用語「作動可能に連結された」とは、遺伝子がＵＣＯＥにより容易にされた発現に供されたシス連結をいう。
開いたクロマチンまたは開いた状態のクロマチンは、非凝縮状態にあるクロマチンをいい、そしてまた真正クロマチンとも言われる。凝縮したクロマチンはまた、ヘテロクロマチンとも言われる。上述のように、閉じた（凝縮した）状態のクロマチンは、転写的にサイレントである。開いた（非凝縮性の）状態のクロマチンは、転写的に能力がある。開いたクロマチン構造の確立は、ＤＮａｓｅ Ｉ感受性、ＤＮＡの低メチル化およびヒストンの高アセチル化により特徴付けられる。開いたクロマチンを同定する標準的方法は、当業者に周知であり、そしてＷｕ、１９８９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７０、２６９〜２８９；Ｃｒａｎｅ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２、４８〜５６；Ｒｅｉｎら、１９９８、Ｎ．Ａ．Ｒ．２６、２２５５〜２２６４に記載されている。
用語「２つ以上の組織型の細胞」とは、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つ、そしてより好ましくは全ての、以下の異なる組織型の細胞をいう：心臓、腎臓、肺、肝臓、腸、骨格筋、性腺、脾臓、脳、および胸腺組織。好ましくは、ポリヌクレオチドは、非組織特異的に、すなわち、組織特異性なしで、再現可能な発現を容易にする。本発明のポリヌクレオチドが、活性な遺伝子が生じる組織型の少なくとも５０％、そしてより好ましくはすべてにおいて再現可能な発現を容易にすることがさらに好ましい。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、生理学的レベルで、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする。生理学的レベルにより、細胞、細胞の集団または患者での発現が生理学的効果を示す遺伝子発現のレベルが意味される。好ましくは、この生理学的レベルは、所望の結果に依存して最適の生理学的レベルである。好ましくは、この生理学的レベルは、対応する内在性遺伝子の発現のレベルに等価である。
本発明のＵＣＯＥは、任意のエレメントであり得、このエレメントは、クロマチンを開くかまたはクロマチンを開いた状態に維持するかして、少なくとも２つの異なる組織型の細胞における作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするが、ただしこのエレメントは、ＬＣＲに由来しない。好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、伸長したメチル化していないＣｐＧ島を含む。ＣｐＧ島は、バルクＤＮＡにおける平均４０％と比較して、平均ＧＣ含量約６０％を有する。当業者は、標準技術を使用して（例えば、ＣおよびＧ配列に特異的な制限酵素を使用して）ＣｐＧ島を容易に同定し得る。このような技術は、Ｌａｒｓｅｎら、１９９２およびＫｏｌｓｔｏら、１９８６に記載されている。広がったメチル化していないＣｐＧ島とは、１より多い転写開始部位を包含する領域にわたって広がり、そして／または３００ｂｐを超えて、そして好ましくは５００ｂｐを超えて広がる、メチル化していないＣｐＧ島である。
好ましくは、ＵＣＯＥは、その天然の内在性の位置において、遍在して発現される遺伝子と結合し、より好ましくはそれに隣接して位置付けられる配列に由来する。ＵＣＯＥは、少なくとも１つの転写因子結合部位を包含することが、さらに好ましい。転写因子結合部位は、プロモーター配列およびエンハンサー配列を含む。好ましくは、ＵＣＯＥは、多岐に転写される、二重プロモーターまたは二方向性プロモーターを含む。二重プロモーターは、互いに独立している２つ以上のプロモーターであり、その結果、そのプロモーターのうちの１つが、他のプロモーターに影響することなく活性化または不活化され得るとして、本明細書中で規定される。二方向性プロモーターとは、両方の方向でプロモーターとして作用し得るが、１つの方向のみでは活性化または不活化され得ない領域として、本明細書中で規定される。好ましくは、ＵＣＯＥは、二重プロモーターを包含する。好ましくは、ＵＣＯＥは、多岐に転写し（すなわち、反対方向の転写を導き得）、そしてその天然の内在性位置が遍在して発現される遺伝子と結合する、二重または二方向性プロモーターを含む。好ましくは、ＵＣＯＥは、多岐に転写する二重プロモーターを含む。ＵＣＯＥは、異種プロモーター（すなわち、ＵＣＯＥの他の配列と天然には結合しないプロモーター）を含み得る。例えば、ｈｎＲＮＰ
Ａ２およびＨＰ１Ｈ−γプロモーターと結合したＵＣＯＥを伴ってＣＭＶプロモーターを使用することが可能であり、これは、以下にさらに考察される。従って、本発明はまた、１つ以上の異種プロモーターを含むＵＣＯＥを提供する。異種プロモーター（単数または複数）は、ＵＣＯＥの１つ以上の内在性プロモーターを置換し得るか、またはＵＣＯＥの１つ以上の内在性プロモーターに加えて使用され得る。異種プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、腫瘍特異的プロモーターおよび遍在性プロモーター）を含む任意のプロモーターであり得る。好ましくは、異種プロモーターは、実質的に遍在性のプロモーターであり、そして最も好ましくはＣＭＶプロモーターである。
好ましくは、ＵＣＯＥは、Ｌａｖｉａら、ＥＭＢＯ Ｊ.，６，２７７３〜２７７９（
１９８７）に記載されるように、ＨｐａＩＩの小さいフラグメント（ＨＴＦ）島ＨＴＦ９の二方向性プロモーターを含む、３７２５ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントではない。
好ましくは、ＵＣＯＥは、Ｓｕｒｆｅｉｔ遺伝子座（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、４７８４〜４７９２、１９９３）のマウスＳＵＲＦ１遺伝子とＳＵＲＦ２遺伝子との間に位置する８００ｂｐ ＢａｍＨＩゲノムフラグメント内に位置する１４９ｂｐのＭＥＳ−１エレメントではない。好ましくは、ＵＣＯＥは、Ｓｕｒｆｅｉｔ遺伝子座（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、４７８４〜４７９２、１９９３）のＳＵＲＦ５遺伝子とＳＵＲＦ３遺伝子との間に位置する二方向性プロモーターではない。ＵＣＯＥは、Ｄｕｈｉｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５２、７２〜７８（１９９８）に規定されるように、６０ｋｂにわたりそして染色体９ｑ３４．２に位置するヒトｓｕｒｆｅｉｔ遺伝子の遺伝子座、または対応するマウス遺伝子座（Ｈｕｘｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０、６０５〜６１４、１９９０）に由来しない。
好ましくは、ＵＣＯＥは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託された１３５０ｂｐ ＳｍａＩフラグメント（登録番号Ｌ１２５３３）（Ｇａｖａｌａｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、４７８４〜４７９２、１９９３）に含まれる、鳥類ＧＰＡＴ遺伝子とＡＩＲＣ遺伝子との間に位置する二方向性プロモーター領域、または対応するヒトの等価物（Ｂｒａｙｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、５３１３〜５３２１、１９９４）ではない。
好ましくは、ＵＣＯＥは、ラットのミトコンドリアシャペロニン６０遺伝子およびシャペロニン１０遺伝子を含む１３８９４ｂｐゲノムＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６８５６２）ではない。ＵＣＯＥが、ラットのミトコンドリアシャペロニン６０遺伝子とシャペロニン１０遺伝子との間の遺伝子間領域に位置する二方向性プロモーター（Ｒｙａｎら、Ｇｅｎｅ １９６、９−１７、１９９７）を含む５８１ｂｐフラグメントではないこともまた、好ましい。
本発明の好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子ならびに各々１２ｋｂの５’隣接配列および３’隣接配列にわたる４４ｋｂのＤＮＡフラグメント、またはその機能的ホモログもしくはフラグメントである。
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、３０ｋｂの５’隣接配列および２０ｋｂの３’隣接配列を伴ってヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子に広がる、６０ｋｂ ＤＮＡフラグメント、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントである。さらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、ヌクレオチド１から６２６４の間の図２１の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、ｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーター（ヌクレオチド５６３６〜６２６４）、およびＨＰ１Ｈ−γプロモーターを含む５．５ｋｂの５’隣接配列を包含する。
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、１ｋｂの５’隣接配列および５ｋｂの３’隣接配列を伴ってヒトＴＢＰ遺伝子に広がる、２５ｋｂのＤＮＡフラグメント、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントである。
さらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、５ｋｂの５’隣接配列および１．５ｋｂの３’隣接配列を伴ってヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子に広がる、１６ｋｂのＤＮＡフラグメント、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントである。
さらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、ヌクレオチド１と５６３６との間の図２１の配列（ｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーターの５．５ｋｂの５’隣接配列）およびＣＭＶプロモーター、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。
さらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、ヌクレオチド４１０２と８２８６との間の図２１の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、ｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーターおよびＨＰ１Ｈ−γプロモーターの両方を包含する。
さらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、ヌクレオチド１と７６２７との間の図２１の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、ｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーターおよびＨＰ１Ｈ−γプロモーターならびにｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子のエキソン１の両方を包含する。
さらに好ましい実施態様において、ＵＣＯＥは、ヌクレオチド１と９１２７との間の図２１の配列、あるいはその機能的ホモログまたはフラグメントを含む。この配列は、ｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーターおよびＨＰ１Ｈ−γプロモーター、ならびにｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーターの３’隣接配列（ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子のエキソン２までだが、このエキソン２を含まない）の両方を包含する。
本発明のＵＣＯＥが、図２０または図２１のヌクレオチド配列、あるいはその機能的フラグメントまたはホモログを有することが、さらに好ましい。
用語「機能的ホモログまたはフラグメント」とは、本明細書中で使用される場合、クロマチンを開くかまたはクロマチンを開いた状態に維持して、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にする、ホモログまたはフラグメントを意味する。好ましくは、このホモログは、同定されたＵＣＯＥに対応する種ホモログであるか、あるいは他の遍在して発現される遺伝子と結合するホモログである。配列比較がＵＣＯＥ間でなされて、他のＵＣＯＥの同定および合成を可能にする保存配列モチーフが同定され得る。このような配列比較を実施するに適切なソフトウェアパッケージは、当業者に周知である。配列比較を実施するに好ましいソフトウェアパッケージは、ＰＣＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）である。機能的フラグメントは、既知のＵＣＯＥのフラグメントを組織的に生成し、そして機能について試験することにより、容易に同定され得る。保存配列モチーフの同定もまた、機能的フラグメントの同定を補助する。なぜなら、この保存配列モチーフを含むフラグメントは、機能的であると思われるからである。機能的ホモログはまた、改変されたＵＣＯＥ（ここで、このＵＣＯＥのエレメントは、類似のエレメントにより置換されている（例えば、ＵＣＯＥの１つ以上のプロモーターを異なる異種プロモーターで置換する））を包含する。上記のように、異種プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、腫瘍特異的プロモーターおよび遍在性プロモーター）を含む任意のプロモーターであり得る。好ましくは、この異種プロモーターは、強力な、かつ／または実質的に遍在性プロモーターであり、そして最も好ましくはＣＭＶプロモーターである。
本発明の別の実施態様において、少なくとも２つの異なる組織型の細胞において、作動可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を容易にするＵＣＯＥを同定する方法が提供される。この方法は、以下を包含する：
１．少なくとも２つの異なる組織型の細胞を、マーカー遺伝子に作動可能に連結された候補ＵＣＯＥを含むベクターでトランスフェクトすることにより、候補ＵＣＯＥを試験する工程；および
２．そのマーカー遺伝子の再現可能な発現が、２つ以上の異なる組織型の細胞において得られるか否かを決定する工程。
好ましくは、本発明のＵＣＯＥを同定する方法は、遍在して発現される遺伝子、二重または二方向性プロモーター、および伸長したメチル化していないＣｐＧ島のうちの１つ以上と結合する候補ＵＣＯＥを選択するさらなる工程を包含する。
好ましくは、このマーカー遺伝子の再現可能な発現は、このマーカー遺伝子に連結された単一コピーのＵＣＯＥを含む細胞において決定される。
本発明は、本発明の方法をさらに提供する。この方法において、候補ＵＣＯＥが、以下の工程によって試験される：マーカー遺伝子に作動可能に連結された候補ＵＣＯＥを含むベクターを含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を生成する工程、およびこのマーカー遺伝子の再現可能な発現が、２つ以上の異なる組織型の細胞において得られるか否かを決定する工程。好ましくは、この非ヒトトランスジェニック動物はＦ１、または、より遠い世代の非ヒトトランスジェニック動物である。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は、齧歯類、より好ましくはマウスである。
本発明は、遍在して発現される遺伝子に結合するかまたは隣接する核酸配列に由来し得るＵＣＯＥを提供する。好ましくは、この核酸配列は、伸長した、メチル化していないＣｐＧ島を含む。この核酸配列が、少なくとも１つの転写因子結合部位を含むことがさらに好ましい。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写される、二重または二方向性プロモーターを含む。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写される、二重プロモーターを含む。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写され、そして遍在的に発現される遺伝子に結合した、二重または二方向性プロモーターを含む。好ましくは、この核酸配列は、多岐に転写され、そして遍在的に発現される遺伝子に結合した、二重プロモーターを含む。
本発明はまた、他のＵＣＯＥを同定するためのアッセイにおける、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの使用を提供する。好ましくは、保存配列または保存構造モチーフを含むポリヌクレオチドのフラグメントが、使用される。このようなアッセイを実施する方法は、当業者に周知である。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このベクターは、好ましくは、このポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現可能な遺伝子を含む。この発現可能な遺伝子は、以下のような遺伝子発現を可能にする必要なエレメントを含む：適切なプロモーター、エンハンサー、スプライスアクセプター配列、内部リボソーム侵入部位配列（ＩＲＥＳ）および転写終止部位。遺伝子発現を可能にするに適切なエレメントは、当業者に周知である。遺伝子発現を可能にするに適切なエレメントは、この遺伝子に結合した天然の内在性エレメントであり得るか、あるいは内在性遺伝子と比較して異なるレベルまたは異なる組織分布の遺伝子発現を得るために使用される異種エレメントであり得る。好ましくは、このベクターは、発現可能な遺伝子と作動可能に結合したプロモーターおよびそのポリヌクレオチドを含む。このプロモーターは、発現可能な遺伝子の天然の内在性プロモーターであり得るか、あるいは異種プロモーターであり得る。異種プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、腫瘍特異的プロモーターおよび遍在性プロモーター）を含む任意のプロモーターであり得る。好ましくは、この異種プロモーターは、強力かつ／または実質的に遍在性のプロモーターであり、そして最も好ましくはＣＭＶプロモーターである。
このベクターは、細胞にＤＮＡを移入し得る任意のベクターであり得る。好ましくは、このベクターは、組み込み型ベクターまたはエピソームベクターである。
好ましい組み込み型ベクターは、組換えレトロウイルスベクターを含む。組換えレトロウイルスベクターは、その部分が標的細胞に感染し得るレトロウイルスゲノムの少なくとも一部のＤＮＡを含む。用語「感染」とは、ウイルスがその宿主または標的細胞に遺伝物質を移入するプロセスを意味するために使用される。好ましくは、本発明のベクターの構築において使用されるレトロウイルスはまた、複製欠損性にされて、標的細胞のウイルス複製の効果が除かれる。このような場合、この複製欠損ウイルスゲノムは、従来の技術に従って、ヘルパーウイルスによりパッケージされ得る。一般的に、感染性および機能的遺伝子移入の能力の上記の基準を満たす任意のレトロウイルスが、本発明の実施において使用され得る。
適切なレトロウイルスベクターとしては、ｐＬＪ、ｐＺｉｐ、ｐＷｅおよびｐＥＭが挙げられるが、これらに限定されず、当業者に周知である。複製欠損レトロウイルスに適切なパッケージングウイルス株としては、例えば、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。
本発明において有用な他のベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶウイルスおよびポックスウイルスベクターが挙げられる。好ましいベクターは、アデノウイルスである。アデノウイルスベクターは、当業者に周知であり、そして多数の細胞型（気道上皮、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む）に遺伝子を送達するために使用されている（Ｈｉｔｔ，ＭＭ、Ａｄｄｉｓｏｎ ＣＬおよびＧｒａｈａｍ，ＦＬ（１９９７）Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ.Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３７〜２０６；
ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９８）Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ.
Ｎａｔｕｒｅ ３９２（６６７９補遺）：２５〜３０）。
さらに好ましいベクターは、アデノ随伴（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、当業者に周知であり、そしてヒトＴリンパ球、線維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および造血幹細胞を、遺伝子治療適用のために安定に形質導入するために使用されている（Ｐｈｉｌｉｐら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、２４１１〜２４１８；Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１、８９１５〜８９１９；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９０、１０６１３〜１０６１７；Ｗａｌｓｈら、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８９、７２５７〜７２６１；Ｍｉｌｌｅｒら、１９９４、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１、１０１８３〜１０１８７；Ｅｍｅｒｓｏｎ、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８７、３０８２〜３０８８）。国際特許出願ＷＯ ９１／１８０８８は、特定のＡＡＶベースのベクターを記載している。
好ましいエピソームベクターには、ウイルスの複製起点由来の機能を有する、一過性の非複製エピソームベクターおよび自己複製性エピソームベクター（例えば、ＥＢＶ、ヒトパポバウイルス（ＢＫ）およびＢＰＶ−１由来のベクター）が含まれる。このような組み込みおよびエピソームベクターは、当業者に周知であり、そして当業者に周知である文献の本文に十分に記載されている。特に、適切なエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載されている。
哺乳動物人工染色体もまた、本発明における使用のための好ましいベクターである。哺乳動物人工染色体の使用は、Ｃａｌｏｓ（１９９６，ＴＩＧ，１２，４６３−４６６）によって議論される。
好ましい実施態様において、本発明のベクターはプラスミドである。そのプラスミドが、非複製、非組み込みプラスミドであることは、さらに好ましい。
本明細書中で使用される場合、用語「プラスミド」とは、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸分子をいい、これには、線状核酸、環状核酸、および二本鎖核酸または一本鎖酢酸が含まれる。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして改変されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得、そしてメチル化あるいは保護基またはキャップ構造もしくはテール構造を含むことのような手段によって化学的に改変され得る。
非複製、非組み込みプラスミドは、宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、複製せず、そして宿主細胞ゲノムに特異的に組み込まれることがない（すなわち、高頻度で組み込まれず、そして特定の部位に組み込まれない）核酸である。
複製プラスミドは、Ｕｓｔａｖら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，４４９−４５７，１９９１の標準的な複製アッセイを含む標準的なアッセイを使用して同定され得る。
好ましくは、非複製、非組み込みプラスミドは、ゲノムＤＮＡ複製と独立して、細胞に安定に維持され得ないプラスミドであり、そして細胞中のプラスミドのコピー数の有意な損失（すなわち、所定の細胞分裂間での子孫細胞におけるプラスミド分子の平均約５０％より多い損失を伴うこと）なしでは、３回以上の細胞分裂の間、子孫細胞において持続されないプラスミドである。一般的に、自己複製ベクターにおいて、自己複製機能は、ウイルスの複製起点を使用すること、および特定のウイルス起点によって媒介される複製のために必要とされる１つ以上のウイルス複製因子を提供することによって提供される。自己複製ベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載される。本明細書中において、用語「一過的にトランスフェクトする、非組み込みプラスミド」は、上記の用語「非複製、非組み込みプラスミド」と同じことを意味する。
好ましくは、そのプラスミドは、裸の核酸である。本明細書中で使用される場合、用語「裸の」とは、共有結合か、または水素結合かに関わらず、タンパク質、脂質、炭水化物、またはプロテオグリカンと直接的物理的に結合していない核酸分子をいう。この用語は、改変された核酸分子もしくはリボヌクレオチド、または、メチル化あるいは保護基またはキャップ構造もしくはテール構造を含むことのような手段による、核酸分子のすべてまたは一部の化学修飾の存在または非存在をいうのではない。
好ましくは、本発明のベクターは、ヌクレオチド１と７６２７との間である図２０の配列（ｈｎＲＮＰ Ａ２プロモーターおよびＨＰ１Ｈ−γプロモーターの両方を含む）、ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位、ポリアデニル化配列、および適切な制御エレメント下で選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む。好ましくは、本発明のベクターは、図４９に模式的に示すＣＥＴ２００ベクターまたはＣＥＴ２１０ベクターである。
本発明はまた、本発明のベクターを用いてトランスフェクトした宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および哺乳動物細胞のような任意の細胞であり得る。好ましくは、この宿主細胞は哺乳動物細胞であり、そしてＣＨＯ細胞株、２９３細胞株、およびＮＳ０細胞のような哺乳動物細胞株に由来し得る。
好ましくは、作動可能に連結された遺伝子は、治療用核酸配列である。本発明において使用され得る、治療的に有用な核酸配列には、レセプター、酵素、リガンド、調節因子、ホルモン、抗体もしくは抗体フラグメント、および構造タンパク質をコードする配列が挙げられる。治療用核酸配列にはまた、核タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、血清タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生生物抗原、および寄生生物抗原をコードする配列が挙げられる。本発明に従って有用な核酸配列にはまた、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、リンタンパク質、および核酸（例えば、ＲＮＡまたはアンチセンス核酸）をコードする配列が挙げられる。治療用核酸配列によってコードされ得るタンパク質またはポリペプチドには、ホルモン、増殖因子、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、レセプター、エリトロポイエチン、治療抗体またはそのフラグメント、薬物、オンコジーン、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、ウイルス抗原、寄生生物抗原、および細菌抗原が挙げられる。これらの化合物の特定の例には、プロインスリン、成長ホルモン、アンドロゲンレセプター、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、上皮増殖因子、トランスホーミング増殖因子α、トランスホーミング増殖因子β、血小板由来増殖因子、血管新生因子（酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、およびアンジオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ））、マトリックスタンパク質（ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミニン）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、オンコプロテイン（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｎｅｕ、ｓｉｓ、ｊｕｎによってコードされるもの）、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７オンコプロテイン、ｐ５３タンパク質、Ｒｂタンパク質、サイトカインレセプター、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ならびにウイルス、細菌、および寄生生物由来のタンパク質（これらを使用して免疫学的応答を誘導し得る）、ならびに体内で有用な有意性の他のタンパク質が挙げられる。組み込まれる遺伝子の選択は、それをコードする核酸配列の利用可能性に限定されるのみである。当業者は、より多くのタンパク質およびポリペプチドが同定されるほど、それらは本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得、そして発現され得ることを容易に認識する。
本発明のポリヌクレオチドがプラスミド中に含まれる場合、例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィーの処置において、およびＤＮＡワクチン投与方法および免疫化方法において、一遺伝子の遺伝子治療においてそのプラスミドが使用されることが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、遺伝子産物の投薬量を増加させるために、宿主細胞においてすでに発現している遺伝子（すなわち、ネイティブな遺伝子または相同遺伝子）を発現されるために使用され得る。しかし、相同遺伝子の発現は、調節解除された発現を生じ得、細胞中でのその過剰発現に起因してＵＣＯＥによる制御に供されないかもしれないことに留意すべきである。
本発明のポリヌクレオチドは、内在性（ネイティブ）遺伝子と作動可能に結合する位置で、細胞のゲノムに挿入され得、それによって内在性遺伝子の発現の増加をもたらす。特定の部位においてゲノム中にエレメントを挿入する方法は、当業者に周知であり、そしてＵＳ−Ａ−５，５７８，４６１およびＵＳ−Ａ−５，６４１，６７０に記載される。あるいは、ゲノムのその内在性（ネイティブ）位置における本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に結合する位置に挿入された遺伝子を有し得、その結果、その遺伝子の発現が起こる。また、特定の部位においてゲノムに遺伝子を挿入するための方法は当業者に周知であり、そしてＵＳ−Ａ−５，５７８，４６１およびＵＳ−Ａ−５，６４１，６７０に記載される。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供して、内在性遺伝子の発現を増加させ、ここでこの使用は、内在性遺伝子と作動可能に結合する位置において、細胞のゲノムにこのポリヌクレオチドを挿入し、それによってその遺伝子の発現のレベルを増加させる工程を包含する。
本明細書中に記載されるベクターを細胞に送達するための、本発明に従う多数の技術が公知かつ有用であり、これらの方法には、核酸縮合剤の使用、エレクトロポレーション、以下：アスベスト、ポリブレン、ＤＥＡＥセルロース、Ｄｅｘｔｒａｎ、リポソーム、カチオン性リポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチンを用いる複合体化、パーティクルボンバードメント、および直接マイクロインジェクションが挙げられる（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＳｋｏｕｌｔｃｈｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３４９−３７９（１９８４）；Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５２７（１９９０）によって概説される）。
本発明のベクターは、非特異的にまたは特異的に（すなわち、宿主細胞の指定されたサブセットに対して）、ウイルス性の送達手段または非ウイルス性の送達手段を介して、宿主細胞に送達され得る。ウイルス起源の好ましい送達方法は、ウイルスパッケージングシグナル（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびパポバウイルスのシグナル）が操作された、本発明のベクターのためのトランスフェクションレシピエントとしてのウイルス粒子産生パッケージング細胞株を含む。好ましいウイルスに基づかない遺伝子送達手段および方法もまた本発明において使用され得、そして直接的な裸の核酸注入、核酸縮合ペプチドおよび非ペプチド、カチオン性リポソーム、およびリポソーム中でのカプセル化を包含する。
組織へのベクターの直接送達が記載されており、そしていくらかの短期的な遺伝子発現が達成されている。筋肉（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，１９９０）、甲状腺（Ｓｙｋｅｓら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，５，８３７−８４４，１９４４）、メラノーマ（Ｖｉｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，９６２−９６７，１９９３）、皮膚（Ｈｅｎｇｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ，１０，１６１−１６６，１９９５）、肝臓（Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，５，１４７７−１４８３，１９９４）への、および気道上皮の曝露後（Ｍｅｙｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２，４５０−４６０，１９９５）の、ベクターの直接送達は、先行技術において明確に記載される。
ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列由来の種々のペプチドは、ポリリジンＤＮＡ複合体とともに同時投与される場合に、遺伝子移入において使用され得る（Ｐｌａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；ＷＯ ９１／１７７７３；ＷＯ ９２／１９２８７；およびＭａｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０７：１３８−１４３（１９９４）は、カチオン性脂質を有するポリリジン結合体の同時濃縮は、遺伝子移入効率の改善をもたらし得ることを示唆する。国際特許出願ＷＯ ９５／０２６９８は、カチオン性脂質遺伝子移入の効率を増加させることを試みるウイルス成分の使用を開示する。
本発明において有用な核酸縮合剤には、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カチオン性ペプチド、カチオン性非ペプチド（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリリジン）が挙げられる。スペルミン誘導体とは、スペルミンのアナログおよび誘導体をいい、そしてこれは、国際特許出願ＷＯ ９３／１８７５９（１９９３年９月３０日公開）において示されるような化合物を含む。
ジスルフィド結合は、送達ビヒクルのペプチド性成分を連結するために使用されてきた（Ｃｏｔｔｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９２）；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら（前出）もまた参照のこと）。
細胞へのＤＮＡ構築物の送達のための送達ビヒクルは、当該分野において公知であり、そして例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；および米国特許第５，１６６，３２０号に記載されるように、細胞表面レセプターについて特異的な、ＤＮＡ／ポリカチオン複合体を含む。
核酸縮合ペプチドを使用する本発明に従うベクターの送達が意図される。ベクターを縮合し、そして細胞にそのベクターを送達するために特に有用な核酸縮合ペプチドが、ＷＯ
９６／４１６０６に記載される。官能基が、ＷＯ ９６／４１６０６に記載されるように、本発明に従うベクターの送達に有用なペプチドに結合し得る。これらの官能基は、特異的な細胞型を標的とするリガンド（例えば、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、または糖）を含み得る。従って、このリガンドは、非特異的な様式において、または細胞型に関して制限される特異的な様式において、細胞を標的化し得る。
その官能基はまた、脂質（例えば、パルミトイル、オレイル、またはステアロイル）；中性親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））；ｆｕｓｏｇｅｎｉｃペプチド（例えば、インフルエンザウイルスのＨＡペプチド）；またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含み得る。この官能基はまた、細胞内輸送タンパク質（例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）、およびエンドソームエスケープ（ｅｓｃａｐｅ）シグナル、または細胞質にタンパク質を直接方向付けるシグナル）を含み得る。
本発明はまた、治療における使用のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を提供する。
好ましくは、そのポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は、遺伝子治療において使用される。
本発明はまた、遺伝子治療における使用のための組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。
本発明はまた、処置方法を提供し、この方法は、そのような処置の必要がある患者に有効な用量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与する工程を包含する。好ましくは、その患者は遺伝子治療によって処置可能な疾患に罹患している。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を、薬学的に受容可能なレシピエントと組み合わせて含む、薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、所望の遺伝子産物を得るための、細胞培養系中において、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。適切な細胞培養系は、当業者に周知であり、そして当業者に公知である文献の本文に十分に記載されている。
本発明はまた、トランスジェニック植物遺伝学を作り出す際の、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。増加した収量、耐性などを有するトランスジェニック植物の生成は、当業者に周知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
本発明の薬学的組成物は、疾患を処置するか、または好都合なタンパク質または機能を有する特定の組織の細胞を提供する治療のために、所望される場合、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞、あるいは薬学的組成物は、全身、筋肉内、静脈内、エアロゾル、経口（固体形態または液体形態）、局所的、眼的、坐剤として、腹腔内、および／または鞘内、ならびに局所的直接注入を含む経路を介して投与され得る。
正確な投薬量レジメは、当然、個々の患者に対して個々の臨床医によって決定される必要があり、次にこれは、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質の正確な性質および処置のために標的化されている組織型によって制御される。
投薬量はまた、疾患の指標および投与の経路に依存する。有利には、処置の期間は、一般的に、継続的であるか、または細胞が死滅するまでである。用量の回数は、疾患、および臨床試験からの効力のデータに依存する。
本発明に従う効果的な遺伝子治療のために送達されるポリヌクレオチドまたはベクターＤＮＡの量は、好ましくは、約５０ｎｇ〜１０００μｇのベクターＤＮＡ／ｋｇ体重の間の範囲；より好ましくは、約１〜１００μｇベクターＤＮＡ／ｋｇの間の範囲にある。
本発明に従って、インビボの細胞取り込みのために、哺乳動物にポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与することが好ましいが、エキソビボアプローチが利用され得、それによって細胞が動物から取り除かれ、ポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質導入され、次いでその動物に再移植される。例えば、肝臓は、動物から肝細胞を取り除く工程、インビトロで肝細胞に形質導入する工程、および形質導入された肝細胞をその動物に再移植する工程による、エキソビボアプローチによってアクセスされ得る（例えば、ウサギについては、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５，１９９１、または、ヒトにおいては、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１７９−２２２，１９９２に記載されるように）。このような方法はまた、循環またはリンパ系における細胞の種々の集団（例えば、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および造血幹細胞）への送達について有効であり得る。
本発明の別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を使用する遺伝子治療の組織特異性および／または効力を決定するための哺乳動物モデルが提供される。この哺乳動物モデルは、その細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を含む。トランスジェニックのマウス（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０（１９８０）；Ｈａｒｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：５４０（１９８１）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５０１６（１９８１）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６３７６（１９８１））、ヒツジ、ブタ、ニワトリ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（１９８５）を参照のこと）などの作製方法は、当該分野において周知であり、そして本発明に従う使用のために意図される。このような動物は、ヒトにおける臨床試験の前の試験を可能にする。
本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物はまた、目的のタンパク質の長期的な産生のために使用され得る。
本発明はまた、機能的な遺伝学の適用における本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能的な遺伝学は、主に、特定の細胞型または疾患状態において特異的に発現される遺伝子の配列決定に関し、現在、薬物発見または遺伝子治療目的のための、何千もの潜在的に目的の新規な遺伝子配列を提供する。新規な治療の開発のためにこの情報を使用することにおける主要な問題は、これらの遺伝子の機能をいかにして決定するかということにある。ＵＣＯＥは、遺伝子配列の機能を決定するために、多数の機能的ゲノム適用において使用され得る。本発明の機能的ゲノム適用には、以下が含まれるがこれらに限定されない：
（１）本発明のポリヌクレオチドを使用して、その遺伝子配列のアンチセンスバージョンまたはリボザイムノックダウンライブラリーの持続した発現を達成することであって、それによって細胞表現型に対する遺伝子を不活化する効果を決定すること。
（２）本発明のポリヌクレオチドを使用して、その遺伝子配列についての発現ライブラリーを調製し、その結果、細胞への送達が、その遺伝子配列の、信頼できる、再現可能な、持続する発現を生じること。その遺伝子配列を発現する、得られる細胞は、この遺伝子配列を発現しており、機能決定および薬物発見に対する種々のアプローチにおいて使用され得る。例えば、その遺伝子産物の活性を中和するために、その遺伝子産物に対する抗体を惹起すること；構造的研究、機能的研究、または薬物スクリーニング研究；あるいは細胞に基づく薬物スクリーニングにおける使用のための、遺伝子それ自体のタンパク質産物の迅速な精製。
（３）マウス胚幹（ＥＳ）細胞およびトランスジェニックマウスを含むアプローチにおいて本発明のポリヌクレオチドを使用すること。最も強力な機能的遺伝学アプローチの１つは、構築物のマウスＥＳ細胞における遺伝子への無作為挿入を含む。この構築物は、発現された遺伝子への挿入後に薬物選択を可能にするのみであり、そして配列決定のために容易にレスキューされ得る（Ｇ．Ｈｉｃｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６，３３８−３３４）。次いで、新規な配列を有する遺伝子にノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスが、それらの機能を探査するために容易に作製され得る。現在のところ、この技術は、マウスＥＳ細胞において良好に発現される１０％のマウスの遺伝子について良好に機能する。ＵＣＯＥの組み込み構築物への取り込みは、この技術が、マウスで発現されるすべての遺伝子を同定するために拡張されることを可能にする。
以下の実施例は、図面を参照して、例示のために提供され、そしていかなる様式においても本発明を限定することを意図しない。本発明のいくつかの代表的なポリヌクレオチドの調製、試験、および分析は、以下に詳細に記載される。当業者は、本発明の他のポリヌクレオチドの調製および試験のためにこれらの手順を適合させ得る。
（材料および方法）
（ライブラリースクリーニング）
ヒトＴＢＰおよびｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子座にかけてのゲノムクローンを、Ｐ１由来人工染色体（ｐＣＹＰＡＣ−２）ライブラリー（ＣＩＮＧ−１；Ｉｏａｎｎｏｕら、１９９４）から単離した。スクリーニングは、細菌溶解物のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によった。
（ＴＢＰに対するプライマー）
プライマーを、Ｃｈａｌｕｔら（１９９５）に記載される部分ゲノム配列を使用して設計し、そしてこれらは、以下のとおりであった：
ＴＢ３［５’ＡＴＧＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧ３’］（−６０５）およびＴＢ４［５’ＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＡＡＧ
ＧＡＧＧＧ３’］（−１１９）は、ＴＢＰ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）にハイブリダイズし、そしてヒト遺伝子のみから４８６ｂｐのＰＣＲ産物を生じる（結果を参照のこと）。括弧内の数は、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９０）によって定義されたｍＲＮＡ
ＣＡＰ部位に関する。
ＴＢ５［５’ＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＡＧＧ３’］（１３４３）およびＴＢ６［５’ＧＣＡＡＴＡＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣ３’］（１７８５）は、３’ＵＴＲ由来の領域を増幅し、そしてこの領域における有意な配列相同性に起因して、ヒトＤＮＡおよびマウスＤＮＡの両方から４１５ｂｐの産物を生成する。括弧内の数は、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９０）によって定義されたｃＤＮＡ配列に関する。
（ｈｎＲＮＰ Ａ２に対するプライマー）
ｈｎＲＮＰ Ａ２に対するプライマーを、Ｂｉａｍｏｎｔｉら（１９９４）によって記載されたゲノム配列から設計した。
Ｈｎ１［５’ＡＴＴＴＣＡＡＡＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＣ３’］（−３０９）およびＨｎ２［５’ＣＡＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＧＴＴＡＣＣＴＣＣ３’］（１９９）は、５’ＵＴＲにおいて５０８ｂｐのＰＣＲ産物を生じる。Ｈｎ３［５’ＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧ３’］（７５６８）およびＨｎ４［５’ＡＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧ３’］（８１７６）は、最後から２番目のエキソン（番号１０）における領域を増幅し、６０７ｂｐのＰＣＲ産物を生じる。括弧内の数は、Ｂｉａｍｏｎｔｉら（１９９４）によって定義された転写開始点に関する。
（ＰＣＲプロトコル）
ＰＣＲを、各２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、１×反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ９．１］、１６ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、３．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）、２．５ユニットのＴａｑ Ｓｕ
ｐｒｅｍｅポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および各１μＭのプライマーを含む、総反応容量２５μｌの反応液中で、１μｌのプールしたクローン材料を使用して行った。サイクル条件は、以下であった：９４℃で１分間、６２℃で１分間、７２℃で１分間の４サイクル、続いて、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクル。ポジティブ同定されたクローンを、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴブロス（１リットル滅菌水あたり１２ｇ トリプトン、２４ｇ 酵母抽出物（両方ともＤｉｆｃｏ）、２３．１ｇ ＫＨ2ＰＯ4、１２５．４ｇ Ｋ2ＨＰＯ4、０．４％ グリセロール；ＴａｒｔｏｆおよびＨｏｂｂｓ、１９８７）において増殖させた。この細菌の永久保存物は、１×保存緩衝液（３．６ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、１．３ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２．０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、４．４％ グリセロール）中の個々の懸濁物を、−８
０℃で冷凍することによって調製した。
（ＣＹＰＡＣ−２ ＤＮＡ単離）
プラスミドＤＮＡを、改変アルカリ溶解法（ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｌｙ、１９７９）を使用して、以下のように単離した。１リットルのＴブロスを含むバッフルした（ｂａｆｆｌｅｄ）２リットルのガラスフラスコに、細菌のシングルコロニーを播種し、そして一定攪拌で３７℃、１６時間インキュベートした。細菌を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ６遠心分離機において４２００ｒｐｍ（５０２０×ｇ、以後全ての工程についても同様）で１０分間の遠心分離によって収集した。ペレットをボルテックスし、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（２００ｍｌ）中に再懸濁し、そして室温で１５分間インキュベートした。溶解液（０．２Ｍ Ｎ
ａＯＨ、１％ ＳＤＳ；２００ｍｌ）を、２分間緩やかに混合しながら添加し、その後、２００ｍｌの中和溶液（３Ｍ 酢酸カリウム［ｐＨ ５．５］）をさらに５分間緩やかに混合しながら添加した。細菌細片を、４℃で１時間沈殿させて、次いで、１５分間の遠心分離および滅菌ガーゼによる上清の濾過によって除去した。イソプロパノール（４００ｍｌ；４０％最終濃度）を添加して、室温で１時間プラスミドＤＮＡを沈殿させた。１５分間の遠心分離およびそのペレットの７０％エタノール中での洗浄後、ＤＮＡを、１×ＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ７．５］、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）、０．１％ ＳＤＳおよび０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｃａｍｂｉｏ）の４ｍｌ溶液に再懸濁して、残存タンパク質を除去した。５５℃で１時間のインキュベーションおよびその後のフェノール：クロロホルム（１：１ ｖ／ｖ）抽出後、ＤＮＡを、１容量の１００％エタノールまたはイソプロパノールで沈殿させ、そして２ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に巻き取った。５０μｇ／ｍｌの収率が、慣用的に得られた。
（制限酵素マッピング）
制限酵素マッピングを、ｐＣＹＰＡＣ−２およびＴＢＰ遺伝子の両方の配列に由来するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化した上記クローン化ＤＮＡのサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５）に対してハイブリダイズさせることによって行った。ゲノムフラグメントがクローン化されるＢａｍＨＩ部位にちょうど近接する、ｐＣＹＰＡＣ−２配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用し、その配列は、以下であった。
Figure 2009102331
ＮｏｔＩによるｐＣＹＰＡＣ−２からのいずれのゲノム挿入物の切除は、この放出されたフラグメントが、各側の少量のプラスミド配列を保持することを意味する。ＥＹ２側において、この配列は、３０ｂｐであり、切除されたフラグメント内のＥＹ２配列の大部分を占める。従って、このオリゴヌクレオチドのＮｏｔＩ消化したｐＣＹＰＡＣ−２クローンへのハイブリダイゼーションは、サザンブロット分析上のこの放出されたゲノムのバンドを強調する。１８９側では、この切除されたフラグメントは、３９ｂｐのプラスミド配列を含み、そして１８９オリゴヌクレオチド配列の大半は、ｐＣＹＰＡＣ−２内のＮｏｔＩ部位の３’側にある。従って、このオリゴヌクレオチドは、ｐＣＹＰＡＣ−２クローンのＮｏｔＩ消化物上で、ベクターにハイブリダイズする。約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、製造者の推奨条件（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用する、制限エンドヌクレアーゼ消化に供し、その後、０．５×ＴＡＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸［ｐＨ ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド）中の０．７％アガロースゲル上、またはパルスフィールドゲル上で電気泳動した。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）は、ＣＨＥＦ−ＤＲＩＩシステム（Ｂｉｏｒａｄ）上で、１％ ＰＦＧＥアガロース（ＦＭＣ）／０．５×ＴＡＥゲル上、６Ｖ／ｃｍ、１秒〜３０秒の切換え時間によって、１４時間で行った。同一条件を、本研究全体の全てのＰＦＧＥ分析に使用した。ゲルを、紫外光下での写真撮影前に、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液中で染色した。
サザンブロット分析のための調製において、最初にこのアガロースゲルを２５４ｎｍの紫外光（ＵＶＰクロスリンカー（ＵＶＰ）中で、１８０，０００μＪ／ｃｍ2）に曝露し
、次いでその後、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中で４０分間（２０分後に溶
液を交換する）の浸漬によって変性することによって、ＤＮＡを脱プリン化した。このＤＮＡを、１６時間の新鮮容量の変性溶液中での毛管作用によって、ＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ転写した。核酸のナイロンへの架橋は、１２０，０００μＪ／ｃｍ2での２５４ｎｍ紫外光への曝露によって達成された。膜を、０．５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ７．５］、１．５Ｍ ＮａＣｌ中、２０分間で中和し、そして使用前に２×ＳＳＣでリンスした。（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム［ｐＨ ７．０］である）。
オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび32Ｐ−γＡＴＰで５’末端標識し、サザンブロット上の特定のフラグメントの検出を可能にした。各実験は、製造者の指定緩衝液中２μｌの32Ｐ−γＡＴＰ（＞４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）標識した、１００ｎｇのオリゴヌクレオチドを使用した。３７℃で２時間のインキュベーション後、取り込まれなかったヌクレオチドを、水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのクロマトグラフィーによって除去した。末端標識プローブは、比活性＞１×１０8ｄｐｍ／μｇで代表的
に標識された。
ハイブリダイゼーションを、２５ｍｌの予熱したハイブリダイゼションミックス（１ｍＭ ＥＤＴＡ ［ｐＨ ８．０］、０．２５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4［ｐＨ ７．２］、７％ ＳＤＳ；ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８４）および１００μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含むガラスボトル（Ｈｙｂａｉｄ）内で、ナイロンメッシュの間に膜を挟んで行った。６５℃で１時間のプレハイブリダイゼーション後、溶液をデカントし、そして標識プローブを含む同一の溶液で置換した。最適なハイブリダイゼーション温度は、実験的に決定され、そしてＴＥ緩衝液中のオリゴヌクレオチドについてのＴm（Ｔm＝５９．９＋４１［％ＧＣ］−［６７５／プライマーの長さ］として計算される）より２０℃低いことが見出された。１６時間後、ハイブリダイゼーション膜を取り出し、６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの２分間での洗浄を３回行い、その後Ｘ線フィルム（ＢｉｏＭＡＸ Ｋｏｄａｋ）に露光した。
（ＤＮＡ構築物）
ＴＢＰ遺伝子（１２ｋｂの５’および３’の両方の隣接配列を含む）にわたる４４ｋｂのゲノムＤＮＡ領域を、ｐＣＰ２−ＴＮＮ ｐＣＹＰＡＣ−２クローン（図９を参照のこと）から、ＮｏｔＩフラグメントとして誘導した。これを、コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内にクローン化し、ｐＷＥ−ＴＳＮを生成した（図９）。ｐＣＹＰＡＣ−２プラスミドは、真核生物細胞トランスフェクション研究用の選択可能なマーカーを含んでいないため、ベクター交換が必要であった。ｐＣＰ２−ＴＮＮのＮｏｔＩでの消化は、ゲノム挿入物の５’末端からＴＢＰの最後のエキソンの１２ｋｂ下流に位置するゲノム配列中に存在するＮｏｔＩ部位までに及ぶ、４４ｋｂフラグメントを遊離する（図９を参照のこと）。さらに、このクローン中の３’隣接配列の残りの２０ｋｂおよびｐＣＹＰＡＣ−２ベクターを含むフラグメントを生成する。連結反応を、上記条件を使用する１０μｌの反応液中で、約１μｇのＮｏｔＩ消化したｐＣＰ２−ＴＮＮおよび２００ｎｇの同様に切断したｐＷＥ１５を使用して行った。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの熱不活化の後、完了した連結混合物を、Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｇｏｌｄ ＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて感染λファージ粒子内にパッケージした。組換えバクテリオファージを、ＳＭ緩衝液（５００μｌの、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ，８ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．０１％（ｗ／ｖ） ゼラチン、２％ クロロホルム）中で保存した。感染を
以下のように行った：５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの一晩培養物を遠心分離（３０００×ｇ、５分）し、そしてこの細菌を、２．５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に再懸濁した
。等量のパッケージした材料およびＥ．ｃｏｌｉを混合して、２５℃で１５分間インキュベートし、その後２００μｌのＬブロスを添加して、そしてこの混合物を３７℃でさらに
４５分間インキュベートした。この懸濁物を、ＬＢ−アンピシリン寒天プレート上にプレートし、シングルコロニーを、その次の日、微量調製物として分析した。大量のｐＷＥ−ＴＳＮを、ｐＣＹＰＡＣ−２クローンの場合と同様に、１リットル培養物から調製した。
（ｐＣＹＰＡＣ−２ ＤＮＡサブクローニング方法）
以下の手順を使用して、ｐＣＹＰＡＣ−２クローン由来の小さい（１０ｋｂ未満）制限酵素フラグメントをサブクローン化した。ＤＮＡを制限酵素消化し、そして０．６％の低融点アガロースゲル（ＦＭＣ）上で電気泳動し、全ての紫外光写真撮影を、エチジウムブロマイド染色したＤＮＡのニックを最小化するために、３６５ｎｍの波長で行った（Ｈａｒｔｍａｎ、１９９１）。所望の範囲のサイズのフラグメントを含むゲル領域を、このゲルから切除し、６８℃で１０分間融解し、そして３７℃でさらに５分間平衡化させた。プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、同様に制限酵素消化し、ｐＣＹＰＡＣ−２由来のＤＮＡに適合可能な末端を与え、自己連結を最小化するために１０ユニットの仔ウシ腸ホスファターゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で１時間処理し、そしてフェノール：クロロホルム（１：１ ｖ／ｖ）抽出、それに引き続くエタノール沈殿によって精製した。融解ゲル切片を、４：１を超えるフラグメント対ベクター分子のモル濃度を与えながら、５０ｎｇのこのベクター調製物と混合した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１０ユニット；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を、指定の緩衝液と共に添加し、この混合物を１６℃で１６時間インキュベートし、その後形質転換効率を改善するために、この酵素を熱不活化（６５℃で２０分間）した（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、１９９５）。塩化カルシウム法のコンピテントＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉの調製および引き続く形質転換を、確立された手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて行った。形質転換は、この連結混合物を３７℃に融解および平衡化し、その後１００μｌのコンピテント細胞を、０．０２％未満の最終アガロース濃度を維持しながら添加することによって達成した。細菌を、２時間氷上でインキュベートし、続いて３７℃で５分間、熱ショックを与え、そしてその後１ｍｌのＳＯＣ培地（１リットル滅菌水あたり２０ｇ トリプトン；５ｇ 酵母抽出物；０．５ｇ ＮａＣｌ；２０ｍＭ グルコース［ｐＨ ７．０］；Ｓａｍｂｒｏｏｌら、１９８９）を添加した。３７℃でのさらに１時間後、細胞を、５０μｌの選択溶液（３６ｍｇ／ｍｌ Ｘｇａｌ、０．１Ｍ ＩＰＴＧ）と混合し、２０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む、適切なＬＢ−抗生物質プレート（１リットル滅菌水あたり１０ｇ ＮａＣｌ［ｐＨ
７．０］、１０ｇ トリプトン、５ｇ 酵母抽出物、２０ｇ 寒天）上にプレートした。３７℃で１６時間のインキュベーション後、組換えプラスミドを含む細菌コロニーを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子活性の破壊に起因する、これらの白色（青色に対する）によって同定した。選択されたコロニーを、シングルコロニーの微量調製物から単離されたＤＮＡの制限消化によって分析した。この手順を使用して、２０ｋｂまでの大きさのフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクターにサブクローン化することが可能であった。
ＰＣＲ増幅産物を、以下の手順を用いてクローン化した。５０μｌ容量中１ｎｇのｐＣＹＰＡＣ−２由来クローンＤＮＡをテンプレートとして使用する標準的なＰＣＲ反応後、１０ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を、その反応液に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ポリメラーゼ酵素の不活化（９６℃、２０分）後、７μｌのこのＰＣＲ産物を、最終容量１０μｌにおいて、５０ｎｇのＥｃｏＲＶ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクターに連結した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用してこのＰＣＲ産物の末端を平滑化することにより、高比率の組換えクローンを生じた（データは示さず）。
（ｐＢＬ３−ＴＰＯ−ｐｕｒｏの生成）
ｐＢＬ３−ＴＰＯ−ｐｕｒｏは、ｐＢＬ３ベクター内にサブクローン化された、約１．２ｋｂの５’隣接配列および約４．５ｋｂの３’隣接配列ならびにピューロマイシン耐性
遺伝子カセットを有する全体で１９ｋｂのＴＢＰ遺伝子を含む。これは、３つの連続するクローニング工程によって達成された。
最初に、ｐＣＰ２−ＴＬＮプラスミド中のヒトＴＢＰ遺伝子の３’末端に隣接する４．５ｋｂの配列を、ｐＣＰ２−ＴＬＮからＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩフラグメントとしてサブクローン化した。このフラグメントは、ＴＢＰ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＳａｃＩＩ部位からｐＣＹＰＡＣ−２ベクター内のＯＬ１８９−近接のＮｏｔＩ部位に及ぶ。このフラグメントを、ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩ消化したｐＢＬ３内にクローン化し、そしてＭＡ４２６と命名した。残りのＴＢＰ遺伝子配列は、１９ｋｂのＳａｃＩＩフラグメント上に存在し、これは、ｍＲＮＡキャップ部位の約１．２ｋｂ上流から３’−ＵＴＲにおけるＳａｃＩＩ部位に及ぶ。このフラグメントを、ＳａｃＩＩで直鎖化したＭＡ４２６内に連結し、正確な方向についてクローンをスクリーニングした。
（ＤＮＡ配列決定およびコンピューター配列分析）
ＤＮＡを、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して調製し、そして自動蛍光配列決定は、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のサービスとして提供された。ｄＢＥＳＴおよび非重複性Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを、以前に記載の検索ツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して照会した。本研究において使用した全ての発現配列タグクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム（Ｌｅｎｎｏｎら、１９９６）を通して入手した。公知のＤＮＡ配列の複数の配列アライメントおよび制限酵素消化パターンの予測は、プログラムＰＣＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して実行した。ＣｐＧジヌクレオチド頻度のプロットは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して作製した。
（トランスジェニック動物の作製）
（マイクロインジェクションのためのＴＢＰフラグメントの調製）
ＴＢＰ／ＰＳＭＢ１遺伝子領域を含む９０ｋｂのゲノムフラグメント（ＴＬＮ）を、ｐＣＰ２−ＴＬＮクローンのＮｏｔＩ消化によって単離し、そして改変塩化ナトリウム勾配法（ＤｉｌｌｏｎおよびＧｒｏｓｖｅｌｄ，１９９３）を使用するマイクロインジェクションのために調製した。最初に、細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）を、ＬＰＳ除去キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を製造者の説明に従って使用して、標準的なｐＣＰ２−ＴＬＮ大量調製物から除去した。次いで、約５０μｇのＤＮＡを、７０ユニットのＮｏｔＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で１時間消化し、少量のアリコートを、ＰＦＧＥによって分析して完全消化を確認した。３ｍＭ ＥＤＴＡ存在下の１４ｍｌの５〜３０％の塩化ナトリウム勾配を、市販の勾配形成剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して超遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ）中に調製した。消化したＤＮＡを広孔ピペットチップを使用して剪断を最小化しながら、この勾配の上に層化し、この勾配を、ＳＷ４１Ｔｉスイングアウトローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で、５．５時間（２５℃で）、３７，０００ｒｐｍで遠心分離した。約３００μｌの画分を、この勾配の底（最高密度）から、１ｍｌの８０％エタノールを含む別個の微量遠心管内に順に取り出し、その後−２０℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡ沈殿物を、遠心分離（１４９００×ｇ、１５分）によって収集した。ペレットを、７０％エタノールで洗浄し、２０μｌのトランスジェニックマイクロインジェクション緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ７．４］、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解し、そして交換画分からの５μｌのアリコートをゲル電気泳動によって分析し、ベクターおよび染色体ＤＮＡの混入を評価した。これらの画分（このような混入物を有さないような）をプールし、そのＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍの吸光度により評価した。
４０ｋｂのゲノムフラグメント（ＴＳＮ）を、ＮｏｔＩ消化および以前に記載のエレクトロエリューション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用する精製によって、ｐＷ
Ｅ−ＴＳＮから単離した。エレクトロエリューション後、ＤＮＡを、ＴＥ緩衝液飽和フェノール、フェノール：クロロホルム（１：１ ｖ／ｖ）、および水飽和ｎ−ブタノール（２回）での連続抽出によって精製し、残存するエチジウムブロマイドを除去した。ＤＮＡを、２容量の１００％エタノールで沈殿させ、そしてマイクロインジェクション緩衝液中に再懸濁した。フラグメントの完全性を、ＰＦＧＥによって評価し、２６０ｎｍでの吸光度により濃度を決定した。２５ｋｂゲノムフラグメント（ＴＰＯ）を、ｐＢＬ３−ＴＰＯから、この挿入物をＳａｌＩでの消化によってこのベクターから遊離したことを除き、同じ手順を使用して単離した。
（マイクロインジェクションのためのｈｎＲＮＰ Ａ２フラグメントの調製）
ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子領域を含む１６０ｋｂのゲノムフラグメント（ＭＡ１６０）を、ｐＣＰ２−ＨＬＮのＮｒｕＩ消化（図１３Ａ）および上記のような塩化ナトリウム勾配超遠心分離によって、マイクロインジェクションのために単離および調製した。
６０ｋｂのゲノムフラグメント（ＨＳＮ；図１３Ｂ）を、ＡａｔＩＩ消化および上記のようなＰＦＧＥによる精製によって、ＭＡ１６０から単離した。この６０ｋｂのバンドを、ゲルから切除し、切片に切断した。各切片を６５℃で融解し、そして３０μｌをＰＦＧＥによって分析した。この６０ｋｂフラグメントの最も純粋なサンプルを示す画分を保持した。この融解ゲル容量を測定し、Ｇｅｌａｓｅ緩衝液で１×にして、４２℃で１０分間平衡化し、そして５００μｌあたり１ユニットのＧｅｌａｓｅ酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。サンプルを４２℃で一晩インキュベートし、次いで、４℃で３０分間遠心分離した。この上清を、広孔チップでデカントし、１０ｃｍペトリ皿における０．２５μｍフィルター上で、１５ｍｌのトランスジェニックマイクロインジェクション緩衝液に対して、４時間滴下透析（ｄｒｏｐ−ｄｉａｌｙｓｅ）した。この透析溶液を微量遠心管に移し、４℃で３０分間スピンさせた。フラグメントの完全性をＰＦＧＥによって評価し、２６０ｎｍでの吸光度により濃度を測定した。
（トランスジェニックマウスの作製）
トランスジェニックマウスを、Ｃ５７／Ｂ１６マウスの受精卵の前核注入によって作製した。各ＤＮＡフラグメントを、トランスジェニック緩衝液中１ｎｇ／μｌの濃度で注入した。これは、標準的な技術を使用するＵＭＤＳ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｕｎｉｔ（Ｓｔ Ｔｈｏｍａｓ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ）によるサービスとして行った。トランスジェニックの創始者を、以下のように単離した尾部生検ＤＮＡのＰＣＲスクリーニングを使用して同定した。１０〜１５日齢マウスからの約０．５ｃｍの尾部生検を、５００μｌ尾部緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ８．０］、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）中、３７℃で１６時間インキュベートした。この加水分解物を、等量のフェノール：クロロホルム（１：１ ｖ／ｖ）での緩やかな反転、その後の遠心分離（１４９００×ｇ、１５分）によって抽出した。このＤＮＡを、２容量の１００％エタノールの添加によって水相から沈殿させ、７０％エタノール中で洗浄した。ＤＮＡを巻き取って、１００μｌのＴＥ緩衝液中に溶解した。２６０ｎｍでの吸光度測定によって測定されるように、代表的に、５０〜２００μｇのＤＮＡが得られた。ＰＣＲ反応のための条件は、テンプレートとしての１００ｎｇの尾部生検ＤＮＡおよびＴＢ３／ＴＢ４のプライマーセットを使用する、ｐＣＹＰＡＣ−２ライブラリーのスクリーニングについて記載される通りであった。陽性の創始者を、野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスへの戻し交配によって交配し、完全なトランスジェニックＦ１の子孫を作製した。
（導入遺伝子の完全性およびコピー数）
導入遺伝子のコピー数および完全性を、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化した尾部生検ＤＮＡのサザンブロット分析によって評価した。約１０μ
ｇのＤＮＡを、２０〜３０ユニットの特定の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして０．７％アガロース／０．５×ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸［ｐＨ ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）ゲル上、１．５Ｖ／ｃｍで１６時間電気泳動した。染色およびＤＮＡのナイロン膜への転写は、正に荷電したマトリクス（ＨＹＢＯＮＤ Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用することを除き、プラスミドのサザンブロットと同様であった。
ＤＮＡプローブを、いずれのクローニングベクター配列をも除去するために、制限酵素消化によって調製し、そしてＧｅｎｅ−Ｃｌｅａｎシステム（Ｂｉｏ１０１，ＵＳＡ）を使用して低融点アガロースから精製した。このプローブの１００ｎｇサンプルの放射性標識を、市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ならびに各２００ｐｍｏｌのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび３μｌのα−Ｐ32−ｄＡＴＰ（比活性＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用する、ニックトランスレーションによって行った。標準緩衝溶液中０．５ユニット ＤＮＡポリメラーゼＩ／１０ｐｇ ＤＮａｓｅＩからなる酵素溶液を添加して、そしてこの反応液を１５℃で２．５時間インキュベートした。プローブを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０クロマトグラフィーによって精製し、そしてそれらの使用直前に５分間煮沸した。代表的に、＞１×１０8ｃｐｍ／μｇの比活性を
得た。
ハイブリダイゼーションを、上記のプラスミドサザンブロットについてと同様に行った。メンブレンを、１５ｍｌの、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む予備ハイブリダイゼーション溶液（３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液は、１リットルの蒸留水あたり、２％Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ）である））中で６５℃で１時間インキュベートした。次いで、この溶液を、１５ｍｌの、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび熱加熱放射標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（予備ハイブリダイゼーション溶液と同様で、デキストラン硫酸を１０％加える）に置き換えた。６５℃で１６時間のハイブリダイゼーションの後、メンブレンを２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳで各々３０分間で３回洗浄し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）スクリーンまたはＸ線フィルムに対して−８０℃で曝露した。これらのブロットが再分析されるべき場合、結合したプローブを、０．２Ｍ ＮａＯＨ中で、２０分間浸し、次いで上記のように中和することによって除去した。
本研究において使用したプローブの大部分は、配列情報が利用可能でないゲノムクローンの領域（例えば、ｐＣＰ−ＴＬＮ末端フラグメントプローブおよびＴＢＰイントロン性領域に由来するもの）に由来する。多数のプローブが、ヒトゲノムＤＮＡに非特異的にハイブリダイゼーションした。このことは、反復配列エレメントの存在を示す。この問題を除去するために、プローブＤＮＡのアリコートを個々に、多数の制限酵素で消化し、電気泳動し、そしてサザンブロットした。短い認識部位を有する酵素（これは、ＤＮＡ内に非常に頻繁に生じるはずである）を、多数のより小さなフラグメントにそのプローブを消化するように選択した。放射標識したヒトＣ0ｔ−１ ＤＮＡを、反復配列を含むそれらの
フラグメントを示すためのプローブとして使用した。この手順を用いて、反復エレメントを含む全てのプローブについて、Ｃ0ｔ−１プローブにハイブリダイズしない５００ｂｐ
未満のフラグメントを得ることが可能であった。
（コスミドＤＮＡの調製および単一コピーのＬ細胞クローンの生成）
ｐＷＥ−ＴＳＮ ＤＮＡを、上記のように、イソプロパノール沈降段階まで、１リットルの培養物のアルカリ溶解によって調製した。２５℃で１時間インキュベートした後、そのペレットを３００μｌのＴＥ中に再懸濁し、次いで１０ｍｌのＳｅｐｈａｇｌａｓ ＦＰ ＤＮＡ結合マトリクス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）との連続混合によって添加した。この
溶液を、１０分間定常的に反転させ、そしてマトリクス結合したＤＮＡを、遠心分離（２８０×ｇ、１分）によって収集した。このペレットを、まず、ＷＳ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、６０％エタノール）で洗浄し、遠心分離で収集し、７０％エタノールで洗浄し、そして再遠心分離した。ＤＮＡを、ペレットを２ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、そして７０℃で１０分間周期的な混合によってインキュベートすることによって、マトリクスから溶出した。この溶液を、遠心分離（１１００×ｇ、２分）し、そして、ＤＮＡを含む上清を、２つの微量遠心管中に等量に分割した。残りのＳｅｐｈａｇｌａｓｓを、遠心分離（１４９５０×ｇ、１５分）によって除去し、その上清をプールし、そしてＤＮＡを、２容量のエタノールを用いて沈降させた。スプールしたＤＮＡを、７０％エタノール中で一回洗浄し、そして１μｇ／μｌの滅菌水中に再懸濁した。凡そ７５〜１００μｇの純粋なコスミドＤＮＡをこの手順を用いて入手した。これは、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ精製なしに得たＤＮＡの６０〜８０％の収率にあたる。
接着マウスＬ細胞（Ｅａｒｌｅら、１９４３）のトランスフェクションを、以下のとおりに行った。１０％の熱非働化した胎仔ウシ血清（ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ中に増殖させたおよそ１×１０7細胞を、１μ
ｇの、ＳａｌＩで直鎖状にしたｐＷＥ−ＴＳＮ ＤＮＡと混合し、そして氷上で１０分間置いた。ＤＮＡを、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒにおいて９６０μＦ，２５０Ｖの設定でのエレクトロポレーション（Ｃｈｕら、１９８７）によって細胞中に導入した。トランスフェクトした細胞を、４００μｇ／ｍｌのジェネティシン硫酸（Ｇ４１８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を含む同じ培地において選択し、そして維持した。個々のクローンを、クローニングリング（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９４）を用いて単離した。厚壁のステンレス鋼クローニングリング（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、シリコングリースにおいてオートクレーブし、そして組織培養プレートへと移して、その結果そのコロニーを単離した。トリプシンの溶液（３００μｌの０．２５％トリプシン（ｐＨ７．６）（Ｄｉｆｃｏ）、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．４％ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．１２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ グルコース、２．４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．８４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ４・１２Ｈ2Ｏ、１％フェノールレッド）を添加し、そしてそのプレートを３７℃で５分間インキュベートした。細胞を２４ウェルプレートに移し、そしてクローン化細胞株を樹立した。クローンを以下のように保存した。およそ１×１０7細胞を遠心分離で採取し、０．７５ｍｌの凍結混合
液（７０％の標準的な培地であるが２０％の仔ウシ血清および１０％ＤＭＥＭを含む）中に再懸濁し、そして液体窒素保存に移す前に１時間ドライアイスで瞬間凍結した。
ゲノムＤＮＡをこれらのＬ細胞クローンから、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて調製した。Ｔ７５フラスコ中の細胞を、コンフルエントにまで増殖させ（およそ４×１０7）、その培地を除去し、そしてそのフラスコをＰＢＳ（２．６８ｍＭ
ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．５１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１３６．８９ｍＭ
ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．３））で洗浄し、そして２ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を添加した。細胞を掻き取りによって培養フラスコから剥がし、そして１５ｍｌの遠沈管に、広い穴のピペットの尖端を用いて移した。溶解を、６８℃で１６時間進行させ、その後、その溶液をフェノール：クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）で一回抽出し、そしてそのＤＮＡを等容量のイソプロパノールを用いて沈降させた。７０％のエタノール中での洗浄後、そのＤＮＡを１ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、そして濃度を２６０ｎｍでの吸光度によって評価した。
トランスフェクトされた遺伝子コピー数を、ＢｇｌＩＩ消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって決定した。ヒトＴＢＰを、Ｃ５遺伝子（ＴＢＰ転写開始領域の５’側の４ｋｂ）中に配置される（そして、４．２ｋｂフラグメントを検出する）特異的なプ
ローブ（１．４ＨＸ）、を用いて検出した（図１０を参照のこと）。さらに、ブロットを、内在性マウスｖａｖ遺伝子座（Ｏｇｉｌｖｙら、１９９８）由来の１ｋｂ ＮｃｏＩフラグメント（これは、５．２ｋｂバンドを与え、そして単一コピーの参照標準として作用する）を用いて同時にプロービングした。ヒトＴＢＰ導入遺伝子のコピー数を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒによるブロットの分析の後、３コピーのトランスジェニックマウス系統ＴＬＮ８を用いて、得られたｖａｖシグナルに対するＴＢＰとの比を比較することによって確認した。
総ＲＮＡを、１ｍｌの３Ｍ ＬｉＣｌ、６Ｍ尿素中での選択的な沈降（ＡｕｆｆｒｅｙおよびＲｏｕｇｅｏｎ、１９８０、Ａｎｔｏｎｉｏｕ、１９９１を参照のこと）によっておよそ４×１０7細胞から調製した。
（ＤＮアーゼＩ超感受性部位分析）
これを、以前に記載（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら、１９８７；Ｒｅｉｔｍａｎｎら、１９９３）されるように行った。核を、約１×１０9 Ｋ５６２細胞（ＬｏｚｚｉｏおよびＬｏ
ｚｚｉｏ、１９７５）から調製した。採取した細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして４ｍｌの氷冷ＲＳＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ2）中で再懸濁し、そして緩い乳棒を装着したガラスダンス型ホモジナイザー
中に置いた。１ｍｌの０．５％ＮＰ４０／ＲＳＢの添加後、その細胞を、１０〜２０ストロークに亙ってゆっくりホモジナイズし、そして核を、５０ｍｌのＲＳＢの添加および４℃での遠心分離（６４０×ｇ、５分）によって回収した。その上清を捨て、そして核を１ｍｌの、１ｍＭＣａＣｌ2を含むＲＳＢ中に再懸濁した。即座に１００μｌのアリコート
（これは、およそ１×１０8の核にあたる）を取り、そしてＤＮＡを、以下のように精製
して、単離の手順の間の内在性ヌクレアーゼ活性について制御下。
ＤＮアーゼＩ消化を、以下のとおりに行った。ある範囲のアリコート（０、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０μｌ）の０．２ｍｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を、１００μｌの核を含む個々の遠沈管に加え、そして３７℃で４分インキュベートした。その消化を１００μｌの２×終結混合液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ）、１０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ濃度）の添加および５５℃で６０分のインキュベートによって終結させた。ＤＮＡを、フェノール：クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）抽出およびエタノール沈降によって精製した。サンプルを、０．７％アガロース／０．５×ＴＢＥゲル上で電気泳動し、そして32Ｐ放射標識したプローブを用いた分析のためにサザンブロットした。
（ＲＮＡ調製）
成体マウス（１０週齢〜４０週齢）を、頚脱臼によって屠殺し、そして全組織を単離し、液体窒素中で瞬間凍結し、そして−８０℃で必要となるまで保存した。総ＲＮＡを３Ｍ
ＬｉＣｌ、６Ｍ尿素での選択的沈降（ＡｕｆｆｒａｙおよびＲｏｕｇｅｏｎ、１９８０）によって調製した。組織を、１ｍｌのＬｉＣｌ−尿素溶液を含む１４ｍｌの管に移し、そしてＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ）を用いて３０秒間ホモジナイズした。次いで、サンプルを、３回の３０秒間のパルスの超音波処理（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，ＵＳＡ）に供し、そのホモジネートを滅菌した微小遠沈管に移し、そしてＲＮＡを１６時間４℃で沈降させた。そのＲＮＡを、遠心分離（４℃、１４９００×ｇ、２０分間）によって収集し、５００μｌのＬｉＣｌ−尿素溶液中で洗浄し、そして５００μｌ ＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）中に再懸濁した。フェノール：クロロホルムでの抽出後、サンプルを酢酸ナトリウムを用いて０．３Ｍにし、そしてＲＮＡを１ｍｌの１００％エタノールの添加および−２０℃での少なくとも１時間の保存によ
って沈降した。そのＲＮＡを遠心分離によって収集し、そして２０μｌの滅菌水に再懸濁し、そして２６０ｎｍでの吸光度によって濃度を評価した。
（競合ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイ）
（ヒトＴＢＰ発現の分析）
改変された競合ＲＴ−ＰＣＲアプローチ（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、１９９０）を用いて、マウスバックグラウンドでのヒトＴＢＰおよびＰＳＭＢ１の遺伝子発現を正確に定量した。トランスジェニックマウス組織または細胞株からの総ＲＮＡ（１μｇ）を２５μｌの反応物（１×ＲＴ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ，０．２５ｍＭスペルミジン）中の１μＭの逆
向きプライマー（ＴＢ１４またはＣ５Ｒ）を伴う、１０ユニットのトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍＭ ＤＴＴ、各々２．５ｍＭのｄＮＴＰ、２５ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））中で逆転写した。ｃＤＮＡの合成を、４２℃で１時間、続いて、５２℃でさらに１時間進行させ、そして９５℃で５分間その酵素を熱不活化した。ＰＣＲ反応物は、尾生検スクリーニングのために記載され、そして問題の配列について特異的なプライマーセット（上記に詳述される。これらのうちの一つは、上記のプロトコルを用いて末端標識された）を含む反応物を用いて増幅された、１μｌのｃＤＮＡを含んだ。プライマーを２回のＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製し、そして８０％の回収が推定された。ＰＣＲ条件は、５と３０との間のサイクル数の９４℃で１分間、５８度で１分間および７２℃で１分間であった。
ヒトＰＣＲ産物とマウスＰＣＲ産物との間を識別するために、２〜１０μｌの各々のサンプルを５ユニットの適切な制限酵素とともに３７℃で２時間インキュベートした。この反応を、大（２５０μｌ）容量で行って、ＰＣＲ緩衝液に由来する塩および界面活性剤を希釈し、制限酵素活性の阻害を防いだ。（コントロール実験は、これが実際にそうであったことを実証した）。消化されたサンプルおよび消化されていないサンプルを、共沈剤としての２５μｇの酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で沈降させ、遠心分離によって収集し、そして５μｌのゲルロード緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸（ｐＨ８．３）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７Ｍ尿素、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロモフェノールブルー）中に再懸濁した。サンプルを、予め泳動した５％ポリアクリルアミドゲル上で、変性剤としての７Ｍ尿素（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および０．５×ＴＢＥ緩衝液の存在下で分析した。４０Ｖ／ｃｍで１時間の電気泳動の後、そのゲルを切断して、キシレンシアノール色素の前面の下に泳動する、残りの取り込まれていないヌクレオチドを除き、乾燥させ、そしてＸ線フィルムまたはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーンに曝露した。
（ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２発現の分析）
類似の競合的ＲＴ−ＰＣＲアプローチ（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、１９９０）を用いて、マウスバックグランドにおけるヒトＨｎＲＮＰ Ａ２遺伝子発現を正確に定量した。逆転写後、ｃＤＮＡサンプルを、プライマーセットＨｎ９およびＨｎ１２（５’−ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣ−３’）（このうち一方は、上記のプロトコルを用いて末端標識された）を用いたＰＣＲによって増幅した。ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２ ＰＣＲ産物とマウスｈｎＲＮＰ Ａ２ ＰＣＲ産物との間を識別するために、２〜１０μｌの各サンプルを、５ユニットのＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃で２時間消化し、精製し、５％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして結果を上記のように定量した。
（クローンの配列決定および生物情報学的（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ）分析）
ＴＢＰ（ヌクレオチド１〜９０９８、図２０）およびｈｎＲＮＰ Ａ２（ヌクレオチド１〜１５０７１、図２１）の両方の遺伝子座のＨｉｎｄＩＩＩゲノムクローンを、Ｂａｓ
ｅｃｌｅａｒ、Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬによって配列決定した。公知の配列に対して作製されたプライマーを用いて開始されるプライマーウォーキング戦略を用いて、未知の配列の領域（ＴＢＰはヌクレオチド１〜５６４２、およびｈｎＲＮＰ Ａ２はヌクレオチド１〜３６８６）を作製した。これらの配列を以前に公知の配列データを用いてともにスプライスし、次いで生物情報学的分析において使用した。
標準的なＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ検索を用いて、ＴＢＰ配列とｈｎＲＮＰＡ２配列との間の直接の比較を行った。これは、図１９に示されるようないくつかのＡｌｕ反復以外の相同性の明らかな領域を示さない。これらの反復をマスクすることおよびＧＣＧベストフィットプログラムを用いた比較を行うことは、以下のような相同な２つの短い領域のを生じた：
ＲＮＰ３８６８−３８３６：ＴＢＰ ８９７１−９００３ 長さ＝３３、％同一性＝７５．７５８
ＲＮＰ ３４２５−３４５９：ＴＢＰ ９０４９−９０８３ 長さ＝３５ ％同一性＝７４．２８６
ＣｐＧ島もまた、同定され、そしてこれを図１９に示す。ヌクレオチド位置は以下のとおりである。
ＲＮＰ ４３９９−５４９１、５７４９−６７３１
ＴＢＰ ５２８５−５６４８、６３９０−６９６６。
配列決定研究を上記のように行って、ＲＮＰ遺伝子およびＴＢＰ遺伝子の直ぐ上流の領域からのより多くの配列データを提供した。
図２０および２１に与えられる配列データは、５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位に始まり、そしてともにスプライスされた、Ｂａｓｅｃｌｅａｒで生成された配列およびすでに公開された配列データを含む。ＴＢＰ配列の場合において、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ配列を大文字で示す。
これらの配列の分析は、以前に特徴付けられた遺伝子であるＨＰ１Ｈ−γの存在すなわち、ＲＮＰ遺伝子のＨγ上流のヘテロクロマチン関連タンパク質の存在を示す（図１９および２２）。この遺伝子はまた、ヒト組織ドットブロット分析によって（データは示さず）普遍的に発現されることが示されている。
生物情報学分析および配列の比較は、遺伝子座の間の明らかな配列相同性を示さなかった。しかし、このデータのまとめを図１９に示す。理解され得るように、いくつかの推定Ｓｐ１転写因子結合部位がこの２つの遺伝子座の二方向性のプロモーター領域において位置する。ＣｐＧメチル化遊離島もまた示す。両方の遺伝子座は、普遍的に発現された遺伝子のクラスターを含む二方向性の構造を示す。
（ｈｎＲＮＰ Ａ２ ＥＧＦＰレポーター構築物の構築）
ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳを、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を消化して、ＥＧＦＰ配列を遊離することによって構築し、次いで、これを、ＫｐｎＩおよび次いでＮｏｔＩを用いて部分的に消化したｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に連結させた。これは、ＣＭＶプロモーターの３’側におよびＩＲＥＳｎｅｏの５’側にＥＧＦＰ遺伝子を有するベクター（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ）を作製した。
ＣＭＶプロモーターをＲＮＰプロモーターについて交換して、図２２においてＲＮＰと称する構築物を作製した。ＣＭＶ−ＥＦＧＰ−ＩＲＥＳを、ＡｇｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．０５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．
０５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ／μｇＤＮＡ）で平滑化し、次いでＮｒｕＩで切断して、ＣＭＶプロモーターを放出してＥＧＦＰ−ＩＲＥＳを与えた。ＲＮＰプロモーターを８ｋｂ ｈｎＲＮＰＡ２ ＨｉｎｄＩＩＩクローン（８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳ）（これは、プロモーターおよびＲＮＰＡ２およびＨＰ１Ｈγ遺伝子の最初のエキソンを含む）から取り出した。８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳをＢｓｐＥＩおよびＴｔｈ１１１Ｉで切断し（６３０ｂｐプロモーターを放出する）、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＥＧＦＰ−ＩＲＥＳに単離したＲＮＰプロモーターを連結させた。
５．５ＲＮＰを、ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳカセットを８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳに挿入して、その結果、ＥＧＦＰの発現を、ＲＮＰプロモーターの制御下に置くことによって構築した。８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳを、Ｔｔｈ１１１Ｉで部分的に消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、次いでＳａｌＩで消化し、これは、ＲＮＰプロモーターの３’側の全ての配列を除去した。ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳカセットを、ＡｇｅＩでの消化によってＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳから取り出し、そしてＸｈｏＩでの消化の前に平滑化した。次いで、これを、制限処理した８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳに連結させた。
５．５ＣＭＶを、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳカセットを８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳ中に挿入すること、続いてＲＮＰプロモーターを除去することによって構築した。８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳを、ＢｓｐＥＩで切断し、平滑化し、次いでＳａｌＩで消化して、ＲＮＰプロモーターおよびそのプロモーターの３’側の全ての配列を除去した。ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳカセットを、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳから、ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩを用いた消化によって取り出し、そして消化した８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳへと連結させた。
およそ４ｋｂのＤＮＡを、５．５ＲＮＰから除去し、そのＲＮＰプロモーターの５’側に１．５ｋｂ残し、１．５ＲＮＰを作製した。これは、ＢａｍＨＩで５．５ＲＮＰを消化することによって達成した。この消化は、４ｋｂ、２．９ｋｂおよび５ｋｂのフラグメントを与えた。次いで、この２．９ｋｂフラグメントおよび５ｋｂフラグメントを単離し、そして再連結して１．５ＲＮＰを作製し、このとき、２．９ｋｂフラグメントは、正確な配向で挿入された。
この５．５ＲＮＰ構築物を、そのＲＮＰプロモーターの３’側のｈｎＲＮＰＡ２配列を含むように拡張し（構築物７．５ＲＮＰおよび８．５ＲＮＰ）、この領域は、ｈｎＲＮＰＡ２の最初のエキソンおよびイントロンを含んだ。ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳレポーターがこれらの構築物に含まれるために、エキソン２のｈｎＲＮＰＡ２スプライスアクセプター配列を、ＥＧＦＰ遺伝子とインフレームに配置し、その結果、ｈｎＲＮＰＡ２の最初のエキソンがＥＧＦＰ遺伝子へとスプライスされ得、それゆえＥＧＦＰ発現がＲＮＰプロモーターによって駆動され得ることが必要であった。ｈｎＲＮＰＡ２スプライスアクセプターを含む２つの構築物を作製し、これらは、第二のエキソンの５’側の８０ｂｐおよび約１ｋｂの配列を含み、これらの配列は、ＰＣＲによって、ＭＡ１６０（これは、ｈｎＲＮＰＡ２ゲノム配列全体を含む）から得られた。８０ｂｐの配列を、ＰＣＲ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１μＭ Ｐｒｉｍｅｒ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ３．５μｇ ＭＡ１６０ ＤＮＡ、５Ｕ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によって、プライマー（５’ＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＡＣＣ３’）および（５’ＧＧＴＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＣ３’）を用いて単離し、１ｋｂのフラグメントを、プライマー（５’ＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＡＣＣ３’）および（５’ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣＧ３’）を用いて単離した。これらのプライマーは、そのＰＣＲ産物がＫｐｎＩおよびＡｇｅＩ部位
がそれぞれ５’末端および３’末端に含むように設計した。次いで、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
８０ｋｂのフラグメントおよび１ｋｂのフラグメントを、ｐＣＲ３．１から、ＫｐｎＩ−ＡｇｅＩフラグメントとして単離し、そしてＫｐｎＩで部分消化し、次いでＡｇｅＩで切断したＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳに連結させた。これは、ＥＧＦＰ遺伝子とのスプライスアクセプター（ＳＡ）のインフレーム融合物を作製した。
７．５ＲＮＰを、８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳをＣｌａＩで消化すること、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化すること、次いでＳａｌＩで消化することによって構築した。この８０ｂｐのＳＡ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳカセットを、ＫｐｎＩでの部分消化に続いて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでの平滑化およびＸｈｏＩ消化によって単離した。これを、ＣｌａＩ−ＳａｌＩ消化した８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳ中に連結させた。
８．５ＲＮＰを、８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳのＳｐｈＩ部分消化、続いてＳａｌＩでの消化によって構築し、この１ｋｂ ＳＡ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳカセットを、同様に、ＳｐｈＩ部分消化に続いてＸｈｏＩでの制限処理によって単離した。このカセットを、８ｋｂ
Ｈｉｎｄ ＢＫＳに連結して８．５ＲＮＰを作製した。
４．０ＣＭＶを、４ｋｂフラグメントを８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳから、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ消化によって切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、クレノウおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端充填した。
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＡｓｅＩで直鎖状とし、上記のように末端を平滑化し、次いでウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処置した。次いで両方のフラグメントを一晩連結させた。
ｐ７．５ＣＭＶを、８．３ｋｂのフラグメントをｐ８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳからＨｉｎｄＩＩＩ消化を用いて切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、クレノウおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を充填した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＡｓｅＩで直鎖状とし、その末端を上記のように平滑化し、次いでウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処置した。次いで両方のフラグメントを一晩連結させた。得られたクローンをその８．３ｋｂ ＵＣＯＥインサートの順配向および逆配向の両方についてスクリーニングした。
ｐ１６ＣＭＶを、１６ｋｂフラグメントを、ＭＡ５５１（ｈｎＲＮＰＡ２ゲノムクローン（これは、５ｋｂの５’側の配列および１．５ｋｂの３'側の配列を含み、これは、コ
ード領域全体（図１３Ｃに示す１６ｋｂフラグメント）を含む））からＳａｌＩ消化によって切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、クレノウおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端充填した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＡｓｅＩを用いて直鎖状とし、末端を、上記のように平滑化し、次いでウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理した。次いで、両方のフラグメントを一晩連結させた。得られたクローンを１６ｋｂ ＵＣＯＥインサートの順配向および逆配向の両方についてスクリーニングした。
（ＣＨＯトランスフェクション）
ＣＨＯ細胞を、無血清培地に２×１０7細胞／ｍｌで回収した。１トランスフェクショ
ン当たり１×１０7細胞（０．５ｍｌ）を、１μｇ（５μｌ）の線状ＤＮＡおよび５０μ
ｇ（５μｌ）のサケ精子キャリアＤＮＡと共に使用した。ＤＮＡおよび細胞を混合し、そ
して１０分間氷上に置いた。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩTMを９７５μＦ／２５０Ｖで使用して、細胞をエレクトロポレーションし、次いで、１０分間氷上に置いた。次いで、この混合物を、１０ｍｌの完全培地（ＨＦ１０）上に積層し、そして１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上清を取り除き、そしてペレットを、５ｍｌのＨＦ１０中に再懸濁した。次いで、これらの細胞を、５×１０4または１×１０4にて１０ｃｍディッシュに、およびＴ２２５フラスコ当たり２×１０6細胞にてプレートした。２４
時間後に、これらの細胞を、選択（最初は、３００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、次いで、４日後に、６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８）下に置いた。トランスフェクションの１０日後に、コロニーを、メチレンブルー（５０％エタノールからなる２％溶液）を用いて染色し、そして計数した。二連のプレートを、制限されたプールとしてか、または単一の細胞コロニーとしてのいずれかで、培養物中に維持した。
（トランスフェクトしたＣＨＯクローンにおけるＧＦＰ発現の分析）
トランスフェクトした細胞を、６００μｇ／ｍｌでのＧ４１８選択上で維持した。細胞を、ＧＦＰ発現分析のために、６ウェルプレートにて剥ぎ取った。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ＧＩＢＣＯ）を用いて洗浄し、そしてそれらがプレートの表面から剥がれるまで、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートした。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ）で補充した過剰の栄養混合Ｆ１２（ＨＡＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ）を、これらの細胞に添加し、そしてこれらの細胞を、５ｍｌのポリスチレン丸底チューブに移した。次いで、これらの細胞を、親細胞集団の自己蛍光と比較する、ＧＦＰ発現の検出のためにＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣｓｃａｎで分析した。１９個のＲＮＰクローン、２４個の５．５ＲＮＰクローン、２１個のＣＭＶクローンおよび１２個の５．５ＣＭＶクローンを分析し、そして平均を、全ての陽性クローンの蛍光の中央値から求めた。
（トランスフェクトしたＣＨＯプールにおけるＧＦＰ発現の分析）
Ｇ４１８での選択を受けた、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞のコロニーを、Ｔ２２５組織培養フラスコから剥ぎ取り、そして１０ｃｍのペトリ皿にプレートして、およそ１００コロニー／プレートを得た。これらのコロニーが成長した時に、これらの細胞を剥ぎ取り、そしてトランスフェクトされた細胞のこの制限されたプールを、ＧＦＰ発現について分析した。ＧＦＰ発現を、３〜４日毎に１：１０に分割したプールを用いて、定期的にモニターした。細胞を、常に、分析する日の前に、これらの細胞が分析の日にほぼ５０％のコンフルエントであるように、２４ウェルプレートに分割した。次いで、これらの細胞を、２４ウェルプレートから剥ぎ取り、そして前節と同じ様式にて分析した。経時的な発現について、マーカー領域（Ｍ１）を設定し、これは、細胞の陽性集団の低い割合のみを含み、そして最初のレベルからのＧＦＰ発現の任意の損失を経時的に調査するために使用された。
（単一コピー数／低いコピー数の組み込み体のＦＩＳＨ分析）
（４０ｋｂ ＴＢＰコスミドｐＷＥ−ＴＳＮまたはｐＢＬ３−ＴＰＯ−プロ（ｐｕｒｏ）を使用するＦＩＳＨ分析）
ＤＭＥＭ−１０％ウシ胎仔血清中で増殖したマウスＬｔｋ細胞を、４０ｋｂ ＴＢＰコスミドｐＷＥ−ＴＳＮ（図９）または２５ｋｂのプラスミドｐＢＬ−ＴＰＯ−プロを用いてエレクトロポレーションした。これらのトランスフェクト体を、２００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＴＳＮ）または５ｍｇ／ｍｌのプロマイシン（ＴＰＯ）のいずれかを用いて選択し、そして単一コピーまたは低コピーのクローンを、先に概説したように作製した。これらの選択されたコロニーに由来する対数的に増殖している細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのコルヒチンを用いて１時間処理して、回収した。次いで、細胞を、０．０５６Ｍ ＫＣｌ中に低張的で膨張させ、３：１のメタノール−酢酸で固定し、そして顕微鏡用スライド上に薄く広げ、中期染色体を得た。このスライドを、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）中の１ｍｌ当たり１００ｍｇのＲＮａｓｅＡを用いて３７℃で１時間予め処理し、２×ＳＳＣ中で洗浄し、そしてエタノール脱水シリーズ（７０、９０、および１００％エタノール）を行った。これらの染色体を、７０％ホルムアミド−２×ＳＳＣ中にて７０℃で５分間変性させ、氷冷７０％エタノール中に沈め、そして上記のように脱水した。１００ｎｇのＴＢＰプローブ（ＴＢＰ遺伝子を含む２５ｋｂのヒトゲノムＤＮＡを保有するＴＰＯプラスミド全体）および５０ｎｇのマウスγサテライトプローブ（Ｈｏｒｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９；６８３〜６９６、１９８１）を、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰおよびビオチン−１６−ｄＵＴＰをそれぞれ用いて、製造業者の使用説明書に従ってニックトランスレーション（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって標識した。標識したプローブを、１ｍｇのｃｏｔ−１ ＤＮＡおよび５ｍｇのニシン精子ＤＮＡを用いて沈澱させ、５０％ホルムアミド−２×ＳＳＣ−１％ Ｔｗｅｅｎ２０−１０％ デキストラン硫酸中に再懸濁し、７５℃で変性させ、ＴＢＰプローブを、３７℃で３０分間予めアニールさせ、そしてプールし、そしてスライドに適用した。ハイブリダイゼーションを、３７℃で一晩実行した。これらのスライドを、５０％ホルムアミド−２×ＳＳＣ中にて４５℃で４回（各回３分間）、２×ＳＳＣ中にて４５℃で４回（各回３分間）、および０．１×ＳＳＣ中にて６０℃で４回（各回３分間）洗浄した。４×ＳＳＣ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で５分間洗浄した後に、これらのスライドを、４×ＳＳＣ−５％低脂肪スキムミルク中で５分間ブロックした。ビオチン標識したプローブを、以下の各々を用いて、３７℃で３０分間のインキュベーションによって検出した：アビジン結合体化Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）、続いてビオチン化抗アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）およびアビジン結合体化Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）。ジゴキシゲニン標識プローブを、以下の各々を用いるビオチン検出と同時に検出した：抗ジゴキシゲニン−フルオレセイン（ＦＩＴＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、続いてマウス抗ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）およびウマフルオレセイン結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ、ＵＳＡ）。２回の各インキュベーションの間に、これらのスライドを、４×ＳＳＣ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０中にて３回（各回２分間）洗浄した。これらのスライドを、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて対比染色し、そしてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）にマウントした。画像を、蛍光顕微鏡で、油浸１００×対物レンズ（ｏｉｌ １００×ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を用いて試験した。これらの画像を、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ冷却電荷結合デバイスおよびＶｙｓｉｓ Ｓｍａｒｔｃａｐｔｕｒｅソフトウェアを使用して、取り込んだ。
（１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰ構築物を使用するＦＩＳＨ分析）
１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰベクターを、ＥＧＦＰ−ＩｒｅｓＮｅｏ発現カセットおよび８．５ＲＮＰに由来するいくつかのＲＮＰ ５’配列をＭＡ５５１に挿入することによって構築した。８．５ＲＮＰをＸｈｏＩを用いて消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、次いでＰａｃＩで消化して、得られたフラグメントを、ＮｈｅＩで切断され平滑化され次いでＰａｃＩで消化されたＭＡ５５１中に連結した。８．５ＲＮＰを用いる場合、発現は、ＲＮＰプロモーターにより駆動され、ＲＮＰの第１エキソンとＥＧＦＰとのインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合を生じる。
１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰでトランスフェクトされたマウスＬＴＫ-細胞のクローンを、Ｄ
ＭＥＭ−１０％ウシ胎仔血清および２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中にて増殖させた。対数的に増殖している細胞を、回収する前に、１時間０．４μｇ／ｍｌのコルヒチンを用いて処理した。細胞を、０．０５６Ｍ ＫＣｌ中にて低張的に膨張させ、３：１のメタノール−酢酸中にて固定し、そして顕微鏡用スライド上に薄く広げ、中期染色体を得た。このスライドを、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸
ナトリウムである）中の１ｍｌ当たり１００ｍｇのＲＮａｓｅＡを用いて３７℃で１時間予め処理し、２×ＳＳＣ中で洗浄し、そしてエタノール脱水シリーズ（７０、９０、および１００％エタノール）を行った。これらの染色体を、７０％ホルムアミド−２×ＳＳＣ中にて７０℃で５分間変性させ、氷冷７０％エタノール中に沈め、そして上記のように脱水した。１００ｎｇの１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰおよび５０ｎｇのマウスγサテライト（Ｈｏｒｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９；６８３〜６９６、１９８１）を、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰおよびビオチン−１６−ｄＵＴＰをそれぞれ用いて、製造業者の使用説明書に従ってニックトランスレーション（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって標識した。標識したプローブを、５μｇのニシン精子ＤＮＡを用いてエタノール沈澱させ、そしてＲＮＰプローブを、１μｇのｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて沈澱させ；５０％ホルムアミド−２×ＳＳＣ−１％ Ｔｗｅｅｎ２０−１０％ デキストラン硫酸中に再懸濁し；７５℃で変性させ、ＲＮＰプローブを、３７℃で３０分間予めアニールさせ；そしてプールし；そしてスライドに適用した。ハイブリダイゼーションを、３７℃で一晩実行した。これらのスライドを、５０％ホルムアミド−２×ＳＳＣ中にて４５℃で４回（各々３分間）、２×ＳＳＣ中にて４５℃で４回（各回３分間）、および０．１×ＳＳＣ中にて６０℃で４回（各回３分間）洗浄した。４×ＳＳＣ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で５分間洗浄した後、これらのスライドを、４×ＳＳＣ−５％低脂肪スキムミルク中で５分間ブロックした。ビオチンを、以下の各々を用いて、３７℃で３０分間のインキュベーションによって検出した：アビジン結合体化Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、続いてビオチン化抗アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびアビジン結合体化Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ジゴキシゲニンを、以下の各々を用いてビオチンと同時に検出した：抗ジゴキシゲニン−フルオレセイン（ＦＩＴＣ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、続いてマウス抗ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）およびウマフルオレセイン結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。２回の各インキュベーションの間に、これらのスライドを、４×ＳＳＣ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０中にて３回（各回２分間）洗浄した。これらのスライドを、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて対比染色し、そしてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）にマウントした。画像をＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４０蛍光顕微鏡で油浸１００×対物レンズを用いて試験した。これらの画像を、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ冷却電荷結合デバイスおよびＶｙｓｉｓ Ｓｍａｒｔｃａｐｔｕｒｅソフトウェアを使用して、取り込んだ。
（コピー数の決定）
ゲノムＤＮＡを、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって細胞クローンから調製した。トランスフェクトした遺伝子のコピー数を、ＨｉｎｃＩＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって決定した。導入遺伝子を、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰに由来する１ｋｐｂフラグメント（製造業者の使用説明書（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識系、Ａｍｅｒｃｈａｍ）に従って［α−32Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識したネオマイシン耐性カセットを含む）へのハイブリダイゼーションによって、２．５ｋｂｐのバンドとして検出した。正規化のために、ブロットを、マウスｖａｖ遺伝子座（Ｏｇｉｌｖｙら、１９９８）に由来する、上記のように標識した１ｋｂｐのＮｃｏＩフラグメントを用いて同時にハイブリダイズし、これにより１．４ｋｂｐのバンドが得られた。コピー数の標準物として、いくつかのｐＷＥ−ＴＳＮクローンに由来するＤＮＡを、ＰｓｔＩで消化し、そして上記のプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションシグナルの定量を、Ｃｙｃｌｏｎｅ ＰｈｏｒｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて実行した。
（トランスフェクトしたＬｔｋクローンにおけるＧＦＰ発現の分析）
トランスフェクトされた細胞を、２００μｇ／ｍｌでのＧ４１８選択上で維持した。８０〜１００％コンフルエントな細胞を、ＧＦＰ発現の分析のために６ウェルプレートに剥
ぎ取った。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてそれらがプレートの表面から剥がれるまで、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）中にてインキュベートした。１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）で補充した過剰のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を、これらの細胞に添加し、、５ｍｌのポリスチレン丸底チューブに移した。次いで、これらの細胞を、トランスフェクトしていないコントロールの自己蛍光と比較して、ＧＦＰ発現の検出のためにＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣｓｃａｎで分析した。
（ＥＢＶレポーター構築物の産生）
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化配列を含むＤＮＡフラグメントを、製造業者の推奨する条件（ＮＥＢ）を使用するＡｓｅ ＩおよびＡｆｌ ＩＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化によって、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から取り除いた。このＤＮＡを０．５％アガロースゲル上で電気泳動し、ベクター骨格からこのフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、ゲルから切り出し、そして標準的なグラスミルク（ｇｌａｓｓ ｍｉｌｋ）精製技術を使用して、ゲルスライスより精製した。このフラグメントを、製造業者の条件に従ってＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、平滑化し、そしてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）での１：１（ｖ／ｖ）の抽出、続いてエタノール沈澱によって精製した。
次いで、レポーターカセットを、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）ベクターｐ２２０．２（国際特許出願ＷＯ ９８／０７８７６に記載される）中にクローニングした。ｐ２２０．２を、ＨｉｎｄＩＩＩ（ベクターのマルチクローニング配列（ＭＣＳ）中の独特の部位）でエンドヌクレアーゼ消化し、平滑化し、そして上記と同じ様式にて精製した。このレポーターカセットを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｐ２２０．２中にライゲーションした。ライゲーション反応を、１×ライゲーション緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中の２００ｎｇの線状化ｐ２２０．２およびモル等量または５モル過剰のいずれかのＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０ｐＡフラグメントを使用して、１０μｌ容量中で実行した。この反応を、室温で一晩インキュベートした。２．５μｌのライゲーション液を、２．５ｋＶ、４００Ω、２５μＦでのエレクトロポレーションによって、電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＤＨ５α細胞中に形質転換し、続いて９００μｌのＳＯＢ培地を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。形質転換液の各々の２００μｌを、ＬＢアンピシリンアガープレートにプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。
得られたコロニーを、ＣＭＶおよびＥＧＦＰ配列中のＤＮＡプライマーを用いるコロニーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の標準的な条件で使用して、レポーターカセットの存在についてスクリーニングした。陽性コロニーを、ＬＢアンピシリン培地にて一晩増殖させ、そしてアルカリ溶解ＤＮＡミニプレパレーション（Ｑｉａｇｅｎ）として分析した。ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を使用して、正確な配向のフラグメントについてスクリーニングした。得られた構築物を、ｐ２２０．ＥＧＦＰと名付けた。
ｐ２２０．ＥＧＦＰは、以下に記載されるのと本質的に同じ方法を使用して、Ｋ５６２細胞中へのエレクトロポレーションの後に、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣｓｃａｎでの分析によって、ＥＧＦＰを発現することが実証された。
（ｈｎＲＮＰＡ２ １６ｋｂ（ＲＮＰ１６）ＵＣＯＥフラグメントを含むＥＢＶレポーター構築物の生成）
ＳａｌＩ部位を、ＳａｌＩを有するベクターの部分的制限エンドヌクレアーゼ消化、続いて、このベクターの平滑化および再ライゲーションによって、ｐ２２０．ＥＧＦＰから取り除き、それによってベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）中の唯一のＳａｌＩ部位を取り去り、これは、１６ｋｂのＲＮＰフラグメントのクローニングに利用され得る。得られたベクターを、ＳａｌＩで制限エンドヌクレアーゼ消化し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理し（ライゲーションの間のベクターの再環状化を防ぐため）、そしてフェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。
１６ｋｂ ＲＮＰフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩを使用して、ベクターＭＡ５５１から除去し、そして平滑化し、電気溶出によって精製し、そして線状化されたベクター中にライゲーションした。ライゲーション反応を、上記と同じ様式にて（等モル量のフラグメントを使用して）設定し、続いて形質転換し、そしてこのフラグメントの存在についてコロニーをスクリーニングした。コロニーを、ＤＮＡミニプレパレーションとしてスクリーニングした。ここで陽性クローンを、アガロースゲル電気泳動分析によって確認した。１６ｋｂ ＲＮＰフラグメントの正確な配向を、ＮｏｔＩを使用する制限エンドヌクレアーゼ分析によって決定した。得られた構築物を、ｐ２２０．ＲＮＰ１６と名付けた。
（Ｈｅｌａ細胞中へのＥＢＶレポーター構築物のトランスフェクション）
Ｈｅｌａ細胞を、国際特許出願ＷＯ９８／３５９８４に記載され、かつ以下に記載される、ＣＬ２２ペプチド媒介性送達系を使用して、ｐ２２０．ＥＧＦＰおよびｐ２２０．ＲＮＰ１６とともに、６ウェルプレート中にトランスフェクトした。２４時間の培養後に、ハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）選択を、４００μｇ/ｍｌの最終濃度まで
添加した。細胞のハイグロマイシンＢ耐性コロニーを、培養物中にて維持し、そしてＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎにおいてＧＦＰの発現を定期的に分析した。細胞を、分析前日に２４ウェルプレート中に、分析日におよそ５０％コンフルエントになるように慣用的に分割した。経時的な発現のために、細胞のＧＦＰ発現集団を含むマーカー領域を、設定し、そしてこのマーカーを使用して、経時的なＧＦＰ発現の安定性を調査した。トランスフェクトされたＨｅｌａ細胞をまた、ハイグロマイシンＢ選択から取り出し、選択圧をなしにして、ＵＣＯＥの非存在／存在下で、ＧＦＰ発現の安定性を調査した。
（ＣＥＴ２００のクローニング）
ＰＥＧＦＰＮ１を、ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩＩを用いて制限処理し、そして以下のオリゴを、アニールさせ、そして挿入して、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を作製した：
５’ＣＴＡＧＣＧＴＴＣＧＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣ３’
５’ＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＣＧＡＡＣＧ３’。
得られたプラスミドを、ＡｓｅＩで制限処理し、平滑化し、そして８．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント平滑化ＲＮＰ Ａ２フラグメントを、挿入した。次いで、得られた配向を決定し、最終的なベクターＣＥＴ２０００を作製した（図４９を参照のこと）。
（ＣＥＴ２０１のクローニング）
ｐＵＣ１９を、ＥｃｏＲＩ／ＡｒＩで制限処理し、そして平滑化し、１つのＰｖｕＩ部位を取り除き、それによって環状化のための唯一のＰｖｕＩ部位を作製した（ｐＵＣ１９Δ）。ＭＣＳを、ＮｈｅＩ／ＡｇｅＩでの消化によってｐＥＧＦＰＮ１から取り除き、そして平滑化した。このことは、ＮｈｅＩ部位を作製する。ＣＭＶ ＥＧＦＰ ＳＶ４０カセットを、ＡｆｌＩＩ平滑ＡｓｅＩフラグメントとして取り除き、そしてＰｖｕＩＩで消化されているｐＵＣ１９Δ中に挿入した。そしてｐＧＫプロｂＧＨ（ｐＧＫプロＢＫＳに由来する）を、ＮｄｅＩで挿入した。次いで、得られたベクターを、ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ
で制限処理し、ＥＧＦＰを取り除き、そしてＭＣＳを、上記のように挿入した。次いで、ＭＣＳ含有ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理し、そして８．３ｋｂのＲＮＰ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを挿入し、最終的なベクターＣＥＴ２１０を作製した（図４９を参照のこと）。
（ＵＣＯＥを含むプラスミドの調製）
（ＲＮＰ−ＵＣＯＥ含有レポーター構築物のクローニング）
ｐ８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳは、ＲＮＰ遺伝子座の８．３ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩゲノムフラグメントを含み、このフラグメントは、ＲＮＰＡ２およびＨＰ１Ｈ−γ遺伝子のプロモーターおよび第１エキソンを含んだ。
ｐＣＭＶ ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＭＶ−ＥＧＦＰと同じ。図３５）をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化することによって構築し、ＥＧＦＰ配列を解離した。次いで、これを、ＫｐｎＩ次いでＮｏｔＩで部分消化されたｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にライゲーションした。このことは、ＣＭＶプロモーターに対して３’およびＩＲＥＳｎｅｏに対して５’のＥＧＦＰ遺伝子を有するベクターを作製した。
イントロンＡ−ＣＭＶを、ＮｒｕＩ（平滑カッター）およびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＴＸ０３５０（ｐＵＣベースのＣＭＶ イントロンＡ−ＭＡＧＥ１プラスミド）から１．５ｋｂのイントロンＡ−ＣＭＶフラグメントを取り出すことによってクローニングした。ｐＥＧＦＰ−ＮＩを、ＡｓｅＩを用いて消化し、次いで、このフラグメントの末端を、ＫｌｅｎｏｗおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端充填した。次いで、これをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、４．２ｋｂのフラグメントを得た。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。
ｐ４．０ＣＭＶを、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ消化を用いて、ｐ８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳから４ｋｂのフラグメントを切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、ＫｌｅｎｏｗおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端充填した。
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＡｓｅＩで線状化し、上記のように末端を平滑化し、次いで、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。得られたクローンを、順方向および逆方向の両方の配向の４ｋｂ ＵＣＯＥインサートについてスクリーニングした。
ｐ７．５ＣＭＶを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化を用いて、ｐ８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＢＫＳから８．３ｋｂのフラグメントを切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、ＫｌｅｎｏｗおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端充填した。ｐＥＧＦＰ−ＮＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＡｓｅＩで線状化し、この末端を、上記のように平滑化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。次いで、両方のフラグメントを、一晩ライゲーションした。得られたクローンを、順方向および逆方向の両方の配向の８．３ｋｂ ＵＣＯＥインサートについてスクリーニングした。
ｐ１６ＣＭＶを、ＳａｌＩ消化によって、ＭＡ５５１（コーディング領域全体を含む５ｋｂの５’配列および１．５ｋｂの３’配列を含むｈｎＲＮＰ Ａ２ゲノムクローン）から１６ｋｂフラグメントを切り出すことによって構築した。次いで、このフラグメントの末端を、ＫｌｅｎｏｗおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端充填した。ｐＥＧＦＰ−ＮＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＡｓｅＩで線状化し、この末端を、上記のように平滑化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。次いで、両方のフラグメン
トを、一晩ライゲーションした。得られたクローンを、順方向および逆方向の両方の配向の１６ｋｂ ＵＣＯＥインサートについてスクリーニングした。
（ＣＬ２２ペプチドを使用するＨｅｌａ細胞のトランスフェクション）
ＣＬ２２ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
ＮＨ2−ＫＫＫＫＫＫＧＧＦＬＧＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲＳＡＹＥＲＭＣＮＩＬＫＧＫ−
ＣＯＯＨ。
ＣＬ２２ペプチドを、ＷＯ ９８／３５９８４に記載される方法に従って、トランスフェクト剤として使用した。
ＨｅＬａ細胞を、ＥＦ１０培地中にて慣用的に培養し、３〜４日毎にコンフルエントフラスコ１：１０に分割した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、１ウェル（６ウェルプレート）当たり５×１０4で播種した。複合体を、等容量のＤＮＡ：ＣＬ２２
（これは、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中にて、それぞれ、４０μｇ／ｍｌおよび８０μｇ／ｍｌの濃度である）を混合することによってトランスフェクションの１時間前に形成させ、そして室温にて１時間インキュベートした。培地を、細胞から取り除き、次いで、これを１％リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。次いで、２．５μｇのＤＮＡ：複合体（１２５μｌ）を、細胞に添加し、そして容量を、ＲＡＱ（ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）、０．１％ヒトアルブミン、１３７μＭ クロロキン（新鮮に添加））で１ｍｌに増量し、このことは、１２０μＭの最終濃度のクロロキンを与えた。細胞および複合体を、３７℃で５時間インキュベートした。次いで、この複合体を除去し、そしてＥＦ１０培地（最小必須培地（Ｓｉｇｍａ）、１０％仔ウシ血清、１００ユニット／ｍｌ ペニシリン／０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ））で置換した。
（トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現の分析）
ＧＦＰの発現分析のために、細胞を６ウェルプレートから剥ぎ取った。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、そしてプレートの表面から剥離するまで、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートした。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ）を補充した過剰なＥＦ１０培地（Ｇｉｂｃｏ）を細胞に添加し、そして細胞を５ｍｌのポリスチレン丸底チューブに移した。次いで、細胞を、親細胞集団の自己蛍光と比較して、ＧＦＰ発現を検出するためにＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ＦＡＣｓｃａｎにて分析した。
（総ＤＮＡサンプルの調製）
トランスフェクトされた集団のエピソームＤＮＡ含量を調べるために、細胞ＤＮＡの総調製物を作製した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで溶解緩衝液（新鮮なプロテイナーゼＫ
１ｍｇ／ｍｌ Ｆ／Ｃを添加した１０ｍＭ ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％ Ｓａｒｃｏｓｙｌ）で溶解した。細胞溶解物を、プレートから剥ぎ取り、そして口径の広いピペットを用いてエッペンドルフチューブに移した。６５℃での一晩のインキュベーションに続いて、この細胞溶解物をフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿を行なった。このＤＮＡペレットをＴＥ ｐＨ８．０中に再懸濁した。
（総ゲノムＤＮＡサンプル中のエピソームＤＮＡの検出）
トランスフェクションの７日後のトランスフェクトされた細胞から調製した総ゲノムＤＮＡを、トランスフェクションに使用したＤＮＡ構築物を直鎖化し、従ってサンプル中に存在するいかなるエピソームＤＮＡも直鎖化するエンドヌクレアーゼを用いて制限エンドヌクレアーゼ消化した。Ａｐａ ＬＩ（ＮＥＢ）をモックに使用し、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、
ＩｎｔｒｏｎＡ−ＣＭＶならびに４．０ＣＭＶを順方向および逆方向サンプルに使用した。ＢｓｐＬＵ１１ Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を、７．５ＣＭＶ順方向および逆方向サンプルに使用した。１０μｌ（サンプルの２０％）の総ゲノムＤＮＡを、３０ユニットの制限エンドヌクレアーゼを用いて１６時間、製造者の推奨する条件に従って消化した。サンプルを、１００ｐｇまたは４ｎｇの直鎖プラスミドコントロールとともに、０．６％アガロースゲル上で、４００ボルト／時間電気泳動した。次いで、ゲルをサザンブロッティングにより、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ転写メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。手短に言えば、ゲルを１５分間０．２５Ｍ ＨＣｌ中でインキュベートしてＤＮＡを脱プリン化し、次いで、４５分間、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ中で変性させ、そして４５分間、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．０中で中和した。次いで、ＤＮＡを、２０× ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7−２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．０）中で、１６時間キャピラリーブロッテ
ィングによりゲルからメンブレンに転写した。フィルターを、１時間風乾し、そしてＵＶＰ ＣＬ−１００紫外線クロスリンカー（ＧＲＩ）を用いて、２分間１２００のエネルギー設定にて架橋させた。メンブレンを、「Ｃｈｕｒｃｈ ハイブリダイゼーション条件」を用いて、放射性ＥＧＦＰプローブを使用して探索した。メンブレンを、６５℃にて２時間より長く、０．５ＭのＮａＰｉ ｐＨ７．２、１％ ＳＤＳ中でプレハイブリダイズした。ＤＮＡのＥＧＦＰフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、Ｂｇｌ ＩＩ／Ｎｏｔ Ｉ（ＮＥＢ）を用いる制限エンドヌクレアーゼ消化により取りだし、電気泳動により分離し、そしてゲル切片から、ＧＦＸTM ＰＣＲ ＤＮＡおよびＧｅｌ
Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。５０ｎｇのＥＧＦＰフラグメントを、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、α−32Ｐ ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。標識したプローブを、１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと混合し、９５℃にて１０分間インキュベートし、そして氷上に置いた後、ハイブリダイゼーションに添加した。メンブレンを、１６時間６５℃にてハイブリダイズさせ、次いで、６５℃にて２回、３０分間、４０ｍＭ ＮａＰｉ ｐＨ７．２、１％ ＳＤＳ中で洗浄した。次いで、放射性標識されたメンブレンを、高解像度蛍光体スクリーンに曝露した後、Ｃｙｃｌｏｎｅ保存蛍光体システム（Ｐａｃｋａｒｄ）上で分析した。
（蛍光顕微鏡）
６ウェルプレート中で培養したトランスフェクトされた細胞を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ Ｓ１００倒立顕微鏡を用いて、蛍光下にて観察した。写真撮影を、Ｚｅｉｓｓ
ＭＣ１００カメラおよびＦｕｊｉｃｈｒｏｍｅ Ｐｒｏｖｉａ ４００ＡＳＡフィルムを用いて、通常の時間で行なった。
（実施例１：ヒトＴＢＰ遺伝子座の分析）
（ＴＢＰ遺伝子ドメインのマッピング）
ヒトＴＢＰ遺伝子は、２０ｋｂの長さであり（Ｃｈａｌｕｔら、１９９５）、６ｑ２７−ｔｅｌ染色体上に位置し（Ｈｅｎｇら、１９９４）、そして遍在性プロテオソームの部分を形成するプロテインＣ５をコードする遺伝子に密接に連鎖する（図１ＡおよびＣ；Ｔｒａｃｈｔｕｌｅｃ，Ｚら、１９９７）。Ｃ５遺伝子は、ＴＢＰのキャップ部位から１ｋｂ上流の位置から、多岐に転写される。従って、ＴＢＰおよびＣ５は、二重プロモーターを含み得る。これは、ＴＢＰに基づく発現ベクターの構築に関して重要な問題を有する。なぜなら、二重プロモーターは、両方の方向に同じ効率で必ずしも機能しないからである（ＧａｖａｌａｓおよびＺａｌｋｉｎ、１９９５を参照のこと）。
配列分析は、ＴＢＰ／Ｃ５プロモーター領域が、３．４ｋｂのメチル化されていないＣｐＧ島内に含まれることを明らかにした。これは、Ｃ５のイントロン１内のＦｓｐＩ部位
およびＴＢＰのイントロン１内のＨｉｎｄＩＩＩ部位から伸長し、そして両方の遺伝子の最初のイントロンの最も５’よりの１ｋｂの配列、およびそれらの転写開始部位間の１．４ｋｂの領域を包含する（図１Ｂ）。
ヒトＴＢＰ遺伝子座は、３つの密接に連鎖した遺伝子から構成される。ＰＳＭＢ１遺伝子（本明細書中でＣ５とも呼ばれる）は、ＴＢＰのキャップ部位から１ｋｂ上流の位置から多岐に転写される。最近同定された遺伝子の３’末端のＰＤＣＤ２は、ＴＢＰの５ｋｂ下流に位置する。これらの３つの転写単位は、全てで５０ｋｂにわたる。セントロメアに向かってＰＳＭＢ１遺伝子の下流には、同一の構造遺伝子を有さない反復配列ＤＮＡのブロックから構成される少なくとも８０ｋｂの領域が存在する。テロメアに向かってＰＤＣＤ２遺伝子の上流には、反復配列、非コード配列、次いで有望な新転写単位の３０ｋｂのストレッチが存在する。ＰＤＣＤ２遺伝子は、テロメア反復領域の開始から約１５０ｋｂである。これは、ＴＢＰ遺伝子座を、第６染色体の長腕上のテロメアから第１の構造遺伝子クラスターにさせる。
（ＴＢＰドメインからの遺伝子発現のパターン）
ＴＢＰ遺伝子クラスター内からの発現の組織分布を、広範なヒトの組織および細胞型に由来するポリ（Ａ）+−ＲＮＡを用いて調製された、市販のドットブロットを用いて評価
した（図３５Ａ）。適切なプローブを用いたこのドットブロットのハイブリダイゼーションは、ＰＳＭＢ１遺伝子（図３５Ｂ）、ＰＤＣＤ２遺伝子（図３５Ｃ）およびＴＢＰ遺伝子（図３５Ｄ）が、全て遍在的に発現されることを示した。これらのデータは、ＴＢＰ座が、全面的に、遍在的に発現されるクロマチンドメインから構成されることを確認した。
（マウス保有ｐＣＰ２−ＴＬＮにおける導入遺伝子完全性のマッピング）
９０ｋｂ長のｐＣＹＰＡＣ−２に由来するｐＣＰ２−ＴＬＮクローン（図１）を使用して、トランスジェニックマウスを作製した。このクローンは、Ｃ５遺伝子の４６ｋｂ下流の位置（ＴＢＰの５’側の６５ｋｂ）で開始し、そしてＴＢＰの３’側の４．５ｋｂで終結する。従って、このクローンは、それらの全体においてＣ５遺伝子およびＴＢＰ遺伝子の両方を保有する。
ｐＣＰ２−ＴＬＮを有する３つのトランスジェニック系統を生成した。ｐＣＰ２−ＴＬＮの末端に由来するプローブを用いる最初のサザンブロット分析は、ＴＬＮ：３系統が、頭−尾立体配置（図３ａ、レーンＴＬＮ：３）における導入遺伝子の２つのコピー（図２ａ、ｂ レーンＴＬＮ−３）を保有することを示した。しかし、１つのコピーは、ＴＢＰプロモーターにおよぶ５’欠失を受けているようである（図４、レーンＴＬＮ：３）。末端フラグメント分析によりＴＬＮ：８系統は、ｐＣＰ２−ＴＬＮの３つのコピーを保有するようであった（図２ａ、ｂ レーンＴＬＮ−８）。ＴＬＮ：２８系統は、複数の組み込み部位でいくつかのコピーを保有するようであった（図３ａ、レーンＴＬＮ：２８）。
これらのＴＬＮマウスにおける導入遺伝子のコピー数および完全性の最初の分析のまとめを図３Ｂに示す。
ｐＣＰ２−ＴＬＮを用いて生成されるトランスジェニック系統のさらなる分析は、ＴＬＮ：３系統が、２つの欠失されたｐＣＰ２−ＴＬＮのコピーを含有し、その結果ＴＢＰ遺伝子およびＰＳＭＢ１遺伝子の１つの機能的なコピーがインタクトなままであることをここで示した（図３Ｃ、ＴＬＮ：３）。ＴＬＮ：８系統は、ｐＣＰ２−ＴＬＮの２つの直列に組みこまれたコピーを保有する（図３Ｃ、ＴＬＮ：８）。ＴＬＮ：２８系統は、ｐＣＰ２−ＴＬＮの４つの直列に配置されたコピーを保有する（図４、ＴＬＮ：２８）。ＴＬＮ：８およびＴＬＮ：２８における導入遺伝子の直列アレイの５’末端および３’末端における欠失でさえ、ＰＳＭＢ１遺伝子およびＴＢＰ遺伝子をインタクトなままで残している
。
予期されたように、メチル化されていないＴＢＰ／Ｃ５の島は、ＣｐＧリッチドメインを保有する他の遺伝子の５’領域において観察されたように（例えば、マウスＴｈｙ−１；Ｋｏｌｓｔｏら、１９８６）、トランスジェニックマウスにおいて保存されている（データ示さず）。
（マウスにおけるｐＣＰ２−ＴＬＮに対するＴＢＰ導入遺伝子およびＣ５導入遺伝子の発現分析）
内在性のマウスおよびヒトの導入遺伝子であるＴＢＰおよびＣ５メッセージの両方を同時に検出する、ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを開発した。このＲＴ−ＰＣＲ反応のためのプライマー（ＴＢ−１４およびＴＢ−２２）を、ヒトのＴＢＰ ｃＤＮＡ配列とマウスのＴＢＰ ｃＤＮＡ配列との間の相同性領域から選択した（図５ｂ）。これは、１対のプライマーによって、２８４ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物が、両方のｍＲＮＡから生成されることを可能にする。ヒトＴＢＰ産物とマウスＴＢＰ産物との間を識別するために、制限酵素部位の存在に変化をもたらす少数の塩基差異を利用した。Ｂｓｐ１４０７Ｉでの消化は、ヒトＰＣＲ産物を切断して、２２１ヌクレオチド（ｎｔ）のフラグメントを生じさせる（図６ａ）。同様に、ヒトＣ５ ｃＤＮＡ配列とマウスＣ５ ｃＤＮＡ配列との間の相同性領域（図５ａ）からは、両方の配列から３５０ｎｔのＲＴ−ＰＣＲ産物を生成することを可能にする。ＰｓｔＩでの切断は、マウスＣ５ ｍＲＮＡ由来の産物の大きさを１７３ｎｔに減少させた（図７ａ）。
ＴＢ１４プライマー（図５ｂ）およびＣ５ＲＴＦプライマー（図５ａ）は、32Ｐで末端標識されて、ＰＣＲ反応後に放射性産物の生成をもたらす。これらの産物を、最終的に、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離する（図６ｂ〜ｃおよび７ｂ）。
トランスジェニックマウス系統であるＴＬＮ：３、ＴＬＮ：８、およびＴＬＮ：２８の種々の組織由来の総ＲＮＡ（１μｇ）を、上記の分析手順に供し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって定量化した（図８）。すべてのマウスが、これら２つの遺伝子のインタクトな単一のコピーを保有する、分析されたすべての組織（ＴＬＮ：３を含む）において、ヒトのＴＢＰ導入遺伝子およびＣ５導入遺伝子の両方の有意なレベルの発現を示した。最も重要なことには、特にＣ５について、所定のマウス系統内の組織間において再現可能なレベルの発現が観察された。このことは、おそらくＴＬＮクローンが、遍在性のクロマチンを開く能力を保有することを示す。しかし、導入遺伝子コピー数あたりの発現レベルにおける幾分の変動が、マウス系統間で観察された。さらに、ＴＬＮ：８系統における組織間のＴＢＰ発現もまた、５〜４０％変動した。これらの結果は、ＴＬＮがクロマチンを開く能力を保有するが、Ｃ５そして特にＴＢＰプロモーターには正および負の転写干渉をする傾向があることを示唆する。このことは、同様に、このクローンのＴＢＰ領域およびＣ５領域の固有の転写活性化能力が弱く、従って位置効果を超える優性効果を常には発揮し得ないことを意味する。このことは、この領域のクロマチンを開くＵＣＯＥ効果であるように思われるものとは対照的であり、これは強力で、そしてこのような位置効果を無効にするように思われる。この仮説は、例えば、ＴＬＮ：８系統におけるＣ５についてのプロモーターを有する脾臓と筋肉との間のＴＢＰレベルの比率と比較して、より弱いＴＢＰプロモーターが、より可変性である傾向があるという観察によって支持される（図８）。
先に記載されたような導入遺伝子発現分析を、２ヶ月齢と６ヶ月齢との間であるマウス由来の組織を用いて実施した。導入遺伝子の発現の安定性をまた、ＴＬＮ：３系統およびＴＬＮ：８系統由来の２３ヶ月齢のマウスにおいて、ＰＳＭＢ１ ｍＲＮＡを分析することによって評価した。より若い動物で得られたものと比較して、類似の結果が両方の系統
において観察された。これらの結果はさらに、この導入遺伝子が、転写的に能力のある開いたクロマチン構造を維持することを実証する。
（ＴＢＰ遺伝座の４０ｋｂサブクローンの発現分析）
トランスジェニックマウスにおける、ｐＣＰ２−ＴＬＮクローンによって与えられる再現可能で生理学的なレベルの発現は、これが、遍在性のクロマチンを開く能力を保有することを示す。この活性を担うＤＮＡの領域の詳細なマッピングに対する最初の工程として、本発明者らは、ヒトＴＢＰ遺伝座の４０ｋｂのサブクローン（ｐＣＰ２−ＴＳＮ；図１ａ）を分析することを開始した。このｐＣＰ−ＴＳＮクローンは、ＴＢＰ遺伝子の周辺に１２ｋｂの５’隣接配列および３’隣接配列の両方を保有する。結果として、これは、完全なＴＢＰ遺伝子および３’を短縮化したＣ５の変異体のみを保有する。
ヒトβ−グロビンＬＣＲでの以前の研究は、ＬＣＲ活性の存在についての最初の指標が、単一コピーの導入遺伝子を保有する安定にトランスフェクトされた組織培養細胞クローン間で発現レベルを比較することによって獲得され得ることを実証した。ＬＣＲエレメントがより完全であればある程、個々のクローン間での発現の再現可能性の程度がより高いことが見出された。ｐＣＰ２−ＴＳＮの発現分析を、ＬＣＲ型の活性の存在について評価するためにこのストラテジーを使用して行った。
ｐＣＰ２−ＴＳＮを、最初に、ネオマイシン耐性遺伝子を保有するコスミドベクターｐＷＥ１５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（図９）内にクローン化した。次いで、得られたｐＷＥ−ＴＢＰ構築物を使用して、安定にトランスフェクトされたマウス線維芽細胞Ｌ細胞のクローンを産生した。次いで、２３クローンの導入遺伝子コピー数を、サザンブロット分析によって決定した（図１０）。次いで、一定範囲のコピー数を表す多くのクローンを選択し、そしてトランスジェニックマウスについて上記されたように、導入遺伝子の発現について分析した。結果を図１１に要約する。この結果は、８つの数までの導入遺伝子コピーによって、生理学的なレベル以上の発現が得られることを示す。２０以上のコピー数では、導入遺伝子あたりの発現レベルは、野生型の３０〜４０％まで減少する。
これらのデータは、再現可能で生理学的なレベルの発現が、単一および複数の導入遺伝子コピー数の両方でｐＣＰ２−ＴＳＮによって生成され得ることを実証する。このことは、このゲノムクローンが、遍在性のクロマチンを開く能力を保有することを強力に示唆する。導入遺伝子コピーあたりの生理学的レベルよりも著しく高い発現レベルを生じる明白な「正の」位置効果を示す多くのクローン（例えば、番号４、３３、および６）が、明らかに存在する。このことは、既に開いた活性なクロマチン内で導入遺伝子の組み込みが行なわれる特定の場合において予期される結果である。これらの状況下で、強力な転写エンハンサーの付近での存在は、本質的に弱いＴＢＰプロモーターに対して刺激効果を有することが予期される。
構築物の発現の安定性を、６０日の期間にわたり試験した。発現レベルは、一定に維持されることが見出された（図３６）。これは、薬物選択圧が取り除かれた場合でさえ事実であった（図３６、Ｇ４１８と印付けられたレーン）。さらに、発現は、薬物選択圧が維持されているか否かとは無関係に、首尾良い細胞の凍結および融解サイクルを通して安定を維持した。
（ＴＢＰ遺伝子座の２５ｋｂのサブクローンの発現分析）
１ｋｂの５’隣接配列および５ｋｂの３’隣接配列を伴うＴＢＰ遺伝子にわたる２５ｋｂのゲノムクローン（ＴＰＯ）（図１Ｃ）を、プロマイシン耐性遺伝子を保有する改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのポリリンカー領域内にクローン化して、上記のようにｐＢＬ−ＴＰＯ−ｐｕｒｏを得た。この構築物を使用して、マウス繊維芽細胞Ｌ細胞の安定
にトランスフェクトされたクローンを生成した。
ｐＢＬ−ＴＰＯ−ｐｕｒｏ構築物は、ＴＳＮ構築物を用いて得られた結果と類似の結果を与えた（図３７）。このデータは、再現可能な生理学的レベルの発現が、単一および複数の導入遺伝子コピー数で、ＴＳＮおよびＴＰＯの両方によって、生成され得ることを実証する。このデータは、遍在性のクロマチンを開く能力を保有するゲノムクローンと一致する。この推測はさらに、ＴＰＯクローン番号７（２コピー）、２９（単一コピー）、および３４（２コピー）が動原体性の組み込み事象である（データを以下に示す）という知見によってさらに増強され、そしてこれは、ゲノムフラグメントがヘテロクロマチン環境内から発現される能力を有することを実証する。導入遺伝子コピーあたりの生理学的レベルよりも著しく高い発現レベルを生じる明白な「正の」位置効果を示す、多数のクローン（例えば、図３７、クローン１１）が明らかに存在する。このことは、既に開いた活性なクロマチン内で導入遺伝子の組み込みが行なわれる特定の場合において予期される結果である。これらの状況下で、強力な転写エンハンサーの付近での存在は、本質的に弱いＴＢＰプロモーターに対して刺激効果を有することが予期される。
類似の結果は、ＣＨＯ細胞の代わりにＨｅｌａ細胞を使用しても得られた（データは示さず）。
（ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位のマッピング）
すべての既知のＬＣＲエレメントは、高度に組織特異的なＤＮａｓｅ Ｉ高感受性の領域であることが見出されており、これは、これらのエレメントが生成すると考えられる非常に開いたクロマチン立体配置を暗示する。従って、本発明者らは、ヒトＴＢＰ遺伝子内およびこの周辺の両方でＤＮａｓｅ Ｉ高感受性（ＨＳ）部位の存在について分析することを開始した。図１２は、ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞株由来の核を用いる一連の実験を要約する。これは、ＴＢＰ遺伝子の１２ｋｂの５’から開始し、そして３’を４．５ｋｂ伸長する４０ｋｂの領域にわたって、ＤＮａｓｅ Ｉ ＨＳ部位をマッピングする。この領域全体を通して明らかであるＨＳ部位のみが、Ｃ５遺伝子およびＴＢＰ遺伝子の隣接したプロモーター領域にマッピングされる（図１２、上パネル、ＨｉｎｄＩＩＩ消化／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩプローブ）。これらのＨＳ部位は、一過的トランスフェクションアッセイによって決定されたような、以前に同定されたＴＢＰ遺伝子発現およびＣ５遺伝子発現について重要なプロモーターエレメントと非常に相関する（Ｔｕｍａｒａ，Ｔ．ら、１９９４；ＦｏｕｌｄｓおよびＨａｗｌｅｙ、１９９７）。しかし、ＬＣＲ型エレメントがこの遺伝子座内に存在する場合、それらは、ＴＢＰ遺伝子およびＣ５遺伝子の両方の転写開始部位からかなり遠いように思われる。これは、遍在性のクロマチンを開く能力の最初の指標を与えた、ＴＢＰ遺伝子にわたる４０ｋｂのクローンの外側に、いかなるＬＣＲ型エレメントをも配置する。
（ＦＩＳＨ分析）
ヒトＴＢＰ導入遺伝子の１〜２のコピーを保有する全３４個のクローンをＦＩＳＨにより分析した。γサテライトまたは主なサテライトである、ＴＢＰ導入遺伝子およびマウス動原体のヘテロクロマチン成分を、それぞれフルオレセインおよびテキサスレッドで検出した。これは、導入遺伝子が染色体のアームに組込まれたクローンにおいて緑色および赤色の蛍光シグナルを発生した（図３９Ａを参照のこと）。しかし、動原体組み込みの場合、共存するシグナルおよび両色の混合物の両方を、黄色の蛍光シグナルとして検出し得る。ｐＷＥ−ＴＳＮを用いて生成した１８個のうちの２個のクローン（３４４−６および３４４−３７）は、動原体領域中で導入遺伝子シグナルを示した。クローン３４４−６では、ＴＢＰ導入遺伝子は、ロバートソニアン染色体の動原体中に組込まれ、一方クローン３４４−３７は、典型的なマウス末端動原体型染色体中に組込まれた。
ｐＢＬ３−ＴＰＯ−ｐｕｒｏを用いて生成した１６個のうちの３個のクローン（４４０−７、４４０−２９、および４４０−３４）は、典型的な末端動原体型染色体中で動原体組み込みを示した。ＴＢＰ導入遺伝子の単一の複製を保有したクローン４４０−２９は、ヘテロクロマチンサテライト配列により明らかに囲まれたＴＢＰシグナルを示した（図３９ＢおよびＣを参照のこと）。これらのクローンは、選択の非存在下で少なくとも１２〜１４週間生理学的レベルでＴＢＰを発現し続けることをさらに示した（データは示さず）。
これらの結果は、ＴＢＰ遺伝子座（ＴＰＯ）の２５ｋｂフラグメントの単一の複製が、ヘテロクロマチンの位置（すなわち、動原体の組み込み）の文脈においてさえ、生理学的発現を保証し得、従って、クロマチンを開く正式な証拠を提供することを示す（Ｓａｂｂａｔｔｉｎｉ Ｐ、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ａ、Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｃ、Ｄｉｌｌｏｎ Ｎ（１９９９）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ λ５−ＶpreB1 ｌｏｃｕｓ ｃｏ
ｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９：６７１−６７９）。
（実施例２）
（ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２座の分析）
（ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子ドメインのマッピング）
ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子は、１０ｋｂにわたる１２のエキソンからなり、そしてそのコード配列およびイントロン／エキソンの構造全体においてｈｎＲＮＰ−Ａ１遺伝子に対して高度に相同であり、このことは、遺伝子複製により生じ得ることを示す（Ｂｉａｍｏｎｔｉら、１９９４）。しかし、Ａ１遺伝子とは異なり、Ａ２特異的偽遺伝子は、見出されていない（Ｂｕｒｄら、１９８９；Ｂｉａｍｏｎｔｉら、１９９４）。さらに、Ａ１遺伝子およびＡ２遺伝子は、それぞれヒト染色体１２ｑ１３．１（Ｓａｃｃｏｎｅら、１９９２）および７ｐ１５（Ｂｉａｍｏｎｔｉら、１９９４）上で遺伝的に連結されていない。図１３Ａは、クローンＭＡ１６０に由来する１６０ｋｂのｐＣＹＰＡＣ−２上に存在するヒトｈｎＲＮＰ Ａ２座の遺伝子地図を示す。このゲノムフラグメントは、１１０ｋｂの５’隣接配列および５０ｋｂの３’隣接配列を保持する。ｈｎＲＮＰ−Ａ２の公知の転写開始部位の上流の４．５ｋｂ領域のＤＮＡ配列を決定した。これは、約１〜２ｋｂのｈｎＲＮＰ−Ａ２ ｃａｐ部位の５’の位置から多岐して転写される、ヘテロクロマチン関連タンパク質ＨＰ１γについての遺伝子の位置を同定した（図１３Ｃ）。サザンブロット分析は、ＨＰ１γ遺伝子全体が１０ｋｂの領域内に含まれることを示す（データは示さず）。
従って、ＴＢＰおよびｈｎＲＮＰ−Ａ２遺伝子座は、緊密に連結した、多岐して転写されるプロモーターの一般的特徴を共有する。
ヒト組織内のＨＰ１γ遺伝子の発現パターンを、広範なヒトの組織および細胞型由来のポリ（Ａ）+−ＲＮＡで調製したドットブロットで評価した。この結果（図３８）は、ｈ
ｎＲＮＰ−Ａ２のような遺伝子もまた遍在的に発現されることを示す。従って、この２つの遺伝子は、ＴＢＰ遺伝子座の遍在的に発現される遺伝子ドメインと類似した遍在的に発現される遺伝子ドメインを形成するようであり得る。
（トランスジェニックマウスにおけるｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子座の機能解析）
ＭＡ１６０（図１３Ａ）を用いて、トランスジェニックマウスを作製した。Ｆ１段階を経て育種された二匹の創始者のサザンブロット分析は、これらの系統がその導入遺伝子の１〜２の複製を保有することを示した（データは示さず）。
ＴＢＰについて使用されるアッセイと類似したＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを用いて、ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２導入遺伝子の発現を分析した。マウスｈｎＲＮＰ Ａ２のｃＤＮＡ配列は公知でない。従って、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅についての配列比較により、ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２とマウスｈｎＲＮＡＰ Ａ２との間の相同性領域を選択し得ない。本発明者らは最初に、２つのプライマーＨｎ９およびＨｎ１１（これは、ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２のエキソン１０および１２内の配列にそれぞれ対応し（図１４Ａ）、そして２７０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を生じる）を選択した。しかし、本発明者らは、これらの２つのプライマーがヒトおよびマウスの両方のＲＮＡ調製物から同一サイズの産物を与えることを見出した（図１４Ｂ）。これは、これらの２つの種間の相同性領域を示す。制限酵素の範囲を用いた試験によりまた、ＨｉｎｄＩＩＩは、マウス産物を切断して１７０ｂｐのフラグメントを生じ得た（図１４Ｂ、レーンＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ）が、ヒト産物（図１４Ｂ、レーンＨｉｎｄＩＩＩ Ｈ）では生じ得なかった。
系統Ｈｎ３５およびＨｎ５５のＦ１トランスジェニックマウスの種々の組織から調製された全ＲＮＡ（１μｇ）を、次いで、32Ｐ末端標識化５’Ｈｎ９を用いて上記の方法を使用して分析した（図１６）。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析を用いてマウスＲＴ−ＰＣＲ産物に対するヒトＲＴ−ＰＣＲ産物の割合を定量した。この結果（図１７Ａ）は、再現可能な、導入遺伝子の複製数あたりの発現の生理学的レベルを、分析した全て組織型において得ることを示す。
（トランスジェニックマウスにおけるｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子座の６０ｋｂのサブクローンの分析）
ＭＡ１６０ ｐＣＹＰＡＣ由来クローンを用いて得られデータは、このゲノムフラグメントが遍在性のクロマチンを開く能力を有することを示す。この活性の原因であるＤＮＡ領域の位置をさらに決定するために、ＭＡ１６０から得られた６０ｋｂのＡａｔＩＩサブフラグメント（Ａａ６０）を用いてトランスジェニックマウスを作製した（図１３Ｂ）。このフラグメントは、ｈｎＲＮＰＡ−２遺伝子の周りに３０ｋｂの５’隣接配列および２０ｋｂの３’隣接配列を有する。これまでに、Ａａ６０フラグメントを有する三匹のトランスジェニックマウス（Ａａ７、Ａａ２３およびＡａ３１）が作製されており、うち二匹（Ａａ２３および３１）は、育種されて系統が確立している。導入遺伝子の推定複製数は、Ａａ７が３個；Ａａ２３が１〜２個；Ａａ３１が１〜２個である。
ある範囲の組織からの全ＲＮＡ（１μｇ）を、上記のように導入遺伝子の発現について分析した。その結果を図１５に示し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒにより定量した（図１７Ｂ）。これらのデータは、全てのトランスジェニックマウスが、全ての分析した組織において導入遺伝子の複製数当たりの再現可能なレベルで発現することを示す。これは、ＭＡ１６０により示される遍在性のクロマチンを開く能力がＡａ６０のサブフラグメントにおいて保存されることを示す。
（ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性性部位のマッピング）
ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子の転写開始点の５’側の２０〜２５ｋｂの領域にわたりＤＮａｓｅ Ｉ ＨＳ部位をマッピングするための予備実験の結果を、図１８に示す。ＡａｔＩＩおよびＣｌａＩを用いる二重の制限酵素消化においてエキソン２からの７６６ｂｐのプローブは、一連の３つのＨＳ部位（図１８、上方のパネル）を与え、これは、ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子の５’側の−１．１ｋｂ、−０．７ｋｂ、および−０．１ｋｂの位置に対応した（図１８、下方のパネル）。本発明者らはまた、ｈｎＲＮＰ−Ａ２および同定されていないさらなるＨＳ部位の転写開始の１２〜１３ｋｂ下流まで分析を広げた。
ＴＢＰ／Ｃ５座の場合のように、３つのＨＳ部位は、ｈｎＲＮＰ Ａ２のプロモーター
とＨＰ１Ｈ−γ遺伝子との間の１〜２ｋｂの領域に対応する。ＬＣＲ型ＨＳ部位は検出されなかった。このことは、この座のクロマチンを開く能力はこの型のエレメントと関連しないことを示す。
示されたデータは、本発明者らが、再現可能な、遍在性の、トランスジェニックマウスの全ての組織における２つの異なる遺伝子座（ＴＢＰおよびｈｎＲＮＰ Ａ２）での発現の生理学的レベルを入手し得ていることを、明らかに示す。これはＬＣＲに由来しない、遍在性のクロマチンを開く能力を有する遺伝子制御エレメントが実際に存在することを示す。
本明細書中に示されるデータは、他の遍在的に発現される遺伝子（例えば、ヒトβ−アクチン（例えば、Ｒａｙ，Ｐ．ら、１９９１；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９３；Ｄｅｐｒｉｍｏら、１９９６を参照のこと）、マウスヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（Ｍｅｈｔａｌｉら、１９９０）、マウスアデノシンデアミナーゼ（Ｗｉｎｓｔｏｎら、１９９２および１９９６）、ヒトオルニチンデカルボキシラーゼ（Ｈａｌｍｅｋｙｔｏら、１９９１）およびマウスホスホグリセレートキナーゼ−１（Ｍｃｂｕｒｎｅｙら、１９９４））からのプロモーター−エンハンサーの組合わせを用いて、以前に公開された結果と全く異なる機能を実証していることに注目することが重要である。これらの初期の研究において、高度なレベルの発現が、組織のサブセットのみにおいて観察され、そしてクロマチンを開く機能は、実証も試験もされなかった。
ＴＢＰ遺伝子の場合、組織培養細胞からの発現データ（図１１）は、この遍在性のクロマチンを開く能力が１２ｋｂの５’および３’の隣接配列を有する４０ｋｂのゲノムフラグメント（ｐＣＰ２−ＴＳＮ、図１ａ）内に含まれることを示す。
ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子にわたる６０ｋｂのフラグメント（Ａａ６０；図１３Ｂ）を有するトランスジェニックマウスのデータは、遍在性のクロマチンを開く能力を有する領域がこのフラグメントに含まれることを示す（図１５〜１７）。
これまでにこれらの領域にマッピングされたＤｎａｓｅ Ｉ ＨＳ部位のみは、ＬＣＲ型エレメントよりもむしろ古典的なプロモーターに対応する。従って、遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）として作用するＤＮＡの領域は、ＬＣＲエレメント（これは、組織特異的または制限的様式において発現される遺伝子と関連する）の定義と一致しない。従って、ＵＣＯＥおよびそれらの活性は、ＬＣＲおよびＫＣＲ由来のエレメントと明らかに区別され得る。
（発現ベクターの開発）
６０ｋｂのＲＮＰ領域のサブフラグメントを、レポーターに基づくアッセイを使用してＵＣＯＥ活性についてアッセイする。
ＲＮＰとＨＰ１Ｈ−γとの間の二重プロモーター領域に位置するサブフラグメントを含む発現ベクターを、ＧＦＰおよびＮｅｏRレポーター遺伝子の両方を用いて、上記のよう
におよび図２２に示されるように設計した。これらは、ＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＲＮＰプロモーターを有するコントロールベクター（ＲＮＰ）、ＲＮＰプロモーター領域の上流の５．５ｋｂのフラグメントおよびＲＮＰプロモーターを含むベクター（５．５ＲＮＰ）、スプライスアクセプター戦略を用いて構築したベクター（ここで、このスプライスアクセプター／分岐コンセンサス配列（ＲＮＰ遺伝子のエキソン２由来）は、ＧＦＰ遺伝子の前でクローン化された（これにより、ＲＮＰイントロン１からの配列を含むＣｐＧ島全体が同じレポーターに基づくアッセイにおいて試験され得ることを確認する））を含む。これは、前のＧＦＰ遺伝子の７．５ｋｂ ＲＮＰ遺伝子を保有するＧＦＰ（７．５ＲＮ
Ｐ）の上流のエキソン１／イントロン１の一部、およびＲＮＰプロモーター領域の上流の１．５ｋｂフラグメントおよびＲＮＰプロモーターを含むベクター（１．５ＲＮＰプロモーター）を生じる。
異種プロモーターＣＭＶを含む発現ベクターはまた、上記に記載されそして図２３に示される。これらは、内部リポソーム結合部位を有するＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＰプロモーターを有するコントロールベクター（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ）および内部結合部位を有さないＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＰプロモーターを有するコントロールベクター（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ）、ＲＮＰプロモーター領域の上流の５．５ｋｂフラグメントおよびＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含むベクター（５．５ＣＭＶ）、ＲＮＰおよびＨＰ１Ｈ−γのプロモーター、ならびにＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含む４．０ｋｂの配列を含むベクター（４．０ＣＭＶ）、ならびにエキソン１およびイントロン１の一部を含むＲＮＰ遺伝子、およびＧＦＰ−Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターの７．５ｋｂの配列を含むベクターを含む。
これらの構築物を、上記のように、エレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。ＲＮＰプロモーター前の５．５領域付加は、Ｇ４１８Rコロニーの数
の３．５倍の増大を生じた（図２４）。これらの同じ構築物の、核酸縮重ペプチド送達戦略を用いたＣＯＳ７細胞中へのトランスフェクションは、７倍近いコロニー数の増加を示した（データは示されず）。
１．５倍のコロニー数の増加はまた、ＣＭＶに基づくベクターのＣＨＯ細胞中へのトランスフェクション（すなわち、ＣＭＶ 対 ５．５ＣＭＶ）後に観察された（図２４）。
これらのトランスフェクションから得られるコロニーの環状クローニングは、次いでＧＦＰ発現レベルについて分析され得る、安定したＧ４１８R細胞株を生じた。ＦＡＣＳデ
ータを図２５に示す。上流配列の付加は、内在性プロモーター（ＲＮＰ対５．５ＲＮＰ）でアッセイされる場合、ＧＦＰ発現において３．５倍の増加を生じた。ＧＦＰ発現における増加はまた、異種ＣＭＶプロモーターの前に５．５ｋｂの配列の付加とともに見られる（ＣＭＶ対５．５ＣＭＶ）。メチル化フリー島全体を含む構築物の伸長は、５．５ＲＮＰと比較してＧ４１８Rの数を増加させなかったが、ＧＦＰ蛍光の平均中央値の増大が存在
した（５．５ＲＮＰ、７．５ＲＮＰ；図２６を参照のこと）。個々のクローンおよび制限プール（約１００コロニー）のＧＦＰ発現をＧ４１８選択して／なしで細胞を培養して、経時的に追跡した。ＲＮＰプロモーター単独で生成されるクローンは、ＧＦＰ発現細胞の割合が、時間が経るにつれて迅速に減少するとともに劇的な不安定性を示した。５．５ＲＮＰ構築物からＧＦＰを発現するクローンは、比較して、３ヶ月以上安定であった。ＣＭＶ−ＧＦＰプールは最初、より良い安定性を示すが、完全に安定したままであった５．５ＣＭＶ集団と比較して、Ｇ４１８の非存在下で培養して増殖させた後のＧＦＰ発現細胞数の減少は明らかであった。図２７および図２８は、これらの集団のＦＡＣプロフィールを示し、これは、左へのシフト、すなわちＣＭＶ−ＧＦＰ構築物を有する非蛍光細胞の割合の増大を明らかに示している。対照的に、５．５ＣＭＶ−ＧＦＰプールは、長い間安定した、発現の均一なピークを示す。低いまたは非発現細胞の割合は、ゲート集団Ｍ１から計算する。
ＲＮＰ座に対する研究は、ＲＮＰ遺伝子およびＨＰ１Ｈ−γ遺伝子の二重プロモーターをカバーする５．５ｋｂの領域上に狭まっている。３’方向におけるこのフラグメントの伸長（７．５ＲＮＰまたは８．５ＲＮＰ）は、遺伝子発現のレベルにおける増強を示し、そしてインタクトなメチル化フリー島を維持することに関連し得る。５．５ｋｂ配列の１．５ｋｂ領域（１．５ＲＮＰ、図２３）への極小化は、Ｇ４１８Ｒコロニーの数およびＦＡＣ分析により決定される発現の両方の点で、レポータートランスフェクションの研究の
結果に劇的に影響を与えない（図２９）こともまた見出された。しかし、１．５ＲＮＰは、５．５ＲＮＰおよび７．５ＲＮＰにより示されるような遺伝子発現の安定性を付与しない。図３０は、ＧＦＰ発現細胞の割合が、６８日間にわたって迅速に減少することを示す。
構築物４．０ＣＭＶを設計し、その結果ＣｐＧメチル化フリー島を提示する４ｋｂの配列全体はインタクトなままであった。さらに、このカセットをＣＭＶ−ＥＧＦＰ（４．０ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｆ（順方向）および４．０ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｒ（逆方向））の前に両方向で挿入した。図３１は、標準ＣＭＶ−ＧＦＰ構築物、ＣＭＶ−ＥＧＦＰと比較して、ＧＦＰ中央値蛍光の劇的な増大（１０倍より大きい）を示す。ＧＦＰ発現のこのブーストは、４ｋｂのカセットが順方向および逆方向の両方である場合に生じることもまた示す。
遺伝子発現の安定性の点において、上流の５．５ｋｂＲＮＰ配列を含むベクターは、ＣＨＯ細胞中へトランスフェクトしそして経時的に追跡した場合、明確な利点を示す。最も重要なことには、この安定性は、内在性プロモーターに限定されるだけでなく、異種のおよび広く用いられるＣＭＶプロモーターに安定性の利点をも付与する。
図３２は、ＣＭＶベース構築物４．０ＣＭＶおよび７．５ＣＭＶを示し、コントロールベクターＣＭＶ−ＥＧＦＰは、ＣＨＯ細胞中へトランスフェクトされ、かつＧ４１８選択後のトランスフェクション後１３日めに分析された。中央値蛍光の実質的な増加（１５〜２０倍）は、ＣＭＰプロモーターの前のＲＮＰ座由来の４．０または７．５ｋｂのフラグメントを付加することによって、見られ得る。この増加は、そのフラグメントの方向と独立している（データは示さず）。
図３３は、図３２中の同じＧ４１８選択プールにおけるＧＦＰ発現細胞の割合を示す。４．０および７．５ｋｂのフラグメントの封入は、Ｇ４１８選択集団におけるＧＦｐ陽性細胞の割合を増大させることが見られ得る。さらに、以前の実験から、ＣＭＶ−ＥＧＦＰの不安定性は、培養において約６０日後にのみ明らかであることが明白であるが、この集団は、長い間比較的安定しているようである。
図３４は、等モル量の種々の構築物でＣＨＯ細胞をトランスフェクションした後のコロニー数を示す。７．５ＣＭＶ構築物は、コントロールベクターＣＭＶ−ＥＧＦＰより約２．５倍多いコロニーを示す。これらの知見は、７．５ＣＭＶ−Ｆが確実に生産的な組み込み事象の数を増大させたことと一致し、従って、７．５ｋｂフラグメントに対してクロマチンを開く能力／維持する能力が存在する。
（ＵＣＯＥを含むアデノウイルスベクター）
現在、アデノウイルス（Ａｄ）は、遺伝子治療のための目的の多くの細胞型へ遺伝子の最も有効な送達をもたらすベクター系である。臨床開発における最も有望な遺伝子治療の多くは、このベクター系、とりわけ、サブタイプ５型Ａｄ由来のベクターを使用する。ヒトの遺伝子治療のためのＡｄの有用性は、２つの主要な方法における治療用遺伝子の発現の改善により実質的に増加され得る。第１の方法は、最小の用量で最大の効果を得るため導入遺伝子発現のレベルを増加する工程を含み、これによりどんなプロモーターが使用されることも適用する。第２の方法は、特異性を保持しながら、受容される細胞においてより強力な発現を得るように、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターを改善する工程、を含む。特定の組織または腫瘍型に良好な特異性を与えるいくつかのプロモーターが公知であるが、許容される細胞においてそれらのプロモーターが与える発現のレベルは、一般に、現実の治療上の利益となるには弱すぎる。この例は、マウスのαフェトプロテイン（ＡＦＰ）遺伝子のプロモーターである。これは肝細胞種（肝癌）細胞に対し
て弱いが非除に特異的である発現を与える（Ｂｕｉら、１９９７、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ、８、２１７３〜２１８１）。このような腫瘍特異的プロモーターは、癌についての遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（Ｇｅｎｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ：（ＧＤＥＰＴ））に特に興味深い。ＧＤＥＰＴは、標的化化学療法を成し遂げるために遺伝子送達を利用する。ＧＤＥＰＴにおいてプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子は、例えば、腫瘍への送達ベクターの注射により、腫瘍細胞に送達される。相対的に無害なプロドラッグの引き続く投与は、プロドラッグを、インサイチュで酵素を発現する細胞を殺傷する強力な細胞傷害性薬物に変換する。１つの例は、酵素ニトロリダクターゼ（ＮＴＲ）およびプロドラッグＣＢ１９５４（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ２３６２〜２３７０）に関する。アデノウイルスベクターは、例えば、腫瘍への直接注射により、このような酵素をコードする遺伝子の最も有効な送達を得る。
（ＡＦＰプロモーターおよびＵＣＯＥからＮＴＲを発現するＡｄの構築）
４ｋｂ ＲＮＰ ＵＣＯＥ（図２０のヌクレオチド４１０２〜８２８６の配列）に続くＡＦＰプロモーターからＮＴＲ遺伝子を発現する組換えの５型アデノウイルスベクターを作製した。４ｋｂ ＵＣＯＥをまず、ｐＴＸＯ３７９へのＰｍｅｌフラグメントとしてクローニングした。ｐＴＸＯ３７９は、ＡＦＰプロモーターに続くＮＴＲ遺伝子を保有する中間ベクターであり（Ｂｕｉら、１９９７、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８、２１７３〜２１８２）、そして、ＡＦＰプロモーターの５’に位置するＣｌａ１部位への平滑末端結合により、Ａｄ５配列（１〜３５９、３５２５〜１０５８９）に隣接する。制限消化を用いて単一のＵＣＯＥコピーの存在を確認し、そしてＵＣＯＥの方向を確立する。次いで、組換えＡｄ構築物を、逆方向にＵＣＯＥフラグメントを含むプラスミドｐＴＸＯ３８４およびＡｄパッケージング細胞株Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅにより開発され、そして供給される）を用いて生成した（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９，１９０９〜１９１７）。Ｉｎｔｏｒｏｇｅｎにより提供されるこの手順を、ウイルスのレスキューに用いた。本質的に、ｐＴＸＯ３８４を、Ｓｗａ１を用いて直線化し、そしてＳｗａ１直線化骨格ベクターｐＰＳ１１６０とともにＰｅｒ．Ｃ６細胞に同時トランスフェクトした。ベクターｐＰＳ１１６０は、Ａｄ５の右端およびｐＴＸＯ３８４との重複領域を保有し、この結果、組換えＡｄを相同組換えにより生成する。トランスフェクトされた細胞において相同組換えにより生成されたウイルスをプールし、ＣＴＬ２０８と名付けた。
（インビトロでの細胞株におけるＮＴＲ発現）
ＣＴＬ２０８および２つの他の組換えＡｄウイルスについて標準的手順を用いて、より大きいスケールのウイルス調製を行った。これら他の２つは、ＡＦＰプロモーターおよび最小エンハンサーに続くＮＴＲ遺伝子を保有するが、ＵＣＯＥフラグメントを保有しないＣＴＬ２０３、およびＣＭＶプロモーターに続くＮＴＲ遺伝子を保有するＣＴＬ１０２であった。このＣＭＶプロモーターを、通常、組換えＡｄベクターにおいて用い、広範囲の組織および腫瘍型において強力な発現を得た。ＣＴＬ２０３およびＣＴＬ１０２は、ＣＴＬ２０８と同じＡｄ５骨格を共有し、そしてＮＴＲ遺伝子の転写に用いられるエレメントを除いてＣＴＬ２０８と同一である。
次いで、ＣＴＬ２０３、２０８および１０２を用いて、インビトロにおいて２つの細胞株を形質導入し、ＮＴＲ発現のレベルおよび特異性を研究する。２つの細胞株は、ＡＦＰを発現する原発性ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２、およびＫＬＮ２０５（ＡＦＰを発現しないマウス扁平上皮癌細胞株）であった。指数関数的に増殖する細胞を短時間のトリプシン処理により組織培養プレートから収集し、１．２５×１０4／ｍｌの生存細胞で感染培
地に再懸濁し、６ウェルプレートにプレートした。ウイルスを、５０の多重度で、そしてＣＴＬ２０３についてはまた１００および５００の多重度で、付着前にウェルに添加した
。９０分後、ウシ胎仔血清濃度を１０％に調整調製し、そしてその細胞を計２４時間インキュベートした。細胞溶解物を低張溶解により感染細胞から作製し、次いでエッペンドルフチューブでの遠心分離により細胞細片を排除した。ＥＬＩＳＡを行い上清中のＮＴＲタンパク質を定量した。これは、組換えＮＴＲを用いるＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅコーティング工程、二連で１ウェルあたり各５０μｌの低張溶解液を添加する工程、および４℃での終夜のインキュベート工程を含んでいた。次いで、このサンプルをＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎで３×洗浄し、そしてヒツジ抗ＮＴＲポリクローナル抗血清（１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中２０００倍希釈）で３０分間室温でインキュベートした。過剰の一次抗体を洗浄除去後、ロバ抗ヒツジである、ＨＲＰ結合体化二次抗体を適用した（１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中５０００倍希釈）。さらに３０分のインキュベーション後、サンプルをＰＢＳで洗浄し、その後、１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質（１０ｍｌあたり、１ｍｌ ＴＭＢ溶液（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ）＋９ｍｌの０．０５Ｍ リン酸−クエン酸緩衝液＋２μｌの３０％ｖ／ｖ Ｈ2Ｏ2）を用いて、室温で１０分間展開した。１ウェルあたり２５μｌの２ＭのＨ2ＳＯ4の添加により反応を停止し、そしてプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
図４６は、これらのＥＬＩＳＡの結果を示す。これは、ＣＴＬ２０３（ＡＦＰプロモーター／エンハンサーから発現されたＮＴＲ有する）が、弱いが特異的なＮＴＲ発現（ＡＦＰ陽性細胞株でのみ検出可能）をもたらすこと示す。ＣＴＬ１０２（ＣＭＶプロモーターから発現されたＮＴＲを有する）は、より高くかつ非特異的な発現をもたらす。これは両方の細胞株において非常に類似のレベルのＮＴＲである。著明に、ＣＴＬ２０８に感染したＡＦＰ陽性ＨｅｐＧ２細胞（ＵＣＯＥ＋ＡＦＰプロモーター（ＮＴＲの発現を駆動する））は、ＣＴＬ１０２に感染した細胞よりも高いレベルでＮＴＲを発現し、一方、ＣＴＬ２０８に感染したＡＦＰ陰性ＫＬＮ２０５細胞は、ＣＴＬ１０２に感染したそれらよりも有意に低いＮＴＲを発現した。これらのデータは、ＵＣＯＥがＡｄの状況で、特異性を部分的に保持しながら、発現を劇的に増強することを示す。
（インビボにおけるＮＴＲ発現および抗腫瘍効果）
腫瘍特異的プロモーターは、安全性の観点から癌の遺伝子治療のための非特異的プロモーターに好ましい。なぜなら、それらのプロモーターは、正常組織における導入遺伝子のより低い発現を与えるからである。これはＡｄに基く遺伝子治療には特に重要である。なぜなら、腫瘍への注射後、いくつかのウイルスは腫瘍から逃れる傾向であり、そして以後の全身的伝播が正常組織を形質導入する傾向であるからである。詳細には、Ａｄは、肝細胞の非常に効果的な形質導入を与え、その結果、肝臓の損傷は通常、Ａｄの遺伝子治療に用量制限的な毒性である。ＧＤＥＰＴの場合、正常組織において発現を生じ得る強力なプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）の使用は、ＮＴＲを発現する正常な肝臓細胞の殺傷を導き得る。この問題は、腫瘍細胞において抗腫瘍効果を得るのに十分強力な発現をさせるのに有利な腫瘍特異的プロモーターを用いて、潜在的に、回避されるか、または減縮され得る。従って、ＣＴＬ２０８を、マウスの腫瘍への注射後、腫瘍細胞および肝細胞におけるＮＴＲ遺伝子発現について、および抗腫瘍効果についてＣＴＬ１０２と比較した。先天性の無胸腺ヌードマウス系統ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕを用いた。このマウスは、特定の病原体がない雄性であり、実験開始時点で８〜１２週齢であり、そしてこれを上部フィルターを備えたマイクロアイソレーターで飼育した。インビトロで培養した指数関数的に増殖するＨｅｐＧ２細胞を、腫瘍接種材料として用いた。この細胞を振盪フラスコ中で培養し、トリプシン処理および８００ｇで５分間の遠心分離により収集し、洗浄し、そして滅菌生理食塩水溶液に再懸濁した。細胞の生存度をトリパンブルー色素排除により評価し、そして９０％より大きい生存度の単一細胞懸濁液のみを用いた。２．０ｍｌのキシリジン（Ｃｈａｎｅｌｌｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ）およびケタミン（Ｗｉｌｌｏｗｓ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｃ
ｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）の混合物（それぞれ、１ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌの濃度）の腹腔内注射で導入した全身麻酔下で、マウスのわき腹に２．５〜１０6細胞を皮下注射
した。最初の実験で、ＣＴＬ１０２またはＣＴＬ２０８を、ヌードマウスにおいて増殖している２５〜６０ｍｍ2のサイズ（サイズは、最長直径とそれに垂直な最大直径との積に
より決定される表面積として表す、長さ×幅＝ｍｍ2）の皮下のＨｅｐＧ２腫瘍に注射し
た。単一用量の７．５×１０9粒子をそれぞれのウイルスについて用いた。動物を４８時
間後に屠殺し、その腫瘍および肝臓を摘出し、２４時間、４％ホルマリン／ＰＢＳ緩衝液中で固定し、そして標準的なプロトコールを用いて、パラフィン包埋および切片化のために処理した。連続の３μｍ切片を切断し、そして免疫染色して、ヒツジ抗ＮＴＲ抗血清（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌｔｄ）およびＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いる間接的イムノペルオキシダーゼ染色によりＮＴＲを発現する細胞を検出した。これらの組織学的切片を標準的顕微鏡装置を用いて検査し、そして全肝臓および腫瘍中のＮＴＲ発現細胞のパーセンテージを顕微鏡により見積もった。図４７は、それぞれのマウスについての結果を示す。ＵＣＯＥは（そうでなければ弱い）ＡＦＰプロモーターと組み合わせて、マウスにおいてＡＦＰ陽性腫瘍中で強力なＮＴＲ発現を与え、その結果、ＣＴＬ２０８は平均して、腫瘍への注射後、ＣＴＬ１０２で検出可能なレベルときわめて類似の数のＮＴＲを発現する腫瘍細胞を得ることを示す。しかし、ＣＴＬ１０２の腫瘍内注射は、ＣＴＬ１０２については、６匹の動物のうち５匹について肝臓において検出可能なＮＴＲ発現を導くが、ＣＴＬ２０８については６匹のうち０匹である。この結果は、ＣＴＬ２０８において、ＵＣＯＥ−ＡＦＰプロモーターの組み合わせが、ＡＦＰ陽性腫瘍細胞においてはＣＭＶプロモーターと類似かまたはより強力な発現を与えるが、正常な（ＡＦＰ陰性の）組織においてはより少ない発現を示すことを確認する。
ＵＣＯＥがＡＦＰプロモーターからの発現を治療上有用なレベルまで上昇することを確認するために、ＣＴＬ２０８およびＣＴＬ１０２を、プロドラッグＣＢ１９５４と組み合わせて抗腫瘍効果を付与する能力について比較した。２５〜６０ｍｍ2のサイズの皮下Ｈ
ｅｐＧ２腫瘍を保有するヌードマウスに、７．５×１０9または２×１０10のいずれかの
粒子の用量で、ＣＴＬ１０２またはＣＴＬ２０８の単回注射を与えた。４８時間後、マウスへのＣＢ１９５４投与を開始する。ＣＢ１９５４（Ｏｘｆｏｒｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）に溶解して、２０ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。投与の直前に、この溶液を滅菌生理食塩水溶液に１：５に希釈して、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。麻酔なしで、マウスに５回、等量を毎日腹腔内投与した。マウスのコントロール群のために、プロドラッグ投与を開始する４８時間前に、ウイルスの代わりにＰＢＳを腫瘍に注射した。その後２７日間、副尺付きカリパス（ノギス）を用いて毎日、腫瘍のサイズを測定した。図４８は、その結果を示す。ＣＢ１９５４もウイルスも投与しないコントロール群については、７／７の腫瘍が迅速に増殖し続けた。腫瘍の退行をＮＴＲ発現ウイルスおよびＣＢ１９５４の両方を投与されたすべての群においていくつかのマウスで観察した。ＣＴＬ１０２での退行は、低い方の用量を投与したマウスで３／８に観察され、そして高い方の用量を投与したマウスで４／８に観察された。ＣＴＬ２０８での退行は、それぞれ５／８マウス、６／８マウスで観察された。これらの結果により、ＣＴＬにおいて、ＵＣＯＥは、許容的な腫瘍細胞におけるＡＦＰプロモーターからのＮＴＲ発現を、強力なＣＭＶプロモーターにより得られる発現を超えるレベルまで上昇させること、そしてこれがＧＤＥＰＴのための臨床状態のマウスモデルにおいて優れた抗腫瘍効果を生じることが確認される。
これらの結果は、ＵＣＯＥの２つの重要かつ有用な特性を実証する。この特性は、第１に、遺伝子治療において大きな可能性を有する非組み込み型ベクターであるＡｄの場合、実質的に発現を改善する。第２に、弱いが特異的なプロモーターから、有用な特異性を保持しながら、より大きい有用なレベルまで、発現を上昇させる。
（ＦＩＳＨ分析）
コピー数をマウスＬｔｋ細胞における３１の１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰクローンにおいて決定した。トランスフェクションに用いられる少量のＤＮＡ（０．５〜１．０μｇ）に起因して、単一コピーのクローンのパーセンテージは非常に高かった（８３％）。さらに、ＥＧＦＰ発現は、単一コピークローン内で２倍を超えて変化した。このことは、導入遺伝子が陽性の位置および陰性の位置の影響を受けやすいことを示す。それにもかかわらず、３つの単一コピークローンが動原体性の異種クロマチンに組み込まれた（図４２）。このことは、この構築物がクロマチンを開き得ることを示す。クローンＦ１およびＧ６は、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰ導入遺伝子が、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｉａｎ転移により開始される中部動原体染色体の動原体の１つに組み込まれていることを示し（図Ｂ、Ｃ）、一方、クローンＩ３において、組み込みは、局所的マウス末端動原体型染色体の動原体に生じた（図Ｄ）。
（ベクターＣＥＴ３００およびＣＥＴ３０１におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現）
（ＥＰＯ発現ベクターＣＥＴ３００およびＣＥＴ３０１の構築）
エリスロポエチン（ＥＰＯ）コード配列を、ヒト胎児肝臓Ｑｕｉｃｋ−ＣｌｏｎｅTM ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳ．）から、プライマーＥＰ２（５’−ＣＡＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣ−３’）およびプライマーＥＰ４（５’−ＣＴＣＧＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。得られる７０５ｂｐの産物（オープンリーディングフレーム全体を含んだ）を、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、ベクターｐＣＲ３．１にサブクローニングし、ベクターｐＣＲ−ＥＰＯを作製した。ＥＰＯ配列を両方の鎖上の自動ＤＮＡ配列決定により確認した。ＥＰＯコード配列を含む７９０ｂｐのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｐＣＲ−ＥＰＯから切り出し、そしてベクターＣＥＴ２００およびＣＥＴ２０１（それぞれ、順方向および逆方向に７．５ｋｂのＲＮＰフラグメントを含む）のＮｈｅＩ部位とＰｍｅＩ部位との間にサブクローニングし、それぞれベクターＣＥＴ３００およびＣＥＴ３０１を生成した。ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてｐＥＧＦＰ−Ｎ１からＥＧＦＰコード配列を切り出すこと、およびそれをＥＰＯコード配列を含有するｐＣＲ−ＥＰＯ由来のＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントで置換することにより、コントロールベクターｐＣＭＶ−ＥＰＯを生成した。
（ＣＨＯ細胞におけるエリスロポエチンの発現）
プラスミドであるＣＥＴ３００、ＣＥＴ３０１およびｐＣＭＶ−ＥＰＯを制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩを用いて直線化した。次いで、制限されたＤＮＡをフェノール−クロロホルムでの抽出、続くエタノール沈殿により精製した。ＤＮＡを滅菌水に再懸濁し、そして等モル量のプラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションした。生存細胞を２２５ｃｍ3の培養フラスコにプレートし、そして、０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有
する完全培地での２４時間後の培地交換により、安定に形質転換した細胞を選択した。Ｇ４１８耐性コロニーが出現するまで（エレクトロポレーション後約１０日）この培地中で細胞を増殖させた。次いで、フラスコから剥離し、そして細胞を１ｍｌの完全培地を含有する６ウェルシャーレ中で１０6細胞／ウェルに播種した。４８時間後、培地を除去し、
そして、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＰＯイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ システム、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、培地中のエリスロポエチンのレベルを定量した。構築物ＣＥＴ３００、ＣＥＴ３０１およびｐＣＭＶ−ＥＰＯにより産生されたＥＰＯのレベルは、それぞれ１７８０ Ｕ／ｍｌ、１０４０ Ｕ／ｍｌおよび１２８ Ｕ／ｍｌであった（図４０）。従って、順方向および逆方向に７．５ｋｂのＲＮＰフラグメントを
含有する構築物、ＣＥＴ３００およびＣＥＴ３０１は、上記の実験において、ＥＰＯの発現を駆動する強力な遍在性のＣＭＶプロモーターを含むコントロールのプラスミドｐＣＭＶ−ＥＰＯよりも、それぞれ約１４倍および８倍高いレベルでＥＰＯを産生した。
（ｈｎＲＮＰＡ２の１６ｋｂのＵＣＯＥフラグメントを有するかまたは有さないＥＢＶレポーター構築物でトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞におけるＧＦＰ発現）
ハイグロマイシン選択で維持された細胞を用いる最初の実験で、ＲＮＰ １６ ＵＣＯＥ含有構築物（ｐ２２０．ＲＮＰ １６）は、２３日でＥＧＦＰの高レベルの均質の発現を得たが、一方、ｐ２２０．ＥＧＦＰ（ＵＣＯＥを有さない構築物）では、ＥＧＦＰ発現のより不均質なパターンが観察された。ｐ２２０．ＥＧＦＰでトランスフェクトしたプールにおけるＥＧＦＰ発現は、徐々に失われ、一方ｐ２２０．ＲＮＰ１６でトランスフェクトしたプールでは、発現は、１６０日間安定に維持された。
３つの反復実験により、ｐ２２０．ＲＮＰ１６でトランスフェクトしたプールにおける高レベルの均質なＥＧＦＰ発現の同じパターンが実証された。これは、ｐ２２０．ＥＧＦＰでトランスフェクトしたプールにおいて再度観察された不均質な発現をともなった。最初の実験と同様に、ＥＧＦＰの発現は、ＲＮＰ１６ ＵＣＯＥで安定であり、そしてＵＣＯＥなしでは不安定であった。これは３０〜４０日までの劇的な発現の低下を伴った（図４３）。
ハイグロマイシン選択を２７日目に除く、さらなる実験を行った。この結果は、選択がなくとも、ＥＧＦＰ発現が、ＲＮＰ１６ＵＣＯＥの存在で安定であり、そしてＵＣＯＥがなければ不安定であることを示す（図４４）。
（実施例３）
（ＵＣＯＥを含有するプラスミド）
図５０は、生成された構築物、およびｈｎＲＮＰＡ２内在性遺伝子座との比較に用いられるフラグメントを示す。
図５１は、一過的にトランスフェクトされたＨｅＬａ集団の蛍光中央値を用いるＦＡＣｓ分析のグラフを示す。この細胞を上記のように示されるＣＬ２２ペプチド凝縮レポータープラスミドを用いてトランスフェクトした。コントロールのＣＭＶ−ＧＦＰレポーター構築物の発現の持続期間が短期であり、そしてトランスフェクト後２４〜４８時間で劇的に短縮されることが見られ得る。
コントロールと対照的に、ＵＣＯＥ含有プラスミド７．５ＣＭＶ−Ｆは、トランスフェクション後少なくとも９日の長期間にわたって有意なＧＦＰ発現を示し続ける。反復した試験において、ＧＦＰ発現は、トランスフェクション後１４日で見られ得る。
図５２は、一過的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞集団の例示的な低い倍率の視野を示す。このデータは、ＦＡＣｓ分析と相関し、そして類似の時間経過後、細胞を可視的にする。トランスフェクション後２４時間で、コントロールのＣＭＶ−ＧＦＰおよび７．５ＣＭＶの一過性の集団の両方において、多数のＧＦＰ陽性細胞が可視である（図５２ＡおよびＢ）。実際、７．５ＣＭＶでトランスフェクトした集団よりも、コントロール集団において、ＧＦＰ陽性細胞がより存在したことが２４時間で見られ得る。これは、両方の場合においてインプットされるＤＮＡの量が遺伝子量について補正されておらず、１トランスフェクションあたり有意により多いコピーのコントロールプラスミドを生じるという事実に起因する。しかし、トランスフェクション後６日に、なんらかの陽性蛍光細胞がＣＭＶ−ＥＧＦＰコントロール集団に残存することは、たとえあったとしてもごくまれである（図５２Ｃ）。対照的に、トランスフェクション６日後、７．５ＣＭＶでトランスフェ
クトしたＨｅｌａ細胞は、多数のＧＦＰ発現細胞を示し続けた（図５２Ｄ）。実際、トランスフェクション後１４日でさえ陽性に蛍光を発する細胞は容易に検出可能であった（データ示さず）。
実験を通じて、総ＤＮＡを異なる時間点で回収し、直線化し、ゲル上で泳動し、そしてブロットした（「材料および方法」を参照のこと）。興味深いことに、ＧＦＰの発現がわずかであるか、または検出されない細胞のコントロール集団においてさえ、６日目に、プラスミドは、組み込まれていない状態で容易に検出され得た（データ示さず）。これは、ＣＭＶ−ＧＦＰコントロールプラスミド内でみられる遺伝子発現の迅速な消失がプラスミド鋳型の慢性的消失に起因するのではなく、むしろ遺伝子発現のクロマチンシャットダウンの機構に起因することを示唆する。
（エリスロポエチン発現ベクターを有するＣＨＯ細胞の一過的トランスフェクション）
プラスミドＣＥＴ３００、ＣＥＴ３０１およびＣＭＶ−ＥＰＯのスーパーコイル化形態を、標準的条件（９７５μＦ、２５０Ｖ）を用いてＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションした。次いで、生存細胞を１ｍｌの完全ＣＨＯ培地を含有する６−ウェルシャーレに１０6細胞で播種した。次いで、この培地を２４時間間隔で取り出し、１ｍｌの新鮮培地で置
換した。培地サンプルを９日間この様式で収集し、次いで、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＩＶＤ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＰＯイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳ）を用いるＥＬＩＳＡにより、エリスロポエチンレベルを定量した。添付の図は、ＣＥＴ３００、ＣＥＴ３０１およびＣＭＶ−ＥＰＯプラスミドでトランスフェクトした細胞によるエリスロポエチン発現の時間経過を示す。エリスロポエチン発現は、全ての細胞集団において４８時間上昇し続けた。その後、ＣＭＶ−ＥＰＯでトランスフェクトした細胞によるエリスロポエチン発現は、日毎に低下した。一方、ＣＥＴ３００またはＣＥＴ３０１でトランスフェクトした細胞によるＥＰＯ発現のレベルは、９日間を通じて上昇し続けた（図４５）。
Figure 2009102331
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図１は、ヒトＴＢＰ遺伝子座を示す。Ａ：本研究において使用したヒトＴＢＰ遺伝子を含むｐＣＹＰＡＣ−２クローンの概略図。同定されていない遺伝子の位置を示し得るＮｏｔＩ制限部位およびＳａｃＩＩ制限部位の位置が、印を付けて示される。 図１は、ヒトＴＢＰ遺伝子座を示す。Ｂ：５’ＴＢＰ／Ｃ５領域にわたるＣｐＧ島の図示。ＣｐＧジヌクレオチド残基の密度は、メチル化されていない島が３．４ｋｂ長であり、そしてＣ５のイントロンＩ内のＦｓｐＩ部位と、ＴＢＰの第１のイントロン内のＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に及ぶことが、意味される。 図１は、ヒトＴＢＰ遺伝子座を示す。Ｃ：ＴＢＰ／Ｃ５領域由来のクローンのさらなる概略図。この遺伝子の配置は、図１Ａにおいて与えられるものと逆転している。Ｃ５遺伝子はまた、ＰＳＭＢ１遺伝子ともいわれることに注意すること。接近して連結する遺伝子の３側の位置を有する第６ｑ染色体の末端小粒由来の２５７ｋｂの連続する領域および関連する制限部位を示す（Ｂ，ＢｓｓＨＩＩ；Ｎ，ＮｏｔＩ；Ｓ，ＳａｃＩＩ）。これらの指定された名称を有するＰＡＣクローンが示される。サブクローンであるｐＢＬ３−ＴＰＯ−ｐｕｒｏもまた、示される。ＰＤＣＤ２の第１のエキソン内のＮｏｔＩ部位と、末端小粒反復の開始との間の距離は、約１５０ｋｂである。 図２は、ＴＬＮ：３トランスジェニックマウスおよびＴＬＮ：８トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検ＤＮＡサンプルのサザンブロット分析を、（ａ）導入遺伝子の３’末端、（ｂ）５’末端、（ｃ）プロモーター、（ｄ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−７．７ｋｂ、（ｅ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−１２ｋｂ、に位置する小ＤＮＡフラグメントでプローブした。ＴＬＮ：３についての結果（ａ、ｂ）は、両末端プローブを有する１つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において１つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル（ｃ）は、プロモータープローブを用いて、２つのバンドが、この系統に存在する第２の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。（ａ）におけるＴＬＮ：８の分析は、６ｋｂで導入遺伝子コンカテマーバンド、および７．８ｋｂで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント２倍の強度であるので、これは、この系統について３のコピー数を示す。（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの欠失は、３つのコピー全ての５’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル（ｄ）および（ｅ）は、この導入遺伝子がＴＢＰ遺伝子に対して５’の１２ｋｂまでインタクトであるようであることを示す。 図２は、ＴＬＮ：３トランスジェニックマウスおよびＴＬＮ：８トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検ＤＮＡサンプルのサザンブロット分析を、（ａ）導入遺伝子の３’末端、（ｂ）５’末端、（ｃ）プロモーター、（ｄ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−７．７ｋｂ、（ｅ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−１２ｋｂ、に位置する小ＤＮＡフラグメントでプローブした。ＴＬＮ：３についての結果（ａ、ｂ）は、両末端プローブを有する１つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において１つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル（ｃ）は、プロモータープローブを用いて、２つのバンドが、この系統に存在する第２の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。（ａ）におけるＴＬＮ：８の分析は、６ｋｂで導入遺伝子コンカテマーバンド、および７．８ｋｂで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント２倍の強度であるので、これは、この系統について３のコピー数を示す。（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの欠失は、３つのコピー全ての５’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル（ｄ）および（ｅ）は、この導入遺伝子がＴＢＰ遺伝子に対して５’の１２ｋｂまでインタクトであるようであることを示す。 図２は、ＴＬＮ：３トランスジェニックマウスおよびＴＬＮ：８トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検ＤＮＡサンプルのサザンブロット分析を、（ａ）導入遺伝子の３’末端、（ｂ）５’末端、（ｃ）プロモーター、（ｄ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−７．７ｋｂ、（ｅ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−１２ｋｂ、に位置する小ＤＮＡフラグメントでプローブした。ＴＬＮ：３についての結果（ａ、ｂ）は、両末端プローブを有する１つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において１つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル（ｃ）は、プロモータープローブを用いて、２つのバンドが、この系統に存在する第２の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。（ａ）におけるＴＬＮ：８の分析は、６ｋｂで導入遺伝子コンカテマーバンド、および７．８ｋｂで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント２倍の強度であるので、これは、この系統について３のコピー数を示す。（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの欠失は、３つのコピー全ての５’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル（ｄ）および（ｅ）は、この導入遺伝子がＴＢＰ遺伝子に対して５’の１２ｋｂまでインタクトであるようであることを示す。 図２は、ＴＬＮ：３トランスジェニックマウスおよびＴＬＮ：８トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検ＤＮＡサンプルのサザンブロット分析を、（ａ）導入遺伝子の３’末端、（ｂ）５’末端、（ｃ）プロモーター、（ｄ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−７．７ｋｂ、（ｅ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−１２ｋｂ、に位置する小ＤＮＡフラグメントでプローブした。ＴＬＮ：３についての結果（ａ、ｂ）は、両末端プローブを有する１つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において１つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル（ｃ）は、プロモータープローブを用いて、２つのバンドが、この系統に存在する第２の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。（ａ）におけるＴＬＮ：８の分析は、６ｋｂで導入遺伝子コンカテマーバンド、および７．８ｋｂで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント２倍の強度であるので、これは、この系統について３のコピー数を示す。（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの欠失は、３つのコピー全ての５’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル（ｄ）および（ｅ）は、この導入遺伝子がＴＢＰ遺伝子に対して５’の１２ｋｂまでインタクトであるようであることを示す。 図２は、ＴＬＮ：３トランスジェニックマウスおよびＴＬＮ：８トランスジェニックマウスの末端フラグメント分析を示す。トランスジェニックマウスの尾生検ＤＮＡサンプルのサザンブロット分析を、（ａ）導入遺伝子の３’末端、（ｂ）５’末端、（ｃ）プロモーター、（ｄ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−７．７ｋｂ、（ｅ）ＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位からの−１２ｋｂ、に位置する小ＤＮＡフラグメントでプローブした。ＴＬＮ：３についての結果（ａ、ｂ）は、両末端プローブを有する１つのハイブリダイズするバンドのみが存在することを示す。このバンドは、頭−頭、頭−尾、または尾−尾のコンカテマーのいずれかについての予測されたサイズと一致しない。従って、この系統において１つの導入遺伝子のコピーのみが存在するようである。しかし、パネル（ｃ）は、プロモータープローブを用いて、２つのバンドが、この系統に存在する第２の検出されたコピーの導入遺伝子もまた存在しなければならないことを示すことを観察する。（ａ）におけるＴＬＮ：８の分析は、６ｋｂで導入遺伝子コンカテマーバンド、および７．８ｋｂで末端フラグメントバンドを示す。コンカテマーバンドがこの末端フラグメント２倍の強度であるので、これは、この系統について３のコピー数を示す。（ｂ）におけるハイブリダイゼーションの欠失は、３つのコピー全ての５’末端での欠失が生じ、そしてこれをマッピングするための作用が進行中であることを示唆する。パネル（ｄ）および（ｅ）は、この導入遺伝子がＴＢＰ遺伝子に対して５’の１２ｋｂまでインタクトであるようであることを示す。 図３Ａは、ＴＬＮ：２８マウスの分析を示す。ＴＬＮ：２８ ＤＮＡのサザンブロットを、導入遺伝子遺伝子座の極めて３’末端に位置するプローブにハイブリダイズした。複数のバンドが、このプローブにハイブリダイズすることを観察し、これは、複数の組み込み事象を示唆した。しかし、鋭いコンカテマーバンドが、頭−尾組み込み事象について予測された位置において見られる。このフラグメントと末端フラグメントとの間のシグナル強度の比較は、この系統において約４のコピー数を示唆した。 図３Ｂは、ＴＬＮマウス系統における導入遺伝子構成の要約を示す。ＴＬＮ：３は、頭−尾配置において２つのコピーの導入遺伝子を含有する。欠失は、このアレイの５’末端および３’末端の両方で生じた。５’欠失は、このコピーにおいてＣ５遺伝子を完全に欠失する、ＴＢＰの５’隣接領域へ伸長する。３’末端において、欠失は、ＴＢＰの３’ＵＴＲへ伸長し、Ｃ５遺伝子インタクトを残す。従って、この動物は、Ｃ５遺伝子の単一コピーおよびＴＢＰ遺伝子の単一機能のコピーを有する。ＴＬＮ：８は、３つのコピーの頭−尾配置を含む。各コピーは、極めて５’領域で欠失を有するようであり、この欠失の程度は現在知られていないが、ヒトＣ５ ｍＲＮＡがこの系統において検出されるので、Ｃ５遺伝子まで伸長していない。ＴＬＮ：２８は、頭−尾立体配置において５コピーを含むが、観察される多くのさらなるフラグメントもまた存在し、このアレイがより複雑であり得ることを示す。 図３Ｃは、ＴＬＮマウス系統における導入遺伝子構成の、更新された概要を示す。この図は、各々のマウス系統におけるＴＬＮ導入遺伝子アレイの予測される構成を示す。機能的遺伝子のみが示され、そしてＴＬＮ：３マウスの３つの可能な配置のうち１つのみを示す。 図４は、ＴＬＮ：３マウスにおける欠失の分析を示す。一連のプローブを、ＴＬＮ：３ ＤＮＡのサザンブロットにハイブリダイズした。最も遠い５’プローブのみが、単一バンドを与え、これは、欠失されたコピーがこの配列を含まなかったことを示す。欠失は、主要なＴＢＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位、Ｅｔｓ因子結合部位およびＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位の上流の領域にマッピングされる。全体の５’領域がこのコピーにおいて欠失されているか、または小さな内部欠失が生じているか否かは、現在のところ未知である。 図５は、ヒトおよびマウス由来のＴＢＰ ｍＲＮＡ配列とＣ５ ｍＲＮＡ配列との比較を示す。（ａ）ｎｔ．３５８〜７０８のヒトＣ５ ｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｇａｎｋ登録番号Ｄ００７６１）は、ｎｔ．３５５〜７０５のマウス配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ８０６８６）と有意な相同性を示す（垂直の棒によって示される）。ヒトｍＲＮＡおよびマウスｍＲＮＡ両方のＲＴ−ＰＣＲ増幅は、両方の種由来の３５０ｂｐのＤＮＡ分子の混合物を生成する。プライマーの位置（強調されている、５’プライマーＣ５ＲＴＦ、３’プライマーＣ５Ｒ）は、多くのエキソンにわたり、ゲノムＤＮＡの夾雑に由来するＰＣＲ増幅からの誤差を除去するように配置される。ヒト遺伝子またはマウス遺伝子のいずれかのイントロン／エキソン構造は制限されるが、プライマー間の距離は、それらが異なるエキソンにおいて配置されるような距離である。マウスＰＣＲ産物およびヒトＰＣＲ産物は、マウス配列のみを切断するＰｓｔＩとともにインキュベーションすることによって区別され得る。Ｃ５ＲＴＦプライマーの放射性標識化は、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した場合に、１７３ｎｔの生成物を与える。（ｂ）エキソン５中のｎｔ．９０１からエキソン７中のｎｔ．１１８５のヒトＴＢＰ ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ５５６５４）および６５５位〜９３９位のマウスＴＢＰ ｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｄ０１０３４）についての同様の分析。あるエキソン由来の最後のヌクレオチドおよびその次のエキソン由来の最初のヌクレオチドは、赤色で示される。使用されるプライマー（強調表示されている）は、５’ＴＢ−２２および３’ＴＢ−１４であった。示されるプライマー（四角で囲まれる）を有する両方の種由来の増幅された生成物のサイズは、２８４ｂｐである。ＰＣＲ産物の５’末端由来のＢｓｐ１４０７１部位の６３ｎｔは、ヒト転写物およびマウス転写物を区別することを可能にする。放射性標識されたＴＢ−１４を有するポリアクリルアミドゲル上のヒト特異的産物のサイズは、２２１ｎｔである。 図５は、ヒトおよびマウス由来のＴＢＰ ｍＲＮＡ配列とＣ５ ｍＲＮＡ配列との比較を示す。（ａ）ｎｔ．３５８〜７０８のヒトＣ５ ｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｇａｎｋ登録番号Ｄ００７６１）は、ｎｔ．３５５〜７０５のマウス配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ８０６８６）と有意な相同性を示す（垂直の棒によって示される）。ヒトｍＲＮＡおよびマウスｍＲＮＡ両方のＲＴ−ＰＣＲ増幅は、両方の種由来の３５０ｂｐのＤＮＡ分子の混合物を生成する。プライマーの位置（強調されている、５’プライマーＣ５ＲＴＦ、３’プライマーＣ５Ｒ）は、多くのエキソンにわたり、ゲノムＤＮＡの夾雑に由来するＰＣＲ増幅からの誤差を除去するように配置される。ヒト遺伝子またはマウス遺伝子のいずれかのイントロン／エキソン構造は制限されるが、プライマー間の距離は、それらが異なるエキソンにおいて配置されるような距離である。マウスＰＣＲ産物およびヒトＰＣＲ産物は、マウス配列のみを切断するＰｓｔＩとともにインキュベーションすることによって区別され得る。Ｃ５ＲＴＦプライマーの放射性標識化は、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した場合に、１７３ｎｔの生成物を与える。（ｂ）エキソン５中のｎｔ．９０１からエキソン７中のｎｔ．１１８５のヒトＴＢＰ ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ５５６５４）および６５５位〜９３９位のマウスＴＢＰ ｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｄ０１０３４）についての同様の分析。あるエキソン由来の最後のヌクレオチドおよびその次のエキソン由来の最初のヌクレオチドは、赤色で示される。使用されるプライマー（強調表示されている）は、５’ＴＢ−２２および３’ＴＢ−１４であった。示されるプライマー（四角で囲まれる）を有する両方の種由来の増幅された生成物のサイズは、２８４ｂｐである。ＰＣＲ産物の５’末端由来のＢｓｐ１４０７１部位の６３ｎｔは、ヒト転写物およびマウス転写物を区別することを可能にする。放射性標識されたＴＢ−１４を有するポリアクリルアミドゲル上のヒト特異的産物のサイズは、２２１ｎｔである。 図６は、ＴＬＮトランスジェニックマウスにおけるヒトＴＢＰ発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総ＲＮＡ（１μｇ）を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、Ｋ５６２細胞由来のヒトＲＮＡ、および非トランスジェニックマウスＲＮＡもまた、使用した。（ａ）ＴＢ２２／１４ ＲＴ−ＰＣＲ産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。（ｂ）種々の組織におけるＴＬＮ：３発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。（ｃ）ＴＬＮ：８についての同様の分析。（ｄ）ＴＬＮ：２８の分析は、ヒトＴＢＰ ｍＲＮＡのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。 図６は、ＴＬＮトランスジェニックマウスにおけるヒトＴＢＰ発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総ＲＮＡ（１μｇ）を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、Ｋ５６２細胞由来のヒトＲＮＡ、および非トランスジェニックマウスＲＮＡもまた、使用した。（ａ）ＴＢ２２／１４ ＲＴ−ＰＣＲ産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。（ｂ）種々の組織におけるＴＬＮ：３発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。（ｃ）ＴＬＮ：８についての同様の分析。（ｄ）ＴＬＮ：２８の分析は、ヒトＴＢＰ ｍＲＮＡのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。 図６は、ＴＬＮトランスジェニックマウスにおけるヒトＴＢＰ発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総ＲＮＡ（１μｇ）を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、Ｋ５６２細胞由来のヒトＲＮＡ、および非トランスジェニックマウスＲＮＡもまた、使用した。（ａ）ＴＢ２２／１４ ＲＴ−ＰＣＲ産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。（ｂ）種々の組織におけるＴＬＮ：３発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。（ｃ）ＴＬＮ：８についての同様の分析。（ｄ）ＴＬＮ：２８の分析は、ヒトＴＢＰ ｍＲＮＡのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。 図６は、ＴＬＮトランスジェニックマウスにおけるヒトＴＢＰ発現の発現分析を示す。種々のマウス組織由来の総ＲＮＡ（１μｇ）を、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用する逆転写反応において使用した。コントロールとして、Ｋ５６２細胞由来のヒトＲＮＡ、および非トランスジェニックマウスＲＮＡもまた、使用した。（ａ）ＴＢ２２／１４ ＲＴ−ＰＣＲ産物内のヒト特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置。（ｂ）種々の組織におけるＴＬＮ：３発現の分析。観察され得るように、ヒト発現のレベルは、全ての組織において生理学的である。（ｃ）ＴＬＮ：８についての同様の分析。（ｄ）ＴＬＮ：２８の分析は、ヒトＴＢＰ ｍＲＮＡのレベルがまた、内在性遺伝子に匹敵するレベルで発現することを示す。 図７は、ＴＬＮトランスジェニックマウスにおけるヒトＣ５発現の発現分析を示す。分析は、図６におけるように実施した。上のパネル（ａ）は、Ｃ５ＲＴＦ／Ｃ５Ｒ ＲＴ−ＰＣＲ産物内のマウス特異的制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位の位置を示す。（ｂ）ＴＬＮトランスジェニックの種々の組織におけるＣ５発現の分析が観察され、ヒト発現のレベルが、試験された全ての組織において生理学的である。 図８は、ＴＬＮトランスジェニックマウスにおける（ａ）ヒトＴＢＰ遺伝子発現および（ｂ）ヒトＣ５遺伝子発現の定量の概略を示す。 図９は、ｐＷＥ−ＴＳＮコスミドの概略図を示す。 図１０は、ｐＷＥ−ＴＳＮ Ｌ細胞クローンの導入遺伝子のコピー数決定を示す。マウスＬ細胞を、ｐＷＥ−ＴＳＮコスミドでトランスフェクトし、ＤＮＡを、サザンブロットを生成するために単離および使用した。ブロットを、２つのコピーのマウスｖａｖ遺伝子座由来のＤＮＡフラグメントおよびＴＢＰ遺伝子由来の−７ｋｂに位置されるプローブを用いてプローブした。コピー数は、３コピーのＴＬＮ：８コントロールの比から決定し、そして各レーンの下部に示した。コピー数は、１〜６０の範囲であった。 図１１は、マウスＬ細胞におけるｐＷＥ−ＴＳＮコスミドクローンの発現の概略を示す。 図１２は、ヒトＴＢＰ遺伝子座のＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位分析を示す。ＴＢＰ遺伝子周囲の４０ｋｂ領域にわたって配置されるプローブを使用して、増加する濃度のＤＮａｓｅ Ｉで消化されたＫ５６２核のサザンブロットをプローブした。ＰＳＭＢ１遺伝子およびＴＢＰ遺伝子のプロモーターにおいて２つの高感受性部位のみが見出された。ＤＮａｓｅ Ｉの濃度の増加は、すべての場合において左から右へ示される。 図１３Ａは、大きな１６０ｋｂのｐＣＹＰＡＣ由来クローンＭＡ１６０を示すヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子座の概略図を示す。逆向きの矢印は、ＨＰ１Ｈ−γ遺伝子を示す。２つのＳａｃ ＩＩ部位（これらは、メチル化を有さない島の存在を示し得る）は、四角で囲まれる。 図１３Ｂは、ＭＡ１６０由来の６０ｋｂのＡａｔＩＩサブフラグメントを示す。これらの両方は、トランスジェニックマウスの産生のために使用されている。 図１３Ｃは、ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子の５’末端に及ぶＣｐＧ島（赤棒）の程度を示す。ＣｐＧ残基は、垂線で示される。数字は、ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子（実線矢印）の転写開始部位（＋１）に関係する。破線矢印は、分岐的に（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ）転写されたＨＰ１Ｈ−γ遺伝子の位置を示す。インタクトなｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子を含む１６ｋｂのサブフラグメントもまた、示される。 図１４は、ヒトおよびマウスｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子発現の定量を示す。ヒト（Ｋ５６２）およびマウスＲＮＡを、ｈｎＲＮＰＡ２遺伝子のエキソン１２に対するプライマーを用いて逆転写した。続いて、サンプルを、ＰＣＲによって、エキソン１０から１２に及ぶプライマーＨｎ９およびＨｎ１１によって増幅した。次いで、生成された産物を、各々の種に対して固有の切断部位を見出すためにランダムな酵素で消化した。マウスの産物は、ヒトの産物において存在しないＨｉｎｄＩＩＩを含むことが見出され得る。 図１４は、ヒトおよびマウスｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子発現の定量を示す。ヒト（Ｋ５６２）およびマウスＲＮＡを、ｈｎＲＮＰＡ２遺伝子のエキソン１２に対するプライマーを用いて逆転写した。続いて、サンプルを、ＰＣＲによって、エキソン１０から１２に及ぶプライマーＨｎ９およびＨｎ１１によって増幅した。次いで、生成された産物を、各々の種に対して固有の切断部位を見出すためにランダムな酵素で消化した。マウスの産物は、ヒトの産物において存在しないＨｉｎｄＩＩＩを含むことが見出され得る。 図１５は、Ａａ６０フラグメント（図１３Ｂ）を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスにおけるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２発現の分析を示す。種々の組織由来の総ＲＮＡは、図１５において記載されるように分析された。ＲＴ−ＰＣＲの後、サンプルは、未処理（−）かまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化（＋）されるかのいずれかであり、次いで、ヒト（Ｈ）産物およびマウス（Ｍ）産物を分離するためにポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって測定した。 図１５は、Ａａ６０フラグメント（図１３Ｂ）を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスにおけるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２発現の分析を示す。種々の組織由来の総ＲＮＡは、図１５において記載されるように分析された。ＲＴ−ＰＣＲの後、サンプルは、未処理（−）かまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化（＋）されるかのいずれかであり、次いで、ヒト（Ｈ）産物およびマウス（Ｍ）産物を分離するためにポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって測定した。 図１５は、Ａａ６０フラグメント（図１３Ｂ）を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスにおけるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２発現の分析を示す。種々の組織由来の総ＲＮＡは、図１５において記載されるように分析された。ＲＴ−ＰＣＲの後、サンプルは、未処理（−）かまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化（＋）されるかのいずれかであり、次いで、ヒト（Ｈ）産物およびマウス（Ｍ）産物を分離するためにポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって測定した。 図１６は、１６０ｋｂのＮｒｕＩフラグメント（図１３Ａ）を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスによるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２発現の分析を示す。トランスジェニックマウスを解剖し、そして総ＲＮＡを組織から抽出した。このＲＮＡを、Ｈｎ１１によって逆転写し、次いで、プライマーＨｎ９およびＨｎ１１を用いるＰＣＲによって増幅させた。このＨｎ９を、32Ｐで末端を放射性標識した。サンプルは、未処理（−）かまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化（＋）されるかのいずれかであり、次いで、ヒト（Ｈ）産物およびマウス（Ｍ）産物を分離するために、変性剤として８Ｍの尿素の存在下での５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって測定した。 図１６は、１６０ｋｂのＮｒｕＩフラグメント（図１３Ａ）を用いて微量注入されたトランスジェニックマウスによるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２発現の分析を示す。トランスジェニックマウスを解剖し、そして総ＲＮＡを組織から抽出した。このＲＮＡを、Ｈｎ１１によって逆転写し、次いで、プライマーＨｎ９およびＨｎ１１を用いるＰＣＲによって増幅させた。このＨｎ９を、32Ｐで末端を放射性標識した。サンプルは、未処理（−）かまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化（＋）されるかのいずれかであり、次いで、ヒト（Ｈ）産物およびマウス（Ｍ）産物を分離するために、変性剤として８Ｍの尿素の存在下での５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。バンドの強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析によって測定した。 図１７は、ｈｎＲＮＰ Ａ２導入遺伝子発現の定量を示す。種々のマウス組織におけるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２導入遺伝子発現の分析を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒによって定量した。レベルは、導入遺伝子のコピー数基準に対するマウスｈｎＲＮＰ Ａ２発現の割合として示される。Ａ：ＭＡ１６０を有するマウス（図１５を参照のこと）。 図１７は、ｈｎＲＮＰ Ａ２導入遺伝子発現の定量を示す。種々のマウス組織におけるヒトｈｎＲＮＰ Ａ２導入遺伝子発現の分析を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒによって定量した。レベルは、導入遺伝子のコピー数基準に対するマウスｈｎＲＮＰ Ａ２発現の割合として示される。Ｂ：Ａａ６０を有するマウス（図１６を参照のこと）。 図１８は、ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子座のＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位マッピングを示す。Ｋ５６２細胞由来の核を、増加する濃度のＤＮａｓｅ Ｉで消化した。続いて、これらの核由来のＤＮＡを、ＡａｔＩＩおよびＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼの組合せで消化し、そしてサザンブロットした。次いで、このブロットを、ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子のエキソンＩＩ由来の７６６ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩフラグメントでプローブした。３つの高感受性部位を、ｈｎＲＮＰ Ａ２転写開始部位の５’の−１．１、−０．７、および−０．１ｋｂ位に対応させて同定した。 図１９は、ｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子座とＴＢＰ遺伝子座との間の生物情報的分析および配列比較を示す。 図２０は、５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位で始まるＴＢＰ遺伝子座のゲノムクローンのヌクレオチド配列（ヌクレオチド１〜９０９８）を示す。 図２０−２は、図２０−１の続きである。 図２０−３は、図２０−２の続きである。 図２０−４は、図２０−３の続きである。 図２０−５は、図２０−４の続きである。 図２０−６は、図２０−５の続きである。 図２１は、図２２において示される５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位で始まるｈｎＲＮＰ遺伝子座のゲノムクローンのヌクレオチド配列（ヌクレオチド１〜１５０７１）を示す。 図２１−２は、図２１−１の続きである。 図２１−３は、図２１−２の続きである。 図２１−４は、図２１−３の続きである。 図２１−５は、図２１−４の続きである。 図２１−６は、図２１−５の続きである。 図２１−７は、図２１−６の続きである。 図２１−８は、図２１−７の続きである。 図２１−９は、図２１−８の続きである。 図２２は、ＧＦＰレポーター遺伝子およびＮｅｏRレポーター遺伝子の両方を使用して設計された、ＲＮＰとＨＰ１Ｈ−γとの間の二重（ｄｕａｌ）プロモーター領域に配置されるサブフラグメントを含む発現ベクターを示す。これらのベクターは、以下である：ＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＲＮＰプロモーターを有するコントロールベクター（ＲＮＰ）；ＲＮＰプロモーター領域の上流の５．５ｋｂのフラグメントおよびＲＮＰプロモーターを含むベクター（５．５ＲＮＰ）；スプライスアクセプターストラテジーを使用して構築されたベクターであって、ここで、このスプライスアクセプター／分枝コンセンサス配列（ＲＮＰ遺伝子のエキソン２に由来する）を、ＧＦＰ遺伝子の前にクローニングし、その結果、ＧＦＰの上流のエキソン１／イントロン１の一部を生じる、ベクター（７．５ＲＮＰ、ＧＦＰ遺伝子の前に約７．５ｋｂのＲＮＰ遺伝子を保有する）；およびＲＮＰプロモーター領域の上流の１．５ｋｂのフラグメントおよびＲＮＰプロモーターを含むベクター（１．５ＲＮＰ）。 図２３は、ＧＦＰレポーター遺伝子およびＮｅｏRレポーター遺伝子の両方を使用して設計された、ＲＮＰとＨＰ１Ｈ−γとの間の二重（ｄｕａｌ）プロモーター領域に配置されるサブフラグメントを含む発現ベクターを示す。これらのベクターは、異種ＣＭＶプロモーターを含む。これらのベクターは、以下である：（ａ）内部リボソーム進入部位配列を用いてＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターを有するコントロールベクター（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ）、ならびに（ｂ）内部リボソーム進入部位配列を有さず、そしてＮｅｏRレポーター遺伝子の上流のＳＶ４０プロモーターを用いてＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターを有するコントロールベクター（ＣＭＶ−ＥＧＦＰ）；内部リボソーム進入部位配列を用いてＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動する、ＲＮＰプロモーター領域の上流の５．５ｋｂフラグメントおよびＣＭＶプロモーターを含むベクター（５．５ＣＭＶ）；ＲＮＰプロモーターおよびＨＰ１Ｈ−γプロモーター、ならびにＮｅｏRレポーター遺伝子の上流のＳＶ５０プロモーターを用いてＧＦＰ／Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターを包含する４．０ｋｂ配列を含むベクター（４．０ＣＭＶ）；ならびに、エキソン１およびイントロン１の一部を含むＲＮＰ遺伝子、ならびにＮｅｏRレポーター遺伝子の上流のＳＶ４０プロモーターを用いてＧＦＰ−Ｎｅｏ発現を駆動するＣＭＶプロモーターの７．５ｋｂの配列を含むベクター（７．５ＣＭＶ）。 図２４は、ＲＮＰ構築物およびＣＭＶ構築物をＣＨＯ細胞へトランスフェクトすることによって産生されるＧ４１８Rコロニーの数を示す。 図２５は、エレメントの上流を有するか、または有さない、ＲＮＰ構築物およびＣＭＶ構築物を用いてトランスフェクトしたＧ４１８選択ＣＨＯコロニーにおけるＧＦＰ発現の比較を示す。 図２６は、４０日の期間にわたって、エレメントの上流を有するか、または有さない、ＲＮＰ構築物を用いてトランスフェクトしたＧ４１８選択ＣＨＯクローンにおけるＧＦＰ蛍光レベルの平均中央値を示す。 図２７−１は、Ｇ４１８の非存在下で培養された後、１０３日の期間にわたるＣＭＶ−ＧＦＰプールのＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図２７−２は、Ｇ４１８の非存在下で培養された後、１０３日の期間にわたるＣＭＶ−ＧＦＰプールのＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図２８は、Ｇ４１８の非存在下で培養された後、１０３日の期間にわたる５．５ＣＭＶ−ＧＦＰプールのＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図２８は、Ｇ４１８の非存在下で培養された後、１０３日の期間にわたる５．５ＣＭＶ−ＧＦＰプールのＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図２９は、６８日間の時間経過にわたって減少する、ＧＦＰを発現するトランスフェクト細胞の割合を示す。 図３０は、６６日間の時間経過にわたってＣＭＶ構築物でトランスフェクトされたＧ４１８選択細胞の蛍光の中央値を示す。 図３１は、６６日間の時間経過にわたってＣＭＶ構築物でトランスフェクトされた陽性Ｇ４１８選択細胞の割合を示す。 図３２は、トランスフェクション後１３日目においてＣＭＶ構築物でトランスフェクトされたＧ４１８選択細胞の蛍光の中央値を示す。 図３３は、２７日間の時間経過にわたってＣＭＶ構築物でトランスフェクトされた陽性Ｇ４１８選択細胞の割合を示す。 図３４は、種々のＣＭＶ構築物を用いるＣＨＯ細胞のトランスフェクション後のコロニー数を示す。 図３５は、ヒトＰＳＭＢ１、ＰＤＣＤ２およびＴＢＰ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するＴＢＰクラスター内の遺伝子由来のｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇにおいて示される）を用いて負荷される。ドットブロットを、（Ｂ）ＰＳＭＢ１ ｃＤＮＡ、（Ｃ）部分的ＰＤＣＤ２遺伝子を含む４．７ｋｂのゲノムフラグメント（ＭＡ４４５）および（Ｄ）ＴＢＰ ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ（Ｅ）は、規格化プロセスが首尾よく、そしてＲＮＡがインタクトであることを実証した。 図３５は、ヒトＰＳＭＢ１、ＰＤＣＤ２およびＴＢＰ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するＴＢＰクラスター内の遺伝子由来のｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇにおいて示される）を用いて負荷される。ドットブロットを、（Ｂ）ＰＳＭＢ１ ｃＤＮＡ、（Ｃ）部分的ＰＤＣＤ２遺伝子を含む４．７ｋｂのゲノムフラグメント（ＭＡ４４５）および（Ｄ）ＴＢＰ ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ（Ｅ）は、規格化プロセスが首尾よく、そしてＲＮＡがインタクトであることを実証した。 図３５は、ヒトＰＳＭＢ１、ＰＤＣＤ２およびＴＢＰ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するＴＢＰクラスター内の遺伝子由来のｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇにおいて示される）を用いて負荷される。ドットブロットを、（Ｂ）ＰＳＭＢ１ ｃＤＮＡ、（Ｃ）部分的ＰＤＣＤ２遺伝子を含む４．７ｋｂのゲノムフラグメント（ＭＡ４４５）および（Ｄ）ＴＢＰ ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ（Ｅ）は、規格化プロセスが首尾よく、そしてＲＮＡがインタクトであることを実証した。 図３５は、ヒトＰＳＭＢ１、ＰＤＣＤ２およびＴＢＰ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するＴＢＰクラスター内の遺伝子由来のｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇにおいて示される）を用いて負荷される。ドットブロットを、（Ｂ）ＰＳＭＢ１ ｃＤＮＡ、（Ｃ）部分的ＰＤＣＤ２遺伝子を含む４．７ｋｂのゲノムフラグメント（ＭＡ４４５）および（Ｄ）ＴＢＰ ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ（Ｅ）は、規格化プロセスが首尾よく、そしてＲＮＡがインタクトであることを実証した。 図３５は、ヒトＰＳＭＢ１、ＰＤＣＤ２およびＴＢＰ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するＴＢＰクラスター内の遺伝子由来のｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇにおいて示される）を用いて負荷される。ドットブロットを、（Ｂ）ＰＳＭＢ１ ｃＤＮＡ、（Ｃ）部分的ＰＤＣＤ２遺伝子を含む４．７ｋｂのゲノムフラグメント（ＭＡ４４５）および（Ｄ）ＴＢＰ ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズした。ユビキチンコントロールプローブ（Ｅ）は、規格化プロセスが首尾よく、そしてＲＮＡがインタクトであることを実証した。 図３６は、ｐＷＥ−ＴＳＮクローンに対する長期間の培養の効果を示す。多くのｐＷＥ−ＴＳＮマウスＬ細胞クローンを、６０世代について連続的に増殖させた。凍結／融解については、ＲＮＡを収集し、そして次のサイクルのために細胞を凍結させる前に、クローンを少なくとも２日間液体窒素中で保存し、融解し、そして１週間培養した。実験を、培地中でＧ４１８を存在させて、および存在させずに、実施した。ＴＢＰ発現を、本明細書に記載されるように、ＴＢ１４オリゴヌクレオチドおよびヒト特異的制限エンドヌクレアーゼ（＋によって示されるように）を使用することによってアッセイした。全てのサンプルを、酵素を用いずに分析し、そして同定した。代表的な（−）サンプルもまた示す。 図３６は、ｐＷＥ−ＴＳＮクローンに対する長期間の培養の効果を示す。多くのｐＷＥ−ＴＳＮマウスＬ細胞クローンを、６０世代について連続的に増殖させた。凍結／融解については、ＲＮＡを収集し、そして次のサイクルのために細胞を凍結させる前に、クローンを少なくとも２日間液体窒素中で保存し、融解し、そして１週間培養した。実験を、培地中でＧ４１８を存在させて、および存在させずに、実施した。ＴＢＰ発現を、本明細書に記載されるように、ＴＢ１４オリゴヌクレオチドおよびヒト特異的制限エンドヌクレアーゼ（＋によって示されるように）を使用することによってアッセイした。全てのサンプルを、酵素を用いずに分析し、そして同定した。代表的な（−）サンプルもまた示す。 図３７は、ｐＢＬ３−ＴＰＯ−ｐｕｒｏクローンにおけるＴＢＰ遺伝子発現の分析を示す。ＴＢＰ遺伝子発現についての分析を、本明細書に記載されるように、ｐＢＬ３−ＴＰＯ−ｐｕｒｏ構築物を用いてトランスフェクトされたマウスＬ細胞から単離された総ＲＮＡとともにＴＢ１４プライマーを使用して実施した。（＋）上のレーンは、ＰＣＲ産物がヒト特異的酵素で消化されたことを示し、（−）は、消化されていない（コントロール）ことを示す。ヒト（Ｋ５６２）およびマウス（非トランスジェニック肺）ＲＮＡコントロールもまた、ＲＮＡなしのコントロール（ｄＨ2Ｏ）と同様に示される。矢印は、切断されていない（ヒトおよびマウスまたはマウス）およびヒト特異的産物の位置を示す。発現の値を、コピー数について補正し、その結果、１００％の発現は、導入遺伝子の単一コピーが２つの内在性マウス遺伝子の１つと同じレベルで発現していることを意味する。全コピー数は１〜２で変化し、そしてこれは各棒の上に示される。 図３８は、（Ｂ）ヒトＨＰ１γ ｍＲＮＡ発現および（Ｃ）ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するｈｎＲＮＰ Ａ２クラスター内からのＨＰ１γ ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＰ Ａ２ ｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇで示される）を用いて負荷される。ブロットを、（Ｂ）ＨＰ１γ ｃＤＮＡ配列由来の７１７ｎｔのＰＣＲフラグメントを用いて、および（Ｃ）ｈｎＲＮＰ Ａ２の発現について、ＰＣＲプライマー５’ＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＣＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧ３’および５’ＣＣＡＡＴＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＣ３’を使用することによって生成された１２３７ｎｔのＰＣＲプローブを用いてハイブリダイズした。 図３８は、（Ｂ）ヒトＨＰ１γ ｍＲＮＡ発現および（Ｃ）ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するｈｎＲＮＰ Ａ２クラスター内からのＨＰ１γ ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＰ Ａ２ ｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇで示される）を用いて負荷される。ブロットを、（Ｂ）ＨＰ１γ ｃＤＮＡ配列由来の７１７ｎｔのＰＣＲフラグメントを用いて、および（Ｃ）ｈｎＲＮＰ Ａ２の発現について、ＰＣＲプライマー５’ＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＣＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧ３’および５’ＣＣＡＡＴＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＣ３’を使用することによって生成された１２３７ｎｔのＰＣＲプローブを用いてハイブリダイズした。 図３８は、（Ｂ）ヒトＨＰ１γ ｍＲＮＡ発現および（Ｃ）ヒトｈｎＲＮＰ Ａ２ ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ヒトの複数の組織のｍＲＮＡドットブロットを使用するｈｎＲＮＰ Ａ２クラスター内からのＨＰ１γ ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＰ Ａ２ ｍＲＮＡの組織分布：各セグメントは、所定の量のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（Ａ，各組織の下にｎｇで示される）を用いて負荷される。ブロットを、（Ｂ）ＨＰ１γ ｃＤＮＡ配列由来の７１７ｎｔのＰＣＲフラグメントを用いて、および（Ｃ）ｈｎＲＮＰ Ａ２の発現について、ＰＣＲプライマー５’ＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＣＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧ３’および５’ＣＣＡＡＴＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＣ３’を使用することによって生成された１２３７ｎｔのＰＣＲプローブを用いてハイブリダイズした。 図３９は、マウスＬｔｋ細胞へ組み込まれたＴＢＰ導入遺伝子のＦＩＳＨ分析の結果を示し、これは、動原体のヘテロクロマチン上での組み込みを実証する。（Ａ）は、非動原体性組み込み、（Ｂ）および（Ｃ）は、２つの別々の動原体性組み込みを示す。 図４０は、ＲＮＰとＨＰ１Ｈ−γとの間の二重プロモーター領域に配置される７．５ｋｂのサブフラグメント、ＣＭＶプロモーターおよびＥＰＯをコードする遺伝子を含むＣＥＴ３００構築物およびＣＥＴ３０１構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プールにおけるエリトロポイエチン（ＥＰＯ）発現を示す。 図４１は、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクトされたマウスＬｔｋ細胞クローンの蛍光ＥＧＦＰ発現およびコピー数に対するその関連を示す。クローンＦ１、Ｇ６およびＩ３は、マウス動原体のへテロクロマチンと共存した１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰを有する。 図４２は、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクトされたマウスＬｔｋ細胞のＦＩＳＨ分析を示す。（Ａ）は、非動原体性組み込みを有するクローンＨ４を示す。（Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンＧ６、Ｆ１およびＩ３を示す。ｔは、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰであり、そしてｃは、マウス動原体である。 図４２は、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクトされたマウスＬｔｋ細胞のＦＩＳＨ分析を示す。（Ａ）は、非動原体性組み込みを有するクローンＨ４を示す。（Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンＧ６、Ｆ１およびＩ３を示す。ｔは、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰであり、そしてｃは、マウス動原体である。 図４２は、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクトされたマウスＬｔｋ細胞のＦＩＳＨ分析を示す。（Ａ）は、非動原体性組み込みを有するクローンＨ４を示す。（Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンＧ６、Ｆ１およびＩ３を示す。ｔは、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰであり、そしてｃは、マウス動原体である。 図４２は、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクトされたマウスＬｔｋ細胞のＦＩＳＨ分析を示す。（Ａ）は、非動原体性組み込みを有するクローンＨ４を示す。（Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、それぞれ、動原体性組み込みを有するクローンＧ６、Ｆ１およびＩ３を示す。ｔは、１６ＲＮＰ−ＥＧＦＰであり、そしてｃは、マウス動原体である。 図４３−１は、４１日間の期間にわたってハイグロマイシンＢの存在下で培養された１６ＲＮＰを含むＥＢＶを用いてトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞のＥＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図４３−２は、４１日間の期間にわたってハイグロマイシンＢの存在下で培養された１６ＲＮＰを含むＥＢＶを用いてトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞のＥＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図４３−３は、４１日間の期間にわたってハイグロマイシンＢの存在下で培養された１６ＲＮＰを含むＥＢＶを用いてトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞のＥＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図４４は、全体にわたってハイグロマイシンＢの存在下で培養される場合、およびハイグロマイシンＢが２７日目に除去される場合の、１６ＲＮＰを含むＥＢＶを用いてトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞のＥＧＦＰ発現のＦＡＣＳプロフィールを示す。 図４５は、ＣＥＴ３００、ＣＥＴ３０１およびＣＭＶ−ＥＰＯを用いて一過的にトランスフェクトされた細胞におけるＥＰＯ産生を示す。 図４６は、ＨｅｐＧ２（ＡＦＰ＋ｖｅ）細胞およびＫＬＮ２０５（ＡＦＰ−ｖｅ）細胞における種々のＡＦＰ構築物についてのＮＴＲ発現を検出するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図４７は、ＣＴＬ１０２／ＣＴＬ２０８を用いる腫瘍内注射後のＨｅｐＧ２腫瘍および宿主マウス肝臓におけるＮＴＲ発現を示す。 図４８は、ＣＴＬ１０２／ＣＴＬ２０８を用いる腫瘍内注射およびＣＢ１９５４投与後のＨｅｐＧ２腫瘍の増殖阻害を示す。 図４９は、ベクターＣＥＴ２００およびＣＥＴ２１０の構造の概略図である。 図５０は、ｈｎＲＮＰ Ａ２内在性ゲノム遺伝子座に対する比較において生成される構築物および使用されるフラグメントを示す。 図５１は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたＨｅＬａ集団の蛍光の中央値を用いるＦＡＣＳ分析のグラフを示す。 図５２は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。 図５２は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。 図５２は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。 図５２は、非複製プラスミドを用いて一過的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞集団の代表的な低倍率視野を示す。

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