JP5051738B2 - 人工遍在的クロマチン開放エレメント（ｕｃｏｅ） - Google Patents
人工遍在的クロマチン開放エレメント（ｕｃｏｅ） Download PDFInfo
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、天然には存在しない、遍在的クロマチン開放エレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞、および治療におけるこのポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用、またはインビトロでのタンパク質発現適用のためのこのポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」に組織化されているということを仮定する１、２。クロマチンドメインは、濃縮されて「閉鎖した」転写的にサイレントな状態であるか、または濃縮されておらず「開放して」かつ転写的に有能な配置であるかのいずれかで存在すると考えられている。ＤＮａｓｅＩ感受性の上昇、ＤＮＡの低メチル化およびヒストン高アセチル化によって特徴付けられた、開放クロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始に対して予め必須であるとみなされている。
【０００３】
クロマチン領域の開放特性および閉鎖特性は、宿主細胞ゲノム中に無作為に組み込まれる導入遺伝子のふるまいに反映される。同一の構築物は、マウスゲノム中の異なる位置で組み込まれる場合、異なるパターンの組織特異的発現および発生段階特異的発現を与える３〜５。位置効果ふ入り（ＰＥＶ）として公知である、所定のトランスジェニックマウス組織内のふ入りの発現パターンはまた、頻繁に観察される６。外因性遺伝子が哺乳動物細胞培養物の染色体中にインビトロで組み込まれる場合、多くの組み込み事象は、導入遺伝子の迅速なサイレンシングを生じ、残りは、発現レベルにおける大きな変動性を与える７、８。これらの位置効果は、基礎研究適用および生物工学適用の両方に関連して、導入遺伝子発現を無能にする。
【０００４】
遺伝子組織化のクロマチンドメインモデルは、転写的に有能な開放したクロマチン構造を確立および維持し得る遺伝的制御エレメントがゲノムの活性領域に結合するはずであることを示唆する。
【０００５】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、広範囲のクロマチン再構築能を有する転写調節エレメントのクラスである。ＬＣＲは、組み込み部位に依存せず、導入遺伝子コピー数に依存する、ｃｉｓで連結された遺伝子（特に、単一コピーの導入遺伝子）における生物学的レベルの発現を付与するそれらの能力により、トランスジェニックマウスにおいて機能的に規定される９、１０。決定的に、このような発現は、組織特異的である。ＬＣＲは、ヘテロクロマチンの広がりを遮断し得、ＰＥＶ６を阻止し得、そして一連のＤＮａｓｅＩ高感受性（ＨＳ）部位からなり、これらの部位は、これらが調節する遺伝子の５’側または３’側のいずれかに位置され得る１０。
【０００６】
ＬＣＲは、２つの別々の（しかし必要ではない）独立した成分から構成されるようである。第一に、開放クロマチンドメインの確立、第二に、導入遺伝子コピー数依存的発現を付与する、優勢な転写活性化能９。ＬＣＲがその機能を発揮する分子機構は、論点が残ったままである２、１１〜１３。
【０００７】
高レベルの治療タンパク質産物を産生する培養哺乳動物細胞株の生成は、主要な発達産業である。クロマチン位置効果は、これを困難な、時間のかかる、そして高価なプロセスにする。このような哺乳動物「細胞工場」の生成に対する、最も一般的に使用されるアプローチは、薬物耐性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ、グルタミン合成酵素（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：５３７−５６６（本明細書中に参考として援用される））およびストリンジェントな選択圧の持続（ｍａｉｎａｔｅｎａｎｃｅ）の組合わせによって誘導される遺伝子増幅に依存する。高度に発現された遺伝子ドメイン由来のＬＣＲを含むベクターの使用（適切な組織由来の細胞を使用する）はこの手順を非常に単純にする（Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：９９７−１００３；Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６：１２４−１３１（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【０００８】
しかし、ＬＣＲの組織特異性はまた、いくつかの環境において有用ではあるが、多くの適用（例えば、発現が必要とされる組織に対するＬＣＲが知られていない場合、または多くのもしくは全ての組織で発現が必要とされる場合）に対して重大な制限である。
【０００９】
本発明者らの同時係属特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（ＷＯ ００／０５３９３）（本明細書中に参考として援用される）は、遍在的に発現したハウスキーピング遺伝子から排他的になる、遺伝子座を横切る開放クロマチン構造の確立を担うエレメントを記載する。これらのエレメントは、ＬＣＲに由来しない。本発明は、遍在的クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関し、このＵＣＯＥは、クロマチンを開放させるかまたはクロマチンを開放状態で維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結されている遺伝子の再現可能な発現を容易にし、ここで、このポリヌクレオチドは、遺伝子座制御領域に由来しない。
【００１０】
メチル化のないＣｐＧ島は、当該分野において周知であり（Ｂｉｒｄら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４０：９１−９９、ＴａｚｉおよびＢｉｒｄ（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：９０９−９２０）、そしてＣｐＧ二ヌクレオチドを平均含量（約６０％）より多く含む、ＣｐＧに富んだＤＮＡ領域として規定され得る。この領域は、シトシン残基がメチル化されておらず、そして密接に区切られ（０．１〜３ｋｂ）分岐転写された２つの遺伝子の５’末端にわたって伸長する。ＤＮＡのこれらの領域は、全ての組織において発達の間中メチル化されないままである（ＷｉｓｅおよびＰｒａｖｔｃｈｅｖａ（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６０：２５８−２７１）。これらは、遍在的に発現された遺伝子全ておよび組織制限された発現プロフィールを示す遺伝子の約４０％の５’末端と結合され１６、１７、そして活性なクロマチンの限局領域として公知である１８。
【００１１】
「伸長した」メチル化のないＣｐＧ島は、メチル化のないＣｐＧ島であり、１つより多い転写開始部位を含む領域を横切って伸長する、および／または３００ｂｐより長く、好ましくは５００ｂｐより長く伸長する。伸長したメチル化のないＣｐＧ島の境界は、配列でＤＮＡを消化（切断）する能力は、存在するＣｐＧ残基のいずれかのメチル化状態に感受性である。このような酵素の１つは、ＨｐａＩＩであり、これは、ＣｐＧ島内に一般に見られる部位ＣＣＧＧを認識しそして部位ＣＣＧＧで消化するが、これは、中央のＣＧ残基がメチル化されていない場合のみである。従って、ＨｐａＩＩ消化したＤＮＡを用いてＨｐａＩＩ部位を保有する領域にわたって実施したＰＣＲは、このＤＮＡがメチル化されていない場合は、ＨｐａＩＩ消化に起因して増幅産物を与えない。このＰＣＲは、このＤＮＡがメチル化されている場合にのみ増幅産物を与える。従って、メチル化のない領域以外は、ＨｐａＩＩがＤＮＡを消化せず、ＰＣＲ増幅産物が観察され、これにより、「伸長したメチル化のないＣｐＧ島」の境界を規定する。
【００１２】
本発明者らは、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）／プロテオソーム成分Ｂ−１（ＰＳＭＢ１）および異種核リボヌクレオタンパク質Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２）／ヘテロクロマチンタンパク質 １ＨＳγ（ＨＰ１ＨＳγ）遺伝子座由来の、双方向に分岐転写されるプロモーターを含むメチル化のないＣｐＧ島にわたる領域が、再現可能な生理学的レベルの遺伝子発現を与えること、そしてこれらは、ふ入りの発現パターンおよび動原体へテロクロマチン内での導入遺伝子組み込みとともに正常に生じるサイレンシングを阻止し得ることを示した。
【００１３】
本発明者らは、活性に転写するプロモーターと結合するメチル化のないＣｐＧ島が、クロマチンを再構築する能力を有すること、よってこのＣｐＧ島が、ハウスキーピング遺伝子座で開放ドメインを確立および維持させる際の第一の決定要因であると考えられていることを示した。
【００１４】
ＵＣＯＥは、導入遺伝子発現のレベルおよび安定性における改善を伴う生産性遺伝子送達事象の割合の増加を付与する。これは、トランスジェニック動物の生成および培養細胞における組換えタンパク質の産生を含む、重要な研究および生物工学的適用を有する。本発明者らは、ＣＭＶ−ＥＧＦＰレポーター構築物の発現に対するＵＣＯＥの有利な効果、および分泌性の薬学的に価値のあるタンパク質エリスロポエチンに対するＵＣＯＥの有利な効果を示した。ＵＣＯＥの特性はまた、遺伝子治療における有用性を示唆し、この有効性は、低頻度の生産性遺伝子送達事象ならびに不十分な発現レベルおよび発現持続によってしばしば限定される４５。
【００１５】
これらの有意な関連および広範な適用を考慮すると、導入遺伝子発現レベルをさらに最適化すること、および長期化した培養期間にわたる遺伝子発現の改善された安定性の達成が所望される。
【００１６】
特に必要なことの１つは、いくつかの天然に存在するＵＣＯＥにおいて観察される方向性の偏向を克服することである。ＵＣＯＥは作動可能に連結されているプロモーターに対して位置非依存的転写増強を付与するが、これは、ある程度、方向依存的である（すなわち、ＵＣＯＥは、一方向において他方向よりも有意により効果的である）。いくつかの環境下（例えば、２つの発現単位（これらの間に位置したＵＣＯＥで分岐転写される）を含む発現ベクター）において、天然のＵＣＯＥを有し得ない両方のプロモーターから均衡のとれた高レベルの発現を得ることができるという利点が存在する。従って、両方の方向に効果的な人工的に構築されたＵＣＯＥの必要性が存在する。
【００１７】
（発明の説明）
本発明に従って、ＵＣＯＥを含むポリヌクレオチドが提供される。ＵＣＯＥは、クロマチンを開放するかまたは開放状態でクロマチンを維持し、そして作動可能に連結されている遺伝子の少なくとも２つの異なる組織型の細胞における再現可能な発現を容易にし、ここで、このＵＣＯＥのヌクレオチド配列は、天然には存在しない。
【００１８】
少なくとも２つの遺伝子由来の調節配列を含むゲノム領域は、長期の培養期間にわたって遺伝子発現が顕著に増強されたキメラＵＣＯＥを形成するように合わせられた。このようなキメラＵＣＯＥは、天然には存在しないヌクレオチド配列を構成する。従って、句「天然には存在しない」は、ＵＣＯＥを構成するエレメントのヌクレオチド配列がそれ自体天然には存在せず、そして天然に存在する配列および／または人工的に生成された配列の組合わせである、人造（ｍａｎ−ｍａｄｅ）または人工的に構築されている状態をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「人工」、「人工的に構築された（構築される）」、「キメラ」などは、ＵＣＯＥを参照する場合、ＵＣＯＥまたはＵＣＯＥを構成するエレメントが天然には存在しない（すなわち、「天然には存在しない」）ことを意味するように、全体を通じて相互交換可能に使用される。ＵＣＯＥが天然に存在する配列の組合わせである場合、これは、非天然であるＵＣＯＥへの配置または組織化である。非限定的な例示によって人工ＵＣＯＥは、通常は共通せず（染色体の異なる領域由来、異なる染色体由来、異なる生物由来など）、かつ非天然組織化において一緒に持ち込まれてキメラまたは人工ＵＣＯＥを作製する、かつ２つの天然に存在する配列からなり得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「人工的に合成された（合成される）」および「人工的に生成された（生成される）」は、ＵＣＯＥにおける配列を参照する場合、非天然の配列（すなわち、天然には存在せずそして全体的に合成されている配列）をいう。このような「人工的に合成された（合成される）」配列および「人工的に生成された（生成される）」配列はまた、人工ＵＣＯＥを作成または作製するために天然に存在する配列と結合され得る。
【００２１】
本発明の代替の局面に従って、以下から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸分子が提供される：
ｉ）図２または図７に示されているようなＤＮＡ配列；
ｉｉ）本発明に従うポリペプチドをコードする、図２または図７に示されている配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、図２または図７に示されている配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニーリングする単離された核酸分子が提供される。
【００２３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件／洗浄条件は、当該分野において周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける６０℃での洗浄後に安定である核酸ハイブリッド。核酸の配列が既知である場合、最適なハイブリダイゼーション条件が算出され得ることは当該分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに供される核酸のＧＣ含量によって決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈを参照されたい。特定の相同性の核酸分子間でのハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を算出するための一般式は：
【００２４】
【化１】
である。
【００２５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている遺伝子の組織非特異的に再現可能な発現を容易にする。
【００２６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、活性な遺伝子発現が生じる組織型全てにおける作動可能に連結されている遺伝子の再現可能な発現を容易にする。
【００２７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている遺伝子の生理学的レベルでの発現を容易にする。
【００２８】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、伸長したメチル化のないＣｐＧ島を含む。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子発現の制御に関連する１つ以上の天然に存在する配列を含む。
【００３０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の天然に存在するプロモーターを含む。
【００３１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、分岐転写される双方向性プロモーターまたは二方向性のプロモーターを含む。
【００３２】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。
【００３３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントにわたる、１００ｂｐ〜３ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００３４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。
【００３５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントにわたる、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００３６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、このフラグメントは、分岐して配向したそのプロモーターに直接隣接する。
【００３７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、２ｋｂのＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、このフラグメントは、分岐して配向したそのプロモーターに直接隣接する。
【００３８】
さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、いずれかの方向において図２の配列またはそのフラグメントを含む。
【００３９】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ヒトＲＮＰ ＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。
【００４０】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ヒトＲＮＰ ＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる４ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。
【００４１】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、メチル化のないＣｐＧ島を含む少なくとも１つのさらなる配列に隣接する二方向性プロモーターを含む、伸長したメチル化のないＣｐＧ島を含む。
【００４２】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ヒトＲＮＰ ＣｐＧ島／プロモーター領域、およびヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００４３】
さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、図７の配列またはそのフラグメントをいずれかの方向で含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、１つ以上のプロモーター配列を含む。
【００４４】
いくつかの環境下で、転写開始が、上流のプロモーターからの読み取り中の転写物によって阻害され得ることは、当該分野において公知である（ＹｏｕｓｓｏｕｆｉａｎおよびＬｏｄｉｓｈ（１９９３）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｂｙ ａｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３（１）９８−１０４）。従って、本発明の１つの実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含み、ここで、１つ以上のプロモーター配列が、転写を開始し得ないように変異されている。
【００４５】
好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１α、ＲＳＶ ＬＴＲまたはＨＩＶ２ ＬＴＲまたはこれら由来の配列の組合わせより選択される。より好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。最も好ましくは、プロモーターは、マウスＣＭＶプロモーターである。
【００４６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、人工的に合成されている少なくとも１つの配列を含む。
【００４７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００４８】
好ましくは、このベクターは、真核生物遺伝子発現に適応された発現ベクターである。
【００４９】
典型的には、この適応としては、細胞／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給が例示として挙げられるが限定の目的ではない。
【００５０】
プロモーターおよびエンハンサーは、当該分野において周知の用語であり、例示のみによって提供され、限定の目的ではない以下の特徴を含む。プロモーターは、転写の開始に直接連結された５’のｃｉｓ作動性調節配列である。プロモーターエレメントとしては、いわゆるＴＡＴＡボックス、および転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列が挙げられる。これらの配列はまた、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドと結合する。
【００５１】
エンハンサーエレメントは、しばしば遺伝子の転写開始部位の５’側に見られるｃｉｓ作動性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’側に見られ得るかまたは内部配列にさえ位置され得、よって独立した位置である）。エンハンサーは、このエンハンサーが連結される遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているｔｒａｎｓ作動性転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性は、例示として挙げられるが限定の目的ではない、以下の多くの環境因子（ｃｕｅ）に応答性である：中間代謝物（例えば、グルコース）、環境エフェクター（例えば、熱）（Ｄａｖｉｄ Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎによる、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。
【００５２】
適応はまた、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおいて上記ベクターの維持を容易にする選択マーカーおよび自律的複製配列の供給を含む。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターといわれる。エピソームベクターは、自己複製しそのため組み込みの必要なく持続するので望ましい。この型のエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載される。
【００５３】
遺伝子をコードするベクターの発現を容易にする適応は、転写終止配列／ポリアデニル化配列の供給を含む。これはまた、二シストロン性の発現カセットまたは多シストロン性発現カセット中に配置されるベクターコード遺伝子の発現を最大限にするように機能する内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の供給を含む。
【００５４】
これらの適応は、当該分野において周知である。発現ベクター構築物および組換えＤＮＡ技術に関する刊行された文献が、一般に多数存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ、およびこれに記載される参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００５５】
好ましくは、ベクターは、プロモーターおよび前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている発現可能な遺伝子を含む。
【００５６】
好ましくは、ベクターは、エピソームベクターまたは組み込みベクターである。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、プラスミドである。
【００５８】
あるいは、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスのようなウイルスであり得る。
【００５９】
好ましくは、作動可能に連結されている遺伝子は、治療用核酸配列である。
【００６０】
好ましくは、ベクターは、発現されるべきオープンリーディングフレームの２つの挿入部位を含み、このオープンリーディングフレームの各々は、異なるプロモーターから転写され、このプロモーターは、分岐転写するように配置されており、そしてこのプロモーターの両方は、これらの間に位置付けられた人工的に構築されたＵＣＯＥに作動可能に連結されており、このＵＣＯＥは、両方向において有効であるように構築されている。このベクターは、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（免疫グロブリンを含むがこれに限定されない）の産生に特に有用である。このベクター中の挿入部位は、目的の異なるポリペプチド（免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードするオープンリーディングフレームを含むがこれに限定されない）をコードする核酸で挿入され得る。
【００６１】
好ましくは、ベクターは、図２の配列、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメント下で選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む。ＵＣＯＥが両方向で挿入され得ることは、当業者に明らかである。
【００６２】
好ましくは、人工ＵＣＯＥを含むベクターは、図３ａに概略的に示されているＣＥＴ５００である。
【００６３】
代替の実施形態において、ベクターは、図３ｂに示されているＣＥＴ５０１である。
【００６４】
あるいは、ベクターは、図７ａの配列、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメント下で選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む。同様に、人工ＵＣＯＥが両方向で挿入され得ることは、当業者に明らかである。
【００６５】
この代替の好ましい実施形態において、人工ＵＣＯＥを含むベクターは、図８ａに概略的に示されているＣＥＴ６００として知られる。
【００６６】
さらに代替の実施形態において、図８ｂに概略的に示されているＣＥＴ６０１である。
【００６７】
本発明はまた、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００６８】
本発明はまた、治療に使用するための、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明はまた、遺伝子治療に使用するための組成物を製造するための、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【００７０】
本発明はまた、処置方法を提供し、この方法は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の薬学的有効量を、このような処置の必要な患者に投与する工程を包含する。好ましくは、この患者は、遺伝子治療によって処置され得る疾患を罹患している。
【００７１】
本発明はまた、疾患を処置するための治療あるいは有利なタンパク質または機能を特定の組織の細胞に提供するための治療のために、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞を、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈剤と合わせて含む薬学的組成物を提供する。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞、あるいは薬学的組成物は、全身性筋肉内投与、静脈内投与、エアロゾル投与、経口投与（固体形態または液体形態）、局所投与、眼内投与、直腸投与、腹腔内投与ならびに／または鞘内注射および局所直接注射を含む経路を介して投与され得る。
【００７３】
正確な投薬量レジメンは、もちろん個々の患者に対して個々の臨床医によって決定される必要があり、これは言い換えると、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質および処置について標的化される組織型の正確な特徴によって制御される。
【００７４】
投薬量はまた、疾患徴候および投与経路に依存する。用量の数は、その疾患および臨床試験からの効力データに依存する。
【００７５】
本発明に従う効果的な遺伝子治療のために送達されるポリヌクレオチドまたはベクターＤＮＡの量は、好ましくは、体重１ｋｇあたりのベクターＤＮＡが５０ｎｇ〜１０００μｇの間の範囲であり；そしてより好ましくは、体重１ｋｇあたりのベクターＤＮＡが約１〜１００μｇの間の範囲である。
【００７６】
インビボでの細胞取り込みのために、哺乳動物にポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を、本発明に従って投与することが好ましいが、エキソビボでのアプローチが利用され得、これにより細胞は、動物から取り出され、ポリヌクレオチドまたはベクターで形質導入され、次いで、その動物に再移植される。例えば、肝臓は、動物より肝細胞を取り出し、インビトロでこの肝細胞を形質導入しそしてこの形質導入された肝細胞をこの動物に再移植することによる、（例えば、ウサギについては、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、１９９１、または、ヒトにおいては、Ｗｉｌｓｏｎによる、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１７９−２２２、１９９２に記載されるような）エキソビボアプローチによって作業され得る。このような方法はまた、循環系またはリンパ系における細胞（例えば、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および造血幹細胞）の種々の集団に送達するために効果的であり得る。
【００７７】
本発明の別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を使用する遺伝子治療の効力を決定するための哺乳動物モデルを提供する。この哺乳動物モデルは、その細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を含む。トランスジェニックマウス（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０（１９８０）；Ｈａｒｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：５４０（１９８１）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５０１６（１９８１）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６３７６（１９８１））、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックブタ、トランスジェニックニワトリ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（１９８５）を参照のこと）などの作製方法は、当該分野において周知であり、そして本発明に従う使用のために意図される。このような動物は、ヒトへの臨床試験の前の試験を可能にする。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物はまた、目的のタンパク質を長期間生成するために使用され得る。
【００７９】
本発明はまた、細胞培養系において所望の遺伝子産物を得るための、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞の使用を提供する。適切な細胞培養系は、当該分野において周知であり、当業者に公知の文献の本文中に十分記載されている。
【００８０】
本発明はまた、内因性遺伝子と作動可能に結合される位置で、細胞のゲノム中にポリヌクレオチドを挿入し、これにより遺伝子の発現レベルを増加させる工程を包含する、内因性遺伝子の発現を増加させるためのポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００８１】
本発明はまた、トランスジェニック植物を生成する際の、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００８２】
収量、抵抗性などを増加させたトランスジェニック植物の生成は、当業者に周知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。人工ＵＣＯＥを含む細胞のいくつかまたは全ては、植物よりもたらされ得る。
【００８３】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００８４】
本発明はまた、機能的なゲノム適用における本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能的なゲノムは、主に、特定の細胞型または疾患状態において特異的に発現される遺伝子の配列決定に関し、そしてここで、薬物発見目的または遺伝子治療目的のために可能な目的の何千もの新規遺伝子配列を提供する。新規治療の開発のためにこの情報を使用する際の主要な問題は、これらの遺伝子の機能をいかに決定するかにある。ＵＣＯＥは、遺伝子配列の機能を決定するために、多くの機能的なゲノム適用において使用され得る。本発明の機能的なゲノム適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
（１）アンチセンスバージョンの遺伝子配列またはリボザイムをノックダウンしたライブラリーの持続した発現を達成するために、本発明のポリヌクレオチドを使用して、これにより遺伝子または細胞の表現型を不活化する効果を決定すること。
（２）遺伝子配列についての発現ライブラリーを調製するために、本発明のポリヌクレオチドを使用して、その結果、細胞への送達が、遺伝子配列の信頼できる、再現可能な、持続した発現を生じること。この遺伝子配列を発現する、生じた細胞は、機能決定および薬物発見のための種々のアプローチにおいて使用され得る。例えば、遺伝子産物に対する中和抗体を惹起させること；構造研究、機能研究または薬物スクリーニング研究において使用するための、その遺伝子自体のタンパク質産物の迅速な精製；または細胞ベースの薬物スクリーニング。
（３）マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）およびトランスジェニックマウスを含むアプローチにおいて、本発明のポリヌクレオチドを使用すること。最も強力な機能的なゲノムアプローチの１つは、発現された遺伝子の挿入に続く薬物選択のみを可能にし、そして配列決定のために容易にレスキューされ得る構築物の、マウスＥＳ細胞中の遺伝子への無作為な挿入を含む（Ｇ．Ｈｉｃｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６，３３８−３３４）。次いで、新規配列を有する遺伝子中にノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスを、これらの機能をプローブするために容易に作製し得る。現在、この技術は、マウスＥＳ細胞中に十分発現されているマウス遺伝子の１０％について、十分作用する。組み込み構築物へのＵＣＯＥの取り込みによって、この技術を拡張してマウス中に発現した遺伝子全てを同定し得る。
【００８５】
本発明の代替の実施形態において、以下の工程：
ｉ）本発明に従う核酸分子で形質転換／トランスフェクトされた細胞を提供する工程；
ｉｉ）このポリペプチドの生成を導く条件下でこの細胞を増殖させる工程；および
ｉｉｉ）細胞またはその増殖環境からこのポリペプチドを精製する工程
を包含する、本発明に従うポリペプチドの産生のための方法が提供される。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明に従うベクターである。
【００８７】
本発明の好ましい方法において、上記ベクターは、上記ポリペプチドの精製を容易にするための選択シグナルをコードし、つまり上記ポリペプチドは、このような選択シグナルとともに提供される。
【００８８】
あるいは、他の好ましい実施形態は、発現した組換えタンパク質の精製を容易にするためのさらなる改良（例えば、親和性タグまたはエピトープ、あるいは酵素切断部位）を含み得る。
【００８９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、付随する図面を参照して例示の目的でのみここで記載される。
【００９０】
（実施例１：ＵＣＯＥフラグメントの異種性組合わせ）
本発明者らは、４．０ＣＭＶ構築物および８．０ＣＭＶ構築物におけるＡ２／ＨＰ１フラグメントと、ＴＢＰ／Ｂ１遺伝子座由来の匹敵する領域との置換が、ｈＣＭＶプロモーターからのＥＧＦＰ発現のレベルおよび安定性が実質的に増加することを見出した。組織培養細胞におけるこれらの知見は、伸長したＣｐＧ島および分岐転写したプロモーターを含むＤＮＡ領域が、生存可能な組み込み事象の割合の増加、有意に改善された導入遺伝子発現および動原体性へテロクロマチンからの転写的サイレンシングに対する耐性を付与することを担うという証拠を提供する。
【００９１】
単一のプロモーターに結合したハウスキーピング遺伝子由来のＣｐＧ島を含むゲノム領域を、合わせた。この構築物は、ヒトＰＤＣＤ２遺伝子の５’末端由来のＣｐＧ島を含む３．２ｋｂフラグメントに連結した、ヒトβ−アクチン遺伝子の５’末端由来の２ｋｂのＣｐＧ島３７を含む。これらのプロモーターは、分岐転写され、そしてこれらの転写開始部位は、１．９ｋｂ隔てられている。
【００９２】
次いで、全体で５．２ｋｂの組合わせを、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰレポーター遺伝子に連結した（ＰＤＣＤ２／アクチン）。比較として、β−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域単独をまた、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ発現ベクター（ＡＣＴＩＮ）の上流に挿入した。
【００９３】
（材料および方法）
図２を特に参照して、ＣＭＶプロモーターを、ＡｓｅＩおよびＮｈｅＩでの消化によってｐＥＧＦＰ−Ｎ１から除去して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、再ライゲーションしてｐΔ−ＥＧＦＰ−Ｎ１を生成した。β−アクチンプロモーターＥＧＦＰ融合物を、ＭＡ３９（ＨＳＡＣＣＹＢＢ）をＢｓｍＩおよびＮｃｏＩで消化し、適切なフラグメントを単離し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化することによって構築した。このフラグメントを、ＡｇｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＳｍａＩで消化したｐΔ−ＥＧＦＰ−Ｎ１に連結した。これは、β−アクチン遺伝子の第一コドンとＥＧＦＰとのインフレームでの融合物を生成し、この発現は、β−アクチンプロモーター／ＭＦＩ（メチル化のない島）を駆動しなかった。この構築物（ｐＡｃｔｉｎ−ＥＧＦＰ）は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯＫ１細胞中でＥＧＦＰを発現することが示された。
【００９４】
二方向性のプロモーターおよび伸長したメチル化のない島を有するベクターを構築するために、ＰＤＣＤ２遺伝子およびそのプロモーターのいくつかを、ＳｗａＩおよびＢｓｐＥＩでの消化によってｐＣＰ２−ＴＮＮ（ｐＣＹＰＡＣ−２中のＴＢＰ遺伝子座の約１６０ｋｂ）から最初に除去し、ＥｃｏＲＶおよびＸｍａＩで消化してあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋にサブクローニングした（ｐＰＤＣＤ２−ＫＳ）。このベクターはＰＤＣＤ２のメチル化のない島の全体を含まないので、ＰＤＣＤ２のメチル化のない島の残りの５’領域（これもまたプロモーターを含む）を、以下のプライマー：
【００９５】
【化２】
を使用するＰＣＲによってｐＣＰ２−ＴＮＮから得た。次いで、ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩ（ＰＣＲプライマーで生成した部位）およびＳｔｕＩ（内部部位）で消化し、ｐＡｃｔｉｎ−ＥＧＦＰを、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてＰＤＣＤ２遺伝子を、ＳａｌＩおよびＳｔｕＩでの消化によってｐＰＤＣＤ２−ＫＳから除去した。３つのフラグメント全てを一緒に連結して、ｐＰＤＣＤ２−Ａｃｔｉｎ−ＥＧＦＰを作製した。
【００９６】
ｐＦ−ＰＤＣＤ２−Ａｃｔｉｎ−ＥＧＦＰのメチル化のない島を含む領域を、ＮｃｏＩフラグメント（約５．２ｋｂ）として除去し、これをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで、ＡｓｅＩで消化した後に平滑末端化したｐＥＧＦＰＮ−１に両方向で連結した。これらのベクターを、ＣＥＴ５１０（順方向でのＵＣＯＥ）およびＣＥＴ５１１（逆方向でのＵＣＯＥ）と呼んだ。マルチクローニングサイトに挿入される導入遺伝子を含まない対応する空の発現ベクターを、それぞれＣＥＴ５００およびＣＥＴ５０１と称した（図３を参照）。
【００９７】
構築物を、ＰｖｕＩで線状化し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、そしてＧ４１８選択下（０．６ｍｇ／ｍｌ）で両方の実験について選択した。
【００９８】
当業者が、これらの手順を本発明の他のポリヌクレオチドの調製および試験に適応し得ることは、理解される。
【００９９】
（結果）
図４および５に示すように、人工ＵＣＯＥ構築物は、メジアン蛍光に関して、８ｋｂ ＲＮＰ／ＨＰ−１ ＵＣＯＥで達成されるレポーター遺伝子発現のレベルに匹敵し、そして実験の時間経過にわたって発現する細胞の割合に関してわずかに勝るレポーター遺伝子発現のレベルを与えた。
【０１００】
（実施例２：ＵＣＯＥおよびメチル化のないＣｐＧ島フラグメントの異種性組合わせ）
（材料および方法）
アクチンのメチル化のない島を、ＮｃｏＩでの消化によってｐＡｃｔｉｎ−ＥＧＦＰから除去し、平滑末端化した後に、ＫｐｎＩで消化した。ＲＮＰの４ｋｂフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってＣＥＴ２０から除去した。次に、ＣｌａＩで消化し、平滑末端化し、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩで切断してあるｐＢＫＳに、これら２つのフラグメントを、連結した。これによって、ｐＢＫＳ中に人工ＵＣＯＥを得た。
【０１０１】
次いで、人工ＵＣＯＥを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりｐＢＫＳより除去し、平滑末端化し、ＡｓＩで消化されて平滑末端化されてあるｐＥＧＦＰ−Ｎ１に連結した。ＵＣＯＥを両方向で挿入してＣＥＴ６１０およびＣＥＴ６１１をそれぞれ作製した。マルチクローニングサイトに導入遺伝子が挿入されていない対応する発現ベクターを、それぞれＣＥＴ６００およびＣＥＴ６０１と称した（図８を参照のこと）。
【０１０２】
構築物を線状化し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、そして実験期間にわたってＧ４１８（０．６ｍｇ／ｍｌ）選択下で選択した。
【０１０３】
（結果）
導入遺伝子発現のレベルに対する人工ＵＣＯＥ（両方向での）効果を、ＣＭＶプロモーター単独、および８ｋｂ ＲＮＰ／ＨＰ−１ ＵＣＯＥ（両方向での）を用いて得た結果と比較することによって、評価した。図９は、ＦＡＣＳ分析におけるメジアン蛍光の点では、ＣＭＶプロモーター単独が、非常に低いレベルの発現を与えたことを示す。ＲＮＰ ＵＣＯＥ（ＣＥＴ２２０）および人工ＵＣＯＥ（ＣＥＴ６００）の両方は、順方向で非常に増加した（３０倍）発現を与え、そして同等である。しかし、ＲＮＰ ＵＣＯＥで見られる方向の偏りは、人工ＵＣＯＥで見られるものよりかなり劣る（すなわち、逆方向では、人工ＵＣＯＥが優れていたが、順方向ではいずれのＵＣＯＥよりわずかに劣っていた）。これは、長期にわたって（１２０日より長く）全体的な発現レベルおよび発現を維持する能力の両方についてあてはまる。
【０１０４】
長期間発現を維持する細胞の割合に関して同一の実験を分析した場合、両方のＵＣＯＥは、両方向において、ＣＭＶ単独より一貫してよい結果（実験の初期に発現する細胞数の約２倍）を与えた。この差異は、より長期間にわたってより著しくなり、ＣＭＶのみの集団は、発現する細胞を徐々に失い、１２０日目までに約１０％の細胞のみがなお発現した。このことは、順方向において両方のＵＣＯＥの約９０％が維持され、そして実験の終わりまでに逆方向においてわずかに低いレベル（７５〜８５％）のみであることと対照的である。
【０１０５】
（実施例３：同一のベクター上の２つの遺伝子の同時発現）
効率的な機能的抗体産生は、重鎖および軽鎖の適切にバランスのとれた発現を必要とする。２つの鎖を別々のプラスミドでトランスフェクトすることによって、等しいコピー数を維持することは困難となり、そしてこれらのベクターがゲノムに互いに近接して組み込まれる場合、これらの遺伝子間の潜在的な転写的干渉が提供される。
【０１０６】
同一のベクターでの２つの遺伝子の同時発現のための一連の新たなベクターを、耐性マーカーとしてｎｅｏ対ｐｕｒｏ、そして軽鎖発現または重鎖発現を駆動するためのｈＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーターまたはｍＣＭＶプロモーターを比較するために構築した（図１１）。
【０１０７】
（材料および方法）
ｐＯＲＴ１（Ｃｏｂｒａ）の２つのＳｆｉＩ部位を、アニーリングしたオリゴ：
【０１０８】
【化３】
からなるアダプター分子の導入によってＭｆｅＩに変化させた。
【０１０９】
ＨＳＶ ＴＫポリＡ部位を、以下のプライマー：
【０１１０】
【化４】
を用いて、ｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅した。ＳａｌＩ〜ＸｈｏＩのフラグメントを、ＳａｌＩ部位に挿入した。マウスＰＧＫポリＡ部位を、以下のプライマー：
【０１１１】
【化５】
を用いて、雄性ＢＡＬＢ／ｃゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、そしてＢａｍＨＩ〜ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。
【０１１２】
２つのｎｅｏ発現カセットを含むｐｃＤＮＡ３．１のＡｓｅＩ〜ＳａｌＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳｐｅＩリンカー（５’−ＧＡＣＴＡＧＴＣ）に連結した。次いで、このＳｐｅＩフラグメントを、ＳｐｅＩ部位にクローニングしてｐＯＲＴｎｅｏＦを得るか、またはピューロマイシン耐性カセットを保有するＣＥＴ７００（Ｃｏｂｒａ）のＥｃｏＲＩ〜ＮｏｔＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＸｂａＩリンカーに連結し、そしてＸｂａＩフラグメントを、ＸｂａＩ部位にクローニングしてｐＯＲＴｐｕｒｏＦを得た。
【０１１３】
ｐＣＭＶＥＧＦＰＮ−１（Ｃｏｂｒａ）由来のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩのマウスＣＭＶプロモーターフラグメントを、ＢＫＳ＋（Ｃｏｂｒａ）におけるハイブリッドＵＣＯＥのＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。次いで、ヒトＣＭＶプロモーターを、以下のプライマー：
【０１１４】
【化６】
を用いてプラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、ＸｈｏＩ〜ＳａｌＩフラグメントを、ＳａｌＩ部位にクローニングした。次いで、ＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩフラグメントを、ｐＯＲＴｎｅｏＦのＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩ部位にクローニングし、ｐＢＤＵｎｅｏ１００を得るか、またはｐＯＲＴｐｕｒｏＦにクローニングしてｐＢＤＵｐｕｒｏ３００を得た。
【０１１５】
ＢＫＳ＋中のハイブリッドＵＣＯＥ中におけるＳａｌＩクローニング部位の上流にある２つのＡＴＧコドンを、部位特異的変異誘発によって変更し、そしてＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩフラグメントを、ｐＯＲＴｎｅｏＦのＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩ部位にクローニングし、ｐＢＤＵｎｅｏ２００を得るか、またはｐＯＲＴｐｕｒｏＦにクローニングしてｐＢＤＵｐｕｒｏ４００を得た。
【０１１６】
ヒト抗体軽鎖コード配列を、４つの二方向性ＵＣＯＥベクター（ｐＢＤＵｎｅｏ１００、ｐＢＤＵｎｅｏ２００、ｐＢＤＵｐｕｒｏ３００およびｐＢＤＵｐｕｒｏ４００）全てのＢａｍＨＩ部位またはＳａｌＩ部位のいずれかにクローニングした後、免疫グロブリン重鎖コード配列を、残りのＢａｍＨＩ部位またはＳａｌＩクローニング部位にクローニングして、ｐＢＤＵｎｅｏ１１２、ｐＢＤＵｎｅｏ１２１、ｐＢＤＵｎｅｏ２１２、ｐＢＤＵｎｅｏ２２１、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１１２、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１２１、ｐＢＤＵｐｕｒｏ２１２およびｐＢＤＵｐｕｒｏ２２１を得た。８つの抗体発現構築物全てを、製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、そして５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ｎｅｏベクター）または１２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ｐｕｒｏベクター）で選択した。
【０１１７】
プールを選択し、そして異なる構築物間で抗体産生速度を比較して、ＣＨＯ細胞における抗体産生のために最適なプロモーターと選択マーカーとの組み合わせを決定した。
【０１１８】
（結果）
表１は、マウスＣＭＶプロモーターから発現される軽鎖を含むベクターが抗体の最良の発現を与えたことを示す。Ｇ４１８耐性カセットまたはピューロマイシン耐性カセットを含むベクターで得られた産生速度の間に、顕著な差異は観察されなかった。別々に実施された同時トランスフェクション実験のプールからの産生速度を、比較した。３〜１８ｐｇ／細胞／日の産生速度を有するこのプールからのクローンを、単離した。しかし、５ｐｇ／細胞／日を超えるクローンは、不安定でありかつ発現を迅速に減少するかまたは産生を停止した。約５ｐｇ／細胞／日を発現するクローンを、最初の発酵実験について使用した。これらの予備的指標は、より速い産生速度が二方向性ＵＣＯＥベクター形質転換体から単離されたクローンにおいて観察されることを非常に奨励する。
（表１：二方向性のＵＣＯＥベクター由来ｈＡｂ１（ＩｇＧ４）の発現（ＣＨＯ−Ｋ１プール）
【０１１９】
【表１】
＊＊同時トランスフェクションを、各々４ｋｂ ＵＣＯＥ ＣＭＶベクターから駆動した同一の抗体遺伝子を使用して先のように実施した（ｈｙｄｒｏ選択およびｎｅｏ選択）。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> EMD MILLIPORE CORPORATION
<120> ARTIFICIAL UBIQUITOUS CHROMATIN OPENING ELEMENTS (UCOE)
<130> F103O91586
<140> JP 2002-529522
<141> 2001-09-20
<150> GB 0022995.5
<151> 2000-09-20
<150> US 60/252,048
<151> 2000-11-20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 5232
<212> DNA
<213> PDCD2/ACTIN ARTIFICIAL UCOE SEQUENCE
<400> 1
catggcacct gtattgtact cttatcagtc attatatgga ctttaacttc cccagatatt 60
atttgggctc ctccataaga ctgtgagcat ctgaccactg gagtgttgct tcccattata 120
tccctgttat caagcacaag gtcaggcaca gagtaagact caaaacatgt tttggaatgt 180
atgactggta tgaactacaa accagtaagc tgatgttttc attttgagtc tataaatcta 240
attttgtggt ggttttgtgt atggctcaag gctcaaattg taaaatttaa tattatgtga 300
ccaaagaaag ttatacccag aacctcaatt tcctcacctt caaaatgggg cagtttctca 360
ctcattggtc tgctgtcacg attttaatga gctcatgcac aaacagccct ttatataagg 420
taagtgctgg ataaatgttg gctactataa taaaataagc ctctaagata cttggtcagc 480
acaagtacta cccaagagta tgcactgtaa gtaaactgac aaaattgtgt atctaaaact 540
ggccagatga aagagaaact tttaaggggc ccttctgcgt gcccgacact gtgctaggca 600
ctcacactat cccgacccga gaaaccgatc tgcgacccag aggaacttac caagcctcca 660
gcatcttgtg cagccctact catgggacca tctggatacc cacccttgtc tttacaggga 720
gcagaacaca cctcttatgt gtcagaaaac aaagtccagg aagtatattt ttacctgagg 780
caatatctga aaattgtatg ctacagcctc caaagtgagt cttcctctca gtacctctct 840
tctaggcaca tggagccctt tcttccaagt attatgttta accacttaat gaatgaagtc 900
ctgaaactgc ttacccatgc tccctataat ctctgagtaa tcttcctttt ccacaacctc 960
aggcataatc tcatcttctg tttctattac aatttcaaat tctggaaaaa ggaagttgtg 1020
gtctggaatt atatggtcca gatgatctga aacaaaaagg acagcactat tagtaatcat 1080
ttagttttga agacagtcta ataatttgct gtctctaaag tactatattc cctatagttc 1140
tggcatttta gataaagggt cataaattaa atgcctatat ggtgacatta ttcagtgatt 1200
cagacttcac agcctttttt ttttttttac aaaggtgttc caggcatgaa aaattttaaa 1260
gtactatacc tttcctaatt ttacctttaa agttgtcctg gaaatatctg ggttgacaaa 1320
ggcgatgaaa ctgaactgag acttaaaaaa aagattaccc acctggttgt gcacaagcct 1380
gcttatgtcc caatctccag tctagggtct gatgctcctt gctgcagtaa tatgctttgt 1440
ggcatctgga gcacgttttg gggcctaaac agccacaaac cctgcagaga tgagcaccag 1500
acttaagctg gagacacact gattctcctg tttctggggg aggattctca gaaggtggct 1560
catatgagta aaaatcgttt ttcctgggta gttgattcct aaaaactaaa aaagaataca 1620
gagaaaagtt ttatcttcaa acaaaacagc aattcacata ttttatcctc tgcacgtaaa 1680
actgaaaata acaacaacaa aaaagaaatg aaagtttttg ctttcaggaa taagctttta 1740
aaatccagaa actagatttc gtccggtaca cgcaactgag ttgcctccta gaggtggttt 1800
gagttaatca aattaataag actgatcgtt aagaacgact gccaaaaata cgaaaaagct 1860
actgggatcc atctttccaa gacaatttct attatctgaa ttaacaccat acctggtacc 1920
cactgattaa aagctggggg ttaccaatgc gcgtgggcac agttagaagc ttatgtagca 1980
aaaatgagca catcctggaa gggcccggga gaaggtgctc ctggggcagc gcggagaggg 2040
agctctgagg ctggggcggc agcggtgctt gccgccgtcc ccctggtcgc tcccggaatt 2100
aacgccgcgc acgcgtcgga ggcatggccc cgtcccgacc ccgtttggcg gctcacctcg 2160
caggccggca cagcacggct gctcgcggca gcagaagagg aagatgcagc ggtggaaggc 2220
gtccgggcgg ccaggcagcg gcgcatacac ctgcagcagg aaggagagcg ggcggccgca 2280
cagctcgcag gccagggcct ggggccccgg cagcccggcc gcgcccagcc atgccggccg 2340
cccgcccacc ttgctgggga actgctcgct gcgcagtcgc cacgccggcg ccgactcggc 2400
gaagcccagc tccacaggcc tggccccggc ggcagccatg cggggcgcgg gctggcgtgg 2460
ggcgcagccc acagctgggt cggaaggcgg aaatcgggcg ccgggccgga aggcaagagg 2520
cgggcacctt tccggaggac aggaggcgga aacgcgtctg acgggagcgg ttgcaggacc 2580
aatgcgaggg aacggggcag aggaaacctc tcggcatcag ccccgcccct ggcgcctctg 2640
cctccgagcc gctttcctgg tgcctccggg tgctctggga tggttctggt ctttgggaga 2700
gtggcagctg gtgacggcgc tccgctcacc tctgcacatg tcttgctgtg ggcctgcggg 2760
tggccgccag ggaggcagag ccctcccgca aaccttccct gctggtgtcc acctcagggt 2820
gtgggaaacc tgtgcgctgg ccgagtgcta accaagagta ggcagtgaaa gacaaatgaa 2880
ggttgaacag gtaaagtgag gaccctacag cggaaaccaa gaatcctgtg tgcctgagag 2940
taatgaagaa gcctctgcag aagagtcttt tctgtcagtc ttaaggtctc tgttttaatg 3000
ttagtgctgg cttgctgtac ctgaattcca agggaggagt gtataatgag gcatggccaa 3060
cccccacttc ccatcattgc ctgaactagt ttttcaggtt aacttcagaa tgcccttggt 3120
accgcgggcc ccctctgtgg tcccacgcca ctgatcgctg catgcccacc acctgggtac 3180
acacagtctg tgattcccgg agcagaacgg accctgccca cccggtcttg tgtgctactc 3240
agtggacaga cccaaggcaa gaaagggtga caaggacagg gtcttcccag gctggctttg 3300
agttcctagc accgccccgc ccccaatcct ctgtggcaca tggagtcttg gtccccagag 3360
tcccccagcg gcctccagat ggtctgggag ggcagttcag ctgtggctgc gcatagcaga 3420
catacaacgg acggtgggcc cagacccagg ctgtgtagac ccagcccccc cgccccgcag 3480
tgcctaggtc acccactaac gccccaggcc tggtcttggc tgggcgtgac tgttaccctc 3540
aaaagcaggc agctccaggg taaaaggtgc cctgccctgt agagcccact tccttcccag 3600
ggctgcggct gggtaggttt gtagccttca tcacgggcca cctccagcca ctggaccgct 3660
ggcccctgcc ctgtcctggg gagtgtggtc ctgcgactct aatggccgca agccacctga 3720
ctcccccaac accacactct acctctcaag cccaggtctc tccctagtga cccacccagc 3780
acatttagct agctgagccc cacagccaga ggtcctcagg ccctgctttc agggcagttg 3840
ctctgaagtc ggcaaggggg agtgactgcc tggccactcc atgccctcca agagctcctt 3900
ctgcaggagc gtacagaacc cagggccctg gcacccgtgc agaccctggc ccaccccacc 3960
tgggcgctca gtgcccaaga gatgtccaca cctaggatgt cccgcggtgg gtggggggcc 4020
cgagagacgg gcaggccggg ggcaggcctg gccatgcggg gccgaaccgg gcactgccca 4080
gcgtggggcg cgggggccac ggcgcgcgcc cccagccccc gggcccagca ccccaaggcg 4140
gccaacgcca aaactctccc tcctcctctt cctcaatctc gctctcgctc tttttttttt 4200
tcgcaaaagg aggggagagg gggtaaaaaa atgctgcact gtgcggcgaa gccggtgagt 4260
gagcggcgcg gggccaatca gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat ggctcgagcg 4320
gccgcggcgg cgccctataa aacccagcgg cgcgacgcgc caccaccgcc gagaccgcgt 4380
ccgcccgcga gcacagagcc tcgcctttgc cgatccgccg cccgtccaca cccgccgcca 4440
ggtaagcccg gccagccgac cggggcatgc ggccgcggcc cttcgcccgt gcagagccgc 4500
cgtctgggcc gcagcggggg gcgcatgggg cggaaccgga ccgccgtggg gggcgcggga 4560
gaagcccctg ggcctccgga gatgggggac accccacgcc agttcgcagg cgcgaggccg 4620
cgctcgggcg ggcgcgctcc gggggtgccg ctctcggggc gggggcaacc ggcggggtct 4680
ttgtctgagc cgggctcttg ccaatgggga tcgcacggtg ggcgcggcgt agcccccgtc 4740
aggcccggtg ggggctgggg cgccatgcgc gtgcgcgctg gtcctttggg cgctaactgc 4800
gtgcgcgctg ggaattggcg ctaattgcgc gtgcgcgctg ggactcaatg gcgctaatcg 4860
cgcgtgcgtt ctggggcccg ggcgcttgcg ccacttcctg cccgagccgc tggcgcccga 4920
gggtgtggcc gctgcgtgcg cgcgcgcgac ccggtcgctg tttgaaccgg gcggaggcgg 4980
ggctggcgcc cggttgggag ggggttgggg cctggcttcc tgccgcgcgc cgcggggacg 5040
cctccgacca gtgtttgcct tttatggtaa taacgcggcc ggcccggctt cctttgtccc 5100
caatctgggc gcgcgccggc gccccctggc ggcctaagga ctcggcgcgc cggaagtggc 5160
cagggcgggg gcgacttcgg ctcacagcgc gcccggctat tctcgcagct caccatgccg 5220
gtcgccacca tg 5232
<210> 2
<211> 6303
<212> DNA
<213> RNP/HP-1/ACTIN ARTIFICIAL UCOE SEQUENCE
<400> 2
aagcttactt gattggccat gtggcaagcg acaggcacaa aacaattttc caagtcaata 60
ggaaaaacct cagagctgaa atctttatat gctgtactac acagctgtat tctgggcact 120
tatgaatgtt aaggaaacct gtcttaaaag ttaactaggt taaaaaacct caaacgagag 180
aaagtgatat ccaggaccaa ctgctacaaa cgcataatgc aaactaaaaa gtcacacgta 240
attttcaatc aattattttt tgttcctagc aagcagcatt aattgctgct ctcatcccag 300
ttctacggag ctctccctcc attcgcatgc tcccaactcc taaaaagtag tggtaaaacc 360
cagttcagat tttttttcct gtagttttca tgactcgtaa aaattaaaga aaaaattaac 420
tgaaatgatc aaactagctc ctatgagaca caaagcagtc ttttgaaatg gttacttgtc 480
acgatagtta ttttcatttt ttcagctagt ttttattctt aattgtcgtc agcacatagg 540
ttatctctaa actgaaatta cggataatgt acatttataa caagttttac aaatcactaa 600
caaaaagcaa aaactcatta cttacctcac aatttatcca aacttacccg atgtccacta 660
tcgattttaa acaatgttat tttataaacg tgcttagggt caaagaaaaa taaccaggta 720
gacccccttc gcttgagacc ttatgcttat caatgtaatg ttcaaccaag attgcaaaca 780
aaatgagaaa agtaacaaag ttcaaataca gagcggccca ggcccaaaac agttttgcac 840
atcaatccat acgcattaca ggaaggagcc tctgaagcca tgttttaatc gaagtataac 900
taaggacaaa atcgttattt cactttcctc gtaatcatct ataaaggtcc atggatctgt 960
cccgtaaggg ttaaacttct cagtaacaac attacttaaa atgagtcagc tctacaactt 1020
aaacggaatc cttaagaaca gtaaaggatt ctgacgcgaa tatccctccc ccgcccagaa 1080
aaccaccttc gtccctgccc ctcgtggccg atggcttcca atttatgttt attttgccgc 1140
ggttcatctg tcgttttact gactgcagac ccagataaaa ccgttactca aaggaaaaaa 1200
aagacaggaa aaacataaaa tggtttcttt gtcctacggc tcgcattgaa cccggcccga 1260
cgccctgggt ggtgatatct tctctgaaac cgggcccgca aacccggagc accccccctc 1320
cccgctcttc ggtgtggctt ccgaacgcaa tggcgccatt tcatcgaggg gaaggctgag 1380
cgcctttaat gaggtgcgca ggactctaaa gatccaagct cacaaaacac tccaaatcca 1440
cctcgaaacg atatgaaaac agcccgagaa gaaaaaaaaa atagttaacc acttctactt 1500
cttgatagag aaagcacact aagaaaataa aagagttata aggaaaacgc tgagaggaag 1560
gcgagccatg aaaatggcgg ccgccaaatc ggttcccggg agagaggggg aggggaagct 1620
ccgcagcctc gctcacgagg acctgctgcc cgccgaaacg ctcgccgagg agacgccgtg 1680
gcccccgaag cagcgtgctt tagaaaggga ataagaattc ccgcctccgc gccccacttt 1740
caccccagcg gggcagcgtc cgccatgtga aagctcccca tcccccaccc ccagtgaagg 1800
gaaatggcgc cgggaggctg agggtgggga agctgtttgt acgctcaggc ctccgctcaa 1860
gaccccgttc ataaacctta agccccactg ctactgaatt ggtccgattt cctgcctctc 1920
tcccacggag gcggctggcc gacttccact gaggcgccaa cggcctcgcc atgccctttt 1980
caataactca ttgatttcaa acccgttacc tccatcgcgg actcagtcgc ttcagcccga 2040
tttcccgcag ccgagcgaga tgagagagat ctccgcggac gaacacgaac cggactcgtc 2100
ctggcgctgt agtgagaact gccgctgctc gagaaacaac tctgcgagga gcacctccgc 2160
acgggacccg gcgctgctgc tactgccgct agagccgctg ccgccgcttt tctagaacct 2220
tcccccccac taacgcgtct tccgctacgt caggccgtcg cgtaaacgcc ctatccgccg 2280
ccaatggcgg gaaggctcta cgccccacct tacgccaaat gcgtactcct cccacccttg 2340
cggccagaga cagtacccga cgttacttcc gtaaatgcgc tcaatgaatt gcggaaggct 2400
agagtcctgc tagttactac ctcttggaat agggtcccgg cccctgcctt ggcgaaggca 2460
ggtgagaaac gtcgcgcagt ttgaaattaa cgccgacggg aggggcttaa tccgcagcct 2520
ggagatccag ccccctcaac ccgggaggtg gtccctgcag ttacgccaat gataaccccc 2580
gccagaaaaa tcttagtagc cttccctttt tgttttccgt gccccaactc ggcggattga 2640
ctcggcccct tccggaaaca cccgaatcaa cttctagtca aattattgtt cacgccgcaa 2700
tgacccaccc ctggcccgcg tctgtggaac tgacccctgg tgtacaggag agttcgctgc 2760
tgaaagtggt cccaaagggg tactagtttt taagctccca actccccctc ccccagcgtc 2820
tggaggattc cacaccctcg caccggcggg cgaggaagtg ggcggagtcc ggttttggcg 2880
ccagccgctg aggctgccaa gcagaaaagc caccgctgag gagactccgg tcactgtcct 2940
cgccccgcct cccccttccc tccccttggg gaccaccggg cgccacgccg cgaacggtaa 3000
gtgccgcggt cgtcggcgcc tccgccctcc ccctagggcc ccaattccca gcgggcgcgg 3060
cgccggcccc tccccccgcc gcgcgcgcgc ccgctgcccc gcccttcgtg gccgcccggc 3120
gtgggcggtg ccacccctcc ccccggcggc cccgcgcgca gctcccggct ccctccccct 3180
tcggatgtgg cttgagctgt aggcgcggag ggccggagac gctgcagacc cgcgacccgg 3240
agcagctcgg aggcggtgaa gtcggtggct ttccttctct ctagctctcg ctcgctggtg 3300
gtgcttcaga tgccacacgc gtcccggggg cccggttctc cgctcccctc ccctcccctt 3360
ctcgccggac cccgcgccgg gagctgcggg aaggagtgga gggtcgggcg gtggcctcgc 3420
ggctggcctg gcgcgcggcc agcccggtag ttagtggggg gactgctctg ccctcgaggg 3480
ggtagggagc tgtggcgacg gttgccccat ttcgagacaa agcgcatttc cccctcccct 3540
cccccacccg cgttccggcg gaggcgcccc ctcccccagc gccacgcggg gctgggtcga 3600
gacttgggcc tcccggaggg cggcgcgtgg tcccgcgtcc gcgagcctgg cggcgcgcgg 3660
ccggctgtcc cgaggctgcg gcgaccgcca gttaacgtgg ccgcgcgggg gtaggcgcgt 3720
gcggtgtggc gcagtgccct tgagcccccg tgccgcggcc tttgtttctc cccgcggatg 3780
cgctgaccac gaggcccgcg ctcccgggtg ggggcgggca cccgcgctta ggcctctgga 3840
cgccgggctt cagcggcggg ggtcgggagc gggtgtttgc aagaggtgat tcttttttca 3900
aagtgtcacg aaacggggtt gaagcatctt aagttttttc cttttgttat ttaattaccg 3960
attggaaaga gggagggttt ctgagcagaa accaagttgg gattgcagaa cagagaagat 4020
tcacagtgct ttaccgttgt gagttgtttg ggtaatcgtg cctggtttta aaccgaaagg 4080
attgtccttt aaaaatggaa catggacttt attataaatg ggacttagat tggaaaagac 4140
attggtcccc tattttaagc catgtgaagc tgttttaggt accgcgggcc ccctctgtgg 4200
tcccacgcca ctgatcgctg catgcccacc acctgggtac acacagtctg tgattcccgg 4260
agcagaacgg accctgccca cccggtcttg tgtgctactc agtggacaga cccaaggcaa 4320
gaaagggtga caaggacagg gtcttcccag gctggctttg agttcctagc accgccccgc 4380
ccccaatcct ctgtggcaca tggagtcttg gtccccagag tcccccagcg gcctccagat 4440
ggtctgggag ggcagttcag ctgtggctgc gcatagcaga catacaacgg acggtgggcc 4500
cagacccagg ctgtgtagac ccagcccccc cgccccgcag tgcctaggtc acccactaac 4560
gccccaggcc tggtcttggc tgggcgtgac tgttaccctc aaaagcaggc agctccaggg 4620
taaaaggtgc cctgccctgt agagcccact tccttcccag ggctgcggct gggtaggttt 4680
gtagccttca tcacgggcca cctccagcca ctggaccgct ggcccctgcc ctgtcctggg 4740
gagtgtggtc ctgcgactct aatggccgca agccacctga ctcccccaac accacactct 4800
acctctcaag cccaggtctc tccctagtga cccacccagc acatttagct agctgagccc 4860
cacagccaga ggtcctcagg ccctgctttc agggcagttg ctctgaagtc ggcaaggggg 4920
agtgactgcc tggccactcc atgccctcca agagctcctt ctgcaggagc gtacagaacc 4980
cagggccctg gcacccgtgc agaccctggc ccaccccacc tgggcgctca gtgcccaaga 5040
gatgtccaca cctaggatgt cccgcggtgg gtggggggcc cgagagacgg gcaggccggg 5100
ggcaggcctg gccatgcggg gccgaaccgg gcactgccca gcgtggggcg cgggggccac 5160
ggcgcgcgcc cccagccccc gggcccagca ccccaaggcg gccaacgcca aaactctccc 5220
tcctcctctt cctcaatctc gctctcgctc tttttttttt tcgcaaaagg aggggagagg 5280
gggtaaaaaa atgctgcact gtgcggcgaa gccggtgagt gagcggcgcg gggccaatca 5340
gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat ggctcgagcg gccgcggcgg cgccctataa 5400
aacccagcgg cgcgacgcgc caccaccgcc gagaccgcgt ccgcccgcga gcacagagcc 5460
tcgcctttgc cgatccgccg cccgtccaca cccgccgcca ggtaagcccg gccagccgac 5520
cggggcatgc ggccgcggcc cttcgcccgt gcagagccgc cgtctgggcc gcagcggggg 5580
gcgcatgggg cggaaccgga ccgccgtggg gggcgcggga gaagcccctg ggcctccgga 5640
gatgggggac accccacgcc agttcgcagg cgcgaggccg cgctcgggcg ggcgcgctcc 5700
gggggtgccg ctctcggggc gggggcaacc ggcggggtct ttgtctgagc cgggctcttg 5760
ccaatgggga tcgcacggtg ggcgcggcgt agcccccgtc aggcccggtg ggggctgggg 5820
cgccatgcgc gtgcgcgctg gtcctttggg cgctaactgc gtgcgcgctg ggaattggcg 5880
ctaattgcgc gtgcgcgctg ggactcaatg gcgctaatcg cgcgtgcgtt ctggggcccg 5940
ggcgcttgcg ccacttcctg cccgagccgc tggcgcccga gggtgtggcc gctgcgtgcg 6000
cgcgcgcgac ccggtcgctg tttgaaccgg gcggaggcgg ggctggcgcc cggttgggag 6060
ggggttgggg cctggcttcc tgccgcgcgc cgcggggacg cctccgacca gtgtttgcct 6120
tttatggtaa taacgcggcc ggcccggctt cctttgtccc caatctgggc gcgcgccggc 6180
gccccctggc ggcctaagga ctcggcgcgc cggaagtggc cagggcgggg gcgacttcgg 6240
ctcacagcgc gcccggctat tctcgcagct caccatgccg gtcgccacca tgataccgtc 6300
gac 6303
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、人工ＵＣＯＥ ＮｃｏＩフラグメントの線状制限地図である。ＰＤＣＤ２転写物およびアクチン転写物を、陰付き矢印として示し、この矢印の方向は、これらそれぞれのプロモーターからの転写の方向を示す。
【図２】 図２は、本発明に従うＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥ ＮｃｏＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図３ａ】 図３ａは、ＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図３ａは、ＣＭＶプロモーターの上流にＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを含み、そして発現されるべきオープンリーディングフレームの挿入に適切なマルチクローニングサイトを含む、ＣＥＴ５００を示す。この特定の実施形態において、プラスミド骨格は、、ｐＥＧＦＰＮ−１由来であり、そしてカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を保有する。
【図３ｂ】 図３ｂは、ＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図３ｂは、ＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを逆方向に含む、ＣＥＴ５０１を示す。
【図４】 図４は、８５日間にわたってＧ４１８選択下で維持された、安定にトランスフェクトされているＣＨＯ細胞のプールにおける、レポーター導入遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現レベルを示す。発現を、ＣＭＶプロモーター単独（ＣＭＶ）により、または８ｋｂのＲＮＰ／ＨＰ−１ ＵＣＯＥ（ＣＥＴ２２０）もしくは人工のＰＤＣＤ２／アクチン ＵＣＯＥ（ＣＥＴ５１０）と組合わせて駆動し、そしてＦＡＣＳによるメジアン蛍光として測定した。
【図５】 図５は、上記の実験における導入遺伝子を発現する細胞の割合を、８５日間にわたるＦＡＣＳ分析での％陽性細胞として示す。
【図６】 図６は、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥフラグメントの線状制限地図である。メチル化のない島を、陰付き矢印として示し、この矢印の方向は、これらそれぞれのプロモーターからの転写の方向を示す。
【図７】 図７は、本発明に従うＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図８ａ】 図８ａは、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図８ａは、ＣＭＶプロモーターの上流にＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを含み、そして発現されるべきオープンリーディングフレームの挿入に適切なマルチクローニングサイトを含む、ＣＥＴ６００を示す。この特定の実施形態において、プラスミド骨格は、ｐＥＧＦＰＮ−１由来であり、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を保有する。
【図８ｂ】 図８ｂは、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図８ｂは、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを逆方向に含む、ＣＥＴ６０１を示す。
【図９】 図９は、１２７日間にわたってＧ４１８選択下で維持された、安定にトランスフェクトされているＣＨＯ細胞のプールにおける、レポーター導入遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現レベルを示す。発現を、ＣＭＶプロモーター単独（ＣＭＶ）により、または順方向（ＣＥＴ２２０）もしくは逆方向（ＣＥＴ２２１）のいずれかである８ｋｂのＲＮＰ ＵＣＯＥと組合わせて駆動するか、または順方向（ＣＥＴ６１０）もしくは逆方向（ＣＥＴ６１１）のいずれかでＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥによって駆動し、そしてＦＡＣＳによるメジアン蛍光として測定した。従って、ＣＥＴ６１０がＣＥＴ６００の等価物であるが挿入された遺伝子としてＥＧＦＰを含むこと、およびＣＥＴ６１１がＣＥＴ６０１の対応するＥＧＦＰ含有等価物であることが、理解される。
【図１０】 図１０は、上記の実験における導入遺伝子を発現する細胞の割合を、１２７日間にわたるＦＡＣＳ分析での％陽性細胞として示す。
【図１１ａ】 図１１ａは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
【図１１ｂ】 図１１ｂは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
【図１１ｃ】 図１１ｃは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
【図１１ｄ】 図１１ｄは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
（発明の分野）
本発明は、天然には存在しない、遍在的クロマチン開放エレメント（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、このポリヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞、および治療におけるこのポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用、またはインビトロでのタンパク質発現適用のためのこのポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」に組織化されているということを仮定する１、２。クロマチンドメインは、濃縮されて「閉鎖した」転写的にサイレントな状態であるか、または濃縮されておらず「開放して」かつ転写的に有能な配置であるかのいずれかで存在すると考えられている。ＤＮａｓｅＩ感受性の上昇、ＤＮＡの低メチル化およびヒストン高アセチル化によって特徴付けられた、開放クロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始に対して予め必須であるとみなされている。
【０００３】
クロマチン領域の開放特性および閉鎖特性は、宿主細胞ゲノム中に無作為に組み込まれる導入遺伝子のふるまいに反映される。同一の構築物は、マウスゲノム中の異なる位置で組み込まれる場合、異なるパターンの組織特異的発現および発生段階特異的発現を与える３〜５。位置効果ふ入り（ＰＥＶ）として公知である、所定のトランスジェニックマウス組織内のふ入りの発現パターンはまた、頻繁に観察される６。外因性遺伝子が哺乳動物細胞培養物の染色体中にインビトロで組み込まれる場合、多くの組み込み事象は、導入遺伝子の迅速なサイレンシングを生じ、残りは、発現レベルにおける大きな変動性を与える７、８。これらの位置効果は、基礎研究適用および生物工学適用の両方に関連して、導入遺伝子発現を無能にする。
【０００４】
遺伝子組織化のクロマチンドメインモデルは、転写的に有能な開放したクロマチン構造を確立および維持し得る遺伝的制御エレメントがゲノムの活性領域に結合するはずであることを示唆する。
【０００５】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、広範囲のクロマチン再構築能を有する転写調節エレメントのクラスである。ＬＣＲは、組み込み部位に依存せず、導入遺伝子コピー数に依存する、ｃｉｓで連結された遺伝子（特に、単一コピーの導入遺伝子）における生物学的レベルの発現を付与するそれらの能力により、トランスジェニックマウスにおいて機能的に規定される９、１０。決定的に、このような発現は、組織特異的である。ＬＣＲは、ヘテロクロマチンの広がりを遮断し得、ＰＥＶ６を阻止し得、そして一連のＤＮａｓｅＩ高感受性（ＨＳ）部位からなり、これらの部位は、これらが調節する遺伝子の５’側または３’側のいずれかに位置され得る１０。
【０００６】
ＬＣＲは、２つの別々の（しかし必要ではない）独立した成分から構成されるようである。第一に、開放クロマチンドメインの確立、第二に、導入遺伝子コピー数依存的発現を付与する、優勢な転写活性化能９。ＬＣＲがその機能を発揮する分子機構は、論点が残ったままである２、１１〜１３。
【０００７】
高レベルの治療タンパク質産物を産生する培養哺乳動物細胞株の生成は、主要な発達産業である。クロマチン位置効果は、これを困難な、時間のかかる、そして高価なプロセスにする。このような哺乳動物「細胞工場」の生成に対する、最も一般的に使用されるアプローチは、薬物耐性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ、グルタミン合成酵素（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：５３７−５６６（本明細書中に参考として援用される））およびストリンジェントな選択圧の持続（ｍａｉｎａｔｅｎａｎｃｅ）の組合わせによって誘導される遺伝子増幅に依存する。高度に発現された遺伝子ドメイン由来のＬＣＲを含むベクターの使用（適切な組織由来の細胞を使用する）はこの手順を非常に単純にする（Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：９９７−１００３；Ｎｅｅｄｈａｍら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６：１２４−１３１（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【０００８】
しかし、ＬＣＲの組織特異性はまた、いくつかの環境において有用ではあるが、多くの適用（例えば、発現が必要とされる組織に対するＬＣＲが知られていない場合、または多くのもしくは全ての組織で発現が必要とされる場合）に対して重大な制限である。
【０００９】
本発明者らの同時係属特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（ＷＯ ００／０５３９３）（本明細書中に参考として援用される）は、遍在的に発現したハウスキーピング遺伝子から排他的になる、遺伝子座を横切る開放クロマチン構造の確立を担うエレメントを記載する。これらのエレメントは、ＬＣＲに由来しない。本発明は、遍在的クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関し、このＵＣＯＥは、クロマチンを開放させるかまたはクロマチンを開放状態で維持し、そして少なくとも２つの異なる組織型の細胞において作動可能に連結されている遺伝子の再現可能な発現を容易にし、ここで、このポリヌクレオチドは、遺伝子座制御領域に由来しない。
【００１０】
メチル化のないＣｐＧ島は、当該分野において周知であり（Ｂｉｒｄら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４０：９１−９９、ＴａｚｉおよびＢｉｒｄ（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：９０９−９２０）、そしてＣｐＧ二ヌクレオチドを平均含量（約６０％）より多く含む、ＣｐＧに富んだＤＮＡ領域として規定され得る。この領域は、シトシン残基がメチル化されておらず、そして密接に区切られ（０．１〜３ｋｂ）分岐転写された２つの遺伝子の５’末端にわたって伸長する。ＤＮＡのこれらの領域は、全ての組織において発達の間中メチル化されないままである（ＷｉｓｅおよびＰｒａｖｔｃｈｅｖａ（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６０：２５８−２７１）。これらは、遍在的に発現された遺伝子全ておよび組織制限された発現プロフィールを示す遺伝子の約４０％の５’末端と結合され１６、１７、そして活性なクロマチンの限局領域として公知である１８。
【００１１】
「伸長した」メチル化のないＣｐＧ島は、メチル化のないＣｐＧ島であり、１つより多い転写開始部位を含む領域を横切って伸長する、および／または３００ｂｐより長く、好ましくは５００ｂｐより長く伸長する。伸長したメチル化のないＣｐＧ島の境界は、配列でＤＮＡを消化（切断）する能力は、存在するＣｐＧ残基のいずれかのメチル化状態に感受性である。このような酵素の１つは、ＨｐａＩＩであり、これは、ＣｐＧ島内に一般に見られる部位ＣＣＧＧを認識しそして部位ＣＣＧＧで消化するが、これは、中央のＣＧ残基がメチル化されていない場合のみである。従って、ＨｐａＩＩ消化したＤＮＡを用いてＨｐａＩＩ部位を保有する領域にわたって実施したＰＣＲは、このＤＮＡがメチル化されていない場合は、ＨｐａＩＩ消化に起因して増幅産物を与えない。このＰＣＲは、このＤＮＡがメチル化されている場合にのみ増幅産物を与える。従って、メチル化のない領域以外は、ＨｐａＩＩがＤＮＡを消化せず、ＰＣＲ増幅産物が観察され、これにより、「伸長したメチル化のないＣｐＧ島」の境界を規定する。
【００１２】
本発明者らは、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）／プロテオソーム成分Ｂ−１（ＰＳＭＢ１）および異種核リボヌクレオタンパク質Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２）／ヘテロクロマチンタンパク質 １ＨＳγ（ＨＰ１ＨＳγ）遺伝子座由来の、双方向に分岐転写されるプロモーターを含むメチル化のないＣｐＧ島にわたる領域が、再現可能な生理学的レベルの遺伝子発現を与えること、そしてこれらは、ふ入りの発現パターンおよび動原体へテロクロマチン内での導入遺伝子組み込みとともに正常に生じるサイレンシングを阻止し得ることを示した。
【００１３】
本発明者らは、活性に転写するプロモーターと結合するメチル化のないＣｐＧ島が、クロマチンを再構築する能力を有すること、よってこのＣｐＧ島が、ハウスキーピング遺伝子座で開放ドメインを確立および維持させる際の第一の決定要因であると考えられていることを示した。
【００１４】
ＵＣＯＥは、導入遺伝子発現のレベルおよび安定性における改善を伴う生産性遺伝子送達事象の割合の増加を付与する。これは、トランスジェニック動物の生成および培養細胞における組換えタンパク質の産生を含む、重要な研究および生物工学的適用を有する。本発明者らは、ＣＭＶ−ＥＧＦＰレポーター構築物の発現に対するＵＣＯＥの有利な効果、および分泌性の薬学的に価値のあるタンパク質エリスロポエチンに対するＵＣＯＥの有利な効果を示した。ＵＣＯＥの特性はまた、遺伝子治療における有用性を示唆し、この有効性は、低頻度の生産性遺伝子送達事象ならびに不十分な発現レベルおよび発現持続によってしばしば限定される４５。
【００１５】
これらの有意な関連および広範な適用を考慮すると、導入遺伝子発現レベルをさらに最適化すること、および長期化した培養期間にわたる遺伝子発現の改善された安定性の達成が所望される。
【００１６】
特に必要なことの１つは、いくつかの天然に存在するＵＣＯＥにおいて観察される方向性の偏向を克服することである。ＵＣＯＥは作動可能に連結されているプロモーターに対して位置非依存的転写増強を付与するが、これは、ある程度、方向依存的である（すなわち、ＵＣＯＥは、一方向において他方向よりも有意により効果的である）。いくつかの環境下（例えば、２つの発現単位（これらの間に位置したＵＣＯＥで分岐転写される）を含む発現ベクター）において、天然のＵＣＯＥを有し得ない両方のプロモーターから均衡のとれた高レベルの発現を得ることができるという利点が存在する。従って、両方の方向に効果的な人工的に構築されたＵＣＯＥの必要性が存在する。
【００１７】
（発明の説明）
本発明に従って、ＵＣＯＥを含むポリヌクレオチドが提供される。ＵＣＯＥは、クロマチンを開放するかまたは開放状態でクロマチンを維持し、そして作動可能に連結されている遺伝子の少なくとも２つの異なる組織型の細胞における再現可能な発現を容易にし、ここで、このＵＣＯＥのヌクレオチド配列は、天然には存在しない。
【００１８】
少なくとも２つの遺伝子由来の調節配列を含むゲノム領域は、長期の培養期間にわたって遺伝子発現が顕著に増強されたキメラＵＣＯＥを形成するように合わせられた。このようなキメラＵＣＯＥは、天然には存在しないヌクレオチド配列を構成する。従って、句「天然には存在しない」は、ＵＣＯＥを構成するエレメントのヌクレオチド配列がそれ自体天然には存在せず、そして天然に存在する配列および／または人工的に生成された配列の組合わせである、人造（ｍａｎ−ｍａｄｅ）または人工的に構築されている状態をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「人工」、「人工的に構築された（構築される）」、「キメラ」などは、ＵＣＯＥを参照する場合、ＵＣＯＥまたはＵＣＯＥを構成するエレメントが天然には存在しない（すなわち、「天然には存在しない」）ことを意味するように、全体を通じて相互交換可能に使用される。ＵＣＯＥが天然に存在する配列の組合わせである場合、これは、非天然であるＵＣＯＥへの配置または組織化である。非限定的な例示によって人工ＵＣＯＥは、通常は共通せず（染色体の異なる領域由来、異なる染色体由来、異なる生物由来など）、かつ非天然組織化において一緒に持ち込まれてキメラまたは人工ＵＣＯＥを作製する、かつ２つの天然に存在する配列からなり得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「人工的に合成された（合成される）」および「人工的に生成された（生成される）」は、ＵＣＯＥにおける配列を参照する場合、非天然の配列（すなわち、天然には存在せずそして全体的に合成されている配列）をいう。このような「人工的に合成された（合成される）」配列および「人工的に生成された（生成される）」配列はまた、人工ＵＣＯＥを作成または作製するために天然に存在する配列と結合され得る。
【００２１】
本発明の代替の局面に従って、以下から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸分子が提供される：
ｉ）図２または図７に示されているようなＤＮＡ配列；
ｉｉ）本発明に従うポリペプチドをコードする、図２または図７に示されている配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、図２または図７に示されている配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニーリングする単離された核酸分子が提供される。
【００２３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件／洗浄条件は、当該分野において周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける６０℃での洗浄後に安定である核酸ハイブリッド。核酸の配列が既知である場合、最適なハイブリダイゼーション条件が算出され得ることは当該分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに供される核酸のＧＣ含量によって決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈを参照されたい。特定の相同性の核酸分子間でのハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を算出するための一般式は：
【００２４】
【化１】
【００２５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている遺伝子の組織非特異的に再現可能な発現を容易にする。
【００２６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、活性な遺伝子発現が生じる組織型全てにおける作動可能に連結されている遺伝子の再現可能な発現を容易にする。
【００２７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている遺伝子の生理学的レベルでの発現を容易にする。
【００２８】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、伸長したメチル化のないＣｐＧ島を含む。
【００２９】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子発現の制御に関連する１つ以上の天然に存在する配列を含む。
【００３０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の天然に存在するプロモーターを含む。
【００３１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、分岐転写される双方向性プロモーターまたは二方向性のプロモーターを含む。
【００３２】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。
【００３３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントにわたる、１００ｂｐ〜３ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００３４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。
【００３５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントにわたる、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００３６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、このフラグメントは、分岐して配向したそのプロモーターに直接隣接する。
【００３７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、２ｋｂのＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる、１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、このフラグメントは、分岐して配向したそのプロモーターに直接隣接する。
【００３８】
さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、いずれかの方向において図２の配列またはそのフラグメントを含む。
【００３９】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ヒトＲＮＰ ＣｐＧ島／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。
【００４０】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ヒトＲＮＰ ＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる４ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。
【００４１】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、メチル化のないＣｐＧ島を含む少なくとも１つのさらなる配列に隣接する二方向性プロモーターを含む、伸長したメチル化のないＣｐＧ島を含む。
【００４２】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、ヒトＲＮＰ ＣｐＧ島／プロモーター領域、およびヒトβ−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００４３】
さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、図７の配列またはそのフラグメントをいずれかの方向で含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、１つ以上のプロモーター配列を含む。
【００４４】
いくつかの環境下で、転写開始が、上流のプロモーターからの読み取り中の転写物によって阻害され得ることは、当該分野において公知である（ＹｏｕｓｓｏｕｆｉａｎおよびＬｏｄｉｓｈ（１９９３）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｂｙ ａｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３（１）９８−１０４）。従って、本発明の１つの実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含み、ここで、１つ以上のプロモーター配列が、転写を開始し得ないように変異されている。
【００４５】
好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１α、ＲＳＶ ＬＴＲまたはＨＩＶ２ ＬＴＲまたはこれら由来の配列の組合わせより選択される。より好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。最も好ましくは、プロモーターは、マウスＣＭＶプロモーターである。
【００４６】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、人工的に合成されている少なくとも１つの配列を含む。
【００４７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００４８】
好ましくは、このベクターは、真核生物遺伝子発現に適応された発現ベクターである。
【００４９】
典型的には、この適応としては、細胞／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給が例示として挙げられるが限定の目的ではない。
【００５０】
プロモーターおよびエンハンサーは、当該分野において周知の用語であり、例示のみによって提供され、限定の目的ではない以下の特徴を含む。プロモーターは、転写の開始に直接連結された５’のｃｉｓ作動性調節配列である。プロモーターエレメントとしては、いわゆるＴＡＴＡボックス、および転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列が挙げられる。これらの配列はまた、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドと結合する。
【００５１】
エンハンサーエレメントは、しばしば遺伝子の転写開始部位の５’側に見られるｃｉｓ作動性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’側に見られ得るかまたは内部配列にさえ位置され得、よって独立した位置である）。エンハンサーは、このエンハンサーが連結される遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているｔｒａｎｓ作動性転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性は、例示として挙げられるが限定の目的ではない、以下の多くの環境因子（ｃｕｅ）に応答性である：中間代謝物（例えば、グルコース）、環境エフェクター（例えば、熱）（Ｄａｖｉｄ Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎによる、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。
【００５２】
適応はまた、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかにおいて上記ベクターの維持を容易にする選択マーカーおよび自律的複製配列の供給を含む。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターといわれる。エピソームベクターは、自己複製しそのため組み込みの必要なく持続するので望ましい。この型のエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載される。
【００５３】
遺伝子をコードするベクターの発現を容易にする適応は、転写終止配列／ポリアデニル化配列の供給を含む。これはまた、二シストロン性の発現カセットまたは多シストロン性発現カセット中に配置されるベクターコード遺伝子の発現を最大限にするように機能する内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の供給を含む。
【００５４】
これらの適応は、当該分野において周知である。発現ベクター構築物および組換えＤＮＡ技術に関する刊行された文献が、一般に多数存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ、およびこれに記載される参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００５５】
好ましくは、ベクターは、プロモーターおよび前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されている発現可能な遺伝子を含む。
【００５６】
好ましくは、ベクターは、エピソームベクターまたは組み込みベクターである。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、プラスミドである。
【００５８】
あるいは、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスのようなウイルスであり得る。
【００５９】
好ましくは、作動可能に連結されている遺伝子は、治療用核酸配列である。
【００６０】
好ましくは、ベクターは、発現されるべきオープンリーディングフレームの２つの挿入部位を含み、このオープンリーディングフレームの各々は、異なるプロモーターから転写され、このプロモーターは、分岐転写するように配置されており、そしてこのプロモーターの両方は、これらの間に位置付けられた人工的に構築されたＵＣＯＥに作動可能に連結されており、このＵＣＯＥは、両方向において有効であるように構築されている。このベクターは、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（免疫グロブリンを含むがこれに限定されない）の産生に特に有用である。このベクター中の挿入部位は、目的の異なるポリペプチド（免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードするオープンリーディングフレームを含むがこれに限定されない）をコードする核酸で挿入され得る。
【００６１】
好ましくは、ベクターは、図２の配列、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメント下で選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む。ＵＣＯＥが両方向で挿入され得ることは、当業者に明らかである。
【００６２】
好ましくは、人工ＵＣＯＥを含むベクターは、図３ａに概略的に示されているＣＥＴ５００である。
【００６３】
代替の実施形態において、ベクターは、図３ｂに示されているＣＥＴ５０１である。
【００６４】
あるいは、ベクターは、図７ａの配列、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメント下で選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む。同様に、人工ＵＣＯＥが両方向で挿入され得ることは、当業者に明らかである。
【００６５】
この代替の好ましい実施形態において、人工ＵＣＯＥを含むベクターは、図８ａに概略的に示されているＣＥＴ６００として知られる。
【００６６】
さらに代替の実施形態において、図８ｂに概略的に示されているＣＥＴ６０１である。
【００６７】
本発明はまた、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００６８】
本発明はまた、治療に使用するための、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明はまた、遺伝子治療に使用するための組成物を製造するための、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【００７０】
本発明はまた、処置方法を提供し、この方法は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の薬学的有効量を、このような処置の必要な患者に投与する工程を包含する。好ましくは、この患者は、遺伝子治療によって処置され得る疾患を罹患している。
【００７１】
本発明はまた、疾患を処置するための治療あるいは有利なタンパク質または機能を特定の組織の細胞に提供するための治療のために、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞を、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈剤と合わせて含む薬学的組成物を提供する。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞、あるいは薬学的組成物は、全身性筋肉内投与、静脈内投与、エアロゾル投与、経口投与（固体形態または液体形態）、局所投与、眼内投与、直腸投与、腹腔内投与ならびに／または鞘内注射および局所直接注射を含む経路を介して投与され得る。
【００７３】
正確な投薬量レジメンは、もちろん個々の患者に対して個々の臨床医によって決定される必要があり、これは言い換えると、目的の遺伝子によって発現されるタンパク質および処置について標的化される組織型の正確な特徴によって制御される。
【００７４】
投薬量はまた、疾患徴候および投与経路に依存する。用量の数は、その疾患および臨床試験からの効力データに依存する。
【００７５】
本発明に従う効果的な遺伝子治療のために送達されるポリヌクレオチドまたはベクターＤＮＡの量は、好ましくは、体重１ｋｇあたりのベクターＤＮＡが５０ｎｇ〜１０００μｇの間の範囲であり；そしてより好ましくは、体重１ｋｇあたりのベクターＤＮＡが約１〜１００μｇの間の範囲である。
【００７６】
インビボでの細胞取り込みのために、哺乳動物にポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を、本発明に従って投与することが好ましいが、エキソビボでのアプローチが利用され得、これにより細胞は、動物から取り出され、ポリヌクレオチドまたはベクターで形質導入され、次いで、その動物に再移植される。例えば、肝臓は、動物より肝細胞を取り出し、インビトロでこの肝細胞を形質導入しそしてこの形質導入された肝細胞をこの動物に再移植することによる、（例えば、ウサギについては、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、１９９１、または、ヒトにおいては、Ｗｉｌｓｏｎによる、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１７９−２２２、１９９２に記載されるような）エキソビボアプローチによって作業され得る。このような方法はまた、循環系またはリンパ系における細胞（例えば、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および造血幹細胞）の種々の集団に送達するために効果的であり得る。
【００７７】
本発明の別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を使用する遺伝子治療の効力を決定するための哺乳動物モデルを提供する。この哺乳動物モデルは、その細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を含む。トランスジェニックマウス（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０（１９８０）；Ｈａｒｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９３：５４０（１９８１）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５０１６（１９８１）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６３７６（１９８１））、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックブタ、トランスジェニックニワトリ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（１９８５）を参照のこと）などの作製方法は、当該分野において周知であり、そして本発明に従う使用のために意図される。このような動物は、ヒトへの臨床試験の前の試験を可能にする。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物はまた、目的のタンパク質を長期間生成するために使用され得る。
【００７９】
本発明はまた、細胞培養系において所望の遺伝子産物を得るための、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞の使用を提供する。適切な細胞培養系は、当該分野において周知であり、当業者に公知の文献の本文中に十分記載されている。
【００８０】
本発明はまた、内因性遺伝子と作動可能に結合される位置で、細胞のゲノム中にポリヌクレオチドを挿入し、これにより遺伝子の発現レベルを増加させる工程を包含する、内因性遺伝子の発現を増加させるためのポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００８１】
本発明はまた、トランスジェニック植物を生成する際の、本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００８２】
収量、抵抗性などを増加させたトランスジェニック植物の生成は、当業者に周知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。人工ＵＣＯＥを含む細胞のいくつかまたは全ては、植物よりもたらされ得る。
【００８３】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００８４】
本発明はまた、機能的なゲノム適用における本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能的なゲノムは、主に、特定の細胞型または疾患状態において特異的に発現される遺伝子の配列決定に関し、そしてここで、薬物発見目的または遺伝子治療目的のために可能な目的の何千もの新規遺伝子配列を提供する。新規治療の開発のためにこの情報を使用する際の主要な問題は、これらの遺伝子の機能をいかに決定するかにある。ＵＣＯＥは、遺伝子配列の機能を決定するために、多くの機能的なゲノム適用において使用され得る。本発明の機能的なゲノム適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
（１）アンチセンスバージョンの遺伝子配列またはリボザイムをノックダウンしたライブラリーの持続した発現を達成するために、本発明のポリヌクレオチドを使用して、これにより遺伝子または細胞の表現型を不活化する効果を決定すること。
（２）遺伝子配列についての発現ライブラリーを調製するために、本発明のポリヌクレオチドを使用して、その結果、細胞への送達が、遺伝子配列の信頼できる、再現可能な、持続した発現を生じること。この遺伝子配列を発現する、生じた細胞は、機能決定および薬物発見のための種々のアプローチにおいて使用され得る。例えば、遺伝子産物に対する中和抗体を惹起させること；構造研究、機能研究または薬物スクリーニング研究において使用するための、その遺伝子自体のタンパク質産物の迅速な精製；または細胞ベースの薬物スクリーニング。
（３）マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）およびトランスジェニックマウスを含むアプローチにおいて、本発明のポリヌクレオチドを使用すること。最も強力な機能的なゲノムアプローチの１つは、発現された遺伝子の挿入に続く薬物選択のみを可能にし、そして配列決定のために容易にレスキューされ得る構築物の、マウスＥＳ細胞中の遺伝子への無作為な挿入を含む（Ｇ．Ｈｉｃｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６，３３８−３３４）。次いで、新規配列を有する遺伝子中にノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスを、これらの機能をプローブするために容易に作製し得る。現在、この技術は、マウスＥＳ細胞中に十分発現されているマウス遺伝子の１０％について、十分作用する。組み込み構築物へのＵＣＯＥの取り込みによって、この技術を拡張してマウス中に発現した遺伝子全てを同定し得る。
【００８５】
本発明の代替の実施形態において、以下の工程：
ｉ）本発明に従う核酸分子で形質転換／トランスフェクトされた細胞を提供する工程；
ｉｉ）このポリペプチドの生成を導く条件下でこの細胞を増殖させる工程；および
ｉｉｉ）細胞またはその増殖環境からこのポリペプチドを精製する工程
を包含する、本発明に従うポリペプチドの産生のための方法が提供される。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明に従うベクターである。
【００８７】
本発明の好ましい方法において、上記ベクターは、上記ポリペプチドの精製を容易にするための選択シグナルをコードし、つまり上記ポリペプチドは、このような選択シグナルとともに提供される。
【００８８】
あるいは、他の好ましい実施形態は、発現した組換えタンパク質の精製を容易にするためのさらなる改良（例えば、親和性タグまたはエピトープ、あるいは酵素切断部位）を含み得る。
【００８９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、付随する図面を参照して例示の目的でのみここで記載される。
【００９０】
（実施例１：ＵＣＯＥフラグメントの異種性組合わせ）
本発明者らは、４．０ＣＭＶ構築物および８．０ＣＭＶ構築物におけるＡ２／ＨＰ１フラグメントと、ＴＢＰ／Ｂ１遺伝子座由来の匹敵する領域との置換が、ｈＣＭＶプロモーターからのＥＧＦＰ発現のレベルおよび安定性が実質的に増加することを見出した。組織培養細胞におけるこれらの知見は、伸長したＣｐＧ島および分岐転写したプロモーターを含むＤＮＡ領域が、生存可能な組み込み事象の割合の増加、有意に改善された導入遺伝子発現および動原体性へテロクロマチンからの転写的サイレンシングに対する耐性を付与することを担うという証拠を提供する。
【００９１】
単一のプロモーターに結合したハウスキーピング遺伝子由来のＣｐＧ島を含むゲノム領域を、合わせた。この構築物は、ヒトＰＤＣＤ２遺伝子の５’末端由来のＣｐＧ島を含む３．２ｋｂフラグメントに連結した、ヒトβ−アクチン遺伝子の５’末端由来の２ｋｂのＣｐＧ島３７を含む。これらのプロモーターは、分岐転写され、そしてこれらの転写開始部位は、１．９ｋｂ隔てられている。
【００９２】
次いで、全体で５．２ｋｂの組合わせを、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰレポーター遺伝子に連結した（ＰＤＣＤ２／アクチン）。比較として、β−アクチンＣｐＧ島／プロモーター領域単独をまた、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ発現ベクター（ＡＣＴＩＮ）の上流に挿入した。
【００９３】
（材料および方法）
図２を特に参照して、ＣＭＶプロモーターを、ＡｓｅＩおよびＮｈｅＩでの消化によってｐＥＧＦＰ−Ｎ１から除去して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、再ライゲーションしてｐΔ−ＥＧＦＰ−Ｎ１を生成した。β−アクチンプロモーターＥＧＦＰ融合物を、ＭＡ３９（ＨＳＡＣＣＹＢＢ）をＢｓｍＩおよびＮｃｏＩで消化し、適切なフラグメントを単離し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化することによって構築した。このフラグメントを、ＡｇｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＳｍａＩで消化したｐΔ−ＥＧＦＰ−Ｎ１に連結した。これは、β−アクチン遺伝子の第一コドンとＥＧＦＰとのインフレームでの融合物を生成し、この発現は、β−アクチンプロモーター／ＭＦＩ（メチル化のない島）を駆動しなかった。この構築物（ｐＡｃｔｉｎ−ＥＧＦＰ）は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯＫ１細胞中でＥＧＦＰを発現することが示された。
【００９４】
二方向性のプロモーターおよび伸長したメチル化のない島を有するベクターを構築するために、ＰＤＣＤ２遺伝子およびそのプロモーターのいくつかを、ＳｗａＩおよびＢｓｐＥＩでの消化によってｐＣＰ２−ＴＮＮ（ｐＣＹＰＡＣ−２中のＴＢＰ遺伝子座の約１６０ｋｂ）から最初に除去し、ＥｃｏＲＶおよびＸｍａＩで消化してあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋にサブクローニングした（ｐＰＤＣＤ２−ＫＳ）。このベクターはＰＤＣＤ２のメチル化のない島の全体を含まないので、ＰＤＣＤ２のメチル化のない島の残りの５’領域（これもまたプロモーターを含む）を、以下のプライマー：
【００９５】
【化２】
【００９６】
ｐＦ−ＰＤＣＤ２−Ａｃｔｉｎ−ＥＧＦＰのメチル化のない島を含む領域を、ＮｃｏＩフラグメント（約５．２ｋｂ）として除去し、これをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで、ＡｓｅＩで消化した後に平滑末端化したｐＥＧＦＰＮ−１に両方向で連結した。これらのベクターを、ＣＥＴ５１０（順方向でのＵＣＯＥ）およびＣＥＴ５１１（逆方向でのＵＣＯＥ）と呼んだ。マルチクローニングサイトに挿入される導入遺伝子を含まない対応する空の発現ベクターを、それぞれＣＥＴ５００およびＣＥＴ５０１と称した（図３を参照）。
【００９７】
構築物を、ＰｖｕＩで線状化し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、そしてＧ４１８選択下（０．６ｍｇ／ｍｌ）で両方の実験について選択した。
【００９８】
当業者が、これらの手順を本発明の他のポリヌクレオチドの調製および試験に適応し得ることは、理解される。
【００９９】
（結果）
図４および５に示すように、人工ＵＣＯＥ構築物は、メジアン蛍光に関して、８ｋｂ ＲＮＰ／ＨＰ−１ ＵＣＯＥで達成されるレポーター遺伝子発現のレベルに匹敵し、そして実験の時間経過にわたって発現する細胞の割合に関してわずかに勝るレポーター遺伝子発現のレベルを与えた。
【０１００】
（実施例２：ＵＣＯＥおよびメチル化のないＣｐＧ島フラグメントの異種性組合わせ）
（材料および方法）
アクチンのメチル化のない島を、ＮｃｏＩでの消化によってｐＡｃｔｉｎ−ＥＧＦＰから除去し、平滑末端化した後に、ＫｐｎＩで消化した。ＲＮＰの４ｋｂフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってＣＥＴ２０から除去した。次に、ＣｌａＩで消化し、平滑末端化し、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩで切断してあるｐＢＫＳに、これら２つのフラグメントを、連結した。これによって、ｐＢＫＳ中に人工ＵＣＯＥを得た。
【０１０１】
次いで、人工ＵＣＯＥを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりｐＢＫＳより除去し、平滑末端化し、ＡｓＩで消化されて平滑末端化されてあるｐＥＧＦＰ−Ｎ１に連結した。ＵＣＯＥを両方向で挿入してＣＥＴ６１０およびＣＥＴ６１１をそれぞれ作製した。マルチクローニングサイトに導入遺伝子が挿入されていない対応する発現ベクターを、それぞれＣＥＴ６００およびＣＥＴ６０１と称した（図８を参照のこと）。
【０１０２】
構築物を線状化し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、そして実験期間にわたってＧ４１８（０．６ｍｇ／ｍｌ）選択下で選択した。
【０１０３】
（結果）
導入遺伝子発現のレベルに対する人工ＵＣＯＥ（両方向での）効果を、ＣＭＶプロモーター単独、および８ｋｂ ＲＮＰ／ＨＰ−１ ＵＣＯＥ（両方向での）を用いて得た結果と比較することによって、評価した。図９は、ＦＡＣＳ分析におけるメジアン蛍光の点では、ＣＭＶプロモーター単独が、非常に低いレベルの発現を与えたことを示す。ＲＮＰ ＵＣＯＥ（ＣＥＴ２２０）および人工ＵＣＯＥ（ＣＥＴ６００）の両方は、順方向で非常に増加した（３０倍）発現を与え、そして同等である。しかし、ＲＮＰ ＵＣＯＥで見られる方向の偏りは、人工ＵＣＯＥで見られるものよりかなり劣る（すなわち、逆方向では、人工ＵＣＯＥが優れていたが、順方向ではいずれのＵＣＯＥよりわずかに劣っていた）。これは、長期にわたって（１２０日より長く）全体的な発現レベルおよび発現を維持する能力の両方についてあてはまる。
【０１０４】
長期間発現を維持する細胞の割合に関して同一の実験を分析した場合、両方のＵＣＯＥは、両方向において、ＣＭＶ単独より一貫してよい結果（実験の初期に発現する細胞数の約２倍）を与えた。この差異は、より長期間にわたってより著しくなり、ＣＭＶのみの集団は、発現する細胞を徐々に失い、１２０日目までに約１０％の細胞のみがなお発現した。このことは、順方向において両方のＵＣＯＥの約９０％が維持され、そして実験の終わりまでに逆方向においてわずかに低いレベル（７５〜８５％）のみであることと対照的である。
【０１０５】
（実施例３：同一のベクター上の２つの遺伝子の同時発現）
効率的な機能的抗体産生は、重鎖および軽鎖の適切にバランスのとれた発現を必要とする。２つの鎖を別々のプラスミドでトランスフェクトすることによって、等しいコピー数を維持することは困難となり、そしてこれらのベクターがゲノムに互いに近接して組み込まれる場合、これらの遺伝子間の潜在的な転写的干渉が提供される。
【０１０６】
同一のベクターでの２つの遺伝子の同時発現のための一連の新たなベクターを、耐性マーカーとしてｎｅｏ対ｐｕｒｏ、そして軽鎖発現または重鎖発現を駆動するためのｈＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーターまたはｍＣＭＶプロモーターを比較するために構築した（図１１）。
【０１０７】
（材料および方法）
ｐＯＲＴ１（Ｃｏｂｒａ）の２つのＳｆｉＩ部位を、アニーリングしたオリゴ：
【０１０８】
【化３】
【０１０９】
ＨＳＶ ＴＫポリＡ部位を、以下のプライマー：
【０１１０】
【化４】
【０１１１】
【化５】
【０１１２】
２つのｎｅｏ発現カセットを含むｐｃＤＮＡ３．１のＡｓｅＩ〜ＳａｌＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳｐｅＩリンカー（５’−ＧＡＣＴＡＧＴＣ）に連結した。次いで、このＳｐｅＩフラグメントを、ＳｐｅＩ部位にクローニングしてｐＯＲＴｎｅｏＦを得るか、またはピューロマイシン耐性カセットを保有するＣＥＴ７００（Ｃｏｂｒａ）のＥｃｏＲＩ〜ＮｏｔＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＸｂａＩリンカーに連結し、そしてＸｂａＩフラグメントを、ＸｂａＩ部位にクローニングしてｐＯＲＴｐｕｒｏＦを得た。
【０１１３】
ｐＣＭＶＥＧＦＰＮ−１（Ｃｏｂｒａ）由来のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩのマウスＣＭＶプロモーターフラグメントを、ＢＫＳ＋（Ｃｏｂｒａ）におけるハイブリッドＵＣＯＥのＨｉｎｄＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。次いで、ヒトＣＭＶプロモーターを、以下のプライマー：
【０１１４】
【化６】
【０１１５】
ＢＫＳ＋中のハイブリッドＵＣＯＥ中におけるＳａｌＩクローニング部位の上流にある２つのＡＴＧコドンを、部位特異的変異誘発によって変更し、そしてＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩフラグメントを、ｐＯＲＴｎｅｏＦのＢａｍＨＩ〜ＳａｌＩ部位にクローニングし、ｐＢＤＵｎｅｏ２００を得るか、またはｐＯＲＴｐｕｒｏＦにクローニングしてｐＢＤＵｐｕｒｏ４００を得た。
【０１１６】
ヒト抗体軽鎖コード配列を、４つの二方向性ＵＣＯＥベクター（ｐＢＤＵｎｅｏ１００、ｐＢＤＵｎｅｏ２００、ｐＢＤＵｐｕｒｏ３００およびｐＢＤＵｐｕｒｏ４００）全てのＢａｍＨＩ部位またはＳａｌＩ部位のいずれかにクローニングした後、免疫グロブリン重鎖コード配列を、残りのＢａｍＨＩ部位またはＳａｌＩクローニング部位にクローニングして、ｐＢＤＵｎｅｏ１１２、ｐＢＤＵｎｅｏ１２１、ｐＢＤＵｎｅｏ２１２、ｐＢＤＵｎｅｏ２２１、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１１２、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１２１、ｐＢＤＵｐｕｒｏ２１２およびｐＢＤＵｐｕｒｏ２２１を得た。８つの抗体発現構築物全てを、製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、そして５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ｎｅｏベクター）または１２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ｐｕｒｏベクター）で選択した。
【０１１７】
プールを選択し、そして異なる構築物間で抗体産生速度を比較して、ＣＨＯ細胞における抗体産生のために最適なプロモーターと選択マーカーとの組み合わせを決定した。
【０１１８】
（結果）
表１は、マウスＣＭＶプロモーターから発現される軽鎖を含むベクターが抗体の最良の発現を与えたことを示す。Ｇ４１８耐性カセットまたはピューロマイシン耐性カセットを含むベクターで得られた産生速度の間に、顕著な差異は観察されなかった。別々に実施された同時トランスフェクション実験のプールからの産生速度を、比較した。３〜１８ｐｇ／細胞／日の産生速度を有するこのプールからのクローンを、単離した。しかし、５ｐｇ／細胞／日を超えるクローンは、不安定でありかつ発現を迅速に減少するかまたは産生を停止した。約５ｐｇ／細胞／日を発現するクローンを、最初の発酵実験について使用した。これらの予備的指標は、より速い産生速度が二方向性ＵＣＯＥベクター形質転換体から単離されたクローンにおいて観察されることを非常に奨励する。
（表１：二方向性のＵＣＯＥベクター由来ｈＡｂ１（ＩｇＧ４）の発現（ＣＨＯ−Ｋ１プール）
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> EMD MILLIPORE CORPORATION
<120> ARTIFICIAL UBIQUITOUS CHROMATIN OPENING ELEMENTS (UCOE)
<130> F103O91586
<140> JP 2002-529522
<141> 2001-09-20
<150> GB 0022995.5
<151> 2000-09-20
<150> US 60/252,048
<151> 2000-11-20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 5232
<212> DNA
<213> PDCD2/ACTIN ARTIFICIAL UCOE SEQUENCE
<400> 1
catggcacct gtattgtact cttatcagtc attatatgga ctttaacttc cccagatatt 60
atttgggctc ctccataaga ctgtgagcat ctgaccactg gagtgttgct tcccattata 120
tccctgttat caagcacaag gtcaggcaca gagtaagact caaaacatgt tttggaatgt 180
atgactggta tgaactacaa accagtaagc tgatgttttc attttgagtc tataaatcta 240
attttgtggt ggttttgtgt atggctcaag gctcaaattg taaaatttaa tattatgtga 300
ccaaagaaag ttatacccag aacctcaatt tcctcacctt caaaatgggg cagtttctca 360
ctcattggtc tgctgtcacg attttaatga gctcatgcac aaacagccct ttatataagg 420
taagtgctgg ataaatgttg gctactataa taaaataagc ctctaagata cttggtcagc 480
acaagtacta cccaagagta tgcactgtaa gtaaactgac aaaattgtgt atctaaaact 540
ggccagatga aagagaaact tttaaggggc ccttctgcgt gcccgacact gtgctaggca 600
ctcacactat cccgacccga gaaaccgatc tgcgacccag aggaacttac caagcctcca 660
gcatcttgtg cagccctact catgggacca tctggatacc cacccttgtc tttacaggga 720
gcagaacaca cctcttatgt gtcagaaaac aaagtccagg aagtatattt ttacctgagg 780
caatatctga aaattgtatg ctacagcctc caaagtgagt cttcctctca gtacctctct 840
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gtctggaatt atatggtcca gatgatctga aacaaaaagg acagcactat tagtaatcat 1080
ttagttttga agacagtcta ataatttgct gtctctaaag tactatattc cctatagttc 1140
tggcatttta gataaagggt cataaattaa atgcctatat ggtgacatta ttcagtgatt 1200
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gtactatacc tttcctaatt ttacctttaa agttgtcctg gaaatatctg ggttgacaaa 1320
ggcgatgaaa ctgaactgag acttaaaaaa aagattaccc acctggttgt gcacaagcct 1380
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ggcatctgga gcacgttttg gggcctaaac agccacaaac cctgcagaga tgagcaccag 1500
acttaagctg gagacacact gattctcctg tttctggggg aggattctca gaaggtggct 1560
catatgagta aaaatcgttt ttcctgggta gttgattcct aaaaactaaa aaagaataca 1620
gagaaaagtt ttatcttcaa acaaaacagc aattcacata ttttatcctc tgcacgtaaa 1680
actgaaaata acaacaacaa aaaagaaatg aaagtttttg ctttcaggaa taagctttta 1740
aaatccagaa actagatttc gtccggtaca cgcaactgag ttgcctccta gaggtggttt 1800
gagttaatca aattaataag actgatcgtt aagaacgact gccaaaaata cgaaaaagct 1860
actgggatcc atctttccaa gacaatttct attatctgaa ttaacaccat acctggtacc 1920
cactgattaa aagctggggg ttaccaatgc gcgtgggcac agttagaagc ttatgtagca 1980
aaaatgagca catcctggaa gggcccggga gaaggtgctc ctggggcagc gcggagaggg 2040
agctctgagg ctggggcggc agcggtgctt gccgccgtcc ccctggtcgc tcccggaatt 2100
aacgccgcgc acgcgtcgga ggcatggccc cgtcccgacc ccgtttggcg gctcacctcg 2160
caggccggca cagcacggct gctcgcggca gcagaagagg aagatgcagc ggtggaaggc 2220
gtccgggcgg ccaggcagcg gcgcatacac ctgcagcagg aaggagagcg ggcggccgca 2280
cagctcgcag gccagggcct ggggccccgg cagcccggcc gcgcccagcc atgccggccg 2340
cccgcccacc ttgctgggga actgctcgct gcgcagtcgc cacgccggcg ccgactcggc 2400
gaagcccagc tccacaggcc tggccccggc ggcagccatg cggggcgcgg gctggcgtgg 2460
ggcgcagccc acagctgggt cggaaggcgg aaatcgggcg ccgggccgga aggcaagagg 2520
cgggcacctt tccggaggac aggaggcgga aacgcgtctg acgggagcgg ttgcaggacc 2580
aatgcgaggg aacggggcag aggaaacctc tcggcatcag ccccgcccct ggcgcctctg 2640
cctccgagcc gctttcctgg tgcctccggg tgctctggga tggttctggt ctttgggaga 2700
gtggcagctg gtgacggcgc tccgctcacc tctgcacatg tcttgctgtg ggcctgcggg 2760
tggccgccag ggaggcagag ccctcccgca aaccttccct gctggtgtcc acctcagggt 2820
gtgggaaacc tgtgcgctgg ccgagtgcta accaagagta ggcagtgaaa gacaaatgaa 2880
ggttgaacag gtaaagtgag gaccctacag cggaaaccaa gaatcctgtg tgcctgagag 2940
taatgaagaa gcctctgcag aagagtcttt tctgtcagtc ttaaggtctc tgttttaatg 3000
ttagtgctgg cttgctgtac ctgaattcca agggaggagt gtataatgag gcatggccaa 3060
cccccacttc ccatcattgc ctgaactagt ttttcaggtt aacttcagaa tgcccttggt 3120
accgcgggcc ccctctgtgg tcccacgcca ctgatcgctg catgcccacc acctgggtac 3180
acacagtctg tgattcccgg agcagaacgg accctgccca cccggtcttg tgtgctactc 3240
agtggacaga cccaaggcaa gaaagggtga caaggacagg gtcttcccag gctggctttg 3300
agttcctagc accgccccgc ccccaatcct ctgtggcaca tggagtcttg gtccccagag 3360
tcccccagcg gcctccagat ggtctgggag ggcagttcag ctgtggctgc gcatagcaga 3420
catacaacgg acggtgggcc cagacccagg ctgtgtagac ccagcccccc cgccccgcag 3480
tgcctaggtc acccactaac gccccaggcc tggtcttggc tgggcgtgac tgttaccctc 3540
aaaagcaggc agctccaggg taaaaggtgc cctgccctgt agagcccact tccttcccag 3600
ggctgcggct gggtaggttt gtagccttca tcacgggcca cctccagcca ctggaccgct 3660
ggcccctgcc ctgtcctggg gagtgtggtc ctgcgactct aatggccgca agccacctga 3720
ctcccccaac accacactct acctctcaag cccaggtctc tccctagtga cccacccagc 3780
acatttagct agctgagccc cacagccaga ggtcctcagg ccctgctttc agggcagttg 3840
ctctgaagtc ggcaaggggg agtgactgcc tggccactcc atgccctcca agagctcctt 3900
ctgcaggagc gtacagaacc cagggccctg gcacccgtgc agaccctggc ccaccccacc 3960
tgggcgctca gtgcccaaga gatgtccaca cctaggatgt cccgcggtgg gtggggggcc 4020
cgagagacgg gcaggccggg ggcaggcctg gccatgcggg gccgaaccgg gcactgccca 4080
gcgtggggcg cgggggccac ggcgcgcgcc cccagccccc gggcccagca ccccaaggcg 4140
gccaacgcca aaactctccc tcctcctctt cctcaatctc gctctcgctc tttttttttt 4200
tcgcaaaagg aggggagagg gggtaaaaaa atgctgcact gtgcggcgaa gccggtgagt 4260
gagcggcgcg gggccaatca gcgtgcgccg ttccgaaagt tgccttttat ggctcgagcg 4320
gccgcggcgg cgccctataa aacccagcgg cgcgacgcgc caccaccgcc gagaccgcgt 4380
ccgcccgcga gcacagagcc tcgcctttgc cgatccgccg cccgtccaca cccgccgcca 4440
ggtaagcccg gccagccgac cggggcatgc ggccgcggcc cttcgcccgt gcagagccgc 4500
cgtctgggcc gcagcggggg gcgcatgggg cggaaccgga ccgccgtggg gggcgcggga 4560
gaagcccctg ggcctccgga gatgggggac accccacgcc agttcgcagg cgcgaggccg 4620
cgctcgggcg ggcgcgctcc gggggtgccg ctctcggggc gggggcaacc ggcggggtct 4680
ttgtctgagc cgggctcttg ccaatgggga tcgcacggtg ggcgcggcgt agcccccgtc 4740
aggcccggtg ggggctgggg cgccatgcgc gtgcgcgctg gtcctttggg cgctaactgc 4800
gtgcgcgctg ggaattggcg ctaattgcgc gtgcgcgctg ggactcaatg gcgctaatcg 4860
cgcgtgcgtt ctggggcccg ggcgcttgcg ccacttcctg cccgagccgc tggcgcccga 4920
gggtgtggcc gctgcgtgcg cgcgcgcgac ccggtcgctg tttgaaccgg gcggaggcgg 4980
ggctggcgcc cggttgggag ggggttgggg cctggcttcc tgccgcgcgc cgcggggacg 5040
cctccgacca gtgtttgcct tttatggtaa taacgcggcc ggcccggctt cctttgtccc 5100
caatctgggc gcgcgccggc gccccctggc ggcctaagga ctcggcgcgc cggaagtggc 5160
cagggcgggg gcgacttcgg ctcacagcgc gcccggctat tctcgcagct caccatgccg 5220
gtcgccacca tg 5232
<210> 2
<211> 6303
<212> DNA
<213> RNP/HP-1/ACTIN ARTIFICIAL UCOE SEQUENCE
<400> 2
aagcttactt gattggccat gtggcaagcg acaggcacaa aacaattttc caagtcaata 60
ggaaaaacct cagagctgaa atctttatat gctgtactac acagctgtat tctgggcact 120
tatgaatgtt aaggaaacct gtcttaaaag ttaactaggt taaaaaacct caaacgagag 180
aaagtgatat ccaggaccaa ctgctacaaa cgcataatgc aaactaaaaa gtcacacgta 240
attttcaatc aattattttt tgttcctagc aagcagcatt aattgctgct ctcatcccag 300
ttctacggag ctctccctcc attcgcatgc tcccaactcc taaaaagtag tggtaaaacc 360
cagttcagat tttttttcct gtagttttca tgactcgtaa aaattaaaga aaaaattaac 420
tgaaatgatc aaactagctc ctatgagaca caaagcagtc ttttgaaatg gttacttgtc 480
acgatagtta ttttcatttt ttcagctagt ttttattctt aattgtcgtc agcacatagg 540
ttatctctaa actgaaatta cggataatgt acatttataa caagttttac aaatcactaa 600
caaaaagcaa aaactcatta cttacctcac aatttatcca aacttacccg atgtccacta 660
tcgattttaa acaatgttat tttataaacg tgcttagggt caaagaaaaa taaccaggta 720
gacccccttc gcttgagacc ttatgcttat caatgtaatg ttcaaccaag attgcaaaca 780
aaatgagaaa agtaacaaag ttcaaataca gagcggccca ggcccaaaac agttttgcac 840
atcaatccat acgcattaca ggaaggagcc tctgaagcca tgttttaatc gaagtataac 900
taaggacaaa atcgttattt cactttcctc gtaatcatct ataaaggtcc atggatctgt 960
cccgtaaggg ttaaacttct cagtaacaac attacttaaa atgagtcagc tctacaactt 1020
aaacggaatc cttaagaaca gtaaaggatt ctgacgcgaa tatccctccc ccgcccagaa 1080
aaccaccttc gtccctgccc ctcgtggccg atggcttcca atttatgttt attttgccgc 1140
ggttcatctg tcgttttact gactgcagac ccagataaaa ccgttactca aaggaaaaaa 1200
aagacaggaa aaacataaaa tggtttcttt gtcctacggc tcgcattgaa cccggcccga 1260
cgccctgggt ggtgatatct tctctgaaac cgggcccgca aacccggagc accccccctc 1320
cccgctcttc ggtgtggctt ccgaacgcaa tggcgccatt tcatcgaggg gaaggctgag 1380
cgcctttaat gaggtgcgca ggactctaaa gatccaagct cacaaaacac tccaaatcca 1440
cctcgaaacg atatgaaaac agcccgagaa gaaaaaaaaa atagttaacc acttctactt 1500
cttgatagag aaagcacact aagaaaataa aagagttata aggaaaacgc tgagaggaag 1560
gcgagccatg aaaatggcgg ccgccaaatc ggttcccggg agagaggggg aggggaagct 1620
ccgcagcctc gctcacgagg acctgctgcc cgccgaaacg ctcgccgagg agacgccgtg 1680
gcccccgaag cagcgtgctt tagaaaggga ataagaattc ccgcctccgc gccccacttt 1740
caccccagcg gggcagcgtc cgccatgtga aagctcccca tcccccaccc ccagtgaagg 1800
gaaatggcgc cgggaggctg agggtgggga agctgtttgt acgctcaggc ctccgctcaa 1860
gaccccgttc ataaacctta agccccactg ctactgaatt ggtccgattt cctgcctctc 1920
tcccacggag gcggctggcc gacttccact gaggcgccaa cggcctcgcc atgccctttt 1980
caataactca ttgatttcaa acccgttacc tccatcgcgg actcagtcgc ttcagcccga 2040
tttcccgcag ccgagcgaga tgagagagat ctccgcggac gaacacgaac cggactcgtc 2100
ctggcgctgt agtgagaact gccgctgctc gagaaacaac tctgcgagga gcacctccgc 2160
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ggtgagaaac gtcgcgcagt ttgaaattaa cgccgacggg aggggcttaa tccgcagcct 2520
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gac 6303
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、人工ＵＣＯＥ ＮｃｏＩフラグメントの線状制限地図である。ＰＤＣＤ２転写物およびアクチン転写物を、陰付き矢印として示し、この矢印の方向は、これらそれぞれのプロモーターからの転写の方向を示す。
【図２】 図２は、本発明に従うＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥ ＮｃｏＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図３ａ】 図３ａは、ＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図３ａは、ＣＭＶプロモーターの上流にＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを含み、そして発現されるべきオープンリーディングフレームの挿入に適切なマルチクローニングサイトを含む、ＣＥＴ５００を示す。この特定の実施形態において、プラスミド骨格は、、ｐＥＧＦＰＮ−１由来であり、そしてカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を保有する。
【図３ｂ】 図３ｂは、ＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図３ｂは、ＰＤＣＤ２／アクチン人工ＵＣＯＥを逆方向に含む、ＣＥＴ５０１を示す。
【図４】 図４は、８５日間にわたってＧ４１８選択下で維持された、安定にトランスフェクトされているＣＨＯ細胞のプールにおける、レポーター導入遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現レベルを示す。発現を、ＣＭＶプロモーター単独（ＣＭＶ）により、または８ｋｂのＲＮＰ／ＨＰ−１ ＵＣＯＥ（ＣＥＴ２２０）もしくは人工のＰＤＣＤ２／アクチン ＵＣＯＥ（ＣＥＴ５１０）と組合わせて駆動し、そしてＦＡＣＳによるメジアン蛍光として測定した。
【図５】 図５は、上記の実験における導入遺伝子を発現する細胞の割合を、８５日間にわたるＦＡＣＳ分析での％陽性細胞として示す。
【図６】 図６は、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥフラグメントの線状制限地図である。メチル化のない島を、陰付き矢印として示し、この矢印の方向は、これらそれぞれのプロモーターからの転写の方向を示す。
【図７】 図７は、本発明に従うＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図８ａ】 図８ａは、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図８ａは、ＣＭＶプロモーターの上流にＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを含み、そして発現されるべきオープンリーディングフレームの挿入に適切なマルチクローニングサイトを含む、ＣＥＴ６００を示す。この特定の実施形態において、プラスミド骨格は、ｐＥＧＦＰＮ−１由来であり、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を保有する。
【図８ｂ】 図８ｂは、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを含む発現ベクターのプラスミド地図を示す。図８ｂは、ＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥを逆方向に含む、ＣＥＴ６０１を示す。
【図９】 図９は、１２７日間にわたってＧ４１８選択下で維持された、安定にトランスフェクトされているＣＨＯ細胞のプールにおける、レポーター導入遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現レベルを示す。発現を、ＣＭＶプロモーター単独（ＣＭＶ）により、または順方向（ＣＥＴ２２０）もしくは逆方向（ＣＥＴ２２１）のいずれかである８ｋｂのＲＮＰ ＵＣＯＥと組合わせて駆動するか、または順方向（ＣＥＴ６１０）もしくは逆方向（ＣＥＴ６１１）のいずれかでＲＮＰ／ＨＰ−１／アクチン人工ＵＣＯＥによって駆動し、そしてＦＡＣＳによるメジアン蛍光として測定した。従って、ＣＥＴ６１０がＣＥＴ６００の等価物であるが挿入された遺伝子としてＥＧＦＰを含むこと、およびＣＥＴ６１１がＣＥＴ６０１の対応するＥＧＦＰ含有等価物であることが、理解される。
【図１０】 図１０は、上記の実験における導入遺伝子を発現する細胞の割合を、１２７日間にわたるＦＡＣＳ分析での％陽性細胞として示す。
【図１１ａ】 図１１ａは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
【図１１ｂ】 図１１ｂは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
【図１１ｃ】 図１１ｃは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
【図１１ｄ】 図１１ｄは、免疫グロブリンの発現のための二方向性ＵＣＯＥベクターのプラスミド地図を示す。
Claims (17)
- 同時発現のために同じベクターにおける２つの部位で挿入されるときに２つの分岐転写される発現単位の均衡のとれた発現を支援する方法であって、該方法は、
（ｉ）（ａ）配列番号１の配列、配列番号１のアンチセンス配列、もしくは配列番号１とそのアンチセンスの配列、または
（ｂ）配列番号２の配列、配列番号２のアンチセンス配列、もしくは配列番号２とそのアンチセンスの配列
を含むキメラポリヌクレオチドの形態の異なるハウスキーピング遺伝子からの２つの組み合わされた伸長したメチル化のないＣｐＧ島を提供する工程であって、該伸長したメチル化のないＣｐＧ島の各々はプロモーターを有する、工程；ならびに
（ｉｉ)工程（ｉ）において提供された該キメラポリヌクレオチドを該発現単位について選択された該２つの部位の間に挿入する工程、
を包含し、連結された該伸長したメチル化のないＣｐＧ島の該プロモーターは、該発現単位の分岐転写を駆動するように指向される、方法。 - 前記ベクター中に前記発現単位を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（ｉｉ）において形成された前記発現単位の転写を指向する前記ベクターのヌクレオチド配列が、転写開始のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲおよびヒト免疫不全２（ＨＩＶ２）ＬＴＲまたはそれらの組み合わせから選択されるプロモーターを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列はＣＭＶプロモーターを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記ＣＭＶプロモーターが、マウスＣＭＶプロモーターである、請求項４に記載の方法。
- 前記分岐転写される発現単位は、免疫グロブリン／抗体の重鎖および軽鎖を発現する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- （ａ）配列番号１の配列、配列番号１のアンチセンス配列、もしくは配列番号１とそのアンチセンスの配列、または（ｂ）配列番号２の配列、配列番号２のアンチセンス配列、もしくは配列番号２とそのアンチセンスの配列を含むキメラポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲおよびヒト免疫不全２（ＨＩＶ２）ＬＴＲまたはそれらの組み合わせから選択されるプロモーターをさらに含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が、ＣＭＶプロモーターをさらに含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ＣＭＶプロモーターが、マウスＣＭＶプロモーターである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項７〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって得られ得る請求項１１に記載のベクター。
- 発現ベクターである請求項１１または請求項１２に記載のベクターであり、連結された前記伸長したメチル化のないＣｐＧ島の前記プロモーターは、同時発現される２つの発現単位の分岐転写を駆動するように指向される、ベクター。
- 請求項１１〜１３のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項１３に記載の発現ベクターを含む、請求項１４に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドを生産するための方法であって、該方法は、請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程および該ポリペプチドを単離する工程を包含し、ここで、該発現単位は同時発現される、方法。
- 前記分岐転写される発現単位は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を発現し、該免疫グロブリンが単離される、請求項１６に記載の方法。
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