ES2387951T3 - Expresión génica mejorada - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido lineal aislado para la integración en un cromosoma, que comprende:a. una isla de CpG sin metilación extendida,b. un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,c. un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y loscomponentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleicoexpresable, marcador seleccionable, en la orientación 5' a 3` con respecto a la cadena sentido del ácido nucleicoexpresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3' del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb delextremo proximal del marcador seleccionable.

Description

Expresión génica mejorada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de la cromatina ubicuo (UCOE), junto con un elemento de marcador seleccionable. Cuando está unido operablemente y además flanquea una secuencia de ácido nucleico expresable, la combinación de elementos proporciona unos altos niveles reproducibles de expresión génica. La presente invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia polinucleotídica, a una célula hospedante que comprende el vector y al uso del polinucleótido, del vector o de la célula hospedante en terapia, o para aplicaciones que implican la expresión de proteínas en cultivos celulares.

Antecedentes de la invención

El actual modelo de estructura de la cromatina en eucariotas superiores postula que los genes están organizados en “dominios” (Dillon, N. y Grosveld, F., Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 260-264 (1994); Higgs, D.R., Do LCRs open chromatin domains?, Cell, 95, 299-302 (1998)). Se piensa que los dominios de cromatina existen en un estado condensado, “cerrado” y transcripcionalmente silencioso,

o en una configuración descondensada, “abierta” y transcripcionalmente competente. El establecimiento de una estructura de cromatina abierta caracterizada por una mayor sensibilidad a la ADNasa I, la hipometilación del ADN y la hiperacetilación de histonas, se considera un prerrequisito para el comienzo de la expresión génica.

La naturaleza abierta y cerrada de las regiones de cromatina se refleja en el comportamiento de transgenes integrados de modo aleatorio en el genoma de la célula hospedante. Construcciones idénticas producen patrones diferentes de expresión específica de tejido y específica de la etapa del desarrollo cuando se integran en diferentes localizaciones en el genoma del ratón (Palmiter, R.D. y Brinster, R.L., Ann. Ref. Genet., 20, 465-499 (1986); Allen,

N.D. et al., Nature, 333, 852-855 (1988); Bonnerot, C., Grimber, G., Briand, P. y Nicholas, J.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6331-6335 (1990)).

Tambien se observa con frecuencia un patrón de expresión variegado dentro de un tejido de ratón transgénico concreto, conocido como variegación por efecto de la posición (PEV) (Kloussis, D. y Festenstein, R., Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 614-619 (1997)). Cuando se integran genes exógenos en el cromosoma de cultivos de células de mamífero in vitro, muchos de los acontecimientos de integración producen un rápido silenciamiento del transgén, y el resto muestra una gran variabilidad en los niveles de expresión (Pikaart, M.J., Recillas-Targa, F. y Feisenfield, G., Genes Dev., 12, 2852-2862 (1998); Fussenegger, M., Bailey, J.E., Hauser, H. y Mueller, P.P., Trends Biotech., 17, 35-42 (1999)). Estos efectos de la posición hacen que la expresión del transgén sea ineficaz, con implicaciones en la investigación básica y en aplicaciones biotecnológicas.

El modelo de organización génica de dominios de cromatina sugiere que los elementos de control genéticos que son capaces de establecer y mantener una estructura de la cromatina abierta transcripcionalmente competente deben estar asociados con regiones activas del genoma.

Las regiones de control de locus (LCR) son una clase de elementos reguladores transcripcionales con una capacidad de remodelación de la cromatina de largo alcance. Las LCR están funcionalmente definidas en ratones transgénicos por su capacidad para conferir unos niveles de expresión fisiológicos, dependientes del número de copias del transgén e independientes de sitio de integración, a un gen unido en cis, en especial transgenes de una sola copia (Fraser, P. y Grosveld, F., Curr. Opin. Cell Biol., 10, 361-365 (1998); Li, Q., Harju, S. y Peterson, K.R., Trends Genet., 15:403-408 (1999)). De forma crucial, esta expresión es específica de tejido. Las LCR son capaces de bloquear la propagación de la heterocromatina, evitar la PEV (Kioussis, D. y Festenstein, R., Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 614-619 (1997)), y consisten en una serie de sitios hipersensibles (HS) a la ADNasa I que también pueden estar 5’ o 3’ de los genes que regulan (Li, Q., Harju, S. y Peterson, K.R., Trends Genet., 15:403-408 (1999)).

Parece que las LCR están formadas por dos componentes separados aunque no necesariamente independientes: el primero, el establecimiento de un “dominio de cromatina abierta”, y el segundo una capacidad de activación transcripcional dominante para conferir una expresión dependiente del número de copias del transgén (Fraser, P. y Grosveld, F., Curr. Opin. Cell Biol., 10, 361-365 (1998)). Los mecanismos moleculares mediante los cuales las LCR ejercen su función siguen siendo objeto de discusión (Higgs, D.R., Cell, 95, 299-302 (1998); Bulger, M. y Groudine, M., Genes Dev., 13, 2465-2477 (1999); Grosveld, F., Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 152-157 (1999); Bender, M.A., Bulger, M., Close, J. y Groudine, M., Mol. Cell, 5, 387-393 (2000)).

La generación de líneas celulares de mamífero cultivadas que producen altos niveles de un producto de proteína terapéutica es un importante industria en desarrollo. Los efectos de posición de la cromatina hacen que sea un proceso difícil, caro y largo. La estrategia que se emplea más habitualmente para la producción de dichas “fábricas celulares” de mamífero se basa en la amplificación de genes inducida por una combinación de un gen de resistencia a un fármaco (por ejemplo, DHFR, glutamina sintetasa (Kaufman, R.J., Methods Enzymol., 185, 537-566 (1990)), y el mantenimiento de una presión selectiva rigurosa. El uso de vectores que contienen LCR de dominios de genes altamente expresados, utilizando células derivadas del tejido apropiado, simplifica mucho el procedimiento, produciendo una gran proporción de líneas celulares clonales que muestran unos altos niveles de expresión estable (Needham, M., Gooding, C., Hudson, K., Antoniou, M., Grosfeld, F. y Hollis, M., Nucleic Acids Res., 20, 997-1003 (1992); Needham, M., Egerton, M., Millest, A., Evans, S., Popplewell, M., Cerillo, G., McPheat, J., Monk, A., Jack, A., Johnstone, D. y Hollis, M., Protein Expr. Purif., 6, 124-131 (1995)).

Sin embargo, la especificidad de tejido de las LCR, aunque es útil es algunas circunstancias, también es una importante limitación para muchas aplicaciones, por ejemplo cuando no se conoce ninguna LCR para el tejido en el que se requiere la expresión, o cuando se requiere la expresión en muchos o en todos los tejidos.

Las solicitudes de patentes de los inventores en tramitación junto con la presente PCT/GB99/02357 (documento WO 00/05393), US 09/358082, GB 0022995.5 y US 60/252.048, incorporadas como referencia en la presente, describen elementos que son responsables, en su contexto cromosómico natural, de establecer una estructura de cromatina abierta a lo largo de un locus que consiste exclusivamente en genes constitutivos expresados de forma ubicua. Estos elementos no se derivan de una LCR y comprenden islas de CpG sin metilación extendidas. Los inventores han utilizado la expresión elemento de apertura de la cromatina ubicuo (“ubiquitous chromatin opening element”, UCOE) para describir estos elementos.

En el ADN de mamíferos, el dinucleótido CpG es reconocido por una enzima ADN metiltransferasa que metila la citosina a 5-metilcitosina. Sin embargo, la 5-metilcitosina es inestable y se convierte en timina. Como resultado, los dinucleótidos CpG aparecen con mucha menos frecuencia que la esperada por el azar. No obstante, algunas secciones de ADN tienen una frecuencia de CpG más cercana a la esperada, y estas secuencias se conocen como “islas de CpG”. Tal como se emplea en la presente, una “isla de CpG” se define como una secuencia de ADN de al menos 200 pb, que tiene un contenido en GC de al menos 50% y una proporción de contenido en CpG observado/esperado de al menos 0,6 (es decir, un contenido en dinucleótidos CpG de al menos 60% del esperado por el azar) (Gardiner-Green, M. y Frommer, M., J. Mol. Biol., 196, 261-282 (1987); Rice, P., Longden, I. y Bleasby, A., Trends Genet., 16, 276-277 (2000)).

Las islas de CpG sin metilación son muy conocidas en la técnica (Bird et al. (1985), Cell, 40:91-99; Tazi y Bird (1990), Cell, 60:909-920) y pueden definirse como islas de CpG en las que una proporción sustancial de los restos citosina no están metilados y que habitualmente se extienden más allá de los extremos 5’ de dos genes divergentemente transcritos muy cercanos (0,1-3 kb). Se ha indicado que estas regiones de ADN permanecen hipometiladas en todos los tejidos a lo largo del desarrollo (Wise y Pravtcheva (1999), Genomics, 60:258-271). A menudo están asociadas con los extremos 5’ de genes expresados de forma ubicua, así como con un 40% calculado de genes que muestran un perfil de expresión limitado a ciertos tejidos (Antequera, F. y Bird, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1195-1199 (1993); Cross, S.H. y Bird, A.P., Curr. Opin. Genet. Dev., 5, 309-314 (1995)) y se sabe que son regiones localizadas de cromatina activa (Tazi, J. y Bird, A., Cell, 60, 909-920 (1990)).

Una isla de CpG sin metilación ”extendida” es una isla de CpG sin metilación que se extiende a lo largo de una región que incluye más de un sitio de inicio transcripcional y/o se extiende en más de 300 pb y preferiblemente en más de 500 pb. Los límites de la isla de CpG sin metilación extendida se definen funcionalmente mediante el uso de PCR a lo largo de la región, en combinación con enzimas de endonucleasas de restricción cuya capacidad para digerir (cortar) el ADN en su secuencia de reconocimiento es sensible al estado de metilación de cualquier resto CpG que esté presente. Una de estas enzimas es HpaII, que reconoce y produce la digestión en el el sitio CCGG, que se encuentra habitualmente dentro de las islas de CpG, pero sólo si los restos CG centrales no están metilados. Por tanto, una PCR realizada con ADN digerido con HpaII y a lo largo de una región que porta sitios HpaII no produce un producto de la amplificación, debido a la digestión por HpaII si el ADN no está metilado. La PCR sólo producirá un producto de la amplificación si el ADN está metilado. Por tanto, más allá de la región sin metilación, la HpaII no digerirá el ADN, y se observará un producto de amplificación por PCR que así definirá los límites de la “isla de CpG sin metilación extendida”.

Los inventores han demostrado (documento WO 00/05393) que las regiones que abarcan islas de CpG sin metilación que incluyen promotores divergentemente transcritos duales de los loci de los genes de la proteína de unión a TATA humana (TBP)/componente-B1 de proteosoma (PSMB1) y de la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2/B1 (hnRNP A2)/proteína 1Hsy de heterocromatina (HP1Hsy) producen unos niveles de expresión génica fisiológicos y reproducibles, y que son capaces de evitar un patrón de expresión variegado y el silenciamiento que normalmente aparece tras la intregración de transgenes dentro de la heterocromatina centromérica.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “expresión reproducible” significa que el polinucleótido de la invención dirigirá la expresión del gen expresable sustancialmente al mismo nivel de expresión independientemente de su entorno de cromatina y, preferiblemente, independientemente del tipo de célula o del tipo de tejido en el que pueda estar el polinucleótido de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán que se logra sustancialmente el mismo nivel de expresión del gen expresable unido operablemente, independientemente del entorno de cromatina del polinucleótido reivindicado y, preferiblemente, independientemente del tipo de célula, suponiendo que la célula sea capaz de una expresión génica activa.

Los inventores han demostrado (documento WO 00/05393) que las islas de CpG sin metilación asociadas con promotores que transcriben activamente poseen la capacidad para remodelar la cromatina y, por tanto, se cree que son un determinante principal para establecer y mantener un dominio abierto en loci de genes constitutivos.

Los UCOE confieren una mayor proporción de acontecimientos de transporte génico productivos con mejoras en el nivel y en la estabilidad de la expresión de transgenes. Esto tiene importantes aplicaciones de investigación y biotecnológicas, incluyendo la generación de animales transgénicos y de productos de proteínas recombinantes en células cultivadas. Los inventores han demostrado (documento WO 00/05393) los efectos beneficiosos de los UCOE en la expresión de la construcción indicadora CMV-EGFP y con el eritropoyetina, una proteína segregada farmacéuticamente valiosa. Las propiedades de los UCOE también sugieren utilidad en la terapia génica, cuya eficacia a menudo se ve limitada por una baja frecuencia de acontecimientos de transporte génico productivos y un nivel y duración inadecuados de la expresión (Verma, I.M. y Somia, N., Nature, 389:239-242 (1997)).

Dadas estas implicaciones significativas y amplia gama aplicaciones, se desea optimizar aún más los niveles de expresión de transgenes. Es necesario aumentar aún más los niveles de expresión obtenibles mediante el uso de un UCOE solo, en particular en el campo de la terapia génica in vivo y para la producción in vitro de proteínas recombinantes.

La expresión de un ácido nucleico unido operablemente a un UCOE 5’ puede aumentarse aún más, de forma sorprendente, mediante la presencia de un elemento seleccionable 3’ al ácido nucleico expresado, de forma que la secuencia de ácido nucleico expresable está flanqueada por un UCOE 5’ y un marcador seleccionable 3’.

Un elemento seleccionable que realiza más de una función en un vector, tal como proporcionar un marcador seleccionable, así como aumentar la expresión de un gen unido operablemente, permite la construcción de vectores de expresión más compactos y eficaces.

Mei, Kothary y Wall (Mei, Q., Kothary, R. y Wall, L., Exp. Cell Research, 260, 304-312 (2000)) describen construcciones que comprenden un gen expresable (1-globina) unido operablemente a una LCR y un elemento de resistencia a puromicina/pgk. Sin embargo, este trabajo indica que es la combinación de un gen expresable y una LCR y un elemento de resistencia a neomicina/tk lo que resulta importante para imponer efectos de posición sobre la expresión génica, utilizándose el elemento de resistencia a puromicina/pgk como control negativo. Este artículo no indica ningún efecto beneficioso obtenido del uso de un elemento de resistencia a puromicina/pgk. Este artículo no describe construcciones que comprenden una isla de CpG no metilada extendida (o UCOE), un gen expresable y un elemento de resistencia a puromicina/pgk, puesto que las construcciones comprenden LCR. De manera similar, el artículo no describe un gen expresable unido operablemente a un promotor con el que no está unido en la naturaleza, también unido operablemente a un elemento de resistencia a puromicina/pgk, puesto que en cada caso el gen de 1-globina se expresa bajo el control de su promotor endógeno.

Arteit et al. comparan la influencia de los genes de resistencia a neomicina y a puromicina en genes unidos en cis en vectores de expresión eucariotas (Arteit, P., Grannemann, R., Stocking, C., Friel, J., Baritsch, J. y Hauser, H., Gene, 99, 249-254 (1991)). Concluyen que los genes de resistencia a neomicina pueden tener un efecto silenciador sobre los genes unidos, pero que “el gen que confiere resistencia a la puromicina de Streptomyces alboniger no influye en promotores adyacenters”. Por consiguiente, no hay nada en este artículo que describa o sugiera la importancia del uso de la posición o el espaciamiento de genes resistentes, según se describe en la presente solicitud.

Las solicitudes de patentes de los inventores en tramitación junto con la presente PCT/GB99/02357 (documento WO 00/05393), US 09/358082, GB 0022995.5 y US 60/252.048, describen polinucleótidos y vectores que comprenden islas de CpG sin metilación extendidas unidas operablemente a ácidos nucleicos expresables con genes de resistencia a antibióticos. Sin embargo, en los ejemplos descritos, el gen de antibiótico no está adyacente y 3’ al ácido nucleico expresable. De forma similar, la sorprendente contribución de dicho marcador seleccionable adyacente tampoco se describe ni se insinua.

Afirmaciones de la invención

La presente invención indica que la influencia de las islas de CpG no metiladas extendidas (UCOE) para sobrerregular la expresión de secuencias de ácidos nucleicos unidas operablemente puede aumentarse aún más mediante la presencia de un elemento seleccionable, con la condición de que dicho marcador seleccionable se sitúe 3’ de la secuencia de ácido nucleico expresable y sea adyacente a esta.

Los términos 5’ y 3’ se utilizan en la presente con respecto a la cadena sentido de la secuencia de ácido nucleico expresable. Así, el extremo 5’ de dicha secuencia se corresponde con el inicio de la transcripción, que avanza en la dirección 3’.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “unido operablemente” se refiere a una relación de operabilidad entre elementos en los polinucleótidos de la invención. “Unido operablemente” es una expresión, muy conocida por los expertos en la técnica, que describe una relación funcional entre secuencias de ADN que actúan en cis. La relación estructural exacta puede o no ser importante, y es distinta para diferentes tipos de elementos. Para un promotor implica una posición fundamentalmente adyacente (normalmente dentro de menos de 100 pb) 5’ al marco de lectura abierto que dirige. En el caso de islas de CpG sin metilación extendidas, parece que un efecto regional sobre la estructura de la cromatina es responsable de aumentar el nivel y la coherencia de la expresión génica. Como ejemplo, el elemento que comprende una isla de CpG sin metilación extendida está colocado inmediatamente 5’ del gen expresable. Sin embargo, “unido operablemente” incluye la posibilidad de estar colocado en otra parte, con la condición de que pueda demostrarse un efecto funcional claro.

En particular, el hecho de que un gen expresable esté flanqueado por un UCOE en el extremo 5’ y un elemento seleccionable en el otro produce un aumento en la expresión en aproximadamente dos veces. En algunos casos, el aumento es mayor que cinco veces el obtenido con un UCOE solo.

Según la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que permite obtener unos mayores niveles de expresión de un gen unido operablemente comparados con los obtenibles utilizando sólo una isla de CpG sin metilación extendida o sólo un UCOE unido operablemente.

El polinucleótido aislado comprende: una isla de CpG sin metilación extendida, un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación, y un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor, en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

Tal como se emplea en la presente, el “extremo proximal” significa el extremo del gen del marcador seleccionable (incluyendo su promotor) que está más cercano al extremo 3’ del ácido nucleico expresable, según está marcado por su señal de poliadenilación. Se contempla que el marcador seleccionable puede estar en cualquier orientación, de forma que el extremo proximal con relación al ácido nucleico expresable pueda estar en el extremo del promotor 5’ del marcador seleccionable o en el 3’, la terminación del extremo de la transcripción, siendo 5’ y 3’ según la cadena sentido del marcador seleccionable.

Preferiblemente, el inicio transcripcional del marcador seleccionable está dentro de 1500 pb del extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico expresable, según está marcado la señal de poliadenilación de la última. Más preferiblemente, están dentro de 1000 pb. Lo más preferiblemente, está dentro de 500 pb.

En un aspecto de la invención, el elemento seleccionable es un gen de resistencia a un antibiótico. Preferiblemente, es un gen de resistencia a un antibiótico obtenido de una especie de Streptomyces. Más preferiblemente, dicho gen de resistencia a un antibiótico está unido operablemente a un promotor del gen de la fosfoglicerato quinasa (pgk). Lo más preferiblemente, es el promotor del gen pgk murino (Adra, C.N., Boer, P.H. y McBurney, M.W., Gene, 60, 65-74 (1987)). Como alternativa, puede ser otro promotor pgk de mamífero.

En una realización preferida, el gen de resistencia a un antibiótico es el gen de resistencia a puromicina de una especie de Streptomyces. Lo más preferiblemente, es el gen de puromicina N-acetiltransferasa de Streptomyces alboniger (Vara, J.A., Portela, A., Ortin, J., Jiménez, A., Nucleic Acids Res., 14, 4617-4624 (1986)).

Como alternativa, el gen de resistencia a un antibiótico es una forma modificada del gen de puromicina Nacetiltransferasa de Steptomyces alboniger. Preferiblemente, este gen se ha modificado mediante la manipulación de su utilización de los codones, de la manera en que se hace habitualmente para adaptar genes bacterianos para la expresión en células hospedantes de mamífero. Esta modificación de codones no cambia la secuencia de aminoácidos codificada, con el resultado de que la enzima expresada es igual que la puromicina N-acetiltransferasa de tipo salvaje. Lo más preferiblemente, el gen modificado tiene la secuencia mostrada en la figura 15.

Como alternativa, el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a neomicina derivado de una especie de Steptomyces. Preferiblemente, es el gen de aminoglicósido fosfotransferasa de Streptomyces fradiae (Thompson, C.J. y Gray, G.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5190-5194 (1983)).

En una realización alternativa, el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a higromicina. Preferiblemente, es el gen de higromicina fosfotransferasa de Streptomyces hygroscopicus.

En otra realización alternativa, el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a bleomicina. Preferiblemente, es una proteína de unión a bleomicina de Streptomyces verticillus. Como alternativa, es la bleomicina N-acetiltransferasa de Streptomyces verticillus.

En otra realización, el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a blasticidina. Preferiblemente, es el gen de blasticidina S-acetiltransferasa de Streptomyces verticillum.

En otro aspecto de la invención, el gen de resistencia a un antibiótico no se obtiene de una especie de Streptomyces. En una realización preferida, es el gen de resistencia a higromicina que codifica la aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli.

En otra realización preferida, es el gen de neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5, derivado originariamente de Klebsiella pneumoniae.

En un aspecto alternativo de la invención, el marcador seleccionable no es un gen de resistencia a un antibiótico. Los mecanismos de selección alternativos implican la utilización de genes que codifican la timidilato sintasa, la timidina quinasa o la dihidrofolato reductasa. Estos mecanismos de selección son muy conocidos por los expertos en la técnica. En un medio sin metionina puede utilizarse un gen que codifique la glutamina sintetasa como medio de selección en células que carecen de una glutamina sintetasa endógena, o cuando el uso de un inhibidor, tal como metionina sulfoxamina, ha hecho que sea inactiva (Kaufman, R.J., Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells, Methods Enzymol., 185, 537-566 (1990)).

En otro aspecto, puede utilizarse un marcador seleccionable. Por ejemplo, un gen que codifique una proteína fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde de Aequoria victoria (GFP), o sus variantes potenciados (EGFP), puede utilizarse como marcador seleccionable. Los transfectantes que contienen un polinucleótido según la presente invención, en los que el marcador seleccionable codifica GFP, pueden seleccionarse por la luminosidad de la fluorescencia con un FACS, mediante un proceso muy conocido en la técnica. Utilizando el polinucleótido de la invención y comparándolo con construcciones expresables con el marcador seleccionable situado 5’ al UCOE o 3’ del transgén (ácido nucleico expresable) pero muy alejado de él, se obtendrán mayores niveles de expresión del transgén para niveles comparables de luminosidad. Por tanto, la selección de las células más luminosas permitirá la selección de células con el mayor nivel de expresión del transgén.

En un aspecto de la invención, la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 16 kb que abarca el gen de hnRNP A2 humano con secuencias flanqueantes 5’ de 5 kb y 3’ de 1,5 kb. Preferiblemente, la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen de hnRNP A2 humano (documento WO 00/05393).

Como alternativa, la isla de CpG sin metilación extendida del polinucleótido descrito es un “UCOE artificial”, según se describe en las solicitudes de los inventores en tramitación junto con la presente GB 0022995.5 y US 60/252.048, que comprende la región promotora/isla de CpG de la 1-actina humana o uno de sus fragmentos. Preferiblemente, este fragmento está dentro del intervalo de tamaño de 100 pb a 3,0 kb y abarca la región promotora/isla de CpG de la 1-actina humana o uno de sus fragmentos. Preferiblemente, el UCOE artificial también comprende la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana o uno de sus fragmentos. Más preferiblemente, la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana comprende un fragmento dentro del intervalo de tamaño de 100 pb a 3,0 kb. Más preferiblemente, la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN dentro del intervalo de tamaño de 100 pb a 3,0 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de la 1-actina humana y un fragmento de ADN dentro del intervalo de tamaño de 100 pb a 3,0 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana.

Lo más preferiblemente, el polinucleótido reivindicado de esta realización de la invención comprende un UCOE artificial que comprende un fragmento de ADN de 2,0 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de la 1-actina humana y un fragmento de ADN de 1,8 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana.

También se proporciona un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las realizaciones previas. Este vector puede ser un vector episómico o un vector integrador. Dependiendo de su uso previsto, los vectores episómicos pueden resultar deseables, puesto que son autorreplicantes y así persisten sin necesidad de integración. Los vectores episómicos de este tipo se describen en el documento WO 98/07876. También se prefieren los vectores no integrantes y no replicantes.

También se proporciona un vector construido para transportar, tras linealizarse e integrarse en un cromosoma, un polinucleótido que comprende una isla de CpG sin metilación extendida, un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación, y un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor, en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

Preferiblemente, el vector es un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser un virus, tal como un adenovirus, un virus adenoasociado, un herpesvirus, un virus de vaccinia, un lentivirus u otro retrovirus.

Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión adaptado para la expresión de genes eucariotas. Generalmente, esta adaptación incluye, como ejemplo y no como limitación, el suministro de secuencias de control de la transcripción (secuencias promotoras) que median en la expresión específica de célula/tejido. Promotor y potenciador son términos muy conocidos en la técnica, e incluyen las siguientes características que se proporcionan sólo como ejemplo y no como limitación. Los promotores son secuencias reguladoras 5’ que actúan en cis unidas directamente al inicio de la transcripción. Los elementos promotores incluyen la denominada caja TATA y secuencias de selección de inicio de ARN polimerasa (RIS) que actúan para seleccionar un sitio de inicio de la transcripción. Estas secuencias también se unen a polipéptidos que actúan, entre otras funciones, para facilitar la selección de inicio de la transcripción por la ARN polimerasa.

Los elementos potenciadores son secuencias de ácidos nucleicos que actúan en cis que a menudo se encuentran 5’ al sitio de inicio de la transcripción de un gen (los potenciadores también pueden encontrarse 3’ a una secuencia génica o incluso localizarse en secuencias intrónicas y, por tanto, son independientes de la posición). Los potenciadores actúan para aumentar la tasa de transcripción del gen al cual está unido el potenciador. La actividad potenciadora responde a factores de transcripción que actúan en trans (polipéptidos) que se ha demostrado que se unen de modo específico con elementos potenciadores. La unión/actividad de los factores de transcripción responde a una serie de indicios ambientales que incluyen, como ejemplo y no como limitación, metabolitos intermedios (por ejemplo, glucosa), efectores ambientales (por ejemplo, calor) (véase Eukaryotic Transcription Factors, de David S. Latchman, Academic Press Ltd., San Diego).

Las adaptaciones también incluyen el suministro de marcadores seleccionables y secuencias de replicación autónoma que facilitan ambos el mantenimiento de dicho vector en la célula eucariota o el hospedante procariota. Los vectores que se mantienen de forma autónoma en células eucariotas se denominan vectores episómicos. Otras adaptaciones que facilitan la expresión de genes codificados por vectores incluyen el suministro de secuencias de terminación de la transcripción/poliadenilación. Esto también incluye el suministro de sitios de entrada a ribosomas internos (IRES) que actúan para maximizar la expresión de genes codificados por el vector dispuestos en módulos de expresión bicistrónicos o multicistrónicos. Estas adaptaciones son muy conocidas en la técnica. Exista una cantidad considerable de bibliografía publicada con respecto a la construcción de vectores de expresión y de técnicas de ADN recombinante en general. Véase Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY y las referencias citadas en ello; Marston, F. (1987), DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, vol. III, IRL Press, Oxford, Reino Unido; DNA Cloning, F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

En un método preferido de la invención, dicho vector codifica y, por tanto, dicho polipéptido tiene una señal de secreción para facilitar la purificación de dicho polipéptido.

Como alternativa, otras realizaciones preferidas pueden incluir otros refinamientos para facilitar la purificación de la proteína recombinante expresada, tales como marcadores de afinidad o epitopos, o sitios de ruptura enzimática.

Preferiblemente, el ácido nucleico expresable es un ácido nucleico terapéutico.

Como alternativa, el ácido nucleico expresable codifica una proteína recombinante para la expresión en un sistema de cultivo celular in vitro.

Como alternativa, el gen expresable codifica un producto no polipeptídico, tal como ARN. Dicho ARN puede ser un ARN antisentido capaz de inhibir la expresión de un gen concreto a nivel postranscripcional, o puede tener una función enzimática (ribozima) u otra función, tal como un ARN ribosómico.

Una realización preferida es un vector que comprende: una isla de CpG sin metilación extendida, un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación, y un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor, en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable. Preferiblemente, la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable. Más preferiblemente, está dentro de 1000 pb, lo más preferiblemente 500 pb.

Una realización preferida es un vector que comprende: una isla de CpG sin metilación extendida, un sitio de clonación múltiple, un gen de resistencia a un antibiótico obtenido de una especie de Streptomyces, en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al sitio de clonación múltiple, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, sitio de clonación múltiple, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y el sitio de clonación múltiple está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

Más preferiblemente, el sitio de clonación múltiple también está unido operablemente a un promotor. Más preferiblemente, el promotor se selecciona de CMV, EF-1e, LTR de RSV o LTR de VIH2, o combinaciones de secuencias derivadas de estos. Más preferiblemente, el promotor es un promotor inmediato/temprano de CMV. Lo más preferiblemente, es un promotor inmediato/temprano de CMV de ratón. En una realización preferida, el vector comprende un promotor de CMV, un sitio de clonación múltiple, una secuencia de poliadenilación, y genes que codifican marcadores seleccionables bajo elementos de control adecuados.

Una realización preferida del vector comprende los nucleótidos 1-10551 de la secuencia de la figura 9. La realización más preferida es el vector CET 710. Como alternativa, el vector comprende los nucleótidos 1-13545 de la secuencia de la figura 10, y es preferiblemente el vector CET 720.

Otras realizaciones preferidas de vectores son:

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CET 740, en el que el gen de resistencia a puromicina de CET 720 está reemplazado por el gen de aminoglicósido fosfotransferasa de Streptomyces fradiae (según se lista en la figura 15). También se prefieren los vectores que tienen secuencias de ácidos nucleicos expresables insertadas en el sitio de clonación múltiple de CET 740, tales como CET 741.

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CET 760, en el que el gen de resistencia a puromicina de CET 720 está reemplazado por la aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli (según se lista en la figura 17). También se prefieren los vectores que tienen secuencias de ácidos nucleicos expresables insertadas en el sitio de clonación múltiple de CET 760, tales como CET 761.

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CET 780, en el que el gen de resistencia a puromicina de CET 720 está reemplazado por la forma modificada del gen de puromicina N-acetiltransferasa de Streptomyces alboniger (según se lista en la figura 14). También se prefieren los vectores que tienen secuencias de ácidos nucleicos expresables insertadas en el sitio de clonación múltiple de CET 780, tales como CET 781.

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CET 820, en el que el promotor de CMV IE humano, unido operablemente al sitio de multiclonación para dirigir la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos expresables insertadas en él, se ha reemplazado por el promotor de CMV IE murino. También se prefieren los vectores que tienen secuencias de ácidos nucleicos expresables insertadas en el sitio de clonación múltiple de CET 820, tales como CET 821.

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CET 823, en el que la isla de CpG sin metilación extendida que comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen de hnRNP A2 humano está reemplazado por la isla de CpG sin metilación extendida que comprende un fragmento de 8 kb que abarca el gen de hnRNP A2 murino (tal como se muestra en la secuencia de la figura 19). También se prefieren los vectores que tienen secuencias de ácidos nucleicos expresables insertadas en el sitio de clonación múltiple de CET 823, tales como CET 824.

También se proporciona una célula hospedante transfectada con cualquiera de las realizaciones de los vectores descritos.

Como alternativa, dicho polinucleótido, vector o célula hospedante puede utilizarse en un sistema de cultivo celular para obtener la expresión de un producto génico deseado. Los sistemas de cultivo celular adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen a fondo en el conjunto de la bibliografía conocida por los expertos en la técnica. Se proporciona un método para la producción de un polipéptido según la invención, que comprende:

i) proporcionar una célula transformada/transfectada con una molécula de ácido nucleico según la invención;

ii) cultivar dicha célula en condiciones que conducen a la fabricación de dicho polipéptido; y

iii) purificar dicho polipéptido de dicha célula, o su entorno de crecimiento.

En una realización preferida de la invención, dicha molécula de ácido nucleico es el vector según la invención.

La presente invención también proporciona el polinucleótido, el vector o la célula hospedante para su uso en terapia.

La presente invención también proporciona el uso del polinucleótido, del vector o de la célula hospedante para la fabricación de una composición para su uso en terapia génica.

La presente invención también proporciona un método de tratamiento, que comprende administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz del polinucleótido, vector o célula hospedante de la presente invención. Preferiblemente, el paciente padece una enfermedad tratable mediante terapia génica.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido y/o el vector y/o la célula hospedante, opcionalmente mezclados con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para terapia para tratar una enfermedad o para proporcionar a las células de un tejido concreto una proteína o una función ventajosas.

El polinucleótido, el vector o la célula hospedante de la invención o la composición farmacéutica puede administrarse a través de una vía que incluye la vía sistémica intramuscular, intravenosa, en aerosol, oral (en forma sólida o líquida), tópica, ocular, rectal, intraperitoneal y/o intratecal, y mediante inyección directa local.

El régimen de dosificación exacto por supuesto será determinado por cada médico para cada paciente individual y esto, a su vez, vendrá controlado por la naturaleza exacta de la proteína expresada por el gen de interés y por el tipo de tejido al que se dirige el tratamiento.

La dosificación también dependerá de la indicación de la enfermedad y de la vía de administración. El número de dosis dependerá de la enfermedad y de los datos de eficacia de los ensayos clínicos.

La cantidad de polinucleótido o de ADN de vector administrada para una terapia génica eficaz según la invención estará preferiblemente en el intervalo de 50 ng-1000 !g de ADN de vector/kg de peso corporal, y más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1-100 !g de ADN de vector/kg.

Aunque se prefiere, según la invención, administrar el polinucleótido, el vector o la célula hospedante a un mamífero para la captación celular in vivo, puede utilizarse una estrategia ex vivo en la que las células se retiran de un animal, se transducen con el polinucleótido o el vector, y después se reimplantan en el animal. Puede accederse al hígado, por ejemplo, mediante una estrategia ex vivo retirando los hepatocitos de un animal, transduciendo los hepatocitos in vitro y reimplantando los hepatocitos transducidos al animal (por ejemplo, tal como se describe para conejos en Chowdhury et al., Science, 254:1802-1805, 1991; o en seres humanos en Wilson, Hum. Gene Ther., 3:179-222, 1992). Estos métodos también pueden ser eficaces para la administración a diversas poblaciones de células en los sistemas circulatorio o linfático, tales como eritrocitos, células T, células B y células precursoras hematopoyéticas.

Otro aspecto de la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un primer promotor unido operablemente a un gen expresable al cual no está unido operablemente en la naturaleza, y un elemento seleccionable también unido operablemente y 3’ al gen expresable, que comprende un promotor pgk y un gen de resistencia a puromicina. También se proporciona el uso de dicho polinucleótido para obtener la expresión reproducible de dicho gen expresable en al menos dos tipos de tejidos o de células.

En otra realización de la invención se proporciona un animal transgénico no humano que comprende un elemento de isla de CpG sin metilación extendida introducido de modo artificial, y un elemento de marcador seleccionable introducido de modo artificial, en el que ambos elementos están unidos operablemente a un gen expresable situado entre ellos, y en el que la expresión reproducible de dicho gen expresable se produce en al menos dos tipos de tejidos o de células. Los métodos para fabricar ratones transgénicos (Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7380 (1980); Harbers et al., Nature, 293:540 (1981); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5016 (1981); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:6376 (1981)), ovejas, cerdos, pollos (véase Hammer et al., Nature,

315:680 (1985)), etc. son muy conocidos en la técnica y se contemplan para su uso según la invención.

Estos animales transgénicos que contienen el polinucleótido de la invención también pueden utilizarse para la producción a largo plazo de una proteína de interés.

También se proporciona un modelo de mamífero para determinar la eficacia de la terapia génica utilizando el polinucleótido, el vector o la célula hospedante de la invención. El modelo de mamífero comprende un animal transgénico cuyas células contienen el vector de la presente invención. Estos animales permiten el ensayo antes de empezar los ensayos clínicos en seres humanos.

La presente invención también proporciona el uso del polinucleótido de la presente invención para producir plantas transgénicas.

La generación de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento, o mayor resistencia a enfermedades, plagas, sequías o entornos salinos, es muy conocida por los expertos en la técnica. La presente invención también proporciona la creación de plantas transgénicas que contienen células que contienen el polinucleótido de la presente invención. Algunas o todas las células que comprenden el UCOE artificial pueden surgir de plantas.

La presente invención también se refiere al uso del polinucleótido de la presente invención en aplicaciones de la genómica funcional. La genómica funcional está relacionada principalmente con la identificación de genes específicamente expresados en tipos de células o estados de enfermedad concretos, y en la actualidad proporciona miles de nuevas secuencias génicas de potencial interés para el descubrimiento de fármacos o para objetivos de terapia génica. El principal problema en la utilización de esta información para el desarrollo de nuevas terapias está en cómo determinar las funciones de estos genes. Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse en una serie de aplicaciones de la genómica funcional para determinar la función de las secuencias génicas. Las aplicaciones de la genómica funcional de la presente invención incluyen, pero no se limitan a:

(1)

La utilización del polinucleótido de la presente invención para lograr una expresión sostenida de las versiones antisentido de las secuencias génicas o de bancos de inactivación de ribozimas, determinando con ello los efectos de la inactivación de los genes sobre el fenotipo celular.

(2)

La utilización del polinucleótido de la presente invención para preparar bancos de expresión para las secuencias génicas, de modo que el transporte hacia el interior de las células produzca una expresión fiable, reproducible y sostenida de las secuencias génicas. Las células resultantes, que expresan las secuencias génicas, pueden utilizarse en una diversidad de estrategias para la determinación de la función y el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, la generación de anticuerpos neutralizantes contra el producto génico; la purificación rápida del producto de proteína del propio gen para su uso en estudios estructurales, funcionales o de selección de fármacos; o en selecciones de fármacos basadas en células.

(3)

La utilización del polinucleótido de la presente invención en estrategias que implican células precursoras embrionarias (ES) de ratón y ratones transgénicos. Una de las estrategias de la genómica funcional más poderosas implica la inserción aleatoria en genes de células ES de ratón de construcciones que sólo permitan la selección de fármacos tras la inserción en genes expresados, y que pueden rescatarse con facilidad para la secuenciación (G. Hicks et al., Nature Genetics, 16, 338-334). Entonces pueden fabricarse con facilidad ratones transgénicos con mutaciones de inactivación en los genes con secuencias nuevas para investigar su función. En la actualidad, esta tecnología funciona bien para 10% de los genes de ratón que se expresan bien en células ES de ratón. La incorporación de los polinucleótidos de la presente invención en las construccioens de integración permitirá que esta técnica se extienda para identificar todos los genes expresados en ratones.

Descripción detallada de la invención

La invención ahora se describirá sólo como ejemplo y haciendo referencia a las figura adjuntas, en las que:

La figura 1 muestra mapas de los vectores “vacíos” CET 200.1, 210, 710 y 720. La inserción del gen de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en el sitio de multiclonación produce CET 230, 711 y 721, respectivamente. Todos los vectores contienen un promotor de CMV a partir del cual se expresan los genes insertados. Sin embargo, en el caso de CET 120 (y su derivado que expresa EGFP, CET 230), aunque dicho gen insertado estaría flanqueado por un UCOE y un elemento de resistencia a puromicina/pgk en el plásmido, este último no está inmediatamente adyacente. De forma más importante, está separado por un sitio PvuI utilizado para linealizar el plásmido antes de la transfección. Después de la integración en el cromosoma de la célula hospedante, esto da como resultado que el gen ya no está flanqueado, puesto que el UCOE y el elemento de resistencia a puromicina/pgk se integrarán en el mismo lado del gen. En el caso de CET 710 (y su derivado que expresa EGFP, CET 711) y CET 720 (y su derivado que expresa EGFP, CET 721), la linealización con PvuI da como resultado la integración del gen flanqueado muy de cerca por el UCOE en un lado y el elemento de resistencia a puromicina/pgk en el otro. CET 210 (y CET 230) y CET 720 (y CET 721) portan UCOE derivados de hnRNP, mientras que CET 710 (y CET 711) portan un UCOE derivado de PDCD2/1-actina “artificial”.

La figura 2 muestra la expresión de EGFP de diversos vectores transfectados en células CHO-K1 según se mide mediante la mediana de la fluorescencia en un análisis FACS medida en los días indicados después de la transfección. “EGFP” representa células transfectadas con un plásmido control que no contiene UCOE (pEGFP). CET 220 muestra las células transfectadas con un plásmido en el que la unidad de expresión de EGFP está unida operablemente a un UCOE derivado de hnRNP pero no a un elemento de resistencia a puromicina/pgk. En su lugar se utiliza un elemento de resistencia a neomicina/SV40. El resto de las células son transfectadas con CET 230, 711

o 721, cuyas estructuras se muestran en la figura 1.

La figura 3 muestra la proporción de las poblaciones de células mostradas en la figura 2 que se consideran positivas para la expresión en los días indicados después de la transfección.

La figura 4 muestra la expresión de EGFP en células CHO-K1 transfectadas con los vectores CET 220, 230, 721 y 711 según se mide mediante la mediana de la fluorescencia corregida para permitir la comparación sin exceder la capacidad de detección del FACScan. Esto demuestra claramente el efecto comparativo de colocar el marcador seleccionable (puro’) bien 5’ (CET 230) o bien 3’ (CET 721) al transgén expresable (EGFP).

La figura 5 muestra la expresión de EGFP en células CHO-K1 transfectadas con los vectores CET 701, 721, 704, 741, 705, 751, 706, 761, 708 y 781, según se mide mediante la mediana de la fluorescencia corregida para permitir la comparación sin exceder la capacidad de detección del FACScan.

La figura 6 muestra los niveles de expresión de EGFP en células CHO-K1 transfectadas con vectores que comparan UCOE de hnRNP humanos y murinos 5’ con un gen de resistencia a puromicina 3’.

La figura 7 muestra el efecto de la posición del gen de resistencia a neomicina de Streptomyces sobre la expresión de EGFP. CET 741 tiene el marcador seleccionable 3’ del transgén, CET 745 tiene el marcador 5’ del transgén y UCEO. El UCOE es el UCOE de RNP humano en ambos casos.

La figura 8 muestra un mapa del plásmido CET 700.

La figura 9 muestra un mapa del plásmido CET 710.

La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 710.

La figura 11 muestra un mapa del plásmido CET 720.

La figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 720.

La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de puromicina N-acetiltransferasa de S. alboniger de tipo salvaje.

La figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de puromicina N-acetiltransferasa de S. alboniger modificado. La figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de aminoglicósido fosfotransferasa de S. fradiae. La figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de higromicina fosfotransferasa de S. hygroscopicus.

La figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de aminociclitol fosfotransferasa (hygror) de E. coli. La figura 18 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5 (Klebsiella pneumoniae).

La figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento HindIII de hnRNP A2 de ratón. La figura 20 muestra un mapa del plásmido CET 1010. La figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 1010. La figura 22 muestra un mapa del plásmido CET 1020. La figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 1020. La figura 24 muestra un mapa del plásmido CET 1030. La figura 25 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 1030. La figura 26 muestra un mapa del plásmido CET 1110. La figura 27 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 1110. La figura 28 muestra un mapa del plásmido CET 1120. La figura 29 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 1120. La figura 30 muestra un mapa del plásmido CET 1130. La figura 31 muestra la secuencia de nucleótidos de CET 1130. Ejemplos Ejemplo 1: Flanquear un gen expresable con UCOE y elementos seleccionables Materiales y métodos

Construcción de vectores de expresión PGK-puro CET

CET 700

Se retiró el módulo CMV-MCS-SV40pA de CET 31 (un plásmido basado en CMV MCS pA SV40Neo) como un fragmento AseI/AfiII, se rellenaron los extremos romos con una ADN polimerasa de T4 y se volvió a acoplar en pPGK-puro (promotor mPGK, gen de resistencia a puromicina, bGHpA en pBluescript) que había sido digerido con EcoRV.

CET 720

Se digirió CET 20 (fragmento de hnRNP A2 de 8,3 kb en pBluescript) con HindIII para obtener el UCOE de RNP de 8 kb y esto después se acopló en CET 700 que también se había cortado con HindIII.

CET 710

El UCOE artificial se retiró de CET 21 (UCOE artificial en pBluescript) como un fragmento XbaI/ClaI, se rellenaron los extremos romos con una ADN polimerasa de T4 y se acopló en CET 700 que había sido digerido con HindIII y de nuevo se rellenaron los extremos romos con ADN polimerasa de T4.

CET 230

Este vector se construyó digiriendo pUC19 con NarI y EcoRI para eliminar aproximadamente 160 pb, seguido de la formación de extremos romos y el reacoplamiento. Esto elimina uno de los dos sitios PvuI y PvuII en el esqueleto del vector. El módulo CMV-EGFP-SV40pA (con su MCS delecionado) se escindió de pEGFPN-1 (Clontech) como un digerido de AseI/AfiII, seguido del relleno de los extremos romos, y después se insertó en el esqueleto del vector pUC19 que había sido digerido con NdeI y Eco109I y de nuevo se rellenaron los extremos romos.

El módulo PGK-Puro-bGpA entonces se retiró de pPGK-Puro como un fragmento con extremos romos rellenados EcoRI/XhoI y se insertó en el sitio exclusivo PvuII del anterior vector. Por último, el fragmento de hnRNP A2 de 8,3 kb se insertó en el sitio HindIII exclusivo de este vector como un fragmento HindIII derivado de CET 20.

Para aclarar:

CET 230 es la versión que expresa EGFP del vector CET 210 “vacío”.

CET 711 es la versión que expresa EGFP del vector CET 710 “vacío”.

CET 721 es la versión que expresa EGFP del vector CET 720 “vacío”.

Pueden construirse vectores basados en CET 720 con diferentes genes de resistencia a antibióticos y con promotores o UCOE alternativos de la siguiente manera. El promotor PGK (pb 11384-11894) y el bghpA (pb 1256712893) pueden retirarse de CET 720 mediante digestión de restricción. Estos elementos pueden insertarse en el esqueleto de pBluescript de modo que los sitios de restricción estén disponibles para la inserción de cualquier secuencia de un gen de resistencia (derivada mediante PCR o digestión de restricción) entre el promotor PGK y el bghpA de tal manera que permita la expresión de este gen. El módulo de expresión CMV-MCS-SV40pA también puede retirarse de CET 720 (pb 10533-11380) e insertarse 5’ al promotor PGK en el anterior vector; como alternativa, el módulo de expresión mCMV-MCS-SV40pA puede colocarse en la misma posición (versiones de expresión de EGFP CET 801, 821, 824). El UCOE de hnRNP A2 puede retirarse de CET 720 (pb 2240-10525) mediante digestión de restricción e insertarse 5’ en el módulo de expresión de CMV en los anteriores vectores; como alternativa, otros UCOE (por ejemplo, hnRNP A2 murino) pueden insertarse en la misma posición (vector de expresión de EGFP CET 824).

Para aclarar:

CET 741 es la versión que expresa EGFP del vector CET 740 “vacío” y comprende un UCOE de RNP humano 5’ y un gen neor de S. fradiae 3’.

CET 761 es la versión que expresa EGFP del vector CET 760 “vacío” y comprende un UCOE de RNP humano 5’ y un gen de aminiciclitol fosfotransferasa (hygror) de E. coli 3’.

CET 781 es la versión que expresa EGFP del vector CET 780 “vacío” y comprende un UCOE de RNP humano 5’ y un gen de puromicina N-acetiltransferasa de S. alboniger modificado 3’.

CET 821 es la versión que expresa EGFP del vector CET 820 “vacío” y comprende un UCOE de RNP humano 5’ y un gen de puromicina N-acetiltransferasa de S. alboniger de tipo salvaje 3’. La expresión del transgén de EGFP está dirigida por el promotor de CMV IE murino (en lugar de humano).

CET 824 es la versión que expresa EGFP del vector CET 823 “vacío” y comprende un UCOE de RNP murino (en lugar de humano) 5’ y un gen de puromicina N-acetiltransferasa de S. alboniger de tipo salvaje 3’.

Vectores pCIA

Esta es una serie de vectores que permiten la construcción fácil de los vectores de expresión de UCOE con la configuración final óptima (UCOE-módulo de expresión-módulo de resistencia) cuando se integran en el cromosoma.

CET 900 es un vector de clonación vacío en el que parejas de sitios de restricción raros flanquean el MCS. CET 901 y CET 902 contienen los promotores de hCMV y mCMV respectivamente, un MCS y el SV40pA. Las mismas parejas de sitios de restricción raros también flanquean estos módulos.

La serie CET 1000 de vectores contiene diversas combinaciones de UCOE y módulos de expresión de resistencia. También contiene los mismos sitios de restricción raros que la serie CET 900 en una posición 3’ al UCOE y 5’ al módulo de resistencia. Los vectores también contienen sitios de linealización 5’ al UCOE y 3’ al módulo de resistencia.

Por tanto, pueden construirse módulos de expresión para cualquier transgén en la serie CET 900 y después pueden transferirse con facilidad a la serie CET 1000 de modo que la configuración final, cuando se integran en el cromosoma, es la deseada de UCOE-módulo de expresión-módulo de resistencia.

Tal como se indicó anteriormente, el gen de antibiótico puede intercambiarse dentro de la serie CET 1000 mediante una digestión de restricción o una PCR.

Transfección

Las células CHO K1 se transfectaron y se seleccionaron según métodos convencionales y según se describe en las solicitudes en tramitación junto con la presente incorporadas como referencia.

Resultados

Haciendo referencia concreta a la figura 2, la comparación de células transfectadas con CET 721 y CET 230 muestra un coherente mayor nivel de expresión obtenido con CET 721. Estos dos vectores son similares porque ambos portan un UCOE derivado de hnRNP de 8 kb unido operablemente al gen de EGFP dirigido por el promotor de CMV, y ambos portan el elemento del gen de resistencia a puromicina/pgk. Sin embargo, tras la linealización con PvuI, la integración de CET 230 en el cromosoma de la célula hospedante da como resultado que los elementos se coloquen en el siguiente orden: pgk/Puro, UCOE de hnRNP, gen de EGFP. El mismo proceso con CET 721 da como resultado que el gen de EGFP esté flanqueado por el UCOE y el pgk/Puro. Los niveles de expresión obtenidos con CET 230 no son significativamente mayores que los obtenidos con CET 220, un vector que no porta el elemento pgk/Puro pero con el mismo UCOE y la misma expresión de EGFP dirigida por un promotor. Todos los vectores que portan UCOE muestran una expresión muy aumentada comparados con el plásmido de expresión de EGFP básico.

La figura 3 demuestra que la expresión aumentada, según se expresa mediante la mediana de la fluorescencia, también se refleja en una mayor proporción de células dentro de la población transfectada consideradas positivas, en términos de expresión, en todos los momentos después de la transfección. Esta es una medida de la falta de efectos de posición, puesto que la integración aleatoria de la construcción normalmente produciría una gama de niveles de expresión dentro de la poblacion (no clonal) de células transfectadas. Esto es superado por la combinación del UCOE 5’ y el elemento seleccionable 3’, que produce una población homogénea de alta expresión.

Los niveles de expresión en algunas de las agrupaciones de células en la figura 2 son tan altos que la fluorescencia producida excede la capacidad del detector.

En la figura 4, las mediciones se han corregido para la región lineal de la respuesta del detector para permitir la comparación entre construcciones. Esto demuestra que la combinación de UCOE y el elemento seleccionable flanqueante 3’ utilizado en CET 721 ha producido un aumento en aproximadamente 7 veces de los niveles de expresión de EGFP, comparado con los obtenidos con el UCOE solo (CET 220) o los obtenidos con el elemento seleccionable (puror) colocado 5’ al UCOE. Es evidente que es necesario que el transgén expresado esté flanqueado por el UCOE y el marcador seleccionable para obtener el aumento en la expresión.

Este efecto no está restringido a un marcador seleccionable concreto. La figura 7 compara la expresión de EGFP unido operablemente a un UCOE de RNP humano 5’ y un gen de resistencia a neomicina de S. fradiae colocado 5’ (CET 745) o 3’ (CET 741). Se produce casi una duplicación del nivel de expresión, que ya era alto.

Ejemplo 2: Eficacia de otros marcadores seleccionables flanqueantes 3’

Resultados

La figura 5 muestra el efecto de flanquear el transgén de EGFP con un UCOE de RNP humano 5’ y diversos genes de resistencia a antibióticos flanqueantes 3’. CET 701 es un control que no contiene UCOE, pero con puror de S. alboniger de tipo salvaje. CET 721 tiene el UCOE 5’ y puror 3’. CET 704 contiene neor de S. fradiae pero no UCOE, CET 741 tiene ambos. CET 705 contiene hygror de S. hygroscopicus pero no UCOE, CET 751 tiene ambos. CET 706 tiene hygror de E. coli pero no UCOE, CET 761 tiene ambos. CET 708 tiene puror con codones modificados pero no UCOE, CET 781 tiene ambos. En todos los casos, el efecto aumentador del gen de resistencia flanqueante 3’ es evidente.

Ejemplo 3: Combinación de otros UCOE y el elemento seleccionable Puro

Resultados

Tal como se muestra en las figuras 2 y 3, la expresión de un plásmido comparable que porta un UCOE construido de forma artificial (CET 711) es comparable con la obtenida con el UCOE de RNP en términos de mediana de la fluorescencia y de proporción de células positivas. Esto demuestra que el fenómeno de amplificación del efecto de un UCEO mediante un segundo elemento rico en CpG flanqueante es general y no está limitado a una combinación concreta del UCOE de RNP y del elemento pgk/Puro. La comparación de la expresión de CET 711 y CET 721 en la figura 4 indica que se obtiene un nivel de expresión ligeramente inferior con CET 711, pero esto aún es 6 veces mayor que el obtenido con un UCOE solo.

La figura 6 muestra el efecto comparable obtenido con un UCOE de hnRNP humano empleando el promotor de CMV murino para dirigir la expresión (CET 821) y el equivalente murino (CET 824). CET 721 comprende el UCOE de hnRNP humano y emplea el promotor de CMV humano.

La siguiente sección de la descripción consiste en párrafos numerados que simplemente proporcionan afirmaciones de la invención que ya se han descrito en la presente. Los párrafos numerados en esta sección no son reivindicaciones. Las reivindicaciones se indican en una sección posterior con el encabezamiento “REIVINDICACIONES”.

1. Un polinucleótido aislado, que comprende:

a.

una isla de CpG sin metilación extendida,

b.

un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

c.

un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

2. Un polinucleótido aislado, que comprende:

a.

una isla de CpG sin metilación extendida,

b.

un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

c.

un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

3. Un polinucleótido aislado, que comprende:

a.

una isla de CpG sin metilación extendida,

b.

un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

c.

un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

4. Un polinucleótido aislado, que comprende:

a.

una isla de CpG sin metilación extendida,

b.

un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

c.

un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

5.

El polinucleótido aislado de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que el marcador seleccionable es un gen de resistencia a un antibiótico.

6.

El polinucleótido aislado del punto 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico se obtiene de una especie de Streptomyces.

7.

El polinucleótido aislado del cualquiera del punto 6, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a puromicina.

8.

El polinucleótido aislado del punto 7, en el que el gen de resistencia a puromicina es el gen de puromicina Nacetiltransferasa de Streptomyces alboniger.

9.

El polinucleótido aislado del punto 8, en el que el gen de resistencia a puromicina es un gen de puromicina Nacetiltransferasa modificado de Streptomyces alboniger.

10.

El polinucleótido aislado del punto 9, que comprende la secuencia de la figura 14.

11.

El polinucleótido aislado del punto 6, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a neomicina.

12.

El polinucleótido aislado del punto 11, en el que el gen de resistencia a neomicina es el gen de aminoglicósido transferasa de Streptomyces fradiae.

13.

El polinucleótido aislado del punto 6, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a higromicina.

14.

El polinucleótido aislado del punto 13, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es el gen de higromicina fosfotransferasa de Streptomyces hygroscopicus.

15.

El polinucleótido aislado del punto 6, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a bleomicina.

16.

El polinucleótido aislado del punto 15, en el que el gen de resistencia a bleomicina es la proteína de unión a bleomicina de Streptomyces verticillus.

17.

El polinucleótido aislado del punto 15, en el que el gen de resistencia a bleomicina es la bleomicina Nacetiltransferasa de Streptomyces verticillus.

18.

El polinucleótido aislado del punto 6, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es un gen de resistencia a blasticidina.

19.

El polinucleótido aislado del punto 18, en el que el gen de resistencia a blasticidina es el gen de blasticidina Sacetiltransferasa de Streptomyces verticillum.

20.

El polinucleótido aislado del punto 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es la aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli.

21.

El polinucleótido aislado del punto 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es el gen de neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5.

22.

El polinucleótido aislado de uno cualquiera de los anteriores puntos, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen hnRNP A2 humano.

23.

El polinucleótido aislado de uno cualquiera de los puntos 1-21, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen hnRNP A2 murino.

24.

El polinucleótido aislado del punto 23, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende los nucleótidos 1-7898 de la secuencia de la figura 19.

25.

El polinucleótido aislado de uno cualquiera de los puntos 1-21, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 2,0 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de 1-actina humana, y un fragmento de ADN de 1,8 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana.

26.

Un vector que comprende el polinucleótido de uno cualquiera de los puntos anteriores.

27.

Un vector construido para transportar, cuando se linealiza y se integra en un cromosoma, el polinucleótido de uno cualquiera de los puntos 1-25.

28.

El vector del punto 26, en el que el vector es un vector episómico.

29.

El vector del punto 26, en el que el vector es un vector integrador.

30.

El vector del punto 26, en el que el vector es un vector es un plásmido.

31.

El vector de uno cualquiera de los puntos 26-30, en el que el ácido nucleico expresable es un ácido nucleico terapéutico.

32.

El vector de uno cualquiera de los puntos 26-30, en el que el ácido nucleico expresable codifica una proteína recombinante para la expresión en un sistema de cultivo celular in vitro.

33.

Un vector que comprende:

a.

una isla de CpG sin metilación extendida,

b.

un sitio de clonación múltiple,

c.

un gen de resistencia a un antibiótico obtenido de una especie de Streptomyces,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, sitio de clonación múltiple, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y el sitio de clonación múltiple está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

34.

El vector del punto 33, en el que el sitio de clonación múltiple también está unido operablemente a un promotor.

35.

El vector del punto 34, en el que dicho promotor es un promotor inmediato/temprano de citomegalovirus.

36.

El vector de uno cualquiera de los puntos 26-31, que comprende los nucleótidos 1-10551 de la secuencia de la figura 10.

37.

El vector CET 710.

38.

El vector de uno cualquiera de los puntos 26-31, que comprende los nucleótidos 1-13545 de la secuencia de la figura 12.

39.

El vector CET 720.

40.

El vector CET 740.

41.

El vector CET 760.

42.

El vector CET 780.

43.

El vector CET 820.

44.

El vector CET 823.

45.

El vector que comprende los nucleótidos 1-12039 de la secuencia de la figura 21.

46.

El vector CET 1010.

47.

El vector que comprende los nucleótidos 1-11646 de la secuencia de la figura 23.

48.

El vector CET 1020.

49.

El vector que comprende los nucleótidos 1-9027 de la secuencia de la figura 25.

50.

El vector CET 1030.

51.

El vector que comprende los nucleótidos 1-12221 de la secuencia de la figura 27.

52.

El vector CET 1110.

53.

El vector que comprende los nucleótidos 1-11828 de la secuencia de la figura 29.

54.

El vector CET 1120.

55.

El vector que comprende los nucleótidos 1-9209 de la secuencia de la figura 31.

56.

El vector CET 1130.

57.

Una célula hospedante transfectada con el vector de uno cualquiera de los puntos 26-56.

58.

El uso del polinucleótido de cualquiera de los puntos 1-25, del vector de los puntos 26-56, o de la célula hospedante del punto 57, para obtener la expresión de un ácido nucleico expresable.

59.

El uso del polinucleótido de cualquiera de los puntos 1-25, del vector de los puntos 26-56, o de la célula hospedante del punto 57 en un sistema de cultivo celular, para obtener la expresión de un producto génico deseado.

60.

El uso del polinucleótido de cualquiera de los puntos 1-25, del vector de los puntos 26-56, o de la célula hospedante del punto 57, para terapia.

61.

El uso del polinucleótido de cualquiera de los puntos 1-25, del vector de los puntos 26-56, o de la célula hospedante del punto 57, para la fabricación de una composición para su uso en terapia génica.

62.

Un método de tratamiento, que comprende administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz del polinucleótido de cualquiera de los puntos 1-25, del vector de los puntos 2656, o de la célula hospedante del punto 57.

63.

Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de cualquiera de los puntos 1-25, el vector de los puntos 26-56, o la célula hospedante del punto 57, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

64.

Un animal transgénico no humano, que comprende un elemento de isla de CpG sin metilación extendida

5 introducido de modo artificial y un marcador seleccionable introducido de modo artificial, en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del

10 marcador seleccionable.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un polinucleótido lineal aislado para la integración en un cromosoma, que comprende:

   a.

   una isla de CpG sin metilación extendida,

   b.

   un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

   c.

   un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

   en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.
2. 2.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 1, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.
3. 3.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 2, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.
4. 4.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 3, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.
5. 5.-Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador seleccionable es un gen de resistencia a un antibiótico.
6. 6.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico se obtiene de una especie de Streptomyces.
7. 7.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico se selecciona del grupo que consiste en:

   (i)

   un gen de resistencia a puromicina, opcionalmente el gen de puromicina N-acetiltransferasa o un gen de puromicina N-acetiltransferasa modificado de Streptomyces alboniger;

   (ii)

   un gen de resistencia a neomicina, opcionalmente el gen de aminoglicósido fosfotransferasa de Streptomyces fradiae;

   (iii) un gen de resistencia a higromicina, opcionalmente el gen de higromicina fosfotransferasa de Streptomyces hygroscopicus;

   (iv)

   un gen de resistencia a bleomicina, opcionalmente la proteína de unión a bleomicina o la bleomicina Nacetiltransferasa de Streptomyces verticillus;

   (v)

   un gen de resistencia a blasticidina, opcionalmente el gen de blasticina S-acetiltransferasa de Streptomyces verticillum.

8. 8.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es la aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli.
9. 9.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es el gen de neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5.
10. 10.-Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen hnRNP A2 humano.
11. 11.-Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen hnRNP A2 murino.
12. 12.-Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 11, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende los nucleótidos 1-7898 de la secuencia de la figura 19.
13. 13.-Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 2,0 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de la 1-actina humana y un fragmento de ADN de 1,8 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana.
14. 14.-Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso como

    medicamento. 15.-Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
15. 13.
16. 16.-El uso del polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para obtener la expresión de un producto génico deseado.
17. 17.-El uso del polinucleótido aislado según la reivindicación 16, en el que el producto génico deseado es una proteína terapéutica.