KR20030051662A - 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

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KR20030051662A
KR20030051662A KR10-2003-7004014A KR20037004014A KR20030051662A KR 20030051662 A KR20030051662 A KR 20030051662A KR 20037004014 A KR20037004014 A KR 20037004014A KR 20030051662 A KR20030051662 A KR 20030051662A
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gene
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KR10-2003-7004014A
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마이클 안토니우
로버트 크롬비
스티브 제라인트 윌리암스
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엠엘 래보러토리즈 피엘씨
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Abstract

본 발명은 자연적으로는 나타나지 않는 독특한 염색질 개방 성분(UCOE)을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 치료요법에서 또는 인 비트로 단백질 발현 응용분야에 대한 상기 뉴클레오티드, 벡터의 용도에 관한 것이다.

Description

폴리뉴클레오티드{POLYNUCLEOTIDE}
고도의 진핵생물에서 염색질 구조의 현재의 모형은 유전자가 "도메인"에서 조작된다고 간주한다1,2. 염색질 도메인은 축소된, "밀폐", 전사적으로 휴지 상태, 또는 탈-축소된, "개방" 및 전사적으로 수용가능한 외형 중 하나에서 존재할 것으로 고찰된다. 증가된 DNaseI 감수성, DNA 저메틸화 및 히스톤 과아세틸화로 특성화되는 개방 염색질 구조의 성립은 유전자 발현의 시초에 선 필수적이라고 간주된다.
염색질 영역의 개방 및 밀폐 성향은 숙주 세포 게놈으로 무작위로 합쳐지는 트랜스진 반응을 반영한다. 동일한 구조물은 마우스 게놈에서 다른 위치로 합쳐질 때, 조직-특이한 및 발전 단계-특이한 발현의 다른 패턴을 나타낸다3-5. 위치 효과 다양성(PEV)으로 알려진, 주어진 트랜스제닉(transgenic) 마우스 조직 안에서 변화된 발현 패턴 또한 빈번하게 관찰된다6. 외인성 유전자가 인 비트로에서 포유동물 세포 배양의 염색체로 합쳐지는 경우에, 대부분의 통합(intergration)은 트랜스진의 빠른 휴지(silencing)를 나타내고, 나머지는 발현 수준에서 많은 변성을 준다7,8. 이들 위치 효과는 기초 연구 및 생물 공학 응용 모두에 관련하여, 트랜스진 발현이 비능률적이게 한다.
유전자 체계의 염색질 도메인은 성립될 수 있고 전사적으로 수용 가능한 개방 염색질 구조를 유지하는 유전적인 조절 성분은 게놈의 활성 영역과 연계되어야 한다고 제안한다.
유전자좌 조절 영역(LCRs)은 긴-범위 염색질 재모형 능력을 가진 전사적인 조정 성분의 한 부류이다. LCRs는cis위치에 연결된 유전자에서, 특히 단일 카피 트랜스진에서 통합 부위 독립적으로, 트랜스진 카피수-의존적인, 발현의 생리적인 수준을 수여하는 그들의 능력에 의해 트랜스제닉 마우스에서 기능적으로 명시된다9,10. 결정적으로, 이러한 발현은 조직-특이적이다. LCRs는 이종염색질의 확장을 막을 수 있고, PEV를 방해할 수 있고6, 그들이 조정하는 유전자의 5' 또는 3' 중 하나에서 위치될 수 있는 일련의 Dnase I 과민감(HS) 부위로 이루어질 수 있다10.
LCRs는 필수적이지는 않더라도, 두 개의 분리되고 독립된 구성 요소로 구성되는 것으로 나타난다. 첫째로, 개방 염색질 도메인의 성립, 그리고 둘째로 트랜스진 카피수 의존성 발현을 줄 수 있는 지배적인 전사적 활성화 능력이다9. LCRs가 그들의 기능을 발휘하는 것으로 인한 분자 메카니즘은 논쟁거리로 남아 있다2,11-13.
약제학적인 단백질 생성물을 높은 수준으로 생산하는 배양 포유동물 세포주의 생성은 주요한 발전적인 산업이다. 염색질 위치 효과는 그것이 어렵고, 시간 소모적이고 및 고비용의 공정이도록 한다. 이러한 포유동물의 "세포 공장"에 대한 가장 일반적으로 사용되는 접근은 약 내성 유전자의 조합(예를 들어, DHFR, 글루타민 합성효소(여기서, 참고문헌으로 포함하는, Kaufman, 1990, Methods Enzymol., 185:537-566)) 및 스트링전트(stringent) 선택 압력의 유지로 유도된 유전자 증폭에 의존한다. 적당한 조직으로부터 유도된 세포를 사용하는, 고도로 발현된 유전자 도메인으로부터 LCRs를 함유하는 벡터의 사용으로 공정은 매우 간단하게 된다(Needhamet al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:997-1003; Needham et al., 1995, Protein Expr. Prif., 6:124-131, 각각은 참고문헌으로 포함된다).
하지만, 어떤 환경에서는 유용할지라도, LCRs의 조직-특이성은 또한, 예를 들어, 어떠한 LCR은 발현이 필요한 조직에 대하여 알려지지 않거나 또는 많거나, 또는 모든 조직에서의 발현이 요구되는 많은 응용 분야에 대하여 주요한 제한이다.
본 명세서에서 참고문헌으로 포함된, 본 발명자들의 동시에 계류중인 특허 출원 PCT/GB99/02357 (WO 00/05393)는 독점적으로 유일하게 발현된, 하우스키핑 유전자로 이루어진 유전자좌에 맞닿은 개방 염색질 구조를 성립하는 원인이 되는 성분을 기재한다. 이들 성분은 LCR로부터 유도되지 않는다. 본 발명은 염색질을 개방하거나 또는 개방 상태에서 염색질을 유지하고 적어도 두 가지의 다른 조직 유형의 세포에서 조작 가능하게 연결된 유전자의 재생 가능한 발현을 촉진하는 유일한 염색질 개방 성분(UCOE)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 유전자좌 조절 영역에서 유도되지 않는다.
메틸화가 결여된 CpG 아일랜드(island)은 당 기술분야에서 잘 알려져 있고(Birdet al(1985) Cell 40: 91-99, Tazi and Bird (1990) Cell 60: 909-920), 시토신 잔류물이 메틸화되지 않고 두 개의 가깝게 위치한(0.1-3kb) 분기적으로(divergently) 전사된 유전자의 5'말단을 넓게 확장하는 CpG 디-뉴클레오티드의 평균 함량 이상(>60%)을 갖는 DNA의 CpG-풍부 영역으로 정의될 수 있다. 이들 DNA의 영역은 발육하는 동안 모든 조직에 메틸화되지 않은 상태로 남는다(Wise and Pravitcheva (1999) Genomics 60: 258-271). 그들은 조직 제한된 발현 프로파일을 보여주는 유전자의 추정 40%뿐만 아니라 모든 유일하게 발현되는 유전자의 5'말단과 연결되고16,17, 활성 염색질의 영역을 위치한다고 알려져 있다.
'확장된' 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드는 하나 이상의 전사적인 시작 부위를 포함하는 영역을 가로질러 확장하고 그리고/또는 300bp이상 바람직하기는 500bp이상 확장하는 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드가다. 확장된 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드의 영역은 그들의 인식 서열에서 DNA을 소화되는(자르는) 그의 능력이 현존하는 CpG 나머지의 메틸화 상태에 민감한 제한 엔도누클라제 효소와 결합한 영역 이상을 PCR을 사용하여 기능적으로 정의한다. 이러한 하나의 효소는 HpaII이고, 이것은 CCGG부위에서 인식하고 소화되고, CpG아일랜드 안에서 일반적으로 발견되지만, 중앙의 CG 나머지만으로는 메틸화가 되지 않는다. 그러므로, HpaII 부위를 포함하는 영역 이상을 HpaII-소화된 DNA으로 처리된 PCR은 DNA가 메틸화가 되지 않는다면, HpaII 소화에 기인한 증폭 생성물을 주지 못한다. 상기 PCR은 오로지 DNA가 메틸화된다면 증폭 생성물을 줄 것이다. 그러므로, 메틸화가 결여된 영역 HpaII는 DNA를 소화되지 못하는 것이외에, PCR 증폭 생성물은 "확장된 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드"의 경계를 정의하는 것으로 관찰될 것이다.
본 발명자들은 인간 TATA 결합 단백질(TBP)/프로테오솜(proteosome) 성분-B1(PSMBI) 및 이종성 핵의 리보핵단백질 A2/B1(hnRNPA2)/이종염색질 단백질 1Hsγ(HP1 Hsγ ) 유전자 유전자좌로부터 영역이 놓인 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드에 분기적으로 전사된 프로모터가 유전자 발현의 재현가능하고, 생리학적인 수준을 생산하고 다양한 발현 패턴 및 동원체의 이종염색질안에서 트랜스진 통합과 함께 일반적으로 발생하는 휴지를 방해할 수 있다는 것을 예증한다.
본 발명자들은 활성적으로 전사하는 프로모터와 결합한 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드는 염색질을 재모형화하는 능력을 가지고, 그리하여 하우스키핑 유전자 유전자좌에서 개방 도메인을 성립 및 유지하는 초기 결정 인자가 된다고 생각되어지는 것을 보였다.
UCOE's는 트랜스진 발현의 수준 및 안정성에서의 향상으로 증식 유전자 전달의 증가된 비율을 수여한다. 이것은 트랜스제닉 동물의 생산 및 배양 세포에서 재조합 단백질 생산을 포함하는 중요한 연구 및 생물 공학적인 응용 분야를 갖는다. 본 발명자들은 CMV-EGFP 리포터 구성체 및 분비된, 약제학적으로 가치 있는 단백질 에리트로포이에틴의 발현에서 UCOEs의 유익한 영향을 보여준다. UCOE의 특성은 또한 유전자 치료요법에서의 유용성, 증식 유전자 전달의 낮은 횟수 및 부적당한 수준 및 발현의 기간으로 인하여 종종 제한된 유효성을 제안한다45.
주어진 이들 중요한 함축 및 넓은 범위의 응용분야에서, 추가로 트랜스진 발현 수준을 최적화하고 배양의 확장된 기간을 넘는 유전자 발현의 향상된 안정성을 성취하는 것이 요구된다.
어떤 자연적으로 발생하는 UCOEs에서 관찰된 방향의 성향을 극복하는 것이 특별히 요구된다. UCOEs가 실시 가능하게 연결된 프로모터에서 위치-의존하는 전사적 상승이 주어질지라도, 이것은, 어떤 범위에서는, 배향-의존적이다(즉, UCOE는 다른 것보다 한 배향에서 현저하게 더욱 효과적이다). 발현 유니트 사이에 있는 UCOE으로 분기적으로 전사된 두개의 발현 유니트를 포함하는 발현 벡터와 같은, 어떤 환경에서는, 양 쪽 프로모터로부터 균형되고, 고-수준의 발현을 얻을 수 있는 장점이 있고, 이것은 쳔연의 UCOE로는 불가능할 것이다. 그러므로, 양 배양에서 효과적인 인공적으로 구성된 UCOEs를 필요로 한다.
본 발명은 자연적으로는 발생하지 않는 독특한 염색질 개방 성분(UCOE)을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 치료요법에서 또는 인 비트로에서 단백질 발현 응용분야에서 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 실시예에 의해서 뿐만 아니라 첨부한 도면에 의해서도 설명될 것이다.
도 1은 인공적인 UCOENcoI 단편의 선형의 제한 지도를 나타내는 도이다. PDCD2와 액틴 전사체는 화살표의 방향이 각각의 프로모터들로부터의 전사의 방향을 나타내는 어두운 화살표로 표시된다.
도 2a-d는 본 발명에 따른 PDCD2/액틴의 인공적인 UCOENcoI 단편의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 도이다.
도 3a 및 3b는 유전자 발현 벡터를 포함하는 PDCD2/액틴 인공적인 UCOE의 플라스미드 지도를 나타내는 도이다.
도 3a는 CMV 프로모터 상류의 PDCD2/액틴 인공적인 UCOE와, 발현되어지는 개방 리딩프레임의 삽입에 적당한 다중의 클로닝 부위로 구성된, CET 500을 나타내는 도이다. 이러한 특정 구현예에서 플라스미드 골격은 pEGFPN-1로부터이며, 카나마이신/네오마이신 내성 유전자로 수행한다.
도 3b는 역방향의 PDCD2/액틴 인공적인 UCOE를 포함하는 CET 501을 나타내는 도이다.
도 4는 85일에 걸친 G418 선택하에서 보존된, 안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 풀에서의 리포터 트랜스진(EGFP)의 발현정도를 나타내는 도이다. 발현은 CMV 프로모터 단독으로 진행되거나, 8kb RNP/HP-1 UCOE (CET 220) 또는 인공적인 PDCD2/액틴 UCOE (CET 510)과의 조합으로 진행되고, FACS에 의한 형광치의 중앙값으로 측정된다.
도 5는 85일간에 걸친 FACS 분석에서 양성 세포 %로 표현된 상기 실험에서의 트랜스진을 발현하는 세포들의 비율을 나타내는 도이다.
도 6은 RNP/HP-1/액틴 인공적인 UCOE 단편의 선형의 제한지도를 나타내는 도이다. 메틸화가 결여된 아일랜드는 화살표의 방향이 그들 각각의 프로모터들로부터 전사되는 방향을 표시하는 어두운 화살표로 표시된다.
도 7a-e은 본 발명에 따른 RNP/HP-1/액틴 인공적인 UCOE의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 도이다.
도 8은 유전자 발현 벡터를 포함하는 RNP/HP-1/액틴 인공적인 UCOE의 플라스미드 지도를 나타내는 도이다.
도 8a는 CMV 프로모터 상류의 RNP/HP-1/액틴 인공적인 UCOE와, 발현되어지는 개방 리딩 프레임의 삽입에 적당한 다중의 클로닝 부위을 포함하는 CET 600을 나타내는 도이다. 이러한 특정 구현예에서 플라스미드 골격은 pEGFPN-1로부터이고, 가나마이신/네오마이신 내성 유전자로 수행한다.
도 8b는 역방향의 RNP/HP-1/액틴 인공적인 UCOE로 구성된 CET 601을 나타내는 도이다.
도 9는 127일에 걸친 G418 선택하에서 보존된, 안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 풀에서의 리포터 트랜스진(EGFP)의 발현 정도를 나타낸다. 발현은 CMV 프로모터 단독으로 진행되거나, 정방향(CET 220) 혹은 역방향으로의(CET 221) 8kb RNP UCOE와 조합되거나, 또는 정방향(CET 610) 혹은 역방향으로의(CET 611) 인공적인 RNP/HP-1/액틴 UCOE에 의해 진행되며, 이는 FACS에 의한 형광치의 중앙값으로 측정된다. 그러므로 CET 610은 CET 600의 등가물이지만, 삽입된 유전자로서 EGFP를 함유하지는 않고, CET 611은 상응하는 EGFP-함유 CET 601의 등가물이라고 이해될 것이다.
도 10은 127일간에 걸친 FACS 분석에서 양성 세포%로 표현된 상기 실험에서의 트랜스진을 발현하는 세포들의 비율을 나타내는 도이다.
도 11a-11b는 면역글로불린의 발현에 대한 2방향성 UCOE 벡터의 플라스미드 지도를 나타내는 도이다.
본 발명에 따라서 UCOE를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이것은 염색질을 개방하거나, 또는 개방 상태에서 염색질을 유지하고, 적어도 두 개의 다른조직 유형에서의 세포는 작동가능하게-연결된 유전자의 복제성의(reproducible) 발현을 촉진하고, 여기서 UCOE의 뉴클레오티드 서열은 자연적으로는 나타나지 않는다.
적어도 두 개의 유전자로부터의 조정 서열을 포함하는 게놈 영역은 배양의 확장된 기간을 넘어 유전자 발현을 현저하게 상승한 키메라 UCOE를 형성하도록 결합되었다. 이러한 키메라 UCOE는 자연적으로는 발생하지 않는 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 따라서 "자연적으로는 발생하지 않는"이라는 구절은 UCOE를 구성하는 성분의 뉴클레오티드 서열이 그것으로서 자연적으로는 존재하지 않고, 인간이 만들거나 또는 자연적으로-발생한 및/또는 인공적으로 생성된 서열의 조합인, 인공적으로 구성된 것인 상태를 나타낸다.
여기서 사용된 바와 같이, UCOE에 관하여, "인공적인", "인공적으로 구성된", "키메라의" 등과 같은 용어는 UCOE 또는 UCOE를 구성하는 성분이 자연적으로는 존재하지 않는다; 즉, "자연적으로는 발생하지 않는다"는 것을 의미하는 것이 통하면 교체하여 사용하는 것이 가능하다. UCOE가 자연적으로 발생하는 서열의 조합이 있는 경우에, UCOE으로의 그들의 배열 또는 편성하는 것이 비자연적이다. 무제한적인 예로서, 인공적인 UCOE는 일반적으로 이종이고, 키메라의 또는 인공적인 UCOE를 창조하기 위한, 비자연적인 조직에서 함께 가져 온, 두 개의 자연적으로 발생하는 서열로 이루어질 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이, UCOE에서의 서열에 관하여 "인공적으로 합성된" 및 "인공적으로 생산된"이라는 용어는 비자연적인 서열; 즉, 자연적으로는 발생하지 않고 전체가 합성적인 서열을 나타낸다. 이러한 "인공적으로 합성된" 및 "인공적으로 생산된" 서열은 또한 인공적인 UCOE을 창조하거나 구성하기 위한 자연적으로 발생하는 서열과 결합될 수 있다.
본 발명의 대체 가능한 관점에 따라서, 하기에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다:
ⅰ) 도 2a-d 또는 도 7a-e에서 나타내는 바와 같은 DNA 서열;
ⅱ) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드화하는, 도 2a-d 또는 도 7a-e에서 존재하는 서열에 혼성화하는 DNA 서열.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 도 2a-d 또는 도 7a-e에서 나타내는 서열에 대한 스트링전트 혼성화 조건하에서 어닐링(annealing)하는, 분리된 핵산 분자를 제공한다.
스트링전트 혼성화/세척 조건은 당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 핵산 잡종은 60℃에서 0.1x SSC, 0.1% SDS에서 세척한 경우에 안정적이다. 최적의 혼성화 조건은 핵산의 서열이 알려진 경우에는 계산될 수 있다는 것이 당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 혼성화 조건은 혼성화에 직면한 핵산의 GC 함량에 의해 결정될 수 있다. Sambrooket al(1989), Molecular Cloning; A Laboratory Approach를 참조하시오. 특정한 상동관계의 핵산 분자 사이에서 혼성화를 성취하기 위해 필요로 하는 스트링전트 조건을 계산하기 위한 일반식은 하기와 같다:
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41[%G+C]-0.63(%포름아미드).
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 작동가능하게 연결되고 명확하게는 비-조직인 유전자의 복제성의 발현을 촉진한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 활성 유전자 발현이 발생하는 모든 조직 유형에서 작동가능하게 연결된 유전자의 복제성의 발현을 촉진한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생리학적인 수준에서 작동가능하게 연결된 유전자의 복제성의 발현을 촉진한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 확장된 메틸화가 결여된, CpG-아일랜드를 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현의 조절과 연결된 하나 이상의 자연적으로 발생하는 서열을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 자연적으로 발생하는 프로모터를 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분기적으로 전사되는 이중 또는 2방향의 프로모터를 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역, 또는 그것의 단편을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역, 또는 그것의 단편에 놓여진 100bp 내지 3.0kb의 범위 안에서의 DNA단편을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역, 또는 그것의 단편을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역, 또는 그것의 단편에 놓여진 100bp 내지 3.0kb의 범위 안에서의 DNA 단편을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 놓여진 100bp 내지 3.0kb의 범위 안에서의 DNA 단편 및 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 놓여진 100bp 내지 3.0kb의 범위 안에서의 DNA 단편을 포함한다. 바람직하게는 상기 단편은 분기적으로 유래된 그들의 프로모터와 직접적으로 근접한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 놓여진 2kb의 DNA 단편 및 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 놓여진 1.8kb의 DNA 단편을 포함한다. 바람직하게는 상기 단편은 분기적으로 유래된 그들의 프로모터와 직접적으로 근접한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 더욱 바람직한 구현예는 어느 배향에서, 도 2a-d의 서열 또는 그것의 단편을 포함한다.
바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 인간 RNP CpG 아일랜드/프로모터 영역 또는 그것의 단편을 포함한다.
바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 인간 RNP CpG 아일랜드/프로모터 영역에놓여진 4kb DNA 단편을 포함한다.
바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드를 포함하는 하나 이상의 추가 서열에 인접한, 확장된 메틸화 결여된 CpG 아일랜드 함유 두 갈래의 프로모터를 포함한다.
바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역 및 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 놓여진 100bp 내지 3kb의 범위에서의 DNA 단편을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 어느 배향에서, 도 7a-e의 서열 또는 그것의 단편을 포함한다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 프로모터 서열을 포함한다.
어떤 환경 하에서, 전사의 개시는 상류 프로모터로부터 해석에 의한 전사체에 의해 억제된다(Youssoufian and Lodish (1993) Transcriptional inhibition of the murine erythopoietin receptor gene by an upstream repetitive element, Mol Cell Biol 13 (1) 98-104). 그러므로, 본 발명의 한 구현예는 하나 이상의 프로모터 서열이 그들이 전사를 개시할 수 있는 그러한 방법에서 돌연변이화되는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
바람직하게는 프로모터는 CMV, EF-1α, RSV LTR, 또는 HIV2 LTR 또는 그들로부터 유도된 서열의 조합에서 선택된다. 더욱 바람직하게는 프로모터는 CMV 프로모터이다. 가장 바람직하게는 마우스 CMV 프로모터이다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인공적으로 합성된 하나 이상의서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
바람직하게는 상기 벡터는 진핵생물 유전자 발현에 적응(adaptation)된 발현 벡터이다.
전형적으로 상기 적응은 예를 들어, 이에 한정되지는 않고, 세포/조직 특정 발현을 중재하는 전사 조절 서열(프로모터 서열)의 공급을 포함한다.
프로모터 및 증폭제(enhancer)는 당 기술분야에서 잘 알려진 용어이고, 예로서 제공되지만, 이에 한정되지는 않는 하기의 특징을 포함한다. 프로모터는 전사의 개시에 직접적으로 관련된 5', cis-활동 조정 서열이다. 프로모터 성분은 소위 TATA박스 및 전사 개시의 부위를 선택하는 기능이 있는 RNA 폴리머라제 개시 선택(RIS) 서열을 포함한다. 이들 서열은 또한 특히, RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 선택을 촉진하는, 기능이 있는 폴리펩티드와 결합한다.
증폭제 성분은 유전자의 전사 개시 부위에서 5'에서 종종 발견되는 cis 활동 핵산 서열이다(증폭제는 또한 유전자 서열에서 3'에서 발견되거나 또는 인트론 서열에 위치되므로 위치 비의존적이다). 증폭제는 증폭제와 관련된 유전자의 전사 속도를 증가시키는 기능이 있다. 증폭제 활동성은 증폭제 성분에 특이적으로 결합하는 것으로 나타내는 trans 활동 전사 인자(폴리펩티드)에 반응성이 있다. 전사 인자의 결합/활동성은 이에 한정되지는 않지만, 예로서, 중간의 대사 산물(예를 들어, 글루코스), 환경적인 영향(예를 들어, 열)을 포함하는 많은 수의 환경적인 자극에 초래한다(David S. Latchman, Academic Press Ltd, San Diego의 EukaryoticTranscription Factors를 참조).
적응은 또한 진핵생물 세포 또는 원핵생물 숙주 세포 중 하나에서 상기 벡터의 유지를 촉진할 수 있는, 선택가능한 마커 및 자율적인 복제 서열의 공급을 포함한다. 자율적으로 유지되는 벡터는 에피솜성 벡터로서 간주된다. 에피솜성 벡터는 그들이 자기복제하고 통합에 필요 없이 계속될 수 있으므로 바람직하다. 이러한 유형의 에피솜성 벡터는 WO98/07876에서 기재된다.
벡터를 코드화한 유전자의 발현을 촉진하는 적응은 전사 종결/폴리아데닐화 서열의 공급을 포함한다. 이것은 또한 비시스트론의 또는 다중-시스트론의 발현 카세트에 배열된 벡터를 코드화하는 유전자의 발현을 최대화하는 내부 리보솜 도입 부위(IRES)의 공급은 포함한다.
이들 적응은 당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 일반적인 발현 벡터 구성 및 재조합 DNA 기술에 관하여 상당히 많은 수의 발행된 문헌이 있다. Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring, NY 및 거기서의 참조문헌; Marstron, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol Ⅲ IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)를 참조하시오.
바람직하게는, 벡터는 프로모터 및 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 표현가능한 유전자를 포함한다.
바람직하게는, 벡터는 에피솜성 또는 통합성 벡터이다.
바람직한 구현예에서는, 본 발명의 벡터는 플라스미드이다.
대체 가능하게는, 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연결된 바이러스, 헤르페스바이러스, 바시니아 바이러스, 렌티바이러스 또는 다른 레트로바이러스와 같은, 바이러스이다.
바람직하게는, 작동가능하게 연결된 유전자는 약제학적인 핵산 서열이다.
바람직하게는, 벡터는 발현될 개방 리딩 프레임의 두 삽입 부위를 포함하고, 각각은 독특한 프로모터로부터 전사된 것이고, 상기 프로모터는 분기적으로 전사하기 위해 배열되고, 두 프로모터는 그들 사이에 위치한 인공적으로 구성된 UCOE에 작동가능하게 연결되고, 여기서, 상기 UCOE는 양 배향에서 효과적이도록 구성된 것이다. 이것은, 이에 한정하지는 않지만, 면역글로블린을 포함하는 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질의 생산에 특히 유용하다. 벡터에서 삽입 부위는, 이에 한정하지는 않지만, 면역글로블린 중쇄 및 면역글로블린 경쇄를 코드화하는 개방 리딩 프레임을 포함하는, 흥미로운 다른 폴리펩티드를 코드화하는 핵산으로 삽입될 수 있다.
바람직하게는, 벡터는 적당한 조절 성분 하에서 도 2a-d의 서열, CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위, 폴리아데닐화 서열 및 유전자를 코드화하는 선택가능한 마커를 포함한다. UCOE가 양 배향에서 삽입될 수 있다는 것은 당 기술분야의 당업자에게 분명할 것이다.
바람직하게는 인공적인 UCOE을 포함하는 벡터는 도 3a에서 도식적으로 나타낸 바와 같은 CET 500이다.
대체 가능한 구현예에서, 벡터는 도 3b에서 나타낸 바와 같은 CET 501이다.
대체 가능하게는, 청구항 중 어느 한 항의 벡터는 적당한 조절 성분 하에서 도 7a-e의 서열, CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위, 폴리아데닐화 서열 및 유전자를 코드화하는 선택가능한 마커를 포함한다. 유사하게는, 인공적인 UCOE가 양 배향에서 삽입될 수 있다는 것은 당 기술분야의 당업자에게 분명할 것이다.
대체 가능한 바람직한 구현예에서, 인공적인 UCOE를 포함하는 벡터는 도 8a에서 도식적으로 나타낸 바와 같은 CET 600으로 알려져 있다.
대체 가능한 추가의 구현예에서, 벡터는 도 8b에서 도식적으로 나타낸 바와 같은 CET 600으로 알려져 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 트랜스펙션(transfection)된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 치료에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 치료요법에서 사용하기 위한 조성물의 제조에서 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 약제학적으로 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 환자는 유전자 치료요법에 위해 치료될 수 있는 질병을 가진 환자이다.
본 발명은 또한 질병을 치료하기 위한 또는 유익한 단백질 또는 기능을 갖는특정 조직의 세포를 제공하기 위한 치료요법에서, 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물에서 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약제학적인 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포 또는 약제학적인 조성물은 전신 근육 내의, 정맥주사의, 에어로졸(aerosol), 경구(고체 또는 액체 형태), 국부적인, 눈의, 직장의, 피하층으로의 및/또는 포막층으로의(intrathecal) 및 국부적인 직접 주사를 포함하는 경로를 걸쳐서 투여될 수 있다.
정확한 복용량 섭생은, 물론, 개별적인 환자에 대한 개별적인 임상 의사에 의해 결정되는 것이 당연할 것이고, 이것은, 교대로, 치료에서 표적이 되는 흥미로운 유전자 및 조직의 유형에 의해 발현되는 단백질의 정확한 성질에 의해 조절될 수 있다.
복용량은 질병의 징후 및 투약의 경로에 의존할 것이다. 투여량의 수는 질병, 임상 실험으로부터의 효율적이 데이터에 의존할 것이다.
본 발명에 따른 효과적인 유전자 치료요법을 위해 이동된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 DNA의 양은 바람직하게는 벡터 DNA/kg 체중에 50ng - 1000㎍의 범위이고 더욱 바람직하게는 약 1-100㎍ 벡터 DNA/㎏의 범위이다.
인 비보 세포 상승을 위해 포유동물에 대하여 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 투여하도록 본 발명에 따르는 것이 바람직할지라도, 엑스 비보 근접은 세포가 동물로부터 제거되고, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터로 형질 도입된 다음 동물에 재이식되기 위하여 유용할 것이다. 예를 들어, 간은 동물로부터 간세포를 제거하고, 인 비트로에서 간세포를 형질 도입하고 동물로 형질 도입된 간세포를 재이식하는 것으로 엑스 비보 근접에 의해 제어될 수 있다(예를 들어, Chowdhuryet al., Science254:1802-1805, 1991, 또는 in humans by Wilson, Hum. Gene Ther. 3: 179-222, 1992). 이러한 방법은 또한 적혈구, T 세포, B 세포 및 조혈의 줄기 세포와 같은, 순환계 또는 림프계에서 다양한 세포의 개체군에 이동을 효과적이게 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 사용하는 유전자 치료요법의 효율성을 결정하기 위한 포유동물 모형을 제공한다. 포유동물 모형은 본 발명의 벡터를 함유하는 트랜스제닉 동물을 포함한다. 트랜스제닉 마우스를 만드는 방법(Gordonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:7380 (1980); Harberset al., Nature293:540 (1981); Wagneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:5016 (1981); 및 Wagneret al., Proc. Acad. Sci. USA78:6376 (1981), 트랜스제닉 양, 돼지, 닭을 만드는 방법(Hammer et al., Nature 315:680 (1985)을 참조), 등은 당 기술 분야에 잘 알려져 있고, 본 발명에 따른 사용에서 예상된다. 이러하 동물은 인간에게 임상 실험하기에 앞서 시험된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 트랜스제닉 동물은 또한 흥미있는 단백질의 장기간의 생산에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 원하는 유전자 생성물을 얻기 위하여 세포 배양 시스템에서 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및/또는 숙주 세포의 용도를 제공한다. 적당한 세포 배양 시스템은 당 기술 분야에 잘 알려져 있고, 당 기술 분야의 당업자에게 알려진 문헌에서 완전히 개시되어 있다.
본 발명은 또한 내성적인 유전자와 작동가능하게 연결된 위치에서 세포의 게놈으로 폴리뉴클레오티드를 삽입하고 그것으로 인하여 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함하는 내성적인 유전자의 발현을 증가시키기 위한 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 트랜스제닉 식물을 생산하는 데에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
증가된 수득율, 내성 등을 갖는 트랜스제닉 식물의 생산은 당 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 식물을 제공한다. 인공적인 UCOE를 포함하는 세포의 일부 또는 전부는 식물로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물(인간을 제외한)을 제공한다.
본 발명은 또한 기능 유전체학의 응용 분야에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 기능 유전체학은 주로 특히 세포 유형 또는 질병 상태를 구체적으로 발현하는 유전자의 서열화에 관한 것이고, 약 발견 또는 유전자 치료요법의 목적으로 가능성 있는 흥미로운 신규한 많은 유전자 서열을 제공한다. 신규한 치료요법의 개발을 위한 이 정보의 사용에서 주요한 문제는 이들 유전자의 기능을 결정하는 방법에 있다. UCOEs는 유전자 서열의 기능을 결정하기 위하여 기능 유전체학의 많은 응용 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명의 기능 유전체학 응용 분야는하기를 포함하지만, 이에 한정하지는 않는다:
(1) 유전자 서열의 안티센스 형 또는 리보자임 녹다운 라이브러리(ribozyme knockdown library)의 지속된 발현을 이루기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것으로 인하여 세포 표현형에서 유전자를 비활성화하는 효과를 결정하는 것.
(2) 세포로의 전달을 위한, 유전자 서열에 대한 발현 라이브러리를 준비하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 사용은 유전자 서열의 믿을 수 있고, 재현가능하고, 지속된 발현을 얻을 것이다. 유전자 서열을 발현하는, 생성된 세포는 기능 결정 및 약 발견에의 다양한 접근에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 생성물에 대한 중화 항체의 증가; 구조적인, 기능적인, 또는 약 선별 연구에서 또는 세포-기저한 약 성별에서 사용하기 위한 유전자 자체의 단백질 생성물의 빠른 정제화 등이 있다.
(3) 마우스 배아 줄기(ES)세포 및 트랜스제닉 마우스를 포함하는 접근에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 사용. 대부분의 강력한 기능 유전체학적인 접근 중 하나는 발현된 유전자로 삽입에 이어서 약 선택이 가능하게 하는 구성체의 마우스 ES 세포에서의 유전자로 무작위한 삽입을 포함하고, 서열에 대하여 쉽게 구조받게 할 수 있게 한다(G. Hicks et al., Nature Genetics, 16, 338-334). 그런 다음, 신규한 서열을 갖는 유전자에서 녹아웃(knockout) 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 마우스는 그들의 기능을 쉽게 입증할 수 있다. 현재에 이 과학기술은 마우스 ES 세포에서 잘 발현하는 마우스 유전자 10%에 대하여 잘 실행한다. 흥미로운 구성체로의 UCOEs의 혼합은 마우스에서 발현된 모든 유전자를 동정화하도록 확장되는 것이 가능하게 할 것이다.
본 발명의 대체 가능한 구현예에서, 하기를 포함하는 발명에 따른 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다:
ⅰ) 본 발명에 따른 핵산 분자로 형질 전환된/트랜스펙션된 세포의 제공;
ⅱ) 상기 폴리펩티드의 제조에 공헌하는 조건에서 세포의 성장; 및
ⅲ) 상기 세포로는 상기 폴리펩티드의 정제, 또는 그것의 성장 환경.
본 발명의 바람직한 구현예에서 상기 핵산 분자는 본 발명에 따른 벡터이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 벡터는 상기 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 분비 신호를 코드화하여, 상기 폴리펩티드를 제공한다.
대체 가능하게는, 다른 바람직한 구현예는 친화도 태그 또는 항원결정기(epitope) 또는 효소의 분열 부위와 같은 발현된 재조합 단백질의 정제화를 촉진하는 추가의 순화를 포함할 것이다.
실시예 1
UCOE 단편의 이종성 조합
본 발명자들은 4.0 CMV와 8.0 CMV 구조에서의A2/HP1단편을TBP/B1유전자좌로부터 비교할 수 있는 영역으로의 치환은 hCMV 프로모터로부터의 EGFP 발현의 수준 및 안정성에서의 본질적인 증가를 나타낸다는 것을 발견하였다. 조직 배양세포에서의 이러한 발견은, 연장된 CpG 아일랜드 및 분기적으로 전사된 프로모터들이 둘러싸는 DNA는 실행가능한 통합, 트랜스진 발현 및 중심체적인 이종염색질 내로부터의 전사적인 휴지에 대한 저항성의 비율을 증가시키는 원인이 된다는 증거를 제공한다.
단일 프로모터와 관련된 하우스키핑 유전자로부터의 CpG 아일랜드를 둘러싸는 유전자 영역이 결합되었다. 구조물은 인간 PDCD2 유전자의 5'말단으로부터의 CpG 아일랜드를 함유하는 3.2kb 단편에 결합한 2kb의 인간β-액틴유전자의 5'말단으로부터 CpG 아일랜드를 포함하였다. 프로모터는 분기적으로 전사되고, 그의 전사 개시 부위는 1.9kb 떨어졌다.
그 후 전체의 5.2kb 결합물이 CMV 프로모터(PDCD2/액틴)에 의해 생성된 EGFP 리포터 유전자에 연결된다. 비교로서,β-액틴CpG 아일랜드/프로모터 영역만으로도 CMV-EGFP 발현 벡터(액틴)의 상류에 삽입되었다.
원료 및 방법
특히 도 2a-d와 관련하여, CMV 프로모터는AseI과NheI으로 소화되어 pEGFP-N1으로부터 제거한 다음, T4 DNA 폴리머라제로 블런팅(blunting)한 다음, p△-EGFP-N1을 만들기 위해 다시 붙였다. β-액틴 프로모터 EGFP 융합(fusion)은BsmI과NcoI으로 MA39(HSACCYBB)로 소화되어 만들어 지고, 적당한 단편을 분리한 후 T4 DNA 폴리머라제로 블런팅하였다. 이 단편은AgeI으로 소화된 p△-EGFP-N1에 결합하고, T4 DNA 폴리머라제로 블런팅한 다음, SmaI 소화되었다. 이것은 EGFP와 β-액틴 유전자의 첫 코돈의 구조내 융합을 생산하고, β-액틴 프로모터/MFI(메틸화가 결여된 아일랜드)가 배제되어진 발현을 생산하였다. p액틴-EGFP 구조는 안정하게 트랜스펙션된 CHOK1 세포에서 EGFP를 발현하는 것으로 관찰되었다.
2방향성 프로모터와 연장된 메틸화가 결여된 아일랜드를 갖는 벡터를 구성하기 위해, PDCD2 유전자와 그 프로모터 일부를 우선SwaI과BspEI으로 소화되어 pCP2-TNN(CYPAC-2에 있는 약 160kb의 TBP 유전자좌)으로부터 제거하고,EcoRV와XmaI(pPDCD2-KS)으로 소화된 pBluescriptKS+에 서브클론했다. 이 벡터는 PDCD2 메틸화가 결여된 아일랜드 전체를 함유하지 않으므로, 역시 프로모터를 함유하고 있는 PDCD2 메틸화가 결여된 아일랜드의 남아 있는 5' 영역은 하기의 프라이머 5'-GCGGTACCAAGGGCATTCTGAAGTTAACC-3', 5'-AGCTCCACAGGCCTGG-3'를 사용하여 pCP2-TNN으로부터 PCR을 이용하여 얻어졌다. PCR 생성물은KpnI (PCR 프라이머로 만들어진 부위)과StuI(중간 부위)에 의해 소화되고, p액틴-EGFP는SalI과KpnI으로 소화되고, PDCD2 유전자는SalI과StuI으로 소화에 의해 pPDCD2-KS로부터 제거된다. 모든 세 단편은 함께 연결되어 pPDCD2-액틴-EGFP로 만들어 졌다.
pF-pPDCD2-액틴-EGFP의 메틸화가 결여된 아일랜드를 함유하는 영역은NcoI단편(대략 5.2kb)에 의해 제거되고, 이것은 T4 DNA 폴리머라제로 블런팅된 다음, 양 방향으로,AseI로 소화되고 블런팅된 pEGFPN-1에 연결되었다. 이들 벡터는 CET510(정방향으로의 UCOE) 및 CET511(역방향으로의 UCOT)이다. 다중 클로닝 부위로 삽입된 트랜스진이 없는, 상응하는 비어있는 발현 벡터들은 CET 500 및 CET501로 각각 명명되었다(도 3).
구조물은PvuI으로 선형화 되고, CHO-K1 세포로 트랜스펙션되고 두 실험 모두에 대해 G418 선택(0.6mg/ml)하에 선택된다.
당 기술분야의 한가지 기술은 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드의 제조 및 시험에 대해 이들 공정을 적응될 것으로 이해될 것이다.
결과
도 4 및 5에서 나타낸 바와 같이, 인공적인 UCOE 구조물은 형광 중앙값의 관점에서 8kb RNP/HP-1 UCOE으로 이루어진 것과 비교할 만한 리포터 유전자 발현 수준을 나타내고, 상기 실험의 시간 경과 후의 발현하는 세포의 비율의 관점에서 약간 더 높았다.
실시예2
UCOE 및 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드 단편의 이종성 조합
원료 및 방법
액틴 메틸화가 결여된 아일랜드는NcoI으로 소화로 인하여 p액틴-EGFP로 부터 제거되고,KpnI으로 소화되는 것으로 인하여 블런팅되었다. RNP 4kb 단편은KpnI 및HindⅢ로 소화되는 것으로 인하여 CET 20으로부터 제거하였다. 그런 다음, 이 두 단편은ClaI으로 소화된 pBKS에 연결되고, 불런팅한 다음HindⅢ로 잘랐다. 이것은 pBKS에서 인공적인 UCOE를 가져다 주었다.
그런 다음, 인공적인 UCOE는SalI 및HindⅢ로 소화되는 것으로 인하여 pBKS로부터 제거되고, 블런팅되고,AseI으로 소화되고 블런팅된 pEGFP-N1에 결합된다. UCOE는 양방향으로 삽입되어 개별적으로 CET610과 CET611을 만들었다. 다중 클로닝 부위에 삽입된 트랜스진이 없는, 상응하는 발현 벡터는 개별적으로 CET600 및 CET601로 각각 명명되었다(도 8 참고).
구조물들은 직선화되고 CHO-K1 세포에 트랜스펙션되며, 상기 실험 기간동안에 G418(0.6mg/ml) 선택 하에서 선택된다.
결과
트랜스진 발현 수준에서 (양 방향의)인공적인 UCOE의 효과는 CMV 프로모터 단독의 결과 및 (양 방향의) 8kb RNP/HP-1 UCOE에 의해 얻어진 결과와 비교해 평가되었다. 도 9는 FACS 분석에서의 형광의 중간값으로, CMV 프로모터 단독은 매우 낮은 수준을 보였다. RNP UCOE(CET220)와 인공적인 UCOE(CET600)는 정방향에서 30배 증가된 발현을 보이고, 비교가능하였다. 그러나, RNP UCOE에서 보여진 방향의 편향성은 인공적인 UCOE에 비해 현저하게 적었다, 즉, 역방향에서의 인공적인 UCOE는, 정방향에서의 어느 한 UCOE보다 여전히 약간 덜 좋음에도 불구하고, 월등하였다. 이것은 총체적인 발현 수준 및 장기간(120일 이상)에 걸쳐 발현을 유지하는 능력 모두에 있어서 사실이었다.
동일한 실험이 시간에 걸친 발현을 유지하는 세포의 비율의 측면에서 분석되는 경우에는, 양 방향에서, 양쪽 UCOE는 CMV 단독보다 일관되게 좋은 결과를 보였다(본 실험의 전부분에서 발현되었던 세포수의 약 두 배). 이 차이는 약 10%의 세포가 여전히 발현하고 있는 120일까지는, CMV만으로 된 아일랜드에서 점차적으로 발현하는 세포들이 줄어듦에도 불구하고, 시간이 오래될수록 더 두드러지게 되었다. 이것은 정방향으로의 두 UCOE에 대해 약 90%의 유지와 대조적이고, 실험 후반부에서의 역방향에 대한 것도 약간 낮은 수준(75-85%)의 유지와 대조적이다.
실시예3
동일한 벡터에 대한 두 유전자의 공동발현(co-expression)
중쇄과 경쇄가 적절하게 균형적으로 발현되는 효과적인 기능적 항체생성이 요구된다. 다른 플라스미드에서의 두 사슬의 트랜스펙션은 같은 정도를 유지하는 것을 어렵게 하고, 벡터가 게놈에서 서로 가깝게 통합된다면, 유전자 사이에 전사적인 간섭에 대한 가능성이 제공한다.
동일한 벡터에서 두 유전자의 공동발현을 위한 일련의 새로운 벡터가, 내성 마커로서 neo와 puro를, 경쇄 또는 중쇄를 발현시키는 hCMV, 베타-액틴 또는 mCMV 프로모터를 비교하기 위해 구성되었다(도 11).
원료 및 방법
pORT1(Cobra)의 두SfiI 부위가 어닐링된 oligos Mfe.F, 5'-AACAATTGGCGGC 및 Mfe.R, 5'-GCCAATTGTTGCC로 이루어진 적응 분자의 도입으로MfeI 부위에 교환되었다.
HSV TK polyA 부위는 프라이머 TK.F, 5'ACGCGTCGACGGAAGGAGACAATACCGGAAG 및TK.R, 5'-CCGCTCGAGTTGGGGTGGGGAAAAGGAA로 하여 pVgRXR(Invitrogen)로부터 증폭되었다.SalI 내지XhoI 단편은SalI 부위로 삽입되었다. 마우스의 PGK polyA 부위는 프라이머 mPGK.F, 5'-CGGGATCCGCCTGAGAAAGGAAGTGAGCTG 및 mPGK.R, 5'-GAAGATCTGGAGGAATGAGCTGGCCCTTA로 수컷 BALB/c 게놈 DNA(Clontech)로부터 증폭시키고BamH I 내지BglⅡ 단편은 BamH I 부위로 클론하였다.
neo 발현 카세트를 함유하는 pcDNA3.1의AseI 내지SalI 단편은 T4 DNA 폴리머라제로 처리되고,SpeI 연결자(linker)(5'-GACTAGTC)에 연결되었다. 그런 다음,SpeI 단편은SpeI 부위에 클론되어 pORTneoF가 생성되거나 또는, 푸로마이신 내성 카세트롤 포함하는 CET700(Cobra)의EcoR I 내지NotI 단편은 T4 DNA 폴리머라제로 처리되고,XbaI 결합자에 연결하고,XbaI 단편은XbaI 부위로 클론되어 pORTpuroF가 생성되었다.
pCMVEGFPN-1(Cobra)으로부터의HindⅢ 내지BamH I 마우스 CMV 프로모터 단편은 BKS+(Cobra)에서 혼성 UCOE의HindⅢ에서BamH I부위에 서브콜론되었다. 그런 다음, 인간 CMV 프로모터는 프라이머 hCMVF, 5'-CTCGAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT 및 hCMVR, 5'-GTCGACGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCT를 사용하여 플라스미드 pIRESneo(Clontech)로부터 증폭되고,XhoI 내지SalI 단편은SalI 부위로 클론되었다. 그런 다음BamH I 내지SalI 단편은 pORTneoF의BamH I에서SalI부위에 클론되어 pBDUneo100가 생성되거나 또는, pORTpuroF에 클론되어 pBDUpuro300이 생성되었다.
BKS+에서 혼성 UCOE에서의SalI 클로닝 부위의 상류의 두 ATG 코돈은 부위-지향적인 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 변형되고BamH I 내지SalI 단편은 pORTneoF의BamH I 내지SalI부위에 클론되어 pBDUneo200이 생성되거나 또는, pORTpuroF로 클론되어 pBDUpuro400이 생성되었다.
인간의 항체 경쇄를 코드화하는 염기서열은 모든 네 개의 2방향성 UCOE 벡터(pBDUneo100, pBDUneo200, pBDUneo300, pBDUneo400)의BamH I 또는SalI 부위 중 하나로 클론된 다음, 남은BamH I 또는SalI 클로닝 부위에서의 면역글로불린 중쇄를 코드화하는 염기서열은 pBDUneo112, pBDUneo121, pBDUneo212, pBDUneo221, pBDUneo112, pBDUneo121, pBDUneo212 및 pBDUneo221이 생성된다. 항체 발현 구조물 8개 모두를 제조업자의 설명서에 따라 Lipofectamine(Invitrogen)을 사용하여 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, G418(neo 벡터) 500㎍/㎖ 또는 푸로마이신(puro 벡터) 12.5㎍/㎖으로 선택되었다.
풀(pool)이 선택되었고, 항체 생산 속도는 CHO 세포에서 발현되는 항체에 대한 최적의 프로모터와 선택가능한 표지 조합을 결정하기 위해 다른 구조체 사이에 비교되었다.
결과
표 1은 마우스 CMV 프로모터로부터 발현되는 경쇄를 함유하는 벡터가 항체의 최적의 발현을 준다는 것을 예증한다. G418 또는 푸로마이신 내성 카세트를 함유하는 벡터로 얻어진 생산 속도 사이에서 유의할 만한 차이를 보이지 않았다. 개별적으로 수행된 공동-트랜스펙션 실험의 풀로부터의 생산 속도가 비교되었다. 이러한 풀로부터의 클론은 3-18pg/세포/일의 생성 속도로 분리되었다. 그러나, 5pg/세포/일 이상의 클론은 불안정하고, 발현이 빠르게 감소하거나 또는, 생산이 중단되었다. 약 5pg/세포/일로 발현하는 클론은 초기 발효 시험에 사용되었다. 이들 예비적 표시는 2-방향성의 UCOE 벡터 트랜스펙션화체(transfectant)로부터 분리된 클론에서는 더 높은 생성률이 관찰될 것이라는 점에서 매우 고무적이다.
표1: 2-방향성 UCOE 벡터들로부터의 hAb1(IgG4)의 발현(CHO-K1 풀)
CHO-K1 풀
벡터(pg/cell/day) H3 프로모터 K1 프로모터 수득률
pBDUneo112 마우스 CMV 인간 CMV 0.3
pBDUneo121 인간 CMV 마우스 CMV 1.5
pBDUneo212 마우스 CMV 인간 베타-액틴 0.06
pBDUneo221 인간 베타-액틴 마우스 CMV 1.3
pBDUneo312 마우스 CMV 인간 CMV 0.5
pBDUneo321 인간 CMV 마우스 CMV 1.4
pBDUneo412 마우스 CMV 인간 베타-액틴 0.05
pBDUneo421 인간 베타-액틴 마우스 CMV 2.3
공동-트랜스펙션** 인간 CMV 인간 CMV 0.7
**공동-트랜스펙션은 각각 4kb UCOE CMV 벡터들(hydro 및 neo 선택)로부터의 얻어진 동일한 항체 유전자를 사용하여 미리 수행되었다.
참고문헌

Claims (57)

  1. 염색질을 개방하거나, 또는 개방 상태로 염색질을 유지하고, 적어도 두 가지의 다른 조직 형태의 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 복제성의 발현을 촉진시키는, UCOE를 포함하는 폴리뉴클레오티드로, 여기서, 상기 UCOE의 뉴클레오티드 서열은 자연적으로는 발생하지 않는 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 작동가능하게 연결된 유전자의 비-조직이 특이적으로 복제성의 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드
  3. 제 1항에 있어서, 활성 유전자 발현이 일어나는 모든 조직 형태에서, 작동가능하게 연결된 유전자의 복제성의 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 생리학적인 수준으로 촉진시키는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1항 내지 제 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 확장된 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 유전자 발현의 조절에 관련된, 하나 이상의 자연적으로 발생하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 하나 이상의 자연적으로 발생하는 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 분기적으로 전사하는 이중의 또는 2방향성의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역이나 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 UCOE는 상기 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역이나 그것의 단편에 걸쳐 있는 100bp 내지 3.0kb의 범위내의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 PDCD CpG아일랜드/ 프로모터 영역이나 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 UCOE는 상기 인간 PDCD CpG 아일랜드/ 프로모터 영역이나 그것의 단편에 걸쳐 있는 100bp 내지 3.0kb의 범위내의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 걸쳐 있는 100bp 내지 3.0kb의 범위내의 DNA 단편과 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 걸쳐 있는 100bp 내지 3.0kb의 범위내의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 걸쳐 있는 2.0kb의 DNA 단편과 인간 PDCD2 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 걸쳐 있는 1.8kb의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 프로모터가 분기적으로 배향된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 제 1항 또는 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 어느 배향으로든 도 2a-d의 염기서열 또는 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제 1항 또는 제 16항 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 RNP CpG 아일랜드/프로모터 영역 또는 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 RNP CpG 아일랜드/프로모터 영역에 걸쳐져 있는 4kb DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드를 포함하는 적어도 하나 이상의 서열에 인접한 2-분기적인 프로모터를 포함하는 확장된 메틸화가 결여된 CpG 아일랜드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인간 RNP CpG 아일랜드/프로모터 영역과 인간 β-액틴 CpG 아일랜드/프로모터 영역에 걸쳐 있는 100bp 내지 3.0kb의 범위내의 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 UCOE는 어느 배향으로든 도 7a-e의 서열 또는 그것의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 전사의 개시를 불가능하게 하는 방식으로 돌연변이된 하나 이상의 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것인 폴리뉴클레오티드.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 프로모터는 마우스 CMV 프로모터인 것인 폴리뉴클레오티드.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 UCOE는 인공적으로 합성된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  28. 제 27항에 있어서, 추가적으로 프로모터에 작동가능하게-연결된 발현가능한 유전자 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  29. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 벡터가 에피솜성의 또는 통합성의 벡터인 것인 벡터.
  30. 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드인 벡터.
  31. 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스인 벡터.
  32. 제 27항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작동가능하게-연결된 유전자가 치료학적인 핵산 염기서열인 벡터.
  33. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 발현되어질 개방 리딩 프레임의 삽입을 위한 부위를 포함하고, 각각은 별개의 프로모터로부터 전사되고, 상기 프로모터들은 분기적으로 전사하도록 배열되고, 둘 다 그들 사이에 위치한 인공적으로 구성된 UCOE에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 상기 UCOE은 양쪽 배향으로 효과적이도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 백터.
  34. 제 33항에 있어서, 발현되어질 개방 리딩 프레임의 두 개의 삽입 부위 중 하나는 면역글로불린 중쇄를 코드화하는 핵산을 포함하고, 나머지 부위는 면역글로불린의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  35. 제 27항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 도 2a-d의 서열, CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위, 폴리아데닐화 서열 및 적당한 조절 구성 성분 하에서의 선택적인 표지를 코드화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  36. 제 27항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 도 7a-e의 서열, CMV 프로모터, 다중 클로닝 부위, 폴리아데닐화 서열 및 적절한 조절 구성 성분 하에서의 선택적인 표지를 코드화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  37. 제 35항 또는 제 36항에 있어서, 상기 UCOE의 방향성이 역위인 벡터.
  38. 도 3a에 개략적으로 나타내어진 CET 500 벡터.
  39. 도 3b에 개략적으로 나타내어진 CET 501 벡터.
  40. 도 8a에 개략적으로 나타내어진 CET 600 벡터.
  41. 도 8b에 개략적으로 나타내어진 CET 601 벡터.
  42. 제 27항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포.
  43. 치료에 사용되는, 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제 27항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제 42항에 따른 숙주세포.
  44. 유전자 치료에서 사용하기 위한 혼합물의 제조를 위한 폴리뉴클레오티드, 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 제42항에 따른 숙주세포의 용도.
  45. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제 27항 내지 제 41항의 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 제42항에 따른 숙주세포의 약제학적으로 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 치료 방법.
  46. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 및/또는 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및/또는 제42항에 따른 숙주세포를 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 약제학적인 조성물.
  47. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 제 27항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및/또는 제42항에 따른 숙주세포의 원하는 유전자 생성물을 얻기 위한 세포 배양 시스템에서의 용도.
  48. 내인성 유전자의 발현을 증가시키기 위한 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도로, 상기 폴리뉴클레오티드를 내인성 유전자와 작동가능하게 연관된 위치에서 세포의 게놈으로 삽입함으로써 상기 유전자의 발현 수준을 증가시키게 하는 것으로 이루어지는 용도.
  49. 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.
  50. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 식물
  51. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물(인간 제외).
  52. 상응하는 내인성 유전자 서열의 발현을 비활성화하는 안티센스 유전자 서열의 발현을 달성하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도
  53. 발현 라이브러리의 제조에서의 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.
  54. 인간을 제외한 동물에서 발현가능한 유전자를 동정하는 방법에서의 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도로, 인간을 제외한 동물의 배아 줄기 세포에 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성물을 삽입하는 것으로 이루어지고, 여기서 상기 구성물은 발현된 유전자로의 삽입 후에만 약물 선택을 허용하는 것인 용도.
  55. 다음에서 선택된 DNA 염기서열을 포함하는 핵산 분자:
    (ⅰ) 도 2a-d 또는 도 7a-e에서 나타낸 DNA 서열;
    (ⅱ) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코드화하는 도 2a-d 또는 도 7a-e에서 나타낸 서열에 혼성화하는 DNA 서열.
  56. 도 2a-d 또는 도 7a-e에 나타낸 서열에 스트린전트 혼성화 조건하에서 어닐링하는 단리된 핵산 분자.
  57. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로, 상기 방법은
    (ⅰ) 제 55항 또는 제 56항에 따른 핵산 분자로 형질변환된/트랜스펙션된 세포를 제공하고;
    (ⅱ) 상기 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건에서 상기 세포를 증식시키고; 그리고
    (ⅲ) 상기 세포로부터 또는 그 증식 환경으로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 것으로 이루어지느 방법.
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