CN1461343B - 多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含天然不存在的遍在染色质开放元件(UCOE)的多核苷酸。本发明还涉及包含多核苷酸序列的载体、包含载体的宿主细胞以及将多核苷酸、载体或宿主细胞用于治疗，或用于体外蛋白质表达。

Description

多核苷酸

发明领域

本发明涉及包含天然不存在的遍在染色质开放元件(UCOE)的多核苷酸。本发明还涉及包含多核苷酸序列的载体、包含载体的宿主细胞以及将多核苷酸、载体或宿主细胞用于治疗，或用于体外蛋白质表达。发明背景

当今高等真核生物的染色质结构模型假定基因构成了“结构域”^1，2。染色质结构域设想的存在形式有缩合、“关闭”、转录沉默状态，或解缩合、“开放”、转录感受态构型。建立开放染色质结构特征是提高DnaseI敏感度、DNA甲基化不足和组蛋白乙酰化不足，被视为基因表达起始的前提条件。

染色质区域的开放和关闭性质反映在通过随机整合到宿主细胞基因组的转基因的行为中。当整合到小鼠基因组不同位置时，相同构建体显示出不同组织特异的模式及发展阶段特异的表达^3-5。在给定转基因小鼠组织内的花斑表达模式，叫做位置效应花斑(PEV)，也经常可以观察到⁶。当外源基因体外整合到哺乳动物细胞培养物中的染色体时，许多整合事件导致转基因快速沉默，而残余基因在表达水平上有大幅度变化^7，8。这些位置效应致使转基因表达无效，牵连到基础研究和生物技术应用。

基因组织的染色质结构域模型暗示能够建立并维持转录感受态、开放染色质结构的遗传控制元件与基因组活性区域有关。

基因座控制区(LCR)是具有长范围染色质重塑能力的一类转录调控元件。通过赋予整合位点独立的转基因拷贝数依赖的、在顺式连接的基因尤其是单拷贝转基因上的生理表达水平的能力，对转基因小鼠中的LCR作出功能性定义^9，10。关键是，这种表达是组织特异性的。LCR能够阻碍异源染色质的扩散，防止PEV⁶及由一系列DnaseI过敏(HS)的位点，这些位点可以位于它们调控的基因的5’或3’端¹⁰。

LCR似乎是由两个分散的、尽管不必互相依赖的组分构成。首先是开放染色质结构域的建立，其次是授予转基因拷贝数目依赖性表达的显性转录活化能力⁹。LCR发挥作用的分子机制尚在争论之中^2，11-13。

培养哺乳动物细胞系后代来生产高水平的治疗蛋白产物，这是一种主要发展产业。染色质位置效应使其方法变得困难、费时和昂贵。最常用的生产这种哺乳动物“细胞工厂”的方法依靠由抗药基因的组合所诱导的基因扩增(例如DHFR，谷氨酰胺合成酶(Kaufman，1990，酶学方法，185：537-566，在此引作参考))，以及维持严格选择压力。运用源自适当组织的细胞，含有来自高表达基因结构域的LCR的载体的应用大大简化了程序(Needham等，1992，核酸研究，20：997-1003；Needham等，1995，蛋白质表达和纯化，6：124-131，分别在此引作参考)。

然而，尽管在某些情况下LCR的组织特异性很有用，但是对许多应用却是主要限制，例如，在需要表达的组织中LCR未知，或是在许多或所有组织中需要表达的情形下。

我们在此引作参考的在审专利申请PCT/GB/02357(WO00/05393)描述了负责建立横跨基因座的开放染色质结构的元件，所述基因座唯一由遍在表达的持家基因所组成。这些元件不是来源于LCR。本发明提供了包含遍在染色质开放元件(UCOE)的多核苷酸，所述UCOE在开放状态下打开染色质或维持染色质，并在至少两种不同组织类型的细胞中促进可操作连接基因重复性表达，其中多核苷酸不是来源于基因座控制区。

无甲基化CpG岛在本领域中是众所周知的(Bird等(1985)Cell40：91-99，Tazi和Bird(1990)Cell 60：909-920)，并可称作DNA的富含CpG区域，其具有平均含量以上(＞60％)的CpG二核苷酸，其中胞嘧啶残基未甲基化，以及其沿着两个紧密空间(0.1-3kb)背驰转录基因的5’末端延伸。DNA的这些区域在所有组织的发育过程中保持无甲基化(Wise和Pravcheva(1999)Genomics 60：258-271)。它们与所有遍在表达基因以及估计40％表现组织限制的表达分布图的基因的5’末端相关^16，17，并已知是活性染色质的定位区域¹⁸。

延伸的无甲基化CpG岛是这样一种无甲基化CpG岛，其延伸跨越了包含一种以上转录起始位点的区域和/或延伸超过300bp，以及优选超过500bp。延伸的无甲基化CpG岛的边界通过对区域运用PCR结合限制性内切酶而被功能性限定，所述限制性内切酶在识别序列消化(切割)DNA上的能力对存在的任何CpG残基的甲基化状态敏感。一种这样酶是HpaII，其识别和消化位点是在CCGG处，这在CpG岛内普遍存在，但是只有当中央CG残基未被甲基化时才可被识别和消化。这样，如果DNA未被甲基化，由于HapII消化，用HapII消化的DNA以及对含有HapII位点的区域进行PCR，则不产生扩增产物。如果DNA被甲基化，则PCR将仅生成扩增产物。因此，除了无甲基化区域，HapII不能消化DNA，而观察到PCR扩增产物，由此限定“延伸的无甲基化CpG岛”的边界。

我们已经证明跨越包括二重背驰转录启动子的无甲基化CpG岛的区域产生基因表达的重复性生理水平，所述启动子，来源于人TATA结合蛋白(TBP)/蛋白体组分B1(PSMBI)和异源核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2)/异源染色质蛋白1Hsγ(HP1^Hsγ)基因座，以及证明其能够阻止花斑表达模式，并基因沉默，基因沉默经常与着丝粒异源染色质内的转基因整合一起出现。

我们已经表明与活性转录启动子相关的无甲基化CpG岛具有重塑染色质的能力，并因此被认为在持家基因座中建立和维持开放结构域的首要决定因素。

UCOE提高了生产基因传递事件的比例，并提高了转基因表达的水平和稳定性。其具有重要的研究和生物技术应用，包括转基因动物和培养细胞中重组蛋白产物的生成。我们已显示了UCOE在CMV-EGFP报告构建体表达和分泌性有药物价值的蛋白促红细胞生成素方面的有益效果。UCOE的特性也暗示在基因治疗方面的应用。其效果经常受到低频率的生产性基因传递事件和不足的表达水平和持续时间的限制⁴⁵。

由于这些有意义的提示和广泛的应用范围，有必要来进一步优化转基因表达水平并在长时间培养中实现基因表达的稳定性的提高。

一个特殊需要是克服在一些天然存在的UCOE中所观察的方向偏差。尽管UCOE赋予了在可操作连接的启动子上的非位置依赖性转录的增强，这在某种程度上为方向依赖的(即UCOE在一种方向上比其它方向更显著有效)。在一些情况下，如一种含有两个背驰转录的UCOE位于其中的表达单元的表达载体，优点在于能从两个启动子中获得平衡的、高水平的表达，而天然UCOE则不可能。因此需要人工构建双向有效的UCOE。发明叙述

本发明提供了含有UCOE的多核苷酸，其在开放状态下打开染色质或维持染色质，并在至少两种不同组织种类的细胞中促进可操作连接基因的重复性表达，其中UCOE的多核苷酸序列在天然中不存在。

含有来自至少两个基因的调控序列的基因组区域结合后形成在长培养时间中显著增强基因表达的嵌合UCOE。这样一种嵌合UCOE组成了天然不存在的多核苷酸序列。因此，短语“天然不存在”是指这样一个情况，其中组成UCOE的元件的核苷酸序列不象这样天然存在，它是通过人造或人工构建，是天然存在和/或人工产生序列的组合。

在此处所用的术语“人工”、“人工构建”、“嵌合”等，参考UCOE在全篇可交换使用，表示UCOE或组成UCOE的元件在天然情况下不存在；即“天然不存在”。如果UCOE是天然存在的序列的组合，则正是它们排列或组织成UCOE是非天然的。通过非限制实施例，人工UCOE可由两个天然存在的序列组成，所述序列通常分开(来自染色体不同区域、来自不同染色体、来自不同生物等)，以及被合并在非天然组织中，从而创建嵌合或人工UCOE。

在此处所用的术语“人工合成”和“人工产生”是参考UCOE的序列，指非天然序列；即，天然不存在并全部合成的序列。这类“人工合成”和“人工产生”的序列可结合到天然存在的序列上以组成或创建人工UCOE。

依据本发明的另一方面，提供含有DNA序列的核酸分子，所述DNA序列选自：

1)图2或图7中表示的DNA序列；

2)与图2或图7中表示的序列杂交的DNA序列，其编码根据本发明所述的多肽。

在本发明优选的实施方案中提供了分离的核酸分子，其在严格杂交条件下退火至图2或图7中代表的DNA序列上。

严格杂交/洗脱条件是本领域众所周知的。例如，60℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中清洗后核酸杂合物是稳定的。本领域众所周知的是如果核酸序列已知，最适杂交条件是可以计算的。例如，可以通过杂交核酸的GC含量确定杂交条件。请参见Sambrook等(1989)，分子克隆：实验室手册。在规定同源性的核酸分子之间进行杂交所需的严格条件的计算通式为：

T_m＝81.5℃+16.6Log[Na⁺]+0.41[％G+C]-0.63(％甲酰胺).

优选的是本发明多核苷酸非组织特异性地促进可操作连接基因的重复性表达。

优选的是本发明多核苷酸在活性基因表达发生的所有组织类型中促进可操作连接基因的重复性表达。

优选的是本发明多核苷酸在生理水平上促进可操作连接基因的表达。

优选的是本发明多核苷酸包含延伸的无甲基化CpG岛。

优选的是本发明多核苷酸包含一种或多种与基因表达控制相关的天然存在的序列。

优选的是本发明多核苷酸包含一种或多种天然存在的启动子。

优选的是本发明多核苷酸包含双重或双向背驰转录的启动子。

优选的是本发明多核苷酸包含人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域或其片段。

优选的是本发明多核苷酸包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域或其片段。

优选的是本发明多核苷酸包含人PDCD2 CpG岛/启动子区域或其片段。

优选的是本发明多核苷酸包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG岛/启动子区域或其片段。

优选的是本发明多核苷酸包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域，以及包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG岛/启动子区域。优选的是所述片段直接与方向背驰的启动子相邻。

优选的是本发明多核苷酸包含2kb的DNA片段，其跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域，以及包含1.8kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG岛/启动子区域。优选的是所述片段直接与方向背驰的启动子相邻。

在进一步优选的实施方案中，多核苷酸包含图2的序列或其片段，方向任意。

优选的是多核苷酸包含人RNP CpG岛/启动子区域或其片段。

优选的是多核苷酸包含跨越人RNP CpG岛/启动子区域的4kb的DNA片段。

优选的是多核苷酸包括含有双背驰启动子的延伸的无甲基化CpG岛，所述双背驰启动子与至少一种含有无甲基化CpG岛的其他序列临近。

优选的是多核苷酸包含人RNP CpG岛/启动子区域和跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域的范围是100bp-3.0kb的DNA片段。

在进一步的优选实施方案中，多核苷酸包括以任意方向插入的图7的序列或其片段。优选的是多核苷酸含有一种或多种启动子序列。

本领域已知的是在一些情形下，上游启动子的连读转录抑制了转录起始(Youssoufian和Lodish(1993)，鼠红细胞生成素受体基因受到上游重复元件的转录抑制，Mol Cell Biol 13(1)98-104)。因此本发明的一个实施方案包括本发明多核苷酸，其中一种或多种启动子序列以这种方式突变而不能起始转录。

优选的是启动子选自CMV、EF-1a、RSV LTR或HIV2 LTR或源于其中的序列组合。更优选的启动子是CMV启动子，最优选的启动子是小鼠CMV启动子。

优选的是本发明多核苷酸包括至少一种人工合成的序列。

本发明还提供含有本发明多核苷酸的载体。

优选的是所述载体为适合于真核生物表达的表达载体。

通过实例而非通过限制方式，通常适应包括提供介导细胞/组织特异表达的转录控制序列(启动子序列)。

启动子和增强子是本领域中熟知的术语，包括下列仅由实施例而非限制方式提供的特征。启动子是直接与转录起始连接的5’端顺式作用调控序列。启动子元件包括所谓的TATA盒和RNA聚合酶起始选择(RIS)序列，其功能是选择转录起始位点。这些序列也结合多肽，其功能特别是通过RNA聚合酶促进转录起始选择。

增强子元件是常常在基因转录起始位点5’端找到的顺式作用的核酸序列(在基因序列的3’端也可找到增强子，或其甚至位于内含子序列中，并因此为位置不依赖型。)增强子有提高与该增强子连接的基因的转录速率的功能。增强子活性是对反式作用转录因子(多肽)的反应，其已显示出与增强子元件特异性结合。转录因子的结合/活性是对许多环境因素的反应，其通过实例而非限制方式包括中间代谢物(如葡萄糖)、环境效应子(如热)(参见David S.Latchman，真核生物转录因子，Academic Press Ltd，SanDiego)。

适应也包括提供选择性标记和自主复制序列，其促进真核细胞和原核生物宿主中所述载体的维持。自主维持的载体是指游离型载体。游离型载体是理想的，这是由于它们无需整合而自主复制和维持。W0/98/07876描述了这种类型的游离型载体。

促进载体编码基因表达的适应包括提供转录终止/聚腺苷酸化序列。也包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，其功能是最大化表达以双顺反子或多顺反子的表达盒排列的载体编码的基因。

这些适应也是本领域熟知的。有大量出版文献是有关表达载体构建和一般DNA重组技术。请参见Sambrook等(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Marston，F(1987)DNA克隆技术：实用方法第3卷，IRL出版社，英国牛津；DNA克隆：FMAusubel等，当前分子生物学方法，John Wiley & Sons有限公司，(1994)。

优选的是载体包含与启动子和多核苷酸可操作连接的可表达基因。

优选的载体是游离型或整合型载体。

在优选的实施方案中，本发明载体为质粒。

或者，载体可以是病毒，如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、慢病毒或其它反转录病毒。

优选的可操作连接基因为治疗性核酸序列。

优选的是载体包含两个待表达可读框插入的位点，每一位点由不同的启动子转录，所述启动子排列后可背驰转录，并且两个启动子可操作连接到位于其间的人工构建UCOE上，以及其中所述UCOE已被构建为双向有效的结构。这样特别有利于生产含有两条或多条肽链的蛋白质，包括但不限于免疫球蛋白。此载体中的插入位点可插入编码不同目的多肽的核酸，包括但不限于编码免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的可读框。

优选的是载体包含在适当控制元件下的图2序列、CMV启动子、多克隆位点、聚腺苷酸化序列和编码可选择性标记的基因。同样，对本领域专业技术人员来说，人工UCOE可以双向插入将是一目了然的。

优选的载体包含人工UCOE，是图3a中示意的CET500。

在另一实施方案中，载体为图3b所示的CET501。

或者，任一项权利要求所述的载体包括在适当控制元件下的图7序列、CMV启动子、多克隆位点、聚腺苷酸化序列和编码可选择性标记的基因。同样，对本领域专业技术人员来说，人工UCOE可以双向插入将是显然的。

在这选择的优选实施方案中，载体包括人工UCOE，已知为图8a示意的CET600。

在进一步或选的实施方案中，载体是CET601，如图8b所示意。

本发明还提供用本发明载体转染的宿主细胞。

本发明还提供用于治疗的多核苷酸、载体和宿主细胞。

本发明还提供多核苷酸、载体和宿主细胞在用于基因治疗组合物制造中的应用。

本发明还提供治疗方法，其包括给需要这种治疗的病人施用药物有效量的发明的多核苷酸、载体或宿主细胞。优选的是病人正患有可由基因疗法处理的疾病。

本发明还提供药物组合物，其包括多核苷酸和/或载体和/或宿主细胞，任选与可药用载体或稀释剂混合，用于治疗疾病或给特定组织的细胞提供有益的蛋白或功能。

本发明的多核苷酸、载体或宿主细胞或药物组合物可以通过下列途径施用，包括全身性肌内、静脉内、气溶胶、口服(固体或液体形式)、局部、眼、直肠、腹膜内和/或鞘内和局部直接注射。

确切的剂量方案当然需要由单个临床医师针对个别临床患者来确定，而这反过来又受到目的基因表达的蛋白和正被靶向治疗的组织类型的确切性质的控制。

剂量也将取决于疾病症状及施用路径。剂量数将取决于疾病及临床测试的功效数据。

依据本发明，有效基因治疗所用的多核苷酸或载体DNA的量优选范围是在50ng-1000μg载体DNA/kg体重；以及更优选范围是在约1-100μg载体DNA/kg体重。

尽管根据本发明，优选是给哺乳动物施用多核苷酸、载体或宿主细胞用于体内细胞吸收，但离体方法可采用，于是将细胞从动物中移出，用多核苷酸或载体转导，然后重植入动物体内。例如，肝可由离体方法进行评价，所述离体方法是从动物体上移取肝细胞，体外转导到肝细胞中，并将转导的肝细胞重植入动物体内(如对兔的描述，Chowdhury等，Science 254：1802-1805，1991，或在人体内，Wilson，Hum.Gene Ther.3：179-222，992)。这些方法也可以有效传递到循环系统或淋巴系统的各种细胞群中，如红细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞。

本发明的另一实施方案提供运用本发明多核苷酸、载体或宿主细胞确定基因疗效的哺乳动物模型。哺乳动物模型包括其细胞含有本发明载体的转基因动物。制备转基因小鼠的方法(Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7380(1980)；Harbers等，Nature 293：540(1981)；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5016(1981)；以及Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6376(1981)，制备转基因羊、猪、鸡的方法(参见Hammer等，Nature 315：680(1985))等是本领域众所周知的，并依据本发明考虑使用。在人体临床试验前允许对这些动物进行测试。

含有本发明多核苷酸的转基因动物也可用于长期生产目的蛋白。

本发明也提供在细胞培养系统中运用多核苷酸，和/或载体，和或宿主细胞以获得所需基因产物。合适的细胞培养系统是本领域众所周知的，并在本领域专业技术人员已知的文献中详细叙述。

本发明也提供运用多核苷酸来提高内源基因的表达，其包括在与内源基因可操作相关的位置上，将多核苷酸插入到细胞的基因组中由此提高基因表达水平。

本发明还提供本发明多核苷酸在生产转基因植物中的应用。

提高产量、抗性等的转基因植物的增殖对本领域那些专业人员是众所周知的。本发明也提供含有本发明多核苷酸细胞的转基因植物。一些或所有包含人工UCOE的细胞起源于植物。

本发明还提供含有本发明多核苷酸细胞的转基因非人类动物。

本发明也涉及在功能性基因组应用中使用本发明多核苷酸。功能性基因组主要涉及特殊细胞类型或病态中特异性表达的基因序列，目前提供成千上万种潜在的用于新药发现和基因治疗的新型基因序列。利用这些信息用于开发新型治疗的主要问题在于如何确定这些基因的功能。为了确定基因序列的功能，在众多功能性基因组应用中可使用UCOE。本发明的功能性基因组应用包括但不限于：

(1)运用本发明的多核苷酸来获得基因序列或核酶剔除文库的反义版本的持续表达，由此确定基因在细胞表型上灭活的效果。

(2)运用本发明的多核苷酸以制备基因序列的表达文库，以便送递到细胞中将导致基因序列可靠、重复、持久的表达。所得细胞表达基因序列可用于功能确定和新药发现的各种方法中。例如，提供基因产物的中和抗体；基因本身蛋白产物的快速纯化，用于结构、功能和药物筛选研究中；或用在基于细胞的药物筛选中。

(3)本发明多核苷酸在涉及小鼠胚胎干(ES)细胞和转基因小鼠方法中的应用。最有效的功能性基因组方法之一包括在小鼠ES细胞中随机插入基因，所述结构在插入表达基因后仅允许药物选择，并可容易地被拯救用于测序(G.Hick等，Nature Genetics，16，338-334)。然后，基因中敲除突变体的具有新型序列的转基因小鼠可容易地被制备以探测到其功能。目前，此技术对小鼠ES细胞中很好表达的10％小鼠基因测定效果不错。把UCOE掺入到整合结构中将使得此技术推广应用到鉴别小鼠中所有表达基因。

本发明另外的实施方案提供生产依据本发明所述的多核苷酸的方法，其包括：

1)提供用依据本发明所述的核苷酸分子转化/转染的细胞；

2)有利于生产所述肽的条件下使所述细胞生长；

3)从所述细胞中或其生长环境中纯化所述多核苷酸。

在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子是根据本发明所述的核酸分子。

在本发明优选的实施方案中，所述载体编码促进所述多肽纯化的分泌信号，并且所述多肽由此信号提供。

或者，其它优选的实施方案可包括进一步精制，以利于表达重组蛋白的纯化，如亲和标记或表位或酶切位点。发明详述

现在本发明将仅以实施例方式及参考附图来描述，其中：

图1是人工UCOE NcoI片段的线性限制性图谱。阴影箭头表示PDCD2和肌动蛋白转录物，箭头方向表示各自启动子转录的方向。

图2表示依据本发明所述的PDCD2/肌动蛋白人工UCOE NcoI片段的核苷酸序列。

图3a和3b描述含有表达载体的PDCD2/肌动蛋白人工UCOE的质粒图谱。

图3a表示CET500，其含有CMV启动子的PDCD2/肌动蛋白人工UCOE上游以及适于待表达可读框插入的多克隆位点。在此特定的实施方案中，质粒骨架来源于pEGFPN-1，并携带卡那霉素/新霉素抗性基因。

图3b表示CET501，其含有反向的PDCD2/肌动蛋白人工UCOE。

图4表示稳定转染CHO细胞库中报告转基因(EGFP)的表达水平，在G418选择下维持85天。表达单独由CMV启动子(CMV)，或与8kb RNP/HP-1(CET200)组合，或与人工PDCD2/肌动蛋白UCOECET510组合驱动，并通过FACS分析以中值荧光测定。

图5表示在上述85天的实验中，经FACS分析，以阳细胞％表示表达转基因细胞的比例。

图6是RNP/HP-1/肌动蛋白人工UCOE片段的线性限制性图谱。阴影箭头表示无甲基化岛，箭头方向表示各自启动子转录的方向。

图7表示依据本发明所述的RNP/HP-1/肌动蛋白人工UCOE片段的核苷酸序列。

图8描述了含有RNP/HP-1/肌动蛋白人工UCOE的表达载体的质粒图谱。

图8a表示CET600，其包括CMV启动子的RNP/HP-1/肌动蛋白人工UCOE上游以及适宜插入待表达可读框的多克隆位点。在此特定的实施方案中，质粒骨架来自pEGFPN-1，并携带卡那霉素/新霉素抗性基因。

图8b表示CET601，其包括反向的RNP/HP-1/肌动蛋白人工UCOE。

图9表示在G418选择下维持127天，稳定转染CHO细胞库中报告转基因(EGFP)的表达水平。表达由CMV启动子(CMV)单独，或与8kb RNP UCOE以正向(CET220)或反向(CET221)组合驱动，或通过RNP/HP-1/肌动蛋白人工UCOE以正向(CET610)或反向(CET611)驱动，并通过FACS分析以中值荧光测量。可以理解为CET610相当于CET600，但是包含EGFP作为插入基因，以及CET611是含有相应EGFP的CET601的等同物。

图10表示上述127天的实验中，经FACS分析，以阳细胞％表示的表达转基因细胞的比例。

图11a-11d描述了用于免疫球蛋白表达的双向UCOE载体的质粒图谱。实施例1

UCOE片段的异源组合

我们已经发现4.0CMV和8.0CMV构建体中的A2/HP1片段用TBP/B1基因座的可比较区域置换，给hCMV启动子在EGFP表达的水平和稳定性方面带来了实质性提高。这些在组织培养细胞方面的发现，为包含延伸CpG岛和背驰转录启动子的DNA区域负责提高整合事件生存的比例、显著提高转基因表达以及抵抗甚至来自着丝点异源染色质内的转录沉默提供了证据。

包含持家基因的CpG岛与单一启动子相关的基因组区域被组合。此构建体包含人β-肌动蛋白基因³⁷5’末端2kb的CpG岛，其连接到含有人PDCD2基因5’末端的CpG岛的3.2kb片段上。启动子是背驰转录的，并且它们的转录起始位点分开1.9kb。

然后把完整的5.2kb组合物连接到EGFP报告基因上。其由CMV启动子(PDCD2/ACTIN)驱动。与此对照，仅仅β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域也插入到CMV-EGFP表达载体(ACTIN)的上游。

材料和方法

参考图2，通过AseI和NheI消化，将CMV启动子从pEGFP-N1中移出，接着用T4 DNA聚合酶钝化并再连接产生pA-EGFP-N1。通过用BsmI和NcoI消化MA39(HSACCYBB)、分离适当片段并用T4DNA聚合酶钝化，以构建β-肌动蛋白启动子EGFP的融合。这一片段连接到已用AgeI消化、用T4 DNA聚合酶钝化、然后用SmaI消化的pΔ-EGFP-N1上。这样产生了β-肌动蛋白基因的第一密码子与EGFP的框内融合，其表达受到β-肌动蛋白启动子/MFI(无甲基化岛)的驱动。该构建体p Actin-EGFP表现出在稳定转染CHOK1细胞中表达EGFP。

为了构建具有双向启动子和延伸的无甲基化岛的载体，PDCD2基因及其某个启动子要首先通过SwaI和BspEI消化从pCP2-TNN(大约160kbp pCYPAC-2中的TBP基因座)上移出，并亚克隆到已用EcoRV和XmaI消化的BluescriptKS+(pPDCD2-KS)中。由于此载体不包括整个PDCD2无甲基化岛，同样含有启动子的PDCD2无甲基化岛的残余5’区域可利用如下引物从pCP2-TNN中经PCR获得：5’GCGGTACCAAGGGCATTCTGAAGTTAACC-3’，5-AGCTCCACAGGCCTGG-3’。然后PCR产物用KpnI(用PCR引物产生的位点)和StuI(内位点)消化，pActin-EGFP用SalI和KpnI消化，以及通过用SalI和StuI消化从pPDCD2-KS上移出PDCD2基因。所有三个片段连接在一起形成pPDCD2-Actin-EGFP。

含有pF-PDCD2-Actin-EGFP的无甲基化岛的区域作为NcoI片段(约5.2kb)被移出，用T4 DNA聚合酶钝化，然后以双向连接到已用AseI消化并钝化过的pEGFPN-1中。这些载体称为CET510(UCOE正向)和CET511(UCOE反向)。相应的空表达载体没有转基因插入到多克隆位点，分别称为CET500和CET501(参见图3)。

构建体用PvuI线性化，转染到CHO-K1细胞中，并在G418筛选物(0.6mg/ml)中筛选用于两次实验。

要理解的是本领域专业技术人员可改编这些程序以制备和测试本发明的其他多核苷酸。

结果

如图4和图5所示，人工UCOE构建体给出报告基因表达水平，根据中值荧光，其与那些用8kb RNP/HP-1UCOE获得的构建体是可比的，并根据实验时间过程中表达的细胞比例，前者略好于后者。实施例2

UCOE与无甲基化CpG岛片段的异源组合

材料和方法

用NcoI消化后用KpnI钝化，从pActin-EGFP上移出肌动蛋白无甲基化岛。用KpnI和HindIII消化，从CET20上移出RNP 4kb片段。然后将这两个片段连接到已用ClaI消化、钝化并用HindIII切割过的pBKS上。这产生pBKS中的人工UCOE。

用SalI和HindIII消化，从pBKS上移出人工UCOE，钝化并连接到已用AseI消化并钝化过的pEGFP-N1上。将UCOE双向插入以分别创建CET610和CET611。没有转基因插入到多克隆位点的相应表达载体分别称为CET600和CET601(参见图8)。

把构建体线性化，转染到CHO-K1细胞中，并在实验持续时间内G418筛选物(0.6mg/ml)中筛选。

结果

人工UCOE(双向)对于转基因表达水平的影响通过与单独用CMV启动子，以及8kb RNP/HP-1UCOE(双向)获得的结果比较作出评价。图9表明，在FACS分析中根据中值荧光，CMV启动子单独体现低表达水平。RNP UCOE(CET220)和UCOE(CET600)在正向均大大提高了表达(30-倍)，并且是可比的。然而，RNP UCOE表现出的方向偏爱与用人工UCOE比较不显著，即反向时人工UCOE较好，尽管仍略逊色与正向UCOE。这对整体表达水平和维持长时间表达的能力是正确的。

根据细胞维持表达时间的比例对相同实验进行分析时，两种UCOE在两个方向上均一致取得比单独使用CMV较好的结果(约2倍于实验早期中表达的细胞)。时间延长，差异更显著。单独使用CMV的群体渐进式丧失表达细胞，直到120天时，仅约10％细胞仍在表达。与之对照，正向两种UCOE维持在约90％，以及实验结束时反向上水平略低(75-85％)。实施例3

同样载体上两种基因的共表达

有效功能性抗体生产需要重链和轻链的适当平衡表达。在不同质粒上两条链的转染使得很难维持相等的拷贝数，并且如果基因组中载体整合彼此相互靠近，会带来基因间潜在的转录干扰。

已经构建了一系列同样载体上两个基因共表达的新载体，用来比较neo对puro作为抗性标记，和hCMV、β-肌动蛋白或mCMV启动子，以驱动轻链和重链表达(图11)。

材料和方法

通过引入含有退火寡Mfe.F，5’-AACAATTGGCGGC和Mfe.R，5’-GCCAATTGTTGCC的连接物分子，pORT1(Cobra)的两个Sfi位点变为MfeI位点。

用引物TK.F，5’ACGCGTCGACGGAAGGAGACAATACCGGAAG，和TK.R，5’-CCGCTCGAGTTGGGGTGGGGAAAAGGAA，从pVg RXR(invitrogen)中扩增HSV TK聚腺苷酸化位点。把SalI到XhoI片段插入到SalI位点上。用引物mPGK.F，5’-CGGGATCCGCCTGAGAAAGGAAGTGAGCTG和mPGK.R，5’-GAAGATCTGGAGGAATGAGCTGGCCCTTA从雄性BALB/c基因组DNA(Clontech)扩增鼠PGK聚腺苷酸化位点，并将BamHI到BglII片段克隆到BamHI位点中。

含有neo表达盒的pcDNA3.1的AseI到SalI片段用T4 DNA聚合酶处理，连接到SpeI接头(5’-GACTAGTC)上。然后将SpeI片段克隆到SpeI位点上以生成pORTneoF或把携带嘌呤霉素抗性盒的CET700(Cobra)的EcoRI到NotI片段用T4 DNA聚合酶处理，连接到XbaI接头上，并将XbaI片段克隆到XbaI位点上以生成pORTpuroF。

将来自pCMVEGFPN-1(Cobra)的HindIII到BamHI鼠CMV启动子片段亚克隆到BKS+(Cobra)中的杂交UCOE的HindIII到BamHI位点上。然后利用引物hCMVF，5’-CTCGAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT和hCMVR，5’-GTCGACGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCT，从质粒pIRESneo(Clontech)上扩增CMV启动子，并将XhoI到SalI片段克隆到SalI位点上。然后把BamHI到SalI片段克隆到pORTneoF的BamHI到SalI位点上以生成pBDUneoF100，或克隆到pORTuroF中以生成pBDUpuro300。

BKS+内杂交UCOE中的SalI克隆位点上游两个ATG密码子通过定点诱变而改变，将BamHI到SalI片段克隆到pORTneoF的BamHI到SalI位点上以生成pBDUneo200，或克隆到pORTpuroF以生成pBDUpuro400。

将人抗体轻链编码序列克隆到所有四种双向UCOE载体(pBDUneo100、pBDUneo200、pBDUpuro300和pBDUpuro400)的BamHI或SalI位点上，接着使免疫球蛋白重链编码序列克隆到残余BamHI或SalI克隆位点上以生成pBDUneo112、pBDUneo121、pBDUneo212、pBDUneo221、pBDUpuro112、pBDUpuro121、pBDUpuro212和pBDUpuro221。按照厂商说明，利用脂转染试剂，把所有8种抗体表达构建体转染到CHO-K1细胞中，并用500μg/ml G418(neo载体)或12.5μg/ml嘌呤霉素(puro载体)筛选。

筛库后比较不同构建体间的抗体产生速率，以确定CHO细胞中抗体表达的最佳启动子和可选择标记。

结果

表1证明，含有从鼠CMV启动子中表达的轻链的载体表达抗体效果最好。在用含有G418或嘌呤霉素抗性盒的载体所获得的生产速率之间未观察到明显差异。对单独进行共转染实验的库的生产速率进行比较。本库分离出的克隆产生速率为3-18pg/细胞/天。然而，5pg/细胞/天以上的克隆不稳定，在表达中迅速降低或停止产生。表达量约5pg/细胞/天的克隆用于初始发酵实验。在从双向UCOE载体转染体中分离的克隆中可观察到更高的产生速率，这些初步指征很鼓舞人心。

表1：来自双向UCOE载体的hAb1(IgG4)(CHO-K1库)的表达。

CHO-K1库

载体              H3启动子            K1启动子        产生速率

(pg/细胞/天)

pBDUneo 112       鼠CMV               人CMV           0.3

pBDUneo 121       人CMV               鼠CMV           1.5

pBDUneo 212       鼠CMV               人β-肌动蛋白   0.06

pBDUneo 221       人β-肌动蛋白       鼠CMV           1.3

pBDUpuro 312      鼠CMV               人CMV           0.5

pBDUpuro 321      人CMV               鼠CMV           1.4

pBDUpuro 412      鼠CMV               人β-肌动蛋白   0.05

pBDUpuro 421      人β-肌动蛋白       鼠CMV           2.3

共转染^**         人CMV               人CMV           0.7

^**用同样抗体基因先进行共转染，各抗体基因由4kb UCOE CMV载体驱动(hydro或neo选择)

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Claims (7)

1.一种含有核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列为基因组区域的组合并由SEQ ID NO：2所示的序列组成，所述基因组区域含有来自至少两种持家基因的延伸的无甲基化CpG岛。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列进一步含有选自CMV，EF-1α，RSV LTR或HIV2 LTR的启动子或其组合。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中CMV启动子为小鼠CMV启动子。

4.一种包含两个或更多个多肽链的多肽的体外生产方法，其包括：

(1)提供用根据权利要求1-3任一项所述的多核苷酸转化/转染的细胞；

(2)在利于生产所述多肽条件下使所述细胞生长；以及

(3)从所述细胞或其生长环境中纯化所述多肽。

5.一种载体，其包括权利要求1-3任一项所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其转染有权利要求5所述的载体。

7.如权利要求1-3任一项所述的多核苷酸、如权利要求5所述的载体或如权利要求6所述的宿主细胞在制备用于通过基因治疗来预防和/或治疗疾病的药物中的应用。

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