JP2003504033A - Ｄｎａ構築物 - Google Patents

Ｄｎａ構築物

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リンディ、トムセン
イアン、リチャード、キャッチポール
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Abstract

(57)【要約】 本発明はｅＩＦ４Ａ１遺伝子プロモーター由来のポリヌクレオチドを含む転写調節配列を含んでなる新規なＤＮＡ構築物を提供する。好ましい具体例では、このポリヌクレオチドはｅＩＦ４Ａ１遺伝子イントロン、特にイントロン１由来のポリヌクレオチドをさらに含んでなる。該構築物を担持する宿主細胞も提供される。これらの新規な構築物は遺伝子治療、ＤＮＡワクチンおよびタンパク質の商業生産に応用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規なＤＮＡ構築物、該構築物を含んでなる宿主細胞、所望のタン
パク質、特に該構築物を含んでなる治療上有用なタンパク質、ＤＮＡワクチンそ
の他の医薬の製造方法ならびにプロセス、および該構築物を用いる遺伝子治療の
方法に関する。
【０００２】 真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ−４Ａ）は、ｍＲＮＡとリボソームの４０Ｓサ
ブユニットとの結合を媒介するＲＮＡヘリカーゼ活性を有する４３ｋＤのタンパ
ク質である。マウスゲノムでは、２つの機能的ｅＩＦ４Ａ遺伝子、ｅＩＦ４ＡＩ
およびｅＩＦ４ＡIIが存在する（１，２）。この２つのｅＩＦ４Ａ遺伝子はマウ
スにおいて違った調節がなされており、分裂細胞ではｅＩＦ４ＡＩ ｍＲＮＡが
ｅＩＦ４ＡII ｍＲＮＡよりも高いレベルで発現し、非分裂細胞ではｅＩＦ４Ａ
II ｍＲＮＡが優先的に発現する（３）。ヒトゲノムでは、相同のｅＩＦ−４Ａ
ＩおよびｅＩＦ−４ＡII遺伝子はそれぞれ染色体１７ｐ１３および１８ｐ１１２
にマッピングされている（４，５）。
【０００３】 ｅＩＦ−４ＡＩをコードする遺伝子は多くの他の「ハウスキーピング遺伝子」
と同じように、あらゆる哺乳動物の細胞種においてほぼ同様のレベルで発現され
るはずである。多くのハウスキーピング遺伝子プロモーターには転写開始を指示
するＴＡＴＡボックス配列は含まれていないが、転写因子Ｓｐ１および開始エレ
メントの結合部位を含むＧＣ豊富なプロモーターが存在している（６）。多くの
ハウスキーピング遺伝子プロモーターには期待頻度より高いジヌクレオチドＣｐ
Ｇが含まれており、これらの領域はゲノムの他の場所の他のＣｐＧジヌクレオチ
ドほど広範囲にメチル化されない（７）。かかるメチル化フリーアイランド（Ｍ
ＦＩ）は多くの場合、遺伝子の転写調節領域に会合しており、隣接するクロマチ
ン領域をオープン配置に維持することにより作用すると考えられる（８）。
【０００４】 嚢胞性繊維症のようなヒト単一遺伝子性疾患において欠損している遺伝子をク
ローニングすることにより、正常な機能へと回復させるための非変異型の嚢胞性
繊維症トランスメンブラン調節（ＣＦＴＲ）遺伝子の好適な細胞種を患者へ導入
できる可能性が高まってきた。かかる体細胞遺伝子治療プロトコールが有効とな
るためには、目的の治療的遺伝子が変異した遺伝子のものと同様またはそれより
高いレベルで安定して発現されなければならない。今日まで用いられていたほと
んど総ての体細胞遺伝子治療ベクターはＳＶ４０エンハンサー、レトロウイルス
の長い末端反復配列またはヒトサイトメガロウイルスの前初期遺伝子のプロモー
ター／エンハンサーエレメントのようなウイルス由来の転写調節領域に頼ってい
た。組換えレトロウイルスは分裂一次細胞に効率よく作用しうるが、組み込まれ
たプロウイルスゲノムの遺伝子発現は不安定である場合が多い（９）。エピソー
ムウイルスベクターを用いる長期遺伝子発現についても同様の問題があった（１
０）。
【０００５】 ごく最近、実験動物モデルにおいてウイルスプロモーターの制御下にある抗原
遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのin vivo送達を用いて、体液性および細胞性免
疫応答が誘導された（１１）。有効な免疫応答を引き出すには、ＤＮＡワクチン
投与用の典型哺乳動物発現ベクターにどのような特性が必要かはまだ明らかでは
ない。現在用いられている多くのウイルスプロモーターは専門の抗原提示細胞に
おいて高レベルの遺伝子発現は指示されない。そのため、ＣＭＶによってわずか
な発現しか起こらないマクロファージおよび他の細胞系、例えば前立腺癌細胞に
おいて発現を駆動しうるプロモーターが遺伝子ワクチン投与および遺伝子治療の
双方に望まれる。
【０００６】 ウイルスプロモーターはすぐにサイレントとなるため、治療または予防遺伝子
がせいぜい一時的発現で終わってしまうことも分かってきた。そこで、あらゆる
種類の遺伝子治療には万能プロモーターとして用いることができる偏在活性プロ
モーターが必要である。
【０００７】 従って本発明の目的は、現在用いられているウイルスプロモーターの代替物を
提供することである。
【０００８】 本発明は、目的の異種遺伝子と機能しうる形で連結された転写調節配列を含ん
でなり、その転写調節配列がｅＩＦ４Ａ遺伝子プロモーター、その断片またはそ
れとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである転写調節ポリヌクレオチドを
含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。
【０００９】 本発明の好ましい態様によれば、構築物は少なくとも１つのＥｌｆ４ａ遺伝子
イントロン、その断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含
んでなる。
【００１０】 本発明のさらに好ましい態様によれば、ｅＩＦ４ａ遺伝子イントロンはイント
ロン１、２、３、５、６、７または９である。
【００１１】 さらなる態様によれば、上記のＤＮＡ構築物を含んでなる宿主細胞を提供する
。
【００１２】 さらなる態様によれば、上記の細胞を培養する工程を含んでなる目的のタンパ
ク質の生産方法を提供する。
【００１３】 もう１つの態様によれば、上記の構築物を含んでなるＤＮＡワクチンを提供す
る。また、疾病または疾患の治療、要すれば予防も含めた方法であって、上記の
ワクチンを投与する工程を含んでなる方法も提供する。さらに、上記の構築物を
投与する工程を含んでなる遺伝子治療の方法も提供する。
【００１４】 本発明は、目的の遺伝子を、ヒトＣＭＶプロモーターのようなウイルスプロモ
ーターによって得られる発現よりも長期にわたって発現しうるＤＮＡ構築物を提
供する。かかる発現特性は遺伝子治療、ワクチン投与治療およびタンパク質の商
業生産の場合のように長期発現が求められる場合に特に有利である。
【００１５】 目的の異種遺伝子はｅＩＦ４ａをコードしない遺伝子である。典型的には目的
の異種遺伝子は目的のタンパク質をコードする。
【００１６】 好ましい具体例において、本発明の構築物は非染色体、例えばファージ、プラ
スミド、ウイルス、ミニクロモソームまたはトランスポゾンである。これらのう
ちプラスミドが特に好ましい。
【００１７】 配列番号３８はヒトｅＩＦ４Ａ１プロモーターの−５２６番からの配列を示し
ている。
【００１８】 「誘導可能な」とは、それが単にその材料の物理的起源であるという意味にお
ける起源を意味するばかりでなく、それらの材料に一致するが、対照起源からは
生じない構造上および／または機能上の特徴を有する材料を定義する起源を意味
するものとする。ポリヌクレオチドは哺乳動物起源、特にネズミ、クマネズミま
たはヒト、好ましくはヒト由来であることが好ましい。
【００１９】 本発明の構築物に組み込む際にプロモーターの生物学的特徴を保持する限り、
全長プロモーター配列の代わりに、またはそれに加えてｅＩＦ４ＡＩプロモータ
ーの断片を用いてもよい。実際に、本発明者はかかる断片が全長ｅＩＦ４ＡＩプ
ロモーター配列から得られることを示した。従ってかかる断片としては、−５２
６ＥＩＦ、−３７１ＥＩＦ、−２７１ＥＩＦ、−１９３ＥＩＦ、−１２０ＥＩＦ
、−９８ＥＩＦ、−６９ＥＩＦおよび−４０ＥＩＦが挙げられる。
【００２０】 また、野生型ｅＩＦ４ＡＩプロモーター配列の変異体も本発明に含められる。
かかる変異体は１以上の塩基の置換、欠失または挿入を有する、天然に存在する
変異体であってもよい。また、変異体として、１以上の塩基を付加、置換、挿入
、欠失、再配列または修飾してもなおプロモーターの特徴を保持している非天然
変異体も含められる。さらに、ｅＩＦ４ＡＩプロモーターまたはその断片と少な
くとも９０％同一、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％さらには９９％までも同一である変異体も本発明の範囲内に含め
られる。
【００２１】 ｅＩＦ４Ａ遺伝子プロモーター、またはそれに対する相補ヌクレオチドとハイ
ブリダイズするポリヌクレオチド分子もプロモーターの転写調節機能を保持して
さえいれば、それらもまた本発明の一部となる。同様に、少なくとも１つのｅＩ
Ｆ４Ａ遺伝子イントロン、またはそれに対する相補ヌクレオチドとハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド分子も転写調節機能を保持してさえいれば、それらもま
た本発明の一部となる。ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下であることが好ましい。ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件の一例としては、約０．９モルの塩溶液を用いて約３５℃〜約６
５℃の温度で行うハイブリダイゼーションがある。しかしながら、当業者ならば
要すれば、プローブ長、塩基組成、存在するイオンのタイプなどのような変数を
考慮に入れてかかる条件を変更することができよう。
【００２２】 好ましい形では、転写調節配列は少なくとも１つのｅＩＦ４Ａイントロン、そ
の断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含んでなる。特に
イントロンがイントロン１、２、３、５、６、７または９から誘導可能であるこ
とが好ましい。イントロンの断片はイントロンの転写調節機能を保持しており、
典型的には少なくとも１５、２０、５０または１００ヌクレオチド長である。こ
れらのうち、ポリヌクレオチドがｅＩＦ４ＡＩ遺伝子のイントロン１由来である
ことが特に好ましい。イントロンポリヌクレオチドは哺乳動物起源、特にネズミ
、クマネズミまたはヒト、好ましくはヒト由来であることが好ましい。
【００２３】 また、１以上の塩基を付加、置換、挿入、欠失、再配列または修飾してもなお
エンハンサーの特徴を保持しているイントロン配列の変異体も本発明の範囲内に
含められる。さらに、少なくとも９０％同一、例えば９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％さらには９９％同一である転写調節配
列の変異体も提供される。
【００２４】 本発明者はｅＩＦ４ＡＩ遺伝子から誘導可能な１を超えるイントロンを用いる
際の利点を示した。従って構築物はｅＩＦ４Ａプロモーターまたはその断片およ
び複数のｅＩＦ４ＡＩ遺伝子イントロンから誘導可能なポリヌクレオチドを含ん
でなる転写調節配列を含んでいてもよい。付加的イントロン配列は上記のイント
ロンと同一であっても異なってもよい。ポリヌクレオチドはフォワードまたはリ
バース向きにタンデム配置されたｅＩＦ４ＡＩプロモーター配列またはその断片
およびｅＩＦ４ＡＩイントロン配列またはその断片を含んでなることが好ましい
。イントロン配列およびプロモーター配列はともに末端にあってもよいし、また
は間隔を置いて離れていてもよい。イントロン配列はｅＩＦ４Ａプロモーター配
列の上流、またはさらに好ましくは下流（リーディングフレームに対して）であ
ってもよい。キメラ構築物、例えばそのポリヌクレオチドが第１の種由来のｅＩ
Ｆ４Ａプロモーターまたはその断片および第２の種由来のイントロン配列を含ん
でなるものもまた考えられる。プロモーター配列は組換え手段によって得られる
ことが好ましく、かかる手法は当業者には一般的であり、かつ十分に公知である
。
【００２５】 本発明の構築物は、要すればターミネーター配列および選択マーカー、細菌の
複製起点、抗生物質耐性遺伝子ならびに分泌のためのシグナルペプチド遺伝子な
どのその他のエレメントをさらに含んでもよい。本発明の構築物は、遺伝子発現
用の宿主細胞に組み込むのが好ましいが、細胞を含まない翻訳系を排除するもの
ではない。構築物の組み込みは当業者には十分に公知な方法、例えばＰ１形質導
入により達成される。好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物、好ましくは
真核生物、いっそう好ましくは哺乳動物である。宿主細胞は完全に分化した幹細
胞、多分化能性幹細胞または他の前駆細胞であってもよい。本発明はマクロファ
ージおよび樹状突起細胞のような専門の抗原提示細胞ならびにウイルスプロモー
ターによる高レベルの永続的遺伝子発現に応じないことが示されている他の細胞
、例えば、前立腺および結腸直腸癌細胞において目的の遺伝子の高レベルの永続
的発現を指示するのに特に有利である。
【００２６】 本発明の構築物で形質転換した宿主細胞をタンパク質の商業生産に用いてもよ
い。一般的には、細胞を好適な容器に入った培地内で培養することを必要とする
発酵法を使用する。好適な条件で培養した後、当業者に十分公知な常法により宿
主細胞により分泌されたタンパク質を培地から回収する。タンパク質は回収して
均質にすることが好ましい。さらに、形質転換した本発明の宿主細胞を、細胞欠
損を置換するまたは補うための治療戦略で使用してもよい。本発明から利益を受
ける他の細胞欠損疾病または疾患については当業者ならば容易に理解できるが、
例えばパーキンソン病の治療のために移植（自己または同種もしくはあまり好ま
しくはないが異種個体間）用の哺乳動物宿主細胞を本発明の遺伝子構築物でex v
ivoにおいて形質転換してもよく、ここでは目的の遺伝子はドーパミンをコード
している。本発明の宿主細胞を用いて臨床上重大なる細胞欠損、特にニューロン
細胞の欠損を特徴とする疾病を治療してもよい。本発明の転写調節配列を組み込
んだウイルス、特にレトロウイルスおよびアデノウイルスもまた考えられる。目
的の遺伝子が酵素または自殺遺伝子を変換するプロドラッグをコードする具体例
もまた提供する。
【００２７】 特に注目すべきはＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療における本発明の構築物の
使用である。本発明から利益を受けるＤＮＡワクチンの例としては、腫瘍ワクチ
ン、ＢおよびＣ型肝炎、ＨＩＶ、結核、ＨＰＶおよびＨＳＶワクチンならびにＭ
Ｓ、喘息、ＲＡおよびアルツハイマー病のような慢性炎症性反応を改変すること
に向けられた、または避妊または薬物中毒のためのワクチンのような他の生物学
的経路に向けられたワクチンが挙げられる。
【００２８】 本発明者らはさらに、本発明の転写調節配列を用いてＤＮＡワクチンにより引
き起こされる免疫応答に傾向を与え得ることを見出した。典型的には免疫応答を
Ｔｈ２よりのＴｈ１に対するように傾向を与える。よって、本発明は患者に作用
量の本発明の構築物またはワクチンを投与し、免疫応答傾向を得ることを含んで
なる治療方法を提供する。本発明はＴｈ１に対する免疫応答傾向を得るための、
本明細書に記載の構築物の使用をさらに提供する。
【００２９】 構築物は例えばリポソームのような担体とともに投与してもよい。典型的には
、かかるリポソームには陽イオン、例えばイミダゾリウム誘導体（ＷＯ９５／１
４３８０）、グアニジン誘導体（ＷＯ９５／１４３８１）、ホスファチジルコリ
ン誘導体（ＷＯ９５／３５３０１）、ピペラジン誘導体（ＷＯ９５／１４６５１
）およびビグアニド誘導体がある。構築物はプロモーター配列と機能しうる形で
連結されたＣＴＦＲまたはエリトロポエチン遺伝子のような目的の遺伝子を含ん
でなってもよい。このように、遺伝子異常が原因となる疾病または疾患（嚢胞性
繊維症など）を矯正するまたは補う方法であって、それを臨床上必要とする哺乳
動物患者に治療上有効量の、好ましくは担体に組み込まれた構築物を投与する工
程を含んでなる方法を提供する。特に有利な使用では、本発明の構築物がアベロ
ラーマクロファージにおいて高レベルの永続的遺伝子発現を駆動するのに用いら
れる。
【００３０】 本発明のプロモーター配列は目的の遺伝子と機能しうる形で連結される。目的
の遺伝子としては、治療または非治療タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ
る。治療タンパク質には、現在の手法のコストの高さがその大規模商業生産の障
害となっているものがある。
【００３１】 目的の異種遺伝子は宿主細胞では通常発現しないタンパク質をコードしうる。
例としては、インスリン、ｓＴＮＦｒ、インターフェロン−β、因子VIII、エリ
トロポエチン、増殖因子およびサイトカインのようなタンパク質をコードする遺
伝子またはその治療上有効な断片は総て目的の遺伝子の例である。例えば、本発
明の構築物を遺伝子治療に用い、脈管形成の誘導のためのＶＥＧＦのようなヒト
遺伝子の過剰発現を達成してもよい。
【００３２】 また、本発明の構築物、本発明の宿主細胞または本発明により得られる治療的
タンパク質を含んでなる医薬、特に医薬組成物も提供される。ｅＩＦ４Ａプロモ
ーターはあらゆる細胞種において活性、すなわち、それは偏在活性プロモーター
であり、あらゆる細胞種において持続した高レベルの発現を提供する。
【００３３】 本発明のさらなる態様によれば、単離形態のイントロン１（配列番号３１）、
２（配列番号３２）、３（配列番号３３）、５（配列番号３４）、６（配列番号
３５）、７（配列番号３６）または９（配列番号３７）が提供される。「単離」
とは本明細書に記載の核酸がそれが天然に存在している環境とは異なる物理環境
で存在することを意味する。例えば、核酸を自然状態においてそれと会合してい
る１以上の物質について単離されうる。このように本発明によれば、配列番号３
１、３２、３３、３４、３５、３６または３７で示される配列もしくはその変異
体、その断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含んでなる
、または実質的にそれらからなる単離ポリヌクレオチドが提供される。さらに、
転写調節配列を含んでなり、その調節配列が本明細書に記載の単離ポリヌクレオ
チドを含んでなる、組換えＤＮＡ構築物も提供される。ここで同定された単離ポ
リヌクレオチドを本発明の組換えＤＮＡ構築物に見出された転写調節配列のエン
ハンサーエレメントとして用いてもよい。その他の態様では、目的の異種遺伝子
と機能しうる形で連結された転写調節配列を含んでなり、その調節配列が配列番
号３８で示される配列またはその変異体を有する、好ましくは配列番号３１、３
２、３３、３４、３５、３６、３７のいずれか１つで示される配列またはその変
異体をさらに含んでなる、ポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれらから実質
的になる組換えＤＮＡ構築物が提供される。
【００３４】 またその他の態様では、配列番号４０の位置−２１０２〜−１０８２番で示さ
れる配列またはその変異体を有する単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００３５】 さらに、配列番号４０の位置−１１０７および−５０５番で示される配列また
はその変異体を有する単離ポリヌクレオチドも提供される。
【００３６】 裸のポリヌクレオチドまたはベクターを患者に導入する好適な手法としては、
好適なビヒクルを用いる局所適用法がある。裸のポリヌクレオチドまたはベクタ
ーはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような医薬上許容される賦形剤とともに
提供する。１つの手法として粒子衝撃（「遺伝子銃」技術または粒子を介するＤ
ＮＡ送達としても知られ、米国特許第５３７１０１５号に記載される）が挙げら
れる。本明細書における不活性粒子（金ビーズなど）を核酸で被覆し、それらが
受容者の表面（例えば、皮膚）に浸透しうるに十分な速度に、例えば発射装置か
ら高圧発射により加速する。（本発明の核酸分子で被覆した粒子は本発明の範囲
内にあり、かかる粒子を充填した装置も同様である。）核酸を直接受容者に投与
する他の方法としては、超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよび米国
特許第５，６９７，９０１号に記載されたマイクロシーディングが挙げられる。
【００３７】 また、本発明の核酸配列は、遺伝子治療に有用な特殊な送達ベクターによって
投与してもよい。遺伝子治療アプローチは、例えばVerme et al, Nature 1997,
389: 239-242に記載されている。ウイルスおよび非ウイルス系の双方を使用する
ことができる。ウイルスに基づく系としては、レトロウイルス、レンチウイルス
、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウ
イルスに基づく系が挙げられる。非ウイルス系としては、核酸の直接投与および
リポソームに基づく系が挙げられる。
【００３８】 本発明の構築物は医薬組成物として投与してもよく、典型的には、例えば非経
口または他の経路、例えば、特に局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹膜内、筋肉
内、皮下、鼻腔内または皮内経路による投与をはじめとする効果的で便宜ないず
れかの方法で投与する。
【００３９】 一般に医薬組成物は特定の適応症の治療または予防に有効な量で投与する。通
常、組成物は少なくとも約１μｇ／体重ｋｇの量で投与する。多くの場合におい
て１日当たり約８ｍｇ／体重ｋｇ以下の量で投与する。好ましくは、多くの場合
において用量は１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。至適量
はそれぞれの治療的理学療法および適応に対して、適応症、その重篤度、投与経
路、合併症状などを考慮して、常法により決めるうることが分かるであろう。Ｄ
ＮＡワクチンについては、典型的には用量は投与当たり１〜１０μｇ、例えば１
〜１０μｇの初回抗原刺激の後に少なくとも１回の１〜１０μｇの追加抗原投与
、であり、１、２、３または４週間の間隔で投与する。
【００４０】 治療においてまたは予防措置として、構築物を注射可能な組成物として、例え
ば好ましくは等張の滅菌水性分散液として個体に投与してもよい。
【００４１】 また、組成物を局所適用用として、例えば軟膏、クリーム剤、ローション剤、
眼軟膏剤、点眼剤、点耳剤、口中洗浄剤、含浸包帯剤および縫合糸ならびにエア
ゾル剤の形に処方してもよく、例えば防腐剤、薬剤の浸透を助ける溶剤、軟膏お
よびクリーム剤への皮膚軟化剤をはじめとする適当な通常の添加剤を含めてもよ
い。また、かかる局所製剤に相溶性の通常の担体、例えばクリーム剤または軟膏
基剤、およびローション剤へのエタノールまたはオレイルアルコールを含めても
よい。かかる担体は製剤の約１重量％〜約９８重量％を占めてよいが、通常は、
製剤の約８０重量％までである。
【００４２】 哺乳動物、特にヒトへの投与では、有効薬剤の１日用量レベルは１μｇ／ｋｇ
〜１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであると考えられる。医師
であれば個々に最も好適な実際の用量を決め、特定の個体の年齢、体重および応
答によって変更することができる。上記用量は平均的な場合の例である。もちろ
ん、より高いまたはより低い用量の範囲が適当な個々の例もありうるが、かかる
場合も本発明の範囲内である。
【００４３】配列の簡単な説明 配列番号３９：ヒトｅＩＦ４Ａ１遺伝子のプロモーターおよびエキソン１のＤ
ＮＡ配列。ＤＮＡ配列に番号を付け、推定転写部位を＋１で示している。可能性
ある転写因子結合部位は下線で示されている。エキソン１によりコードされるア
ミノ酸が示される。ｅＩＦ４Ａ１遺伝子配列はコスミドクローンｃｏｓＣＤ６８
Ｃ１のＤＮＡ配列決定法(Jones, E., Quinn, C. M.、C. G., Montgomery, D. S.
, Ford, M. J., Kolble, K., Gordon, S., and Greaves, D. R. (1998), Genomi
cs 53: 248-250参照)により決定した。
【００４４】 配列番号４０：ヒトｅＩＦ４Ａ遺伝子の上流にある５．３１８ｋｂのＤＮＡ配
列。この配列は−５２８０番のコスミドｃｏｓＣＤ６８Ｃ１の５’ＮｏｔＩ部位
から開始している（なお、ヒトｅＩＦ４Ａ遺伝子の転写開始部位が＋１である（
配列番号３９））。また、配列番号３９で示されるプロモーターおよびエキソン
１配列を含み、エキソン１の最終塩基（＋３７）で終結している。ＡｌｕＩ反復
配列またはマウスｅＩＦ４Ａ遺伝子と相同な領域およびその周囲の配列は下線で
示されている（図１参照）。クローニングして転写活性についてアッセイしたＰ
ＣＲＡ（−２１０２〜−１０８２番）およびＰＣＲＢ（−１１０７〜−５０５番
）の領域をそれぞれ太字またはイタリック体で示している（図１および３参照）
。
【００４５】 以下、本発明を単に例示として示す。これらは、本発明の好ましい具体例を示
すものと理解すべきである。本発明の精神および範囲内の種々の改変および変形
については当業者には明らかであろう。
【００４６】実施例 ヒトｅＩＦ−４ＡＩ遺伝子のＤＮＡ配列 ヒトｅＩＦ４ＡＩ遺伝子を含む組換えコスミドｃｏｓＣＤ６８Ｃ１の制限酵素
断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫにサブクローニングした。Ｄｙｅターミネ
ーター配列決定キット(ABI Perkin Elmer)を用いてプラスミドおよびコスミド鋳
型の両鎖のＤＮＡ配列を決定した。
【００４７】リポーター遺伝子プラスミド ヒトｅＩＦ４Ａ１プロモーターの断片を、鋳型としてコスミドｃｏｓＣＤ６８
Ｃ１を用いてＰＣＲ増幅し、５’プロモーター欠失系統を得た。フォワードＰＣ
ＲプライマーにはＫｐｎＩ部位が含まれ、リバースＰＣＲプライマーにはＨｉｎ
ｄIII部位が含まれており、ＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、
ルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３ベーシック(Promega)の多重クロー
ニング部位にクローニングした。用いたフォワードプライマーは、 であった。
【００４８】 用いたリバースプライマーは であった。
【００４９】 マウスｅＩＦ−４ＡＩ ５’フランキング配列と相同性を示すヒトｅＩＦ４Ａ
Ｉ ５’フランキング領域の領域を以下のプライマー： を用いてＰＣＲ増幅した。
【００５０】 ネズミｅＩＦ−４ＡＩ ５’フランキング領域と非相同な領域を以下のプライ
マー： を用いてＰＣＲ増幅した。
【００５１】 ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化し、ｅＩＦ−４０ｌｕｃのＫｐｎＩ部位にクロー
ニングしてプラスミドＢｅＩＦ−４０ｌｕｃ、Ｂ’ｅＩＦ−４０ｌｕｃ、ＡｅＩ
Ｆ−４０ｌｕｃおよびＡ’ｅＩＦ−４０ｌｕｃを得た。 ｅＩＦ４Ａ１遺伝子のイントロンを以下のプライマー： を用いてＰＣＲ増幅した。
【００５２】 ＰＣＲ断片をＨｉｎｄIIIで消化し、ｅＩＦ４Ａ１遺伝子プロモーターの転写
開始部位の３’にあるプラスミドｅＩＦ−４０ｌｕｃの特異なＨｉｎｄIII部位
にクローニングした。制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定法を用いて適当な配
向にイントロンを含むプラスミドを同定した。イントロン１、２または３をＨｉ
ｎｄIIIで切り出し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理することで平滑末端と
し、−４０ｅＩＦｌｕｃのＫｐｎＩ部位にクローニングして、イントロンがｅＩ
Ｆ４Ａ１最小プロモーターの５’に配置されるプラスミドＩＶＳ１ｅＩＦ−４０
ｌｕｃ、ＩＶＳ２ｅＩＦ−４０ｌｕｃおよびＩＶＳ３ｅＩＦ−４０ｌｕｃを得た
。プラスミドｐＧＬ３コントロールはルシフェラーゼリポーター遺伝子の５’に
クローニングされた１９５ｂｐのＳＶ４０プロモーターおよびルシフェラーゼリ
ポーター遺伝子(Promega)の３’にクローニングされた２４４ｂｐのＳＶ４０エ
ンハンサーを含む。ｐｃＤＮＡ３(InVitrogen)のＮｒｕＩ／ＨｉｎｄIIIＣＭＶ
プロモーターをｐＧＬ３ベーシック(Promega)のＳｍａＩ／ＨｉｎｄIIIポリリン
カー部位にクローニングしてプラスミドｈＣＭＶｌｕｃを構築した。２００ｂｐ
単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼプロモーターをＰＣＲ増幅し、ｐＧＬ
３ベーシック(Promega)のＫｐｎＩ／ＢｇII部位にクローニングした。プラスミ
ドｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌ（１４）は哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３(InV
itrogen)にクローニングされた大腸菌(E.Coli)ｌａｃＺ遺伝子を含む。トランス
フェクション用のプラスミドＤＮＡを、１００μｇアンピシリン(Sigma)含有Ｌ
Ｂエキスで一晩増殖させた大腸菌の５００ｍｌ培養物から標準的なＮａＯＨ／Ｓ
ＤＳ溶解プロトコールおよびＣｓＣｌ臭化エチジウム勾配における遠心分離法を
用いて調製した（１２）。
【００５３】哺乳動物細胞培養物および一時的トランスフェクション ネズミマクロファージ細胞系統ＲＡＷ２６４．７およびＰ３８８．Ｄ１、ネズ
ミＢ細胞系統Ａ２０ならびにヒト赤白血病性細胞系統Ｋ５６２およびヒト前立腺
癌細胞系統ＬＮＣａＰは、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）(Sigma, St. Lo
uis, MO)、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
および２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地(Life Technologies)
で維持した。ＣＨＯ Ｋ１およびＳＫＯＶ−３細胞をHamのＦ−１２培地に維持
し、２９３細胞ＷｉＤｒおよびＣＯＳ−１細胞は、１０％ＦＣＳ、抗生物質およ
びグルタミンを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した
。総ての細胞を恒湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２／空気混合、３７℃で
増殖させた。
【００５４】 ＲＡＷ２６４．７、Ｐ３８８．Ｄ１、Ａ２０およびＫ５６２ ＬＮＣａＰなら
びにＣＯＳ−１細胞をエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。
要するに、細胞をＴ１７５フラスコで密集状態まで増殖させ、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）に採り、ＰＢＳで１回洗浄し、ＲＡＷ細胞用のＯｐｔｉｍｅｍ１
無血清培地(Life Technologies)またはＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＭを含まな
い）に再懸濁した。アリコート２×１０７細胞（０．５ｍｌ）を２０μｇルシフ
ェラーゼリポータープラスミドＤＮＡおよび２０μｇ ｐｃＤＮＡ３ β−ガラ
クトシダーゼプラスミドＤＮＡと混合し、０．４ｃｍ電極ギャップエレクトロポ
レーションキュベット(BioRad, Hercules, CA)に加え、室温にてBioRad遺伝子導
入装置（３００Ｖ、９６０μＦＤ）でパルスをかけた。細胞を直ちに１０ｍｌの
予熱した培地に回収し、９ｃｍ径組織培養ペトリ皿(Nunc)に入れた。
【００５５】 ＣＨＯおよび２９３細胞を９ｃｍペトリ皿で７０〜８０％密集状態まで増殖さ
せ、Ｏｐｔｉｍｅｍで２回洗浄した後に５ｍｌのプラスミドＤＮＡ：陽イオン脂
質複合体（Ｏｐｔｉｍｅｍ中、５μｇＤＮＡ：５０μｇリポフェクタミン(Life
Technologies)）を加えた。インキュベーション４〜６時間後に培地を吸引し、
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、完全培地で１６時間回復させた後に解析した。同様
にして、ＳＫＯＶ−３細胞およびＷｉＤｒ細胞を５μｇＤＮＡ、５０μｌリポフ
ェクチン(Life Technologies)を用いてトランスフェクトした。
【００５６】リポーター遺伝子アッセイ トランスフェクトした細胞を５００μｌリポーター溶解バッファー(Promega)
に採取し、１サイクルの凍結融解で溶解した。細胞溶解物を、比色定量基質クロ
ロフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド(CPRG, Boehringer Mannheim)
を用いて、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（
ｐＨ７．３）を入れる９６ウェルプレートアッセイにおいて、β−ガラクトシダ
ーゼ酵素活性についてアッセイした。精製した大腸菌β−ガラクトシダーゼ酵素
(Sigma)の希釈物を用い、３７℃で３０分のインキュベーション後、５７０ｎｍ
における分光光度測定により酵素活性を測定し、標準曲線を得た。ルシフェラー
ゼ酵素活性はルシフェラーゼアッセイキット(Promega)およびBerthold Instrume
nts ＬＢ９５０１照度計を用いて測定した。トランスフェクト細胞抽出物を用
いるルシフェラーゼ酵素アッセイはアッセイの直線範囲内であった。
【００５７】in vivoルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼリポータープラスミド（５０μｇ）をＣ５７ＢI／６マウスの
四頭筋に注射した。７２時間後に筋肉を取り出し、IKA Labortechnic Ultra tur
rax T8 polytronを用いて５００μｌリポーター溶解バッファー(Promega)で破壊
した。ルシフェラーゼ酵素活性はルシフェラーゼアッセイキット(Promega)およ
びDynatech Laboratories ＭＬ３０００照度計を用いて測定した。全タンパク
質含量を、標準曲線を対照するPierce クーマシープラスタンパク質アッセイ試
薬を用いる９６ウェル形式で、Molecular Devices Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ２
５０プレートリーダーを用いて測定した。
【００５８】ｅＩＦ４ＡＩ遺伝子構成 マクロファージＣＤ６８制限遺伝子が染色体１７ｐ１３の遍在発現される翻訳
開始因子をコードする遺伝子、ｅＩＦ−４ＡＩ遺伝子の３’に６６９ｂｐで存在
していることは本発明者らが従前に示した（１３、１４）。本発明者らは１１．
９ｋｂのＣＤ６８ ５’フランキング配列のＤＮＡ配列を決定し、ヒトｅＩＦ４
Ａ１遺伝子の大きさが６．２ｋｂであり、図１の模式図で示される１０のイント
ロンを含んでいることを示した。ｅＩＦ４Ａ１遺伝子イントロンの位置およびそ
れらの大きさを表１に記載する。
【００５９】
【表１】 表１：ｅＩＦ４Ａ１イントロンの大きさを塩基対で示している。エキソン／イン
トロン境界配列はエキソン配列を大文字で、イントロン配列を小文字で示してい
る。
【００６０】 ｅＩＦ４Ａ１遺伝子の第１のイントロンには多くのＣｐＧジヌクレオチドが含
まれており、メチル化フリーアイランドの多くの特徴を備えている。第１のイン
トロンＤＮＡ配列の解析により、哺乳動物転写因子の可能性ある多くの結合部位
の存在が示された。ｅＩＦ４Ａ１イントロン１にはＳｐ１の３つの共通結合部位
、２つのＣ／ＥＢＰβ部位、ｅｔｓ因子Ｅｌｋ−１およびｃｅｔｓ−１各々の２
つの結合部位および転写因子ＧＡＴＡ−１の８つの結合部位が含まれている。ｅ
ＩＦ４Ａ１遺伝子の第３の４４０ｂｐのイントロンにはＧＡＴＡ−１の４つの重
複共通結合部位およびＧＡＴＡ−２の３つの結合部位を含む３５ｂｐ領域が含ま
れている（配列番号３９）。
【００６１】ヒトｅＩＦ４Ａ１プロモーター配列のネズミｅＩＦ４Ａ１プロモーター配列との 比較 ヒトｅＩＦ４Ａ１遺伝子５’フランキング領域のＤＮＡ配列のネズミｅＩＦ−
４ＡＩ遺伝子配列の公開配列（１５）との比較により、マウスｅＩＦ−４ＡＩ遺
伝子近傍のプロモーターと〜８５％の配列相同性を示す３００ｂｐ領域であるこ
とがが分かった。この領域には、推定転写開始部位（１６）から−３２番に通常
のＴＡＴＡボックス配列、−６５、−１４１および−１９０番にＣＣＡＡＴボッ
クス配列および−５１、−７４、−１７７および−３４８番に転写因子Ｓｐ１の
共通結合部位が含まれている（配列番号３９）。ネズミｅＩＦ−４ＡＩプロモー
ター配列との相同関係は−４７５番で終わっているが、ネズミプロモーターとの
相同関係は−１１１０番まで続き、公開されたネズミｅＩＦ−４ＡＩ配列の末端
まで、さらに２５６ｂｐ延びている。ネズミプロモーターと相同でない６３８ｂ
ｐ領域（−１１０９〜−４７１番）には延長されたジヌクレオチド反復配列（Ａ
Ｔ）３８が含まれており、数種の真核生物ゲノム（１７）では交互のＡＴ反復配
列が散在反復性エレメントとして存在することが分かっている。ｅＩＦ４Ａ１
５’フランキング配列の解析により、ｅＩＦ４Ａ１転写開始部位から−４５８８
および−３７２２番にＡｌｕＩ散在反復配列の存在が示された（図１）。
【００６２】ｅＩＦ４ＡＩプロモーターがルシフェラーゼの発現を指示する ｅＩＦ４Ａ１遺伝子プロモーターの５’欠失系統をルシフェラーゼベクターｐ
ＧＬ３ベーシックに構築し、プラスミドＤＮＡを一時的トランスフェクションに
より、ある範囲の哺乳動物細胞系統に導入した。ｅＩＦ４Ａ１遺伝子の−５２６
〜＋１５番に延びるＤＮＡ断片により上皮細胞系統ＣＨＯおよび２９３、ならび
にネズミマクロファージ細胞系統ＲＡＷ２６４．７において高レベルのルシフェ
ラーゼリポーター遺伝子発現が指示される（図２Ａ〜Ｃ）。ＣＨＯ細胞ではプラ
スミド−５２６ｅＩＦｌｕｃにより最大レベルのルシフェラーゼ発現が得られ、
その発現レベルはＳＶ４０エンハンサー／プロモーターベクターｐＧＬ３コント
ロールで得られるものと同等である（図２Ａ）。２９３細胞では−３７１ｅＩＦ
ｌｕｃプラスミドにより最大レベルのルシフェラーゼ発現が得られ、そのルシフ
ェラーゼ発現レベルはＳＶ４０エンハンサー／プロモーターで得られるものの１
８倍である（図２Ｂ）。ＴＡＴＡボックスしか含まれてない−４０ｅＩＦｌｕｃ
プラスミドならびにＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ１およびＴＡＴＡボックスを含む
−６９ｅＩＦｌｕｃプラスミドでは、リポーター遺伝子ベクター単独（ｐＧＬ３
ベーシック）で見られるよりも若干高いリポーター遺伝子発現レベルしか得られ
ない。さらなる２９ｂｐのｅＩＦ４Ａ１プロモーター配列を含む−９８ｅＩＦｌ
ｕｃプラスミドはＡＰ−２部位を含んでおり、試験した３つ総ての細胞系統で高
レベルの遺伝子発現を指示する。−１２０ｅＩＦｌｕｃプラスミドは、２９３細
胞では同等レベルのリポーター遺伝子発現を指示するが、ＣＨＯおよびＲＡＷ２
６４．７細胞ではリポーター遺伝子発現レベルのかなりの低下が見られる。ｅＩ
Ｆ４Ａ１配列を−１２０の５’に付加することで高レベルのリポーター遺伝子発
現が回復する。
【００６３】 ＰＣＲプライマーを、ネズミｅＩＦ−４ＡＩプロモーターと相同性を示す−１
１１０番の５’でヒトｅＩＦ４Ａ１遺伝子配列を増幅するよう設計した。−２０
９８〜−１０８０番に延びているｅＩＦ４Ａ１遺伝子配列を含む１０１８ｂｐを
両配向でリポーター遺伝子ベクター−４０ｅＩＦｌｕｃのｅＩＦ４Ａ１最小プロ
モーターの５’にクローニングしてプラスミドＢｅＩＦ−４０ｌｕｃおよびＢ’
ｅＩＦ−４０ｌｕｃを得た。ネズミｅＩＦ−４ＡＩプロモーターと相同性のない
ヒトｅＩＦ４Ａ１プロモーターの５９７ｂｐ領域をリポーター遺伝子ベクター−
４０ｅＩＦｌｕｃにクローニングしてプラスミドＡｅＩＦ−４０ｌｕｃおよびＡ
’ｅＩＦ−４０ｌｕｃを得た。ＣＨＯ細胞ではプラスミドＢｅＩＦ−４０ｌｕｃ
およびＢ’ｅＩＦ−４０ｌｕｃにより、ｅＩＦ４Ａ最小プロモーターを用いて得
られるものの２倍高いルシフェラーゼ発現レベルしか得られない（図３Ａ）。２
９３細胞では同じプラスミドで発現が４〜６倍高まり（図３Ｂ）、ＲＡＷ細胞で
は発現が５倍高まる。これに対し、プラスミドＡｅＩＦ−４０ｌｕｃおよびＡ’
ｅＩＦ−４０ｌｕｃに存在するネズミｅＩＦ−４ＡＩプロモーターと相同でない
領域によっては、ＣＨＯ細胞では発現が２７倍まで高まり、２９３細胞では１３
倍、さらにＲＡＷ細胞では５倍高まる（図３）。
【００６４】ｅＩＦ４ＡＩ遺伝子イントロンの転写調節エレメントの解析 ｅＩＦ４Ａ１イントロン１にはメチル化フリーアイランドおよびＳｐ１、ｃ−
ｅｔｓ−１およびＥｌｋ−１のようないくつかの遍在転写因子の可能性ある結合
部位が含まれている。可能性ある転写因子結合部位はｅＩＦ４Ａ１遺伝子の他の
イントロンにも見られる。本発明者らは一連のルシフェラーゼリポータープラス
ミドを調製し、そのｅＩＦ４Ａ１遺伝子の最初の９つのイントロンをｅＩＦ４Ａ
１最小プロモーター断片の下流にクローニングし、一時的トランスフェクション
アッセイでそれらの活性を調べた。そのデータを表２にまとめ、ｅＩＦ４Ａ１最
小プロモーター単独（プラスミド−４０ｅＩＦｌｕｃ）の場合に対し、リポータ
ー遺伝子活性において何倍増殖したかを示した。
【００６５】
【表２】 表２：ｅＩＦ４Ａ１イントロンのｅＩＦ４Ａ１最小プロモーターの転写への効力
【００６６】 調べた９つのｅＩＦ４ＡＩイントロンは、イントロン４および８を除き、ｅＩ
Ｆ４Ａ１最小プロモーターの下流にクローニングすると発現が高まることが分か
った。調べた総ての細胞系統では、１３９７ｂｐのｅＩＦ４Ａ１遺伝子第１イン
トロンをｅＩＦ４Ａ１最小プロモーターの下流にクローニングする場合に発現の
最大の高まりが見られる。観察される高まりの大きさはＣＨＯ細胞の３０倍〜ネ
ズミマクロファージ細胞系統Ｐ３８８．Ｄ１の４８０倍と様々である。イントロ
ン２、３、７および９ではリポーター遺伝子発現を１５倍を越えて高めることが
できた。しかしながら、これらのイントロンの活性は異なる細胞系統間では大き
く変化する、例えば８３ｂｐのｅＩＦ４Ａ１イントロン７ではＫ５６２細胞では
ルシフェラーゼ発現が２５倍高まるが、ＣＨＯおよびＰ３８８．Ｄ１細胞では６
倍しか高まらない。
【００６７】 ｅＩＦ４Ａ１のイントロン１が一般的な転写エンハンサーとして作用しうるか
どうかを調べるため、１３９７ｂｐのＩＶＳ１断片をプラスミド−４０ｅＩＦｌ
ｕｃのｅＩＦ４Ａ１最小プロモーターの５’にクローニングして、プラスミドＩ
ＶＳ１ｅＩＦ−４０ｌｕｃを得た。ｅＩＦ４Ａ１最小プロモーターの５’または
３’に配置されたｅＩＦ４Ａ１を有するリポーター遺伝子プラスミドをネズミマ
クロファージ細胞系統ＲＡＷ２６４．７でトランスフェクトした。ｅＩＦ４Ａ１
ＩＶＳ１をｅＩＦ４Ａ１−４０プロモーター断片の３’に配置するとルシフェラ
ーゼ発現は１７００倍高まり、ＩＶＳ１をｅＩＦ４Ａ１−４０プロモーター断片
の５’に配置すると発現は６８０倍高まる（表３）。このように、ｅＩＦ４Ａ１
イントロン１配列を転写開始部位の５’または３’に配置すると遺伝子発現を高
めることができる。
【００６８】
【表３】 表３：示されたルシフェラーゼリポータープラスミド（２０μｇ）をβ−ガラク
トシダーゼリポータープラスミドｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌ（２μｇ）とともに
ＲＡＷ２６４．７細胞にエレクトロポレートした。トランスフェクション２４時
間後に細胞溶解物を調製し、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ酵素活
性についてアッセイした。示した結果は２つの独立した試験の典型的なものであ
る。
【００６９】ｅＩＦ４Ａ１配列によるマクロファージの持続的高レベルリポーター遺伝子発現 ｅＩＦ４Ａ１配列を用いて発現ベクターを開発するため、本発明者らはｅＩＦ
４Ａ１イントロン１を選択したｅＩＦ４Ａ１プロモーター断片の下流にクローニ
ングし、ｅＩＦ４Ａ１配列により得られるルシフェラーゼ発現のレベルを同リポ
ーター遺伝子ベクターにクローニングしたＳＶ４０およびＣＭＶエンハンサー／
プロモーター配列と比較した。ｅＩＦ４Ａ１イントロン１配列の付加により、調
べた総てのｅＩＦ４Ａ１プロモーター断片のＲＡＷ細胞でリポーター遺伝子発現
が高まる。プラスミド−２７１ｅＩＦＩＶＳ１により得られるルシフェラーゼ活
性のレベルは、プラスミドｈＣＭＶｌｕｃのヒトサイトメガロウイルスのプロモ
ーター／エンハンサーにより得られるものと同等であり、プラスミドｐＧＬ３コ
ントロールのＳＶ４０エンハンサー／プロモーターにより得られるものの３倍を
越える（図４）。
【００７０】 トランスフェクション２４時間後に採取したＲＡＷ細胞により、図４Ａのデー
タを得た。ＲＡＷ細胞をプラスミドを含むＣＭＶおよびｅＩＦ４Ａ１プロモータ
ーでトランスフェクトし、９６時間にわたるリポーター遺伝子発現レベルの比較
を図４Ｂに示している。ＲＡＷ細胞のＣＭＶにより駆動されるリポーター遺伝子
の発現レベルは、トランスフェクション４８時間後、開始レベルの１０％未満ま
で低下している。−２７１ｅＩＦ４ＡＩプロモーター断片およびｅＩＦ４Ａ１イ
ントロン１を含むＲＡＷ細胞で得られるリポーター遺伝子発現レベルは、トラン
スフェクション７２時間後に、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを用いて見ら
れるものより１０倍高い（図４Ｂ）。同試験を非マクロファージ細胞系統でも行
った。図４ＣのデータはＲＡＷ細胞のＣＭＶ−およびｅＩＦ４Ａ１により駆動さ
れるリポーター遺伝子発現の比較を示している。ＲＡＷ細胞で見られるＣＭＶ駆
動発現の急速な低下はＣＨＯ細胞では見られない。しかしながら、−２７１ｅＩ
ＦＩＶＳ１プラスミドでは、ＣＨＯ細胞において持続的高レベルリポーター遺伝
子発現が得られ、トランスフェクション１６〜４８時間後のルシフェラーゼ発現
が５倍増加する（図４Ｃ）。
【００７１】１を越えるｅＩＦ４Ａ１イントロンによるネズミマクロファージの発現特性 プラスミド−４０ＩＶＳ１（×１）はｐＧＬ３Ｂａｓｉｃの−４０ｅＩＦ４Ａ
１プロモーター断片の下流にクローニングされた１コピーのｅＩＦ４Ａ１遺伝子
イントロン１を含んでおり、プラスミド−４０ＩＶＳ１（×２）は−４０ｅＩＦ
４Ａ１プロモーターの下流にクローニングされた２コピーのｅＩＦ４Ａ１遺伝子
イントロン１を含んでいる。プラスミドｐＧＬ３コントロールはルシフェラーゼ
リポータープラスミドｐＧＬ３ベーシックにクローニングされたＳＶ４０プロモ
ーターおよびエンハンサー配列を含んでいる。
【００７２】 示されたプラスミドＤＮＡをβ−ガラクトシダーゼコ・リポータープラスミド
（ｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌ）とともにネズミマクロファージ細胞系統ＲＡＷ２
６４．７、ヒト２９３細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に
導入した。トランスフェクション１６時間後に細胞を採取し、細胞溶解物をルシ
フェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ酵素活性についてアッセイした。標準化
したルシフェラーゼ活性は、プロモーターを持たないベクターｐＧＬ３ベーシッ
クに対して何倍誘導されたかで示している。試験した３つ総ての細胞系統では、
２コピーのｅＩＦ４Ａ１イントロン１をｅＩＦ４Ａ１−４０プロモーターの下流
にクローニングすることにより、１コピーのイントロン１により得られるレベル
に比べてリポーター遺伝子発現が高まる。リポーター遺伝子発現のさらなる高ま
りはＲＡＷ細胞では小さい（１０％）が、２９３細胞ではｅＩＦ４Ａ１の第２の
コピーによる遺伝子発現の高まりは５倍を越える。
【００７３】 ｅＩＦ４Ａプロモーターおよびイントロン１はマウス筋肉におけるin vivo遺
伝子発現を指示する。マウス筋肉のin vivo ｅＩＦ４Ａプロモーター／イントロ
ン活性はルシフェラーゼリポータープラスミドを注射することで調べた（図７）
。イントロン１を加えた−５２６断片では、この系でのＳＶ４０プロモーター／
エンハンサーの組合せの活性の３倍を越える活性を示している。
【００７４】 ｅＩＦ４Ａプロモーターおよびイントロン１は癌細胞系統において活性である
。そのルシフェラーゼ発現がｅＩＦ４Ａプロモーター断片およびイントロン１（
ＩＶＳ１）領域により駆動されるプラスミドを一連の癌細胞系統：ＬＮＣａＰ、
Ｃｏｓ−１、ＷｉＤｒおよびＳＫＯＶ−３に導入した（図６）。標準化したルシ
フェラーゼ活性により、ｅＩＦ４ＡプロモーターおよびＩＶＳ１が試験した総て
の細胞型において活性であることが分かる。他の細胞種の場合と同様に、−２７
１および−５２６プロモーター断片が最も活性である（図２および４参照）。例
えば、−５２６およびＩＶＳ１の組合せにより、ＷｉＤｒ、結腸直腸癌細胞では
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの組合せよりも約２倍高く、ＬＮＣａＰ、
前立腺癌細胞系統では５００倍を越えるルシフェラーゼ発現が駆動される。
【００７５】 ｅＩＦ４Ａ１プロモーター配列をｅＩＦ４Ａ１イントロン１と組み合わせるこ
とで、本発明者らはマクロファージの持続的高レベルリポーター遺伝子発現を導
くことができた。ｅＩＦ４Ａ１ベクターによりネズミマクロファージで得られた
ルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーに
より見られるものより３倍高く、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーにより見ら
れる発現レベルと同等であった。
【００７６】ネズミケラチン生成細胞における−２７１ｅＩＦ４ＡおよびＣＭＶプロモーター の転写活性の比較 本発明者らはまた、ｅＩＦ−４Ａプロモーターがネズミケラチン生成細胞にお
いてＣＭＶプロモーターよりも活性であることを示した。さらに、このことによ
り、抗原提示細胞以外の細胞系統でｅＩＦ４ＡプロモーターがＣＭＶプロモータ
ーよりも効力が強いことが示される。ネズミケラチン生成細胞により、抗原をin vivoで発現させることにより、遺伝子銃を介して抗体応答の一助をになう専門
のＡＰＣ以外の細胞種の細胞系統モデルも提供される。このモデルによりｅＩＦ
４Ａ１配列によるケラチン生成細胞の持続的高レベルリポーター遺伝子発現を示
す。
【００７７】哺乳動物細胞の培養 ネズミケラチン生成細胞系統ＭＫ(Weissman, B. E. and Aaronson, S. A., 19
83, Cell 32, 599-606)を１０％ウシ胎児血清、(Life Technologies)、１００単
位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン
および４ｎｇ／ｍｌヒト組換えＥＧＦ(Sigma)を添加したＳ−ＭＥＭ（撹拌培養
改変イーグル培地）(Life Technologies)で維持した。細胞を恒湿インキュベー
ターにおいて５％ＣＯ２／空気混合、３７℃で増殖させた。
【００７８】一時的トランスフェクション ＭＫ細胞を６ウェルプレートで８０％密集状態まで増殖させ、１ｍｌのＯｐｔ
ｉｍｅｍで２回洗浄し、Ｏｐｔｉｍｅｍ中の１ｍｌのプラスミドＤＮＡ：陽イオ
ン脂質複合体（５μｇＤＮＡ：３０μｌ Ｔｒａｎｓｆａｓｔ（商標）、Promeg
a）でトランスフェクトした。通常、細胞をルシフェラーゼアッセイ用にはトラ
ンスフェクション４８時間後に、または活性の時間推移については特定の時間に
採取した。
【００７９】ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼアッセイでは、トランスフェクト細胞を１ｍｌ受動的溶解バッ
ファーに採取した。ルシフェラーゼ活性はルシフェラーゼアッセイキット(Prome
ga)およびＭＬ３０００プレート照度計(Dynatech Laboratories)を用いて測定し
た。全タンパク質含量は、Pierceクーマシープラスタンパク質アッセイ試薬を用
いる９６ウェル形式で、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ２５０プレートリーダー(Mol
ecular Devices)を用い標準曲線に対して測定した。
【００８０】転写活性のレベル ネズミケラチン生成細胞のＣＭＶプロモーターのものと比較した、イントロン
１（ＩＶＳ−１）と組み合わせたｅＩＦ４Ａ１プロモーター断片の転写活性のレ
ベルを測定した。ルシフェラーゼ発現を駆動する関連プロモーター／イントロン
組合せを含むプラスミドをＭＫ細胞でトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョン４８時間後にルシフェラーゼ活性をアッセイし、ＣＭＶｌｕｃプラスミド（
１００％とする）の割合（ＲＬＵ／タンパク質ｍｇ）として表した。相対ルシフ
ェラーゼ活性（図８）により、プラスミド−２７１ｅＩＦＩＶＳ１がプラスミド
ｈＣＭＶｌｕｃの約３倍高いルシフェラーゼ発現を導いていることが分かる。
【００８１】プロモーター活性の時間推移 ＭＫ細胞をプラスミドｈＣＭＶｌｕｃまたは−２７１ｅＩＦ−ＩＶＳ１ｌｕｃ
でトランスフェクトした。トランスフェクション２２、３１および４８時間後に
細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性および全タンパク質についてアッセイした。
相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／タンパク質ｍｇ）は、トランスフェクトした
各プラスミドの最初の時点の値のパーセンテージとして示している。図９は２回
の試験の平均であり、−２７１ｅＩＦ−ＩＶＳ１プラスミドでは、トランスフェ
クション２２〜４８時間後に、ルシフェラーゼ発現の約６倍の高まったことが分
かる。、また、ＲＡＷ細胞で見られる、ＣＭＶにより駆動される発現の急速な低
下（図４Ａ）はＭＫ細胞では見られないことも分かる。
【００８２】ＤＮＡワクチン投与における−２７１ｅＩＦ−ＩＶＳ１プロモーターの効力 次の実施例では、粒子を介するＤＮＡ送達試験においてｅＩＦ４Ａプロモータ
ーがインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）抗原の発現を駆動している場合には、
ＣＭＶにより駆動されるＮＰ発現をする同等のプラスミドと同等以上の抗体応答
が得られることを示している。
【００８３】プラスミドの構築およびＤＮＡの調製 ＤＮＡワクチン投与試験で用いたプラスミドはｐＶＡＣ１（Michelle Young,
GlaxoWellcome, UKから入手）、哺乳動物発現ベクター、ｐＣ１(Promega)の改変
物（多重クローニング部位、ＥｃｏＲＩ〜ＢｓｔＺＩ、特異なＮｈｅＩ、Ｒｓｒ
IIおよびＸｈｏＩ側の５’および特異なＰａｃＩ、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩ制限
部位側の３’によってフランクされたＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列で置換）に基づい
ている。インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）発現プラスミド、ｐＶＡＣ１．Ｐ
Ｒ（ＣＭＶ ＮＰ−ＰＲ）を、ｐＡＲ５０１由来のインフルエンザＡ型ウイルス
株ＰＲ／８／３４の核タンパク質をコードするＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡ（
D. Kiossis博士からの寄贈、NIMR, London, UK）を発現ベクターｐＶＡＣ１と連
結することにより構築した。−２７１ｅＩＦ４Ａプロモーターおよび第１イント
ロン（ＩＶＳ−１）を含むｐＶＡＣ１．ＰＲの変異体を得るために、ＣＭＶプロ
モーターおよびキメライントロンを含むＭｓｃＩ／ＮｈｅＩ断片を、−２７１ｅ
ＩＦ４Ａプロモーターおよび適切な制限酵素部位によりフランクされているＩＶ
Ｓ−１を含むＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片と置換して、プラスミド：−２７
１ｅＩＦ４ＡＩＶＳ−１ＮＰ−ＰＲを作出した。
【００８４】 ＤＮＡワクチン投与試験では、プラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α中で増殖さ
せ、内毒素を含まない精製キット(QIAGEN Ltd., Crawley, UK)を用いて調製し、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー中、約１ｍｇプラスミドＤＮＡ／ｍｌ
で−２０℃にて保存した。
【００８５】カートリッジの作製 Accell遺伝子導入装置を用いる、粒子を介するＤＮＡ送達（ＰＭＤＤ）用のカ
ートリッジの調製については従前に記載されている(Eisenbraun et al DNA and
Cell Biology, 1993 Vol 12 No 9 pp 791-797)。プラスミドＤＮＡで２μｍ金粒
子(DeGussa Corp., South Plainfield, N. J., USA)を被覆し、Tetzelチューブ
に充填した。続いてそれを１．２７ｃｍの長さに切ってカートリッジとし、使用
時まで乾燥させて４℃で保存した。典型的ワクチン投与では、各カートリッジに
０．５〜０．８μｇプラスミドＤＮＡで被覆した０．５ｍｇの金を入れた。
【００８６】動物および免疫化 ６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢI／６マウスを免疫化した。それぞれの免疫化では、
プラスミドＤＮＡをＰＭＤＤにより、Accell遺伝子導入装置を５００ｌｂ／ｉｎ ２ で用いて２つのカートリッジから腹部皮膚の毛を刈った標的部位に送達し（Ｍ
ｃＣａｂｅ ＷＯ９５／１９７９９）、１回の免疫化につき総量１．０〜１．６
μｇＤＮＡを送達した。ワクチン投与は、最初の免疫化に続いて６週間後に１回
の追加抗原投与を行う手順であった。
【００８７】抗体ＥＬＩＳＡアッセイのための採血 血液サンプルを免疫化１〜３日前、最初の免疫化２４日後、追加抗原投与１５
日後に尾の静脈から採取した。血清を分離し、次の抗体分析用に−２０℃で保存
した。
【００８８】血清抗体ＥＬＩＳＡアッセイのための、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ 融合タンパク質としてのインフルエンザウイルスの精製組換え核タンパク質（Ｎ Ｐ）の調製 インフルエンザＡ型ウイルス株ＰＲ／８／３４の核タンパク質のｃＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ断片として改変ｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。次いで、これ
をＥｃｏＲＩ断片としてｐＧＥＸ−４Ｔ−３(Pharmacia)にサブクローニングし
、ＤＮＡ配列解析により、この構築物がＧＳＴとのフレーム内融合物を発現する
ことを確認した。
【００８９】 ｐＧＥＸ ｆｌｕ／ＮＰで形質転換した大腸菌ＤＨ５αの１リットル培養物を
ＯＤ６００−０．８の濃度まで増殖させた。イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラク
トピラノシドを最終濃度０．１ｍＭまで加えて融合タンパク質発現を誘導し、さ
らに３７℃で３時間増殖を続けた。細胞を７０００ｒｐｍで７分間の遠心分離に
より採取し、ペレットを３０ｍｌのＰＢＳ＋１ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁した。細
胞を氷上で最大振幅、３×１０秒間の音波処理により破壊し、不溶性物質を１８
，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により除去した。上清を除き、１ｍｌのグ
ルタチオン−セファロース(Pharmacia)を加えて４℃で１時間、緩やかに撹拌し
ながらインキュベートした。グルタチオン−セファロースを遠心分離により回収
し、２０ｍｌの氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。セファロースに７×１ｍｌの溶離バ
ッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８中、１０ｍＭ還元グルタチオン
(Sigma)）を加えて室温で１０分間インキュベートして融合タンパク質を溶離し
た。精製したタンパク質を３リットルのＰＢＳで透析して遊離グルタチオンを除
去し、最終濃度１２５ｍｇ／ｎｌでそれぞれ１ｍｌアリコートで−２０℃にて保
存した。
【００９０】抗体ＥＬＩＳＡアッセイ マイクロタイタープレート(Nunc Immunoplate F96 maxisorp, Life Technolog
ies)を４℃で一晩のインキュベーションにより、１０μｇ／ｍｌ ＮＰで被覆し
、洗浄バッファー（５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％アジ化ナトリウム含有Ｐ
ＢＳ）で４回洗浄した。この後、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、５％ＢＳ
Ａ ｗ／ｖ）を加えて２０℃で１時間インキュベートし、さらに４回洗浄バッフ
ァーで洗浄した後、プレートを、ブロッキングバッファーで段階的に希釈した血
清サンプルを加えて２０℃で４時間インキュベートした。さらに４回洗浄（上記
のように）して結合していない抗体を除去した後、プレートを、ブロッキングバ
ッファーで希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体(Southern Biotec
hnology, Birmingham, AL, USA)を加えて１時間インキュベートした。さらに４
回洗浄（上記のように）し、続いてＴＭＢ基質溶液（Ｔ−８５４０、Sigma）を
加えた後に結合した抗体量を測定した。遮光して２０℃で３０分後、１Ｍ硫酸を
加えて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＯＤが０．２に到達
する力価を最大希釈と定義した。
【００９１】−２７１ｅＩＦ４ＡおよびＣＭＶプロモーターのｐＶＡＣ１．ＰＲに対するＩｇ Ｇ抗体応答へのin vivo効力の比較 免疫化の前にＮＰ特異的血清ＩｇＧレベルを測定し、間隔をおいて最初の免疫
化および追加抗原投与を行った。 −２７１ｅＩＦ４Ａプロモーターを含む構築
物では、ＣＭＶプロモーターを含む構築物による免疫後のものと同様の応答が得
られ（図１０）、追加抗原投与後、両プロモーターは同等な力価であった（図１
１）。
【００９２】免疫応答傾向をもたらしかつＣＴＬ応答を引き起こすｅＩＦ４Ａ調節配列の使用 カートリッジの作製 典型的ワクチン投与では、各カートリッジに−０．５、−０．０５または−０
．００５μｇのいずれかのｐＶＡＣ１．ＰＲプラスミドＤＮＡで被覆した０．５
ｍｇの金を入れた。後者の二用量にはエンプティベクター（ｐＶＡＣ１）を加え
て総量０．５μｇＤＮＡ／カートリッジとした。他の総ての条件は上記実施例の
通り。
【００９３】動物および免疫化 上記実施例の通り。
【００９４】ex vivoアッセイのための血液サンプルおよび組織の採取 上記実施例の通り
【００９５】抗体ＥＬＩＳＡアッセイ さらに４回洗浄（上記のように）して結合していない抗体を除去した後、プレ
ートを、ブロッキングバッファーで希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ
Ｇ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体(Southern Biotechnology, Birmingham, AL,
USA)を加えて１時間インキュベートしたこと以外は上記実施例の通り。
【００９６】ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ ９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート(Millipore)をアッセイ前日に５０μｌラ
ット抗マウスＩＦＮγ捕捉抗体(PharMingen)、１５μｇ／ｍｌで被覆した。これ
を４℃で一晩インキュベートした。１００μｌ完全ＲＰＭＩにより室温で少なく
とも１時間ブロッキングすることにより、非特異的結合を最小限にした。
【００９７】 脾細胞の単細胞懸濁液を、すりガラス顕微鏡スライド（スーパープレミアム顕
微鏡スライド、１．０〜１．２ｍｍ厚／ツイン・フロスト(ＢＤＨ））を用いて
標本にした。赤血球を標準溶解バッファー（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ
ＫＨＣＯ３、ＥＤＴＡ）を用いて溶解した。細胞を完全ＲＰＭＩで３回洗浄し
、計数し、再懸濁して最終濃度４×１０５細胞／ウェルとした。３反復で次の処
理を加えて最終容量２００μｌ／ウェルを得た： 培地単独；ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＰ−ＰＲペプチド（１０μＭ）＋Ｉ
Ｌ−２、ＮＰ−ＰＲペプチド単独
【００９８】 ＩＦＮγ産生の検出の前に試験物を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベート
した。細胞を溶解し（Ｈ２Ｏ）、洗浄（ＰＢＳ）した後、ビオチン結合二次抗体
（ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮγ、PharMingen））を１μｇ／ｍｌで加えて
室温で２時間インキュベートした。この後、ＰＢＳで洗浄し、原液の１／１００
０のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（ＴＣＳ、Biologicals）
を加えて室温で２時間インキュベートした。最後に、サイトカインを提供された
プロトコールに従って調製したアルカリ性ホスファターゼ基質キット(BioRad)を
用いて検出した。プレートをＨ２Ｏで洗浄して反応を停止させ、プレートを乾燥
させて、画像解析により１０６脾細胞当たりのＩＦＮγ産生細胞を計数した。
【００９９】ＣＴＬ活性の検出のためのＥｕ３＋放出アッセイ これらの試験を上記のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイと同時に行い、機能
的細胞溶解能を確認した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液を上記のように調製した（
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ）。５日間in vitroで拡張した後にＥｕ３＋放出アッ
セイを行った。要するに、エフェクター細胞（２×１０７）を、適用したウイル
ス（ＰＲ／８／３４）で再度刺激し、総量１０ｍｌの完全ＲＰＭＩ中、ＡＰＣ（
５×１０６細胞）を照射した（３０００Ｒａｄ）。拡張した後、細胞を洗浄し、
９６ウェル組織培養プレート（Ｕ型底）で培養して必要なエフェクター：標的（
Ｅ：Ｔ）比を得た。
【０１００】 標的細胞（ＥＬ４）をＨＥＰＥＳバッファーで１回洗浄した後、氷冷標識バッ
ファーで標識（１ｍｌ／１０７標識細胞、氷上で４０分間、５分おきに激しく振
盪しながら）した。９ｍｌのリペアバッファーを加えて反応を停止させ、さらに
５分間氷上でインキュベートした後、リペアバッファーで２回、完全ＲＰＭＩで
２回洗浄した。細胞に１０μＭ同種ペプチドを３７℃で１時間適用した。（１ア
リコートにモックとして、対照とした）。完全ＲＰＭＩで３回洗浄した後、標的
細胞を５×１０３細胞／ウェルで培養した。プレートを１００ｒｐｍで３分間遠
心分離し、３７℃で４時間インキュベートした。Ｅｕ３＋放出測定のため、上清
を採取し、２００μｌの増強液(Wallac)の存在下、タイム・ディレイド蛍光測定
法により蛍光を検出した。
【０１０１】 特異的細胞傷害性％は次のように算出する： （試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００％
【０１０２】 標的細胞からの試験放出はエフェクター存在下、自然放出はエフェクター不在
下、最大放出はエフェクター不在下で、細胞溶解を引き起こす手段として１０％
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えて測定した。
【０１０３】−２７１ｅＩＦ４ＡおよびＣＭＶプロモーターのｐＶＡＣ１．ＰＲに対するＩｇ Ｇ抗体特殊型応答へのin vivo効力の比較 抗体ＥＬＩＳＡアッセイにより、核タンパク質ＰＲ特異的ＩｇＧ１およびＩｇ
Ｇ２ａ応答を測定し、追加抗原投与１４日後に試験した。ＥＬＩＳＡアッセイの
結果は表４に示している。この結果から、−２７１ｅＩＦ４Ａ配列を含む構築物
では、０．００５および０．０５μｇ／カートリッジの用量でＩｇＧ１の力価が
検出されないこと、またＤＮＡの総ての用量でＩｇＧ２ａの高い力価が検出され
た（＞３．６０）ことが分かる。ＩｇＧ２ａ応答はＴｈ１細胞応答と相関させる
ことができ、ＩｇＧ１応答はＴｈ２細胞応答と相関させることができる。よって
、表４で示される結果により、構築物が−２７１ｅＩＦ４Ａ配列を含む場合の、
還元Ｔｈ２応答および対応するＴｈ１応答傾向が示される。
【０１０４】
【表４】表４ ＊４５０ｎｍで光学濃度０．２が得られる力価を最大希釈と定義した。結果は各
群に対するｌｏｇ１０力価で表している。
【０１０５】−２７１ｅＩＦ４ＡおよびＣＭＶプロモーターのＣＴＬ誘導へのin vivo効力の
比較 ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、−２７１ｅＩＦ４Ａプロモーターにより駆動さ
れる構築物による免疫化後、ＩＦＮγ陽性細胞が容易に検出されることが分かっ
た（図１２）。 また、同時に行ったＥｕ３＋溶解アッセイでもＣＴＬ活性の同様なパターンが
示された（図１３）。 従って、これらのアッセイから細胞傷害性Ｔ細胞溶解（ＣＴＬ）応答が、ｅＩ
Ｆ４Ａプロモーターが発現を駆動している場合に粒子を介するＤＮＡ送達後に誘
導されることが確認される。
【０１０６】参照文献
【０１０７】配列情報 配列番号３１
【０１０８】 配列番号３２
【０１０９】 配列番号３３
【０１１０】 配列番号３４
【０１１１】 配列番号３５
【０１１２】 配列番号３６
【０１１３】 配列番号３７
【０１１４】 配列番号３８
【０１１５】 配列番号３９
【０１１６】 配列番号４０
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトｅＩＦ４Ａ１遺伝子の構成を示している。ｅＩＦ４Ａ１およびＣＤ６８遺
伝子のコード配列エキソンを黒のボックスで、イントロンを白のボックスで、３
’非翻訳領域を影をつけたボックスで表している。ＡｌｕＩ反復配列の位置を水
平方向の矢印（下欄）で示している。矢じりの垂線は２つの遺伝子の転写開始部
位を示している。ポリＡ付加部位はｐＡ＋の記号で表している。ストライプのボ
ックスはネズミｅＩＦ４Ａ１プロモーターと相同関係にあるヒトｅＩＦ４Ａ１遺
伝子配列の領域およびイントロン１内のＣｐＧが豊富なメチル化フリーアイラン
ドの位置を表している。白と黒のボックスは図３で転写活性についてアッセイし
たプロモーター断片の位置（それぞれＰＣＲＡおよびＰＣＲＢ）を表している。
【図２】 ｅＩＦ４Ａ１プロモーターの転写調節配列のマッピング。図示したルシフェラ
ーゼリポータープラスミドを以下に記載するβ−ガラクトシダーゼリポーター遺
伝子プラスミド（ｐｃＤＮＡ β−ｇａｌ）とともにＣＨＯ２９３およびＲＡＷ
２６４．７細胞に導入した。トランスフェクション１６時間後に細胞溶解物を調
製し、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ酵素活性についてアッセイし
た。細胞溶解物を細胞溶解バッファーで希釈して、総てのルシフェラーゼアッセ
イが確実に酵素アッセイの直線範囲に入るようにした。エラーバーは２つの独立
したトランスフェクション試験の平均の標準誤差を表している。
【図３】 ｅＩＦ４Ａ１ ５’フランキング配列における転写調節配列。図示したプラス
ミドのプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）をβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐ
ｃＤＮＡ３ β−ｇａｌ）のプラスミドＤＮＡ（２μｇ）とともにエレクトロポ
レーションによってＲＡＷ２６４．７細胞に導入した。ＡおよびＡ’、Ｂおよび
Ｂ’は図１に示されるＰＣＲ断片それぞれのフォワードおよリバース向きを表し
ている。トランスフェクション１６時間後に細胞溶解物を調製し、ルシフェラー
ゼおよびβ−ガラクトシダーゼ酵素活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ
酵素活性は同試験でトランスフェクトしたプラスミド−４０ｅＩＦ ｌｕｃで得
られたルシフェラーゼ活性と比較して示してある。
【図４】 ｅＩＦ４Ａ１はマクロファージ細胞系における高レベル発現を指示する。パネルＡ ．図示したプラスミドのプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）をβ−ガラクト
シダーゼ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌ）のプラスミドＤＮＡ（２μ
ｇ）とともにエレクトロポレーションによってＲＡＷ２６４．７細胞に導入した
。トランスフェクション２４時間後に細胞溶解物を調製し、ルシフェラーゼおよ
びβ−ガラクトシダーゼ酵素活性についてアッセイした。エラーバーは２つの独
立した試験の平均の標準誤差を表している。パネルＢ ．ＲＡＷ細胞をプラスミドｈＣＭＶｌｕｃまたは−２７１ｅＩＦ−ＩＶ
Ｓ１およびコリポータープラスミドｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌでエレクトロポレ
ートした。トランスフェクション１６、２４、３６、４８、７２および９６時間
後に細胞を採取し、細胞溶解物をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。相
対ルシフェラーゼ活性は、１６時間でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準
化した１６時間で得られた値の割合として示している。同様の結果が２つの独立
した試験で得られた。パネルＣ ．ＣＨＯ細胞をプラスミドｈＣＭＶｌｕｃまたは−２７１ｅＩＦ−ＩＶ
Ｓ１およびコ・リポータープラスミドｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌでトランスフェ
クトした。トランスフェクション１６、２４、４０および４８時間後に細胞を採
取し、細胞溶解物をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。相対ルシフェラ
ーゼ活性は、１６時間でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した１６時
間で得られた値の割合として示している。同様の結果が２つの独立した試験で得
られた。
【図５】 プラスミド−４０ＩＶＳ１（×１）はｐＧＬ３ベーシック（ｐＧＬ３基本）の
−４０ｅＩＦ４Ａ１プロモーター断片の下流にクローニングされた１コピーのｅ
ＩＦ４Ａ１遺伝子イントロン１を含んでおり、プラスミド−４０ＩＶＳ１（×２
）は−４０ｅＩＦ４Ａ１プロモーターの下流にクローニングされた２コピーのｅ
ＩＦ４Ａ１遺伝子イントロン１を含んでいる。プラスミドｐＧＬ３コントロール
（ｐＧＬ３対照）はルシフェラーゼリポータープラスミドｐＧＬ３ベーシック（
ｐＧＬ３基本）にクローニングされたＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサー
配列を含んでいる。 図示したプラスミドＤＮＡをβ−ガラクトシダーゼコ・リポータープラスミド
（ｐｃＤＮＡ３ β−ｇａｌ）とともにネズミマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６
４．７、ヒト２９３細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に導
入した。トランスフェクション１６時間後に細胞を採取し、細胞溶解物をルシフ
ェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ酵素活性についてアッセイした。標準化し
たルシフェラーゼ活性は、プロモーターを持たないベクターｐＧＬ３ベーシック
（ｐＧＬ３基本）に対して何倍誘導されたかで示している。
【図６】 ｅＩＦ４Ａプロモーターおよびイントロン１は癌細胞系において活性である。
ルシフェラーゼリポータープラスミドをエレクトロポレーションによって（Ａ）
ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌）および（Ｂ）Ｃｏｓ−１（ミドリザル腎臓）細胞に
、リポフェクチンを用いて（Ｃ）ＷｉＤｒ（ヒト結腸直腸癌）および（Ｄ）ＳＫ
ＯＶ−３（ヒト卵巣癌）に導入した。トランスフェクション４８時間後に細胞溶
解物を調製し、ルシフェラーゼアッセイを行い、全タンパク質含量により標準化
した。総ての試験を３回ずつ繰り返して、同様の値が得られたため、それぞれに
典型的な１つの試験を示している。 （ＨＳＶ１Ｔｋｍｉｎ＝単純ヘルペスウイルス１の最小チミジンキナーゼプロモ
ーター）
【図７】 ｅＩＦ４Ａプロモーターおよびイントロン１はマウス筋肉におけるin vivo遺
伝子発現を指示する。ルシフェラーゼリポータープラスミド（５０μｇ）をＣ５
７ＢI.６マウスの四頭筋に注射した。７２時間後に筋肉を取り出し、ルシフェラ
ーゼ活性についてアッセイし、その値をタンパク質含量により標準化した。デー
タは５匹の動物の平均である。（−４０ＥＩＦＩＶＳ１Ａ＝イントロン１の１コ
ピー、−４０ｅＩＦ４ＡＩＶＳ１Ｂ＝イントロン１の２コピー）。
【図８】 ＭＫ細胞での一時的トランスフェクションにおけるｅＩＦ４ＡおよびＣＭＶプ
ロモーター発現プラスミドのルシフェラーゼ活性の比較。
【図９】 ＭＫ細胞におけるプロモーター活性の時間経過。
【図１０】 粒子を介するＤＮＡ送達におけるＣＭＶおよび−２７１Ｅｌｆ−ＩＶＳ１プロ
モーターの効力。血清ＩｇＧ応答（１０００倍希釈）。
【図１１】 粒子を介するＤＮＡ送達におけるＣＭＶおよび−２７１ｅＩＦ−ＩＶＳ１プロ
モーターの効力。追加抗原投与２週間後の血清ＩｇＧ応答。
【図１２】 追加抗原投与６週間後に回収した脾臓細胞のインターフェロン−γ ＥＬＩＳ
ＰＯＴアッセイにより示される−２７１ｅＩＦ４ａプロモーターを有するｐＶＡ
Ｃ１．ＰＲ構築物に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【図１３】 追加抗原投与６週間後に回収した脾臓細胞のユウロピウム放出ＣＴＬアッセイ
により示される−２７１ｅＩＦ４ａプロモーターを有するｐＶＡＣ１．ＰＲに対
するＣＤ８＋Ｔ細胞応答。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月２日（２００１．１０．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１９】 配列番号４０の位置−１１０７〜−５０５番で示される配列を有する、単離さ
れたポリヌクレオチド、その断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリヌクレ
オチド。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年３月２９日（２００２．３．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】 ネズミｅＩＦ−４ＡＩ ５’フランキング領域と非相同な領域を以下のプライ
マー： を用いてＰＣＲ増幅した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８７ 43/00 １０５ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デビッド、ロバート、グリーブス イギリス国オックスフォードシャー、オッ クスフォード、サウス、パークス、ロー ド、ユニバーシティ、オブ、オックスフォ ード、サー、ウィリアム、ダン、スクー ル、オブ、パソロジー (72)発明者 リンディ、トムセン イギリス国ハートフォードシャー、スティ ーブネージ、ガネルズ、ウッド、ロード、 グラクソスミスクライン内 (72)発明者 イアン、リチャード、キャッチポール イギリス国ハートフォードシャー、スティ ーブネージ、ガネルズ、ウッド、ロード、 グラクソスミスクライン内 (72)発明者 マーティン、ジェームズ、フォード イギリス国エセックス、ハーロウ、サー ド、アベニュ、ニュー、フロンティアズ、 サイエンス、パーク、サウス、グラクソス ミスクライン内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA31 CA01 CA02 CA20 DA02 DA03 EA04 FA02 GA11 GA13 HA17 4B064 AG01 AG31 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA91X AA93X AA95Y AB01 AC14 BA02 BA05 CA24 CA45 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA23 CA18 CA53 CA56 DA01 DA27 NA14 ZB212 ZB262 4C085 AA03 BB01 BB11 CC21 DD21 DD62 EE01 4C087 AA01 AA02 AA03 BB64 BB65 BC83 NA14 ZB21 ZB26

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 目的の異種遺伝子と機能しうる形で連結された転写調節配列を含んでなり、前
    記転写調節配列がｅＩＦ４Ａ遺伝子プロモーター、その断片またはそれとハイブ
    リダイズ可能なポリヌクレオチドである転写調節ポリヌクレオチドを含んでなる
    、ＤＮＡ構築物。
  2. 【請求項２】 転写調節配列が少なくとも１つのｅＩＦ４Ａイントロン、その断片またはそれ
    とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項１に記載
    の構築物。
  3. 【請求項３】 ｅＩＦ４Ａイントロンがイントロン１、２、３、５、６、７または９である、
    請求項２に記載の構築物。
  4. 【請求項４】 イントロンがイントロン１である、請求項３に記載の構築物。
  5. 【請求項５】 転写調節配列が少なくとも１つのさらなるｅＩＦ４Ａ１遺伝子イントロン、そ
    の断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含んでなる、請求
    項２〜４のいずれか一項に記載の構築物。
  6. 【請求項６】 ｅＩＦ４ＡＩ遺伝子プロモーター断片が−５２６ＥＩＦ、−３７１ＥＩＦ、−
    ２７１ＥＩＦ、−１９３ＥＩＦ、−１２０ＥＩＦ、−９８ＥＩＦ、−６９ＥＩＦ
    および−４０ＥＩＦからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に
    記載の構築物。
  7. 【請求項７】 ｅＩＦ４Ａプロモーターが配列番号３８で示される配列を有する、請求項１〜
    ６のいずれか一項に記載の構築物。
  8. 【請求項８】 調節配列が配列番号３１〜３７で示される配列の１以上を含んでなる、請求項
    ２〜７のいずれか一項に記載の構築物。
  9. 【請求項９】 ファージ、プラスミド、ウイルス、ミニクロモソームまたはトランスポゾンで
    ある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の構築物。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築物を含んでなる、宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、所望によりタンパク質を回収する工程
    を含んでなる、タンパク質の生産方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築物を含んでなる、医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 疾病または疾患を治療する方法であって、 治療上有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築物または請求項１２に
    記載の組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
  14. 【請求項１４】 治療に用いるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築物。
  15. 【請求項１５】 ワクチンの製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築物の使用
    。
  16. 【請求項１６】 構築物が粒子を介するＤＮＡ送達により投与される、請求項１５に記載の使用
    。
  17. 【請求項１７】 Ｔｈ１に対する免疫応答傾向を得るための医薬の製造のための、請求項１〜９
    のいずれか一項に記載の構築物の使用。
  18. 【請求項１８】 配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７で示される配列を有
    する、単離されたポリヌクレオチド、その断片またはそれとハイブリダイズ可能
    なポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 配列番号４０の位置−２１０２および−１０８２番で示される配列を有する、
    単離されたポリヌクレオチド、その断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリ
    ヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 配列番号４０の位置−１１０７〜−５０５番で示される配列を有する、単離さ
    れたポリヌクレオチド、その断片またはそれとハイブリダイズ可能なポリヌクレ
    オチド。
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