HU224175B1 - Vírus vektorok cirkuláris, replikálódó DNS molekulák in situ előállítására - Google Patents

Vírus vektorok cirkuláris, replikálódó DNS molekulák in situ előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU224175B1
HU224175B1 HU9902585A HUP9902585A HU224175B1 HU 224175 B1 HU224175 B1 HU 224175B1 HU 9902585 A HU9902585 A HU 9902585A HU P9902585 A HUP9902585 A HU P9902585A HU 224175 B1 HU224175 B1 HU 224175B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
viral vector
site
recombinase
gene
promoter
Prior art date
Application number
HU9902585A
Other languages
English (en)
Inventor
Héléne Leblois-Prehaud
Michel Perricaudet
Patrice Yeh
Original Assignee
Gencell S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gencell S.A. filed Critical Gencell S.A.
Publication of HUP9902585A2 publication Critical patent/HUP9902585A2/hu
Publication of HUP9902585A3 publication Critical patent/HUP9902585A3/hu
Publication of HU224175B1 publication Critical patent/HU224175B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/11043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya vírusvektor, amely tartalmaz egy DNS-régiót, melyetkét, helyspecifikus rekombinációt biztosító, direkt orientációbanelhelyezkedő szekvencia határol, ahol az említett DNS-régió egymásután tartalmaz egy emlőssejtekben működőképes promotert, Epstein–Barr-vírus (EBV) oriP replikációs origót, egy kívánt gént és attól azencefalomiokarditisz vírus (ECMV) belső riboszóma belépési hely (IRES)szekvenciával elválasztott EBNA1 fehérjét kódoló gént, ahol a promoterdirekt orientációban helyezkedik el a replikációs origóhoz és azemlített génekhez képest, miáltal ezek inaktivált formában vannak, ésa promoter és az említett gének kapcsolata csak a helyspecifikusrekombináció eredményeként válik működőképessé. A találmány tárgyatovábbá eljárás cirkuláris, replikatív DNS-molekulák in situelőállítására a fenti vírusvektorokkal.

Description

A találmány tárgyát a génterápiában alkalmazható cirkuláris, replikálódó DNS-molekulák előállítására szolgáló vírusvektorok képezik. A találmány egy eljárást is leír, amely különösen hatékony az ilyen molekulák találmány szerinti vírusvektorból történő in situ kialakításában.
A génterápia abból áll, hogy egy hiányosságot vagy rendellenességet (mutáció, aberráns expresszió stb.) kijavítunk egy genetikai információnak az érintett sejtbe vagy szervbe történő bevezetésével.
A genetikai információt in vitro, egy, a szervből kivett sejtbe vezethetjük be, és ekkor a módosított sejtet a szervezetbe visszaültetjük, vagy közvetlenül in vivő az érintett szövetbe építhetjük be. Ebben a második esetben különböző eljárások léteznek, többek között különböző transzfekciós eljárások, melyek különböző természetű hordozókat alkalmaznak. Szó lehet kémiai vagy biokémiai, természetes vagy szintetikus hordozókról egyrészt, vagy virális vektorokról másrészt. A vírusvektorokra példaképpen említhetjük a DNS és DEAE-dextrán [Pagano et al., J. Virol. 1, 891 (1967)], DNS és nukleáris proteinek [Kaneda et al., Science 243, 375 (1989)], DNS és lipidek [Felgner et al., PNAS 84, 7413 (1987)] komplexeit, liposzómákat [Fraley et al., J. Bioi. Chem. 255, 10431 (1980)] stb. Ezek alkalmazása lehetővé teszi többek között jelentős mennyiségű farmakológiai tisztaságú DNS termelését.
A virális vektorok (retrovírusok, adenovírusok, adenoasszociált vírusok stb.) nagyon hatékonyak a korábban leírt kémiai és/vagy biokémiai hordozókhoz képest, különösen ami a plazmamembránon való áthaladást illeti. A vírusok közül különösen az adenovírusok mutatnak kívánatos tulajdonságokat a génterápiás felhasználás tekintetében. Többek között széles gazdaspektrumúak, képesek osztódásban vagy nyugalomban lévő sejteket transzdukálni, és genomjuk extrakromoszomálisan marad fenn, ezenkívül a mai napig nem kapcsolható hozzájuk jelentős emberi betegség. Ezzel szemben a retrovírusok alkalmazása, melyek genomja véletlen módon beépül a fertőzött sejt genomjába, korlátozott az osztódásban lévő sejtek esetében. Két loxP hellyel határolt gént tartalmazó, kivágható DNS-kazettát tartalmazó retrovírust ismertetnek a Nucleic Acid Research 23 (21), 4451-56 (1995) irodalmi helyen. Az adenovírusokat alkalmazták kívánt gének átvitelére nyugalomban lévő izomsejtekbe (myotubes) [Ragot et al., Natúré 361, 647 (1993)], májsejtekbe [Jaffe et al., Natúré genetics 1, 372 (1992)], idegsejtekbe [Akii et al., Natúré genetics 3, 224 (1993)], bronchus epiteliális sejtekbe [Rosenfeld et al., (1992)] stb. A gyorsan megújuló szövetekben azonban a transzgén expressziójának fokozatos elvesztése figyelhető meg a sejtosztódás során végbemenő hígulási hatás miatt.
Az adenovírusvektorok javítása és új generációs vektorok kifejlesztése a maradék patogén képesség, valamint a vektor replikációjához, genomjának rekombinációjához és a vírusfehérjék kifejeződéséhez kapcsolt immunogén képesség potenciális veszélyeinek csökkentésén nyugszik.
Hogy maximálisan megelőzzük az ilyen veszélyeket, a jelenleg javasolt vírusvektor-konstrukciókat úgy módosították, hogy azok képtelenek legyenek autonóm módon replikálódni a célsejtben. Ezeket detektív vagy hiányos vektoroknak nevezik. Általában a hiányos vírusok genomjából hiányoznak legalább az említett vírusnak a fertőzött sejtben való replikációjához szükséges szekvenciák. így az adenovírusok esetében a szakirodalomban leírt konstrukciók olyan adenovírusok, melyekből az E1, és adott esetben az E3 régió deletált, és a heterológ szekvenciák ezek területére vannak beépítve [Levrero et al., Gene 101, 195 (1991); Goshchoudhury et al., Gene 50, 161 (1986)]. Más konstrukciók az E1 régióban és az E4 régió egy nem esszenciális területén hordoznak deléciót [WO 94/12649], vagy módosított genomiális szerveződéssel rendelkeznek [FR 94/13355]. Az EP 704 534 számú iratban olyan hiányos adenovírusvektort ismertetnek, amely két, helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvencia között tartalmaz egy heterológ gént.
A hiányos vírusvektorok termelődése során azonban megmarad a replikatív vírusrészecskéket létrehozó rekombináció, vagy a sejt E1 típusú funkciói által történő transzkomplementáció veszélye. Világos, hogy az ilyen módon szennyezett vektorok génterápiában való felhasználása végzetes következményekkel járhat, például vírusterjedést válthat ki, és szabályozatlan szétszóródáshoz vezethet, ami gyulladásos reakciók és a vírusfehérjék elleni immunválasz stb. veszélyével járhat.
Másrészt az adenovírusvektor által fertőzött sejtekben, különösen az osztódásban lévő sejtekben lévő transzgénkifejeződés stabilitásának javítása jelentős megoldandó probléma marad. Ebből következik, hogy a génterápiában a mai napig valós igény maradt olyan transzfer vektorokra, melyek alapvetően rendelkeznek a korábban leírt vektorok mindegyikének előnyeivel, azaz a vírusvektorokra, különösen az adenovírusvektorokra jellemző jó transzfekciós tulajdonsággal és teljes ártalmatlansággal, amely különösen a replikatív vírusrészecskék in vivő kialakulásának hiányában nyilvánul meg, ami a nem virális plazmidok vagy vektorok esetében egy nem létező kockázat.
A találmány célja pontosan olyan új génátviteli elv bemutatása, amely az előbb felsorolt kívánalmaknak eleget tesz.
A találmány tárgyát többek között cirkuláris, replikatív, terápiás területen és a transzgénkifejeződés stabilitása és az ártalmatlanság szempontjából előnyös DNS-molekuláknak egy vírusvektor útján való in situ kialakítása képezi. Ezekből a molekulákból hiányzik a virális genomnak minden olyan szekvenciája, amelyről feltételezhető, hogy gyulladásos típusú, valamint a vírusfehérjék ellen irányuló specifikus immunválaszt vált ki, amely a szervezetre káros hatással lehet, és korlátozhatja a transzgén kifejeződésének időtartamát.
A találmány tárgya tehát cirkuláris, replikatív DNS-molekulák in situ előállítása, melyek legalább a következőket tartalmazzák.
(i) egy vagy több kívánt gént az expressziójukhoz szükséges szekvenciákkal, (ii) egy emlőssejtekben működőképes replikációs origót és
HU 224 175 Β1 (iii) egy rekombináz által felismert két szekvencia közötti helyspecifikus rekombináció eredményeképpen létrejött szekvenciát.
A találmány tárgya közelebbről egy eljárás és specifikus konstrukciók, azaz virusvektorok, melyek különösen hatékonyak az ilyen terápiás DNS-molekulák előállítására. Részletesebben a találmány szerinti eljárás abból áll, hogy egy találmány szerinti vírusvektorral korábban definiált terápiás DNS-molekulát állítunk elő.
Nem várt módon a bejelentés kimutatta, hogy ín situ lehetséges egy vírusvektorból helyspecifikus rekombinációval egy cirkuláris, terápiás és replikatív jellegű DNS-molekulát létrehozni. Ezenfelül egy előnyös megvalósítási módban a transzgén és a replikációs origó inaktív a virális vektorban, mivel aktivitásuk a helyspecifikus rekombinációs eseménytől függ. Még előnyösebben a rekombinációs eseményt feltételes módon egy rekombináz expressziójával indukáljuk, ami a kívánt gén kifejeződésének és a termelt episzomális molekulák replikációjának magas szintű szabályozottságát teszi lehetővé.
Egy ilyen eljárás különösen előnyös terápiás téren, mivel:
- kihasználja a virális vektoroknak a nem virális vektorokkal összehasonlítva általánosan jó transzfekciós képességét,
- jelentősen csökkenti a vírusszennyeződés, a helyi gyulladásos reakció, valamint az antivirális immunválasz veszélyét, számításba véve az alkalmazott vírusvektorok csekély mennyiségét. Ez utóbbit csak a terápiás DNS-molekulák kialakításához szükséges arányban vezetjük be,
- lehetővé teszi, hogy bizonyos vírusvektorok alkalmazási területét kiszélesítsük: az adenovírusvektorok alkalmazása korlátozott osztódó sejtekben, amilyenek például a hematopoetikus sejtek. A találmány lehetővé teszi, hogy fertőzőképességüket stabil cirkuláris replikatív molekulák előállítása céljából proliferatív sejtekben is kiaknázzuk.
A találmány szerint előállított DNS-molekulák tehát rendelkeznek azzal a képességgel, hogy hatékonyan biztosítják a tartalmazott terápiás gén vagy gének átvitelét a megcélzott sejtekbe.
Ehhez tartalmaznak egy replikációs origót, melyet az jellemez, hogy működőképes emlős- és humán sejtekben. Előnyösen az alkalmazott replikációs origó egy feltételes replikációs origó, azaz aktivitása szabályozható. Még előnyösebb módon a replikácós origó úgy van elhelyezve, hogy inaktív legyen a vírusvektorban, és aktív a helyspecifikus rekombináció után.
A találmány szerinti vírusvektorok replikációs origója az Epstein-Barr-vírus (EBV) replikációs origója. Az EBV vírus a Herpesviridae családhoz tartozik. Replikációs origója két elemet tartalmaz: a replikációért felelős oriP szekvenciát (1,7 kb), amelynek aktivitását az EBNA1 gén által kódolt fehérje indukálja. Ez a szekvencia transz-helyzetben helyezkedhet el. Ezek az elemek egymagukban lehetővé teszik a replikáció során egy plazmidvektor sejtenként 5-20 kópiaszámban való episzomális fenntartását és szegregációját. Az oriP szekvencia egy 30 bp-os motívum 20-szoros ismétlődéséből áll, melyet a replikációs origótól 960 bp választ el, mely utóbbit egy 65 bp-os inverz ismétlődő motívum alkot, és négy nem teljes kópiáját tartalmazza a 30 bp-os motívumnak. Az EBNA1 fehérje a 30 bp-os motívumokhoz kapcsolódik a replikációs origó területén, és lehetővé teszi sejtfaktorok befogását az S fázis és az oriP szekvenciát cisz-helyzetben hordozó plazmid sejtosztódással szinkronban zajló replikációja során. Ezenfelül az EBNA1 valószínűleg az ismétlődő motívumok és kromoszomális szerkezetek területén történő egyidejű kötődése által lehetővé teszi az episzómák intracelluláris fenntartását és szegregációját a sejtosztódás idején. Az EBV genomjának oriP replikációs origóját tartalmazó, és a virális EBNA1 fehérje (641 aminosav) kifejeződését lehetővé tevő plazmidok stabil episzomális módon maradnak fenn a transzfektált humán sejtekben, és replikációjuk szinkronban zajlik a sejtosztódással [Lupton et Levine (1985)].
Ami a kívánt gént illeti, szó lehet egy terápiás, vakcináláshoz alkalmazható, agronómiái vagy állatorvosi génről. Ez tartalmaz egy, a célsejtben vagy szervezetben működőképes transzkripciós promoterterületet is, valamint egy 3’ irányban elhelyezkedő területet, amely egy transzkripciós végjelet és egy poliadenilációs jelet határoz meg. Ami a promoterterületet illeti, szó lehet az adott gén expressziójáért természetesen felelős promoterrégióról, amennyiben erről feltételezhető, hogy működik az illető sejtben vagy szervezetben. Szó lehet eltérő eredetű (más fehérjék expressziójáért felelős vagy szintetikus) területekről is. Többek között eukarióta vagy virális gének promoterszekvenciáiról lehet szó. Például szó lehet a célsejt genomjából származó promoterszekvenciákról. Az eukarióta promoterek közül bármely promotert vagy származék szekvenciát alkalmazhatunk, amely egy gén transzkripcióját specifikus vagy nemspecifikus, indukálható vagy nem indukálható, erős vagy gyenge módon elősegíti vagy visszaszorítja. Különösen a mindenütt jelen levő promotereket (HPRT, PGK, α-aktin, tubulin stb. gének promoterei), az intermedier filamentumok promotereit (GFAP, dezmin, vimentin, neurofilamentumok, keratin stb. gének promoterei), terápiás gének promotereit (MDR, CFTR, Vili faktor, ApoAI stb. gének promoterei), a szövetspecifikus promotereket (piruvát-kináz, viliin, a zsírsavak kötődéséért felelős bélfehérje promotere, a simaizomsejtek α-aktinjának promotere stb.) vagy egy ingerre válaszoló promotereket (szteroidhormonok receptorai, retinsavreceptor stb.) említhetjük meg. Ezenfelül szó lehet egy vírus genomjából származó promoterszekvenciákról, például az adenovírus E1A, MLP génjeinek promotereiről, a CMV korai promotere vagy az RSV LTR promotere stb. Másrészt ezeket a promoterterületeket aktivációs vagy regulációs, vagy szövetspecifikus, vagy nagymértékű expressziót lehetővé tevő szekvenciák hozzáadásával módosíthatjuk is. Másrészt a kívánt gén tartalmazhat egy szignálszekvenciát is, amely a szintetizált terméket a célsejt szekréciós útvonalára irányítja. Ez a szignálszekvencia lehet a szintetizált termék természetes szignálszekvenciája, de
HU 224 175 Β1 bármely más működőképes szignálszekvenciáról vagy mesterséges szignálszekvenciáról is szó lehet.
Előnyösen egy, a CMV korai promotere vagy az LTR közül választott víruspromotert vagy egy emlőspromotert alkalmazunk.
Egy replikációs origón és legalább egy kívánt génen kívül a találmány szerinti DNS-molekulák tartalmaznak egy olyan régiót, amely két szekvencia közötti specifikus rekombináció eredménye. A helyspecifikus rekombináció különböző, szekvenciák közötti helyspecifikus rekombinációt eredményező rendszerekből kiindulva kapható meg.
A találmány keretein belül az igényelt DNS-molekulák in situ kialakítása céljából felhasznált specifikus rekombinációs rendszer különböző eredetű lehet. Részletesen, az alkalmazott specifikus szekvenciák és rekombinázok különböző szerkezeti osztályokhoz tartozhatnak, többek között a P1 bakteriofág rekombináz családjához.
Még előnyösebben a találmány szerinti eljárásban alkalmazott helyspecifikus rekombinációt két specifikus szekvencia segítségével kapjuk meg, melyek képesek egy specifikus, általában rekombináznak nevezett fehérje jelenlétében egymással rekombinálódni. Ezért tartalmaznak a találmány szerinti cirkuláris DNS-molekulák többek között egy olyan szekvenciát, amely ennek a helyspecifikus rekombinációnak az eredménye. A találmány keretein belül alkalmazott, a rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák általában 5-100, előnyösebben kevesebb mint 50 bázispárt tartalmaznak.
Az 1 bakteriofág integrázai családjába tartozó rekombinázok közül például a lambda [Landy et al., Science 197, 1147 (1977)], a P22 és az F80 [Leong et al., J. Bioi. Chem. 260, 4468 (1985)] fágok integrázát, a Haemophilus influenzáé HP1 tágjának [Hauser et al., J. Bioi. Chem. 267, 6859 (1992)] integrázát, a P1 fág Cre integrázát, a pSAM2 plazmid integrázát [EP 350 341] vagy a Saccharomyces cerevisiae élesztő 2 μ plazmidjának FLP rekombinázát említhetjük meg. Amikor a találmány szerinti DNS-molekulákat egy lambda bakteriofág integrázának családjába tartozó helyspecifikus rendszer útján történő rekombinációval állítjuk elő, a találmány szerinti DNS-molekulák általában tartalmaznak többek között egy olyan szekvenciát, amely a bakteriofág vagy a megfelelő plazmid két att kapcsolószekvenciája közötti rekombináció eredménye.
A Tn3 transzpozon családba tartozó rekombínázok közül többek között a Tn3 transzpozon vagy a gd, Tn21 vagy Tn522 [Stark et al. (1992)] transzpozonok reszolvázát, a mu bakteriofág Gin invertázát, vagy plazmidok reszolvázait, például az RP4 pár fragmentumát [Abert et al., Mól. Microbiol. 12, 131 (1994)] említhetjük meg. Amikor a találmány szerinti DNS-molekulákat egy Tn3 transzpozon családjába tartozó helyspecífikus rendszer útján történő rekombinációval állítjuk elő, a találmány szerinti DNS-molekulák általában tartalmaznak többek között egy olyan szekvenciát, amely az illető transzpozon reszolvázának két felismerőszekvenciája közötti rekombináció eredménye.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti genetikai konstrukciókban a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák egy bakteriofágból származnak. Még előnyösebben egy bakteriofág kapcsolószekvenciáiról (attP és attB szekvenciák) vagy ezekből származó szekvenciákról van szó. Ezek a szekvenciák képesek egymás között specifikusan rekombinálódni egy integráznak nevezett rekombináz jelenlétében. A származék szekvencia kifejezés magában foglalja a bakteriofágok kapcsolószekvenciáinak módosításával kapott szekvenciákat, amelyek megőrzik képességüket a specifikus rekombinációra a megfelelő rekombináz jelenlétében. így szó lehet a szekvenciák rövidebb fragmentumairól, vagy ezzel ellentétben más szekvenciákkal (restrikciós helyek stb.) meghosszabbított fragmentumokról. Szó lehet mutációval vagy mutációkkal, többek között pontmutációval vagy pontmutációkkal kapott variánsokról is. Egy bakteriofág vagy plazmid attP és attB szekvenciái kifejezéssel a találmány szerint az említett bakteriofág vagy plazmid specifikus rekombinációs rendszerének szekvenciáit jelöljük, azaz az említett fágon vagy plazmidon jelen levő attP szekvenciát és a megfelelő kromoszomális attB szekvenciát.
Előnyös példaképpen említhetjük többek között a lambda, P22, F80, P1, Haemophilus influenzáé HP1 fágok, vagy a pSAM2 vagy 2 μ plazmidok kapcsolószekvenciáit.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák a P1 fág rekombinációs rendszeréből származnak. A P1 fág egy Cre nevű rekombinázzal rendelkezik, amely specifikusan egy 34 bázispáros, loxP helynek nevezett nukleotidszekvenciát ismer fel. Ez a szekvencia két 13 bp-os palindrom szekvenciából áll, melyeket egy 8 bp-os konzervált szekvencia választ el egymástól.
Egy különleges változatban a találmány tárgya tehát egy cirkuláris replikatív DNS-molekula, amely tartalmaz a P1 bakteriofág két LoxP területe közötti helyspecifikus rekombinációból származó szekvenciát, legalább egy kívánt gént, és egy emlős- és humán sejtekben működőképes replikációs origót, amely egy előnyös megvalósítási mód szerint feltételes működésű.
Ebben a tekintetben a találmány olyan különleges génkonstrukciókat is szolgáltat, melyek a korábban definiált terápiás DNS-molekulák termelésére alkalmasak. Ezek a genetikai konstrukciók vagy találmány szerinti rekombináns DNS-ek tartalmazzák többek között a kívánt gént vagy géneket, az EBV replikációs origót és az EBNA1 fehérje génjét, melyet két direkt orientációban elhelyezkedő, helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvencia fog közre. Ezeket a szekvenciákat bakteriális plazmidokba klónozhatjuk kazetták formájában. A plazmid-DNS első lépésben humán sejtekbe transzfektálható a szekvenciák működőképességének vizsgálatára. A kazettákat azután olyan virális vektorok kialakítására használhatjuk, melyek ugyanezekkel a szekvenciákkal rendelkeznek genomjukba beépítve.
HU 224175 Β1
Amint korábban jeleztük, a találmány másik tárgya egy eljárás a korábban definiált terápiás DNS-molekulák in situ termelésére egy vektorból kiindulva helyspecifikus rekombinációval. Egy ilyen vektor alkalmazása előnyösen lehetővé teszi, hogy a fenti DNS-molekulának a kezelni kívánt sejtekbe történő bevezetését optimalizáljuk.
Ebben a tekintetben a találmány tárgyát képezi egy vírusvektor is, amely genomjába beépítve tartalmaz legalább egy DNS-régiót, amely tartalmazza az EBV vírus oriP replikációs origóját, egy kívánt gént és egy promotert, ahol az említett DNS-régió két, helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő, direkt orientációban elhelyezkedő szekvencia által határolt, és a promoter a DNS-régió egyik végén direkt orientációban van a replikációs origóhoz és kívánt génhez képest.
A találmány szerinti vírusvektorba beépített replikációs origó, valamint a kívánt gén inaktívak, mivel a promoter az expressziós kazetta egyik végéhez direkt orientációban van klónozva (1. ábra). A két LoxP hely közötti rekombináció után a promoter a kívánt gén előtt fog elhelyezkedni, ez utóbbitól egy LoxP hellyel elválasztva, ahol a transzkriptum első ATG-je a transzgén iniciációs helyének felel meg. Az oriP szekvencia csak az EBNA1 fehérje jelenlétében aktív, amely ugyanazon promoter irányítása alól fejeződik ki, mint a transzgén, egy bicisztronos messenger formájában. Az EBNA transzlációját egy belső iniciációs mechanizmus indítja be egy IRES-szekvencia szintjén, amely a pikornavírusok családjába tartozó encefalomiokarditisz vírusból (ECMV) származik. A transzgén és az EBNA1 fehérje kifejeződése, valamint a plazmid replikációja tehát közvetlenül a két loxP hely közötti rekombinációs eseménytől függ.
A találmány egy másik változata szerint a vírus részecskeképződésért (enkapszidáció) felelős területe a replikonban van benne (a DNS azon területe, melyet a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák határolnak). Ez a megvalósítási mód nagyobb biztonságot nyújt a rendszernek, amint azt a későbbiekben megmagyarázzuk.
Az alkalmazott vírusvektor különböző eredetű lehet, amennyiben képes állati, előnyösen humán sejteket transzdukálni. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában adenovírusokból, adenoasszociált vírusokból (AAV), herpeszvírusokból (HSV) vagy retrovírusokból származó vektorokat alkalmazunk. Különösen előnyös, ha beültetésre szánt sejtek ex vivő módosításához vagy közvetlen bevezetéshez adenovírust alkalmazunk, illetve ha termelősejtek beültetéséhez retrovírust alkalmazunk.
A találmány szerinti vírusok hiányosak, azaz képtelenek autonóm módon replikálódni a célsejtben. Általában a találmány keretein belül alkalmazott hiányos vírus genomjából legalább az említett vírusnak a fertőzött sejtben való replikációjához szükséges szekvenciák hiányoznak. Ezeket a területeket eltávolíthatjuk (teljesen vagy részben), vagy működésképtelenné tehetjük, vagy más szekvenciákkal, többek között a kívánt heterológ nukleotidszekvenciával helyettesíthetjük. Előnyösen a hiányos vírus mégis megőrzi genomjának azon szekvenciáit, melyek a vírusrészecskék pakolódásához szükségesek.
Részletesebben az adenovírusokról szólva a találmány keretein belül a humán 2 vagy 5 típusú adenovírusok (Ad2 vagy Ad5), vagy az állati eredetű adenovírusok [lásd a WO 94/26914 számon közzétett bejelentést] alkalmazását részesítjük előnyben. A találmány keretein belül alkalmazható állati eredetű adenovírusok közül a kutya-, szarvasmarha-, egér- (például Mav1) [Beard et al., Virology 75, 81 (1990)], juh-, sertés-, madár- vagy majom- (például SAV) eredetű adenovírusokat említhetjük meg.
A találmány szerinti vírusvektorok előnyösen hiányos adenovírusok, melyek genomjukba beépítve tartalmaznak egy génszekvenciát, amely legalább egy replikációs origót és egy kívánt gént hordoz, melyeket két direkt orientációban elhelyezkedő szekvencia határol. Ezek lehetővé teszik, hogy a replikációs origó és a transzgén feltételes aktivitását a rekombináz jelenlététől függő helyspecifikus rekombináció közreműködésével kiváltsuk.
A találmány szerinti adenovírusok genomjában előnyösen az E1 régió működésképtelen. Még előnyösebben az E1 gén és az E2, E4, L1-L5 gének közül legalább egy működésképtelen. Más régiók is módosíthatók, többek között az E3 [WO 95/02697], E2 [WO 94/28938], E4 [WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697] és az L5 területek [WO 95/02697],
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti adenovírus deléciót tartalmaz az E1 és az E4 területen, és a két helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciával határolt DNS-régió az inaktivált E1 régió területére van beépítve. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az adenovírus az E1 és E4 régióban deléciót tartalmaz, és a két helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciával határolt DNS-régió az inaktivált E4 régió területére van beépítve. Amint azt később jelezzük, a találmány egy különleges megvalósítási módja szerint az adenovírus tartalmazza a rekombináz génjének expressziós kazettáját is.
Az igényelt vektorokat a korábbiakban definiált plazmidokkal történő rekombináció útján kapjuk meg, amely plazmidok azzal jellemezhetők, hogy két helyspecifikus rekombinációs terület között legalább egy feltételes aktivitású replikációs origót és egy kívánt gént tartalmaznak.
Ami az igényelt vírusvektorba beépített DNS-területben levő replikációs origó, a két helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvencia és a kívánt gén definícióját illeti részletesebben, a korábban említett definíciókra hivatkozunk.
A találmány szerinti hiányos rekombináns adenovírusokat bármely, a szakember számára ismert eljárással előállíthatjuk [Levrero et al., Gene 101, 195 (1991), EP 185 573, Graham, EMBO J. 3, 2917 (1984)]. Részletesen, egy adenovírus és egy többek között a találmány szerinti DNS-szekvenciákat hordozó plazmid közötti homológ rekombinációval vagy egy virális genom E. coliban való kialakításával állíthatók elő. A homológ
HU 224 175 Β1 rekombináció az említett adenovírusoknak és plazmidnak egy megfelelő sejtvonalba történő kotranszfekciója után valósul meg. Az alkalmazott sejtvonal előnyösen (i) transzformálható kell legyen az említett elemekkel, és (ii) hordoznia kell a hiányos adenovírus genomjának hiányzó részét komplementálni képes szekvenciákat, előnyösen beépített formában, hogy a rekombináció veszélyét elkerüljük. A sejtvonalra példaképpen említhetjük a 293 humán embrionális vesesejtvonalat [Graham et ah, J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)], amely többek között az Ad5 adenovírus genomjának bal részét tartalmazza (12%) genomjába beépített módon, vagy az E1 és E4 funkciókat komplementálni képes sejtvonalakat, melyeket például a WO 94/26914 és WO 95/02697 számon közzétett bejelentések írnak le.
Végül a felszaporított adenovírusokat a molekuláris biológia klasszikus módszerei szerint összegyűjtjük és tisztítjuk, amint azt a példákban bemutatjuk.
Ami az adenoasszociált vírusokat (AAV) illeti, viszonylag kisméretű DNS-vírusokról van szó, melyek a fertőzött sejt genomjába stabil és helyspecifikus módon beépülnek. Sejtek széles spektrumát képesek fertőzni anélkül, hogy a sejtek növekedésére, morfológiájára vagy differenciálódására hatással lennének. Másrészt úgy tűnik, nem vesznek részt emberi betegségek kialakításában. Az AAV-k genomját klónozták, szekvenálták és jellemezték. Körülbelül 4700 bázist tartalmaz, és mindkét végén egy körülbelül 145 bázisos inverz ismétlődő régió (ITR) található, amely a vírus replikációs origójaként szolgál. A genom fennmaradó része két alapvető területre osztható, amelyek a részecskeképződésért felelős funkciókat hordozzák: a genom bal része, amely a virális replikácíóban és a vírusgének expressziójában szerepet játszó rep gént tartalmazza, és a genom jobb része, amely a vírusburok-proteineket kódoló cap gént tartalmazza.
Az AAV-eredetű vektorok alkalmazását gének in vitro és in vivő átvitelére már leírták az irodalomban [lásd például WO 91/18088, WO 93/09239, US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528]. Ezek az iratok különböző AAV-eredetű konstrukciókat írnak le, melyekben a rep és/vagy cap gének deletáltak, és azokat egy kívánt gén helyettesíti, valamint a konstrukciók alkalmazását az említett kívánt gén in vitro (sejttenyészetben) vagy in vivő (közvetlenül egy szervezetben) átvitelére. A találmány szerinti hiányos rekombináns AAV-ket egy humán helpervírussal (például egy adenovírussal) fertőzött sejtvonalnak egy, a találmány szerinti nukleotidszekvenciákat az AAV két inverz ismétlődő területe (ITR) között tartalmazó plazmiddal és egy, a részecskeképződésért felelős géneket (rep és cap gének) hordozó plazmiddal való kotranszfekciójával állíthatjuk elő. A termelt rekombináns AAV-ket azután a klasszikus eljárásokkal tisztítjuk.
Ami a herpesz- és retrovírusokat illeti, rekombináns vektorkonstrukciókat nagy számban ismertet az irodalom [lásd például Breakfield et al., New Biologist 3, 203 (1991), EP 453 242, EP 178 220, Bernstein et al., Génét. Eng. 7, 235 (1985), McCormick, BioTechnology 3, 689 (1985) stb.].
Részletesen, a retrovírusok integratív vírusok, melyek szelektíven az osztódó sejteket fertőzik. Ezek tehát a rákos alkalmazásokhoz megfelelő vektorok. A retrovírusok genomja alapvetően két LTR-t, egy részecskeképződésért felelős szekvenciát és három kódolóterületet (gag, pol, env) tartalmaz. A retrovíruseredetű rekombináns vektorokban a gag, pol és env géneket általában teljesen vagy részben deletálják, és egy kívánt heterológ nukleinsavszekvenciával helyettesítik. A vektorokat különböző típusú retrovírusokból kiindulva hozhatjuk létre, például a MoMuLV („murine moloney leukémia vírus”, melyet MomLV-nek is neveznek), az MSV („murine moloney sarcoma vírus”), a HaSV („harvey sarcoma vírus”), az SNV („spleen necrosis vírus”), az RSV („rous sarcoma vírus”) vagy a Friend-vírus.
A találmány szerinti rekombináns retrovírusok előállításához általában egy olyan plazmidot szerkesztünk, amely többek között az LTR-eket, a részecskeképződésért felelős szekvenciát és a találmány szerinti szekvenciákat tartalmazza, majd ezt alkalmazzuk egy úgynevezett részecskeképző sejtvonal transzfektálására, amely képes transz-helyzetben szolgáltatni a plazmidból hiányzó retrovirális funkciókat. A részecskeképző sejtvonal tehát általában a gag, pol és env géneket képes kifejezni. Ilyen részecskeképző sejtvonalakat az irodalomban leírtak, például a PA317 sejtvonal [US 4,861,719], a PsiCRIP sejtvonal [WO 90/02806] és a GP+envAm-12 sejtvonal [WO 89/07150]. Másrészről a rekombináns retrovírusok tartalmazhatnak módosításokat az LTR-ek szintjén a transzkripciós aktivitás megszüntetésére, valamint tartalmazhatnak meghosszabbított részecskeképző szekvenciákat, amelyek a gag gén egy részét is tartalmazzák [Bender et al., J. Virol. 61, 1639 (1987)]. A termelt retrovírusokat azután a klasszikus technikákkal tisztítjuk.
A találmány szerint előnyben részesített vektorokra példaképpen különösen azokat az adenovírusokat javasolhatjuk, melyek genomjukban egy, a találmánynak megfelelő DNS-területet tartalmaznak, melyet a P1 fág két direkt orientációban elhelyezkedő inverz ismétlődő szekvenciája (loxP terület) határol.
Az ilyen típusú vektorokra példaképpen említhetjük különösen a következő konstrukciókat a β-galaktozidáz génnel (LacZ) vagy a herpeszvírus timidin-kinázának génjével (TK) (1. ábra). A kívánt gén bármely gén lehet (cDNS, gDNS, RNS, szintetikus vagy félig szintetikus nukleinsav), amely egy terápiás vagy vakcinálási célú fehérjét vagy RNS-t kódol, amilyenek az enzimek, a vérszármazékok, a hormonok, a limfokinek: interleukinok, interferonok, TNF stb. [FR 9203120], a növekedési faktorok, a neurotranszmitterek vagy azok prekurzorai vagy szintézisenzimei, a trofikus faktorok: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 stb., az apolipoproteinek: ApoAI, ApoAlV, ApoE stb. [FR 9305125], a disztrofin vagy egy minidisztrofin [FR 9111947], a tumorszuppresszor gének: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev stb. [FR 9304745], a véralvadásban szerepet játszó faktorokat kódoló gének: VII., VI—II., IX. faktorok stb., vagy egy természetes vagy mesterséges
HU 224 175 Β1 immunglobulin vagy annak egy része (Fab, ScFv stb.), egy ligandum RNS [WO 91/19813] stb.
A kívánt gén lehet egy antiszensz szekvencia is, melynek expressziója a célsejtben gének expressziójának vagy a celluláris mRNS transzkripciójának szabályozását teszi lehetővé. Az ilyen szekvenciák a célsejtben például a sejt mRNS-sel komplementer RNS-sé íródhatnak át, és így gátolhatják annak fehérjévé fordítását, az EP 140 308 számú szabadalomban leírtak szerint.
A találmány szerinti vektorok különösen alkalmasak toxikus faktorokat kódoló szekvenciák expressziójára. Különösen sejtmérgekről (diftéria-toxin, pseudomonas-toxín, ricin A stb.), egy külső szerre érzékenységet kiváltó termékekről (öngyilkos gének: timidin-kináz, citozin-dezamináz stb.) vagy a sejthalál kiváltására képes gyilkos génekről (Grb3-3 [PCT/FR94/005542], antiras ScFv [WO94/29446] stb.) lehet szó. A találmány szerinti rendszer lehetővé teszi, hogy az ezeket a szekvenciákat tartalmazó vektorokat, többek között virális vektorokat a termelősejtekre kifejtett toxicitás nélkül termeljük, majd a toxikus molekulák expresszióját szelektíven a célsejtekben indukáljuk a helyspecifikus rekombináció után. Ez a típusú konstrukció tehát különösen a tumorellenes terápiás stratégiákhoz megfelelő például, amelyekben a cél szelektíven az érintett sejtek elpusztítása. A rendszer különösen előnyös például citokinek, interferonok, TNF vagy TGF expressziójához is, melyek szabályozatlan termelése jelentős másodlagos hatásokkal járhat.
A találmány tárgya minden eukarióta sejt is, amely legalább egy, a korábbiakban definiált találmány szerinti vírusvektorral vagy DNS-molekulával van transzfektálva.
A találmány egy másik tárgya egy eljárás a korábbiakban definiált DNS-molekula termelésére, amely szerint egy találmány szerinti vírusvektort tartalmazó gazdasejttenyészetet a helyspecifikus rekombináció kiváltását lehetővé tevő rekombinázzal hozzuk érintkezésbe.
A találmány tárgya pontosabban általános módon minden előállítási eljárás, amely azzal jellemezhető, hogy az említett cirkuláris és replikatív DNS-molekulák kialakítása céljából érintkezésbe hoz:
(i) módosított gazdasejteket, amelyek legalább egy vírusvektort tartalmaznak, ahol az említett vírusvektor tartalmaz genomjában legalább egy DNS-régiót, melyet két direkt orientációban elhelyezkedő, a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvencia határol, és az említett régió legalább egy replikációs origót és egy kívánt gént tartalmaz, és (ii) a helyspecifikus rekombináció in situ kiváltását lehetővé tevő rekombinázt.
A találmány keretein belül különböző eljárásokat javasolhatunk a vírusvektornak a specifikus rekombinázzal történő érintkezésbe hozására. Ezt többek között a gazdasejtben valósíthatjuk meg vagy egy, az említett rekombináz génjét tartalmazó plazmid vagy vírusvektor kotranszfekciójával, vagy az említett rekombinázt kódoló, közvetlenül az említett gazdasejt genomjában jelen levő gén expressziójának kiváltásával. A rekombinázt kódoló gén tehát a gazdasejtben a genomba integrált formában, egy plazmidon, vagy egy például adenovírus típusú segítő vírusvektoron lehet jelen. Ebben az esetben a találmány szerinti DNS-molekula kialakítása céljából alkalmazott vírusvektor a korábbiakban definiáltakkal megegyezik.
Egy másik eljárás szerint a gén expressziós kazettáját a kívánt gén kifejeződéséért is felelős vírusvektor hordozza.
Ebben a különleges esetben a találmány szerinti eljárás egy olyan vírusvektort alkalmaz, amely genomjában tartalmazza a két specifikus rekombinációs helyet kódoló szekvenciával határolt, és legalább egy replikációs origót és egy kívánt gént tartalmazó DNS-régión kívül a rekombináz génjének expressziós kazettáját is.
Egy ilyen vektor a találmány egy másik tárgyát képezi.
Ebben a tekintetben egy különleges megvalósítási mód szerint a találmány tárgya egy adenovírus, amely egy első deléciót tartalmaz az E1 régióban, ahova a replikon (a két helyspecifikus rekombinációs hellyel határolt DNS-terület) van beépítve, és egy, az E4 és/vagy az E3 területben lévő deléciót, ahova a rekombináz fehérje expressziós kazettája van beépítve.
Az előzőleg leírt megvalósítási módhoz képest fordított sorrendben a replikon az E3 vagy E4 régiónak megfelelő deletált részbe is be lehet építve, és ekkor a rekombináz expressziós kazettája a deletált E1 régió területére van beépítve.
Egy másik változat szerint a replikon, valamint a rekombináz expressziós kazettája a hiányos E1 régió területére van beépítve.
Még részletesebben, amint a korábbiakban jeleztük, a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák a LoxP szekvenciák, és a rekombináz a Cre protein, melynek működésmódját az említett rekombinációs szekvenciákon a korábbiakban írtuk le.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint kívánatos lenne, ha a rekombináz expresszióját a gazdasejten belül szabályozni, és különösen indukálni tudnánk. Ehhez a találmány keretein belül előnyösen azt javasoljuk, hogy a rekombinázt kódoló gén expresszióját szabályozzuk. Ehhez javasolt, hogy az említett gén expresszióját egy szabályozóelem irányítása alá helyezzük. Többek között egy indukálható promoterről lehet szó, amely lehetővé teszi, hogy a gén expressziójának szintjét és/vagy idejét szabályozzuk, például az MMTV LTR-ének promotere (Pharmacia), amelyet a dexametazon indukál, vagy egy tetraciklinnel szabályozható promoter [WO 94/29442; WO 94/04672], Természetesen más promotereket is alkalmazhatunk, többek között az MMTV LTR változatait, melyek például heterológ szabályozóterületeket hordoznak (például enhancer régiók).
Egy másik megvalósítási módban a rekombinázt kódoló gén szabályozott promoterek irányítása alatt áll, hogy az említett protein konstitutív felhalmozódását elkerüljük a gazdasejtben, vagy hogy minimalizáljuk a nukleáris sejtalkotórész felé történő „elszivárgást és a
HU 224 175 Β1 citotoxicitást. így olyan elemeket kapcsolhatunk hozzá, amelyek transzkripciós transzaktivátor doménekként működnek. Az ilyen elemekre példaképpen említhetjük többek között a hormonreceptorokat, beleértve a szteroidhormonokat, a retinsavreceptort és a tiroidreceptorokat, melyek közül különösen a glükokortikoid-, mineralokortikoid-, tiroid-, ösztrogén-, aldoszteron- és retinsavreceptorokat említhetjük meg. A Cre rekombináz és egy glükokortikoidreceptor DNS-kötő doménje közötti ilyen konstrukciót például Feil és munkatársai írtak le [PNAS 93, 10887 (1996)]. Az FLP rekombináz és egy hormonreceptor kötődoménje közötti fúziót is leírták [PNAS 92, 5490 (1995)].
A rekombinázexpresszió szabályozásának lehetősége különösen jelentős az olyan találmány szerinti vektorok esetében, melyek egyszerre hordozzák a replikont és a rekombinázexpressziós kazettát. Ebben a megvalósítási módban, ha a rekombináz például a vírusvektorok termelése idején kifejeződik, a replikon ki fog vágódni a vírusgenomból annak pakolódása előtt. Ezért hasznos, ha olyan rendszerrel rendelkezünk, amelyben a rekombináz fehérje expressziója a vírustermelő sejtekben meg van akadályozva. Ezt, amint az előzőekben jeleztük, egy szabályozott promoter (tetraciklin vagy MMTV típusú) és/vagy egy hormonreceptor típusú elem alkalmazásával érhetjük el, amely elem a rekombinázhoz kapcsolódva azt az extranukleáris sejtalkotórészekben tartja az említett hormon hiányában (6. és 7. ábra). Ezért hormon hiányában a rekombináz nem aktív, hormon jelenlétében a nukleáris sejtalkotórész felé transzportálódik, ahol kifejti aktivitását.
A rekombinázexpresszió szabályozásának egy érdekes megközelítése, amikor egy hormonreceptorral (DNS-kötő dómén) fuzionált, tehát az említett hormon hiányában inaktív rekombinázt alkalmazunk, majd az említett gént a vírusvektorban úgy helyezzük el, hogy a replikon promoterének kontrollja alatt álljon. Ezt a megvalósítási módot például a 6b. ábrán mutatjuk be.
Másrészt a rendszer biztonságának növelésére lehetséges, amint azt a korábbiakban jeleztük, hogy a replikonba belefoglaljuk a vírusvektor pakolódásához szükséges területet (7. ábra). Ez lehetővé teszi, hogy a termelt vírussarzs replikont elvesztett vektorokkal történő szennyeződését elkerüljük. Ha a fent említett szabályozórendszer ellenére a vírus termelése folyamán előfordul aktív rekombinázexpresszió, ez a replikon vírusgenomból történő kivágódását, és így replikont nem tartalmazó vírusgenomok kialakulását vonja maga után. Ha a vírus részecskeképződésért felelős területe az említett replikonban van, az így kialakult vírusgenomok nem fognak pakolódni. így csak a replikont és a rekombinázexpressziós kazettát egyszerre tartalmazó vírusok fognak pakolódni.
A találmány tárgyát képezik legalább egy találmány szerinti vírusvektort vagy találmány szerint transzfektált sejtet tartalmazó gyógyszerkészítmények is. A gyógyszerkészítmények helyi, orális, parenterális, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris stb. bevezetés céljából formulázhatók. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény előnyösen az injektálható formulázáshoz gyógyszerészetileg elfogadható hordozókat tartalmazza. Különösen steril, izotóniás sóoldatokról lehet szó (mononátrium-, dinátrium-foszfát, nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnézium-klorid stb., vagy ilyen sók keveréke), vagy szárított, például liofilezett készítményekről, melyek az adott esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injektálható oldatok előállítását teszik lehetővé. Retrovírusok esetében előnyös lehet közvetlenül a részecskeképző sejtek alkalmazása, vagy ex vivő az in vivő visszaültetés céljából fertőzött sejtek alkalmazása, adott esetben új szervek formájában [WO 94/24298],
Az injektáláshoz alkalmazott vektorok dózisa különböző paraméterek, például az alkalmazott beadási mód, az illető betegség vagy a kívánt kezelési időtartam függvényében választható meg. Általános módon a találmány szerinti rekombináns vírusokat általában 104 és 1014 pfu/ml közötti dózisban formulázzuk és adjuk be. Az AAV-k és az adenovírusok esetében 1O6-1O10 pfu/ml közötti dózisokat is alkalmazhatunk. A pfu („plaque farming unit”) kifejezés egy virionoldat fertőzőképességét fejezi ki, és egy megfelelő sejtkultúra fertőzésével és általában 48 óra elteltével a fertőzött sejtplakkok számának mérésével határozzuk meg. Egy vírusoldat pfu titerének meghatározásának technikáit az irodalom bőségesen ismerteti.
A találmány szerinti DNS-molekulákban jelen lévő kívánt géntől vagy az említett vírusvektorok genomjába beépített területektől függően ezeket számos betegség kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatjuk, beleértve a genetikai betegségeket (miodisztrófia, mukoviszcidiózis stb.), a neurodegeneratív megbetegedéseket (Alzheimer, Parkinson, ALS stb.), a rákokat, a véralvadás rendellenességeivel vagy a diszlipoproteinémiával kapcsolatos betegségeket, a vírusfertőzésekkel kapcsolatos betegségeket (hepatitisz, AIDS stb.), vagy alkalmazhatjuk agronómiái és állatorvosi stb. területen.
A találmányt a következő példák segítségével írjuk le részletesebben, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, csupán illusztrációként szolgálnak.
Az ábrák leírása
1. táblázat: Az episzóma kialakításához alkalmazott szekvenciák eredete
1. ábra: Az episzóma kialakításának sémája
2. ábra: Az episzóma szerkezetének bemutatása
3. ábra: A promoter (P-RSV) és az expressziós kazetta (TKCITE-EBNA1) közötti szekvencia a pLoxP-ori-EBNA1 plazmidban (A) és az episzómában a rekombináció után (B, C és D) - 3. számú szekvencia
4. ábra: A LoxP-ori-TK-EBNA1 kazetta klónozási lépéseinek vázlata
5. ábra: A LoxP-ori-LacZ-EBNA1 kazetta klónozási lépéseinek vázlata
6. ábra: Egy replikont és egy szabályozott Cre expressziós kazettát hordozó adenovírusvektor bemutatása. CREr: vagy a promoter szintjén, vagy fúzióval, vagy mindkettővel szabályozott Cre. A (b) ábrán a repli8
HU 224 175 Β1 kon orientációja lehetővé teszi, hogy a CREr kazettát a replikonban lévő promoter irányítása alá helyezzük. A szürke téglalap a LoxP helyeknek felel meg.
7. ábra: Egy replikont és egy szabályozott Cre expressziós kazettát hordozó adenovírusvektor bemutatása, ahol a Psi (ψ) virális részecskeképződésért felelős terület a replikonban található. A szürke téglalap a LoxP helyeknek felel meg.
Általános klónozási és molekuláris biológiai módszerek
A molekuláris biológia klasszikus módszereit, mint amilyenek a plazmid-DNS centrifugálása cézium-klorid/etídium-bromid gradiensen, a restrickiós enzimes emésztések, a gélelektroforézis, a DNS-fragmentumok elektroelúciója agarózgélből, transzformálás E. coliban, a nukleinsavak kicsapása stb., az irodalomban ismertetik [Maniatis et al., (1989); Ausubel et al., (1987)]. A nukleotidszekvenciákat a láncterminációs módszerrel határoztuk meg a már ismertetett eljárást alkalmazva [Ausubel et al., (1987)].
A restrikciós enzimeket a New England Biolabs (Biolabs), a Bethesda Research Laboratories (BRL) vagy az Amersham Ltd. (Amersham) forgalmazta.
A ligálásokhoz a DNS-fragmentumokat méretük szerint elválasztottuk 0,7% agaróz vagy 8% akrilamid gélen, elektroforézissel, majd elektroelúcióval tisztítottuk, fenollal extraháltuk, etanolban kicsaptuk, majd 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM MgCI2, 10 mM DTT, 2 mM ATP pufferben, T4 fág DNS-ligáz jelenlétében inkubáltuk. Az oligonukleotidokat foszforamidites módszert alkalmazva szintetizáltuk, β-helyzetben ciano-etil-csoporttal védve [Sinha et al., (1984); Giles (1985)], Biosearch 8600 automata DNS-szintetizátorral, a gyártó előírásai szerint.
A plazmid-DNS-t az alkalikus lízis módszere szerint tisztítottuk [Maniatis et al., (1989)].
Példák
1. példa
Egy találmány szerinti vektor leírása (1-3. ábrák)
Az 1. ábra egy találmány szerinti vektor, részletesebben a helyspecifikus rekombinációt lehetővé tevő szekvenciák közötti terület általános szerkezetét mutatja be. Részletesebb szerkezet szerepel a 2. ábrán.
A promoter (P), és a transzgén (TG) és az EBNA1 protein expressziós kazettájának orientációját nyilakkal jelöltük. Ez az orientáció tehát csak a Cre rekombináz jelenlétében végbement rekombináció után teszi lehetővé, hogy a két gén kifejeződjön. A promoter (P) és a gén rekombináció utáni részletes szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. Ezen az ábrán a promoter az RSV vírus LTR promotere (P-RSV), és a gén a TK timidin-kináz. A messenger RNS első ATG-je, amely a TK-gén első ATG-jének felel meg, alá van húzva. Amint az 1. ábrán bemutatjuk, az EBNA1 kifejeződését egy policisztronos messengerből kiindulva kapjuk meg a transzláció belső iniciálásával, az encefalomiokarditisz vírus (ECMV) IRES- (Internál Ribosome Entry Site, belső riboszóma belépési hely) szekvenciáit alkalmazva, melyeket CITE (Cap Independent Translation Entry, Cap független transzláció belépés) szekvenciáknak is neveznek. A transzkripció végét jelölő szekvenciát és az SV40 vírus poliadenilációs helyét (pA) az EBNA1-et kódoló szekvencia 3' végére vezettük be. Az oriP szekvencia a TK-EBNA1 expressziós kazetta és az RSV-promoter között helyezkedik el. Ez a szekvencia replikáció esetén csak az EBNA1 jelenlétében aktív, ebből következik, hogy csak a rekombináció és az episzóma kialakítása után működik.
2. példa
A LoxP-oriP-TK-EBNA1 és a LoxP-ori-LacZEBNA1 plazmidok kialakítása
A plazmidok kialakításának lépéseit a 4. és az 5. ábrákon mutatjuk be, az alkalmazott szekvenciák eredetét az 1. táblázatban foglaljuk össze.
2.1. A pLoxP-oriP-TK-EBNA 1 plazmid kialakítása (4. ábra)
1. A pSLori plazmidot Hpal és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, és a kapott oriP szekvenciának megfelelő 1817 bp fragmentumot az előzőleg defoszforilált plC19H plazmid Smal és EcoRI helyei közé klónoztuk, és így a pIC-ori plazmidot kaptuk (4A. ábra).
2. A pIC-ori plazmidot a Hindlll és Bglll helyeken emésztettük és defoszforiláltuk, és a kapott 1900 bp fragmentumot a pBS246 vektor Hindlll (174) és BamHI (208) helyei közé klónoztuk, hogy így a pLox-ori vektort kapjuk (4A. ábra).
3. A pCEP4 vektor 399 bp BamHI-Sall fragmentumát, amely az SV40 vírus transzkripciós stopszekvenciájának és poliadenilációs szekvenciájának felel meg, DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával kiegészítettük, majd az előzőleg defoszforilált plC20R vektor (szintén DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával kiegészített) Smal és Sáli helyei közé klónoztuk, hogy így a plCpA vektort kapjuk (4A. ábra).
4. A pCITE-2 vektor 16. és 518. nukleotidjai között elhelyezkedő ECMV IRES-szekvenciát PCR-rel amplifikáltuk a szintetikus
1. oligonukleotid:
5’-GGCCTCTAGACAGCTGGTTATTTTCC-3’ (1.
számú szekvencia) és a 2. oligonukleotid:
5’-GGCCGGATCCCATATTATCATCG-3’ (2. számú szekvencia) segítségével, melyek Xbal és Pvull (1. oligo), és BamHl (2. oligo) helyeket tartalmaznak 5' végükön. A kapott terméket Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, és az előzőleg defoszforilált pCMVEBNA1 vektor Xbal és Pstl helyei közé klónoztuk, hogy így a pCITE-EBNA1 vektort kapjuk. Az IRES transzlációs kezdőhelynek megfelelő 12. ATG-je és az EBNA1 fehérje metionint követő szerinkodonja közötti szekvenciát irányított mutagenezissel deletáltuk, PCR-technika segítségével (ex-site PCR). A PCR után kapott teljes IRES- és EBNA1 szekvenciát egészében szekvenáltuk (4A. ábra).
HU 224 175 Β1
5. A pCITE-EBNA1 vektor Xbal-Pstl fragmentumát (2546 bp) az előzőleg defoszforilált plCpA plazmid Xbal és Pstl helyei közé klónoztuk, és így a pCITEEBNA1-pA vektort kaptuk (4A. ábra).
6. A pCITE-EBNA1-pA vektor Clal-EcoRI fragmentumát (2945 bp) az őri végén elhelyezkedő EcoRI helynél részlegesen emésztett, majd Clal-gyel emésztett és defoszforilált pLox-ori vektorba klónoztuk, és így a pLox-ori-CITE-EBNA1-pA vektort kaptuk (4B. ábra).
7. A pCMV-TK vektor részleges BsaW1 emésztéssel, és a BsaW1 hely DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával történt betöltésével kapott Clal-BsaW1 fragmentumát (1270 bp) a pLox-ori-CITE-EBNA1-pA vektor Clal és Pvull helyei közé klónoztuk, és így a pLox-oriCITE-TK-EBNA1-pA vektort kaptuk (4B. ábra).
8. A pRSV-TK plazmidnak az RSV LTR promoter szekvenciának megfelelő BamHI-Sall fragmentumát (600 bp) az előzőleg defoszforilált pLox-oriCITE-TK-EBNA1-pA vektor BamHI és Sáli helyei közé klónoztuk, és így a pLox-ori-pRSV-TK-CITEEBNA1-pA vektort kaptuk (4B. ábra).
2.2. A pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1 plazmid kialakítása (5. ábra)
A fenti 2.1. példában leírt és a 4A. ábrán bemutatott 1-6. klónozási lépések közösek a pLox-ori-pRSV-TKCITE-EBNA1-pA és a pLox-ori-pRSV-LacZ-CITEEBNA1-pA vektorok kialakításában.
7. Az RSV LTR promoter klónozását a 2.1. példa 7. lépése szerint végeztük (5. ábra).
8. A pRSV-GalIX vektor BamHI-Stul fragmentumát (3205 bp), amely a LacZ génnek felel meg, melyet egy nukleáris lokalizációs szignál (NLS) előz meg, az előzőleg defoszforilált plC20H vektor Smal és Bglll helyei közé klónoztuk, és így a pICLacZ vektort kaptuk (5. ábra).
9. A pICLacZ vektor Xbal-Nrul fragmentumát (3205 bp) a pLox-ori-pRSV-CITE-EBNA1-pA vektor Xbal és Pvull helyei közé klónoztuk, és így a pLox-oripRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA vektort kaptuk (5. ábra).
3. példa
A rendszer értékelése humán sejtek (Hela-EBNA1;
143B-TK) CMV-CRE (pBS185) és
LoxP-oriP-TK-EBNA1 vagy LoxP-oriP-LacZEBNA1 vektorokkal történő kotranszfekciója útján
3.1. In vitro értékelés
Egy, az EBNA1 gént stabilan kifejező Hela-sejtvonalat a pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1 plazmiddal és egy, a Cre rekombináz génjét a citomegalovíruspromoter irányítása alatt kifejező plazmiddal (pBS185) transzferáltuk. A rekombináció hatékonyságát és a LacZ gén expressziós kazettájának működőképességét a sejtekben lévő, csak a Cre rekombináz jelenlétében megfigyelt β-galaktozidáz-aktivitás alapján becsültük. A kapott eredmények a replikongeneráció hatékonyságát mutatják a Cre rekombináz hatása alatt, melyet a LacZ gén expressziójának aktiválása útján mutattunk ki a LoxP helyek közötti rekombináció és az episzóma kialakulása után. Ezenfelül a kotranszfektált sejtek háromhetes tenyésztése után (hetente egy passzálás, hígítás 1:10) a LacZ gént kifejező sejtek arányának fennmaradását figyeltük meg, míg a LacZ expressziója eltűnt az oriP replikációs origót nem tartalmazó kontrollplazmiddal, ami az oriP működőképes jellegét támasztja alá a konstrukcióban.
Ugyanilyen módon egy TK- sejtvonalat (143TK-) kotranszfektáltunk a LoxP-ori-TK-EBNA1 és a pBS185 plazmidokkal. A transzferált, TK gént kifejező sejteket HAT közegen szelektáltuk. A TK gén expressziójának stabilitását a sejtosztódás során, és így az oriP-EBNA1 rendszer aktivitását immunfluoreszcenciával igazoltuk, egy, a herpeszvírus TK fehérjéjére specifikus monoklonális antitest segítségével. Az episzóma jelenlétét és replikációját a sejtosztódás után Hírt módszerével mutattuk ki, melyet az episzomális DNS PCR-technikával, specifikus primerek segítségével végzett amplifikációja követett.
3.2. In vivő értékelés
A konstrukciók in vivő aktivitását a pLoxP-oriTK-EBNA1 vagy a pLoxP-ori-LacZ-EBNA1 és a pBS185 plazmidok DNS-ének intratumorális injekciójával (elektroporáció) teszteltük Hela- vagy Hela-EBNA1 sejteknek szubkután injektálásával kiváltott tumorokban csupasz egereken. Az ugyanezekkel a plazmidokkal előzetesen kotranszfektált sejtek injektálását párhuzamosan végeztük. A transzgén (TK vagy LacZ) fennmaradását az ezen konstrukciókkal transzdukált tumorokban immunhisztokémiai módszerrel vizsgáltuk, egy replikációs origóval nem rendelkező kontrollplazmidhoz viszonyítva.
4. példa
A rekombinációs rendszer és az episzóma fennmaradásának vizsgálata
4.1. A pCre plazmid kialakítása
A pCre plazmid a Cre rekombináz génjét tartalmazza 5’ irányban fuzionálva az SV40 vírus T-antigénje nukleáris lokalizációs szignáljához, a herpeszvírus timidin-kináz (TK) promoteréből kifejeződve. Egy hasonló konstrukciót hoztunk létre, amely a TK promoter helyett egy tetraciklinnel szabályozható promotert vagy az MMTV promotert hordozza. Másrészt létrehoztunk egy olyan kazettát is, amely egy Cre-ER fúziót hordoz.
4.2. A pRep plazmid kialakítása
A fleomicin rezisztenciagén β-galaktozidáz génnel alkotott fúzióját (Zeo-LacZ), az oriP-t és a citomegalovírus fő korai promoterét az EBNA1 fehérje nélkül tartalmazó replikon plazmidot (pRep) a következők szerint alkottuk meg.
A pRSV-Gal-IX plazmid LacZ gént és az SV40 vírus poliadenilációs szignálját tartalmazó Stul-Clal fragmentumát (1149-4553) a pLox-ori (2. példa, 4. ábra) Clal és EcoRV helyei közé (2029-2032) klónoztuk, és így a pLox-ori-LacZ plazmidot kaptuk.
A pCEP4 Bglll-Bglll fragmentumát (473-1226), amely a CMV korai promoterét tartalmazza, a pLoxori-LacZ BamHI helyeire kiónoztuk, és így a pLX2-t kaptuk.
A LacZ 5’ végét a pLX2-ben (Xbal-Clal fragmentum) a pUT651 plazmid (CAYLA, 1. táblázat) Ncol-Clal
HU 224 175 Β1 fragmentumával helyettesítettük. Hogy a klónozást megkönnyítsük, a fragmentumot előzőleg a plC20RpA plazmid EcoRV és Clal helyei közé szubklónoztuk, majd Xbal-gyel emésztettük, és a pLX2 Xbal és Clal helyei közé klónoztuk.
A kontrollplazmid ugyanazt a szerkezetet tartalmazza, mint a pRep, a replikációs origó (oriP) nélkül.
4.3. A pRep-EBNA1 plazmid kialakítása
Az EBNA1 expresszióját az ECMV IRES-éből lehetővé tevő kazettát hoztunk létre irányított mutagenezissel a pCITE-EBNA1-pA plazmídból, amelyet azután a pAdLX2 (5-2-2) adenovírus ingázó vektorba klónoztunk, és így a pAdLX2-EBNA1-et vagy a pRepEBNA1-et kaptuk. Az IRES-t, valamint az EBNA1 elejét teljes egészében szekvenáltuk. Az EBNA1 az IRES-ből kiinduló expresszióját Western-blottal vizsgáltuk a pRep-EBNA1-gyel transzformált Hela-sejtekben. Kontrollként a pCMV-EBNA1 plazmid szolgált, amelyet a pCITE-EBNA1-pA kialakításához használtunk.
4.4. In vitro értékelés
4.4.1. A rekombináció és az episzomális fennmaradás vizsgálata Hela-EBNA1 sejtekben Első lépésben az EBNA1 fehérjét konstitutívan kifejező Hela-sejtek (Hela-EBNA1) transzfekciós kísérletei egyedül a pRep-pel vagy a pCre-vel azt mutatták, hogy a két plazmid lehetővé tette a replikon kivágódását és a β-galaktozidáz gén expresszójának indukálódását. A replikon plazmiddal egymagában transzfektált kontrollsejtek konstans alapzajt és szinte elhanyagolható β-galaktozidáz-aktivitást mutattak. A transzgén expresszióját a sejtek 24 sejtosztódással egyenértékű, egymást követő, heti két átoltás gyakorisággal egy hónapon keresztül végzett passzálásai során követtük. A pRep+pCre-vel transzfektált sejtekben a β-galaktozidáz expressziója a kísérlet teljes időtartamán át megmaradt, míg az oriP replikációs origót nem hordozó kontrollplazmiddal kotranszfektált sejtekben gyorsan (néhány sejtosztódás után) elveszett.
Egy második lépésben a (pRep+pCre) plazmidokkal kotranszfektált sejteket fleomicin jelenlétében szelektáltuk. Az egyetlen Xhol helynél történt emésztéssel linearizált vagy nem linearizált, majd adott esetben, annak bemutatására, hogy a DNS valóban replikálódott eukarióta sejtekben, Mbol-gyel emésztett episzomális DNS-t Hirt módszerével izoláltuk. Az így kapott minták Southem-blot-vizsgálata lehetővé tette, hogy egy várt méretű replikon jelenlétét mutassuk ki. A sejtenként! kópiaszám becsült értéke 1-10. A szelektált sejteket azután szelekciós nyomás jelenlétében vagy anélkül tartottuk fenn. E vizsgálati körülmények között a β-galaktozidáz-expresszió hasonló mértékű fennmaradását figyeltük meg lassú és konstans csökkenéssel a sejtosztódás során. 27 sejtosztódás után a β-galaktozidáz-aktivitás még detektálható a sejtek 25%-ában közvetlen in vitro festéssel. Az eredmények az episzóma 97%-os szegregációs stabilitásának felelnek meg osztódásonként. Ez egyezésben van a publikált eredményekkel, melyek szerint osztódásonként 1-5%-os veszteséget mutattak ki [Simpson et al., (1996)].
4.4.2. Az EBNA1 működőképességének vizsgálata
Hela-sejtekben
Hela-sejtek pRep-EBNA1-gyel és pCre-vel történt kotranszfekciós kísérletei lehetővé tették, hogy vizsgáljuk, hogy az EBNA1 megfelelően fejeződik-e ki az IRES-ből kiindulva, és biztosítja-e a β-galaktozidáz expressziójának fennmaradását az egymást követő passzálások során. Kontrollként ugyanezekkel a plazmidokkal transzfektált Hela-EBNA1 sejtek szolgáltak.
4.5. In vivő értékelés csupasz egereknél indukált tumormodellen
A Hela- és Hela-EBNA1 sejtek tumort okoznak csupasz egérnél, 106 sejt szubkután injektálása kimutatható tumor kialakulását váltja ki nyolc napon belül, amely nagyon gyorsan növekszik, és egy hónapig követhető. Egy első kísérletben pRep és pCre plazmidokkal transzfektált, majd in vitro fleomicin jelenlétében szelektált Hela-EBNA1 sejteket injektáltunk. A tumorok vizsgálata (3 cm átmérő) 21 nap múlva X-gal festés után azt mutatja, hogy a replikon ebben a modellben in vivő fennmarad.
Egy második kísérletben pRep plazmiddal transzfektált, majd Ad-Cre vektorral (vö. 5.2. példa) fertőzött Hela-EBNA1 sejteket injektáltunk. Kontrollként két pRep-ből származó, rekombináció hiányában a LacZ expresszióját lehetővé tevő, oriP-t hordozó vagy nem hordozó plazmiddal transzfektált sejtek szolgáltak. A tumor 21. napon történő vizsgálata kimutatta, hogy a harmadik generációs Cre adenovírus lehetővé teszi a replikon kivágódását, és hogy jelenléte nem változtatja meg sem a sejtek életképességét, sem az episzóma kialakításának előző lépéseit. Meg kell jegyezni, hogy nem volt megfigyelhető β-galaktozidáz-aktivitás az oriP-t nem hordozó kontrollplazmiddal. Az eredmények világosan mutatják, hogy a találmány szerinti konstrukciók működőképesek in vivő tumoros sejtekben, és 21 nap elteltével az episzómák stabilak.
5. példa
Első generációs és harmadik generációs rekombináns adenovirusok kialakítása A példa a találmány szerinti vírusvektorok kialakítását írja le, melyek tartalmaznak egy olyan területet, amely helyspecifikus rekombináció útján cirkuláris replikatív molekulát tud létrehozni in vivő. A vírusvektorok tartalmaznak ezenkívül egy, a rekombinációt lehetővé tevő rekombinázt kódoló szekvenciát is.
5.1. Első generációs adenovírus kialakítása (a pBS185, pLoxP-oríP-TK-EBNA1 és a pLoxP-oríP-LacZ-EBNA 1 plazmidokból)
A Cre rekombináz expressziós kazettáját és a replikon teljes, a LoxP helyeket is tartalmazó szekvenciáját a pBS185 és a pLox-oríP-TK-EBNA1 vagy pLoxPoriP-LacZ-EBNA1 vektorokból kiindulva az E1 régió egészének vagy egy részének delécióját tartalmazó adenovírusvektorok (Add11327; ΔΕ1-ΔΕ3) E1 területére klónoztuk. A rekombináns adenovírusokat 293 sejtekben a homológ rekombináció klasszikus technikáival izoláltuk. A vírusvektorokat kettős rekombinációval is kialakíthatjuk E. coliban az Adeno5 ΔΕ1 ΔΕ3 genom11
HU 224 175 Β1 ját tartalmazó plazmidok segítségével, ekkor a vírusgenom azután egy megfelelő sejtvonalban pakolódik adenovírusrészecskébe. A vektorok korlátozott klónozási kapacitása miatt a LacZ gént előnyösen egy kisebb markergénnel helyettesítjük.
5.2. Harmadik generációs adenovírus kialakítása
A harmadik generációs adenovírusok alkalmazása bizonyos előnyökkel rendelkezik az első generációs adenovírusokhoz képest; nemcsak az ártalmatlanság területén, hanem a gyulladásos válasz csökkenésének és a transzgénexpresszió stabilitásának területén is. Ezek a vektorok ezenkívül megnövekedett klónozási kapacitással rendelkeznek, és nincs közvetlen in vitro és in vivő citopátiás hatásuk.
Harmadik generációs vektorokat (Ad11007; ΔΕ1 ΔΕ3 ΔΕ4) klasszikus homológ rekombinációs eljárásokkal is előállíthatunk megfelelő pakolósejtekben [WO 96/22378], vagy kettős rekombinációval E. coliban, majd pakolással.
A két adenovírust kettős rekombinációval állítottuk elő a pXL2811 (pRSV-pGal-AE1 .ΔΕ3.ΔΕ4dl1007-Sspl) és pXL2789 (pdE1 ,ΔΕ3,ΔΕ4-όΙ1007Sspl) harmadik generációs adenovírusgenomot és a (Kana-SacB) pMA37 vagy pXL3048 öngyilkos plazmidokat tartalmazó E. coli váz segítségével, mely utóbbiak arra szolgálnak, hogy az E1 régiót a korábbiakban leírt stratégia szerint módosítsák [Crouzer et al., PNAS 94, 1414 (1997); WO 96/25506].
5.2.1. Cre adenovírus (Ad-Cre) előállítása
A pMC-Cre plazmid (1. táblázat) Xhol-BamHI fragmentumát (451-2057) Klenow-val helyreállítottuk, és a pMA37 öngyilkos plazmid EcoRV helyére klónoztuk.
A pXL2811 plazmiddal történt kettős rekombinációval kapott adenovírus genomját Paci-emésztéssel linearizáltuk, és IGPR2 sejtekbe [WO 96/22378] transzfektáltuk Lipofectamine (Gibco) segítségével. Az így termelt Ad-Cre 3.0-t ugyanilyen sejtekben amplifikáltuk, majd a klasszikus technikák szerint (cézium-klorid) vagy kromatográfiával [FR 96/08164] tisztítottuk.
A Cre adenovírus genomjának szerkezetét enzimes emésztéssel igazoltuk.
5.2.2. Rep adenovírus (Ad-Rep) előállítása
A pLX2 plazmidot BamHI-gyel emésztettük, majd újra ligáltuk, hogy a LacZ gén 5' végén elhelyezkedő SV40 poliadenilációs szignált eltávolítsuk. A kapott plazmid Notl-Notl fragmentumát (1-6145) Klenow-val helyreállítottuk, majd az előzőleg BamHI-gyel és Sallgyel emésztett, Klenow-val helyreállított, majd a két hely eltávolítása végett újra ligáit pXL3048 öngyilkos vektor EcoRV helyére klónoztuk, és így a pAdLX2 plazmidot kaptuk. A mutagenizált pCITE-EBNA1-pA plazmid Shol-Sall fragmentumát (441-3457) az előzőleg kapott pAdLX2 plazmid Xhol helyére klónoztuk, és így a pAdLX2-EBNA1 (pRep-EBNA1) plazmidot kaptuk.
Az Ad-Rep-et a pAdLX2-EBNA1 és a pXL2789 rekombinációjával kaptuk, az Ad-Cre esetében korábban leírt eljárás szerint.
5.2.3. A Rep/Cre adenovírus előállítása (6. ábra)
A replikont és a Cre rekombináz génjét együtt tartalmazó Rep-Cre adenovírust is előállítottuk. Ez a stratégia lehetővé teszi, hogy megnöveljük a replikon átvitelének hatékonyságát, különösen in vivő. A Cre expressziós kazettáját az adenovírus genomjába az E1, E3 vagy E4 régiókba építettük be. A rekombináz teljes mértékben szabályozott kifejeződését kívántuk elérni, hogy megakadályozzuk a replikon kivágódását az adenovírus genomjából IGPR2 sejtekben történő terjedése során.
A rekombináz expressziójának transzkripciószintjén (in vivő aktivált szövetspecifikus promoter vagy indukálható promoter) vagy poszttranszkripciós szinten (a Cre fúziója szteroidhormon receptorok kötődoménjével, Cre-ER) történő szabályozását képzeltük el.
Ilyen adenovírusok kialakításához a replikont a pXL2789 plazmidba vezettük be, amint azt az előző példában leírtuk. A tét vagy MMTV promotert hordozó Cre expressziós kazettát vagy egy Cre-ER fúziót kettős homológ rekombinációval vezettük be az említett plazmidba E. colinál, és így a pRep-Cre1-et (Rep és Cre az E1-ben) és a pRep-Cre2-t (Rep az E1-ben, cre az E4ben) kaptuk. Ezeket a plazmidokat azután Pacl-gyel kezeltük, hogy a rekombináns vírusgenomot kivonjuk, melyet IGPR2 sejtekbe vezettünk be, a megfelelő vírus termeléséhez.
5.2.4. A Rep/Psi adenovírus előállítása (7. ábra)
Ez a konstrukció előnyösen lehetővé teszi, hogy elkerüljük az Ad-Rep-Cre szennyeződését olyan adenovírusokkal, melyekből a replikon deletált, abban az esetben, ha a Cre-aktivitás teljes szabályozottságát nem sikerül elérni. A stratégia a Psi részecskeképződési jel replikonba történő beépítésén alapul. A pXL3048 vektort irányított mutagenezissel módosítottuk az ITR régió területén, hogy a részecskeképző jelet deletáljuk, és bevezessünk egy LoxP helyet, és így a pXL3048-APsi-LoxP plazmidot kaptuk. A „bal LoxP” helyről deletált replikon szekvenciáját enzimatikus emésztéssel izoláltuk a pAdLX2 vagy a pAdLX2-EBNA1 plazmidokból, és a pXL3048-APsi-LoxP plazmid EcoRV helyére klónoztuk.
6. példa
A rendszer értékelése a két rekombináns adenovlrus koinfekciójával
A találmány szerinti vírusvektorok működőképességét in vitro és in vivő ellenőriztük.
6.1. In vitro értékelés, különböző sejtvonalak fertőzésével
A Cre adenovírus rekombinázaktivitását in vitro, pRep-pel transzfektált Hela-EBNA1 sejtekben, valamint egy egér embrionális sejtvonalban (LoxP-pGal) mutattuk ki, mely utóbbiban a lacZ expressziója két loxP hely közötti rekombinációval aktiválható.
A replikon adenovírusgenomból történő kivágódásának hatékonyságát Ad-Rep és Ad-Cre adenovírusokkal fertőzött IGPR2 sejtekben vizsgáltuk.
A Hírt módszerével izolált és Xhol-gyel emésztett vírus-DNS közvetlen vizsgálata a nem kivágódott replikonnak megfelelő fragmentum teljes eltűnését mutatta ki az Ad-Rep genomjából, ami a két LoxP hely közötti rekombináció hatékonyságát mutatja. Ugyanazon minták Southern-vizsgálata lehetővé tette, hogy egy
HU 224 175 Β1
9,2 kb-os, a replikonnak megfelelő fragmentumot mutassunk ki.
Az Ad-Rep és Ad-Cre adenovírusokkal fertőzött Hela-sejtekben 48 óra elteltével a sejtek 50%-ában figyeltünk meg β-galaktozidáz-aktivitást, míg az Ad-Rep 5 adenovírussal egymagában fertőzött sejtekben nem volt kimutatható β-galaktozidáz-aktivitás. 96 óra elteltével a lacZ-t kifejező sejtek száma a sejtosztódással növekedett. A sejtek átoltása után a lacZ expressziója még legalább a fertőzés utáni 20. napig fennmaradt. 10 Az eredmények azt mutatják, hogy (i) a replikon képes hatékonyan szállítódni a sejtbe a két adenovírus koinfekciójával, (ii) a rekombináció felszabadítja a replikont, és aktiválja a transzgén expresszióját, és hogy (iii) a replikon lehetővé teszi, hogy a transzgén stabil expresszióját biztosítsuk a sejtosztódás során.
6.2. In vivő értékelés
Az in vivő értékelést előzőleg az Ad-Rep és Ad-Cre adenovírusokkal fertőzött normál [keratinociták, hematopoetikus sejttörzsek (CD34+), bronchikus epiteliális sejttörzsek, mioblasztok stb.] vagy rákos (MDA, HT29 stb.) humán sejtek csupasz egerekbe történő átvitelével végeztük.
A transzgén expresszójának és az episzóma stabilitásának igazolását a sejtosztódás során az előzőleg leírt módszerekkel végeztük.
1. táblázat
Az episzóma kialakításához alkalmazott szekvenciák eredete
Szekvencia Fragmentum Méret (bp) Eredet
LoxP Notl (1-296) 34 pBS246 (Gibco-BRL)
RSV LTR BamHI-Sall (478-1080) 602 pRSV-TK [WO 95/14101]
oriP EcoRI-Hpal (5052-3235) 1817 pSLori [WO 95/14101]
SV40 poliA BamHI-Sall (406-7) 399 pCEP-4 (In Vitrogen)
EBNA1 BamHI-Pstl (759-2803) 2044 pCMV-EBNA (Clontech)
IRES (16-518) 502 pCITE 2a (Novagen)
TK Clal-Bsawl (1721-556) 1165 pCMV-TK-EI [Gene Therapy 3, 315(1996)]
plC19H 2700 Marsh et al., Gene 32, 481 (1984)
plC20H 2700
plC20R 2700
pBluescriptII-KS 2850 (Stratagene)
hCMV Bglll-Bglll (473-1226) 753 pCEP4 (In Vitrogen)
LacZ Stul-BamHI (1149-4354) 3205 pRSVGalIX [L. Stratford-Perricaudet, J. Clin. Invest, 626 (1992)]
hCMV-Cre-MTpA Hindlll-Hindlll (0-3400) 3400 pBS185 (Gibco-BRL)
Zeo-Lac Ncol-Clal (750-1980) 1230 pUT641 (Cayla)
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) Általános információk:
(i) Bejelentő:
(A) Név: Rhone Poulenc Rorer SA (B) Utca: Áron Raymond avenue 20 (C) Helység: Antony (E) Ország: Franciaország (F) Irányítószám: 920165 (ii) Bejelentés címe: Replikálódó molekulák in vivő előállítása (iii) Szekvenciák száma: 3 (iv) Rögzítési adatok:
(A) Hordozó típusa: floppy disk (B) Rendszer: IBM PC kompatibilis (C) Rögzítés módja: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentln Release 1.0, Version 1.30 (OEB)
HU 224 175 Β1 (2) Információk az 1. számú szekvenciához:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 26 bázispár (B) Típusa: nukleotid (C) Szál típusa: egyszálú (D) Konfiguráció: lineáris (ii) Molekula típusa: cDNS (xi) Szekvencia leírása: 1. számú szekvencia
GGCCTCTAGA CAGCTGGTTA TTTTCC (2) Információk a 2. számú szekvenciához:
(i) A szekvencia jellemzői:
(E) Hossza: 23 bázispár (F) Típusa: nukleotid (G) Szál típusa: egyszálú (H) Konfiguráció: lineáris (ii) Molekula típusa: cDNS (xi) Szekvencia leírása: 2. számú szekvencia
GGCCGGATCC CATATTATCA TCG (2) Információk a 3. számú szekvenciához:
(i) A szekvencia jellemzői:
(I) Hossza: 147 bázispár (J) Típusa: nukleotid (K) Szál típusa: kétszálú (L) Konfiguráció: lineáris (ii) Molekula típusa: cDNS (xi) Szekvencia leírása: 3. számú szekvencia CAGCTGGACG TCGGTTCGAA CCGACCTGCA TTTGAGGAGA AGTCTGGATT ATTGAAGCAT ATCGTATGTA ATATGCTTCA ATATAATTCC CAAGGCCTAG TAGCGCTCGA GCTCTAGATC TATAGCTAAC GGAGGTGGTA CCGAAGC

Claims (25)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Vírusvektor, amely tartalmaz egy DNS-régiót, 40 melyet két, helyspecifikus rekombinációt biztosító, direkt orientációban elhelyezkedő szekvencia határol, ahol az említett DNS-régió egymás után tartalmaz egy emlőssejtekben működőképes promotert, Epstein-Barr-vírus (EBV) oriP replikációs origót, egy kívánt 45 gént és attól az encefalomiokarditisz vírus (ECMV) belső riboszóma belépési hely (IRES) szekvenciával elválasztott EBNA1 fehérjét kódoló gént, ahol a promoter direkt orientációban helyezkedik el a replikációs origóhoz és az említett génekhez képest, miáltal ezek inakti- 50 vált formában vannak, és a promoter és az említett gének kapcsolata csak a helyspecifikus rekombináció eredményeként válik működőképessé.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a kívánt gén expressziója a helyspecifikus rekombináció 55 eredményétől függ.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a helyspecifikus rekombinációt biztosító szekvenciák egy rekombináz jelenlétében specifikusan rekombinálódni képes szekvenciák. 60
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor, amelyben a helyspecifikus rekombinációt biztosító szekvenciák egy bakteriofágból származnak.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a helyspecifikus rekombinációt biztosító szekvenciák P1 bakteriofágból származnak.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a helyspecifikus rekombinációt biztosító szekvenciák a P1 fág inverz ismétlődő szekvenciái (LoxP területek), melyek rekombinációját a Cre rekombináz indukálja.
  7. 7. A 3. igénypont szerinti vírusvektor, amely tartalmazza a megfelelő rekombinázt kódoló gént is a két, helyspecifikus rekombinációt biztosító szekvencia által határolt DNS-régión kívül.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a rekombinázt kódoló gén egy indukálható promoter irányítása alatt áll.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben az indukálható promoter a dexametazonnal indukálható MMTV promoter vagy egy tetraciklinnel indukálható promoter.
  10. 10. A 8. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a rekombinázt kódoló gén tartalmaz egy szabályozóele14
    HU 224 175 Β1 met is, amely egy hormonreceptor kötődoménjét kódolja.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben a hormonreceptort a glükortikoid-, mineralokortikoid-, tiroid-, ösztrogén-, aldoszteron- és retinsavreceptorok közül választjuk ki.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor, amelyben a DNS-régió tartalmaz egy vírusenkapszidációs régiót.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor, amelyben a vektor egy replikációhiányos rekombináns adenovírus.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben az adenovírus az E1 régió egészében vagy egy részében deléciót hordoz.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti vírusvektor, amelyben az adenovírus továbbá az E4 régió egészében vagy egy részében deléciót hordoz.
  16. 16. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor, amelyben a vektor egy hiányos retrovírus.
  17. 17. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor, amelyben a vektor egy hiányos rekombináns AAV.
  18. 18. Egy sejt, amely az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektort tartalmazza.
  19. 19. A18. igénypont szerinti sejt, amely egy eukarióta sejt.
  20. 20. Gyógyszerkészítmény, amely egy 1-17. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektort vagy egy 18. igénypont szerinti sejtet tartalmaz.
  21. 21. Eljárás cirkuláris replikatív DNS-molekulák in vitro vagy ex vivő in situ előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti vírusvektort tartalmazó sejtek populációját egy rekombinázzal hozzuk érintkezésbe olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik az in situ helyspecifikus rekombinációt.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érintkezésbe hozást a sejteknek a rekombinázt kódoló gént tartalmazó plazmiddal vagy vírusvektorral történő transzfekciójával vagy fertőzésével végezzük.
  23. 23. Eljárás cirkuláris replikatív DNS-molekulák in vitro vagy ex vivő in situ előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) sejteket transzformálunk egy 3. igénypont szerinti vírusvektorral, amely tartalmaz egy rekombinázt kódoló gént is egy indukálható promoter kontrollja alatt; és (ii) indukáljuk a rekombináz expresszióját.
  24. 24. Egy 1-17. igénypontok bármelyike szerinti vírusvektor alkalmazása replikatív DNS cirkuláris molekulák in situ létrehozására.
  25. 25. Eljárás nukleinsavak sejtbe való átvitelére, azzal jellemezve, hogy (i) sejteket transzformálunk egy 3. igénypont szerinti vírusvektorral, amely tartalmaz egy rekombinázt kódoló gént is egy indukálható promoter kontrollja alatt; és (ii) indukáljuk a rekombináz expresszióját.
HU9902585A 1996-06-12 1997-05-23 Vírus vektorok cirkuláris, replikálódó DNS molekulák in situ előállítására HU224175B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9607273A FR2749857B1 (fr) 1996-06-12 1996-06-12 Generation de molecules replicatives in vivo
PCT/FR1997/000914 WO1997047757A1 (fr) 1996-06-12 1997-05-23 Generation de molecules replicatives in vivo

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9902585A2 HUP9902585A2 (hu) 1999-11-29
HUP9902585A3 HUP9902585A3 (en) 2001-11-28
HU224175B1 true HU224175B1 (hu) 2005-06-28

Family

ID=9492965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9902585A HU224175B1 (hu) 1996-06-12 1997-05-23 Vírus vektorok cirkuláris, replikálódó DNS molekulák in situ előállítására

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6630322B1 (hu)
EP (1) EP0906443B1 (hu)
JP (1) JP2000511779A (hu)
AT (1) ATE301721T1 (hu)
AU (1) AU726442B2 (hu)
BR (1) BR9709700A (hu)
CA (1) CA2257916A1 (hu)
CZ (1) CZ296600B6 (hu)
DE (1) DE69733948T2 (hu)
DK (1) DK0906443T3 (hu)
ES (1) ES2248849T3 (hu)
FR (1) FR2749857B1 (hu)
HU (1) HU224175B1 (hu)
IL (1) IL127430A0 (hu)
NO (1) NO985739D0 (hu)
SK (1) SK169898A3 (hu)
WO (1) WO1997047757A1 (hu)
ZA (1) ZA975134B (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2720756B1 (fr) * 1994-06-02 1996-07-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2799472B1 (fr) 1999-10-07 2004-07-16 Aventis Pharma Sa Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales
AU2001288839A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-22 The General Hospital Corporation Self-rearranging dna vectors
AU2002325346A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Aventis Pharma S.A. Method of administration of a gene of interest to the heart and vasculature
US7164056B2 (en) 2002-05-03 2007-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene targeting using replicating DNA molecules
WO2011071476A2 (en) * 2008-11-14 2011-06-16 Life Technologies Corporation Compositions and methods for engineering cells

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665543A (en) * 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
DE4228458A1 (de) * 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
US5834256A (en) * 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US6120764A (en) * 1993-06-24 2000-09-19 Advec, Inc. Adenoviruses for control of gene expression
EP0632054A1 (en) * 1993-06-28 1995-01-04 European Molecular Biology Laboratory Regulation of site-specific recombination by site-specific recombinase/nuclear receptor fusion proteins
JP4216350B2 (ja) * 1994-09-19 2009-01-28 大日本住友製薬株式会社 動物細胞感染用の組換えｄｎａウイルスベクター
US5801030A (en) * 1995-09-01 1998-09-01 Genvec, Inc. Methods and vectors for site-specific recombination
EP0927263A1 (en) * 1996-01-05 1999-07-07 Genetic Therapy, Inc. Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
ZA975134B (en) 1997-12-31
NO985739L (no) 1998-12-08
AU726442B2 (en) 2000-11-09
HUP9902585A2 (hu) 1999-11-29
DE69733948T2 (de) 2006-06-08
NO985739D0 (no) 1998-12-08
HUP9902585A3 (en) 2001-11-28
SK169898A3 (en) 1999-07-12
CA2257916A1 (fr) 1997-12-18
IL127430A0 (en) 1999-10-28
WO1997047757A1 (fr) 1997-12-18
EP0906443B1 (fr) 2005-08-10
FR2749857A1 (fr) 1997-12-19
AU3037797A (en) 1998-01-07
ATE301721T1 (de) 2005-08-15
BR9709700A (pt) 1999-08-10
ES2248849T3 (es) 2006-03-16
US6630322B1 (en) 2003-10-07
DE69733948D1 (de) 2005-09-15
FR2749857B1 (fr) 1998-08-14
CZ296600B6 (cs) 2006-04-12
DK0906443T3 (da) 2005-12-19
CZ402398A3 (cs) 1999-03-17
EP0906443A1 (fr) 1999-04-07
JP2000511779A (ja) 2000-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6156497A (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors
Ghattas et al. The encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site allows efficient coexpression of two genes from a recombinant provirus in cultured cells and in embryos
WO1997025446A9 (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors
JPH09509578A (ja) 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用
US6872528B2 (en) Highly productive packaging lines
HU224713B1 (en) Method for producing recombinant virus
WO1995026411A2 (en) Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US6806080B2 (en) Hybrid vectors for gene therapy
US7179646B2 (en) Gene expression using T cell factor responsive element
US20070166286A1 (en) Self-rearranging DNA vectors
Boulikas Status of gene therapy in 1997: molecular mechanisms, disease targets, and clinical applications
US7094398B1 (en) Recombinant adenoviral vectors expressing chimeric fiber proteins for cell specific infection and genome integration
HU224175B1 (hu) Vírus vektorok cirkuláris, replikálódó DNS molekulák in situ előállítására
US6783977B1 (en) Internal ribosome entry site and vector containing same
JP2002543792A (ja) ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込み
US20020144302A1 (en) Novel constructs and vectors for the targeted and inducible expression of genes
JP2003519464A (ja) 代替の血清型のヘルパー依存型アデノウィルスベクターを使用することにより反復ベクター投与が可能になる
KR100537142B1 (ko) 복제성분자의 생체내 제조방법
MXPA98009881A (en) Generation of v replication molecules
Strayer et al. Virus-based vectors for gene expression in mammalian cells: SV40
AU3345801A (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050421

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees