SK169898A3 - Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector - Google Patents

Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector Download PDF

Info

Publication number
SK169898A3
SK169898A3 SK1698-98A SK169898A SK169898A3 SK 169898 A3 SK169898 A3 SK 169898A3 SK 169898 A SK169898 A SK 169898A SK 169898 A3 SK169898 A3 SK 169898A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
viral vector
gene
recombinase
site
sequences
Prior art date
Application number
SK1698-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Michel Perricaudet
Patrice Yeh
Helene Leblois-Prehaud
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of SK169898A3 publication Critical patent/SK169898A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/11043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka molekúl kruhovej a replikatívnej DNA použitelnej v génovej terapii. Vynález tiež opisuje metódu účinnú predovšetkým na ich tvorbu in situ zo zodpovedajúceho vírusového vektora.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v oprave zníženia schopnosti alebo anomálie (mutácia, aberantná expresia, atď.) vložením genetickej informácie do bunky alebo do postihnutého orgánu.
Táto informácia sa môže vložiť buď in vitro do bunkového extraktu orgánu a potom sa môže modifikovaná bunka znova vložiť do orgánu, alebo sa informácia môže vložiť in vivo priamo do postihnutého tkaniva. V druhom prípade sa vytvorili rôzne techniky transfekcie zahrňujúce vektory rôzneho pôvodu. Ide predovšetkým o chemické vektory alebo biochemické, prírodné alebo syntetické na jednej strane, alebo sa môžu uviesť vírusové vektory na strane druhej. Čo sa týka vírusových vektorov, môžu sa uviesť komplexy DNA a DEAE-dextránu (Pagano a kol., J. Virol. (1967) 891), DNA a nukleových proteínov (Kaneda a kol., Science 243 (1989), 375), DNA a lipidy (Felgner a kol., PNAS 84 (1987), 7413), lipozómy (Fraley a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atď. Ich použitie zahrňuje predovšetkým možnosť produkovať významné množstvo farmaceutický čistej DNA.
Vírusové vektory (retrovírus, adenovírus, vírus adenoasociovaný, . . .) sú velmi účinné v porovnaní s už skôr opísanými chemickými alebo biochemickými vektormi, predovšetkým čo sa týka prechodu cez membrány. Z týchto vírusov majú predovšetkým adenovírusy významné vlastnosti na použitie v génovej terapii. Majú dosť široké hostiteľské spektrum a sú schopné transdukovať bunku vo fáze delenia genóm adenovírusu v extrachromozómovej forme a nespôsobujú významné patológie u ludi. Ale použitie retrovirusov, ktorých genóm sa náhodne začleňuje do genómu infikovanej bunky, je obmedzené bunkami vo fáze delenia. Adenovirusy sa tiež použili na prenos génov záujmu do svalových buniek (svalové bunky; Ragot a kol., Náture 361 (1993) 647), pečeňových (Jaffe a kol., Náture Genetics 1 (1992) 372), nervových (Akli a kol., Náture Genetics 3 (1993) 224), epitelových bronchiálnych (Rosenfeld a kol., 1992), atď. Avšak v rýchle obnovovanom tkanivu sa pozorovala postupná strata expresie transgénu vplyvom riedenia počas bunkového delenia.
Zlepšenie adenovirusových vektorov a vývoj nových generácií vektorov znížilo potenciálne nebezpečenstvo zvyškovej patogénnej schopnosti rovnako ako imunogénnu schopnosť spojenú s replikáciou vektora, rekombináciou jeho genómu a expresiou vírusových proteínov.
minimálne sekvencii vírusu v infikovanej
Aby sa čo najviac predišlo týmto nebezpečenstvám, modifikovali sa navrhnuté konštrukcie vírusových vektorov tak, aby neobsahovali uvedené vektory neschopné autonómne sa replikovať v cieľovej bunke. Sú to tzv. defektné vírusy. Genóm defektného vírusu sa teda zbavil nevyhnutných pre replikáciu uvedeného bunke. Tiež v tomto prípade adenovírusov odborníkmi opísané konštrukcie sú adenovirusy s deléciami v oblastiach El a prípadne E3 na úrovni, do ktorej sú vložené sekvencie heterologickej DNA (Levrero a kol., Gene 101; Gosh-Choudhury a kol., Gene 50 (1986) 161). Iné konštrukcie obsahujú deléciu na úrovni oblasti El a deléciu neesenciálnej časti oblasti E4 (WO94/12649), alebo modifikované genómové organizácie (FR 94 13355).
Napriek tomu zostáva počas produkcie vírusových vektorov nebezpečenstvo rekombinácie, ktoré vytvárajú vírusové replikatívne alebo transkomplementárne častice in vivo bunkovými funkciami typu El. Je jasné, že použitie takto kontaminovaných vektorov v génovej terapii môže mať velmi nežiaduce následky, ako je napríklad vyvolanie propagácie vírusu a vyvolanie nekontrolovaného roznášania s nebezpečenstvom zápalovej reakcie a imunitnej odpovede riadenej proti vírusovým proteínom, atď.
Zvýšenie stability expresie transgénu v transdukovaných bunkách s adenovírusovým vektorom, predovšetkým v bunkách vo fáze delenia ostáva dôležitý problém. V génovej terapii existuje teraz reálna potreba transportných vektorov, ktoré majú výhody skôr opísaných vektorov, ako sú dobré transfekčné vlastnosti, napríklad vlastnosti vírusových vektorov a predovšetkým vlastnosti adenovírusov a prejavuje sa úplná neškodnosť predovšetkým neprítomnosťou replikatívnych vírusových častíc, nebezpečenstvo neexistujúce s plazmidmi alebo nevírusovými vektormi.
Podstata vynálezu
Predložený vynález spočíva predovšetkým vo vytvorení in situ molekúl kruhovej replikatívnej a terapeutickej DNA pomocou vírusového vektora, výhodnej z hľadiska stability expresie transgénu a neškodnosti. Majú odstránené všetky sekvencie vírusového genómu schopné indukovať imunitnú odpoveď zápalového typu ako špecifickú odpoveď riadenú proti vírusovým proteínom, ktoré môžu mať zhubný účinok na organizmus a môžu obmedziť dĺžku expresie transgénu.
Predložený vynález má teda ako predmet molekuly kruhovej a replikatívnej DNA, ktoré obsahujú aspoň:
(i) jeden alebo viac génov záujmu so sekvenciami nevyhnutnými pre ich replikáciu (ii) počiatok replikácie funkčný v cicavčích bunkách a (iii) výslednú sekvenciu miestne špecifickej rekombinácie medzi dvoma sekvenciami pre rekombinázu.
Predložený vynález spočíva predovšetkým v spresnení metódy a špecifických konštrukcií účinných predovšetkým na tvorbu molekúl terapeutickej DNA. Postup pódia vynálezu spočíva vo vytvorení už skôr definovaných molekúl terapeutickej DNA z vírusového vektora.
Predkladáte! neočakávane dokázal, že je možné vytvoriť in situ z vírusového vektora a miestne špecifickou rekombináciou molekulu kruhovej DNA terapeutického a replikatívneho charakteru. Vo výhodnom spôsobe uskutočnenia transgén a počiatok replikácie nie sú aktívne vo vírusovom vektore, ich aktivita je závislá na výsledku miestne špecifickej rekombinácie. Ešte výhodnejšie výsledok rekombinácie je podmienečne vyvolaný expresiou rekombinázy, čo umožňuje vysokú úroveň riadenia expresie génu záujmu a replikáciu epizomálnych molekúl produktov.
Takýto protokol je predovšetkým výhodný z terapeutického hľadiska:
-vyberá dobré transfekčné schopnosti vyjadrené všeobecne vírusovými vektormi porovnateľnými s nevírusovými vektormi,
-výrazne znižuje nebezpečenstvo vírusovej kontaminácie, miestne zápalovej reakcie, rovnako aj antivírusovú imunitnú odpoveď, čo spôsobuje malé množstvo dokázaných vírusových vektorov. Vírusový vektor je vložený len v nevyhnutnom množstve na vytvorenie molekuly terapeutickej DNA,
-umožňuje rozšíriť aplikačnú oblasť určitých vírusových vektorov: adenovírusove sú limitované aplikáciami v proliferatívnych bunkách takých ako sú bunky' hematopoetického kmeňa. Predložený vynález umožňuje využiť ich infekčnú schopnosť na vytvorenie stabilnej kruhovej replikatívnej molekuly v proliferatívnych bunkách.
Taká molekula DNA, ktorá je nárokovaná, má teda schopnosť účinne zaistiť prenos do buniek alebo do terapeutického génu alebo terapeutických génov, ktoré obsahuje.
Preto obsahuje počiatok replikácie vyznačený predovšetkým tým, že je funkčný v cicavčích a ľudských bunkách. Použitý počiatok replikácie je výhodne podmienečný počiatok replikácie, to znamená počiatok replikácie ktorého aktivita sa môže regulovať. Počiatok replikácie je ešte výhodnejšie rozložený takým spôsobom, že je inaktívny vo vírusovom vektore a aktívny po miestne špecifickej rekombinácii.
Použitý počiatok replikácie je výhodne eukaryotického, vírusového alebo cicavčieho pôvodu.
Uprednostňovaný príklad počiatku replikácie, ktorý je možné uviesť v rámci predloženého vynálezu, je konkrétne počiatok replikácie vírusu Epstein-Barrovej (EBV). Vírus EBV patrí k rodine Herpesviridae. Jeho počiatok replikácie obsahuje dva elementy: sekvenciu oriP (1,7 kb) zodpovednú za replikáciu, ktorej aktivita je indukovaná proteínom kódovaným génom EBNA1. Táto sekvencia sa môže niesť v trans. Tieto elementy umožňujú v nich samotných zároveň replikáciu, epizomálne správanie a segregáciu 5 až 20 kópií plazmidového vektora na bunku. Sekvencia oriP je tvorená opakovaním dvadsiatich motívov s dĺžkou 30 bp, oddelených s 960 bp veľkým počiatkom replikácie, ktorý je tvorený motívom obrátenej repetície 65 bp a obsahuje 4 úplné kópie motívu 30 bp. Proteín EBNA1 sa viaže na motívy 30 bp na úrovni počiatku replikácie a umožňuje získanie bunkových faktorov v momente fázy S a replikácie, synchrónnej s bunkovým delením plazmidu, ktorý má sekvenciu oriP v cis. Konkrétne EBNA1 pravdepodobne súčasnou fixáciou na úrovni opakovaných motívov z chromozómových štruktúr umožňuje intracelulárne vlastnosti a segregáciu epizómu v momente bunkového delenia. Plazmidy obsahujúce počiatok replikácie oriP genómu EBV a umožňujúce expresiu vírusového proteínu EBNA1 (641 aminokyselín) sú uschovávané stabilne epizomálne v ľudských transfekovaných bunkách a ich replikácia je synchrónna s bunkovým delením (Lupton a Levine, 1985).
Počiatok replikácie sa môže tiež odvodiť z papilomavírusu. Papilomavírusy používajú systém vírusovej latencie so zachovávaním epizómu analogického vírusu Epstein-Barrovej (EBV). Tento systém sa študoval konkrétne pre hovädzí papilomavírus typ 1 (BPV-1). Počiatok replikácie BPV je aktívny v prítomnosti proteínov El a E2. Ako v prípade EBV, epizomálne správanie je nezávislé na replikácii a je zaistené fixáciou E2 na úrovni sekvencie MME (minichromosome maintenance element), ale vyžaduje tiež prítomnosť El. Naopak v rozpore so systémom oriP/EBNAl, EBV replikácia epizómu nie je synchrónna s bunkovým delením (Piirso a kol., 1996).
Počiatok replikácie sa môže tiež tvoriť schopnými replikácie sequences). ARS sa predovšetkým ľudských (autonomously z cicavčích Konkrétne sa sekvenciami replicating chromozómov, môže uviesť alebo ARS izolovali a myšacích.
sekvencia ARS umiestnená proti smeru lokusu c-myc u ľudí (Ariga a kol., 1988) a fragment 4 kb lokusu génu adenozíndeaminázy z myši (Virta-Pearlman a kol., 1993).
Čo sa týka génu záujmu, môže ísť jednak o terapeutický, vakcinálny, agronomický alebo veterinárny gén. Obsahuje tiež oblasť promótora transkripcie funkčného v bunke alebo v cielovom organizme, rovnako ako oblasť umiestnenú na 3' konci, ktorá špecifikuje terminačný signál transkripcie a polyadenylácie. Čo sa týka oblasti promótora, môže ísť o oblasť promótora prirodzene zodpovednú za expresiu požadovaného génu, keď táto je schopná fungovať v bunke alebo určitom organizme. Môže tiež ísť o oblasti iného pôvodu (zodpovedných za expresiu iných proteínov alebo rovnakých syntetických) . Konkrétne môže ísť o sekvencie promótorov eukaryotických génov alebo vírusových génov. Napríklad, môže ísť o sekvencie promótorov vzniknutých z genómu cielovej bunky. Z množstva eukaryotických promótorov sa môže použiť každý promótor alebo odvodená sekvencia stimulujúca alebo potláčajúca transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, induktívne alebo neinduktívne, silno alebo slabo. Môže ísť konkrétne o ubikvitínové promótory (promótor génov HPRT, PGK, aaktín, tubulín, atď.), promótory stredných filamentov (promótor génov GFAP, dezmín, vimentín, neurofilamenty, keratín, atď.), promótory terapeutických génov (napríklad promótory génov MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI, atď.), špecifické tkanivové promótory (promótor pyruvátkinázy, vilínu, väzbový črevný proteín mastných kyselín, α-aktín hladkého svalstva, atď.) alebo tiež promótory odpovedajúce na stimuly (receptor steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej, atď.). Rovnako môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu takých vírusov, ako sú napríklad promótory génov E1A a MLP adenovírusov, raný promótor CMV alebo tiež LTR RSV, atď.. Okrem toho tieto oblasti promótorov sa môžu modifikovať adíciou aktivačných sekvencii, regulačných sekvencii alebo sekvencii umožňujúcich expresiu tkanivovo špecifickú alebo majoritnú. Inak gén záujmu môže tiež obsahovať signálnu sekvenciu riadiacu syntetický produkt v sekrečných dráhach delovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť prírodná signálna sekvencia syntetického produktu, ale môže tiež ísť o každú inú funkčnú signálnu sekvenciu alebo umelú signálnu sekvenciu.
Výhodne sa používa promótor vírusového pôvodu vybraný spomedzi skorého promótora CMV, LTR retrovírusu alebo cicavčieho promótora.
Okrem počiatku replikácie a molekuly DNA génu záujmu podľa vynálezu obsahujú oblasť, ktorá je výsledkom špecifickej rekombinácie medzi dvoma sekvenciami. Táto miestne špecifická rekombinácia sa môže získať z rôznych systémov, ktoré spôsobujú miestne špecifickú rekombináciu medzi sekvenciami.
Systém špecifickej rekombinácie uvedený v rámci predloženého vynálezu z pohladu tvorby in situ nárokovanej molekuly DNA môže mať rôzny pôvod. Špecifické sekvencie a použité rekombinázy môžu patriť k rôznym štruktúrnym triedam, konkrétne k rodine rekombinázy bakteriofága PI.
Použitá miestne špecifická rekombinácia podľa postupu vynálezu sa získa prostredníctvom dvoch špecifických sekvencií, ktoré sú schopné rekombinácie medzi sebou v prítomnosti špecifického proteínu, všeobecne označeného ako rekombináza. Je to z toho dôvodu, že molekuly kruhovej DNA podľa vynálezu obsahujú okrem iného sekvencie vzniknuté touto miestne špecifickou rekombináciou. Sekvencie umožňujúce rekombináciu použité v rámci predloženého vynálezu obsahujú všeobecne od 5 do 100 bázových párov, konkrétne menej ako 59 bázových párov.
Z rekombináz patriacich k rodine integráz bakteriofága PI sa môže uviesť konkrétne integráza fága lambda (Landy a kol., Science 197 (1977) 1147), P22 a P80 (Leong a kol., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 Haemophilus influenzae (Hauser a kol., J. Biol. Chem 267 (1992) 6859), integráza Cre fága PI, integráza plazmidu pSAM2 (EP 350 341) alebo tiež FLP rekombináza 2μ plazmidu kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Keď molekuly DNA podía vynálezu sú pripravené rekombináciou prostredníctvom miestne špecifického systému rodiny integrázy bakteriofága lambda, molekuly podlá vynálezu obsahujú všeobecne okrem iného sekvenciu, ktorá je výsledkom rekombinácie medzi dvoma sekvenciami att bakteriofága alebo zodpovedajúceho plazmidu.
Z rekombináz patriacich do rodiny transpozónu Tn3 sa môže uviesť konkrétne resolváza transpozónu Tn3 alebo transpozónov γδ, Tn21 a Tn522 (Stark a kol., 1992); invertáza Gin bakteriofága Mu alebo tiež resolváza plazmidov takých, ako je resolváza fragmentu par RP4 (Abert a kol., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Keď sú pripravené molekuly DNA podľa vynálezu prostredníctvom miestne špecifického systému rodiny transpozónu Tn3, molekuly DNA podľa vynálezu všeobecne obsahujú okrem iného sekvenciu, ktorá je výsledkom rekombinácie medzi dvoma rozpoznávacími sekvenciami resolvázy požadovaného transpozónu.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu v genetických konštrukciách predloženého vynálezu sekvencie umožňujúci miestne špecifickú rekombináciu sú odvodené z bakteriofága. Môže konkrétne ísť o sekvencie att (sekvencie attP a attB) bakteriofága alebo o odvodené sekvencie. Tieto sekvencie sú schopné sa stereošpecificky rekombinovať medzi sebou v prítomnosti rekombinázy označené ako integráza. Termín odvodená sekvencia zahrňuje sekvencie získané modifikáciami či modifikáciami sekvencií att bakteriofágov, ktoré zachovávajú schopnosť sa špecificky rekombinovať v prítomnosti vhodnej rekombinázy. Môže tiež ísť o obmedzené fragmenty týchto sekvencií alebo naopak o rozsiahle fragmenty adíciou iných sekvencií (reštrikčné miesta, atď.). Môže tiež ísť o varianty získané mutáciou či mutáciami, konkrétne mutáciou či mutáciami bodovými. Podľa vynálezu sa označujú sekvenciami attP a attB bakteriofága alebo plazmidu sekvencie systému špecifickej rekombinácie uvedeného bakteriofága alebo plazmidu a zodpovedajúcu chromozómovú sekvenciu attB.
Ako uprednostňovaný príklad sa môžu uviesť konkrétne sekvencie att fága lambda, P22, F80, PI, HP1 Haemophilus influenzae alebo tiež plazmidu pSAM2 alebo 2μ.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu sekvencie umožňujúce miestne špecifickú rekombináciu sú odvodené zo systému rekombinácie fága PI. Tento fág PI má rekombinázu nazvanú Cre, ktorá špecificky rozpozná nukleotidovú sekvenciu s 34 bázovými pármi nazvanú loxP. Táto sekvencia je tvorená dvoma palindrómovými sekvenciami 13 bp oddelenými konzervovanou sekvenciou 8 bp.
V špeciálnom variante sa teda vynález týka molekuly kruhovej a replikativnej DNA obsahujúcej (a) sekvenciu vzniknutú z miestne špecifickej rekombinácie medzi dvoma oblasťami loxP bakteriofága PI, gén záujmu a počiatok replikácie funkčný v cicavčích bunkách a ľudských, ktorá má podľa uprednostňovaného spôsobu podmienečný účinok.
Z tohto hľadiska sa predložený vynález týka tiež genetických konštrukcií mimoriadne výhodných na produkciu už skôr definovaných molekúl terapeutickej DNA. Tieto genetické konštrukcie alebo rekombinantné DNA podľa vynálezu obsahujú konkrétne gén alebo gény záujmu, počiatok replikácie a gén proteínu EBNA1 ohraničený dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu umiestnenú v priamej orientácii. Tieto sekvencie sa môžu klonovať vo forme kaziet v bakteriálnych plazmidoch. Plazmidová DNA sa môže najskôr transfekovať do ľudských buniek, aby sa otestovala účinnosť týchto sekvencií. Tieto kazety sú potom využité na konštrukciu vírusových vektorov, ktoré majú tieto rovnaké sekvencie včlenené do svojho genómu.
Ak sa už uviedlo, iný pohľad predloženého vynálezu spočíva v postupe tvorby molekúl terapeutickej DNA in situ už skôr definovaných z vírusového vektora miestne špecifickou Použitie takéhoto vektora výhodne umožňuje podávanie nárokovanej molekuly DNA do bunky rekombináciou. optimalizovať určenej na ošetrenie.
Z tohto hľadiska predmetom predloženého vynálezu je tiež vírusový vektor obsahujúci v svojom genóme oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami, ktoré umožňujú miestne špecifickú rekombináciu, umiestnenými v priamej orientácii, uvedenú oblasť DNA obsahujúcu aspoň počiatok replikácie a gén záujmu.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu počiatok replikácie, rovnako ako gén záujmu začlenený do vírusového vektora, sú prítomné v inaktívnej forme, promótor je klonovaný v priamej orientácii k jednému z koncov kazety expresie (obrázok 1). Po rekombinácii medzi dvoma miestami LoxP sa promótor nachádza pred génom záujmu a oddelený od tohto génu miestom LoxP, prvé ATG transkriptu zodpovedá iniciačnému kodónu transgénu. Sekvencia oriP je aktívna iba v prítomnosti proteínu EBNA1 a je exprimovaná riadením z rovnakého promótora ako transgén v mediátorovej bicistronickej forme. Translácia je iniciovaná interným iniciačným mechanizmom na úrovni sekvencie IRES odvodenej z vírusu encefalomyokardidu (ECMV) z rodiny pikornavírusov. Expresia transgénu a proteínu EBNA1, rovnako ako replikácia plazmidu, sú teda priamo podmienené výsledkom rekombinácie medzi dvoma miestami LoxP.
Podľa iného variantu vynálezu je zahrnutá oblasť enkapsidácie vírusu do replikónu (oblasť ohraničená sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu.) . Tento spôsob uskutočnenia poskytuje dodatočnú bezpečnosť systému, ako je vysvetlené ďalej.
Použitý vírusový vektor môže byť aj iného pôvodu, ak je schopný transdukovať zvieracie bunky, prednostne ľudské bunky. V uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia vynálezu sa používajú vektory odvodené z adenovírusu, vírusu adenoasociovaného (AAV), herpes vírusu (HSV) alebo retrovírusu. Je predovšetkým výhodné použiť adenovírus na priame podávanie alebo na modifikáciu ex vivo určených buniek a potom implantovať alebo použiť retrovírus na implantáciu produkovaných buniek.
Vírusy podľa vynálezu sú defektné, teda sú neschopné sa replikovať autonómnym spôsobom v cieľovej bunke. Genóm defektného vírusu použitého v rámci predloženého vynálezu je teda zbavený minimálne sekvencií nevyhnutných na replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti sa môžu buď vylúčiť (úplne alebo čiastočne), alebo môžu byť znefukčnené substitúciou iných sekvencii, predovšetkým. heterologickou nukleotidovou sekvenciou záujmu. Defektný vírus si však zachováva sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na enkapsidáciu vírusových častíc.
Čo sa týka konkrétne adenovírusu, v rámci predloženého vynálezu sa prednostne používa ľudský adenovírus typ 2 alebo typ 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírus zvieracieho pôvodu (pozri WO94/26914). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu použiteľných v rámci predloženého vynálezu sa môžu uviesť adenovírusy psieho, hovädzieho, myšacieho pôvodu (napríklad: Mavl, Beart a kol., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo opičieho pôvodu (napríklad: SAV).
Vírusové vektory podľa vynálezu sú defektné adenovírusy obsahujúce v svojom genóme vloženú genetickú sekvenciu obsahujúcu aspoň počiatok replikácie a gén záujmu ohraničený dvoma sekvenciami umiestnenými v priamej orientácii. Toto umožňuje indukovať podmienečnú aktivitu počiatku replikácie a transgénu vzájomnou miestne špecifickou rekombináciou závislou na prítomnosti rekombinázy.
Výhodne je v genóme týchto adenovírusov podľa vynálezu aspoň oblasť El nefunkčná. Konkrétne gén El a aspoň jeden z génov E2, E4, L1-L5 je nefunkčný. Modifikovať sa môžu tiež ďalšie oblasti, konkrétne oblasť E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697) .
Podľa uprednostňovaného spôsobu adenovírus podľa vynálezu obsahuje deléciu v oblasti El a E4 a oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu vloženú na úrovni oblasti neaktívnej El. Podľa iného uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia adenovírus obsahuje deléciu v oblastiach El a E4 a oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu vloženú na úrovni oblasti neaktívnej E4. Ako sa už uviedlo, podľa spôsobu uskutočnenia vynálezu adenovírus obsahuje tiež kazetu expresie génu rekombinázy.
Nárokované vektory sú získané rekombináciou s plazmidmi takými, ktoré sú skôr už definované, teda charakterizované tým, že obsahujú medzi dvoma oblasťami miestne špecifickej rekombinácie aspoň počiatok replikácie a gén záujmu s podmienečnou aktivitou.
Čo sa týka konkrétne definície počiatku replikácie, dvoch sekvencií umožňujúcich miestne špecifickú rekombináciu a génu záujmu prítomných v oblasti DNA integrovanej do vírusového nárokovaného vektora, bude sa odvolávať na presné definície.
Defektné rekombinantné adenovírusy podlá vynálezu sa môžu pripraviť všetkými odborníkmi ovládajúcimi techniky (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Môžu sa pripraviť homologickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcimi okrem iného sekvencie DNA podlá vynálezu alebo konštrukcie vírusového genómu v E. coli. Homologická rekombinácia sa uskutočňuje po spoločnej transfekcii uvedeného adenovírusu a plazmidu vo vhodnej bunkovej línii. Použitá bunková línia musí prednostne (i) byť transformovatelná uvedenými elementmi a (ii) obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu prednostne vo forme integrovanej na vyhnutie sa nebezpečenstvu rekombinácie. Ako príklad línie sa môže uviesť obličková línia ludského embrya 293 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje vo svojom genóme včlenenú Iavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) alebo línie schopné doplniť funkcie El a E4 tak, ako je opísané konkrétne v prihláškach vynálezov WO94/26914 a WO95/02697.
Adenovírusy, ktoré sú rozmnožené, sa získajú a purifikujú podlá klasických techník molekulárnej biológie, ako je uvedené v príkladoch.
Čo sa týka adenoasociovaného vírusu (AAV), ide o vírus s relatívne malou DNA, ktorý sa včleňuje do genómu buniek, ktoré stabilne a stereošpecificky infikuje. Tieto vírusy sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez vyvolania účinku na rast, morfológiu alebo bunkové delenie. Nezdá sa, že sú zahrnuté do patológií u človeka. Genóm vírusu AAV sa klonoval, sekvenoval a charakterizoval. Obsahuje asi 4700 báz a na každom konci obsahuje oblasť obrátenej repetície (ITR) so 145 bázami, ktorá slúži pre vírus ako počiatok replikácie. Zvyšok genómu je rozdelený na dve základné oblasti nesúce enkapsidačné funkcie: na ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rep zahrnutý do vírusovej replikácie a expresie vírusových génov; a na pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap, ktorý kóduje kapsidové proteíny vírusu.
Použitie vektorov odvodených z AAV na prenos génov in vitro a in vivo sa opísalo v literatúre (pozri predovšetkým WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368; US 5,139,941; EP 488 528). Tieto prihlášky vynálezov opisujú rôzne konštrukcie odvodené z AAV, v ktorých gény rep alebo cap sú deletované a nahradené génom záujmu a opisujú ich použitie na prenos in vitro (do bunkovej kultúry) alebo in vivo (priamo do organizmu) uvedeného génu záujmu. Defektný rekombinantný AAV podlá vynálezu sa môže pripraviť spoločnou transfekciou v infikovanej bunkovej línii pomocným humánnym vírusom (napríklad adenovírusom) plazmidu obsahujúceho kazetu expresie podlá vynálezu ohraničenú dvoma oblasťami obrátenej repetície (ITR) AAV a plazmidu, ktorý nesie gény enkapsidácie (gény rep a cap) AAV. Rekombinantné produkty AAV sú potom purifikované klasickými technikami.
Čo sa týka herpes vírusu a retrovírusov, v literatúre je široko opísaná konštrukcia rekombinantných vektorov: pozri konkrétne Breakfield a kol., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein a kol., Genet. Eng. 7 (1995) 235; McCormick, Biotechnology 3 (1985) 689, atď.
Retrovírusy sú integratívne vírusy, ktoré selektívne infikujú bunky vo fáze bunkového delenia. Tvoria teda vektory záujmu pre rakovinové aplikácie. Genóm retrovírusu obsahuje konkrétne dve LTR, sekvenciu enkapsidácie a tri kódujúce oblasti (gag, pol, env). V rekombinantných vektoroch odvodených z retrovírusov sú všeobecne deletované gény gag, pol a env úplne alebo čiastočne a nahradené sekvenciou heterologickej nukleovej kyseliny záujmu. Tieto retrovírusy sa môžu uskutočniť z rôznych typov retrovírusov, konkrétne MoMuLV (murine moloney leukémia vírus), HaSV (harvey sarcoma vírus), SNV (spleen necrosis vírus), RSV (rous sarcoma vírus) alebo tiež Friendov vírus.
Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov podlá vynálezu sa skonštruoval plazmid obsahujúci konkrétne LTR, sekvenciu enkapsidácie a sekvencie vynálezu, potom sa použil na transfekciu bunkových línii nazvaných enkapsidačné, ktoré sú schopné niesť v trans retrovírusové deficientné funkcie v plazmide. Línie enkapsidácie sú teda schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie sa opísali vo vedlajších odboroch, konkrétne línie PA317 (US 4,861,719)/, línia PsiCRIP (W090/02806) a línia GP+envAm-12 (W089/07150). Rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity rovnako ako rozsiahle sekvencie enkapsidácie zahrňujúce časť génu gag (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1639). Produkty rekombinantných retrovírusov sú potom purifikované klasickými technikami.
Ako príklad uprednostňovaného vektora podlá vynálezu sa môžu uviesť adenovírusy obsahujúce vo svojom genóme oblasť DNA zhodnú s vynálezom a lemovanú sekvenciami obrátenej repetície bakteriofága PI (oblasť loxP) umiestnenú v priamej orientácii.
Ako príklad tohto typu vektorov sa môžu uviesť konkrétne uviesť nasledovné konštrukcie s génom β-galaktozidázy (LacZ) alebo s génom tymidínkinázy Herpes vírusu (TK), (obrázok 1). Gén záujmu môže byť každý gén (cDNA, gDNA, RNA, syntetická nukleová kyselina alebo semi-syntetická nukleová kyselina) kódujúca RNA alebo terapeutický alebo vakcinačný proteín taký ako sú enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF, atď. (FFR 9203120), rastové faktory, neuronosiče alebo ich prekurzory alebo enzýmy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NFG, IGF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atď; apolipoproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atď. (FR 93 05125), distrofín alebo minidistrofin (FR 9111947) supresorové gény tumorov: p53, Rb, RaplA, DCC, krev, atď (FR 93 04745), gény kódujúce faktory zahrnuté do koagulácie: Faktory VII, VIII, IX, atď. alebo tiež celok alebo časť prírodného alebo umelého imunoglobulínu (Fab, ScFv, atď) , ligand RNA (WO91/19813), atď..
Gén záujmu môže byť tiež antisense sekvenciou, ktorej expresia v cielovej bunke umožňuje riadiť expresiu génov alebo transkripciu bunkovej mRNA. Takéto sekvencie sa môžu napríklad transkribovať v cielovej bunke na RNA komplementárnu bunkovej mRNA a tak blokovať ich transláciu v proteíne podlá techník opísaných v EP 140 308.
Vektory podľa vynálezu sú predovšetkým prispôsobené expresii sekvencií kódujúcich toxické faktory. Môže konkrétne ísť o bunkové jedy (toxín difterický, toxín pseudomonas, ricín A, atď), produkty indukujúce citlivosť k externým činiteľom (sebevražedné gény: tymidínkináza, cytozíndeamináza, atď.) alebo tiež k vražedným génom schopným indukovať bunkovú smrť (Grb3-3 (PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (WO94/29445), atď). Systém vynálezu konkrétne umožňuje produkciu vírusových vektorov obsahujúcich tieto sekvencie bez toxicity na produkciu buniek, potom tiež umožňuje selektívne indukovať expresiu týchto toxických molekúl v cieľových bunkách po miestne Špecifickej rekombinácii. Tento typ konštrukcie je teda konkrétne prispôsobený stratégiám antitumorovej terapie, napríklad stratégiám, v ktorých je cieľom selektívne zničiť zasiahnuté bunky. Tento systém je konkrétne zaujímavý na expresiu cytokínov, interferónov, TNF alebo TGF, ktorých neriadená produkcia môže mať veľmi viditeľný sekundárny účinok.
Predložený vynález sa tiež týka každej eukaryotickej bunky transfekovanej minimálne vírusovým vektorom alebo molekulou DNA podľa vynálezu takou, ako je už definovaná.
Iný predmet vynálezu spočíva, v postupe produkcie molekuly DNA takej, ako je už definovaná podľa ktorého hostiteľská bunková kultúra obsahujúca vírusový vektor podľa vynálezu je uvedená do kontaktu s rekombinázou umožňujúcou indukovať miestne špecifickú rekombináciu.
Predložený vynález sa týka každého postupu prípravy vyznačujúceho sa tým, že uplatňuje:
(i) modifikované hostiteľské bunky obsahujúce aspoň vírusový vektor, uvedený vektor obsahujúci v svojom genóme aspoň oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu a umiestnenými v priamej orientácii, uvedenú oblasť obsahujúcu aspoň počiatok replikácie a gén záujmu a (ii) rekombinázu umožňujúcu indukovať in situ miestne špecifickú rekombináciu z .pohľadu tvorby uvedených molekúl kruhovej a replikativnej
DNA.
V rámci predloženého vynálezu sa navrhli rôzne postupy na uskutočnenie uvedenia vírusového vektora do kontaktu so špecifickou rekombinázou. Tento kontakt môže byť konkrétne uskutočnený na úrovni hostiteľskej bunky spoločnou transfekciou s plazmidom obsahujúcim gén uvedenej rekombinázy; a to indukciou expresie génu kódujúceho uvedené rekombinázy priamo prítomné v genóme uvedenej hostiteľskej bunky. Gén kódujúci rekombinázu môže teda byť prítomný v hostiteľskej bunke v integrovanej forme genómu na plazmide alebo tiež na vedľajšom vírusovom vektore napríklad adenovíruse. V tomto prípade vírusový vektor uplatnený na vytvorenie molekuly DNA podľa vynálezu sa použije taký, ako je už definovaný.
Podlá inej metódy je kazeta expresie génu nesená na vírusovom vektore tiež zodpovedná za expresiu génu záujmu.
Konkrétne v tomto prípade podlá vynálezu uplatňuje vírusový vektor, obsahujúci v svojom genóme okrem oblasti DNA ohraničenej sekvenciami kódujúcimi miesta špecifickej rekombinácie a obsahujúce aspoň počiatok replikácie a gén záujmu kazetu génu rekombinázy.
Takýto vektor predstavuje iný predmet predloženého vynálezu.
Z tohto hľadiska podlá zvláštneho variantu predložený vynález sa týka adenovírusu obsahujúceho prvú deléciu v oblasti El, do ktorej je vložený replikón (oblasť DNA ohraničená dvoma sekvenciami miestne špecifickej rekombinácie) a deléciu realizovanú v E4 alebo v E3 na úrovni, v ktorej je vložená kazeta expresie proteínu rekombinázy.
Replikón sa môže vložiť do deletovanej časti zodpovedajúcej oblasti E3 alebo E4, zatial čo kazeta expresie rekombinázy je vložená na úrovni deletovanej oblasti El.
Podía iného variantu replikón, rovnako ako kazeta expresie rekombinázy, je vložený na úrovni defektnej oblasti El.
Ako sa už skôr uviedlo, sekvencie umožňujúce miestne špecifickú rekombináciu sú sekvencie LoxP a rekombináza je proteín Cre, ktorého spôsob pôsobenia na uvedené sekvencie rekombinácie bol už opísaný.
Podía uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia bude žiaduce, aby sa mohla riadiť a predovšetkým indukovať expresia tejto rekombinázy vo vnútri hostiteľskej bunky. V rámci predloženého vynálezu bolo výhodne navrhnuté riadenie expresie génu kódujúce rekombinázu. Na toto uskutočnenie sa navrhlo umiestnenie expresie uvedeného génu pod kontrolu regulačného elementu. Môže ísť konkrétne o indukovatelný promótor umožňujúci riadenie úrovní alebo periód expresie tohto génu, napríklad môže ísť o promótor LTR MMTV (Pharmacia), ktorý je indukovaný dexametazónom alebo promótor indukovaný tetracyklínom (WO94/29442; WO94/04672). Je pochopiteľné, že sa môžu použiť aj ďalšie promótory , konkrétne varianty LTR MMTV, ktoré nesú napríklad heterologické oblasti regulácie (konkrétne oblasti enhancer).
V inom spôsobe uskutočnenia expresie génu, ktorý kóduje rekombinázu, je táto riadená promótormi, aby sa zamedzilo buď konštitutívnej akumulácii uvedeného proteínu v hostiteľskej bunke alebo unikanie cez bunkovú stenu a jej istej toxicite. Môžu sa tiež nimi spojiť elementy, ktoré fungujú ako oblasti transaktivácie transkripcie. Ako príklad tohto typu sa môžu uviesť receptory hormónov, receptory steroidov, kyselina retinová a tyroidy, z ktorých je možné uviesť predovšetkým glukokortikoidy, mineralokortikoidy, tyroidy, estrogén, aldosterón a kyselinu retinovú. Tento typ konštrukcií medzi rekombinázou Cre a väzbovou oblasťou DNA receptora glukokortikoidu sa opísal napríklad vo Feil a kol. (PNAS 93 (1996) 10887).
Možnosť regulovať expresiu rekombinázy je predovšetkým dôležitá v prípade vektorov podlá vynálezu nesúcich zároveň replikón a kazetu expresie rekombinázy. Ak v tomto spôsobe uskutočnenia je rekombináza exprimovaná napríklad počas produkcie vírusových vektorov, bude replikón odstránený z vírusového genómu pred svojou enkapsidáciou. Z tohto dôvodu je prospešné usporiadať taký systém, v ktorom expresia proteínu rekombinázy je potlačená v bunkách, ktoré produkujú vírus. Toto je zaistené, ako sa už uviedlo skôr, s použitím riadeného promótora (typ tetracyklín alebo MMTV) alebo elementu typu receptora hormónu, ktorý spojený s rekombinázou udržuje expresiu rekombinácie v extranukleárnych oddeleniach v neprítomnosti uvedeného hormónu (obrázok 6 a 7) . Preto v neprítomnosti hormónu rekombináza nemôže byť účinná, v prítomnosti hormónu je teda transportovaná cez nukleárne oddelenie, kde vykonáva svoju aktivitu.
Zaujímavý prístup na riadenie expresie rekombinázy spočíva v použití fúznej rekombinázy v hormonálnom receptore (oblasť viazania DNA), teda rekombinázy neaktívnej v neprítomnosti uvedeného hormónu, potom spočíva v umiestnení uvedeného génu do vírusového vektora takého druhu, ktorý bude pod kontrolou promótora replikónu. Tento spôsob uskutočnenia je vyjadrený napríklad na obrázku 6b.
Inak na zvýšenie bezpečnosti systému je tiež možné, ako sa už uviedlo, vložiť do replikónu oblasť enkapsidácie vírusového vektora (obrázok 7). To umožňuje vyhnúť sa nahromadeniu vytvoreného vírusu kontaminovaného vektorom, ktorý stratil replikón. Ak napriek systému regulácie, pripomenuté ďalej, expresia aktívnej rekombinázy pôsobí v počas produkcie vírusu, bude spúšťať vybratie replikónu z vírusového genómu a tak generácia vírusových genómov sa zbaví replikónu. Ak oblasť enkapsidácie vírusu je nesená uvedeným replikónom, vírusové genómy takto vytvorené nebudú enkapsidované. Samotné vírusové genómy nesúce zároveň replikón a kazetu expresie rekombinázy sa môžu enkapsidovať.
Predmetom predloženého vynálezu je tiež farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jeden vírusový vektor pódia vynálezu alebo transfekovanú bunku podlá vynálezu. Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sa môžu formulovať z hľadiska podávania a to orálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné, intraokulárne, atď.. Farmaceutická kompozícia podlá vynálezu obsahuje vhodný farmaceutický nosič pre injikovatelnú formu. Môže ísť konkrétne o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý alebo horečnatý, atď. alebo zmes týchto solí), sterilné, izotonické alebo kompozície suché, konkrétne lyofilizované, ktoré po prídavku, podlá prípadu, sterilizovanej voda alebo fyziologického séra umožňujú injikovatelnú formu kompozície. Čo sa týka retrovírusov, môžu sa výhodne použiť priamo bunky enkapsidácie alebo bunky infikované ex vivo z pohladu ich reimplantácie in vivo, prípadne vo forme neoorgánov (WO94/24298) .
Dávka vektora pre injekciu sa môže prispôsobiť rôznym parametrom, konkrétne použitému spôsobu podávania, patológii, génu určenému na expresiu alebo na dĺžke liečenia. Všeobecne rekombinantné adenovírusy podlá vynálezu sú formulované a podávané vo forme dávok, ktoré obsahujú medzi 104 až 1014 pfu/ml. Pre AAV a adenovírus sa môže použiť dávka 106 až 1O10 pfu/ml. Termín pfu (plaque forming units) zodpovedá infekčnej schopnosti suspenzie viriónu a je určená infekciou určitej bunkovej kultúry a následným meraním po 48 hodinách počtu plakov infikovaných buniek. Techniky určenia veľkosti pfu vírusového roztoku sú dobre opísané v odbornej literatúre.
Podlá génu záujmu prítomného v molekulách DNA podlá vynálezu alebo oblasti integrovanej v genóme uvedených vírusových vektorov sa môžu použiť na liečenie alebo prevenciu počtu patológií, ktoré zahrňujú genetické ochorenia (myodistrofie, mucoviscidózy, atď.), neurodegeneratívne ochorenie (Alzheimer, Parkinson, ALS, atď.), rakoviny, patológie spojené s dezorganizáciou koagulácie alebo s dyslipoproteinémiou, patológie spojené s vírusovou infekciou (hepatitída, AIDS, atď.), alebo ochorenia v oblastiach agronomických alebo veterinárnych, atď..
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, pričom však v akomkoľvek smere neobmedzujú jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Tabuľka 1: Pôvod sekvencií použitých na konštrukciu epizómu
Obrázok 1: Schéma konštrukcie epizómu
Obrázok 2: Vyjadrenie štruktúry epizómu
Obrázok 3: Sekvencia medzi promótorom (P-RSV) a kazetou expresie (TK-CITE-EBNA1) v plazmide pLoxP-ori--TK-EBNAl (A) a v epizóme po rekombinácii (B, C a D) - SEQ ID NO: 3.
Obrázok 4: Schéma etáp klonovania kazety LoxP-ori-TK-EBNAl Obrázok 5: Schéma etáp klonovania kazety LoxP-ori-lacZEBNA1
Obrázok 6: Zobrazenie adenovírusového vektora, ktorý nesie replikón a regulačnú kazetu expresie Cre : CREr : Cre regulačnú, buď na úrovni promótora alebo fúzie, alebo týchto dvoch. V (b) orientácia replikónu umožňuje umiestniť kazetu CRTK pod kontrolu promótora prítomného v replikóne. Šedý box zodpovedá miestam LoxP.
Obrázok 7: Vyjadrenie adenovírusového vektora, ktorý nesie replikón a regulačnú kazetu expresie Cre, oblasť vírusovej enkapsidácie Psi (Δ), ktorá je začlenenádo replikónu. Šedý box zodpovedá miestam LoxP.
Všeobecné techniky klonovania a molekulová biológia
Klasické techniky molekulárnej biológie také, ako sú odstreďovanie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho/ etídiumbromidu, štiepenie s reštrikčnými enzýmami, elektroforéza v géli, elektroelúcia fragmentov DNA z agarózových gélov, transformácia E. coli, zrážanie nukleových kyselín, atď. sú opísané v odbornej literatúre (Maniatis a kol,., 1989, Ausubel a kol., 1987). Nukleotidové sekvencie sa určili metódou terminácie reťazca uvedenou ďalej v protokole (Ausubel a kol, 1987).
Reštrikčné enzýmy sa dodali z firmy New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) alebo Amersham Ltd (Amersham).
Na ligáciu sa DNA fragmenty rozdelili na základe velkosti v 0,75% agarózovom géli alebo v 8% akrylamidovom géli, potom sa purifikovali elektroforeticky elektroelúciou, extrahovali fenolom, zrážali etanolom a inkubovali v pufri 50mM Tris-HCl pH 7,4, lOmM MgCl2, lOmM DTT, 2mM ATP v prítomnosti DNA ligázy fága T4. Oligonukleotidy chránené v β polohe kyanoetylovou skupinou, sa syntetizovali s použitím fosforamidovej chémie (Sinha a kol., 1984, Giles 1985) automatickým syntetizátorom DNA Biosearch 8600 podľa odporučenia dodávateľa.
Plazmidové DNA sa purifikovali nasledujúcou technikou alkalickej lýzy (Maniatis a kol., 1989).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Opis vektora potvrdzuje vynález (obrázok 1-3)
Obrázok 1 opisuje všeobecnú štruktúru vektora podlá vynálezu, konkrétne oblasť obsiahnutú medzi sekvenciami, ktoré umožňujú miestne špecifickú rekombináciu. Na obrázku 2 je uvedená konštrukcia ešte podrobnejšie.
Orientácia promótora (P) a kazety expresie transgénu (TG) a proteínu EBNA1 je naznačená šípkami a umožňuje teda expresiu týchto dvoch génov iba po rekombinácii v prítomnosti rekombinázy Cre. Na obrázku 3 je uvedený detail sekvencii medzi promótorom (P) a génom po rekombinácii. Na tomto obrázku je promótor LTR vírusu RSV (P-RSV) a gén je gén tymidínkinázy TK. Je zdôraznený prvý ATG mRNA, ktorý zodpovedá prvému ATG génu TK. Ako je uvedené na obrázku 1, expresia EBNA-1 sa získa z polycistronického messangeru internou iniciáciou translácie s použitím sekvencie IRES (Internal Ribosome Entry Site) tiež nazvanej sekvencie CITE (Cap Independent Translation Entry) vírusu Encephalomyocardite (ECMV). Signálna sekvencia terminácie transkripcie a polyadenylácie vírusu SV40 (pA) sa vložila na 3' koniec sekvencie kódujúcej EBNA1. Sekvencia oriP je umiestnená medzi kazetou expresie TK-EBNA-1 a promótorom RSV. Táto sekvencia je aktívna pre replikáciu iba v prítomnosti EBNA-1 a teda iba po rekombinácii a tvorbe epizómu.
Príklad 2
Konštrukcie plazmidov LoxP-OriP-EBNAl a LoxP-ori-LacZ-EBNAl
Na obrázku 4 a 5 sú uvedené etapy konštrukcie plazmidov, pôvod použitých sekvencií je uvedený v tabuľke 1.
2.1. Konštrukcia plazmidu LoxP-OriP-EBNAl (obrázok 4)
1. Plazmid pSLori sa štiepil s reštrikčnými enzýmami Hpal a EcoRI a získaný fragment 1817 bp, ktorý zodpovedá sekvencií oriP, sa klonoval medzi miesta Smal a EcoRI plazmidu pIC19H a dopredu sa defosforyloval na získanie plazmidu pIC-ori (obrázok 4A) .
2. Plazmid pSLori sa štiepil v miestach HindlII a BglII, defosforyloval a fragment 1900 bp sa klonoval medzi miesta HindlII (174) a BamHI (208) vektora pBS246 na získanie vektora pLox-ori (obrázok 4A) .
3. Fragment BamHI-SalI 399 bp vektora pCEP4, ktorý zodpovedá signálnej sekvencií terminácie transkripcie a polyadenylácie vírusu SV40 sa odstránil DNA-polymerázou podľa Klenowa, potom klonoval medzi miesta Smal a Sali (odstránený DNA-polymerázou podľa Klenowa) vektora pIC20R a dopredu sa defosforyloval na získanie vektora pICpA (obrázok 4A).
4. Sekvencia IRES obsiahnutá medzi nukleotidmi 16 a 518 vektora pCITE-2 sa amplifikoval s PCR pomocou syntetických oligonukleotidov 5' -GGCCTCTAGACAGCTGGTTATTTTCC-3' (SEQ ID NO: 1) a 5'-GGCCGGATCCCATATTATCATCG-3' (SEQ ID NO: 2), obsahujú miesta
Xbal a PvuII (oligo 1) a BamHI (oligo 2) a ich 5' koniec. Získaný produkt sa štiepil s reštrikčnými enzýmami Xbal a BamHI a klonoval medzi miesta Xbal a PstI vektora pCMV-EBNAl a dopredu sa defosforyloval na získanie vektora pCIRE-EBNAl. Sekvencia obsahuje medzi ATG 12 IRES zodpovedajúcich iniciačnému kodónu translácie a kodón serínu nasledujúci kodón metionínu proteínu EBNA1 sa deletoval cielenou mutagenézou pomocou techniky PCR (ex-site PCR). Úplná sekvencia IRES a EBNA1 získaná po PCR sa úplne sekvenovala (obrázok 4A) .
5. Fragment Xbal-PstI vektora pCITE-EBNAl (2546 bp) sa klonoval medzi miesta Xbal a PstI plazmidu pICpA a dopredu sa defosforyloval na získanie vektora pCITE-EBNAl-pA (obrázok 4A) .
6. Fragment Clal-EcoRI vektora pCITE-EBNAl-pA (2945 bp) sa klonoval vo vektore pLox-ori, čiastočne štiepenom v mieste EcoRI umiestnenom na konci ori, potom sa štiepil s Clal a defosforyloval na získanie vektora pLox--ori-CITE-EBNAl-pA (obrázok 4B) .
7. Fragment Clal-BsaWl (1270 bp) vektora pCMV-TK získaný čiastočným štiepením s BsaWl a odstránením miesta BsaWl DNApolymerázou podlá Klenowa sa klonoval medzi miesta Clal a PvuII vektora pLox-ori-CITE-EBNAl-pA na získanie vektora pLox-oriCITE-TK-EBNAl-pA (obrázok 4B).
8. Fragment BamHI-SalI (600 bp) plazmidu pRSV-TK, zodpovedajúci sekvencií promótora LTR RSV sa klonoval medzi miesta BamHI a Sali vektora pLox-ori-CITE-TK-EBNAl-pA a dopredu sa defosforyloval na získanie plazmidu pLox--ori-pRSV-TK-CITEEBNAl-pA (obrázok 4B).
2.2. Konštrukcie plazmidu pLox-oriP-LacZ-EBNAl (obrázok 5)
Klony 1-6 opísané v príklade 2.1 a uvedené na obrázku 4A sú spoločné pre konštrukciu vektorov pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNAl-pA a pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNAl-pA.
7. Klonovanie promótora LTR RSV sa uskutočnilo podlá bodu 7 v príklade 2.1 (obrázok 5).
8. Fragment BamHI-StuI (3205 bp) vektora pRSV-Gall zodpovedajúci génu LacZ predchádzajúci signálu nukleárnej lokalizácie (NSL) sa klonoval medzi miesta Smal a BglII vektora pIC20H a dopredu sa defosforyloval na získanie plazmidu pICLacZ (obrázok 5).
9. Fragment Xbal-Nrul (3205 bp) vektora pICLacZ sa klonoval medzi miesta Xbal a PvuII vektora pLox-ori-pRSV-CITE-EBNAl-pA na získanie vektora pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNAl-pA (obrázok 5).
Príklad 3
Potvrdenie systému spoločnou transfekciou ľudských buniek (Hela-EBNA1; 143-TK-) pomocou plazmidov CMV-Cre (pBS185) a LoxP-oriP-TK-EBNA1 alebo LoxP-oriP-LacZ-EBNAl.
3.1. Potvrdenie in vitro
Bunková línia Hela stabilne exprimujúca gén EBNA1 sa transfekovala s plazmidom pLox-oriP-LacZ-EBNAl a plazmidom exprimujúcim Cre pod riadením promótora cytomegalovírusu (pBS185). Účinnosť rekombinácie a funkcie kazety expresie génu LacZ sa potvrdila aktivitou β-galaktozidázy v bunkách pozorovanou v prítomnosti rekombinázy Cre. Získané výsledky ukazujú účinok tvorby replikónu vplyvom rekombinázy Cre, dokázanie aktiváciou expresie génu LacZ po rekombinácii medzi miestami LoxP a tvorby epizómu. Po troch týždňoch kultivácie kotransfekovaných buniek (pasážovanie jeden krát za týždeň (riedenie 1:10)) sa pozorovalo zachovanie proporcií buniek exprimujúcich gén LacZ tak, že expresia LacZ zmizla v transfekovaných bunkách s kontrolným plazmidom, ktorý nemá počiatok replikácie oriP, čo ukazuje funkčnú vlastnosť oriP v konštrukcii.
Rovnakým spôsobom sa kotransfekovala bunková línia TK (143TK') plazmidy LoxP-ori-TK-£BNAl a pBS185. Transfekované bunky exprimujúce gén TK sa selektujú v prostredí HAT. Stabilita expresie génu TK počas bunkového delenia a teda aktivita systému oriP-EBNAl, je overená imunofluorescenciou pomocou špecifickej monoklonálnej protilátky proteínu TK Herpes vírusu. Prítomnosť epizómu a jeho replikácia v priebehu bunkového delenia je dokázaná technikou Hirt nasledovanou amplifikáciou epizómovej DNA technikou PCR pomocou špecifických nástrojov.
3.2. Potvrdenie in vivo
Aktivita týchto konštrukcií in vivo sa testovala intratumorálne injekciou (elektroporácia) DNA plazmidov pLoxoriP-TK-EBNAl a pLox-oriP-LacZ-EBNAl a pBS185do tumorov indukovaných podkožnou injekciou buniek Hela alebo Hela-EBNAl do myší. Injekcie buniek dopredu kotransfekovaných tými istými plazmidmi sa uskutočnilo paralelne. Zachovanie transgénu (TK alebo LacZ) v tumoroch transdukovaných týmito konštrukciami sa analyzovalo imunohistochemicky porovnaním s kontrolným plazmidom, ktorá nemá počiatok replikácie.
Príklad 4
Analýza rekombinačného systému a epizomálneho správania
4.1. Konštrukcia plazmidu pCre
Plazmid Cre obsahuje gén fúznej rekombinázy Cre na 5'konci signálu nukleárnej lokalizácie antigénu T vírusu SV40 a je exprimovaný z promótora tymidínkinázy (TK) Herpes vírusu. Pripravila sa podobná konštrukcia nesúca v mieste promótora TK promótor riadený tetracyklínom alebo promótor MMTV. Tiež sa pripravila kazeta nesúca fúziu Cre-ER.
4.2. Konštrukcia plazmidu pRep
Plazmid replikónu (pRep) obsahujúci fúziu génu k phleomycínu s génom β-galaktozidázy (Zéo-LacZ), oriP a raný promótor cytomegalovírusu (P.CMVj, bez proteínu EBNA1 sa skonštruoval tak, ako je uvedené ďalej.
Fragment Stul-Clal (1149-4553) plazmidu pRSV-Gal-IX obsahujúci gén LacZ a polyadenylačný signál vírusu SV40 sa klonoval medzi miesta Clal a EcoRV (2029-2032) pLox-ori (Príklad 2 a obrázok 4) na získanie plazmidu pLox-ori-LaZ.
Fragment BglII-BglII pCEPO4 obsahujúci raný promótor CMV sa klonoval do miesta BamHI pLox-ori-LacZ, aby sa získal plazmid pLX2.
5' koniec génu LacZ v pLX2 (fragment Xbal-Clal sa substituoval fragmentom Ncol-Clal plazmidu pUT651 (CAYLA, tabuľka 1) . Na uľahčenie klonovanie tohto fragmentu sa dopredu predklonoval medzi miesta EcoRV a Clal plazmidu pIC20RpA, potom sa štiepil s Xbal a Clal a klonoval medzi miesta Xbal a Clal pXL2.
Kontrolný plazmid obsahuje rovnakú štruktúru ako pRep bez počiatku replikácie (OriP).
4.3. Konštrukcie plazmidu pRep-EBNAl
Kazeta umožňujúca expresiu EBNA1 z IRES ECMV sa konštruovala mutagenézou riadenou z plazmidu pCITE-EBNAl-pA a klonovala sa do kyvadlového vektora Adenovírusu pAdLX2 (5-2-2) na získanie' pAdLX2-EBNAl alebo pRep-EBNAl. IRES rovnako ako počiatok EBNA1 sa úplne sekvenoval. Expresia EBNA1 z IRES sa analyzovala Western prenosom v bunkách Hela transfekovaných pRep-EBNAl. Plazmid pCMV-EBNAl, ktorý umožňuje konštrukciu pCITE-EBNAlpA, sa použil ako kontrola.
4.4. Potvrdenie in vivo
4.4.1. Analýza rekombinácie a epizomálneho správania v bunkách Hela-EBNAl
V prvej etape pokusy transfekcie buniek Hela, ktoré exprimujú proteín EBNA1 konštitutívne (Hela-EBNAl s pRep samotným alebo s pCre sa ukázalo, že kotransfekcia dvoch plazmidov umožňuje vybratie replikónu a indukciu expresie génu β-galaktozidázy. Transfekované kontrolné bunky s plazmidom replikónu majú stále šum pozadia, ale obsahujú takmer zanedbateľnú aktivitu β-galaktozidázy. Expresia transgénu sa sledovala počas pasážovania vhodných buniek pri 2 presádzaniach každý týždeň počas jedného mesiaca, čo je ekvivalentné 24 bunkovým deleniam. V bunkách transfekovaných pRep-pCre sa expresia β-galaktozidázy zachováva počas celej dĺžky pokusu tak, že rýchlo vymizla (po akomkoľvek bunkovom delení) v bunkách kotransfekovaných s kontrolným plazmidom, ktorý nenesie počiatok replikácie oriP.
V druhej etape kotransfekované bunky (pRep+pCre) sa selektovali v prítomnosti phleomycínu. Epizomálna DNA sa izolovala technikou Hirt, linearizovaná alebo nelinearizovaná sa štiepila v mieste Xhol, potom sa prípadne štiepila s Mbol, aby sa dokázalo, že DNA sa replikovala v eukaryotických bunkách. Analýza takto získaných vzoriek Southern prenosom dokázala prítomnosť replikónu s očakávanou veľkosťou. Počet kópií buniek bol 1 až 10. Selektované bunky sa potom uchovali v prítomnosti alebo neprítomnosti selekčného tlaku. Pri týchto dvoch podmienkach sa pozorovalo podobné správanie expresie βgalaktozidázy s pomalým konštantným úbytkom počas bunkového delenia. Po 27 deleniach je aktivita β-galaktozidázy ešte detegovatelná u 25% buniek priamym farbením in vitro. Tieto výsledky zodpovedajú segregačnej stabilite epizómu v 97% delení. Tieto výsledky sú v zhode s výsledkami uvedenými v odbornej literatúre, kde sa už publikovala hodnota straty 1% až 5% na delenie (Simpson a kol., 1996).
4.4.2 Analýza účinku EBNA1 v bunkách Hela
Pokusy kotransfekcie buniek Hela s pRep-EBNAl a pCRE umožňujú testovať, či EBNA1 je správne exprimovaný z IRES a či sa zachováva správanie expresie β-galaktozidázy počas postupného pasážovania. Bunky Hela-EBNAl transfekované s rovnakým plazmidom tvoria kontrolu.
4.5. Potvrdenie in vivo v modeli tumoru indukovaného v myši
Bunky Hela a Hela-EBNAl sú tumorigénne pre myši podkožnej injekcie. 106 buniek indukuje tvorbu tumoru detegovatelného po 8 dňoch velmi rýchleho rastu a môžu sa pozorovať mesiac. V prvom príklade sa injikované bunky Hela EBNA1 transfekované s pRep a pCre selektovali in vitro v prítomnosti phleomycínu. Analýza tumorov (3 cm v priemere) po 21 dňoch po zafarbení s X-gal ukazuje na správanie replikónu in vivo v tejto molekule.
V druhom príklade sa potom injikované bunky Hela-EBNAl transfekované s pRep infikovali s AdCre (pozri príklad 5.2). Ako kontrola sa použili transfekované bunky súčasne injikované s dvoma plazmidmi odvodenými z pRep, nesúcimi alebo nenesúcimi oriP, umožňujúcimi expresiu LacZ v neprítomnosti rekombinácie. Analýza tumorov po 21 dňoch ukázala, že adenovírus Cre tretej generácie umožňuje vybratie replikónu a že jeho prítomnosť nemení ani životaschopnosť bunky, ani prvú etapu tvorby epizómu. Možno zaznamenať, že žiadna aktivita β-galaktozidázy sa nedetegovala v transfekovaných bunkách s kontrolným plazmidom, ktorý nenesie oriP. Tieto výsledky jasne ukazujú, že konštrukcie podľa vynálezu sú funkčné in vivo v tumorových bunkách a tiež možno zaznamenať stabilitu epizómov po 21 dňoch.
Príklad 5
Konštrukcie rekombinantných adenovírusov prvej a tretej generácie
Tento príklad opisuje konštrukciu vírusového vektora podľa vynálezu, ktorý obsahuje oblasť, ktorá môže tvoriť miestne špecifickou rekombináciou kruhovú a replikatívnu molekulu in vivo. Tieto vírusové vektory obsahujú okrem iného sekvenciu kódujúcu rekombinázu umožňujúcu rekombináciu.
5.1. Príprava adenovírusu prvej generácie (z plazmidov pBS185, pLoxP-oriP-TK-EBNAl a pLox-oriP-LacZ-EBNAl)
Kazeta expresie rekombinázy Cre a úplná sekvencia replikónu zahrňujúca miesta LoxP sa klonovala z vektorov pBS185 a pLoxoriP-TK-EBNAl alebo pLox-oriP-LacZ-EBNAl v oblasti E1 adenovírusových vektorov obsahujúcich úplnú alebo čiastočnú deléciu oblasť E1 (Addl327; ΔΕ1-ΔΕ3). Rekombinantné adenovírusy sa izolovali klasickými technikami homologickej rekombinácie z buniek 293. Vírusové vektory sa môžu tiež pripraviť- dvojnásobnou rekombináciou v F. coli pomocou plazmidov obsahujúcich genóm Adeno 5 ΔΕ1ΔΕ5, vírusový genóm, ktorý sa potom enkapsiduje do adenovírusovej častice vo vhodnej línii. Z dôvodov možnosti klonovania sa gén LacZ výhodne nahradil menším markerovým génom.
5.2. Príprava adenovírusu druhej generácie
Použitie adenovírusov tretej generácie vyjadruje určité výhody vzhľadom na použitie adenovírusov prvej generácie; nielen z hladiska neškodnosti, ale tiež z hľadiska zníženia zápalovej odpovede a zvýšenia stability expresie transgénu. Tieto vektory majú okrem iného zvýšenú možnosť klonovania a neprítomnosť priameho cytopatického účinku in vitro alebo in vivo.
Vektory tretej generácie (Adll007; ΔΕ1ΔΕ3ΔΕ4) sa môžu pripraviť klasickými technikami pomocou skeletu E. coli obsahujúceho genóm adenovírusu tretej generácie pXL2811 (pRSV3Gal-AEl,ΔΕ3,AE4-dlllO7-SspI) a pXL2789 (ΔΕΙ,ΔΕ3,AE4-dlllO7SspI) a sebevražedné plazmidy (Kana-SacB) pMA37 alebo pXL3048 určené na modifikáciu oblasti E1 podlá stratégie opísanej skôr (Coruzet a kol., 1997 PNAS, 94: 1414; WO96/25506).
5.2.1 Príprava adenovírusu Cre (Ad-Cre)
Fragment Xhol-BamHI (451-2057) plazmidu pMC-Cre (tabulka 1) sa odstránil Klenowom a klonoval v mieste EcoRV sebevražedného plazmidu pMA37.
Genóm dvojnásobnou rekombináciou získaného adenovírusu s plazmidom pXL2811 sa linearizoval štiepením s Pac a transfekoval do buniek IGRP2 (WO96/22378) pomocou Lipofektamínu (GIBCO). Takto vytvorený Ad-Cre sa amplifikoval do rovnakých buniek, potom sa purifikoval klasickými metódami (chlorid cézny) alebo chromatograficky (FR96/08164).
Štruktúra genómu adenovírusu Cre sa potvrdila enzýmovou digesciou.
5.2.2 Príprava adenovírusu Rep (Ad-Rep)
Plazmid pXL2 sa štiepil s BamHI, potom sa recirkularizoval, aby sa odstránil polyadenylačný signál SV40 na 5'konci génu. LacZ. Fragment Notl-NotI (1-6145) plazmidu takto získaného sa opracoval Klenowovým fragmentom, potom sa klonoval do miesta EcoRV sebevražedného vektora pXL3048, dopredu štiepeného s BamHI a Sali, opracoval sa s Klenowovým fragmentom a následne sa recirkularizoval po odstránení týchto dvoch miest, aby sa získal plazmid pAdLX2. Fragment Xhol-Sall (441-3457) plazmidu pCITEEBNAlpA-mutagénny sa klonoval do miesta Xhol plazmidu pAdLX2 dopredu získaného, aby sa získal plazmid pAdLX2-EBNAl (pRepEBNA1).
Ad-Rep sa získal rekombináciou s plazmidmi pAdLX2-EBNAl apXL2789 podlá techník už skôr opísaných pre Ad-Cre.
5.2.3 Príprava adenovírus Rep/Cre (obrázok 6)
Skonštruoval sa adenovírus Rep-Cre nesúci zároveň replikón a gén rekombinázy Cre. Táto stratégia umožňuje zvýšiť účinok prenosu replikónu predovšetkým in vivo. Kazeta expresie Cre sa vložila do genómu adenovírusu v oblastiach El, E3 alebo E4. Úplná expresia riadená rekombinázou je skúmaná, aby sa zabránilo zničenie replikónu od genómu adenovírusu počas jeho propagácie v bunkách IGRP2.
Pozorovala sa regulácia expresie rekombinázy na transkripčnej úrovni (tkanivovo špecifický promótor aktívny in vivo alebo indukovatelný promótor) alebo na úrovni posttranskripčnej (fúzia Cre s oblasťou viazania receptoru steroidných hormónov Cre-ER).
Na konštrukciu týchto adenovírusov sa replikón vložil do plazmidu pXL2789 tak, ako je opísané v predchádzajúcom príklade. Kazeta expresie Cre nesúca promótor tet alebo MMTV alebo fúziu Cre-ER je potom vložená dvojnásobnou homologickou rekombináciou v E. coli do uvedeného plazmidu, aby sa vytvorili plazmidy pRepCrel (Rep a Cre v El) a pRep-Cre2 (Rep v El a Cre v E4) . Tieto plazmidy sa potom upravili s Pac, aby sa vybral vírusový rekombinantný genóm, ktorý je vložený do buniek IGRP2 na produkciu zodpovedajúcich vírusov.
5.2.4 Príprava adenovírusu Rep/Psi (obrázok 7)
Táto konštrukcia umožňuje výhodne vyhnúť sa kontaminácii s Ad-Rep-Cre adenovírusom s deléciou replikónu, alebo sa nemôže získať úplná regulácia aktivity Cre. Stratégia sa zakladá na vložení enkapsidačného signálu Psi do replikónu. Vektor pXL3048 sa modifikoval cielenou mutagenézou na úrovni oblasti IRT, aby sa deletoval enkapsidačný signál a vložil miesto LoxP na vznik plazmidu pXL3048-Apsi-LoxP. Sekvencia replikónu deletovaného v mieste lavý LoxP je izolovaná enzýmovým štiepením z plazmidu pAdLX2 alebo pADlX2-EBNAl a klonovaná do miesta EcoRV plazmidu pXL3048-APsi-LoxP.
Príklad 6
Dokázanie systému spoločnou infekciou s dvoma rekombinantnými adenovírusmi
Funkčnosť vírusových vektorov podlá vynálezu je riadená in vitro a in vivo:
6.1. Dokázanie in vitro infekciou rozdielnych bunkových línií
Aktivita rekombinázy adenovírusu Cre sa dokázala in vitro v bunkách Hela-EBNAl transfekovaných s pRep rovnako ako v línii myšacích embryonálnych buniek (Lox-pgal), v ktorých expresia LacZ sa môže aktivovať rekombináciou medzi dvoma miestami loxP.
Účinok excízie replikónu z adenovírusového genómu sa študoval v bunkách IGRP2 spoločne infikovaných Ad-Rep a Ad-Cre.
Priama analýza vírusovej DNA izolovanej technikou Hirt a štiepenej s Xhol odhaluje zmiznutie fragmentu zodpovedajúceho replikónu neexcizovaného genómu Ad-Rep, čo ukazuje účinok rekombinácie medzi dvoma miestami LoxP. Analýza Southern prenosu rovnakej vzorky umožnila dokázať fragment 9,2 kb zodpovedajúci replikónu.
V bunkách spoločne infikovaných s Ad-Rep a Ad-Cre možno pozorovať po 48 hodinách aktivitu β-galaktozidázy v 50% buniek zatial čo sa nedetegovala žiadna aktivita β-galaktozidázy v infikovaných bunkách samotným Adeno-Rep. V 96. hodine sa s bunkovým delením zvýšil počet buniek exprimujúcich LacZ. Po pasáži buniek sa expresia LacZ udržala ešte počas 20 dní po spoločnej infekcii. Tieto výsledky ukazujú, že (i) replikón môže byť účinne odstránený v bunke spoločnou infekciou s dvoma adenovírusmi, že (ii) rekombinácia uvoľňuje replikón a aktivuje expresiu transgénu a že (iii) replikón umožňuje zaistiť stabilnú expresiu transgénu počas bunkového delenia.
6.2. Dokázanie in vivo normálnych (CD34+),
..) alebo spoločne
Dokázanie in vivo sa uskutočnilo prenosom ľudských buniek (keratinocyty, hematopoetické bunky bunky kmeňa epitelového bronchiálneho, myoblasty rakovinových buniek (MDA, HT29 ...) dopredu infikovaných s Ad-Rep a Ad-Cre na myši.
Expresia transgénu a stabilita epizómu počas delenia sú overené dopredu opísanými technikami.
bunkového
Zoznam sekvencií (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 26 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:
GGCCTCTAGA CAGCTGGTTA TTTTCC 2 6 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 23 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:
GGCCGGATCC CATATTATCA TCG 23 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 147 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:
CAGCTGGACG TCGGTTCGAA CCGACCTGCA TTTGAGGAGA AGTCTGGATT
ATTGAAGCAT ATCGTATGTA ATATGCTTCA ATATAATTCC CAAGGCCTAG
TAGCGCTCGA GCTCTAAGATC TATAGCTAAC GGCGGTGGTA CCGAAGC
100
147
Tabuľka 1: Pôvod sekvencii použitých na konštrukciu epizómu
sekvencie fragment veikosť (bp) pôvod
LoxP Nôti (1-296) 34 pBS246 (GIBCO- BRL)
LTR RSV BamHI-SalI (478-1080) 602 pRSV-TK (WO95/14101)
oriP EcoRI-Hpal (5052-3235) 1817 pSLori (W095/14101)
SV40polyA BamHI-SalI 399 pCEP-4
(406-7) (Invitrogen)
EBNA-1 BamHI-Pstl 2044 pCMV-EBNA
(759-2803) (Clontech)
IRES (16-518) 502 pCITE2a (Novagen)
TK Cla-Bsawl 1165 pCMV-TK-El
(1721-556) Gene Therapy 3 (1996) 315
pIC19H 2700 Marsh a kol., Gene 32 (1984) 481
pIC20H 2700
pIC20R 2700
pBluescriptII- KS 2850 (Stratagene)
hCMV BglII-BglII (473-1226) 753 pCEP4 (Invitrogen)
Tabuľka 1: pokračovanie
sekvencie fragment veľkosť (bp) pôvod
LacZ StuI-BamHI (1149-4354) 3205 pRSVGalIX (L.Stratford- Perricaudet, J. Clin. Invest 1992 p626)
hCMV-Cre-MTpA HindlII-HindlII (0-3400 3400 pBS185 (GIBCO- BRL)
Zéo-Lac Ncol-Clal (750-1980 1230 pUT641 (CAYLA)

Claims (31)

1. Vírusový vektor obsahujúci oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu a umiestnenými v priamej orientácii, uvedená oblasť obsahujúca aspoň počiatok replikácie a gén záujmu.
2. Vírusový vektor podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že počiatok replikácie je vybraný z počiatkov replikácie vírusu EBV, replikácie papilomavírusu a sekvencií ARS.
3. Vírusový vektor podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že počiatok replikácie je počiatok replikácie EBV vírusu.
4. Vírusový vektor podlá nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m, že aktivita počiatku replikácie je závislá na miestne špecifickej rekombinácii.
5. Vírusový vektor podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že počiatok replikácie obsahuje oblasť oriP vírusu EBV a sekvenciu kódujúcu proteín EBNA1, ktorého expresia je závislá na miestne špecifickej rekombinácii.
6. Vírusový vektor podlá nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa t ý m, že expresia génu záujmu je závislá na miestne špecifickej rekombinácii.
7. Vírusový vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu a umiestnenými v priamej orientácii, uvedená oblasť obsahuje postupne promótor funkčný v cicavčích bunkách, sekvenciu oriP vírusu EBV, kazetu expresie obsahujúcu gén a gén proteínu ÉBNAÍ oddelené sekvenciou IRES odvodenej z vírusu ECMV, promótor a kazetu expresie, ktoré sú orientované takým spôsobom, že expresia dvoch génov je možná iba po miestne špecifickej rekombinácii.
8. Vírusový vektor podlá nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že sekvencie umožňujúce miestne špecifickú rekombináciu sú sekvencie schopné špecificky rekombinovať v prítomnosti rekombinázy.
9. Vírusový vektor podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sekvencie umožňujúce miestne špecifickú rekombináciu sú odvodené z bakteriofága.
10. Vírusový vektor podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sekvencie umožňujúce miestne špecifickú rekombináciu sú odvodené z bakteriofága PI.
11. Vírusový vektor podlá nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ide o obrátené repetície sekvencie bakteriofága PI (oblasť loxP), ktorých rekombinácia je indukovaná rekombinázou Cre.
12. Vírusový vektor podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem iného oblasť ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu, gén kódujúci zodpovedajúcu rekombinázu.
13. Vírusový vektor podlá nároku 12, vyznačujúci sa tým, že gén kódujúci rekombinázu je umiestnený pod riadením indukovatelného promótora.
14. Vírusový vektor podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že promótor je vybraný z promótora MMTV indukovatelného dexametazónom a promótora indukovatelného tetracyklínom.
15. Vírusový vektor podía nároku 13, vyznačujúci sa tým, že gén rekombinázy obsahuje okrem iného regulačný element kódujúci väzbovú doménu receptora hormónu.
16. Vírusový vektor podía nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ide o receptor vybraný z receptorov glukokortikoidových, mineralokortikoidových, tyroidových, estrogénu, aldosterónu a kyseliny retinovej.
17. Vírusový vektor podía jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že oblasť enkapsidácie vírusu je včlenená do oblasti DNA ohraničenej dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu.
18. Vírusový vektor podía jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že ide o defektný rekombinantný adenovírus.
19. Vírusový vektor podía nároku 18, vyznačujúci sa tým, že ide o adenovírus obsahujúci úplnú alebo čiastočnú deléciu oblasti El.
20. Vírusový vektor podía nároku 19, vyznačujúci sa tým, že ide o adenovírus obsahujúci okrem iného úplnú alebo čiastočnú deléciu oblasti E4.
21. Vírusový vektor podía nárokov 1 až 17, vyznačuj ú c i sa t ý m, že ide o defektný rekombinantný retrovírus.
22. Vírusový vektor podľa nárokov 1 až 17, vyznačuj ú c i sa t ý m, že ide o defektný rekombinantný AAV.
23. Bunka modifikovaná vložením vírusového vektora podľa jedného z nárokov 1 až 22.
24. Bunka podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že ide o eukaryotickú bunku.
25. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň vírusový vektor podľa jedného z nárokov 1 až 22 alebo bunku podľa nároku 23.
26. Postup prípravy in situ molekúl replikativnej kruhovej DNA, vyznačujúci sa tým, že bunková populácia obsahujúca vírusový vektor podľa nároku 8 je skontaktovaná s rekombinázou umožňujúcou indukovať in situ miestne špecifickú rekombináciu.
27. Postup podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že skontaktovanie s rekombinázou je uskutočnené transfekciou alebo infekciou uvedených buniek s plazmidom alebo vírusovým vektorom obsahujúcim gén uvedenej rekombinázy.
28. Postup prípravy in situ molekúl replikativnej kruhovej DNA obsahujúci:
(i) transformáciu buniek prostredníctvom vírusového vektora obsahujúceho:
oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu v prítomnosti rekombinázy a umiestnenými v priamej orientácii, uvedená oblasť obsahuje aspoň počiatok replikácie a gén záujmu a gén kódujúci uvedenú rekombinázu pod riadením indukovateľného promótora (ii) indukciu expresie rekombinázy.
29. Použitie vírusového vektora na vytvorenie in situ molekúl replikatívnej kruhovej DNA.
30. Postup na prenos nukleových kyselín do bunky obsahujúci (i) transformáciu buniek prostredníctvom vírusového vektora obsahujúceho:
oblasť DNA ohraničenú dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne špecifickú rekombináciu v prítomnosti rekombinázy a umiestnenými v priamej orientácii, uvedená oblasť obsahuje aspoň počiatok replikácie a gén záujmu a gén kódujúci uvedenú rekombinázu pod riadením indukovatelného promótora (ii) indukciu expresie rekombinázy.
31. Molekula replikatívnej kruhovej DNA, vyznačuj ú c a sa t ý m, že obsahuje aspoň:
(i) jeden alebo viac génov záujmu so sekvenciami nevyhnutnými na expresiu, (ii) počiatok replikácie oriP vírusu EBV a (iii) oblasť vyplývajúcu zo špecifickej rekombinácie medzi dvoma sekvenciami.
SK1698-98A 1996-06-12 1997-05-23 Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector SK169898A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9607273A FR2749857B1 (fr) 1996-06-12 1996-06-12 Generation de molecules replicatives in vivo
PCT/FR1997/000914 WO1997047757A1 (fr) 1996-06-12 1997-05-23 Generation de molecules replicatives in vivo

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK169898A3 true SK169898A3 (en) 1999-07-12

Family

ID=9492965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1698-98A SK169898A3 (en) 1996-06-12 1997-05-23 Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6630322B1 (sk)
EP (1) EP0906443B1 (sk)
JP (1) JP2000511779A (sk)
AT (1) ATE301721T1 (sk)
AU (1) AU726442B2 (sk)
BR (1) BR9709700A (sk)
CA (1) CA2257916A1 (sk)
CZ (1) CZ296600B6 (sk)
DE (1) DE69733948T2 (sk)
DK (1) DK0906443T3 (sk)
ES (1) ES2248849T3 (sk)
FR (1) FR2749857B1 (sk)
HU (1) HU224175B1 (sk)
IL (1) IL127430A0 (sk)
NO (1) NO985739L (sk)
SK (1) SK169898A3 (sk)
WO (1) WO1997047757A1 (sk)
ZA (1) ZA975134B (sk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2720756B1 (fr) * 1994-06-02 1996-07-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2799472B1 (fr) * 1999-10-07 2004-07-16 Aventis Pharma Sa Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales
EP1317560A4 (en) * 2000-09-08 2005-10-05 Gen Hospital Corp SELF-ORDERING DNA VECTORS (18.03.02)
AU2002325346A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Aventis Pharma S.A. Method of administration of a gene of interest to the heart and vasculature
US7164056B2 (en) * 2002-05-03 2007-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene targeting using replicating DNA molecules
EP2362912A1 (en) * 2008-11-14 2011-09-07 Life Technologies Corporation Compositions and methods for engineering cells

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665543A (en) * 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
DE4228458A1 (de) * 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
US5834256A (en) * 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US6120764A (en) * 1993-06-24 2000-09-19 Advec, Inc. Adenoviruses for control of gene expression
EP0632054A1 (en) * 1993-06-28 1995-01-04 European Molecular Biology Laboratory Regulation of site-specific recombination by site-specific recombinase/nuclear receptor fusion proteins
JP4216350B2 (ja) * 1994-09-19 2009-01-28 大日本住友製薬株式会社 動物細胞感染用の組換えｄｎａウイルスベクター
US5801030A (en) * 1995-09-01 1998-09-01 Genvec, Inc. Methods and vectors for site-specific recombination
AU1695197A (en) * 1996-01-05 1997-08-01 Genetic Therapy, Inc. Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
FR2749857B1 (fr) 1998-08-14
EP0906443A1 (fr) 1999-04-07
CA2257916A1 (fr) 1997-12-18
HU224175B1 (hu) 2005-06-28
DE69733948D1 (de) 2005-09-15
AU3037797A (en) 1998-01-07
HUP9902585A3 (en) 2001-11-28
DK0906443T3 (da) 2005-12-19
FR2749857A1 (fr) 1997-12-19
IL127430A0 (en) 1999-10-28
HUP9902585A2 (hu) 1999-11-29
BR9709700A (pt) 1999-08-10
WO1997047757A1 (fr) 1997-12-18
CZ402398A3 (cs) 1999-03-17
NO985739D0 (no) 1998-12-08
EP0906443B1 (fr) 2005-08-10
JP2000511779A (ja) 2000-09-12
ZA975134B (en) 1997-12-31
CZ296600B6 (cs) 2006-04-12
NO985739L (no) 1998-12-08
US6630322B1 (en) 2003-10-07
ES2248849T3 (es) 2006-03-16
AU726442B2 (en) 2000-11-09
DE69733948T2 (de) 2006-06-08
ATE301721T1 (de) 2005-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6156497A (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors
ES2260803T3 (es) Procedimiento para la produccion de virus recombinantes.
KR100379654B1 (ko) 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터
US6340595B1 (en) High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications
AU747847B2 (en) A simplified system for generating recombinant adenoviruses
WO1997025446A9 (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors
SK282843B6 (sk) Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom
JPH09509578A (ja) 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用
US6806080B2 (en) Hybrid vectors for gene therapy
US20070166286A1 (en) Self-rearranging DNA vectors
KR100631428B1 (ko) 위치-특이적 재조합 기술을 이용한 재조합 바이러스의 제조방법
US6943012B2 (en) Helper dependent adenoviral vector system and methods for using the same
SK169898A3 (en) Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector
Youil et al. Comparative analysis of the effects of packaging signal, transgene orientation, promoters, polyadenylation signals, and E3 region on growth properties of first-generation adenoviruses
KR20000053163A (ko) 표적화된 유도가능한 유전자 발현을 위한 신규 작제물 및 벡터
JP2021052763A (ja) 大きな核酸をクローニングするためのアデノウイルスベクターを作製する手段
KR100537142B1 (ko) 복제성분자의 생체내 제조방법
JP2003519464A (ja) 代替の血清型のヘルパー依存型アデノウィルスベクターを使用することにより反復ベクター投与が可能になる
MXPA98009881A (en) Generation of v replication molecules
AU3345801A (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors
AU2002303151A1 (en) A helper dependent adenoviral vector system and methods for using the same