KR100631428B1

KR100631428B1 - 위치-특이적 재조합 기술을 이용한 재조합 바이러스의 제조방법

Info

Publication number: KR100631428B1
Application number: KR1020047014159A
Authority: KR
Inventors: 손호선; 정연철; 신동승; 김경진; 조성은; 최은욱
Original assignee: (주)뉴로제넥스
Priority date: 2002-03-09
Filing date: 2003-03-08
Publication date: 2006-10-11
Also published as: JP2010193896A; AU2003212687A1; EP1483375B1; WO2003076605A1; JP2005519603A; US20040005710A1; CN1639325A; JP4558328B2; CN100532545C; KR20040111390A; DE60325942D1; EP1483375A4; ATE421576T1; EP1483375A1

Abstract

본 발명은 시험관내에서 위치-특이적 재조합기술을 사용하여 재조합 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 선형의 바이러스 게놈 DNA를 2개의 절편으로 분해하고 시험관내에서 위치-특이적 재조합효소 부위에 플랭킹되어 있는 목적 게놈 물질과 위치-특이적 재조합 단계를 수행한다. 본 발명에 따르면, 위치-특이적 재조합 혼합물은 재조합 바이러스 게놈 DNA를 선별하는 추가적인 절차없이 숙주 세포에 적용될 수 있기 때문에 동시에 수많은 재조합 바이러스를 신속하게 수득하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 수백 또는 수천개 이상의 재조합 바이러스를 생성하기 위한 고효율 시스템으로서 사용될 수 있다.

Description

위치-특이적 재조합기술을 이용한 재조합 바이러스의 제조 방법{A METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT VIRUSES USING SITE-SPECIFIC RECOMBINATION}

본 발명은 재조합 바이러스의 제조 방법 및 이를 구성하는 벡터에 대한 것이다. 본 발명은 또한 이 방법을 수행하기 위한 DNA 구성물 및 이 방법에 의해 생성된 재조합 바이러스에 관한 것이다.

재조합 바이러스 벡터는 백신의 제조, 유전자 또는 유전자 군의 기능분석, 특정 유전자 도메인의 기능분석, 유전자 치료, 라이브러리의 제조, 단백질의 생산 등의 목적을 위해 조작된 벡터를 말한다. 바이러스 벡터에 삽입되는 목적 유전물질은 발현시키고자 하는 모든 유전물질 예를 들어, 유전자, cDNA, 게놈 DNA, 펩타이드를 발현할 수 있는 DNA 서열, 특정 단백질의 전체 또는 일부를 발현하는 서열, RNA, 안티센스 RNA, siRNA를 발현할 수 있는 DNA, 프로모터, 인핸서 등을 포함하며, 이와 같은 재조합 바이러스 벡터의 제조에 이용되는 바이러스로는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 허프스바이러스 (Herpes virus) 또는 박시니아 바이러스 등이 있다.

현재 재조합 바이러스 벡터의 제조에 이용되는 바이러스 중에서 레트로 바이 러스가 유전자 치료에 가장 널리 사용되는 것으로 알려졌다 [참고문헌: Clive Patience et al. J Virol, 72:2671-2676, 1998, Marshall, Science, 269: 1050-1055,1995]. 레트로바이러스 게놈은 2개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3개의 암호화 영역 (gag, pol 및 env)을 포함하며, 재조합 레트로바이러스 벡터의 제작 및 이의 시험관 내 또는 생체 내 사용은 문헌에 기재되어 있다 [참고문헌: WO9908692A1, EP 453242]. 그러나, 레트로바이러스 벡터는 임상적으로 사용하는 경우, 패키징 세포주에 존재하는 동일한 바이러스 유전자 서열을 포함하여 벡터와 패키징 게놈의 재조합에 의하여 복제가능레트로바이러스 (replication-competent retrovirus: RCR)를 생성할 가능성이 크고 (참고문헌: Sharon K. Powell et al. J.Virol., 73:8813-8816, 1999), 생체 내 (in vivo)에서는 유전자 발현량이 상대적으로 적으며 시간에 따라 발현량이 감소하고, 바이러스 생산역가가 낮으며, 세포분열이 일어나지 않는 세포로는 유전자를 전달하지 못하는 단점이 있다 [Jaffe, E.M. Cancer Res., 53:2221-2226, 1993; Bender, M.A. et al. J. Virol., 61:1639-1646, 1987].

한편, 아데노바이러스는 각각의 말단에 103 bp의 역위 말단 반복부 (ITR) 서열을 지닌 약 36 kb의 선형 게놈을 가진 복제 기원 및 좌측 ITR 근처에 캡시드화 시그널을 포함한다 [참고문헌: Shenk, Adenoviridae: The Viruses andTheir Replication. In: Fields BN, Knipe DM Howley PM, ed. Virology. Philadelphia: Raven publishers, 1996: 2111-2148]. 대부분의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스의 DNA 복제과정에 필수적인 E1 부위를 목적 외래 유전물질로 대체하는 방법에 의해 제조되어 왔는데, 이는 재조합 아데노바이러스가 E1 부위로부터 발현되 는 단백질을 공급하는 패키징 세포주에서만 바이러스로 복제되고, 다른 세포에서는 복제 및 입자화되지 않도록 하기 위함이다. 지금까지 공지된 대표적인 패키징 세포로는 HEK293 세포, 911 세포, PER. C6 세포 등이 있다 [참고문헌: Hitt MM et al., Advances in Pharmacology, vol. 40, 137-206 (1997), Wang Y. and Huang S., Drug]. 벡터로서 이용되는 재조합 아데노바이러스는 안전성 및 매우 광범위한 세포 친화성을 지니고 활발하게 분열하는 세포를 감염시킬 수 있으며, 높은 역가 (10¹¹ pfu/ml)로 생성될 수 있는 장점이 있다. 따라서, 아데노바이러스는 이종 유전자의 클로닝 및 발현을 위한 벡터의 제조에 바람직한 것으로 알려져 있다.

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 4700개의 염기를 포함하고 각 말단에 복제 원점으로서 제공되는 약 145개 염기의 역위 말단 반복부 (ITR)을 포함하며, 이들이 감염하는 세포의 게놈 DNA내로 안정적이고 특이적으로 혼입될 수 있다.
재조합 바이러스를 벡터로서 이용하기 위해서는, 감염된 세포에서 이들 바이러스가 자가 복제할 수 없도록 바이러스 게놈이 변형되어야 한다. 따라서, 상기바이러스는 복제에 필수적인 게놈의 특정 영역을 결손시켜 재조합 벡터의 제조에 이용된다. 예를 들어, 레트로바이러스는 gag, pol 및 env 유전자를 일부 이상 결실시키고, 그 위치에 목적유전물질이 삽입되며 [참고문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987)1639], 아데노바이러스는 상기한 바와 같이 E1 뿐만 아니라, E2 및/또는 E4이 결실되어 이용되고 있다 [참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161, Van der Vliet et al., (1975)]. 또한, 바이러스 생성을 위한 필수영역 (ITR 및 캡시드화 서열)만을 함유하는 "슈도-아데노바이러스" 벡터가 이용되고 있다 (참고문헌: WO95/02697).
구체적으로, 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법은 크게 하기 3부류로 분류할 수 있다.

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제 1 방법은 세포내에서 목적 외래 유전물질을 운반하는 운반벡터와 아데노바이러스 게놈 DNA 사이의 상동 재조합을 이용하는 방법이다 [Hitt MM et al., Advances in Pharmacology, vol. 40, 137-206 (1997)]이다. 이 방법은 운반벡터에 목적 외래 유전물질을 클로닝한 후 이를 아데노바이러스 게놈 DNA와 함께 패키징 세포에 도입하여 세포내 상동 재조합을 일으키는 과정을 필수적으로 포함한다. 여기서, 운반벡터는 외래 유전물질을 적절하게 발현시키기 위한 카세트 (cassette) 예컨대, 프로모터 (promotor), 클로닝을 위한 제한효소 부위, poly(A) 부착 시그널 등을 포함한다. 또한, 운반벡터는 아데노바이러스 게놈 DNA와 상동 재조합을 유도하는 염기서열을 포함한다. 일반적으로 이러한 방법에 사용되는 아데노바이러스 게놈은 아데노바이러스의 증식에 필요한 LITR, 패키징 신호, E1 부위가 결실된 비감염성 아데노바이러스 게놈이 사용된다. 한편, 프랭크 그라함 (Frank Graham) 등은 상기 방법을 이용함에 있어, 결실 (비감염성) 아데노바이러스 게놈을 바이러스로부터 추출해야 했던 문제점을 해결하기 위해 벡터를 대장균에서 증식 가능한 플라스미드 형태로 구성하고, 이를 이용하여 결실 아데노바이러스 게놈을 대장균으로부터 대량으로 얻을 수 있었다 [Bett AJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,, vol 91, 8802-8806 (1994)]. 그러나, 프랭크 그라함 등의 방법도 운반벡터와 비감염성 아데노바이러스 DNA 사이의 상동 재조합을 유도하여 재조합 바이러스를 제조해야 한다는 점에서 종래기술과 차이가 없었으며, 패키징 세포내의 낮은 상동 재조합 효율은 비효율적인 재조합 바이러스 생산을 가져왔다.

재조합 아데노바이러스를 얻기 위한 제 2 방법은 제한효소와 라이가아제(ligase)를 사용하여 목적 외래 유전물질을 아데노바이러스 게놈의 특정 부위에 직접 클로닝하는 방법이다. 이 방법은 약 30 kb 크기의 아데노바이러스 게놈이 갖는 복잡성과 이로 인한 클로닝의 어려움을 극복하기 위해 목적 유전자 발현 카세트를 운반벡터에 클로닝하고, 바이러스 게놈과 운반벡터에 있는 특이적인 제한효소 절단부위를 이용하여 클로닝 한 다음, 이를 대장균에 도입하여 목적하는 클론을 수득하여 패키징 세포에 도입하므로써 재조합 바이러스를 제조한다 [참고문헌: Mizuguchi H. and Kay MA., Human Gene Therapy, vol. 10, 2013-2017 (1999)]. 한편, 대장균을 이용하지 않고 바이러스로부터 추출한 바이러스 게놈 DNA를 직접 이용하는 방법에는 재조합 바이러스의 생성 효율을 높이기 위해 ITR 말단에 터미널 단백질 전구체 (pTP)가 붙은 형태로 바이러스 DNA를 추출하여 목적 유전자 발현 카세트와 라이게이션시킨 다음 세포주에 직접 도입하는 방법이 있다 [참고문헌: Okada T. et al., Nucleic Acids Research, vol. 26, 1947-1950 (1998)].

재조합 아데노바이러스를 제조하기 위한 제 3의 방법으로서, 패키징 세포내의 낮은 상동 재조합 효율을 개선하기 위해 상동 재조합 효율이 비교적 높은 대장균을 사용하는 방법이다 [참고문헌: Chartier C. et al., Journal of Virology, vol. 70, 4805-4810 (1996), He T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,, Vol 95, 2509-2514 (1998)]. 이 방법에서, 운반벡터에 목적 유전물질을 클로닝하는 과정은 종래 기술과 동일하나, 이를 플라스미드 형태로 존재하는 아데노바이러스 게놈과 함께 상동 재조합을 일으킬 수 있는 대장균에 동시에 도입하여 비교적 높은 효율로 상동 재조합을 유도한다는 점에서 상이하고, 세포내에서 상동 재조합을 유도하는 종래 방법 보다 더 높은 효율로 재조합 아데노바이러스를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 상기 제 3의 방법은 목적 유전물질을 운반벡터에 클로닝해야 하고, 상동 재조합을 유도할 수 있는 특별한 대장균 균주 (예를 들어, BJ5183)를 사용해야 하며, 대장균 내에서 상동 재조합이 발생한 재조합 DNA를 다시 스크리닝 해야 하고, 상동 재조합을 유도할 수 있는 대장균 균주 내에서의 플라스미드의 불안정성으로 인해 다시 다른 대장균 균주 (예, DH5alpha)로 플라스미드를 옮겨야 한다는 점 등에서 복잡하고 비효율적이다.

이와 같이, 재조합 바이러스의 제조를 위한 종래기술은, i) 운반벡터에 목적 유전물질을 특정한 목적에 부합되도록 클로닝 해야 한다는 점, ii) 목적 유전물질이 바이러스 게놈에 삽입되는 과정이 세포 내에서 이루어져야 하므로 복잡하고 효율성의 저하를 초래할 수 있는 클로닝 과정이 필요하며, iii) 대량 배양 등 목적하는 용도로 이용하기에 앞서 숙주세포로부터 목적하는 재조합 바이러스를 선별 하여야 하는 등의 단점이 있어, 재조합 바이러스의 제조시 많은 시간과 노력이 소요되고, 생성 효율이 낮다는 문제가 있었다. 특히, 상기 단계 ii) 및 단계 iii)은 재조합 바이러스를 제조함에 있어 해결되어야 할 가장 큰 과제 중의 하나로 지적되어 왔으며, 이를 해결하고자 하는 노력이 계속하여 이루어져 왔다. 더욱이, 최근 재조합 바이러스의 다양한 적용이 개발됨에 따라 보다 더 용이하고 신속하며, 보다 더 고효율적인 재조합 바이러스 제조 방법에 대한 요구가 증대하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 목적하는 유전자를 함유하는 재조합 바이러스를 보다 더 용이하고 효율적으로 수득할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하였으며, 그 결과 시험관내에서 위치-특이적 재조합 (site-specific recombination)으로 재조합 바이러스 벡터를 제조하고 이를 재조합 바이러스 제조에 이용함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 보다 더 신속하고 용이하며 효율적인 재조합 바이러스를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 시험관 내에서 위치-특이적 재조합 방법으로 제조하여 이용하였다. 보다 더 구체적으로 본 발명에서 사용된 바이러스는 선형의 게놈 DNA를 가지고 있다. 그러므로, 본 발명의 다른 목적은 시험관내 위치-특이적 재조합을 이용하여 재조합 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명에서, 시험관 내 위치-특이적재조합을 이용함에 있어 바이러스 게놈 DNA를 포함하는 벡터를 각각 바이러스 발현에 필수적인 2개의 단편, 즉 각각 단독으로는 바이러스를 발현할 수 없으며 결합된 상태에서만 편으로 절단하여 적용하였으며, 목적 유전물질을 포함하는 DNA 단편이 상기 절단된 2개의 단편 사이에 특이적으로 결합되므로 목적 유전물질이 결합되지 아니한 재조합 바이러스 벡터의 생성이 원천적으로 차단되어 목적하는 재조합 바이러스를 분리하는 단계 없이도 숙주세포로부터 재조합 바이러스를 고수율로 수득할 수 있다.

본래 위치-특이적 재조합은 다양한 종의 생명체에서 생명활동을 영위하기 위한 수단으로서 자연발생적으로 이루어지는 현상으로써, 위치-특이적 재조합에 사용되는 효소는 통상적으로 엔도뉴클리아제 활성과 라이가아제 활성 둘 모두를 포함하며, 이들 재조합 효소들은 DNA 상에 존재하는 특정 염기서열을 인지하고 이들 대응하는 염기서열과 교한하는 역할을 한다 [참고문헌: Yang W. and Mizuuchi K., Structure, 1997, Vol. 5, 1401-1406(9)]. 현재까지 가장 잘 연구된 위치-특이적 재조합 시스템에는, 박테리오파아지 람다에서 알려진 인테그라아제 (Int/att) 재조합 시스템, P1 박테리오파지에서 발견된 Cre/LoxP 시스템, 및 효모에서 발견된 FLP-FRT 시스템 등이 잘 연구된 시스템 등이 있다.

위치-특이적 재조합 시스템이 재조합 바이러스의 제조에 사용된 예로는, i) 재조합 바이러스에 클로닝된 목적 유전물질의 발현 조절, ii) 헬퍼 (helper) 바이러스 의존적인 바이러스의 제조시 헬퍼 바이러스의 제거, iii) 바이러스의 제조시 패키징 세포 내에서 일어나는 상동 재조합의 낮은 효율을 증가시키기 위한 보조적 사용, 또는 iv) 운반벡터와 바이러스 게놈 사이의 위치-특이적 재조합이 패키징 세포 내에서 일어나도록 유도하여 재조합 바이러스를 제조 [참고문헌: Philip NG et al., Biotechniques, vol. 29., 524-528 (2000), Philip NG et al., Human Gene therapy, vol. 10., 2667-2672 (1999), Hardy S et al., Journal of Viology, vol. 71., 1842-1849 (1997), Parks RJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,, vol 93., 13565-13570 (1996)] 등이 있으나, 모두 생체 내 또는 특정 세포주를 이용한 클로닝 과정에 보조적으로 이용되고 있을 뿐이다.

이와 같이, 본 발명에서와 같이 위치-특이적 재조합을 시험관 내에서 재조합 바이러스 벡터의 제조를 위한 목적 유전물질의 특이적인 삽입에 이용한 것은 종래기술에서 그 예를 찾아 볼 수 없으며, 특히 목적 유전물질이 결합되는 바이러스 게놈 DNA를 2개의 단편으로 절단하여 적용한 예 또한 찾아 볼 수 없다.

따라서, 본 발명은 시험관 내에서 위치-특이적 재조합을 이용하여 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 것을 그 기술적 특징으로 하고 있으며, 이는 재조합 바이러스를 제조함에 있어서 종래기술로부터 예측할 수 없는 다음과 같은 현저한장점을 갖는다: i) 위치-특이적 재조합을 이용하여 시험관 내에서 목적 유전물질과 바이러스 게놈 사이의 재조합을 유도함으로써 보다 더 신속하고 용이하며 특이적으로 재조합 바이러스의 제조를 위한 벡터를 제조할 수 있고, ii) 목적 유전물질과 위치-특이적 재조합 서열을 포함하는 DNA 단편 및 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열을 포함하고 각각 바이러스 형성에 필수적인 2개의 절단된 선형 바이러스 게놈 DNA를 사용하므로써 목적 유전물질이 삽입되지 아니한 벡터의 생성을 원천적으로 차단하여 숙주세포로부터 목적하는 재조합 바이러스를 분리 (selection)하는 단계 예를 들어, 플라크 단리 등의 단계 [Nash HA and Pollock TJ., J. Mol. Biol. vol. 170., 19-38 (1983)]를 생략할 수 있으며, iii) 시험관 내에서 제조된 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 반응 혼합물을 추가의 공정없이 숙주세포에 그대로 적용하여 재조합 바이러스를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 패키징 세포 내에서의 효율이 낮은 상동 재조합을 유도할 필요가 없을 뿐만아니라, 대장균 내에서 상동 재조합을 유도하기 위해 특별한 균주를 사용해야 할 필요가 없다. 본 명세서에 첨부된 도 5는 종래기술에서 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법 (AdEasy system)과 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 제조 방법 (AdHT System)의 단계별 과정을 비교한 것으로서, 본 발명에 따라 재조합 아데노바이러스를 제조하는 경우 종래기술 보다 훨씬 더 신속하게 목적하는 재조합 바이러스를 수득할 수 있음을 보여준다.

또한, 본 발명에 따르면 시험관 내에서 바이러스의 게놈과 목적 유전물질의 결합이 정확하게 이루어지므로, 멀티-웰 (e.g. 96-well and 384-well) 환경에서 동시에 다양한 유형의 재조합 바이러스를 제조하기 위한 목적에도 매우 적합하다. 또한, 본 발명은 단일 범용 벡터 (pMaster Vector)에 목적 유전물질을 클로닝하고 이를 여러 가지 유형의 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노 부속 바이러스, 박테리오파아지, 코로나 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, CMV, EBV, VZV를 포함하는 선형의 게놈을 지닌 바이러스) 게놈에 동일한 방법으로 삽입할 수 있으므로 하나의 유전물질을 다양한 재조합 바이러스 형태로 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 재조합 바이러스의 제조 방법은 게놈 프로젝트 이후 획기적으로 증가된 유전자의 기능연구에 대단히 유용한 방법을 제공한다 [참고문헌: Wang Y. and Huang S., Drug Discovery Today, vol. 5, 10-16 (2000)].

일 구체예에서, 본 발명은 선형의 게놈 DNA를 지닌 바이러스로서 아데노바이 러스를 이용하여 재조합 바이러스를 제조하였다.

도 2에 도시한 바와 같이, 재조합 아데노바이러스의 게놈 DNA를 각각 바이러스의 복제와 생성에 필수적인 두 개의 단편으로 절단하고, 이것을 주형(template)으로 사용하여 위치-특이적 재조합 염기서열을 포함하는 목적 유전물질과 위치-특이적으로 재조합시켰다. 보다 구체적으로, 본 발명은 E1 부위가 제거된 아데노바이러스 게놈을 두 개의 단편으로 절단하고, 각 단편의 특정 위치에 위치-특이적 재조합을 시험관 내에서 유도할 수 있는 위치특이적 재조합효소 인식 염기서열을 도입하였으며, 상기 재조합 염기서열과 위치-특이적으로 결합하는 다른 재조합 염기서열을 목적 유전물질을 포함하는 DNA의 양 말단에 도입함으로써 재조합이 일어난 바이러스 게놈만이 패키징 세포 내에서 복제 가능한 주형으로 이용될 수 있도록 하였다. 즉, 두 개의 단편으로 나누어진 바이러스 게놈은 패키징 세포 내로 도입되어도 바이러스 DNA의 적절한 복제 및 입자화가 유도되지 않아 바이러스를 생성하지 못하며, 목적 유전물질이 위치-특이적 재조합에 의해 바이러스 게놈에 삽입되어 바이러스 게놈이 복제 및 입자화가 가능한 형태로 구성된 재조합 바이러스 게놈만이 바이러스를 형성할 수 있으므로, 목적 유전물질이 삽입되지 않은 바이러스의 생성이 원천적으로 차단된다.

도 2에서, 아데노바이러스 게놈의 절단된 좌측 단편은 ITR, 패키징 신호를 포함하고, 우측 단편은 바이러스의 복제에 필요한 다른 유전자들을 포함하며, 이들 두 개의 단편이 나누어진 상태에서는 바이러스의 복제 및 입자화가 이루어지지 않는다 (우측 단편의 경우 입자화에 필요한 시그널이 결여되어 있으며, 좌측 단편의 경우 바이러스로 입자화 될 수 있는 게놈 크기에 미달한다).

선형의 바이러스 게놈을 두 개의 단편으로 절단하는 방법은 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다. 제 1 방법은 한쌍의 위치-특이적 재조합 서열을 포함하는 바이러스 게놈 DNA를 제한효소를 사용하여 절단하여 각각 바이러스의 입자화에 필수적이고 위치특이적 재조합효소 인식 염기서열을 가진 두 개의 DNA 단편을 수득하는 것이다 (도 2 참조). 보다 구체적으로, 바이러스 게놈 DNA를 두 개의 단편으로 절단하기 위해, 먼저 목적 유전물질이 위치-특이적 재조합에 의해 치환되는 위치에 하나 이상의 제한효소 인식부위를 클로닝 한다 (도 1 참조). 이러한 구조를 가진 바이러스 게놈 DNA는 대장균으로부터 플라스미드의 형태로 얻거나, 바이러스로부터 직접 분리하여 얻을 수 있으며 간단한 제한효소 처리에 의해 두 개의 단편으로 나눌 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 형태로 얻어진 바이러스 게놈 DNA는 도 1의 pAdHTS (SEQ. ID No.: 1)와 같은 구조를 가지며, 제한효소 처리에 의해 모두 세 개의 단편으로 절단된다. 분리된 단편 중 위치-특이적 재조합, 바이러스 복제 및 입자화에 관여하지 않는 단편 예컨데, 대장균 내에서 플라스미드 복제에 필요한 항생제 마커 부분 등이 포함된 단편을 제외하고 도 2에 도시된 바와 같이 두개의 단편이 재조합 바이러스 벡터의 제조에 이용된다.

제 2의 방법은 제한효소의 절단 효율에 따른 선대 (parental) 바이러스의 생성 위험을 근원적으로 차단하는 수단을 제공한다. 실시예 3에 나타낸 바와 같이 선형 바이러스 게놈의 좌측 단편과 우측 단편을 다른 위치-특이적 재조합 서열을 포함한 서로 다른 플라스미드 형태로 클로닝하고 이를 선형화하는 방법이다. 도 3에서, 좌측 단편은 ITR과 패키징 시그널이 포함되고 우측 단편은 바이러스의 증식에 필수적인 나머지 부분을 포함하며 이들 각각의 단편은 DNA를 대장균에서 복제하기 위한 복제 원점 (replication origin) (pBR322 origin 또는 pUC origin 등)과 선택성 마커 (selection marker) (Ampr, Kanr, Cmr 등)를 포함한다. 이들 각 단편은 서로 다른 플라스미드 형태로 제조될 수 있다.

시험관 내 재조합을 일으키기 위한 두 DNA 단편의 형태는 선형 또는 원형 모두가 가능하다. 예를 들어, 제한효소를 이용하여 각각의 벡터를 선형화 시킨 DNA를 pMaster 벡터와 시험관 내 재조합을 유도할 수 있는데, 이 경우 최종적으로 재조합된 DNA의 형태는 도 4와 같은 선형의 재조합 바이러스 게놈이 된다. 원형 플라스미드 DNA를 재조합 한 뒤 다시 PacI 과 같은 제한효소로 선형화할 경우에도 최종 산물은 도 4와 동일하며 패키징 세포 내로 도입하여 바이러스의 형성을 유도할 수 있다 (도 3 및 도 4).

일 구체예에서, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 목적 유전물질의 발현을 유도할 수 있는 프로모터가 도입된다. 상기 프로모터는 단편으로 분리된 바이러스 게놈 DNA 형태에서는 작동하지 않으나, 위치-특이적 재조합에 의해 목적 유전물질이 삽입되면 목적 유전물질의 발현을 유도하는 역할을 한다. 도 6에서 녹색형광 단백질 (GFP)나 Gus의 유전자 발현이 위치-특이적 재조합을 유도하지 않은 반응군이 세포 내에서 유전자를 전혀 발현하지 않는다는 데서 예시되고 증명된 바와 같다.

재조합 바이러스의 특정 목적을 위해 도입되는 프로모터에는, 지속적인 유전 자 발현을 유도하는 바이러스 유래의 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV 프로모터 등이 있으며, 특정 환경에서만 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터, 호르몬에 의해 작동이 유도되는 ERE를 포함하고 있는 프로모터, 곤충 호르몬인 엑다이손에 의해 작동되는 프로모터, 항생제 테트라사이클린에 의해 유도되는 프로모터 등이 포함된다. 이들 프로모터는 목적 유전물질의 목적에 적합하게 바이러스 게놈에 삽입하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 두 개의 바이러스 게놈 DNA 단편에 포함되는 attR 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열은 목적 유전물질이 클로닝된 운반벡터로부터 제공되는 attL 위치-특이적 재조합효소 인식 인식염기 서열과 재조합되어 attB 및 attP 서열을 구성한다 [Pollock TJ and Nash HA, J. Mol. Biol. vol. 170., 1-18 (1983)]. 즉, 두 개의 단편으로 분리된 바이러스 게놈과 목적 유전물질이 클로닝된 운반벡터를, 람다 인테그라아제 재조합 효소, 보조인자로 작용하는 IHF 및 엑시즈나아제와 함께 처리하면 바이러스 게놈에 포함된 attR 서열과 벡터의 attL 서열이 서로 재조합되어 attB 서열로 바뀌게 되며 그 부산물로 attP 서열을 지닌 벡터 DNA 단편을 수득할 수 있다.

상기 혼합물을 재조합 바이러스를 발현시키기에 적합한 숙주세포 내로 도입하면 attB1-[목적유전물질]-attB2와 결합된 바이러스 게놈 DNA만이 복제 및 입자화되며 반응에 참여하지 않은 바이러스 DNA 단편들과 벡터 DNA, 반응후 attP 서열을 갖는 벡터 DNA 단편들은 바이러스로 입자화 되지 않는다.

도 6에 제시된 바와 같이, 재조합 효소를 처리한 군에서 바이러스 게놈 DNA의 좌측 단편이 사라짐을 확인함으로써 attR 서열을 포함하는 단편들이 재조합됨을 알 수 있다. 도 7은 목적 유전물질이 바이러스 게놈의 특정 위치에 적절하게 삽입되었는지는 PCR을 통해 확인한 결과를 나타내는 것으로서, PCR 반응은 바이러스 게놈의 특정 위치를 증폭할 수 있는 프라이머 (Adeno-F 및 Adeno-R 프라이머)를 이용하여 재조합 반응전후의 샘플에 대해 수행되었다. 이 PCR 산물들을 DNA 염기서열 결정법을 통해 분석해 본 결과, 바이러스 게놈과 목적 유전물질이 [바이러스 게놈의 좌측단편-attB1-목적유전물질-attB2-바이러스 게놈의 우측 단편]의 형태를 만든 것을 확인하였다.

Adeno-F 프라이머 : 5'-GGTCTATATA AGCAGAGCTG-3' (SEQ. ID No.: 2)

Adeno-R 프라이머: 5'- GTATGGCTGA TTATGATCAG-3' (SEQ. ID No.: 3)

위치-특이적으로 재조합시킨 다음 반응액을 패키징 세포인 293 세포로 도입한 후 바이러스 형성을 조사해 본 결과, 바이러스 입자화가 유도되고 재조합 바이러스가 생성된 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 방법에 따라 바이러스를 제조한 경우, 시험관 내에서의 반응액을 직접 세포 내로 도입하여 재조합 바이러스를 제조할 수 있다는 놀라운 결과를 제시한다. 즉, 본 발명에 따르면 적절한 게놈 DNA를 선별하기 위해 대장균과 같은 중간숙주세포를 이용할 필요 없이 목적 재조합 바이러스를 신속하게 생성할 수 있다.

도 8은 AdHTP 벡터와 pMater 클론 사이의 시험관 내 위치-특이적 재조합 결과를 제시하는 것으로서, 녹색형광 단백질 (GFP)의 발현을 통해 알 수 있는 바와 같이 종래 기술의 방법 (Ad-GFP control)와 비교하여 형광 단백질의 발현이 우수하며, Gus 단백질의 활성 측정은 본 발명에 따른 재조합 바이러스 제조 방법이 단백질의 활성에 아무런 영향이 미치지 아니함을 나타낸다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 과정을 통해 만든 재조합 바이러스는 세포를 감염시켜 목적 유전물질을 발현하는 목적 기능에 매우 적합하다.

도 1은 pAdHTS 벡터의 구조를 나타낸다.

도 2는 pAdHTS 벡터와 pMaster 클론 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 과정을 나타낸다.

도 3a 및 도 3b는 각각 pAd-Left와 pAd-Right 벡터의 구조를 나타낸다.

도 4는 pAd-Left, pAd-Right와 pMaster 클론 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 과정을 나타낸다.

도 5는 AdHTS를 이용하여 재조합 아데노바이러스를 생산하기까지의 전체적인 단계와 소요 시간을 종래기술과 비교하여 제시하는 흐름도이다.

도 6은 pAdHTS 벡터와 pMaster 클론 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 결과를 제시하는 아가로오스겔 사진이다.

도 7은 pAdHTS 벡터와 pMaster 클론 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 결과를 제시하는 PCR 사진이다.

도 8은 AdHTS 벡터와 pMaster 클론 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 결과를 나타내는 것으로서, pMaster 클론에 있는 목적 유전물질이 아데노바이러스 게놈으로 이전 되어 목적 단백질로 발현됨을 제시한다.

도 9는 96웰에서 AdHTS와 pMaster-GFP 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 결과를 제시하는 PCR 사진이다.

도 10은 96웰에서 AdHTS와 pMaster-GFP 사이의 시험관내 위치-특이적 재조합 결과를 나타내는 것으로서, pMaster 클론에 삽입된 GFP 유전자가 아데노바이러스 게놈으로 이전되어 형광 단백질 (GFP)을 발현하고 있음을 제시한다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 본질 및 범위가 하기 실시예의 내용에 한정되는 것이 아님은 물론이다. 또한, 본 발명에서 인용된 모든 문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예 1: pAdHTS를 이용한 위치-특이적 재조합

목적 유전물질을 제공하는 벡터로서, attL 서열을 양측 말단에 가지고 있는 pMaster 벡터 (도 2)를 사용하고, 이 벡터와 위치-특이적 재조합에 의해 결합되는 바이러스 게놈 DNA로서 attR 서열을 양측 말단에 가지고 있는 pAdHTS (SEQ. ID No.: 1)를 통상적인 유전자 재조합 방법으로 제작하였다 (도 1). pAdHTS 벡터는 아데노바이러스 E1 및 E3 부위가 결실되고 E1 위치(region)에 재조합된 목적 유전물질을 발현시킬 수 있는 카세트로서 [(CMV 프로모터)-attR1-(람다 stuffer DNA)- attR2-(polyA 부착 신호)]를 순차적으로 연결하여 구성했다 (도 1 및 도 2). 람다 스터퍼 (stuffer) DNA는 SwaI, ClaI, PacI과 같은 제한효소 인식 부위를 갖도록 PCR 프라이머에 상기 효소 인식 부위를 포함시켜 증폭한 다음 클로닝 하여, PacI 절단, 또는 PacI 및 ClaI 동시 절단 등에 의해 바이러스 게놈이 두 개의 핵심 단편으로 분리될 수 있도록 하고, att 서열은 제임스 엘 (James L) 등이 고안한 돌연변이 att 서열과 동일한 것을 사용하였다 [참고문헌: Hartley JL. et al., Genome Research, vol. 10, 1788-1795 (2000)]. 다음, 돌연변이된 attL 서열을 양측 말단에 가지고 있는 (attL1, attL2) pMaster 벡터에 제한효소를 이용하여 GFP cDNA와 Gus cDNA를 각각 클로닝하여 (도 2, pMaster 벡터의 Gene-X 위치), 클로닝된 벡터를 attL1-목적 유전물질-attL2의 발현 카세트를 지닌 플라스미드 형태로 제조하였다.

pAdHTS (1 마이크로그람)를 PacI 또는 PacI, ClaI 처리한 후, 페놀/클로로포름을 이용하여 DNA만을 순수 분리하였다. GFP cDNA와 Gus cDNA가 삽입된 pMaster-GFP (100 나노그람), pMaster-Gus (100 나노그람)와 각각 100 나노그람의 인테그라아제, 10 나노그람의 IHF, 10 나노그람의 엑시즈나아제를 함께 반응 버퍼 (50mM Tris, pH 7.8, 16.5 mM NaCl, 35 mM KCl, 5 mM Spermidine, 0.25 mM EDTA, 3% Glycerol)에서 25로 1시간 동안 반응시켰다. 인테그라아제와 IHF, 엑시즈나아제는 각각 이미 보고된 문헌을 참고하여 대장균에서 정제하였다 [참고문헌: Kotewicz M et al., Journal of Biological Chemistry, 1980, vol. 255, 2433-2439; Nash HA. and Robertson CA. Journal of Biological Chemistry, vol. 256, 9246-9253 (1981); Cho EH et al., Journal of Bacteriology, vol. 182, 5807-5812 (2000)]. 아가로즈겔에서 전기영동 처리한 결과, 제한효소 PacI을 처리한 pAdHTS는 32 kb, 4.5 kb, 1.8 kb의 3개의 단편을 나타냈으나 (도 7, 제 1 레인), 위치-특이적 재조합이 발생한 경우 1.8 kb 위치의 단편이 사라졌음을 확인 하였다 (도 7, 제 2, 3 레인). 이를 보다 더 구체적으로 확인하기 위해, Adeno-F 및 Adeno-R 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, 그 결과 위치-특이적 재조합 반응을 유도한 반응액에서만 원하는 크기의 PCR 산물 (약 32 kb 및 약 4.5 kb)이 검출됨을 확인하였다 (도 6).

이들 PCR 산물을 각각 아가로즈 겔에서 분리하여 시퀀싱 (sequencing)을 수행하였으며, 그 결과 제 2 레인, 제 3 레인 및 제 4 레인의 PCR 산물은 아데노바이러스 게놈의 불완전한 절단에 의해 증폭된 람다 DNA이고, 제 5 레인의 PCR 산물은 attB1-GFP-attB2로 치환된 DNA이며, 제 6 레인의 PCR 산물은 attB1-Gus-attB2로 치환된 DNA인 것으로 밝혀졌다. 즉, 두 개의 아데노바이러스 게놈 단편과 하나의 pMaster 클론 사이에 재조합이 정확하게 유도되었다.

실시예 2: pAdHTS를 이용한 바이러스 제조

실시예 1에서 위치-특이적 재조합을 유도한 반응액 2 마이크로리터 (DNA 100 나노그람)를 293 패키징 세포주에 도입하였다. 24-웰에 웰 당 5 X 10⁴ 세포를 DMEM에 5% 우태아혈을 첨가한 배지와 함께 분주하였고, 24시간 후 재조합을 유도한 반응액 2 마이크로리터와 0.5 마이크로리터의 LipofecAmine2000 용액 (Invitrogen사)과 혼합하여 세포에 도입하였다. 세포 내로 DNA를 도입하는 방법은 LipofecAmine2000의 제조사인 제조자의 프로토콜에 따라 수행했다. DNA를 도입한지 7일 후 세포에 바이러스의 생성을 표지하는 CPE가 형성되었음을 현미경으로 관찰할 수 있었으며, 이때 세포를 수거하여 원심 분리에 의해 침전시킨 뒤 100 마이크로리터의 DMEM 10% 우태아혈청에 현탁시키고, 이를 -70℃에서 1시간 냉동, 37℃에서 5분간 용해를 3회 반복시켜 세포를 파쇄하였다. 생성된 세포 침전물을 원심 분리 방법에 의해 제거하여 최종적으로 바이러스 용액을 얻었다. 수득한 바이러스 용액을 다시 293 세포에 감염시켜 적절한 바이러스가 형성되었는지 여부를 플라크 어세이 (plaque assay) 방법으로 측정하였다.

플라크 분석을 위해 2 X 10⁵ 세포를 6-웰에 분주한 다음, 24시간 후 바이러스 용액 10 마이크로리터를 DMEM 400 마이크로리터와 혼합하여 세포에 덮어주고 1시간 동안 바이러스의 흡착을 유도하였다. 이때 1%의 저융점 아가로즈 (SeaPlaque Agarose; FMC사)가 첨가된 DMEM 배지(3 밀리리터)를 세포에 덮어주어 고형화시킨 뒤 바이러스 플라크의 형성을 2주간 관찰하였다. 바이러스의 역가는 바이러스 용액 1 밀리리터 당 형성된 바이러스 플라크의 개수로서 측정하였으며, 전체 바이러스 중 정확한 재조합 바이러스가 생성된 효율을 계산하기 위해, 2주 후 고형화된 아가로즈위에 Gus 단백질의 기질인 X-Gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-글루쿠로닉산) 500 마이크로그람을 첨가하여 24시간 반응시킨 다음 생성된 청색 플라크의 개수를 측정하였다. 상기 측정법에 의해 계산된 바이러스의 역가는 밀리리터당 10⁶~10⁷ PFU 로 확인되었다. Gus 유전자를 발현하는 재조합 바이러스를 통해 재조합 바이러스가 생겨난 효율을 검사한 결과 모두 청색 플라크로 확인되었으며 이는 본 발명의 방법에 따라 제조한 바이러스가 100% 재조합 바이러스임을 지지했다. 즉, 세 개의 단편사이에서 이루어지는 위치-특이적 재조합 효율이 100%에 미치지 않더라도 반응에 참여하지 않은 DNA, 또는 반응의 부산물들은 바이러스로 입자화 되지 않고 오직 반응이 제대로 일어나 단편이 정확하게 조합된 바이러스 게놈만이 바이러스로 입자화 되었음을 확인하였다.

도 8에 예시한 바와 같은 녹색형광단백질 (GFP)를 발현하는 재조합 바이러스와 Gus를 발현하는 재조합 바이러스를 상기와 같이 제조한 후 다시 293 세포를 감염시킨 다음, 형광 현미경하에서 관찰하거나 배지에 X-Gluc 기질을 첨가하여 목적 단백질의 목적 기능을 관찰하였다. 도 8에서 예시되고 입증된 바와 같이 위치-특이적 재조합 효소를 첨가하여 재조합을 유도한 군에서만 적절한 바이러스가 형성되어 목적 단백질이 발현되었음을 확인하였다 (도 8, 제 4 레인 및 제 5 레인).

실시예 3: pAd-Left 및 pAd-Right를 이용한 재조합 바이러스의 제조방법

pAd-Left (SEQ. ID No.: 4)와 pAd-Right (SEQ. ID No.: 5)를 제조하였다 (도 3a 및 도 3b 참조). pAdHTS 벡터를 PacI, ClaI으로 절단 한 후, LITR과 패키징 시그널이 포함된 좌측 단편과 약 33kb 크기의 우측 단편을 각각 PCR 증폭한 Amp-Ori DNA와 라이게이션함으로써 수득하였다. 본 실시예에서, Amp-Ori를 PCR하기 위해 사용한 프라이머는 pBR322 DNA의 암피실린 (Ampicillin) 내성 유전자와 복제 오리진 부분을 증폭할 수 있는 부분과 제한효소 클로닝을 위한 PacI, ClaI 효소 링커를 포함하였다. 수득된 pAd-Left와 pAd-Right는 각각 대장균 (DH5α)에서 대량으로 플라스미드 DNA를 얻은 뒤 (Qiagen, Midiprep kit) 제한효소 SwaI과 PacI을 이용하여 절단하였다. 절단된 각각의 플라스미드 DNA를 사용하여 실시예 1과 2에 기술한 것과 유사한 방법으로 시험관내 재조합을 유도하고 바이러스를 제조하였다. 즉, pAd-Left 선형 DNA 100 ng과 pAd-Right 선형 DNA 800 ng을 GFP cDNA가 삽입된 pMaster-GFP 100 ng, 100 ng 인테그라아제, 10 ng IHF, 10 ng 엑시져나아제와 함께 반응 완충액에서 1시간 동안 반응시켰다. 생성된 반응 혼합액을 실시예 2와 같이 293 패키징 세포에 도입하고, 7일 후 세포를 파쇄하여 획득한 바이러스로 플라크 분석을 수행하여 재조합 바이러스를 확인하였다.

실시예 4: AdHTS-말단 단백질 복합체 (TPC)의 단리 및 조작

AdHTS 바이러스를 얻기 위해 pAdHTS를 제한효소 PacI으로 절단하고 293 패키징 세포에 도입하여 바이러스 형성을 유도하였다. AdHTS 바이러스의 대량 생산을 위해 150mm 세포배양용 디쉬 30장에 DMEM에 5% 우태아혈청을 첨가한 배지와 함께 5 X 10⁵ 의 293 패키징 세포를 분주하고, 24시간 경과 후 AdHTS3 바이러스를 5 MOI의 농도로 감염시켰다. 바이러스를 감염시킨 후 48시간 경과한 다음 150 mm 세포배양용 디쉬로부터 세포 스크레이퍼(scraper)를 이용하여 세포를 수거하고 원심분리하여 침전시킨 후, 10mM 트리스(Tris), 1mM MgCl₂ 용액에 현탁시켰다. 세포 현탁액를 -70℃에서 1시간 냉동, 37℃에서 5분간 용해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후, 세포 침전물을 원심분리하여 침전, 제거시켜 바이러스 용액을 수득하였다. 바이러스 용액으로부터 감염성 바이러스 입자를 얻기 위해 CsCl 농도구배를 이용한 초원심분리법을 이용하였다. 즉, 밀도 1.4 g/ml의 CsCl 용액을 원심분리용 튜브 (BeckMan)에 붓고, 밀도 1.2 g/ml 인 CsCl 용액을 가한 다음, 농도구배를 유지하면서 바이러스 용액 20 ml을 넣은 다음 초원심분리기에서 25,000 rpm으로 2시간 동안 회전시켜 바이러스 용액 내의 비감염성 바이러스 입자 (defective viral partice) 또는 세포 구성물 등으로부터 1X10¹² 의 감염된 바이러스 입자를 분리하였다.

초원심분리법을 이용하여 분리, 획득한 AdHTS 바이러스로부터 DNA-말단 단백질 복합체를 얻기 위해 두 가지 방법을 병용하였다. 첫째, AdHTS 바이러스 용액에 동량의 6M 구아니딘 (guanidine) HCl을 섞어주고 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide) 1 mg과 포화 CSCl/4M 구아니딘 HCl 용액을 최종 5 ml이 되도록 넣어준 후, 650,000 g의 속도로 4시간 동안 초원심분리하였다. 분리된 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체 밴드는 365 nm 파장의 자외선을 이용하여 확인 후 해당 DNA 부위를 뽑아내어, 탈염 (desalting) 하여 사용하였다 [참고문헌: Okada T. et al., Nucleic Acids Research, vol. 26, 1947-1950 (1998)]. 둘째, AdHTS 바이러스 용액에 동량의 6M 구아니딘 HCl을 섞은 용해된 아데노바이러스 비리온 용액을 수퍼덱스 (superdex) 16/30HR S-200 컬럼 (Amersham-Pharmacia)에 넣고, 유속 0.4 ml/min으로 전개하면서 2 ml씩 분획을 받아 각각의 분획에 대해 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정에 따른 피크 분획을 모아 1% 아가로스겔 상에서 AdHTS DNA-말단 단백질 복합체의 존재 여부를 확인하였다. 위 두가지 방법으로 분리한 AdHTS DNA-말단 단백질 복합체는 제한효소 SwaI (NEB)으로 절단하여 분주한 상태로 재조합에 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 5: pMaster-GFP와 위치-특이적 재조합 결과 생성된 바이러스에 대한 플라크 어세이 결과 분석

실시예 2에서 제조한 pAdHTS2 벡터와 pMaster-GFP의 시험관 내 반응 혼합물 10 ul을 실시예 2에서와 같이 293 패키징 세포 내로 도입하고, 7일 후 세포를 파쇄하여 수득한 바이러스로 플라크 분석을 수행했다. 이와 동일한 방법으로, 실시예 3의 pAd-left/pAd-right 및 실시예 4의 AdHTS-DNA-TPC에 대한 플라크 분석을 수행하여 그 결과를 하기 표 2에 나타냈다.

표 2. 각각의 아데노바이러스 벡터와 pMaster-GFP와의 위치-특이적 재조합 결과 생성된 바이러스에 대한 플라크 어세이 결과

Mater 클론	pMaster-GFP
아데노바이러스 벡터	No recombination	PAdHTS2	AdHTS-TPC	pAd-left pAd-Right
총 플라크 (white spot)	0	50	74	65
GFP-양성 플라크	0	50	74	65

실시예 6: Multiwell Production of Recombinant Adenovirus

실시예 4에서 준비된 SwaI 처리된 AdHTS-DNA-말단 단백질 복합체를 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰 당 45 ng씩 분주하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 위치-특이적 재조합 반응 시켰다. 즉, 100 ng 인테그라아제, 10 ng IHF, 10 ng Xis와 반응버퍼 (50mM 트리스, pH 7.8, 16.5 mM NaCl, 35 mM KCl, 5 mM spermidine, 0.25 mM EDTA, 3% 글리세롤)를 넣고, GFP cDNA가 삽입된 pMaster-GFP를 각 웰 당 5 ng씩 넣었으며, 대조군으로 4개 웰에는 Gus cDNA가 삽입된 pMaster-Gus를 웰 당 5 ng 씩 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 위치-특이적 재조합 반응 여부를 알아보기 위해 Adeno-F 및 Adeno-R 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과, 대조군을 제외한 88개 웰에서 GFP에 상응하는 크기의 PCR 산물이 검출됨을 알 수 있었다 (도 9). 실시예 2의 방법과 유사하게 PCR을 통해 위치 특이적 재조합 반응여부를 확인한 반응액 10 ul (DNA 50 ng)를 폴리-L-라이신 코팅된 96 웰 플레이트에 각 웰 당 5 X 10³ 세포로 분주하여 24시간 동안 인큐베이션 시킨 293 패키징 세포에 도입하였다. DNA가 도입된 세포는 형광현미경 하에서 형광을 나타냈으며, 도입한 지 4일 내지 7일 이후부터 바이러스의 생성을 표지하는 CPE가 관찰되었다. DNA 도입 후 10일째에 96-웰 플레이트를 -70℃에서 1시간 냉동, 37℃에서 5분간 용해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후, 2,500 rpm, 10분간 원심분리하여 그 상층액을 다시 96-웰에 분주된 293 세포에 감염시켜 pMaster-GFP와 위치-특이적 재조합 반응을 했던 웰들에서 GFP을 발현하는 바이러스가 생성되었음을 확인하였다 (도 10). 이와 같은 방법으로, 다른 아데노바이러스 벡터 pAdHTS2 및 pAd-Left/pAd-Right 각각에 대해 96-웰 수준에서 나타나는 재조합 바이러스의 발현정도를 확인하고, 평균 생성율을 하기 표 2에 나타냈다.

표 2. 96웰에서 각각 아데노바이러스 벡터에 따른 재조합 바이러스 생성 효율

Master 클론	pMaster-GFP
아데노바이러스 벡터	PAdHTS2	pAd-Left/pAd-Right	AdHTS-TP
96웰에서 재조합 바이러스의 생성 효율	62.5	47.9	99.0

상기한 바와 같이, 본 발명은 시험관 내 위치-특이적 재조합을 이용하여 재 조합 바이러스의 발현을 위한 벡터를 제조하여 이용하므로써, 바이러스 게놈 내의 정확한 위치에 목적 유전물질을 삽입하고, 무세포 환경 (시험관 내)에서 목적 유전물질과 바이러스 게놈을 결합시키므로 많은 수의 바이러스를 동시에 만들 수 있으며, 바이러스의 자가-복제의 문제를 원천적으로 차단하였을 뿐만아니라, 시험관 내에서의 목적 유전물질과 바이러스 게놈 DNA 단편의 혼합물을 목적하는 용도에 는 장점이 있다. 따라서, 본 발명은 게놈 수준의 유전자 기능 연구를 위한 수백, 또는 수천개 이상의 재조합 바이러스를 보다 더 용이하고 신속하게 고효율로서 제조할 수 있는 수단을 제공한다.

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Claims

i) 유전자 재조합 방법으로 바이러스 게놈 DNA를 제조함에 있어, 바이러스 게놈 DNA에 하나 이상의 제한효소 인식 염기서열 및 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열을 클로닝 하여, 제한효소 처리에 의해 각각 일 말단부에 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이 결합되고, 각각 단독으로는 바이러스로 입자화 될 수 없는 2개의 바이러스 게놈 DNA 절편을 제공하는 단계;

ii) 상기 i)의 바이러스 게놈 DNA 절편에 포함된 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열과 반응하는 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이 양 말단부에 결합된, 목적 DNA를 포함하는 운반벡터를 제공하는 단계;

iii) 단계 i)의 절단된 바이러스 게놈 DNA 단편과 ii)의 운반벡터를 위치-특이적 재조합 효소 존재 하에 시험관 내 (in vitro)에서 반응시키는 단계를 포함하는, 시험관내 선형 재조합 바이러스 벡터 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 바이러스 게놈 DNA가 아데노바이러스, 레트로 바이러스, 아데노관련 바이러스, 박테리오파아지, 코로나 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, CMV (cytomegalovirus), EBV (Epstein-Barr virus) 또는 VZV (Varicella-zoster virus)에서 유래함을 특징으로 하는, 시험관내 선형 재조합 바이러스벡터 제조방법.
제 3항에 있어서, 바이러스 게놈 DNA가 아데노바이러스 게놈 DNA임을 특징으로 하는, 시험관내 선형 재조합 바이러스 벡터 제조방법.
제 4항에 있어서, 아데노바이러스 게놈 DNA가 E1, E2, E3 또는 E4 부위가 결실된 아데노바이러스 게놈 DNA임을 특징으로 하는, 시험관내 선형 재조합 바이러스 벡터 제조방법.
제 1항에 있어서, 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이 att 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열임을 특징으로 하는, 시험관내 선형 재조합 바이러스 벡터 제조방법.
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i) 유전자 재조합 방법으로 바이러스 게놈 DNA를 제조함에 있어, 바이러스 게놈 DNA에 하나 이상의 제한효소 인식 염기서열 및 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열을 클로닝 하여, 제한효소 처리에 의해 각각 일 말단부에 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이 결합되고, 각각 단독으로는 바이러스로 입자화 될 수 없는 2개의 바이러스 게놈 DNA 절편을 제공하는 단계;

ii) 상기 i)의 바이러스 게놈 DNA 절편에 포함된 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열과 반응하는 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이 양 말단부에 결합된, 목적 DNA를 포함하는 운반벡터를 제공하는 단계;

iii) 단계 i)의 절단된 바이러스 게놈 DNA 단편과 ii)의 운반벡터를 위치-특이적 재조합 효소 존재 하에 시험관 내 (in vitro)에서 위치-특이적 반응시켜 발현 가능한 선형 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 혼합물을 수득하는 단계; 및

iv) 상기 iii)에서 수득한 혼합물을 숙주세포로 형질도입하여 재조합 바이러스를 발현시키는 단계를 포함하는, 재조합 바이러스 제조방법.
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제 8항에 있어서, 바이러스 게놈 DNA가 아데노바이러스, 레트로 바이러스, 아데노관련 바이러스, 박테리오파아지, 코로나 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, CMV, EBV 또는 VZV에서 유래함을 특징으로 하는, 재조합 바이러스 제조방법.
제 8항에 있어서, 바이러스 게놈 DNA가 아데노바이러스 게놈 DNA임을 특징으로 하는, 재조합 바이러스 제조방법.
제 11항에 있어서, 아데노바이러스 게놈 DNA가 E1 부위가 결실된 아데노바이러스 게놈 DNA임을 특징으로 하는, 재조합 바이러스 제조방법.
제 8항에 있어서, 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열이 att 위치-특이적 재조합효소 인식 염기서열임을 특징으로 하는, 재조합 바이러스 제조방법.
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