KR970703429A - 동종 재조합에 영향을 주는 dna 구성물 및 이것의 사용 방법(dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof) - Google Patents

동종 재조합에 영향을 주는 dna 구성물 및 이것의 사용 방법(dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof) Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하는 구성물에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 상기에서 설명된 바와 같이 세포내의 구성물의 동종 재조합을 포함하며 시험관내 또는 생체내 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 그리고 나서 동종 재조합 세포는 전사 및 번역을 일어나게 하는 조건하에서 유지되고, 단백질 발현을 얻는다, 추가로 본 발명은 일차, 이차, 또는 불멸화된 척추 동물 세포를 포함하는 동종 재조합 세포, 이러한 세포들을 제조하는 방법, 동종 재조합에 의해 융합 유전자를 생성하는 방법, 세포안에서 유전자 발현을 변화시키는 방법, 및 본 발명의 구성물을 사용하는 세포안에서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

동종 재조합에 영향을 주는 DNA 구성물 및 이것의 사용 방법(DNA CONSTRUCT FOR EFFECTING HOMOLOGOUS RECOMBINATION AND USES THEREOF)
[도면의 간단한 설명]
제1도는 굵은 선, 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터; 스팁플된 박스, hGH의 5' 번역되지 않은 영역; 솔리드 박스, hGH 엑손 1; 빗금친 박스, hEPO 인트론 1으로부터의 10bp 스플라이스-공여체 서열; 직교 빗금친 박스, hEPO의 5' 번역되지 않은 영역; 빈 속의 숫자를 매긴 박스, hEPO 코딩 서열; 사선으로 빗금친 박스, hEPO의 3' 번역되지 않은 서열; HⅢ, HindⅢ 부위를 포함하는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키는 방법을 나타내는 개략도이다.
제2도는 굵은 선, 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터; 스팁플된 박스, hGH의 5' 번역되지 않은 영역; 솔리드 박스, hGH 엑손 1; 빈 속의 숫자를 매긴 박스, hEPO 코딩 서열; 사선으로 빗금친 박스, hEPO의 3' 번역되지 않은 서열; HⅢ, HindⅢ 부위를 포함하는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키는 방법을 나타내는 개략도이다.
제3도는 마우스 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에서 hGH 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pXHG5를 나타내는 개략도이다.
제5도는 플라스미드 pcD의 BamHI 부위안에 삽입된 네오 코딩 영역(BamHI-Bg1II 단편); pBR322로부터의 Amp-R 및 pBR320ri 서열; 및 SV40으로부터의 16S 스플라이스 결합부 및 초기 프로모터 영역을 포함하는 플라스미드 pcDNEO를 나타내는 개략도이다.
제7도는 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4㎛의 메토트렉세이트에서 단계적인 선택이 수행된 표적화된 사람 세포 라인에서의 에리트로포이에틴 발현을 나타내는 그래프이다.
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

Claims (153)

  1. 염색체 DNA내로 삽입되는 경우 표적화된 유전자의 발현을 변화시킬 수 있는 DNA 구성물로서, (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손; 및 (d) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하는 DNA 구성물.
  2. 제1항에 있어서, 엑손이 CAP 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  3. 제2항에 있어서, 엑손이 뉴클레오티드 서열 ATG를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  4. 제3항에 있어서, 엑손이 표적화된 유전자를 가지는 인-프레임에 존재하는 코드화 DNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  5. 제4항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  6. 제4항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  7. 제4항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  8. 제4항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  9. 제4항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  10. 제4항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  11. 제4항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  12. 제4항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  13. 제4항에 있어서, 표적화된 유전자가 치료용 단백질을 코드화하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  14. 제4항에 있어서, 표적화된 유전자가 호르몬, 사이토킨, 항원, 항체, 효소,응고 인자, 운송 단백질, 리셉터, 조절 단백질, 구조적 단백질 또는 전자 인자를 코드화하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  15. 제4항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴, 칼시토닌, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-형 성장 인자, 파라티로이드 호르몬, β-인터페론, γ-인터페론, 신경 성장 인자, FSH β, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루타곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터로이킨 1, 인터로이킨 2, 인터로이킨 3, 인터로이킨 6, 인터로이킨 11, 인터로이킨 12, CSF-그래뉼로사이트, CSF-매크로파지, CSF-그래뉼로사이트／매크로파지, 면역 글로불린, 촉매 항체, 단백질 키나아제 C, 글루코세레브로시다제, 초과산화 디스뮤타제, 조직 플라스미노겐 활성제, 우로키나아제, 안티프로빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다제, 티로신히록실라제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 Ⅷ, 혈액 응고 인자 Ⅸ, 혈액 응고 인자 Ⅹ, 혈액 응고 인자 ⅩⅢ, 아폴리드 단백질 E 또는 아폴리포 단백질 A-I, 글로빈, 저밀도 리포 단백질 리셉터, IL-2 리셉터, IL-2 안타고니스트, 알파-1 안티트립신, 면역 반응 변형제, 및 용해성 CD4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코드화하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  16. 제15항에 있어서, 표적화된 유전자가 성장 호르몬, FSHβ, G-CSF, 또는 GM-CSF를 코드화하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  17. 제15항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  18. 제17항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  19. 제17항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  20. 제19항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 사람 성장 호르몬의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  21. 제1항에 있어서, 조절 서열이 프로모터, 인핸서, 스캐폴드-부착 영역 또는 전사 인자 결합 부위인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  22. 제21항에 있어서, 조절 서열이 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  23. 제22항에 있어서, 부가적 조절 서열을 더 포함하는 DNA 구성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 구성물이 인핸서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  25. 제24항에 있어서, 1개 이상의 선택할 수 있는 마아커를 더 포함하는 DNA 구성물.
  26. 제25항에 있어서, 증폭할 수 있는 마이커 유전자를 더 포함하는 DNA 구성물.
  27. 제21항에 있어서, 조절 서열이 마우스 메탈로티오네인- I 유전자의 조절 서열, SV-40 유전자의 조절 서열, 사이토메갈로바이러스 유전자의 조절 서열, 콜라겐 유전자의 조절 서열, 액틴 유전자의 조절 서열, 면역 글로불린 유전자의 조절 서열, HMG-CoA 리덕타제 유전자의 조절 서열 또는 EF-1α 유전자의 조절 서열인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  28. 표적화된 유전자의 발현을 변화시키는 동종 재조합 세포를 제조하는 방법으로서, (a) (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열; (iii) 엑손; 및 (iv) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하고, 이렇게 하여 형질 전환된 세포를 생성하는 DNA 구성물로 세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b) 동종 재조합에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 엑손이 CAP 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 엑손이 뉴클레오티드 서열 ATG를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 엑손이 표적화된 유전자를 가지는 인-프레임의 코드화 DNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA가 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제31항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제31항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제31항에 있어서, 구성물이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제31항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제28항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제31항에 있어서, 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제31항에 있어서, 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제31항에 있어서, 엑손의 코드화 DNA가 사람 성장 호르몬의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제28항에 있어서, (c) 단백질은 생성하기에 적당한 조건하에서 단계 (b)로부터의 동종 재조합 세포를 유지시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 발현이 변화되는 유전자가 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제45항의 방법에 의해 생성되는 에리트로포이에틴.
  48. DNA 구성물로부터 엑손에 의해 코드화되는 아미노산 및 제45항의 방법에 의해 제조된 내인성 유전자에 의해 코드화된 아미노산을 함유하는 융합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 내인성 단백질이 에리트로포이에틴인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 사람 성장 호르몬의 아미노산 1-3 및 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 6-165를 포함하는 융합 단백질.
  51. 제28항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  52. 제29항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  53. 제30항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  54. 제31항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  55. 제32항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  56. 제33항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  57. 제40항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  58. 제41항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  59. 제42항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  60. 제44항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  61. 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 스플라이스-공여체 부위를 포함하고, 내인성 유전자의 제2엑손에 효과적으로 링크되는 동종 재조합 세포.
  62. 제61항에 있어서, 와인성 엑손이 CAP 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  63. 제62항에 있어서, 외인성 엑손이 뉴클레오티드 서열 ATG를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  64. 제63항에 있어서, 외인성 엑손이 표적화된 내인성 유전자를 가지는 인-프레임의 코드화 DNA를 더포함 하는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  65. 제64항에 있어서, 코드화 DNA가 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  66. 제64항에 있어서, 코드화 DNA가 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  67. 제64항에 있어서, 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 스플라이스-공여체 부위가 표적화된 유전자의 코딩 영역의 상류인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  68. 제67항에 있어서, 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 스플라이스-공여체 부위가 표적화된 내인성 조절 서열의 상류인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  69. 제61항에 있어서, 내인성 조절 서열이 삭제되는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  70. 제69항에 있어서, 제1내인성 엑손이 삭제되는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  71. 제64항에 있어서, 표적화된 유전자가 호르몬, 사이토킨, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 운송 단백질, 리셉터, 조절 단백질, 구조적 단백질 또는 전사 인자를 코드화하는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  72. 제64항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴, 칼시토닌, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-형 성장 인자, 파라티로이드 호르몬, β-인터페론, γ-인터페론, 신경 성장 인자, FSH β, TGF-β, 종양 괴사 인자, 글루타곤, 뼈 성장 인자-2, 뼈 성장 인자-7, TSH-β, 인터로이킨 1, 인터로이킨 2, 인터로이킨 3, 인터로이킨 6, 인터로이킨 11, 인터로이킨 12, CSF-그래뉼로사이트, CSF-매크로파지, CSF-그래뉼로사이트／매크로파지, 면역 글로불린, 촉매 항체, 단백질 키나아제 C, 글루코세레브로시다제, 초과산화 디스뮤타제, 조직 플라스미노겐 활성제, 우로키나아제, 안티프로빈 Ⅲ, DNAse, α-갈락토시다제, 티로신히록실라제, 혈액 응고 인자 V, 혈액 응고 인자 Ⅶ, 혈액 응고 인자 Ⅷ, 혈액 응고 인자 Ⅸ, 혈액 응고 인자 Ⅹ, 혈액 응고 인자 ⅩⅢ, 아폴리드 단백질 E 또는 아폴리포 단백질 A-I, 글로빈, 저밀도 리포 단백질 리셉터, IL-2 리셉터, IL-2 안타고니스트, 알파-1 안티트립신, 면역 반응 변형제, 및 용해성 CD4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코드화하는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  73. 제61항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  74. 제73항에 있어서, 세포가 균류, 식물 또는 동물 기원의 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  75. 제74항에 있어서, 세포가 척추 동물 기원의 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  76. 제75항에 있어서, 세포가 일차 또는 이차 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  77. 제75항에 있어서, 세포가 일차 또는 이차 사람 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  78. 제75항에 있어서, 세포가 불멸화된 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  79. 제75항에 있어서, 세포가 불멸화된 사람 세포인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  80. 제75항에 있어서, 세포가 HT1080 세포, HeLa 세포 및 HeLa 세포의 유도체, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종 세포, 2780AD 난소 암종 세포, 라지 세포, 주르카트 세포, 나말와 세포, HL-60 세포, 다우디 세포, RPMI 8226 세포, U-937 세포, 보우스 멜라노마 세포, WI-38VA13 서브라인 2R4 세포, MOLT-4 세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  81. 제80항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화하는 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  82. 제81항에 있어서, 에리트로포이에틴을 발현시킬 수 있는 동종 재조합 세포.
  83. 제82항에 있어서, 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  84. 제81항에 있어서, 코드화 DNA가 에리트로포이에틴의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  85. 제84항에 있어서, 코드화 DNA가 사람 성장 호르몬의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  86. 제61항에 있어서, 외인성 엑손에 의해 코드화되는 아미노산 및 내인성 유전자에 의해 코드화되는 아미노산을 포함하는 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 동종 재조합 세포.
  87. 제86항에 있어서, 내인성 유전자가 에리트로포이에틴인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  88. 제87항에 있어서, 사람 성장 호르몬의 아미노산 1-3 및 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 6-165을 포함하는 융합 단백질.
  89. 제66항에 있어서, 조절 서열이 프로모터, 인핸서, 스캐폴드-부착 영역 또는 전사 인자 결합 부위인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  90. 제89항에 있어서, 외인성 조절 서열이 프로모터인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  91. 외인성 조절 서열이 마우스 메탈로티오네인-I 유전자의 조절 서열, SV-40 유전자의 조절 서열, 사이토메갈로바이러스 유전자의 조절 서열, 콜라겐 유전자의 조절 서열, 액틴 유전자의 조절 서열, 면역 글로불린 유전자의 조절 서열, HMG-CoA 리덕타제 유전자의 조절 서열 또는 EF-1α 유전자의 조절 서열인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  92. 세포안에서 유전자의 발현을 변화시키는 방법으로서, (a) (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열; (iii) 엑손; 및 (iv) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하고, 이렇게 하여 형질전환된 세포를 생성하는 DNA 구성물로 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 동종 재조합에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 유지시키고, 이렇게 하여 동종 재조합 세포를 제조하는 단계; 및 (c) 유전자의 발현에 적합한 조건하에서 동종 재조합 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 엑손이 뉴클레오티드 서열 ATG를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 엑손이 CAP 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 엑손이 표적화된 유전자를 가지는 인-프레임에 존재하는 코드화 DNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 엑손이 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제96항에 있어서, 코드화 DNA가 표적화 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제98항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제98항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제98항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자에 대한 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제98항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제98항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제98항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자에 대한 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제92항에 있어서, (c) 단백질을 생성하는데 적합한 조건하에서 동종 재조합 세포를 유지시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 발현이 변화되는 유전자가 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제107항의 방법에 의해 생성되는 에리트로포이에틴.
  109. 제106항의 방법에 의해 생성되는 융합 단백질.
  110. 제109항에 있어서, 내인성 유전자가 에리트로포이에틴인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  111. 제110항에 있어서, 사람 성장 호르몬의 아미노산 1-3 및 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 6-165를 포함하는 융합 단백질.
  112. 세포안에서 유전자의 발현을 변화시킴으로써 단백질을 제조하는 방법으로서, (a) (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열; (iii) 엑손; 및 (iv) 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하고, 이렇게 하여 형질전환된 세포를 생성하는 DNA 구성물로 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 동종 재조합에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 유지시키고, 이렇게 하여 동종 재조합 세포를 제조하는 단계; 및 (c) 단백질을 생성하는데 적합한 조건하에서 동종 재조합 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  113. 제112항에 있어서, 엑손이 CAP 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 엑손이 뉴클레오티드 서열 ATG를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 엑손이 표적화된 내인성 유전자를 가지는 인-프레임에 존재하는 코드화 DNA를 더 포함하는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 코드화 DNA가 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 코드화 DNA가 표적화된 유전자의 제1엑손의 코드화 DNA와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 표적화 서열이 표적화 유전자내의 서열과 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제117항에 있어서, 표적화 서열이 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제117항에 있어서, 표적화 서열이 표적화 유전자에 대한 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제117항에 있어서, 상기 구성물이 표적화 유전자내의 서열과 동종인 제2표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제117항에 있어서, 상기 구성물이 표적화 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제117항에 있어서, 상기 구성물이 표적화 유전자에 대한 내인성 조절 서열의 서열 상류에 동종인 제2표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제112항의 방법에 의해 생성되는 에리트로포이에틴.
  125. 제124항에 있어서, 세포가 사람 기원의 세포인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴.
  126. 제112항의 방법에 의해 생성되는 단백질.
  127. 제126항에 있어서, 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질.
  128. 제127항에 있어서, 내인성 유전자가 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  129. 제128항에 있어서, 사람 성장 호르몬의 아미노산 1-3 및 사람 에리트로포이에틴의 아미노산 6-165를 포함하는 융합 단백질.
  130. DNA 플라스미드 pREPO18.
  131. 세포의 염색체 DNA내로 삽입되는 경우에 표적화된 유전자의 발현을 변화시킬 수 있는 DNA 구성물로서, (a) 표적화 서열; (b) 조절 서열; (c) 엑손; (d) 스플라이스-공여체 부위; (e) 인트론; 및 (f) 스플라이스-수용체 부위를 포함하는 DNA 구성물.
  132. 제131항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  133. 제131항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  134. 제131항에 있어서, 표적화 서열이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  135. 제131항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자내의 서열과 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  136. 제131항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자의 서열과 동종인 것을 코딩 영역의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  137. 제131항에 있어서, 상기 구성물이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 서열 상류와 동종인 제2표적화 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성물.
  138. 표적화된 유전자의 코딩 영역의 동종 재조합 상류에 의해 도입되는 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 부위, 인트론 및 스플라이스-수용체 부위를 포함하는 동종 재조합 세포.
  139. 제138항에 있어서, 표적화된 유전자가 α-인터페론 유전자인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  140. 제138항에 있어서, 표적화된 유전자가 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 동종 재조합 세포.
  141. 내인성 에리트로포이에틴 조절 영역의 상류 위치에서 표적화되는 dhfr 유전자, neo 유전자, CMV 프로모터, hGH 엑손 1 및 쌍을 이루지 않은 스플라이스-공여체 부위를 포함하는 동종 재조합 세포.
  142. 제141항에 있어서, pREPO18로부터 DNA의 통합에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  143. 표적화된 유전자의 발현을 변화시키는 동종 재조합 세포를 제조하는 방법으로서, (a) (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열; (iii) 엑손; (iv) 스플라이스-공여체 부위; (v) 인트론; 및 (vi) 스플라이스-수용체 부위를 포함하는 DNA 구성물로 세포를 형질전환시키는 단계로서, 표적화 서열이 성분 (b)-(f) 상류의 통합을 유도하여 상기 성분들이 표적화된 유전자의 제1엑손에 효과적으로 링크되도록 하는 단계; 및 (b) 동종 재조합에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  144. 제143항의 방법에 의해 생성되는 동종 재조합 세포.
  145. 세포안에서 유전자의 발현을 변화시키는 방법으로서, (a) (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열; (iii) 엑손; (iv) 스플라이스-공여체 부위; (v) 인트론; 및 (vi) 스플라이스-수용체 부위를 포함하는 DNA 구성물로 세포를 형질전환시키는 단계로서, 표적화 서열이 성분 (b)-(f) 상류의 통합을 유도하여 상기 성분들이 표적화된 유전자의 제1엑손에 효과적으로 링크되도록 하는 단계; 및 (b) 동종 재조합에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 유지시키는 단계; 및 (c) 유전자의 발현에 적합한 조건하에서 동종 재조합 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  146. 세포안에서 유전자의 발현을 변화시킴으로써 단백질을 제조하는 방법으로서, (a) (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열; (iii) 엑손; (iv) 스플라이스-공여체 부위; (v) 인트론; 및 (vi) 스플라이스-수용체 부위를 포함하는 DNA 구성물로 세포를 형질전환시키는 단계로서, 표적화 서열이 성분 (b)-(f) 상류의 통합을 유도하여 상기 성분들이 표적화된 유전자의 제1엑손에 효과적으로 링크되도록 단계; 및 (b) 동종 재조합에 적합한 조건하에서 형질전환된 세포를 유지시키는 단계; 및 (c) 유전자의 발현에 적합한 조건하에서 동종 재조합 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  147. 제146항에 있어서, 표적화된 유전자가 α-인터페론 유전자 또는 에리트로포이에틴 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 에리트로포이에틴 유전자의 ATG의 5kb 및 30kb 상류 사이에 위치된 DNA 서열.
  149. 형질전환한 세포를 포함하는 포유류 세포 안에서 에리트로포이에틴 유전자의 서열 ATG의 서열 상류와 동종인 DNA 서열을 포함하는 구성물로 에리트로포이에틴 유전자를 표적화하는 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 구성물이 에리트로포이에틴 유전자의 서열 ATG의 5kb 및 30kb 상류 사이에 위치한 서열에 동종인 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제150항에 있어서, 포유류 세포가 사람 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 형질전환한 세포를 포함하는 포유류 세포안에서 에리트로포이에틴 유전자내의 서열과 동종인 DNA 서열을 포함하는 구성물로 에리트로포이에틴 유전자를 표적화하는 방법.
  153. 제152항에 있어서, 포유류 세포가 사람 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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