CN111741770A - 用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于提供包含单‑聚乙二醇化蛋白质和寡‑聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，并且提供了用于提供具有高收率和产率的单‑聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。所述的方法特别适合于提供单‑聚乙二醇化红细胞生成素组合物。这些方法包含使非‑聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非‑聚乙二醇化、单‑聚乙二醇化和寡‑聚乙二醇化蛋白质的混合物，使该混合物经历阴离子交换色谱步骤，并且将非‑聚乙二醇化蛋白质再循环入进一步的聚乙二醇化反应。

Description

用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法
发明领域
本发明涉及用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，特别是用于提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，并且提供用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。特别地，本发明涉及用于提供包含单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO的聚乙二醇化红细胞生成素(EPO)组合物的方法和用于提供单-聚乙二醇化红细胞生成素(EPO)组合物的方法。
背景
蛋白质的PEG化或聚乙二醇化是指一个或多个PEG(聚乙二醇)基团添加至蛋白质。聚乙二醇化特别地用于治疗蛋白，例如，这归因于它增加体内循环半衰期。然而，聚乙二醇化还可以降低治疗蛋白的生物活性，由此降低其有效性。因此。在增加的循环时间与降低的治疗功效之间的平衡被打断。
对于某些治疗蛋白，单-聚乙二醇化为特别期望的，因为它提供了改善的稳定性，而不会显著地损害治疗功效。单-聚乙二醇化治疗蛋白包括
Figure BDA0002637417760000011
和
Figure BDA0002637417760000012
Figure BDA0002637417760000013
为红细胞生成素(EPO)的单-聚乙二醇化形式且用于治疗贫血。
聚乙二醇化反应倾向于产生包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物。有利于高程度聚乙二醇化(例如长反应时间、高PEG/蛋白质摩尔比)的反应条件倾向于产生具有高比例的寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物，这在单-聚乙二醇化蛋白质为期望的产物时产生低收率。有利于低程度聚乙二醇化(例如短反应时间、低PEG/蛋白质摩尔比)的反应条件倾向于产生具有高比例的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的混合物，这在单-聚乙二醇化蛋白质为期望的产物时也产生低收率。
治疗蛋白对于制备而言通常是昂贵的，因此，提供良好收率的单-聚乙二醇化治疗蛋白(作为未反应的和/或寡-聚乙二醇化的治疗蛋白的最少浪费)的方法在商业上是有利的且由此为特别期望的。
已经尝试研发使关注蛋白质聚乙二醇化方法、同时结合离子交换色谱柱，以便操控聚乙二醇化的特异性，且由此改善具有期望的聚乙二醇化程度的蛋白质的收率(所谓的“柱上”法)。这类方法在技术上是复杂的且耗时，因此具有低产率。这类方法还可能消耗相对大量的聚乙二醇化试剂，使得它们在商业上处于不利状态。不同的“柱上”聚乙二醇化方法在Pfister(Reac React.Chem.Eng.，2016，1，204)、Ingold(2016)和Fee&Van Alstine(2006)中讨论。
提供单-聚乙二醇化蛋白质的方法可以包含进行聚乙二醇化反应，得到包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物，且然后进行纯化步骤以纯化单-聚乙二醇化蛋白质。
WO 2009/010270和WO 2012/035037涉及用于从包含非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物纯化单-聚乙二醇化EPO的方法。该纯化方法牵涉使得自聚乙二醇化反应的混合物经历至少一种阳离子交换色谱法(CEC)步骤。进行CEC步骤以结合和洗脱模式，并且不同的洗脱级分包含大部分非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化或寡-聚乙二醇化EPO。这类CEC方法必须在低于蛋白质的等电点下进行，就EPO而言(等电点为4.0-5.5)，牵涉在pH约3.0下的CEC。
用于生产单-聚乙二醇化蛋白质的方法通过进行聚乙二醇化反应且然后从得到的混合物中纯化单-聚乙二醇化蛋白质进行，该方法牵涉再循环未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质。这些方法牵涉回收未反应的蛋白质并且将其添加至随后的聚乙二醇化反应中。这类再循环改善了单-聚乙二醇化蛋白质的总收率。
Pfister(Biotech和Bioeng，2016)描述了一种方法，其中进行聚乙二醇化反应，然后从包含未反应的(非-聚乙二醇化)、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物中纯化单-聚乙二醇化蛋白质。在该方法中，回收未反应的蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应。该纯化方法包含结合和洗脱模式的阳离子交换色谱法(CEC)，其中以依次洗脱方式分离未反应的蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质。最后使用高盐洗脱缓冲液洗脱未反应的蛋白质。因此，再循环未反应的蛋白质需要通过渗滤除去盐，然后进行进一步聚乙二醇化反应。对于除去盐的需求降低了产率并且增加了方法的复杂性。
根据上述考量设计了本发明。
发明概述
本发明涉及用于提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法和用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。本发明的方法特别适合于提供包含单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO的聚乙二醇化EPO组合物以及单-聚乙二醇化EPO组合物。本文所述的方法的优点包括高收率和产率。
在第一个方面，本发明提供用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：(a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；(b)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物的比例增加；IEC步骤包含使反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；和(c)从步骤b)中收集IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
可以通过洗脱在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且用于随后的聚乙二醇化反应。即步骤b)还可以包含洗脱IEC洗脱液中的非-聚乙二醇化蛋白质。IEC洗脱液包含非-聚乙二醇化蛋白质。
该方法可以牵涉步骤(a)、(b)和(c)的两个或多个循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
IEC步骤可以为阴离子交换色谱(AEC)步骤或阳离子交换色谱(CEC)步骤。
本发明提供用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：(a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；(b)使反应产物的混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物的比例增加；AEC步骤包含使反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于AEC材料；和(c)从步骤b)中收集AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，其中通过从AEC材料中洗脱AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
该方法可以牵涉步骤(a)、(b)和(c)的两个或多个循环，其中通过从AEC材料中洗脱AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
反应产物的混合物可以包含相对低比例的寡-聚乙二醇化蛋白质。例如，反应产物的混合物可以包含低于25％、20％、15％、10％或5％的寡-聚乙二醇化蛋白质。
反应产物的混合物可以包含至少约20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％或70％的非-聚乙二醇化蛋白质。
IEC流通溶液(AEC或CEC流通溶液)可以包含相对高比例的聚乙二醇化蛋白质。例如，IEC流通溶液可以包含至少约90％、95％、98％、99％或至少约99.9％聚乙二醇化蛋白质。AEC流通溶液可以包含相对高比例的聚乙二醇化蛋白质。例如，AEC流通溶液可以包含至少约90％、95％、98％、99％或至少约99.9％聚乙二醇化蛋白质。
蛋白质可以为红细胞生成素(EPO)。蛋白质可以为激素。蛋白质可以为激素、细胞因子、酶或抗体。
本发明的方法包括进行聚乙二醇化反应并且再循环非聚乙二醇化蛋白质。这类方法是有利的，因为它们能够实现相对高的收率。
本发明的方法可以牵涉在约pH 7.0-9.0下进行聚乙二醇化反应，该反应可以例如使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的PEG试剂进行。聚乙二醇化反应可以在约pH 7.5-8.5或在约pH 8.0下进行，且可以使用NHS活化的PEG试剂进行。这提供了相对快速的聚乙二醇化步骤，其促成本文所述方法的总体迅速性和高产率。通过聚乙二醇化的蛋白质可以为红细胞生成素。
该方法牵涉进行聚乙二醇化反应，得到反应产物的混合物，并且再循环来自该聚乙二醇化反应的非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)。从反应产物的混合物中回收非-聚乙二醇化蛋白质作为IEC步骤的组成部分。IEC步骤牵涉使反应产物的混合物接触离子交换材料。IEC流通包含相对高比例的聚乙二醇化蛋白质(单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质)，因为大部分非-聚乙二醇化蛋白质结合阴离子交换材料。因此，可以通过从IEC材料中洗脱从反应产物的混合物中回收非-聚乙二醇化蛋白质。将回收的非-聚乙二醇化蛋白质加入到随后的聚乙二醇化反应中，由此再循环非-聚乙二醇化蛋白质。
该方法牵涉进行聚乙二醇化反应，得到反应产物的混合物，并且从该聚乙二醇化反应中再循环非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)。从反应产物的混合物中回收非-聚乙二醇化蛋白质作为AEC步骤的组成部分。AEC步骤牵涉使反应产物的混合物接触阴离子交换材料。AEC流通包含相对高比例的聚乙二醇化蛋白质(单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质)，因为大部分非-聚乙二醇化蛋白质结合阴离子交换材料。因此，可以通过从AEC材料中洗脱从反应产物的混合物中回收非-聚乙二醇化蛋白质。将回收的非-聚乙二醇化蛋白质加入到随后的聚乙二醇化反应中，由此再循环非-聚乙二醇化蛋白质。
本文公开的方法中非-聚乙二醇化蛋白质的再循环通过在IEC步骤中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质来进行。本文公开的方法中非-聚乙二醇化蛋白质的再循环通过在AEC步骤中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质来进行。从阴离子交换材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质相对简单快捷，由此能够简单和快捷地回收未反应的蛋白质用于再循环。非-聚乙二醇化蛋白质再循环的洗脱的快速性有助于本文公开的方法的整体快速性和产率。
使用包含非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物进行所述方法。在反应产物的混合物中寡-聚乙二醇化蛋白质的比例可以相对较低。这些方法牵涉离子交换色谱(IEC)步骤，其提供IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加。这些方法牵涉离子交换色谱(IEC)步骤，其提供IEC流通溶液，其中非聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加。IEC流通溶液可以包含高比例的聚乙二醇化蛋白质，其中聚乙二醇化蛋白质由单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质组成。即本发明的方法牵涉以流通模式进行的IEC步骤。流通模式中的IEC步骤相对快捷。本发明相对快捷的IEC步骤有助于本发明的方法的相对总体产率。IEC步骤可以为AEC步骤或CEC步骤。
IEC流通溶液将增加聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物的分数。AEC流通溶液具有非-聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物减小的分数。
所述方法可以牵涉阴离子交换色谱(AEC)步骤，其提供AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加。这些方法牵涉阴离子交换色谱(AEC)步骤，其提供AEC流通溶液，其中非聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物的分数减小。AEC流通溶液可以包含高比例的聚乙二醇化蛋白质，其中聚乙二醇化蛋白质由单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质组成。即本发明的方法牵涉以流通模式进行的AEC步骤。流通模式中的AEC步骤相对快捷。本发明相对快捷的AEC步骤有助于本发明的方法的相对总体的高产率。
AEC流通溶液具有聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物增加的分数。AEC流通溶液具有非-聚乙二醇化蛋白质相对于反应产物的混合物减小的分数。
AEC步骤包含将反应产物的混合物施加于阴离子交换材料。阴离子交换材料可以为强阴离子交换材料。适合的材料为本领域众所周知的，且包括Toyopearl SuperQ 650M，其为强阴离子交换材料。阴离子交换材料可以具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量。
IEC材料可以具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。IEC材料可以具有低于约1.0g/L、0.75g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.10g/L或0.05g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。结合容量可以为动态结合容量。阴离子交换材料可以具有低于约1.5g/L、小于约1.0g/L、小于约0.75g/L、小于约0.5g/L、小于约0.1g/L、小于约0.05g/L、小于约0.01g/L或低于约0.001g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。阴离子交换材料可以具有接近0g/L(即接近0g的聚乙二醇化蛋白质/L AEC树脂)的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。特别地，阴离子交换材料可以具有低于约0.5g/L、小于约0.05g/L、小于约0.01g/L或低于约0.001g/L的聚乙二醇化EPO的结合容量。阴离子交换材料可以具有接近0g/L(即接近0g的聚乙二醇化EPO/L AEC树脂)的聚乙二醇化EPO的结合容量。IEC材料可以为AEC材料且聚乙二醇化蛋白质可以为聚乙二醇化红细胞生成素。
IEC材料可以具有20-50g/L、30-40g/L或约35g/L的非-聚乙二醇化蛋白质(例如非-聚乙二醇化EPO)的相对高的结合容量。IEC材料可以具有至少约20g/L、25g/L、30g/L或约35g/L的非-聚乙二醇化蛋白质(例如非-聚乙二醇化EPO)的结合容量。结合容量可以为动态结合容量。IEC材料可以为AEC材料，且非-聚乙二醇化蛋白质可以为非-聚乙二醇化红细胞生成素。蛋白质可以为红细胞生成素(EPO)。蛋白质可以为激素。蛋白质可以为激素、细胞因子、酶或抗体。
该方法可以包含阴离子交换色谱(AEC)步骤且蛋白质可以为红细胞生成素。
具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的离子交换材料的应用是有利的。因为它有利于从聚乙二醇化蛋白质中快速分离非-聚乙二醇化蛋白质。IEC步骤可以以流通模式进行，以便快捷地提供IEC流通溶液，从其中已经除去了大部分或几乎全部的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质。因此，来自IEC步骤的流通溶液包含相对高比例的聚乙二醇化蛋白质。其可以包含至少约80％、85％、90％或95％聚乙二醇化蛋白质或80-95％聚乙二醇化蛋白质。其可以包含至少约90％聚乙二醇化蛋白质。其可以包含至少约95％聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低比例、接近于零或零非-聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低于约20％、15％、10％或5％的非-聚乙二醇化蛋白质或约20-5％的非-聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低于10％的非-聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低于5％的非-聚乙二醇化蛋白质。
使用具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的离子交换材料的另一个优点在于，它有利于从离子交换材料中快速回收未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质。可以通过洗脱步骤快速回收非-聚乙二醇化蛋白质，这可以提供洗脱液，其包含相对浓缩形式的非-聚乙二醇化蛋白质，这种浓缩形式可以适合于直接添加到聚乙二醇化反应中。可以在相对低电导率或低盐浓度下进行的洗脱步骤中从阴离子交换材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，例如，这有利于再循环非-聚乙二醇化蛋白质，因为在将洗脱液添加到随后的聚乙二醇化反应前无需除去高盐浓度(例如，通过渗滤、再浓缩或缓冲液交换)。因此，具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的离子交换材料的应用是有利的，因为它提供特别适合于随后的聚乙二醇化反应中再循环的形式的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的快捷回收。
具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的阴离子交换材料的应用是有利的，因为它有利于从聚乙二醇化蛋白质快速分离非-聚乙二醇化蛋白质。AEC步骤可以以流体模式进行，以便快捷地提供AEC流通溶液，从其中已经除去大部分或几乎全部的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白。因此，来自AEC步骤的流通溶液包含相对高比例的聚乙二醇化蛋白质。其可以包含至少约80％、85％、90％或95％聚乙二醇化蛋白质或80-95％聚乙二醇化蛋白质。其可以包含至少约90％聚乙二醇化蛋白质。其可以包含至少约95％聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低比例、接近零或零非-聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低于约20％、15％、10％或5％的非-聚乙二醇化蛋白质或约20-5％的非-聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低于10％的非-聚乙二醇化蛋白质。其可以包含低于5％的非-聚乙二醇化蛋白质。
使用具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的阴离子交换材料的另一个优点在于，它有利于从阴离子交换材料中快捷地回收未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质。可以通过洗脱步骤快速回收非-聚乙二醇化蛋白质，这可以提供洗脱液，其包含相对浓缩形式的非-聚乙二醇化蛋白质，这种浓缩形式可以适合于直接添加到聚乙二醇化反应中。可以在相对低电导率或低盐浓度下进行的洗脱步骤中从阴离子交换材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，例如，这有利于再循环非-聚乙二醇化蛋白质，因为在将洗脱液添加到随后的聚乙二醇化反应前无需除去高盐浓度(例如，通过渗滤、再浓缩或缓冲液交换)。因此，具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的阴离子交换材料的应用是有利的，因为它提供特别适合于随后的聚乙二醇化反应中再循环的形式的未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的快捷回收。
本发明的方法牵涉提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，该步骤包含从IEC步骤中收集流通溶液。收集IEC流通溶液可以包含从单独的IEC循环中收集批量的IEC流通溶液，按照这种方式，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。IEC步骤可以为AEC步骤或CEC步骤。
本发明的方法牵涉提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，该步骤包含从AEC步骤中收集流通溶液。收集AEC流通溶液可以包含从单独的AEC循环中收集批量的AEC流通溶液，按照这种方式，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。在第二个方面，本发明提供用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该方法包含：使包含通过本发明第一个方面的方法生产的单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程，该纯化过程分离单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；并且回收单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质相对于聚乙二醇化蛋白质混合物的分数增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
单-聚乙二醇化蛋白质组合物可以包含相对高比例的单-聚乙二醇化蛋白质。例如，该蛋白质组合物可以包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。
聚乙二醇化反应倾向于产生包含非-聚乙二醇化蛋白质(未反应的蛋白质)、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物。单-聚乙二醇化蛋白质可以为理想的，因为它们提供相对于蛋白质的非-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化形式在增加的半衰期与相差无几的生物活性之间的平衡。蛋白质、尤其是治疗蛋白通常在生产方面是昂贵的，且由此提供具有良好收率的单-聚乙二醇化治疗蛋白的方法是特别理想的。提供良好收率的单-聚乙二醇化EPO
Figure BDA0002637417760000101
的方法为特别理想的。
本文公开的方法是有利的，因为它们相对快捷，且由此能够实现相对高的产率。本文公开的方法还能够实现高收率，即高比例的起始蛋白质变成PEG化的，特别是单-聚乙二醇化的。本文公开的方法还提供了相对高纯度的单-聚乙二醇化蛋白质组合物。
来自IEC步骤的流通溶液用于提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，例如，来自AEC步骤的流通溶液用于提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物。该混合物经历纯化过程，以使单-聚乙二醇化蛋白质与寡-聚乙二醇化蛋白质分离，由此得到包含相对高比例的单-聚乙二醇化蛋白质的组合物。所述纯化方法可以包含使聚乙二醇化蛋白质混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤。阴离子交换步骤和HIC步骤均为相对快捷的，由此提供用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物的相对快捷方法。HIC步骤可以以流通模式进行，这种模式特别快捷，得到用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物的快捷方法。
本发明的方法牵涉从IEC步骤(可以为AEC或CEC步骤)收集流通溶液。例如，本发明的方法可以牵涉收集IEC流通溶液。收集IEC(AEC或CEC)流通溶液可以包含从单独的IEC(AEC或CEC)循环中收集批量或部分的IEC(AEC或CEC)流通溶液，按照这种方式，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。收集IEC(AEC或CEC)流通溶液可以包含通过在线连接、“在线调节”操作将IEC(AEC或CEC)流通溶液递送至HIC材料。收集IEC(AEC或CEC)流通溶液可以包含将IEC(AEC或CEC)流通溶液递送至用于调节IEC(AEC或CEC)流通溶液的容器。收集IEC(AEC或CEC)流通溶液可以包含将IEC(AEC或CEC)流通溶液直接递送至HIC材料。当将IEC(AEC或CEC)流通溶液直接递送至HIC材料时，例如，可以通过在线调节来调节IEC(AEC或CEC)流通溶液。从IEC(AEC或CEC)材料到HIC材料可以存在IEC(AEC或CEC)流通溶液(聚乙二醇化蛋白质混合物)的连续流动，这种在线调节是为了向HIC材料连续提供较低的流通溶液。IEC(AEC或CEC)流通溶液可以包含低比例的非-聚乙二醇化蛋白质和高比例的聚乙二醇化蛋白质(单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质)。本发明的方法还可以牵涉通过进行疏水作用色谱(HIC)步骤从聚乙二醇化蛋白质混合物中的寡-聚乙二醇化蛋白质中分离单-聚乙二醇化蛋白质。
本发明的方法特别适合于生产单-聚乙二醇化EPO组合物。在用于生产单-聚乙二醇化EPO的方法中，AEC步骤在约7.0-10.0、约7.0-9.0、约7.5-8.5或约8.0的pH下进行。这是有利的，超过了牵涉阳离子交换色谱法(CEC)的方法，而阳离子交换色谱法(CEC)通常在3.0或以下的pH下进行。约pH 3.0或以下的酸性条件可以EPO对质量具有不良影响，这类不良影响在本发明的方法中减少，无需CEC且由此无需对于EPO的基于CEC的纯化必不可少的低pH条件。
此外，EPO的酸性形式(酸性变体)可以具有较高的治疗活性，使得它们特别有用。然而，通过CEC回收EPO的单-聚乙二醇化酸性形式可能较差，因为它们在CEC中的洗脱条件类似于EPO的二-聚聚乙二醇化非酸性形式。酸性条件导致蛋白质分子中氨基酸侧链的氧化。当CEC根据其电荷分离蛋白质分子时，种类的碱性变体将比酸性变体更晚洗脱。因此，EPO的二-聚乙二醇化非酸性形式的CEC洗脱特性倾向于与EPO的单-聚乙二醇化酸性形式重叠。在本文公开的方法中减少了通过CEC对这些有用的单-聚乙二醇化酸性EPO形式的回收差的问题，所述方法不依赖于CEC将单-聚乙二醇化与寡-聚乙二醇化EPO分离。
与提供单-聚乙二醇化EPO的本发明相关的优点可以适用于其他蛋白质，特别是其他治疗蛋白。即避免低pH条件和酸性变体的回收可使本发明用于提供单-聚乙二醇化蛋白质而非单-聚乙二醇化EPO。所述方法可以包含在基本相同的pH下进行IEC和HIC步骤。所述方法可以包含在基本相同的pH下进行聚乙二醇化反应、IEC和HIC步骤。所述方法可以包含在基本相同的pH值下进行AEC步骤和纯化过程。所述方法可以包含在基本相同的pH下进行AEC和HIC步骤。所述方法可以包含在基本相同的pH下进行聚乙二醇化反应、AEC和HIC步骤。pH可以约为7.0-9.0或约7.5-8.5或约8.0。基本上相同的pH可以指±0.5个pH单位。在基本上相同pH下进行所述方法的步骤是有利的，因为它避免了对于步骤之间pH调节的需求，这些pH调节可能耗时且由此产率降低。该方法可以包含进行聚乙二醇化反应，得到反应产物的混合物，并且将反应产物的混合物直接施加于IEC材料。即该方法可以包含进行聚乙二醇化反应并且将得到的混合物施加于IEC材料，无需调节该混合物的pH。
本发明的方法牵涉提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，该步骤包含收集来自IEC步骤的流通溶液。收集IEC流通溶液可以包含从单独的IEC循环中收集批量的IEC流通溶液，按照这种方式，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。本发明的方法牵涉提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，该步骤包含收集来自AEC步骤的流通溶液。收集AEC流通溶液可以包含从单独的AEC循环中收集批量的AEC流通溶液，按照这种方式，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。
本发明的方法牵涉使聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程。这可以牵涉使汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程。收集IEC流通溶液可以包含通过在线连接、“在线调节操作”将IEC流通溶液递送至HIC材料。收集IEC流通溶液可以包含将IEC流通溶液递送至用于调节IEC流通溶液的容器，得到聚乙二醇化蛋白质混合物。IEC流通溶液可以包含低比例的非-聚乙二醇化蛋白质和高比例的聚乙二醇化蛋白质(单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质)。纯化过程可以包含使聚乙二醇化蛋白质混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤。HIC步骤可以以流通模式进行。流通模式中的HIC步骤可以包含使聚乙二醇化蛋白质混合物接触疏水作用材料并且收集流通量。流通量包含相对高比例的单-聚乙二醇化蛋白质。在流通模式中进行HIC步骤是有利的，因为它可以相对快捷地进行，由此有助于该方法的总体快捷性和产率。在流通模式而非结合和洗脱模式中进行HIC步骤是有利的，因为它可以使用相对较小尺寸的柱进行。
提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含汇集来自两个IEC步骤或三个IEC步骤或三个以上IEC步骤或四个IEC步骤或五个IEC步骤中的流通溶液。IEC流通溶液的这类汇集能够使HIC步骤由多个聚乙二醇化反应产物生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物，这是相对有效的。IEC步骤可以为一系列AEC步骤或一系列CEC步骤。本发明的方法牵涉使汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程。这可以牵涉使汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程。收集AEC流通溶液可以包含通过在线连接、“在线调节操作”将AEC流通溶液递送至HIC材料。收集AEC流通溶液可以包含递送AEC流通溶液至容器，以便调节AEC流通溶液，得到聚乙二醇化蛋白质混合物。收集AEC流通溶液可以包含将AEC流通溶液直接递送至HIC材料。当将AEC流通溶液直接递送至HIC材料时，例如，可以通过在线调节来调节AEC流通溶液。从AEC材料到HIC材料可以存在AEC流通溶液的连续流通，其为在线调节的，得到调节的流通溶液到HIC材料的连续流通。AEC流通溶液可以包含低比例的非-聚乙二醇化蛋白质和高比例的聚乙二醇化蛋白质(单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质)。该纯化方法可以包含使聚乙二醇化蛋白质混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤。
调节IEC流通溶液可以称作提供条件化的第二混合物。条件化的第二混合物在下文中更详细地描述。调节IEC流通溶液(或提供条件化的第二混合物)可以包含添加盐。调节IEC流通溶液包含添加N，N-二(羟乙基)甘氨酸。调节IEC流通溶液(或提供条件化的第二混合物)可以包含添加盐和N，N-二(羟乙基)甘氨酸。调节IEC流通溶液(或提供条件化的第二混合物)可以包含添加盐和/或N，N-二(羟乙基)甘氨酸，得到如下所述的条件化的第二混合物。
HIC步骤可以以流通模式进行。流通模式中的HIC步骤可以包含使聚乙二醇化蛋白质混合物接触疏水作用材料并收集流通量。流通量包含相对高比例的单-聚乙二醇化蛋白质。在流通模式中进行HIC步骤是有利的，因为它可以相对快捷地进行，从而有助于该方法的总体快捷性和产率。在流通模式而非结合和洗脱模式中进行HIC步骤是有利的，因为可以使用较小尺寸的柱进行。
提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含汇集来自两个IEC步骤或三个IEC步骤或三个以上IEC步骤或四个IEC步骤或五个IEC步骤的流通溶液。IEC流通溶液的这类汇集能够使HIC步骤由多个聚乙二醇化反应产物生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物，这是相对有效的。例如，提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含汇集来自两个AEC步骤或三个AEC步骤或三个以上AEC步骤或四个AEC步骤或五个AEC步骤的流通溶液。AEC流通溶液的这类汇集能够使HIC步骤由多个聚乙二醇化反应产物生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物，这是相对有效的。
附图简述
在附图中，“EPO”是指未反应的EPO(非-聚乙二醇化EPO)，“单”是指单-聚乙二醇化EPO，“寡”是指寡-聚乙二醇化EPO。“F/T”是指流通溶液。
图1：根据本发明的方法的实施方案的图示顺序和关键数据。非-聚乙二醇化原料用于两个额外的循环，无需补充新鲜的EPO。相对于WO 2009/010270中公开的单-聚乙二醇化EPO
Figure BDA0002637417760000151
的已知生产方法，计算出产率得到提高，其中使用两个CEC色谱柱。AEC材料的动态结合容量为35g/L(35g非聚乙二醇化蛋白质/L树脂)(比WO 2009/010270的方法的CEC材料高约30倍)。使用动态结合容量5g/L(5g寡-聚乙二醇化蛋白质/L树脂)(比WO2009/010270的方法中使用的CEC材料高～4倍)以流通模式上HIC柱。与WO 2009/010270中公开的方法相比，可以使第一个柱更小，并且可以在相等尺寸的第二个柱上一次运行来处理来自3个循环的合并的级分(流通量)。
图2：根据本发明的方法的实施方案的图示顺序和关键数据。通过在随后的循环中用等量的新鲜EPO替代已反应的EPO来增加批量大小。循环数可以根据需要在本文中进行改变。本文中选择批量大小，以便可以在一周内完成。相对于WO 2009/010270中公开的单-聚乙二醇化EPO的已知生产方法，计算出的产率提高约10倍。
图3：根据本发明的方法的实施方案的图示性顺序和关键数据。批量大小增加，因为在下一个循环中用相同数量的新鲜EPO替代聚乙二醇化反应中消耗的EPO。另外，用于聚乙二醇化反应的EPO的浓度增加到10g/L。按照这种方式，可以在相同的反应体积下处理两倍的量。在这种情况下，循环数可以根据需要改变。在本文中，选择批量大小，以便可以在一周内完成。相对于WO 2009/010270中公开的单-聚乙二醇化EPO的已知生产方法，计算出产率提高约20倍。
图4：来自流通模式中AEC的样品的色谱图，其显示了来自流通和洗脱液级分中聚乙二醇化反应混合物的EPO的收率。流通溶液中存在单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO。EPO可以通过几乎定量和高纯度的分步洗脱回收EPO用于进一步的聚乙二醇化反应。通过RP-HPLC测定级分的组成。
图5：在三个依次的循环中从聚乙二醇化反应混合物中回收EPO的实例AEC色谱图。循环2和3中的EPO总量减少，因为在循环2和3中只有从前一个循环中回收的未反应的EPO用于聚乙二醇化。流通溶液中存在单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化EPO。未反应的EPO可以通过几乎定量的和高纯度的分步洗脱来回收，以用于进一步的聚乙二醇化反应。通过RP-HPLC测定级分的组成。
图6：结合和洗脱模式中用Toyopearl Phenyl 650M纯化的性能量的实例HIC色谱图。在约500mM Na2SO4浓度的流通溶液中除去非-聚乙二醇化EPO。在下降的Na2SO4梯度中，单-聚乙二醇化EPO以约300mM Na2SO4从寡聚种类中洗脱，并且具有良好的分离度。通过RP-HPLC测定级分的组成。
图7：流通模式中用Toyopearl Phenyl 650M纯化的性能容量的实例HIC色谱图。单-聚乙二醇化EPO存在于流通溶液中，浓度约300mM Na2SO4。寡-聚乙二醇化EPO种类保留在色谱柱上直至再生。通过RP-HPLC测定级分的组成。
图8：图8A、8B和8C显示在三个依次循环中从聚乙二醇化反应混合物中回收EPO的AEC色谱图。
图9：用Toyopearl Phenyl 650M以结合和洗脱模式纯化的性能容量的HIC色谱图。
图10：用Toyopearl Phenyl 650M以流通模式纯化的性能容量的HIC色谱图。
发明详述
现在将参照附图讨论示例本发明原理的实施方案和实验。
单-聚乙二醇化蛋白质组合物
本发明涉及用于提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。本发明涉及用于提供包含至少90％的单-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质组合物的方法。特别地，本发明提供用于提供包含至少90％的单-聚乙二醇化EPO的EPO组合物的方法。
在本文上下文中，单-聚乙二醇化蛋白质组合物为包含蛋白质的组合物，其中该组合物中存在的相对高比例的蛋白质作为单-聚乙二醇化蛋白质存在。单-聚乙二醇化蛋白质组合物可以包含至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％的单-聚乙二醇化蛋白质。
包含至少x％的单-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质组合物是指蛋白质组合物，其中该组合物中存在的至少x％的蛋白质为单-聚乙二醇化的。例如，包含至少99％的单-聚乙二醇化蛋白质的该蛋白质组合物为蛋白质组合物，其中该组合物中存在的至少99％的该蛋白质为单-聚乙二醇化的。通过本发明的方法生产的蛋白质组合物可以包含至少约90％、至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％的单-聚乙二醇化蛋白质。
特别地，在本文上下文中，单-聚乙二醇化EPO组合物为包含EPO的组合物，其中该组合物中存在的相对高比例的EPO作为单-聚乙二醇化EPO存在。包含至少“x％”的单-聚乙二醇化EPO的EPO组合物是指EPO组合物，其中该组合物中存在的至少“x％”的EPO为单-聚乙二醇化的。例如，包含至少99％的单-聚乙二醇化EPO是EPO组合物为EPO组合物，其中该组合物中存在的至少99％的EPO为单-聚乙二醇化的。通过本发明的方法生产的EPO组合物可以包含至少约90％、至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％的单-聚乙二醇化EPO。通过本发明的方法生产的EPO组合物可以包含至少约98％的单-聚乙二醇化EPO。通过本发明的方法生产的EPO组合物可以包含至少约99％的单-聚乙二醇化EPO。
用于测定纯度的方法为本领域技术人员公知的。非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化或寡-聚乙二醇化蛋白质的纯度可以通过任意适合的分析方法测定(例如凝胶上的谱带强度、ELISA、HPLC等)。纯度的测定可以牵涉使用应用已知纯度的参比材料生成的标准曲线。还可以基于重量/重量测定纯度。例如，可以使用典型地对于色谱图中峰得到的相对″曲线下的面积″值测定本文以百分比术语(％)表示的非-聚乙二醇化或聚乙二醇化蛋白质的纯度，例如HPLC色谱图。测定纯度的方法包括RP-HPLC和尺寸排阻色谱法(SEC)。
色谱法
蛋白质的″等电点″或″pI″为蛋白质具有为零的总净电荷时的pH。即蛋白质的pI为蛋白质具有等量正电荷和负电荷时的pH。对任意指定蛋白质测定pI可以根据充分建立的技术进行，例如等电聚焦。EPO的pI在4.0-5.5。测定pI的可替代选择方法可以得到适度不同的值，例如，微芯片等电聚焦得到约3.5-4.0的表观pI(Vlckova 2008)。EPO的精确pI可能取决于例如糖基化的程度和唾液酸残基或电荷变异体的存在，而它们又可能取决于其产生的方式(例如用于重组表达的宿主细胞)。
离子交换色谱法基于其净表面电荷的差异分离分子。它可以用于分离蛋白质分子。在离子交换色谱法中，可以使包括关注的蛋白质的混合物通过携带电荷的离子交换材料。当离子交换材料带有负电荷时，该方法称作阳离子交换色谱法(CEC)，而当其带有正电荷时，该方法称作阴离子交换色谱法(AEC)。关注的蛋白质可以通过操作基于蛋白质与离子交换材料之间的电荷的相互作用分离自混合物的其余部分。这典型地通过操作混合物的离子强度或电导率和或通过离子交换材料的缓冲液来进行。
本文所用的术语离子交换色谱法(IEC)可以指阳离子交换色谱法(CEC)或阴离子交换色谱法(AEC)。如果方法牵涉多个IEC步骤，则它们或者为全部AEC步骤，或者为全部CEC步骤。同样，涉及的IEC流通溶液或IEC材料可以指CEC或AEC流通溶液，并且可以指CEC或AEC材料。如果方法牵涉为AEC步骤的IEC步骤，则全部IEC步骤为AEC步骤，IEC材料为AEC材料，IEC流通溶液为AEC流通溶液，任意的IEC洗脱液为AEC洗脱液。如果方法牵涉为CEC步骤的IEC步骤，则IEC步骤为CEC步骤，IEC材料为CEC材料，IEC流通溶液为CEC流通溶液，且任意的IEC洗脱液为CEC洗脱液。
例如，可以使包含关注的蛋白质的混合物上离子交换材料。选择加载条件(和洗涤条件，如果使用的话)以促进混合物的仅某些成分与离子交换材料结合。
例如，加载条件可以促进关注的蛋白质与离子交换材料的结合，然后可以用洗涤缓冲液洗涤离子交换材料，以去除混合物中不需要的成分(例如污染物)，且最终可以通过增加缓冲液的离子强度(电导率)洗脱关注的蛋白质(从离子交换材料中除去)。这种类型的方法称作“结合并洗脱”模式，因为关注的蛋白质与离子交换材料结合，且然后被洗脱。从洗脱步骤中的基质中流出并且包含关注的蛋白质的溶液可以称作洗脱物或洗脱液。
或者，加载条件可以促进混合物中不需要的成分(例如污染物)的结合。在这种模式下，关注的蛋白质可以流过离子交换材料的基质并被收集。这种类型的方法称作“流通”模式。流过离子交换材料基质后收集的成分为“流通型”或“流通型溶液”。离开基质并包含关注的蛋白质的流通溶液也可以称作“流出物”。与牵涉改变电导率和/或pH值以从柱上洗脱关注的蛋白质的“结合并洗脱”模式不同，“流通”模式在等度条件下进行。可以将流通溶液收集为级分，可以将其汇集以得到流通汇集物。蛋白质、例如EPO由氨基酸组成，所述氨基酸包括酸性和碱性残基。在低pH(高H+浓度)下，蛋白质的羧酸基团倾向于不带电荷(COOH)，而它们的含氮碱性基团则完全带电荷(-NH3 +)，使大多数蛋白质带有净正电荷。在高pH下，羧酸基团带负电荷(-COO-)，而碱性基团倾向于不带电荷(-NH2)，使大多数蛋白质带有净负电荷。
蛋白质的等电点(pI)为该蛋白质不带有净电荷时的pH，因为正电荷和负电荷平衡。
离子交换色谱法利用了以下事实：净表面电荷与pH值之间的相关性对于特定的蛋白质而言是唯一的。在pH值低于其等电点时，蛋白质将带有完全的正电荷，因此将与带负电荷的材料(即在CEC中)结合。在高于其等电点的pH值下，蛋白质将带有完全的负电荷，因此将与带正电荷的材料(即在AEC中)结合。
这就是为什么在AEC蛋白质混合物(负载组合物)和相对高pH的洗涤缓冲液中通常使用pH的原因，以使关注的蛋白质(或污染物，例如不需要的蛋白质)带有净负电荷，且由此与带正电荷的阴离子交换材料结合。当关注的蛋白质与阴离子交换材料结合时，可以任选地对其进行洗涤以除去污染物，然后将其洗脱。当污染物(例如不需要的蛋白质)结合到阴离子交换材料中时，将其从该混合物中去除，从而纯化流通中关注的一种或多种蛋白质。
疏水性相互作用色谱法(HIC)基于其表面疏水性差异分离分子。它可以用于分离蛋白质分子。在HIC中，可以使包括关注的蛋白质的混合物通过HIC材料。蛋白质与HIC材料之间的相互作用可以因存在某些盐而改变。增加盐浓度可以增加这种相互作用，而降低盐浓度可以减少这种相互作用。为了选择性洗脱，可以降低盐浓度，且混合物的成分可以按照疏水性顺序洗脱下来，大部分疏水性成分最后洗脱下来。HIC可以以流通模式进行或以如上述对离子交换色谱法所述的结合并洗脱模式进行。
在本文上下文中，色谱“材料”例如阴离子交换材料或HIC材料是指固定相或固相。它也可以称作树脂或基质。本文上下文中的这种“材料”提供了混合物成分例如关注的蛋白质可以结合的基质。该材料可以为或可以包含柱，例如，膨胀床或填充床柱。该材料可以为离散颗粒或珠粒的形式。该材料可以是膜的形式。在本文上下文中，流动相流经固定相并携带通过色谱法分离的物质。流动相为混合物，例如第一或第二混合物或溶液例如流通溶液。缓冲液、例如洗脱缓冲液或洗涤缓冲液也是流动相。
在本文上下文中，术语“加载”是指使混合物或组合物在色谱材料中接触的步骤。色谱材料可以在加载步骤前平衡。
平衡牵涉对色谱材料施加平衡缓冲液。选择平衡缓冲液的pH、离子强度、导电率和/或盐浓度，以确保当将蛋白质混合物加载到色谱基质上时，实现期望的结合和/或流通或特定蛋白质或污染物的流动。
可以通过改变缓冲液的离子强度、pH、电导率或盐浓度，使用梯度洗脱或分步洗脱来实现从色谱材料(例如阴离子交换材料或阳离子交换材料或疏水作用材料)的洗脱。当许多关注的各个成分结合至材料并且可以以不同方式洗脱时，可以使用梯度洗脱或线性梯度洗脱，且用于高分离度分离。分步洗脱对于从色谱材料中除去单一成分(或共同除去特定组的成分)是有用的。分步洗脱相对快捷且消耗的缓冲液较少。分步洗脱可以用于从色谱材料中以相对浓缩的形式洗脱关注的蛋白质。离子强度的上升梯度通常用于AEC中的洗脱。盐浓度的下降梯度通常用于HIC中的洗脱。
生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物
本发明提供用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。
与使用CEC提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物的现有技术方法相比，本文公开的方法产率更高。用于生产单-聚乙二醇化EPO的现有技术方法描述在WO 2009/010270中。
本发明提供用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的产物混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；(b)使反应产物的混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；AEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于AEC材料；和(c)收集来自步骤b)的AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，其中通过从AEC材料中洗脱AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
通过使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应生产的包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物在本文中也可以称作“第一混合物”。通过该方法生产的包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物在本文中也可以称作“第二混合物”。
本发明还提供用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该方法包含：使通过上述方法生产的包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程，其分离单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；并且回收单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对于聚乙二醇化蛋白质混合物增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
本发明提供用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的蛋白质组合物的方法，该方法包含：(a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的第一混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；(b)使第一混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物增加；AEC步骤包含在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下将第一混合物施加于AEC材料；(c)收集来自步骤b)的AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的第二混合物；和(d)使第二混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第二混合物增加，其中该蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
图1-3显示本公开方法的实施方案。
生产反应产物混合物
本发明的方法包含提供反应产物的混合物(步骤a)。本发明的方法采用包含非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物(或“第一混合物”)进行。反应产物的混合物包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质。该蛋白质可以为EPO。
本发明的方法采用包含非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物(或“第一混合物”)进行，其中寡-聚乙二醇化蛋白质的比例相对较低。反应产物的混合物可以包含低于约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的寡-聚乙二醇化蛋白质，寡-聚乙二醇化蛋白质可以为寡-聚乙二醇化EPO。反应产物的混合物可以包含低于约10％的寡-聚乙二醇化蛋白质。反应产物的混合物可以包含低于约10％的寡-聚乙二醇化EPO。
反应产物的混合物(或“第一混合物”)可以包含至少约20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％或70％的非-聚乙二醇化蛋白质。反应产物的混合物可以包含约20-70％、40-60％、45-55％的非-聚乙二醇化蛋白质。
反应产物的混合物(或“第一混合物”)可以包含至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％或70％的单-聚乙二醇化蛋白质。反应产物的混合物可以包含约30-70％、40-60％或45-55％的单-聚乙二醇化蛋白质。
反应产物的混合物(或“第一混合物”)可以包含(A)40-60％的非-聚乙二醇化蛋白质和(B)40-60％的单-聚乙二醇化蛋白质和(C)1-10％的寡-聚乙二醇化蛋白质，其中(A)、(B)和(C)的总和为100％。反应产物的混合物可以包含(A)45-55％的非-聚乙二醇化蛋白质和(B)45-55％的单-聚乙二醇化蛋白质和(C)1-5％的寡-聚乙二醇化蛋白质，其中(A)、(B)和(C)的总和为100％。
反应产物的混合物(或“第一混合物”)可以包含(A)非-聚乙二醇化蛋白质和(B)单-聚乙二醇化蛋白质和(C)寡-聚乙二醇化蛋白质。非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质可以以A∶B∶C之比存在，其中A约为40-60，B约为30-50，且C约为1-10；或者，其中A约为45-55，B约为35-45，且C约为1-10；或者，其中A约为35-55，B约为35-45，且C约为1-25。非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质可以以(A+B)∶C之比存在，其中(A+B)∶C约为19∶1；约9∶1或约9-19∶1。
所述比例可以为重量或质量比。所述比例可以为摩尔比。
通过进行聚乙二醇化反应得到反应产物的混合物(或“第一混合物”)。进行聚乙二醇化反应牵涉使蛋白质(可以为非-聚乙二醇化蛋白质)与聚乙二醇化试剂反应。所述蛋白质可以为EPO。聚乙二醇化反应可以如上述涉及EPO的聚乙二醇化所述进行。聚乙二醇化反应可以在约7.0-9.0的pH下进行，其中PEG/蛋白质的摩尔比约为0.6-1.0。
聚乙二醇化反应可以在约7.0-9.0或约7.5-8.5或约8.0的pH下进行。聚乙二醇化反应可以在约7.0-9.0或约7.5-8.5或约8.0的pH下、采用(NHS)活化的PEG试剂进行。进行聚乙二醇化反应时的pH可以取决于所用的PEG试剂。PEG试剂可以为mPEG-NHS、mPEG-SPA、mPEG-SVA或mPEG-CI。聚乙二醇化反应速率与pH之间的相关性综述在Pfister 2016中。用于聚乙二醇化反应的其他试剂为本领域公知的。
聚乙二醇化反应中PEG/蛋白质的摩尔比可以为≤1.0。聚乙二醇化反应中PEG/蛋白质的摩尔比可以约为0.8。PEG/蛋白质摩尔比可以约为0.25-1.0、0.3-1.0、0.4-1.0、0.5-1.0、0.6-1.0或0.7-1.0。PEG/蛋白质摩尔比可以约为0.25-1.2、0.3-1.2、0.4-1.2、0.5-1.2、0.6-1.2或0.7-1.2。PEG/蛋白质摩尔比可以约为0.25-1.5、0.3-1.5、0.4-1.5、0.5-1.5、0.6-1.5或0.7-1.5。PEG/蛋白质摩尔比可以具有约0.4、0.5、0.6或0.7的下限，且可以具有0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5的上限。
离子交换色谱法
使第一混合物经历离子交换色谱(AEC)步骤(步骤b)。这提供了IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于第一混合物增加。这提供了IEC流通溶液，其中非-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物减少。IEC步骤可以为AEC步骤或CEC步骤。
阴离子交换色谱法
可以使反应产物的混合物(或“第一混合物”)经历阴离子交换色谱(AEC)步骤(步骤b)。这提供了AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加。这提供了AEC流通溶液，其中非-聚乙二醇化蛋白质级分相对于反应产物的混合物减少。
在本公开的上下文中，增加的级分可以为增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量。增加的级分可以为增加至少约1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
在本公开的上下文中，减少的级分可以为减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量。减少的级分可以为增加至少约1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
AEC步骤包含使反应产物的混合物接触阴离子交换材料或将反应产物的混合物施加于阴离子交换材料。AEC步骤可以包含将反应产物的混合物上包含阴离子交换材料的柱。阴离子交换材料具有聚乙二醇化蛋白质、例如聚乙二醇化EPO的低结合容量。即AEC材料具有单-聚乙二醇化所期望的蛋白质物种的聚乙二醇化形式的相对低结合容量。使用适合于使非-聚乙二醇化蛋白质结合至阴离子交换材料的AEC条件。流通阴离子交换材料的溶液为AEC流通溶液。阴离子交换材料对聚乙二醇化蛋白质的低结合容量具有如下影响：大部分聚乙二醇化蛋白质流过阴离子交换材料且由此存在于AEC流通溶液中。适合于使非-聚乙二醇化蛋白质结合至阴离子交换材料的结合条件具有如下影响：大部分非-聚乙二醇化蛋白质被除去(通过结合阴离子交换材料)并且不存在于流通溶液中。
AEC材料可以为不会显著结合聚乙二醇化蛋白质的材料。这可能意味着AEC材料结合低于约10％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％的施加于它的聚乙二醇化蛋白质。使聚乙二醇化蛋白质结合至阴离子交换材料还可以因大量非-聚乙二醇化蛋白质施加于阴离子交换材料而减少。按照这种方式，结合的聚乙二醇化蛋白质被非-聚乙二醇化蛋白质替代。施加于阴离子交换材料的非-聚乙二醇化蛋白质的量可以约为阴离子交换材料的动态漏出容量的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％或120％。施加于阴离子交换材料的非-聚乙二醇化蛋白质的量可以约为阴离子交换材料的动态漏出容量的70-110％、约80-100％或约85-95％。施加于阴离子交换材料的非-聚乙二醇化蛋白质的量可以为阴离子交换材料的动态漏出容量的约80-95％。
AEC流通溶液包含单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质。AEC流通溶液还可以包含非-聚乙二醇化蛋白质，其中非-聚乙二醇化蛋白质的比例相对低或接近零。AEC流通溶液可以包含零非-聚乙二醇化蛋白质或低于检测限的量的非-聚乙二醇化蛋白质。该蛋白质可以为EPO。流通溶液可以包含低于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.0％、0.5％或0.1％的非-聚乙二醇化蛋白质。流通溶液可以包含低于约2％的非-聚乙二醇化蛋白质。流通溶液可以包含低于约2％的非-聚乙二醇化EPO。
AEC流通溶液可以包含至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约99.9％聚乙二醇化蛋白质。
AEC流通可以包含约80％的单-聚乙二醇化蛋白质和约20％的寡-聚乙二醇化蛋白质。AEC流通溶液可以包含至少约60％、65％、70％、75％或80％的单-聚乙二醇化蛋白质。流通溶液可以包含约60-90％、70-90％或75-85％的单-聚乙二醇化蛋白质。AEC流通溶液可以包含至少约20％、25％、30％、35％或40％的寡-聚乙二醇化蛋白质。流通溶液可以包含约10-40％、10-30％或15-25％的寡-聚乙二醇化蛋白质。
AEC流通溶液可以包含(A)0.1-5％的非-聚乙二醇化蛋白质和(B)60-90％的单-聚乙二醇化蛋白质和(C)10-40％的寡-聚乙二醇化蛋白质，其中(A)、(B)和(C)的总和为100％。流通溶液可以包含(A)0.1-1.5％的非-聚乙二醇化蛋白质和(B)75-85％的单-聚乙二醇化蛋白质和(C)15-25％的寡-聚乙二醇化蛋白质，其中(A)、(B)和(C)的总和100％。
AEC流通溶液可以包含(A)非-聚乙二醇化蛋白质和(B)单-聚乙二醇化蛋白质和(C)寡-聚乙二醇化蛋白质。非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质可以以A∶B∶C之比存在，其中A约为1-5，B约为10-20，且C约为5-15；或者，其中A约为1-3，B约为25-35，且C约为5-10。非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质可以以A∶(B+C)之比存在，其中A∶(B+C)约为1∶25；1∶50；1∶100；约1∶150、约1∶200或约1∶100-200。该比例可以为重量或质量比。该比例可以为摩尔比。
AEC步骤在适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合至AEC材料的条件下进行。适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合的条件可以通过筛选为AEC材料或pH、电导率、盐含量或平衡缓冲液的缓冲剂含量的一种或多种经经验确定。
离子交换材料中的官能团决定其电荷。在本文中，术语“强”和“弱”是指官能团的电离状态随pH变化的程度。强离子交换剂随pH的变化几乎不显示或不显示离子交换容量的变化。强离子交换剂可在很宽的pH范围内保持完全带电荷。弱离子交换剂显示出pH依赖性功能，并在较窄的pH范围内递送最佳性能。
强阴离子交换材料可包括季铵基团(Q)或季氨基乙基基团(QAE)。弱阴离子交换材料可以包括二乙氨基乙基残基(DEAE)。使用强阴离子交换材料的优点在于，由于没有电荷损失，因此可以将结合容量维持在高或低pH下。
AEC材料可以包含已经被带正电荷的配体或官能团即被碱性配体或官能团官能化的树脂。
用于本发明的方法的阴离子交换材料可以为强阴离子交换材料。阴离子交换材料优选为强阴离子交换材料。它可以具有季铵基团(Q)。它可以为被Q基团官能化的羟基化聚甲基丙烯酸聚合物。它可以具有50-150nm、70-120nm、70-100nm或90-110nm孔径。本文的孔径可以指平均孔径。它可以具有40-150μm、40-120μm、40-100μm、40-80μm或约60、65、70、80、90或100μm的粒径。粒径(或珠粒尺寸)可以指平均粒径。它可以具有70-100μm孔径和35-100μm珠粒尺寸。它可以具有100nm孔径和65μm珠粒尺寸。它可以为Toyopearl Super Q 650M(Tosoh Bioscience LLC；产品编号43205)。用于本发明的方法的阴离子交换材料可以根据制造商的说明使用。
用于本发明的方法的阴离子交换材料可以为弱阴离子交换材料。它可以具有叔和/或仲胺官能团。它可以不带有伯胺官能团。它可以仅具有一种类型的胺基或可以具有两种或多种类型的胺基。
阴离子交换材料可以为或可以包含柱，例如，膨胀床或填充床柱。阴离子交换材料可以为或可以包含连续逆流切向色谱系统。阴离子交换材料可以为离散颗粒或珠粒形式。阴离子交换材料可以为膜的形式。阴离子交换材料可以为官能化滤器或官能化纤维、羊毛或筛网形式。阴离子交换材料可以为任意其他固体支持物形式，这些固体支持物形式能够携带官能团或展示出阴离子交换特性。
阴离子交换剂的实例包括包括Toyopearl Super Q 650C、Toyopearl Super Q650S，Toyopearl GigaCap Q 650M、GigaCap Q 650S，Toyopearl Q-600C AR、ToyopearlDEAE 650S，Toyopearl DEAE 650M和Toyopearl DEAE 650C、Toyopearl Super Q 650、Toyopearl Super Q 650QAE、Toyopearl Super Q 550C、Macroprep High Q、FractoprepTMAE、Q Hyper DF、Capto Q、Q-Sepharose FF、Q-Sepharose BB、Q-Sepharose XL、-Sepharose HP、MiniQ、MonoQ、MonoP、DEAE Sepharose FF、Source SQ、Source 30Q、ANXSepharose 4FF(high sub)、Streamline DEAE、Streamline QXL、Poros HQ、Poros PI、Poros D，DEAEHyperD、Q Ceramic Hyper D、Fractogel DMAE。
本发明的方法中是AEC材料可以为具有蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量的阴离子交换材料。特别地，它可以为具有聚乙二醇化EPO的低结合容量的阴离子交换材料。阴离子交换材料可以为具有聚乙二醇化EPO的低结合容量的Toyopearl Super Q 650M，例如，低于约0.5g/L、0.05g/L、0.01g/L or 0.001g/L或接近0g/L的结合容量。阴离子交换材料可以为具有基本上与用在pH 8.0下25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、7.5mM Na2SO4平衡的Toyopearl Super Q 650M相同的聚乙二醇化EPO的结合容量的阴离子交换材料。
AEC材料可以具有20-50g/L、30-40g/L或约35g/L的对非-聚乙二醇化蛋白质例如非-聚乙二醇化EPO的相对高的结合容量。AEC材料可以具有至少约35g/L的对非-聚乙二醇化蛋白质、例如非-聚乙二醇化EPO的结合容量。
可以平衡阴离子交换材料，然后将反应产物的混合物(或“第一混合物”)施加于其上。AEC平衡缓冲液可以包含盐，例如Na2SO4和/或N，N-二(羟乙基)甘氨酸。AEC平衡缓冲液可以包含磷酸盐。AEC平衡缓冲液不含具有伯胺基团的化合物，例如，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。AEC平衡缓冲液可以具有约6.5-9.5、7.0-9.0、7.5-8.5或8.0的pH。AEC平衡缓冲液可以包含约10-40mM、15-35mM、20-30mM N，N-.二(羟乙基)甘氨酸或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。AEC平衡缓冲液可以包含约1-20mM、1-10mM、2.5-10mM、5-10mM盐或约7.5mM盐。用于AEC的平衡缓冲液可以包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约7.5mM Na2SO4、pH 8.0。平衡缓冲液可以具有约1-约8mS/cm、约1-约5mS/cm、约1.5-约3.0mS/cm、约2.0-约3.0mS/cm或约1.0-3.0mS/cm的电导率。如果反应产物的混合物具有平衡缓冲液电导率范围以外的电导率。则其可以将其进行调节(例如，通过添加盐和/或缓冲液)，得到反应产物的混合物，其具有平衡缓冲液电导率范围内的电导率或在平衡缓冲液的0.5mS/cm或0.05mS/cm内。
可以调节包含非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物(或“第一混合物”)，得到反应产物的混合物，其具有上述对平衡缓冲液举出的pH缓冲剂和盐值。反应产物的条件化混合物也可以称作AEC负载组合物或负载溶液。AEC负载溶液可以为非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的约10-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约5.0-10.0mM Na2SO4、pH 7.0-9.0的水溶液。AEC负载溶液可以为非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约7.5mM Na2SO4、pH 8.0的水溶液。
AEC步骤可以在高于蛋白质的pI至少1.0-2.0个pH单位的pH下进行。许多蛋白质具有5.5-7.5的pI，且由此本发明的方法可以用于生产单-聚乙二醇化蛋白质，其中AEC步骤在约6.5-9.5、或6.5-8.5或7.5-8.5的pH下进行。
EPO的pI在4.0-5.5。其中蛋白质为EPO的方法可以在高于蛋白质的pI至少2.0、2.5或3.0个pH单位下进行。这能够使EPO有效地结合至AEC材料。用于生产单-聚乙二醇化EPO组合物的方法可以牵涉在至少约7.0或约pH 7.0-10.0或pH 7.0-9.0的pH下进行的AEC步骤。pH可以约为7.5-8.5或约7.8-8.2或约8.0。
AEC步骤可以在约1.0-3.0mS/cm、1.5-2.5mS/cm或约2.2mS/cm的电导率下进行。AEC步骤的电导率可以通过调节AEC配合缓冲液或AEC洗涤缓冲液中的盐例如NaCl或Na2SO4浓度来调节。AEC步骤可以在约5.0-15mM、5.0-10mM或约7.5mM的Na2SO4浓度下进行。AEC步骤可以使用其他的盐进行，其浓度提供与本文对Na2SO4举出的那些等同的离子强度。
在将反应产物的混合物(或“第一混合物”)或AEC负载溶液施加于AEC材料中之后，可以洗涤AEC材料。可以用平衡缓冲液洗涤AEC材料。可以用洗涤缓冲液洗涤AEC材料。洗涤缓冲液可以包含约10-40mM、15-35mM、20-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。洗涤缓冲液可以包含约1-20mM、1-10mM、2.5-10mM、5-10mM盐或约7.5mM盐。它可以包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约7.5mM Na2SO4、pH 8.0。洗涤缓冲液可以具有约1-约8mS/cm、约1-约5mS/cm、约1.5-约3.0mS/cm、约2.0-约3.0mS/cm的电导率。可以用1-10、1-5或约1、2、3、4或5个柱体积的平衡缓冲液或洗涤缓冲液洗涤AEC材料。可以用一定体积的平衡缓冲液或洗涤缓冲液洗涤AEC材料，所述平衡缓冲液或洗涤缓冲液的体积的可以通过监测流通溶液的蛋白质含量(例如通过UV光谱法)且一旦蛋白质含量低于阈值(例如当UV信号恢复至基线时)则终止洗涤过程来测定。可以将流通溶液或流出液收集为级分，并且可以汇集这些流体级分的一些或全部。
牵涉阴离子交换色谱法的方法对于生产单-聚乙二醇化EPO是特别优选的，因为它们允许在EPO相对稳定下利用相对高的pH条件。
本发明的方法可以包含AEC步骤，其中AEC材料为Toyopearl Super Q 650M；AEC步骤在约7.0-9.0的pH下进行；AEC步骤在约1.0-3.0mS/cm的电导率下进行；且将第一混合物施加于作为包含约10-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约1-10mM Na2SO4的AEC负载溶液的AEC材料。所述蛋白质可以为红细胞生成素。
阳离子交换色谱法
IEC步骤可以为CEC步骤。可以使第一混合物经历阳离子交换色谱(CEC)步骤(步骤b)。这提供了CEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于第一混合物增加。这提供了CEC流通溶液，其中非-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物降低。
在本公开的上下文中，增加的级分可以增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量。增加的级分可以增加至少约1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
在本公开的上下文中，减少的级分可以减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量。减少的级分可以增加至少约1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
CEC步骤包含使第一混合物接触阳离子交换材料或将第一混合物施加于阳离子交换材料。CEC步骤可以包含使第一混合物上包含阳离子交换材料的柱。阳离子交换材料具有对聚乙二醇化蛋白质、例如聚乙二醇化EPO的低结合容量。即CEC材料具有相对低的单-聚乙二醇化组合物所期望的蛋白质物种的聚乙二醇化形式的结合容量。使用适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合至阳离子交换材料的CEC条件。流过阳离子交换材料的溶液为CEC流通溶液。阳离子交换材料对聚乙二醇化蛋白质的低结合容量具有如下影响：大部分聚乙二醇化蛋白质流过阳离子交换材料，且由此存在于CEC流通溶液中。适合于使非-聚乙二醇化蛋白质结合至阳离子交换材料的结合条件具有如下影响：大部分非-聚乙二醇化蛋白质被除去(通过结合阳离子交换材料)并且不存在于流通溶液中。
CEC材料可以为不会明显地结合聚乙二醇化蛋白质的材料。这可能意味着CEC材料结合低于约10％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％的施加于其上的聚乙二醇化蛋白质。聚乙二醇化蛋白质与阳离子交换材料结合还可以通过将非-聚乙二醇化蛋白质施加于阳离子交换材料来减少。按照这种方式，结合的聚乙二醇化蛋白质被非-聚乙二醇化蛋白质替代。施加于阳离子交换材料的非-聚乙二醇化蛋白质的量可以为阳离子交换材料的动态漏出容量的约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％或120％。施加于阳离子交换材料的非-聚乙二醇化蛋白质的量可以为阳离子交换材料的动态漏出容量的约70-110％、约80-100％或约85-95％。施加于阳离子交换材料的非-聚乙二醇化蛋白质的量可以为阳离子交换材料的动态漏出容量的约80-95％。
CEC流通溶液包含单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质。CEC流通溶液还可以包含非-聚乙二醇化蛋白质，其中非-聚乙二醇化蛋白质的比例相对较低或接近零。CEC流通溶液可以包含零非-聚乙二醇化蛋白质或低于检测限的量的非-聚乙二醇化蛋白质。所述蛋白质可以为EPO。该流通溶液可以包含低于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.0％、0.5％或0.1％的非-聚乙二醇化蛋白质。该流通溶液可以包含低于约2％的非-聚乙二醇化蛋白质。该流通溶液可以包含低于约2％的非-聚乙二醇化EPO。
CEC流通溶液可以包含至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少约99.9％聚乙二醇化蛋白质。
CEC流通可以包含约80％的单-聚乙二醇化蛋白质和约20％的寡-聚乙二醇化蛋白质。CEC流通溶液可以包含至少约60％、65％、70％、75％或80％的单-聚乙二醇化蛋白质。该流通溶液可以包含约60-90％、70-90％或75-85％的单-聚乙二醇化蛋白质。CEC流通溶液可以包含至少约20％、25％、30％、35％或40％的寡-聚乙二醇化蛋白质。该流通溶液可以包含约10-40％、10-30％或15-25％的寡-聚乙二醇化蛋白质。
CEC流通溶液可以包含(A)0.1-5％的非-聚乙二醇化蛋白质和(B)60-90％的单-聚乙二醇化蛋白质和(C)10-40％的寡-聚乙二醇化蛋白质，其中(A)、(B)和(C)的总和为100％。流通溶液可以包含(A)0.1-1.5％的非-聚乙二醇化蛋白质和(B)75-85％的单-聚乙二醇化蛋白质和(C)15-25％的寡-聚乙二醇化蛋白质，其中(A)、(B)和(C)的总和为100％。
CEC流通溶液可以包含(A)非-聚乙二醇化蛋白质和(B)单-聚乙二醇化蛋白质和(C)寡-聚乙二醇化蛋白质。非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质可以以A∶B∶C之比存在，其中A约为1-5，B约为10-20，且C约为5-15；或者，其中A约为1-3，B约为25-35，且C约为5-10。非-聚乙二醇化蛋白质、单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质可以以A∶(B+C)之比存在，其中A∶(B+C)约为1∶25；1∶50；1∶100；约1∶150、约1∶200或约1∶100-200。该比例可以为重量或质量比。该比例可以为摩尔比。
CEC步骤在适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合至CEC材料的条件下进行。适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合的条件可以通过筛选CEC材料或pH、电导率、盐含量或平衡缓冲液的缓冲剂含量的一种或多种经经验确定。
离子交换材料上的官能团决定其电荷。在本文上下文中，术语“强”和“弱”是指官能团的电离状态随pH变化的程度。强离子交换剂随pH的变化几乎不显示或无离子交换容量的变化。强离子交换剂可在宽的pH范围内保持完全带电荷。弱离子交换剂显示出pH依赖性功能，并在较窄的pH范围内提供最佳性能。
强阳离子交换材料可以包括磺酸基团。弱阳离子交换材料可以包括羧酸或膦酸官能团。使用强阳离子交换材料的优点在于，由于没有电荷损失，因此可以将结合容量维持在高或低pH下。
CEC材料可以包含被带负电荷的配体或官能团官能化、即被酸性配体或官能团官能化的树脂。
CEC材料包括POROS HS材料、Fractogel S材料、Fractogel EMD SO3-(S)、Fractogel EMD SO3-(M)、Fractogel SMD SE HiCap(M)、Fractogel EMD COO-(M)和CaptoS材料。
用于本发明的方法中的阳离子交换材料可以为强阳离子交换材料。它可以具有50-150nm、70-120nm、70-100nm或90-110nm孔径。本文的孔径可以指平均孔径。它可以具有40-150μm、40-120μm、40-100μm、40-80μm或约60、65、70、80或90100μm的粒径。粒径(或珠粒尺寸)可以指平均粒径。它可以具有70-100nm孔径和35-100μm珠粒尺寸。它可以具有100nm孔径和65μm珠粒尺寸。它可以为SP Toyopearl 650M。
阳离子交换材料可以为或可以包含柱，例如，膨胀床或填充床柱。阳离子交换材料可以为或可以包含连续逆流切向色谱系统。阳离子交换材料可以为离散的颗粒或珠粒形式。阳离子交换材料可以为膜的形式。阳离子交换材料可以为官能化的滤器或官能化的纤维、羊毛或筛网形式。阴离子交换材料可以为能够携带官能团或展示出阴离子交换特性的任意其他固体支持物的形式。
本发明的方法中的CEC材料可以为阳离子交换材料，其具有对蛋白质的聚乙二醇化形式的低结合容量。特别地，它可以为具有聚乙二醇化EPO的低结合容量的阳离子交换材料。阳离子交换材料可以为SP Toyopearl 650M，其具有聚乙二醇化EPO的低结合容量，例如，低于约0.5g/L、0.05g/L、0.01g/L或0.001g/L或接近0g/L的结合容量。
CEC材料可以具有20-50g/L、30-40g/L或约35g/L的相对高的非-聚乙二醇化蛋白质、例如非-聚乙二醇化EPO的结合容量。CEC材料可以具有至少约35g/L的非-聚乙二醇化蛋白质、例如非-聚乙二醇化EPO的结合容量。
提供包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混 合物
如上所述，本发明的方法牵涉使反应产物混合物(“第一混合物”)经历离子交换色谱(IEC)步骤(步骤b)。使用来自离子交换色谱步骤的流通，得到聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)(步骤c)。例如，聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含来自一个或多个IEC步骤的收集的流通量。提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含提供将聚乙二醇化蛋白质混合物批量提供给HIC装置(例如HIC柱)。或者，提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含将流通量通过在线连接提供给HIC装置(例如HIC柱)。
提供聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)的步骤(步骤c)包含收集来自IEC步骤的流通溶液。提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含汇集来自两个、三个、四个或五个IEC步骤或三个以上IEC步骤的流通溶液。提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含调节第二混合物。调节聚乙二醇化蛋白质混合物可以提供条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物，其具有将其中包含的单-聚乙二醇化蛋白质与寡-聚乙二醇化蛋白质分离的改善的适合性。调节聚乙二醇化蛋白质混合物可以提供条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物，其具有通过HIC将其中包含的单-聚乙二醇化蛋白质与寡-聚乙二醇化蛋白质分离的改善的适合性。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以称作HIC负载组合物或负载溶液。调节聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含添加盐和/或添加N，N-二(羟乙基)甘氨酸。
例如，如上所述，本发明的方法牵涉使反应产物混合物(“第一混合物”)经历阴离子交换色谱(AEC)步骤(步骤b)。使用来自阴离子交换色谱步骤的流通，得到聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)(步骤c)。例如，聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含来自一个或多个AEC步骤的收集的流通量。提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含将批量的聚乙二醇化蛋白质混合物提供给HIC装置(例如HIC柱)。或者，提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含将流通量通过在线连接提供给HIC装置(例如HIC柱)。
提供聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)的步骤(步骤c)包含收集来自AEC步骤的流通溶液。提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含汇集来自两个、三个、四个或五个AEC步骤或三个以上AEC步骤的流通溶液。提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤可以包含调节第二混合物。调节聚乙二醇化蛋白质混合物可以提供条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物，其具有将其中包含的单-聚乙二醇化蛋白质与寡-聚乙二醇化蛋白质分离的改善的适合性。调节聚乙二醇化蛋白质混合物可以提供条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物，其具有通过HIC将其中包含的单-聚乙二醇化蛋白质与寡-聚乙二醇化蛋白质分离的改善的适合性。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以称作HIC负载组合物或负载溶液。调节聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含添加盐和/或添加N，N-二(羟乙基)甘氨酸。
再循环未反应的蛋白质
所述方法牵涉进行聚乙二醇化反应，得到反应产物的混合物。非-聚乙二醇化(未反应的)蛋白质通过在随后的聚乙二醇化反应中包括它而得到再循环。通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质。然后将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。
所述方法可以牵涉进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质。然后将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。即可以进行额外的步骤a)、b)和c)的循环，其中来自上一个循环的非-聚乙二醇化蛋白质用于另一个循环的聚乙二醇化反应。或者，步骤a)、b)和c)的循环后可以接下来的聚乙二醇化反应(可以为步骤a)的聚乙二醇化反应)和提供溶液的处理步骤，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加，并且允许回收非-聚乙二醇化蛋白质。即步骤a)、b)和c)的循环后或可以交替地与聚乙二醇化反应，和与步骤b)IEC步骤不同、但具有相似效果的处理步骤。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的聚乙二醇化反应。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)、b)和c)的循环。
例如，所述方法牵涉进行聚乙二醇化反应，得到反应产物的混合物。非-聚乙二醇化(未反应的)蛋白质通过在随后的聚乙二醇化反应中包括它而得到再循环。通过从AEC材料中洗脱AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质。然后将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。
所述方法可以牵涉进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质。然后将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。即可以进行额外的步骤a)、b)和c)的循环，其中来自上一个循环的非-聚乙二醇化蛋白质用于另一个循环的聚乙二醇化反应。或者，步骤a)、b)和c)的循环后可以接下来的聚乙二醇化反应(可以为步骤a)的聚乙二醇化反应)和提供溶液的处理步骤，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加，并且允许回收非-聚乙二醇化蛋白质。即步骤a)、b)和c)的循环后或可以交替地与聚乙二醇化反应，和与步骤b)IEC步骤不同、但具有相似效果的处理步骤。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的聚乙二醇化反应。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)、b)和c)的循环。
不同的处理步骤适合于提供溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加，并且允许回收非-聚乙二醇化蛋白质存在，且为本领域技术人员所公知。它们包括，例如色谱方法，例如阳离子交换色谱法、离子交换色谱法和疏水性作用色谱法。
如本文所用，“循环”是指步骤a)、b)和c)的完整循环。
所述方法可以包含三个、四个或五个循环，其中每个循环的步骤b)包含从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到IEC洗脱液，并且，其中在步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。可以将在步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至随后的循环中的步骤a)的聚乙二醇化反应。
所述方法可以包含汇集来自多个IEC步骤的步骤b)中回收的非-聚乙二醇化蛋白质，然后将其用于随后的聚乙二醇化反应。所述方法可以包含汇集来自多个IEC步骤的步骤b)中回收的非-聚乙二醇化蛋白质，然后将其用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。所述方法可以包含汇集从两个、三个、四个或五个步骤b)IEC步骤或五个以上步骤b)IEC步骤中回收的非-聚乙二醇化蛋白质。
所述方法可以包含将步骤b)IEC洗脱液直接添加至随后的聚乙二醇化反应。所述方法可以包含将来自循环步骤b)的IEC洗脱液直接添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。例如，该方法可以包含将来自第一个循环步骤b)的IEC洗脱液直接添加至第二个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。在本文上下文中，直接添加是指在纯化或净化洗脱液中非-聚乙二醇化蛋白质(例如通过渗滤或超滤)中无居间步骤。而是将来自包含非-聚乙二醇化蛋白质的IEC材料的洗脱液添加至随后的聚乙二醇化反应。
可以给用于随后的聚乙二醇化反应的非-聚乙二醇化蛋白质补充新鲜蛋白质。该方法可以包含将新鲜蛋白质与从IEC材料中回收的非-聚乙二醇化蛋白质一起添加至聚乙二醇化反应。再循环非-聚乙二醇化蛋白质的步骤包含将从IEC材料中回收的非-聚乙二醇化蛋白质添加至随后的聚乙二醇化反应，且这可以进一步包含将新鲜蛋白质添加至聚乙二醇化反应，使得聚乙二醇化反应中的蛋白质起始浓度基本上恒定。在本文上下文中，基本上恒定可以指第二次和随后的聚乙二醇化反应中的蛋白质起始浓度与第一次聚乙二醇化反应基本上相同。这可以指第二次和随后的聚乙二醇化反应中的蛋白质起始浓度与第一个循环的聚乙二醇化反应中基本上相同。基本上相同可以指±10％。新鲜蛋白质是指尚未经历聚乙二醇化反应的蛋白质。
所述方法可以牵涉步骤a)、b)和c)的循环，以便进行第一个和第二个循环，且第二个循环为最终的循环。或者，本发明的方法可以牵涉步骤a)、b)和c)的两个额外的循环，以便进行第一个、第二个和第三个循环，且第三个循环为最终的循环。所述方法可以牵涉两个以上额外的步骤a)、b)和c)的循环。所述方法可以牵涉总计一个、两个、三个、四个或五个步骤a)、b)和c)的循环。
最终循环可以包含进行聚乙二醇化反应，其中PEG/蛋白质的摩尔比在约1.4-1至约2-1。PEG/蛋白质的摩尔比可以约为1.4-1.0、1.5-1.0、1.6-1.0、1.7-1.0、1.8-1.0、1.9-1.0、2.0-1.0、2.1-1.0、2.2-1.0、2.3-1.0、2.4-1.0或2.5-1.0。相对高的PEG/蛋白质比在最终循环中可能是有利的。在最终循环后，不存在未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的再循环，且由此通过最小化未反应的蛋白质将蛋白质废物减少到最低限度可能是有利的。即在最终的循环中，最大化蛋白质聚乙二醇化且特别是单-聚乙二醇化可能是有利的。
最终循环可以包含在约pH 7.0-9.0下进行聚乙二醇化反应。聚乙二醇化反应可以在约pH 7.5-8.5或约pH 8.0下进行。聚乙二醇化反应可以在约15-25℃或约20℃下进行。聚乙二醇化反应可以具有30-120分钟或约60分钟的反应时间。聚乙二醇化可以使用NHS-活化的PEG。
可以通过从IEC材料中洗脱在IEC步骤中回收非-聚乙二醇化蛋白质。因此，回收非-聚乙二醇化蛋白质可以牵涉提供包含相对浓缩形式和/或相对纯形式的非-聚乙二醇化蛋白质的洗脱液。该洗脱液可以包含至少约95％的非-聚乙二醇化蛋白质。
从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质可以包含使IEC材料接触洗脱缓冲液。IEC洗脱缓冲液可以包含约40-100mM、50-90mM、60-80mM NaCl，或约70mM NaCl，或至少约40mM、50mM、60mM或70mM NaCl，或约20-60mM、40-50mM或约45mM NaCl。洗脱缓冲液可以包含小于或等于约45mM NaCl。洗脱缓冲液可以包含约20-50mM、25-45mM、30-40mM Na2SO4或约35mMNa2SO4或至少约20mM、25mM、30mM或35mM Na2SO4。其他的盐可以为适用于IEC洗脱缓冲液，其可以提供对NaCl和Na2SO4所示浓度范围相同量的带负电荷的离子。例如，洗脱缓冲液可以包含约70mM NaCl或约35mM Na2SO4。洗脱缓冲液可以包含约20-30mM或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。洗脱缓冲液可以具有约7.0-9.0、7.5-8.5或约8.0的pH。洗脱缓冲液可以包含约35mM Na2SO4、约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、pH约8.0。
用于IEC材料的洗脱缓冲液可以包含盐，其用量为小于或等于约60mM、55mM、50mM、45mM、40mM或35mM。洗脱缓冲液可以包含盐，其用量低于约60mM、55mM、50mM、45mM或40mM。所述盐可以为Na2SO4。所述盐可以为包含Na2SO4的盐混合物。用于IEC材料的洗脱缓冲液可以具有约5-20mS/cm、5-15mS/cm或8-10mS/cm的电导率。洗脱缓冲液可以具有小于或等于约20mS/cm、15mS/cm或10mS/cm的电导率。
作为用于IEC洗脱缓冲液(或本文讨论的另外的缓冲溶液)的N，N-二(羟乙基)甘氨酸的可替代选择包括，例如，另外的“Good氏缓冲液”。可以使用具有约6-10的pKa的缓冲液。可以使用磷酸盐或HEPES。不含伯胺的缓冲液为特别适合的(因为伯胺可以充当PEG试剂的伴侣，产生一些聚乙二醇化缓冲分子)。
作为用于IEC洗脱缓冲液(或本文讨论的另外的缓冲溶液)的Na2SO4的可替代选择包括，例如，盐，其包含阴离子，其选自：PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-；和阳离子，其选自：NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li2 +、Mg2 +、Ca2 +、Ba2 +。作为Na2SO4的可替代选择的盐可以包括NaCl、KCl、NaHPO4、LiCl和KSCN。
例如，所述方法可以牵涉进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中通过从AEC材料中回收AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质。然后将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。即可以进行额外的步骤a)、b)和c)的循环，其中来自上一个循环的非-聚乙二醇化蛋白质用于另一个循环的聚乙二醇化反应。或者，步骤a)、b)和c)的循环随后可以为接下来的聚乙二醇化反应(可以为步骤a)聚乙二醇化反应)和提供溶液的处理步骤，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加，并且允许回收非-聚乙二醇化蛋白质。即步骤a)、b)和c)的循环后或可以交替与聚乙二醇化反应和与步骤b)AEC步骤不同、但具有类似效果的处理步骤。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的聚乙二醇化反应。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)聚乙二醇化反应。回收的非-聚乙二醇化蛋白质可以用于随后的步骤a)、b)和c)的循环。
不同的加工步骤适合于提供溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加，并且允许回收的非-聚乙二醇化蛋白质存在，且为本领域技术人员所公知。它们包括，例如，色谱方法，例如阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和疏水作用色谱法。
如本文所用，“循环”是指步骤a)、b)和c)的完整循环。
所述方法可以包含三、四或五个循环，其中每个循环的步骤b)包含从AEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到AEC洗脱液，并且，其中步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。可以将步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至随后循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。
所述方法可以包含在步骤b)中汇集从多个AEC步骤中回收的非-聚乙二醇化蛋白质，然后将其用于随后的聚乙二醇化反应。所述方法可以包含在步骤b)中汇集从多个AEC步骤中回收的非-聚乙二醇化蛋白质，然后将其用于随后的步骤a)的聚乙二醇化反应。所述方法可以包含汇集从AEC步骤的两个、三个、四个或五个步骤b)或AEC步骤的五个以上步骤b)中回收的非-聚乙二醇化蛋白质。
所述方法可以包含将步骤b)的AEC洗脱液直接添加至随后的聚乙二醇化反应中。所述方法可以包含将来自循环的步骤b)的AEC洗脱液直接添加至下一个循环步骤a)的的聚乙二醇化反应中。例如，该方法可以包含将来自第一个循环的步骤b)的AEC洗脱液直接添加至第二个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。在本文上下文中，直接添加是指在纯化或净化洗脱液中的非-聚乙二醇化蛋白质中无居间步骤(例如通过渗滤或超滤)。而是将来自包含非-聚乙二醇化蛋白质的AEC材料的洗脱液添加至随后的聚乙二醇化反应中。
可以给用于随后的聚乙二醇化反应的非-聚乙二醇化蛋白质补充新鲜蛋白质。该方法可以包含将新鲜蛋白质与从AEC材料中回收的非-聚乙二醇化蛋白质一起添加至聚乙二醇化反应中。再循环非-聚乙二醇化蛋白质的步骤包含将从AEC材料中回收的非-聚乙二醇化蛋白质添加至随后的聚乙二醇化反应中，且这可以进一步包含将新鲜蛋白质添加至聚乙二醇化反应中，使得聚乙二醇化反应中的蛋白质起始浓度基本上恒定。在本文上下文中，基本上恒定可以指第二和随后的聚乙二醇化反应中的蛋白质起始浓度与第一聚乙二醇化反应中相同。这可以指第二和随后的聚乙二醇化反应中的蛋白质起始浓度与第一个循环的聚乙二醇化反应中基本上相同。基本上相同可以指±10％。新鲜蛋白质是指尚未进行上述聚乙二醇化反应的蛋白质。
所述方法可以牵涉步骤a)、b)和c)的循环，使得进行第一和第二个循环，并且第二个循环为最终的循环。或者，本发明的方法可以牵涉步骤a)、b)和c)的两个额外的循环，使得进行第一、第二和第三个循环，并且第三个循环为最终的循环。所述方法可以牵涉两个以上额外的步骤a)、b)和c)的循环。所述方法可以牵涉总计一个、两个、三个、四个或五个步骤a)、b)和c)的循环。
最终循环可以包含进行聚乙二醇化反应，其中PEG/蛋白质的摩尔比约为1.4-1至约2-1。PEG/蛋白质的摩尔比可以约为1.4-1.0、1.5-1.0、1.6-1.0、1.7-1.0、1.8-1.0、1.9-1.0、2.0-1.0、2.1-1.0、2.2-1.0、2.3-1.0、2.4-1.0或2.5-1.0。相对高的PEG/蛋白质比在最终的循环中可能是有利的。在最终的循环后，不存在未反应的(非-聚乙二醇化)蛋白质的再循环，且由此通过使未反应的蛋白质最少化对于将蛋白质废物减少到最低限度可能是有利的。即在最终的循环中，使蛋白质聚乙二醇化且特别是单-聚乙二醇化达到最大化可能是有利的。
最终循环可以包含在约pH 7.0-9.0下进行聚乙二醇化反应。可以在约pH 7.5-8.5或约pH 8.0下进行聚乙二醇化反应。聚乙二醇化反应可以在约15-25℃或约20℃下进行。聚乙二醇化反应可以具有30-120分钟或约60分钟的反应时间。聚乙二醇化可以使用NHS-活化的PEG。
可以通过从AEC材料中洗脱在AEC步骤中回收非-聚乙二醇化蛋白质。因此，回收非-聚乙二醇化蛋白质可以牵涉以相对浓缩形式和/或相对纯的形式提供包含非-聚乙二醇化蛋白质的洗脱液。该洗脱液可以包含至少约95％的非-聚乙二醇化蛋白质。
从AEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质可以包含使AEC材料接触洗脱缓冲液。AEC洗脱缓冲液可以包含约40-100mM、50-90mM、60-80mM NaCl，或约70mM NaCl或至少约40mM、50mM、60mM或70mM NaCl。洗脱缓冲液可以包含约20-50mM、25-45mM、30-40mM Na2SO4或约35mM Na2SO4或至少约20mM、25mM、30mM或35mM Na2SO4。另外的盐可以为适用于AEC洗脱缓冲液，其可以提供与NaCl和Na2SO4所示浓度范围相同量的带负电荷离子。例如，洗脱缓冲液可以包含约70mM NaCl或约35mM Na2SO4。洗脱缓冲液可以包含约20-30mM或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。洗脱缓冲液可以具有约7.0-9.0、7.5-8.5或约8.0的pH。洗脱缓冲液可以包含约35mM Na2SO4、约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、pH约8.0。
用于AEC材料的洗脱缓冲液可以包含盐，其用量小于或等于约60mM、55mM、50mM、45mM、40mM或35mM。洗脱缓冲液可以包含盐，其用量低于约60mM、55mM、50mM、45mM或40mM。所述盐可以为Na2SO4。所述盐可以为包含Na2SO4的盐的混合物。用于AEC材料的洗脱缓冲液可以具有约5-20mS/cm、5-15mS/cm或8-10mS/cm的电导率。洗脱缓冲液可以具有小于或等于约20mS/cm、15mS/cm或10mS/cm的电导率。
作为用于AEC洗脱缓冲液的N，N-二(羟乙基)甘氨酸的替代选择(或本文讨论的另外的缓冲溶液)包括，例如，另外的“Good氏缓冲液”。可以使用具有约6-10的pKa的缓冲液。可以使用磷酸盐或HEPES。不含伯胺的缓冲液为特别适合的(因为伯胺可以充当PEG试剂的伴侣，从而产生一些聚乙二醇化缓冲分子)。
作为用于AEC洗脱缓冲液的Na2SO4的替代选择(或本文讨论的另外的缓冲溶液)可以包括，例如，盐，其包含阴离子，所述阴离子选自：PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-；和阳离子，其选自：NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li2 +、Mg2 +、Ca2 +、Ba2 +。作为Na2SO4的替代选择可以包括NaCl、KCl、NaHPO4、LiCl和KSCN。
AEC和HIC步骤的进行
本发明的方法中的IEC和HIC步骤可以依次进行。例如，本发明的方法中的AEC和HIC步骤可以依次进行。即该方法可以包含如下的依次步骤：a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的第一混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；b)使第一混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物增加；AEC步骤包含将第一混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于AEC材料；c)收集来自步骤b)的AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的第二混合物；和d)使第二混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第二混合物增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
术语“依次”是指任意的步骤a-d之间无居间的色谱步骤(步骤(a)与(b)、(b)与(c)、(c)与(d)之间无色谱步骤)。术语“依次”是指权利要求任一项中所述的任意步骤之间无居间的色谱步骤。本发明的方法的步骤可以直接进行，其含义为步骤(b)-(d)的每一个在上一个步骤后直接进行。所述方法可以由步骤(a)-(d)组成。所述方法可以由权利要求任一项中所述的步骤组成。
步骤(b)-(d)可以以不连续或连续方式进行。步骤(b)-(d)可以以依次和不连续或依次和连续方式进行。连续方式是指AEC材料和HIC材料直接连接或存在允许在AEC材料与HIC材料之间连续流动的一些另外的机制。不连续方式是指在AEC材料与HIC材料之间不存在连续流动，例如，收集并且汇集AEC流通溶液或流出液，得到第二混合物。连续方式的步骤的进行可以指相同流速用于整个方法中。
可以将IEC流通溶液直接施加于HIC材料。优选地，进行条件化步骤以直接提供具有条件化第二混合物的HIC材料。IEC材料和HIC材料可以直接串联。例如，IEC材料可以包含在IEC柱中，并且HIC材料可以包含在HIC柱中，且IEC柱直接连接至HIC柱。来自IEC柱的IEC流通溶液可以直接连接至HIC柱。IEC柱与HIC柱之间存在在线连接。可能存在允许IEC柱与HIC柱之间的连续流动的机制。所述方法的步骤可以连续进行。所述方法的步骤可以平行地进行，即在完成步骤(b)前可以开始步骤(d)，使得步骤(b)和(d)平行运行。即HIC步骤和IEC步骤可以平行运行。连续(或平行地)进行所述方法是有利的，因为它相对快捷和有效。
当IEC步骤为CEC步骤时，CEC和HIC步骤可以依次进行，和/或可以连续或不连续地进行，如上述对AEC和HIC步骤所述。
分离单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的纯化方法
本发明的方法使用IEC材料，其具有对蛋白质的聚乙二醇化形式的相对低的结合容量和对蛋白质的非-聚乙二醇化形式的相对高的结合容量。这是有利的，因为它有利于快捷分离非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化蛋白质。柱的大部分结合容量用于结合至蛋白质的非-聚乙二醇化形式，这有利于使用相对小的柱处理相对大体积的第一混合物(包含非-聚乙二醇化单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物)。这是因为第一混合物通常包含相对较低的非-聚乙二醇化蛋白质(IEC结合材料具有相对高的结合容量)和高聚乙二醇化蛋白质(IEC结合材料具有相对低的结合容量)-这意味着在操作中，本文公开的方法可以在IEC步骤中处理相对大体积的第一混合物。相对快捷地分离非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化蛋白质有利于快速再循环非-聚乙二醇化蛋白质和总体加工效率。
如上所述，本发明提供用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该方法包含：使如上述作为IEC流通溶液产生的包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程，该过程分离单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质。IEC流通溶液可以为AEC流通溶液。
存在各种适合的纯化方法，并且对于本领域技术人员而言是已知的，例如，沉淀、尺寸依赖性分离和过滤方法以及色谱方法，例如尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和疏水作用色谱法。在本文所述的方法中，疏水作用色谱法可以为优选的纯化方法。
疏水作用色谱法
HIC材料可以包含已经被疏水性配体官能化的树脂。HIC材料上的疏水性配体可以与蛋白质的疏水性表面发生相互作用。HIC材料上的配体和取代度(高或低取代“sub”)有助于其最终的疏水性和由此的其选择性。所述配体可以包含烷基或芳基。HIC材料的疏水性通过配体系列增加：醚、聚丙二醇(PPG)、苯基、丁基和己基。
用于本发明的方法中的HIC材料可以包含苯基配体。它可以包含被苯基配体官能化的甲基丙烯酸树脂。它可以为被苯基配体官能化的羟基化聚甲丙烯酸聚合物珠粒。它可以具有50-150nm、70-120nm、70-100nm、90-110nm孔径。它可以具有40-150μm、40-120μm、40-100μm、40-80μm或约60、65、70、80、90或100μm的粒径。它可以具有70-100nm孔径和30-65μm珠粒尺寸。它可以具有100nm孔径和65μm珠粒尺寸。它可以为Toyopearl Phenyl 650M(Tosoh Bioscience LLC；产品编号14478)。用于本发明的方法中的HIC材料可以根据制造商的说明使用。
HIC材料可以为或可以包含柱，例如，膨胀床或填充的床柱。HIC材料可以为多孔整体材料形式。HIC材料可以为官能化纤维、羊毛或筛网形式。HIC材料可以为能够携带官能团或展示出HIC特性的任意其他固体支持物的形式。HIC材料包括Toyopearl Phenyl 650M、Toyopearl Phenyl 650S、Toyopearl PPG 600M、TSKgel Phenyl 5PW、Butyl Sepharose4FF、Butyl-S Sepharose FF、Octyl Sepharose 4 FF、Phenyl Sepharose BB、PhenylSepharose HP、Phenyl Sepharose 6 FF High Sub、Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub、Source I SETH、Source 151 SO、Source 1 SPHE、Phenyl Sepharose BB，PhenylSepharose HP、Phenyl Sepharose 6 FF High Sub、Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub、Source I SETH，Source 151 SO，Source 1 SPHE，Cellufine Butyl，Cellufine Octyl、Cellufine Phenyl、WP HI-Propyl(C3)、Macroprep t-Butyl、Macroprep methyl。
本发明的方法可以包含流通模式中的HIC步骤。在流通模式中，将聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)在适合于单-聚乙二醇化蛋白质流过HIC材料的条件下施加于HIC材料，且由此存在于HIC流通溶液中。所述条件适合于寡-聚乙二醇化蛋白质结合至HIC材料。
本发明的方法可以包含结合和洗脱模式中的HIC步骤。在结合和洗脱模式中，将聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)在适合于单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质结合至HIC材料的条件下施加于HIC材料。从HIC材料中洗脱单-聚乙二醇化蛋白质。降低盐的梯度用于洗脱单-聚乙二醇化蛋白质。在低盐浓度下洗脱寡-聚乙二醇化蛋白质，且由此在分离的级分中从单-聚乙二醇化蛋白质洗脱。
可以平衡HIC材料，然后将聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”或HIC负载溶液)加载其上。HIC平衡缓冲液可以包含盐，例如Na2SO4和/或N，N-二(羟乙基)甘氨酸。HIC平衡缓冲液可以具有约6.5-9.0、7.5-8.5或8.0的pH。HIC平衡缓冲液可以包含约10-40mM、15-35mM、20-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。HIC平衡缓冲液可以包含约10-40mM、15-35mM、20-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸或约25mM NaPO4。
适合于单-聚乙二醇化蛋白质流过HIC材料、同时使寡-聚乙二醇化蛋白质结合至HIC材料的条件易于测定。可以选择pH、离子强度和平衡缓冲液的组成，以确保当蛋白质混合物上色谱基质时，得到期望的结合和/或流通或特异性蛋白质或污染物。例如，可以选择pH、离子强度和平衡缓冲液的组成，以确保单-聚乙二醇化蛋白质流过HIC材料，同时使寡-聚乙二醇化蛋白质结合至HIC材料。
为了平衡，在进行流通模式中的HIC步骤之前，平衡缓冲液可以包含约200-500mM、250-450mM、300-450mM、300-400mM、350-400mM盐或约390mM盐或约300mM盐。用于流通模式HIC的平衡缓冲液可以包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约390mM Na2SO4、pH 8.0。用于流通模式HIC的平衡缓冲液可以包含约25mM N，N-.二(羟乙基)甘氨酸、约300mM Na2SO4、pH8.0。用于流通模式HIC的平衡缓冲液可以包含约25mM NaPO4、约300mM Na2SO4、pH 8.0。用于流通模式HIC的平衡缓冲液可以具有约30-70mS/cm、40-60mS/cm或约50mS/cm的电导率。
当所述的方法包含流通模式中的HIC步骤时，该方法可以牵涉提供条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)，其包含盐(例如Na2SO4)和N，N-二(羟乙基)甘氨酸，可以作为约300mM Na2SO4和约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸存在或可以作为约390mMNa2SO4和约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸存在。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以称作HIC负载溶液。用于HIC流通模式的条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含约200-500mM、250-450mM、250-350mM盐或约300mM盐或约350-450mM盐或约390mM盐。该盐可以为Na2SO4。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含约10-40mM、15-35mM、20-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含约300mM Na2SO4和约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。
在HIC流通模式中，在将聚乙二醇化蛋白质混合物施加于HIC材料后，可以洗涤HIC材料。可以用适用于流通模式的平衡缓冲液洗涤HIC材料。可以用HIC洗涤缓冲液洗涤HIC材料，所述HIC洗涤缓冲液可以包含约200-500mM、250-450mM、300-450mM、300-400mM、350-400mM盐或约390mM盐或约300mM盐。用于流通模式的HIC洗涤缓冲液可以包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约390mM Na2SO4、pH 8.0。用于流通模式的HIC洗涤缓冲液可以包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约300mM Na2SO4、pH 8.0。可以用1-10、1-5或约1、2、3、4或5个柱体积的缓冲液洗涤HIC材料。可以用一定体积的平衡缓冲液或洗涤缓冲液洗涤HIC材料，所述体积通过监测流通溶液的蛋白质含量(例如通过UV光谱法)并且一旦蛋白质含量低于阈(例如当UV信号恢复至基线时)值则终止洗涤过程来测定。可以将流通溶液或流出液收集为级分，并且可以汇集这些流通级分的一些或全部。
聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物”)可以包含零或接近零的非-聚乙二醇化蛋白质。聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含低于约10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1.0％、0.5％或0.1％的非-聚乙二醇化蛋白质。聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含低于约2％的非-聚乙二醇化蛋白质。聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含低于约2％的非-聚乙二醇化EPO。
当本发明的方法包含流通模式中的HIC步骤时，聚乙二醇化蛋白质混合物的非-聚乙二醇化蛋白质含量应低于最终治疗产物的阈值规格。
当以流通模式进行HIC步骤时，HIC流通提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。即HIC流通为如本文所述的单-聚乙二醇化蛋白质组合物。HIC流通可以包含至少90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
当以流通模式进行HIC步骤时，可以从HIC材料中洗脱寡-聚乙二醇化蛋白质。例如，通过梯度或分步洗脱，在0mS/cm电导率下。
为了在结合和洗脱模式下进行HIC步骤之前进行平衡，平衡缓冲液可以包含约400-600mM、450-550mM盐或约500mM盐。用于结合和洗脱模式的HIC平衡缓冲液可以包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约500mM Na2SO4、pH 8.0。用于结合和洗脱模式HIC的平衡缓冲液可以具有约40-80mS/cm、50-70mS/cm或约60mS/cm或约58mS/cm的电导率。
当所述方法包含在结合和洗脱模式下的HIC步骤时，该方法可以牵涉提供包含盐(例如Na2SO4)和N，N-(羟乙基)甘氨酸的条件化的聚乙二醇化蛋白质溶液(或“第二种介质”)，其可以以上述浓度的任意组合形式存在，并且可以以约500mM Na2SO4和约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸存在，并且洗脱步骤可以包含用500mM-0mM Na2SO4的降低梯度洗脱。条件化的聚乙二醇化蛋白质溶液可以称作HIC负载溶液。用于HIC结合和洗脱模式的条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含约250-750mM、400-600mM、450-550mM盐或约500mM盐。所述盐可以为Na2SO4。可以使用其他盐，例如NaCl。其他盐可以以提供与Na2SO4浓度等同的离子强度的浓度使用。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含约10-40mM、15-35mM、20-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸或约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。条件化的聚乙二醇化蛋白质混合物可以包含约500mM Na2SO4和约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸。
当HIC步骤以结合和洗脱模式进行时，将单-聚乙二醇化蛋白质从HIC材料中洗脱出来。通过降低盐梯度进行洗脱。洗脱可以包含应用从500mM-0mM盐(例如Na2SO4)的线性洗脱梯度。洗脱可以包含应用约60mS/cm-0mS/cm的线性洗脱梯度。在递减的盐梯度中，单-聚乙二醇化EPO在约300mM Na2SO4下洗脱(见图6)。从HIC材料中洗脱单-聚乙二醇化蛋白质提供HIC洗脱液，其中HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质。
当以流通模式进行HIC步骤时，HIC流通提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。即HIC流通为如本文所述的单-聚乙二醇化蛋白质组合物。HIC流通可以包含至少90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
可以调节聚乙二醇化蛋白质混合物(或“第二混合物“)用于一个或多个批次中的HIC步骤。可以在线调节聚乙二醇化蛋白质混合物。提供第二混合物的步骤(步骤c)可以包含在线调节该混合物，得到直接从IEC装置(例如AEC或CEC柱)到HIC装置(例如HIC柱)的条件化介质。例如，提供聚乙二醇化蛋白质混合物的步骤(步骤c)可以包含在线调节该混合物，得到直接从AEC装置(例如AEC柱)到HIC装置(例如HIC柱)的条件化介质。
室温可以约为18-25℃、20-22℃、约20℃、约21℃或约22℃。本文公开的方法可以在室温下进行。HIC可以在室温下进行。HIC可以在15-25℃的温度下进行。为了再现性，方法可以在特定和稳定的温度下进行HIC。稳定的温度可以为特定温度±1.0℃或±1.0℃。
本发明的方法可以包含使第二混合物经历流通模式中的HIC步骤，得到HIC流通溶液，其中单-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第二混合物增加，HIC步骤包含在适合于结合寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下将第二混合物施加于HIC材料，其中HIC流通提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。在这类方法中，HIC材料可以为Toyopearl Phenyl 650M，HIC步骤在约7.0-9.0的pH和约30-40mS/cm的电导率下进行；且将第二混合物施加于作为包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约390mM Na2SO4的HIC负载溶液的HIC材料。所述蛋白质可以为红细胞生成素。
本文公开的方法是有利的
蛋白质的形式和相对高的蛋白质的非-聚乙二醇化形式的结合容量。这是有利的，因为它有利于快捷地分离非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化蛋白质。大部分柱结合容量用于结合至蛋白质的非-聚乙二醇化形式，这有利于使用相对小的柱处理相对大体积的第一混合物(包含非-聚乙二醇化单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物)。这是因为第一混合物通常包含相对低的非-聚乙二醇化蛋白质(IEC结合材料对其具有相对高的结合容量)和高聚乙二醇化蛋白质(IEC结合材料对其具有相对低的结合容量)-这意味着在操作中，本文公开的方法可以在IEC步骤处理相对大体积的第一混合物。相对快捷地分离非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化蛋白质有利于快速再循环非-聚乙二醇化蛋白质和总体加工效率。
本发明的方法包含再循环非-聚乙二醇化蛋白质，无需进行渗滤或超滤步骤。这提供了更为快捷的方法，与牵涉再循环非-聚乙二醇化蛋白质、但需要从非-聚乙二醇化蛋白质级分中除去或减少盐的方法相比，该方法能够得到更高的产率。
例如，与WO 2009/010270中公开的现有技术方法相比，本发明的方法还具有相对较高的收率。回收非-聚丁基化(未反应)蛋白质可提高整体收率。如以下实施例中所讨论的，本文公开的方法提供的单-聚乙二醇化蛋白质的收率比WO 2009/010270中公开的方法的收率高40％以上。预期本文公开的方法的产率是WO 2009/010270中公开的类型的现有技术方法的产率的至少两倍，并且可以高出许多倍。当使用相同尺寸的设备时，预期本文公开的方法的产率是WO 2009/010270中公开的类型的现有技术方法的产率的至少两倍，并且可以高许多倍。
与Pfister(Biotech and BioEng 2016；113)中公开的方法相比，经计算本文.公开的方法的产率约为其两倍(产率提高了约1.7倍)。产率的提高主要是避免了费时的非聚乙二醇化(未反应)EPO渗滤的结果，然后再通过添加至随后的聚乙二醇化反应进行再循环。由于未反应的EPO在目前公开的方法中回收得更快，因此整体产率更高。本文公开的方法还牵涉更快的聚乙二醇化反应。经计算，本文公开的聚乙二醇化方法比Pfister中公开的方法每个反应多产生20-33％的单-聚乙二醇化EPO。
与WO 2009/010270中公开的方法相比，本文公开的方法产率更高并且具有更高的单-聚乙二醇化蛋白质的收率。
结合容量
色谱材料的结合容量是指在规定的实验条件下可以与介质结合的蛋白质的量。本文的结合容量可以指动态结合容量。动态结合容量是指在定义的实验条件下可以与介质结合的蛋白质的量，所述实验条件包括流动相(或缓冲溶液)的流速。结合容量可以指静态结合容量，其涉及不包括流速的限定实验条件。
用于特定蛋白质的动态结合容量可以使用常规技术测定。特定蛋白质的动态结合容量可以通过以下步骤来测定：加载包含已知浓度的该特定蛋白质的样品，并且测定流通至溶液的蛋白质浓度，以建立可以结合的蛋白质的量，然后大量蛋白质“突破”。这可以通过在规定的实验条件下为色谱材料生成“突破曲线”来实现。测量动态结合容量的实验条件可以为操作条件。实验条件可以为所用方法中使用的条件，得到单-聚乙二醇化蛋白质组合物。因此，在采用色谱材料的方法中，可以调节加载条件，以便在色谱材料的“突破”容量以下的范围内施加关注的蛋白质，以避免色谱材料超载。
在本文中涉及的动态结合容量是指在为色谱方法或步骤选择的条件下的动态结合容量。可以将用于特定蛋白质的特定色谱法条件下的色谱介质的动态结合容量视为可以加载到色谱介质上而不会造成不必要的蛋白质损耗的该蛋白质的最大量。即在不引起“突破”的情况下可以加载的关注的蛋白质最大量。蛋白质突破可以通过分光光度法进行监测，例如在280nm(A280)处。突破阈值可以为10％。色谱条件可以是pH、电导率和流速以及流动相中任何盐或其他添加剂的浓度。在相关色谱步骤的操作条件(为其选择的条件)下测定动态结合容量色谱材料。例如，在本发明方法的AEC步骤的操作条件下测定AEC材料的动态结合容量。
在本文上下文中，结合容量可以指在用于制备单-聚乙二醇化蛋白质组合物的色谱条件下的动态结合容量。例如，AEC材料的结合容量可以指AEC材料在25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约7.5mM Na2SO4、pH 8中的动态结合容量，流速为200cm/h，停留时间为3.3分钟。
HIC材料的结合容量在流通模式下可以约为5g/L聚乙二醇化蛋白质，而在结合和洗脱模式下为2g/L聚乙二醇化蛋白质。用于流通模式的寡-聚乙二醇化蛋白质的动态HIC材料的结合容量可以为至少约2g/L、3g/L、4g/L或5g/L或约2-8g/L、3-7g/L、4-6g/L或约5g/L。用于结合和洗脱模式的聚乙二醇化蛋白质的动态HIC材料的结合容量可以为至少约0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L或5g/L或约0.5-4g/L、1-3g/L或约5g/L。结合容量可以指HIC材料的聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量，在25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约300mM Na2SO4、pH8.0中，流速为150cm/h，停留时间为3.3分钟；或在25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、约390mMNa2SO4、pH 8.0中，流速为150cm/h，停留时间为3.3分钟。
在离子交换色谱步骤为阴离子交换色谱法的实施方案中，在适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合到AEC材料上的条件下进行AEC步骤。可以根据动态结合容量来考虑条件的适合性。AEC步骤以流通模式进行。在本发明的方法中，在AEC的流通模式中，聚乙二醇化蛋白质与AEC材料的结合相对较弱，而非聚乙二醇化蛋白质的结合相对较强(紧密地)。在这样的条件下，用于非聚乙二醇化蛋白质的AEC材料的动态结合容量相对较高，而用于聚乙二醇化蛋白质的AEC材料的动态结合容量相对较低。可以选择色谱条件以最大化非聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。可以选择色谱条件以最小化聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。可以选择色谱条件进行调整或优化AEC材料对聚乙二醇化蛋白质和非-聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量，以使非-聚乙二醇化蛋白质保留在AEC材料上，并且在流通溶液中回收聚乙二醇化蛋白质。AEC材料可以具有低于约2.5g/L、1.5g/L或1.0g/L或约1.0-2.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。例如，AEC材料可以具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。
因此，在本发明的方法中，使第一混合物经历AEC步骤，该步骤可以包含将第一混合物以一定载量加载到AEC材料上，该载量等于AEC材料对非聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量，或该载量低于CEC材料对非聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。它可以包含将第一混合物以比AEC材料对非-聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量低至少2、5、10、20、25或30倍的载量加载到AEC材料上(使得非-聚乙二醇化材料保留在AEC材料上)。非-聚乙二醇化蛋白质施加于阴离子交换材料上的量可以约为80-95％的阴离子交换材料的动态结合容量。可以将第一混合物以一定载量加载到AEC材料上，该载量高于AEC材料对聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量或高于AEC材料对聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量至少2、5、20、25或30倍(使得在来自AEC材料的流通溶液和流出液中回收聚乙二醇化蛋白质)。
随后在一定条件下从AEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，其中非-聚乙二醇化蛋白质的AEC材料的动态结合容量相对较低。通过使用与上样和/或洗涤缓冲液相比具有相对高电导率的洗脱缓冲液可以实现此目的。
HIC步骤可以为以流通模式进行。在本发明的方法中，在HIC步骤的流通模式中，关注的蛋白质(在这种情况下为单-聚乙二醇化蛋白质)与HIC材料的结合相对较弱，而不需要的蛋白质(或污染物，在这种情况下为寡-聚乙二醇化蛋白质)的结合相对较强(紧密)。在这种条件下，对寡-聚乙二醇化蛋白质的动态HIC材料的结合容量高于对单-聚乙二醇化蛋白质的动态HIC材料的结合容量。可以选择色谱条件以使对寡-聚乙二醇化蛋白质的结合强度最大化和/或使单-聚乙二醇化蛋白质的结合强度最小化。
HIC步骤可以在结合和洗脱模式下进行。在本发明的方法中，在HIC步骤中以结合和洗脱模式，关注的目标蛋白质(在这种情况下为单-聚乙二醇化蛋白质)与HIC材料的结合相对较弱，而不需要的蛋白质(或污染物，在这种情况下为寡-聚乙二醇化蛋白质)与HIC材料相对(牢固地)结合。可以使用递减的盐梯度在寡-聚乙二醇化蛋白质之前从HIC材料中洗脱出单-聚乙二醇化蛋白质。
在离子交换色谱步骤为阳离子交换色谱法的实施方案中，在适合于非-聚乙二醇化蛋白质结合到CEC材料上的条件下进行CEC步骤。可以根据动态结合容量来考虑条件的适合性。CEC步骤以流通模式进行。在本发明的方法中，在CEC的流通模式中，聚乙二醇化蛋白质与AEC材料的结合相对较弱，而非聚乙二醇化蛋白质的结合相对较强(紧密地)。在这样的条件下，用于非聚乙二醇化蛋白质的CEC材料的动态结合容量相对较高，而用于聚乙二醇化蛋白质的CEC材料的动态结合容量相对较低。可以选择色谱条件以最大化非聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量和/或最小化聚乙二醇化(或单-聚乙二醇化)蛋白质的动态结合容量。可以选择色谱条件进行调整或优化CEC材料对聚乙二醇化蛋白质和非-聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量，以使非-聚乙二醇化蛋白质保留在CEC材料上，并且在流通溶液中回收聚乙二醇化蛋白质。CEC材料可以具有低于约2.5g/L、1.5g/L或1.0g/L或约1.0-2.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。例如，CEC材料可以具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。
因此，在本发明的方法中，使第一混合物经历CEC步骤，该步骤可以包含将第一混合物以一定载量加载到CEC材料上，该载量等于CEC材料对非聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量，或该载量低于CEC材料对非聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量。它可以包含将第一混合物以比CEC材料对非-聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量低至少2、5、10、20、25或30倍的载量加载到CEC材料上(使得非-聚乙二醇化材料保留在CEC材料上)。非-聚乙二醇化蛋白质施加于阴离子交换材料上的量可以约为80-95％的阴离子交换材料的动态结合容量。可以将第一混合物以一定载量加载到CEC材料上，该载量高于CEC材料对聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量或高于CEC材料对聚乙二醇化蛋白质的动态结合容量至少2、5、20、25或30倍(使得在来自CEC材料的流通溶液和流出液中回收聚乙二醇化蛋白质)。
随后在一定条件下从CEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，其中非-聚乙二醇化蛋白质的CEC材料的动态结合容量相对较低。通过使用与上样和/或洗涤缓冲液相比具有较高电导率的洗脱缓冲液可以实现此目的。
色谱条件
加载到色谱材料上的蛋白质量可能取决于该材料的结合容量。例如，如果AEC材料具有对非-聚乙二醇化的EPO的结合容量约为35g/L，而在反应产物的混合物中的EPO约为50％，则施加于AEC材料的该反应产物的最大载量(就总蛋白而言)约为70g/L。
色谱步骤的流速可以根据常规技术进行选择和调整。更快的流速会降低结合容量，这意味着可以在达到最大动态结合容量和快速分离之间达到平衡，尤其是当应用大量分离的蛋白质混合物时。适合的流速可以为50-400cm/h。停留时间可以为3-5分钟或可能更少，这取决于所使用的色谱材料。更快的流速和更短的停留时间可以是改善整体工艺产率所期望的。
色谱步骤可以在“适合于结合”特定蛋白质(或蛋白质的聚乙二醇化形式)的条件下进行。本领域技术人员熟悉色谱法技术，并且能够使用其公知常识并在本公开的指导下根据经验找到适合于结合特定蛋白质的条件。参数例如色谱材料、盐的类型和/或浓度、pH、缓冲液、温度和流速均可以改变，得到适合于在色谱中结合特定蛋白质(或蛋白质的聚乙二醇化形式)的条件。
如上所述，在AEC中，通常使用蛋白质混合物(加载组合物)和相对高pH的缓冲液，以使关注的蛋白质(或污染物，例如不需要的蛋白质)带有净负电荷，且由此结合带正电荷的阴离子交换材料。相反，在CEC中，通常使用蛋白质混合物和pH值相对较低的洗涤缓冲液，以使关注的蛋白质(或污染物，例如不需要的蛋白质)带有净正电荷，且由此与带负电荷的阳离子交换材料结合。
本发明的方法可以用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中所述蛋白质具有约8.0或以下或7.0或以下或6.0或以下的pI。本发明的方法特别适合于具有pI为6.0或以下的蛋白质。在这种情况下，离子交换色谱法步骤可以为AEC步骤，且AEC条件在大于蛋白质的pl的pH下，优选大于蛋白质的pl至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.0个pH单位。在本文上下文中，pI可以指蛋白质组合物中蛋白质的最具有碱性的同种型的pI或蛋白质的最丰富同种型的pI。
本发明的方法可以用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中所述蛋白质具有约8.0或以上的pI。在这种情况下，离子交换色谱法步骤可以为CEC步骤，并且CEC条件在低于蛋白质的pl的pH下，优选小于蛋白质的pl至少0.5、1.0、2.0或3.0个pH单位。在本文上下文中，pI可以指蛋白质组合物中蛋白质的最具有酸性的同种型的pI或蛋白质的最丰富同种型的pI。所述蛋白质可以具有约2.0-6.0、2.5-5.5、3.0-5.5、3.5-5.0或约3.5-4.5的pI。
本发明的方法可以用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中所述蛋白质具有约6.0-8.0的pI。在这种情况下，离子交换色谱步骤可以为AEC或CEC步骤，其pH条件应选择为低于用于AEC的蛋白质的pI，而高于用于CEC的蛋白质的pI。优选地，离子交换步骤的pH为远离(不同于)蛋白质的pI至少0.5、1.0、2.0或3.0个pH单位。在本文上下文中，pI可以指蛋白质的最酸性或碱性同种型的pI或蛋白质组合物中蛋白质的最丰富的同种型的pI。离子交换色谱法为充分建立的技术，且由此本领域技术人员在选择适合于实施本发明方法的pH条件时不会遇到困难(即选择pH条件，其有利于非聚乙二醇化蛋白质与离子交换材料结合，并且允许聚乙二醇化蛋白质流通/通过流通溶液中回收的材料)。
聚乙二醇化反应的pH可以与离子交换步骤(AEC步骤或CEC步骤)的pH基本相同。可以将聚乙二醇化反应的pH选择为与离子交换步骤的pH基本相同，从而将由聚乙二醇化反应产生的蛋白质混合物直接加载到离子交换材料上。在本文上下文中，基本上相同的含义是在1.0、0.9、0.8、0.6、0.7、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1个pH单位内。在这样的方法中，第一混合物为由聚乙二醇化反应产生的反应产物的混合物。这样的方法是相对高效和快捷的。在本文上下文中，“直接加载”是指在对其进行离子交换色谱法步骤之前不进行反应产物的混合物的pH调节。用于聚乙二醇化反应的缓冲液可以与用于离子交换步骤的缓冲液相同。
聚乙二醇化反应可以在约6.5-9.5的pH下进行。可以选择使聚乙二醇化反应的pH远离蛋白质的pI至少0.5、1.0、2.0或3.0个pH单位，从而使反应产物的混合物可以在有利于结合蛋白质的pH下直接加载到离子交换材料上。在本文上下文中，具有相对中性pH(例如pI约7.5)的蛋白质可以是在约pH 9.5的反应中聚乙二醇化，并且反应产物的混合物经历AEC步骤。或者，具有约7.5的pI的蛋白质可以是在约pH 6.5的反应中聚乙二醇化，并且反应产物的混合物经历CEC步骤。可以选择聚乙二醇化反应的pH，使其远离蛋白质的pI至少0.5、1.0、2.0或3.0个pH单位，并相应地选择离子交换色谱法(AEC或CEC)的模式。按照这种方式，反应产物的混合物可以经历离子交换色谱步骤。
在本文上下文中，色谱步骤(例如AEC、CEC或HIC)可以从混合物(例如反应产物的混合物，在本文中也称作“第一混合物”；或聚乙二醇化蛋白质溶液，也称作“第二混合物”)中去除“污染物”，其中所述污染物为蛋白质的一种不期望的形式。污染物也可以称作杂质。例如，由于在本文上下文中蛋白质的理想形式为单-聚乙二醇化蛋白质，所以色谱步骤可以去除非-聚乙二醇化蛋白质或寡-聚乙二醇化蛋白质。色谱步骤还可以去除其他污染物，例如蛋白质聚集体或聚乙二醇化反应物。
本公开提供了AEC介质或CEC介质在从包含非聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的混合物中去除非聚乙二醇化蛋白质中的用途。蛋白质可以是EPO。如本文所公开的，可以在制备单-聚乙二醇化蛋白质的方法中进行AEC介质的应用。
可以使用筛选方法来选择用于实施本发明的色谱条件和色谱材料。所述筛选方法可以允许筛选结合的选择性。结合的选择性是有利的。例如，可以筛选离子交换材料和条件的选择性，该选择性有利于非-聚乙二醇化蛋白质与AEC材料结合以及聚乙二醇化蛋白质不结合离子交换材料。例如，可以对HIC材料和流通条件筛选选择性，以利于结合寡-聚乙二醇化蛋白质和不结合单-聚乙二醇化蛋白质。离子交换材料、例如AEC材料或CEC材料的筛选方法可能涉及以相对较低的电导率将非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物施加到离子交换材料上，然后将增加的电导率(例如盐)梯度施加到该材料上，并且监测洗脱液中非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化的材料的外观。该方法可以在几个不同的pH值下进行。HIC材料的筛选方法可以牵涉在相对高盐条件下将非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质的混合物施加于HIC材料，然后对该材料施加递减的盐梯度，并且监测洗脱液中非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化的外观。色谱材料和条件可以通过用UV色谱法分析洗脱液和提供色谱图中峰的良好分离的材料和条件来评估结合的选择性。
PEG
聚(乙二醇)或PEG是中性的亲水性聚醚。在本文中术语“分子量”(以kDa计)应理解为PEG的平均分子量，因为未得到具有限定的分子量、而实际上具有分子量分布的作为聚合物化合物的PEG；术语“约”表示某些PEG分子或残基会重一些，而某些分子量低于所示分子量，即术语“约”在本文上下文中指分子量分布，其中95％的PEG分子具有的分子量在指示+/-10％的范围内的分子量。例如，分子量为30kDa可以表示27kDa-33kDa的范围。
PEG残基可以包含结合反应所必不可少的其他化学基团，该化学基团是由聚乙二醇化分子的化学合成产生的，或者是分子部分最佳距离的间隔基。这些其他化学基团不用于计算PEG残基的分子量。另外，这种PEG残基可以由一个或多个彼此共价连接在的PEG链组成。具有多于一个PEG链的PEG残基称为多臂或支链PEG残基。例如，可以通过将聚氧化乙烯加入各种多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)中来制备支链PEG残基。例如，EP 0 473084、US 5,932,462中报道了支链PEG残基。
用于聚乙二醇化反应的PEG分子和聚乙二醇化蛋白质上的PEG残基可以各自具有至少约12kDa或至少约20kDa、约20kDa-40kDa或约30kDa的分子量。PEG残基可以具有20kDa-35kDa的分子量，并且为直链PEG残基。PEG残基可以具有35kDa-40kDa的分子量，并且为支链PEG残基。
单-聚乙二醇化EPO可以包含具有至少约12kDa或至少约20kDa、约20kDa-40kDa、约20kDa或约30kDa分子量的单一PEG残基。PEG残基可以具有至少约20kDa的分子量。
单-聚乙二醇化蛋白质为蛋白质包含单一PEG残基。即单-聚乙二醇化蛋白质仅具有一个PEG残基。寡-聚乙二醇化蛋白质包含至少两个PEG残基。例如，寡-聚乙二醇化蛋白质可以是二-、三-或四-聚乙二醇化蛋白质。术语寡-聚乙二醇化蛋白质(或多-聚乙二醇化蛋白质)可以指具有不同程度的聚乙二醇化(两个、三个或多个PEG残基)的寡-聚乙二醇化蛋白质分子的组。术语聚乙二醇化蛋白质是指单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质。术语聚乙二醇化蛋白质可以指由单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质组成的蛋白质。非-聚乙二醇化蛋白质为不含任何PEG残基的蛋白质。非-聚乙二醇化蛋白质在上下文的聚乙二醇化反应中也可以称作未反应的蛋白质。非-聚乙二醇化蛋白质可以称作天然蛋白质或未-聚乙二醇化蛋白质或游离蛋白质。
术语“聚乙二醇化”是指PEG残基与蛋白质的共价连接。特别地，它可以指在多肽的N-末端和/或内部赖氨酸残基上的共价键。蛋白质的聚乙二醇化在现有技术中是众所周知的，并且，例如，综述在Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417中。可以使用不同的官能团和具有不同分子量的聚乙二醇、线性和支链PEG以及不同的连接基来连接PEG(另外参见Francis，G.E.等人Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado，C.等人Crit.Rev.Ther.Drug Carrier 30 Systems 9(1992)249-304)。例如WO 00/44785中所述，用聚乙二醇化试剂在水溶液中，在一个实施方案中，通过使用NHS-活化的具有5kDa-40kDa的分子量的直链或支链PEG分子进行红细胞生成素的聚乙二醇化。根据Lu，Y.等人ReactivePolymers 22(1994)221-229，也可以在固相上进行聚乙二醇化。并非随机地，也可以根据WO94/01451生产N末端的聚乙二醇化多肽。聚乙二醇化反应也综述在WO 2009/010270和WO2012/035037中。
适合的PEG衍生物为活化的PEG分子，其具有约5-约40kDa或约20-约40kDa的平均分子量。在一个实施方案中，PEG衍生物为直链或支链PEG。各种PEG衍生物适用于制备PEG-蛋白质，并且PEG-肽缀合物可以得自Shearwater Polymers(Huntsville，AL，U.S.A.；www.nektar.com)。活化的PEG衍生物为本领域公知的且描述在例如Morpurgo，M.等人J.Bioconjug.Chem.7(1996)363-368中。
聚乙二醇化反应可以在约6.5-9.5、约7.0-9.0或约7.5-8.5或约8.0的pH下进行。进行聚乙二醇化反应时的pH可以取决于所用的PEG试剂。PEG试剂可以为mPEG-NHS、mPEG-SPA、mPEG-SVA或mPEG-CI。聚乙二醇化反应可以在约7.0-9.0或约7.5-8.5或约8.0的pH下使用(NHS)活化的PEG试剂进行。聚乙二醇化反应可以在约15-25℃或约18-22℃或约20℃下进行。聚乙二醇化反应可以进行至少约20、30、40、50或60分钟或约30-90或30-60分钟或约40、50或60分钟。
聚乙二醇化反应可以在包含盐和缓冲液的溶液中进行。所述盐可以为Na2SO4，且所述缓冲液可以为N，N-二(羟乙基)甘氨酸。所述盐可以以5-10mM或约7.5mM的量存在，所述缓冲液可以以约10-50mM、20-30mM或约25mM的量存在。聚乙二醇化反应可以在7.5mM Na2SO4和25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸中进行。
EPO
术语“红细胞生成素”及其缩写“EPO”是指具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质或与其基本同源的蛋白质或多肽，其生物学特性与刺激血红细胞生成和刺激骨髓中定型红系先祖细胞的分裂和分化相关。重组的红细胞生成素可以通过重组DNA技术或内源基因活化在真核细胞例如CHO细胞、BHK细胞或HeLa细胞中表达而制备，即通过内源基因活化表达红细胞生成素糖蛋白，参见，例如，US 5,733,761、US 5,641,670、US 5,733,746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667和WO 91/09955。EPO可以为人EPO。EPO可以为糖基化EPO。
人EPO可以具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。人EPO可以具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。术语“EPO”也表示具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的蛋白质的变体，其中一个或多个氨基酸残基已被改变、缺失或插入，并且具有与未修饰的蛋白质相差无几的生物学活性，例如在EP 1 064 951或US 6,583,272中报道的。改变、缺失或插入的氨基酸数量可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1-50、1-40、1-30、1-20或1-10。术语EPO表示包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其变体。变体可以具有人红细胞生成素的氨基酸序列，具有1-6个额外的糖基化位点。聚乙二醇化红细胞生成素的比活可以通过本领域已知的各种测定法来确定。纯化的聚乙二醇化红细胞生成素的生物学活性使得与未注射或对照组受试者相比，通过注入人体患者的蛋白质施用导致骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞的产生。根据本文报道的方法获得和纯化的聚乙二醇化红细胞生成素的生物活性可以通过根据Bristow，A，PharmeuropaSpec.Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2(1997)31-48的方法进行测试。
EPO的氨基酸序列变体可以将适当的修饰导入编码EPO的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，从红细胞生成素的氨基酸序列中的残基的缺失和/或其中的插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合，以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有与人EPO相差无几的生物学活性。
保守氨基酸取代显示在下表中“优选取代”的标题下。在“示例性取代”的标题下提供了更实质性的变化，并且如以下参考氨基酸侧链类别所述。可以将氨基酸取代导入人红细胞生成素中，并筛选以保留人红细胞生成素的生物学活性的产物。
非保守取代需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。
EPO可以为变体EPO。EPO可以包含在与另一种蛋白质的融合蛋白中，或可以除PEG外还可以与另一个部分缀合。
红细胞生成素的化学聚乙二醇化产生包含红细胞生成素的蛋白质制剂，所述红细胞生成素在赖氨酸残基的一个或多个ε-氨基上和/或在N-末端氨基上被聚乙二醇化。在N-末端氨基上的选择性聚乙二醇化可以根据Felix(1997)进行。可以在固相合成期间通过使Nα-聚乙二醇化氨基酸衍生物与肽链的N-1末端氨基酸偶联进行选择性N-末端聚乙二醇化。侧链聚乙二醇化可以在固相合成期间通过使Nε-聚乙二醇化赖氨酸衍生物与生长链偶联进行。合并的N-末端和侧链聚乙二醇化如上所述在固相合成期间或通过溶液相合成，通过将活化的PEG试剂施加于氨基脱保护的肽为切实可行的。
Figure BDA0002637417760000631
Figure BDA0002637417760000641
氨基酸可以根据常见的侧链特性分类：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非-保守取代将需要将这些类别之一中的一个成员交换为另一个类别。
蛋白质
本发明的方法尤其适合于生产单-聚乙二醇化EPO组合物。涉及的蛋白质或本文关注的蛋白质可以指EPO。
本发明的方法可以为适合于生产其他蛋白质的单-聚乙二醇化组合物，特别是治疗蛋白。例如，白细胞介素-2(IL-2)、培干扰素α-2a、人生长激素(hGH)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨形态发生蛋白7(BMP-7)、骨形态发生蛋白15(BMP-15)、神经营养因子-3(NT-3)、yon Willebrand因子(vWF)蛋白酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(IPA)、瘦素、水蛭素、尿激酶、人Dnase、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、嵌合白喉毒素-IL-2、人绒毛膜促性激素(hCG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、酸性a-葡萄糖苷酶(酸性麦芽糖酶)、抗凝血酶III(AT III)、滤泡刺激激素(FSH)、类高血糖素肽-I(GLP-1)、类高血糖素肽-2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)、成纤维细胞生长因子21(FGF-21)、成纤维细胞生长因子23(FGF-23)、因子X、因子XIII、prokinetisin、extendin-4、CD4、肿瘤坏死因子受体(TNF-R)、a-CD20、P-选择蛋白糖蛋白配体-I(PSGL-I)、补体、转铁蛋白、糖基化依赖性细胞粘附分子(GlyCAM)、神经细胞粘附分子(N-CAM)、INF受体-IgG Fe区融合蛋白。这类蛋白质还包括抗体，例如针对如下任一种的单克隆抗体：呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒蛋白质F、INF-a、糖蛋白IIb/IIIa、CD20、VEGF-A、PSGL-1、CD4、a-CD3、EGF、癌胚抗原(CEA)、TNFα和IL-2受体。
本发明的方法可以为适合于生产蛋白质例如激素、细胞因子或酶的单-聚乙二醇化组合物。这类蛋白质可以为红细胞生成素。所述蛋白质可以为干扰素α-2a或干扰素-α-2b。所述蛋白质可以为粒细胞集落刺激因子、人生长激素或尿酸氧化酶。
本发明对于具有相对短的半衰期的治疗蛋白特别有用，因为聚乙二醇化增加体内循环半衰期。通常，激素和细胞因子具有相对较短的半衰期。较小的生物分子倾向于具有相对较短的半衰期。相对较小的生物分子的药代动力学特性可以通过聚乙二醇化而改善，且由此本发明对于相对较小的治疗蛋白也可能特别有用。通常，小于约70kDa的蛋白质和多肽比比较大的蛋白质更容易被肾脏消除。较小的生物分子或蛋白质可以定义为分子量小于约70kDa的生物分子或蛋白质。红细胞生成素具有约为37kDa的分子量。本发明可用于具有分子量低于约70kDa(在其非-聚乙二醇化形式中)的治疗蛋白。本发明可用于具有分子量低于约70kDa、60kDa、50kDa或40kDa或具有约10-70kDa、20-60kDa、20-50kDa或30-40kDa分子量的治疗蛋白。本发明具有低于约70kDa、60kDa、50kDa或40kDa分子量或40kDa或具有约10-70kDa、20-60kDa、20-50kDa或30-40kDa分子量的激素或细胞因子。
蛋白质可以为抗体。抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可以是具有生物学功能的抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、单-结构域抗体(sdAb或dAB)、互补决定区片段、线性抗体、单链抗体分子、小抗体、双体和由抗体片段形成的多特异性抗体。许多抗体片段在体内具有相对较短的半衰期，这是由于其相对较小的尺寸并且不再具有Fc区导致。本发明特别适用于具有相对较小尺寸的抗体片段，例如单-结构域抗体、Fabs、Fab’s和scFv。本发明可用于具有低于约70kDa、60kDa、50kDa或40kDa的分子量或具有约10-70kDa、20-60kDa、20-50kDa或30-40kDa的分子量的抗体片段。
可以将单-聚乙二醇化蛋白质组合物配制为药物组合物。可以用一种或多种药学上可接受的赋形剂配制，和/或可以用生理学可接受的缓冲液例如生理盐水配制通过本文公开的方法生产的单-聚乙二醇化蛋白质组合物。可以除去HIC步骤的用于平衡的盐和/或缓冲液、洗涤或洗脱缓冲液，然后将单-聚乙二醇化蛋白质组合物配制为药物组合物。例如，可以透析单-聚乙二醇化蛋白质组合物。可以冻干单-聚乙二醇化蛋白质组合物的单-聚乙二醇化蛋白质。可以分离单-聚乙二醇化蛋白质组合物的单-聚乙二醇化蛋白质，并且重新配制在药物组合物中。
本文公开的方法可以为工业化规模的方法。工业化规模的方法可以为生产至少约5g、10g、25g、50g、100g、250g或500g/批次或/循环的方法。在本文上下文中的批次或循环可以为包含如本文所公开的所有步骤a)-c)的方法。工业化规模方法可以为这样的方法，其中经历AEC步骤的第一混合物(包含非-聚乙二醇化、单-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化蛋白质)的体积为至少100L、500L、1000L、5000L、10000L、50000L或100000L。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这种组合。
在上述描述中或在如下权利要求中或在附图中公开的特征，可以以它们的特定形式或用于实施所公开的功能的手段，或者适当地获得所公开的结果的方法或过程来表示，其可以单独地或以这些特征的任何组合可以用于以其各种形式来实现本发明。
尽管已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是在给出本公开的情况下，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，以上阐述的本发明的示例性实施方案被视为示例性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种改变。
为了避免任何疑问，提供本文提供的任何理论解释是为了提高读者的理解。发明人不希望受到任何这些理论解释的束缚。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图通过实施例的方式示例本发明的方面和实施方案。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施方案将是显而易见的。正文中提及的所有对比文件均通过引用并入本文正文。
在本说明书的上下文中，包括所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和“包括”以及变型例如“含有”，“包含”和“包括”将被理解为意味着包含所述的整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。
必须注意，如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一实施方案。相对于数值的术语“约”为任选的，例如，+/-10％。
上述举出的所有参考文献通过引用并入本文。
实施例
下列实施例、包括所进行的实验和获得的结果仅出于示例性目的而提供，而不应解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所享有的等同方案的全部范围。
实施例1
使用NHS-活化的PEG试剂(分子量约为30kDa)在pH 8.0在25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和7.5mM Na2SO4中使EPO聚乙二醇化，得到反应产物混合物(“第一混合物”)，其包含非-聚乙二醇化EPO、单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO。
使第一混合物在pH 8.0、25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、7.5mM Na2SO4经历AEC。AEC树脂为Toyopearl SuperQ 650M。其具有约34g/L的EPO的动态结合容量。通过在pH 8下分步洗脱至25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、35mM硫酸钠进行洗脱。将通过洗脱回收的非聚乙二醇化EPO回收到随后的聚乙二醇化反应中，其产物(随后的“第一混合物”)经历第二次AEC步骤。再次重复该过程，使得该过程包括三个循环的聚乙二醇化和AEC步骤。
显示AEC步骤中的蛋白质洗脱的色谱图如图4中所示。显示三个AEC步骤的色谱图如图5中所示，这表明第二个循环中的EPO量小于第一个，且第三个循环中的EPO量小于第二个。
表1显示各种中间体组合物的含量。聚乙二醇化产物为“第一混合物”，产物汇集物为AEC流通溶液，而epo汇集物为AEC洗脱液。
表1
Figure BDA0002637417760000691
然后在结合和洗脱模式以及流通模式下研究了HIC从寡-聚乙二醇化EPO中分离单-聚乙二醇化EPO的能力。
在结合和洗脱模式下，HIC树脂为Toyopearl Phenyl-650M。用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和500mM Na2SO4在pH 8.0平衡该树脂。出于测试目的，将该混合物施加于包含非-聚乙二醇化EPO、单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO的树脂。用pH 8.0的25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和500mM Na2SO4调节该混合物，并施加于HIC树脂。应用从500mM到0mMNa2SO4的降低盐浓度的洗脱梯度。图6是色谱图，其显示EPO处于流通中，并且单-聚乙二醇化EPO以较高盐浓度下洗脱，而寡-聚乙二醇化EPO以较低盐浓度下洗脱。
在流通模式下，HIC树脂为Toyopearl Phenyl-650M。用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和390mM Na2SO4在pH 8.0平衡该树脂。将该混合物施加于包含单-聚乙二醇化EPO和寡-聚乙二醇化EPO的树脂，它不包含大量的非-聚乙二醇化EPO，且由此为本发明“第二混合物”的代表。用N，N-二(羟乙基)甘氨酸和Na2SO4在pH 8.0调节混合物，并且施加于HIC树脂。将盐浓度调节至390mM。图7为显示单-聚二醇化EPO处于流通中的色谱图。使用降低的盐梯度洗脱寡-聚乙二醇化EPO。
实施例2
EPO的聚乙二醇化
将EPO储备溶液解冻，使用3kDa Centricon离心过滤器浓缩至6.5g/l，并在pH 8的25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸中缓冲，然后将7.7ml的该溶液转移至50ml Falcon管，并与0.3ml 25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸pH 8缓冲液混合。称重96mg的PEG试剂，并溶于3ml的1mM HCl中以制备聚乙二醇化溶液。
通过向EPO溶液中加入2ml聚乙二醇化溶液(分子量约为30kDa)启动聚乙二醇化反应。该反应在20℃的水浴中进行50分钟。
环状聚乙二醇化和使用离子色谱法的纯化
作为第一步，如上所述制备了聚乙二醇化EPO。将1ml的聚乙二醇化EPO溶液转移到Eppendorf杯中，然后使用50ml注射器将剩余的9ml注入150ml Superloop中，并启动阴离子交换色谱法。
将直径为1cm的16ml Toyopearl SuperQ-650M用作阴离子交换色谱柱。该柱用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、7.5mM Na2SO4、pH 8缓冲液平衡。通过在pH 8下对25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、35mM硫酸钠的洗脱步骤进行洗脱。相应的色谱图如图8A中所示。
除去1ml的级分1B3，并通过HPLC测量其组成。随后，将级分1B3-1C1合并，并且还通过RPHPLC测量该混合级分的1ml样品的组成。用光度法测定蛋白质浓度，并且消光系数为1.25时为0.097g/l。该混合级分(AEC洗脱液)来自洗脱步骤。
将剩余的21ml混合级分转移到50ml Falcon管中，并置于20℃水浴中以重新进行聚乙二醇化。加入1ml 26.89g/l聚乙二醇化试剂溶液，并启动第二次聚乙二醇化反应。
AEC洗脱液(EPO-级分)的条件(35mM硫酸钠)与上述第一次色谱法的洗脱缓冲液相同。50min后，用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液将反应溶液稀释4.66倍，且由此调节至平衡条件。将所得的97.9ml样品再次注入150ml Superloop中，并启动第二次色谱法。仅在较大的样品体积方面改变色谱法。所有其他参数和成分保持不变。相应的色谱图如图8B中所示。
再次汇集级分2A3-2A5并且重复上述方法作为第三个循环。
合并第三次色谱的级分1A1-1C5，并且使用3kDa Centricon离心过滤器浓缩。通过RP HPLC测定级分2A1-2A3的浓缩物和汇集物。相应的色谱图如图8C中所示。
表2列出了所有移液的聚乙二醇化反应体积和稀释步骤。
表2-起始成分和样品的体积
Figure BDA0002637417760000711
结果和讨论
RP HPLC分析的测量结果如表3中所示。循环的聚乙二醇化EPO汇集物中EPO的质量百分比平均约为95％。
表3-聚乙二醇化反应和色谱分离前后的组成
Figure BDA0002637417760000722
表4中列出了每个循环以及整个过程的质量平衡。应当注意，有关于产物汇集物的信息不是基于测量值，而是计算。
表4-质量平衡
Figure BDA0002637417760000721
Figure BDA0002637417760000731
在该过程结束时，所有样品的收率均为95.5％。由于采样和分析，测定总蛋白质损耗为4.5％。EPO汇集物1和EPO汇集物2在聚乙二醇化2和3中消耗。63.6％的初始EPO被转化成单-PEG-EPO。中间体汇集物中单-PEG-EPO含量为82.0％。
基于质量平衡，可以观察到，使用的50mg未聚乙二醇化EPO可以制备32.5mg单-聚乙二醇化EPO，它以1.4％Epo、82.0％的单-PEG Epo和16.6％的寡-形式的混合物形式存在。因此，AEC步骤产生包含82％的单-聚乙二醇化EPO(82％纯度)的溶液。
单-PEG-EPO的反应收率为63.6％。即，在该方法开始时的EPO蛋白质量(50mg)中63.6％转化成单-聚乙二醇化EPO(32.5mg)。与WO 2009/010270的现有技术方法相比，其中聚乙二醇化反应仅进行一次，收率约为44％，这相当于收率提高约44％。
由于本实验中的技术原因，不可能在第二次聚乙二醇化反应之后从AEC上的流通中除去所有EPO。因此，第二次反应的所得组成不同于预期值。聚乙二醇化1和3递送约50％的EPO、40％的单PEG-EPO和＜10％的寡-PEG-EPO。第二次聚乙二醇化反应的有效性较低，仅产生33％的单-PEG EPO和5％的寡-PEG-EPO。
这些结果表明，AEC可以从聚乙二醇化反应混合物中分离和回收未反应的EPO，而无需过多的聚乙二醇化形式。回收的EPO级分中聚乙二醇化形式的总和约为5％-这可能是由于在该特定实验中使用的AEC色谱柱尺寸过大所致这一事实。当尺寸合适时，由于位移效应或对配体的竞争，预期聚乙二醇化种类的容量会下降。
这些结果还表明，在循环1和循环3中，可以通过应用阴离子交换色谱法几乎定量地除去EPO。中间产物以流通的方式通过柱，并且通常具有约80％的单-PEG-EPO和20％的寡-PEG-EPO的组成。
实施例3
环状聚乙二醇化、通过AEC色谱法除去红细胞生成素和通过HIC纯化单-PEG EPO
本实验的目的在于在3个循环内将EPO聚乙二醇化，并使用阴离子交换色谱法(AEC)和HIC分离出反应产物(非-聚乙二醇化EPO、单一聚乙二醇化EPO(单-PEG EPO)和EPO的寡-聚乙二醇化形式)。
为了在AEC阶段除去EPO，使用来自Tosoh Bioscience的Toyopearl SuperQ-650M作为吸附剂。这是一种强阴离子交换剂。为了在HIC阶段从寡形式中分离单PEG EPO，使用来自Tosoh Bioscience的Toyopearl Phenyl-650M。
AEC柱的设计
用Toyopearl SuperQ-650M吸附材料填充内径为7mm且床高为100mm的色谱柱，并以200cm/h(1.28ml/min)的流速操作，导致在柱体积为3.847ml时方法步骤时间约30min。
环状聚乙二醇化和AEC
使用具有在25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、7.5mM Na2SO4中12.5g/l浓度的EPO储备溶液。使用起始体积为18ml的该储备溶液，相当于225mg EPO。
对于第一次聚乙二醇化反应，将18ml EPO储备溶液与22.5ml 25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、7.5mM Na2SO4混合，并且放入50ml Falcon管。
将328mg PEG试剂(分子量约为30kDa)称重入15ml Falcon管并且溶于4.97ml的1mM HCl。
为了启动反应，将4.5ml PEG试剂溶液移液入40.5ml EPO溶液。
以300rpm混合该反应混合物，并且通过低温恒温器将温度调整至20℃。
反应进行60min。然后在280nm处以光度法测量浓度并取250μl样品。浓度为5.56g/l。由剩余溶液测量电导率。其为2.19mS/cm，因此未对AEX色谱法(2.21mS/cm)平衡条件进行调节。剩余的44.8ml溶液通过AEC纯化。用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、7.5mM Na2SO4、pH 8对其进行平衡。
用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、35mM Na2SO4逐步进行洗脱。将级分1B1-1B4彼此合并构成16.5ml，且下文称作EPO汇集物1。以光度法测定EPO收集物1的浓度为5.263g/l。取200μl样品。
合并级分1A1-1A5构成62.17ml，且下文称作产物汇集物1。其浓度为2.27g/l。取500μl样品。
将剩余体积的EPO汇集物1转移至50ml Falcon管中以进行第二次聚乙二醇化。称重164.73mg PEG试剂，并溶于2.4ml的1mM HCl中。将1.62ml该溶液加入到EPO汇集物1中，并开始第二次聚乙二醇化反应。该反应再次在20℃下进行60min。然后测量浓度，取250μl样品。浓度为4.73g/l。
使用22ml的25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸pH 8缓冲液将剩余溶液的电导率调整为2.1mS/cm，并通过色谱法纯化。
将第二次色谱的级分1B2-1B4合并构成EPO收集物2。体积为15ml。取500μl样品。浓度测量得到2.5g/l的浓度。
合并级分1A1-1A5与62.7ml产物汇集物2。取2ml样品。浓度为0.75g/l。
将剩余体积的EPO汇集物2转移至50ml Falcon管中。称重119.4mg的PEG试剂，并用1.9ml的1mM HCl溶解。将1.72ml的该溶液添加到EPO汇集物2中，并开始第三次聚乙二醇化反应。再次在20℃下进行。在60min的反应时间后，测定浓度并取500μl样品。浓度为2.8g/l。
通过25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液再次调节反应产物至平衡条件，并且通过色谱法纯化。
合并级分1C2-1C5构成15ml EPO汇集物3。从其中取4ml样品。浓度为0.429g/l。
合并级分1A1-1C1得到160.5ml产物汇集物3。浓度为0.15g/l。取10ml样品。
使用HIC纯化单-PEG EPO
使用具有10mm内径的220mm高的柱。所使用的吸附剂为来自Tosoh的ToyopearlPhenyl-650M。柱体积为17.27ml。它以150cm/h的流速运行。该柱用于从单-PEG EPO和寡-PEG EPO的混合物中提取目标产物单-PEG EPO。
为此目的，进行两次实验。首先，使单-PEG EPO和寡-PEG EPO与柱材料结合，且然后通过梯度选择性洗脱。在第二次中，使寡-PEG EPO形式与柱材料结合，而单-PEG EPO没有。
HIC结合和洗脱模式中的分离
从上述产物汇集物1(本文公开的方法的“第二混合物”；蛋白质浓度为2.27g/l)中取出15ml，并20ml 25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、1M Na2SO4、pH 8溶液将其电导率调节至56mS/cm。该样品通过150ml Superloop完全分配。
为了平衡Phenyl-650M柱，使用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、500mM Na2SO4、pH 8缓冲液。在15CV内使用500mM Na2SO4-0mM Na2SO4的梯度进行洗脱。相应的色谱图如图9中所示。
各自汇集级分1A1-1B1、1B5-2A3和2A4-2B4并且通过RP-HPLC分析其组成。
HIC流通模式中的分离
使用完整的62.7ml产物汇集物2(根据本文公开的方法的“第二混合物”)作为分离样品，相当于蛋白质水平为47.03mg，由0.58％EPO、79.9％的单-PEG EPO和19.52％的寡-PEG EPO形式。通过25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、1M Na2SO4、pH 8缓冲液将样品的电导率调整至50mS/cm的目标电导率，并通过150ml Superloop注射。
用25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸、390mM Na2SO4平衡HIC树脂。洗脱以390mMNa2SO4-0mM Na2SO4的梯度进行。相应的色谱图如图10所示。
实际上，样品被无意地调整至56mS/cm(而不是目标50mS/cm)。因此，在图10中可以观察到逐步突破曲线。最初，只有EPO处于流通中。约80ml后，由于单PEG-EPO的突破，UV信号升至约120mAU。当电导率在从负载到负载后平衡过渡时降低时，洗脱较早结合的单PEG-EPO的峰。寡-PEG-EPO形式按以下梯度洗脱。然而，已经显示了单-PEG-EPO与寡聚-PEG-EPO的分离。如果未反应的EPO水平高于产品质量标准的目标值，则流通模式不适合。
结果和讨论
环状聚乙二醇化和AEC
表5显示各个样品的组成以及蛋白质量的平衡。
表5-方法中各个样品的组成、质量和体积
Figure BDA0002637417760000781
AEC上的第一个循环被无意地超载。因此，本实验中未反应的EPO的收率仅约为78％。由于色谱柱已被EPO超载，因此洗脱汇集物中不存在聚乙二醇化形式。这证实了AEC色谱柱的适当的尺寸会降低AEC洗脱汇集物中聚乙二醇化形式的含量，且由此使中间体汇集物中聚乙二醇化形式的收率最大化。AEC在聚乙二醇化2和3未完全加载EPO后运行，且由此洗脱汇集物中存在少量的聚乙二醇化EPO，在两种情况下均＜2％。
聚乙二醇化1和2的结果表明反应结果的一致性。在所选条件下，结果为约50％的EPO、40％的单-PEG-EPO和＜10％的寡-PEG-EPO。
作为最终聚乙二醇化的聚乙二醇化3使用不同条件以有利于可能的最大单-PEG-EPO含量形成。46％的单-PEG-EPO含量效果良好。
每个中间产物汇集物的组成是不同的。第一流通操作的汇集物由约10％EPO(归因于上述举出的突破)、72％的单-PEG-EPO和16％的寡-PEG EPO组成。如果没有EPO的突破，其组成将与试验2相同(80％的单-PEG-EPO和20％的寡-PEG-EPO)。第三次运行采用不同的聚乙二醇化条件，导致反应混合物中更高的寡-PEG-EPO含量。这转化为59％的单-PEG-EPO和41％寡聚Peg EPO的汇集物组成。
经过3个循环的“聚乙二醇化反应+通过AEC回收EPO”后，中间体汇集物中单-PEG-EPO的总收率为68.4％。这已经优于原始方法＞50％，但如果在首次AEC运行的流通加载过程中没有大量EPO损耗，则甚至可能会更好。
通过HIC纯化单-PEG EPO-结合和洗脱模式中的分离
表5显示RP HPLC分析结果。
表5-结合和洗脱模式中HIC汇集物的RP-HPLC分析数据
Figure BDA0002637417760000791
来自包含EPO的AEC运行1中的中间体汇集物的应用用于通过疏水作用色谱法进行最终纯化步骤。EPO和单PEG-EPO汇集物均为100％纯。在寡聚PEG-EPO汇集物中仍然可以找到少量的单PEG-EPO。
通过HIC纯化单-PEG EPO-流通模式中的分离
由于各个级分的蛋白质浓度低，因此无法通过RP HPLC产生有意义的结果。然而，该色谱图表明，实现了单-聚二醇化EPO与非-聚乙二醇化和寡-聚乙二醇化形式的分离。
参考文献
上面引用了许多出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的技术水平。下面提供了这些参考文献的完整引用。这些参考文献中的每一个的全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
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下列编号的陈述涉及本公开的方面并且构成本说明书的组成部分。
1.用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该方法包含：
a)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的第一混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；
b)使第一混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物增加；IEC步骤包含
将第一混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；
c)收集来自步骤b)的IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的第二混合物；并且
d)使第二混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第二混合物增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
2.根据陈述1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。
3.根据陈述1或陈述2的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。
4.根据上述陈述任一项的方法，其中IEC步骤为AEC步骤。
5.用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素，该方法包含：
e)提供包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的第一混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；
f)使第一混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质级分相对于第一混合物增加；AEC步骤包含
将第一混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于AEC材料；
g)收集来自步骤b)的AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的第二混合物；并且
h)使第二混合物经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质级分相对于第二混合物增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
6.根据上述陈述任一项的方法，其中IEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。
7.根据陈述4-6任一项的方法，其中AEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。
8.根据上述陈述任一项的方法，其中：
i.第一混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或
ii.IEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质；和/或
iii.单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。
9.根据上述陈述任一项的方法，其中：
i.第一混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或
ii.AEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质；和/或
iii.单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。
10.根据上述陈述任一项的方法，其中步骤a)还包含进行聚乙二醇化反应，其包含使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应。
11.根据陈述10的方法，其中聚乙二醇化反应在约7.0-9.0的pH下进行，并且，其中PEG/蛋白质的摩尔比约为0.6-1.0。
12.根据陈述10或11的方法，其包含
进行包含步骤a)、b)和c)的第一个循环，其中步骤b)还包含从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到IEC洗脱液，并且
进行步骤a)、b)和c)的第二个循环，其中将第一个循环的步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至步骤a)的聚乙二醇化反应中。
13.根据陈述10或11的方法，其中IEC步骤为AEC步骤，该方法包含
进行包含步骤a)、b)和c)的第一个循环，其中步骤b)还包含从HIC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到AEC洗脱液，并且
进行步骤a)、b)和c)的第二个循环，其中将第一个循环的步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至步骤a)的聚乙二醇化反应中。
14.根据陈述12的方法，其中从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。
15.根据陈述13的方法，其中从HIC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。
16.根据陈述12-15任一项的方法，其中该方法包含三、四或五个循环，并且，其中每个循环的步骤b)包含从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到IEC洗脱液，并且，其中将步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。
17.根据陈述12-15任一项的方法，其中IEC步骤为AEC步骤，并且，其中该方法包含三、四或五个循环，并且，其中每个循环的步骤b)包含从AEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质，得到AEC洗脱液，并且，其中将步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。
18.根据陈述12-17任一项的方法，其中将来自循环的步骤b)的IEC洗脱液直接添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。
19.根据陈述12-17任一项的方法，其中IEC步骤为AEC步骤，并且，其中将来自循环的步骤b)的AEC洗脱液直接添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中。
20.根据陈述12-17任一项的方法，其中将循环的步骤b)中洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中，并且，其中还将新鲜的非-聚乙二醇化蛋白质添加至步骤a)，以便维持每个循环的步骤a)中基本上恒定的聚乙二醇化反应条件。
21.根据上述陈述任一项的方法，包含进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中
步骤c)还包含汇集收集自每个IEC步骤的流通溶液，得到第二混合物，其为汇集的第二混合物，并且其中
步骤d)包含使第二混合物经历HIC步骤。
22.根据上述陈述任一项的方法，包含进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中
步骤c)还包含汇集收集自每个AEC步骤的流通溶液，得到第二混合物，其为汇集的第二混合物，并且其中
步骤d)包含使第二混合物经历HIC步骤。
23.根据上述陈述任一项的方法，其中IEC步骤为AEC步骤，并且，其中
i.AEC材料为Toyopearl Super Q 650M；和/或
ii.在约7.0-9.0的pH下进行AEC步骤；和/或
iii.在约1.0-3.0mS/cm的电导率下进行AEC步骤；和/或
iv.将第一混合物施加于作为包含约10-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约1-10mMNa2SO4的AEC负载溶液的AEC材料。
24.根据上述陈述任一项的方法，其中步骤d)包含使第二混合物以流通模式经历HIC步骤，得到HIC流通溶液，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对第二混合物于增加，
HIC步骤包含将第二混合物在适合于结合寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于HIC材料，其中HIC流通提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。
25.根据陈述1-23任一项的方法，其中步骤d)包含使第二混合物以结合和洗脱模式经历HIC步骤，得到HIC洗脱液，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对第二混合物于增加，所述的HIC步骤包含
将第二混合物在适合于结合单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于HIC材料，
从HIC材料中洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到HIC洗脱液，其中HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质。
26.根据陈述24的方法，其中
i.HIC材料为Toyopearl Phenyl 650M；和/或
ii.HIC步骤在约7.0-9.0的pH下进行；和/或
iii.在约30-40mS/cm的电导率下进行HIC步骤；和/或
iv.将第二混合物施加于作为包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约500mMNa2SO4的HIC负载溶液的HIC材料。
27.根据陈述25的方法，其中
i.HIC材料为Toyopearl Phenyl 650M；和/或
ii.在约7.0-9.0的pH下进行HIC步骤；和/或
iii.从HIC材料中洗脱单-聚乙二醇化蛋白质的步骤包含施加约50mS/cm-0mS/cm的梯度；和/或
iv.将第二混合物施加于作为包含约25mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约500mMNa2SO4的HIC负载溶液的HIC材料。
28.根据上述陈述任一项的方法，其中
i.在基本上相同pH下进行IEC步骤和HIC步骤；或
ii.在基本上相同pH下进行聚乙二醇化反应、IEC步骤和HIC步骤。
29.根据上述陈述任一项的方法，其中
i.在基本上相同pH下进行IEC步骤和HIC步骤；或
ii.在基本上相同pH下进行聚乙二醇化反应、AEC步骤和HIC步骤。
30.根据上述陈述任一项的方法，其中单-聚乙二醇化蛋白质包含具有至少约20kDa的分子量的PEG残基。
31.根据上述陈述任一项的方法，还包含用药学上可接受的载体配制所述蛋白质组合物，得到药物组合物。
32.用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：
a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；
b)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；
IEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；并且
c)收集来自步骤b)的IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，
其中进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。
33.根据陈述32的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。
34.根据陈述32或33的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。
35.根据陈述32-34任一项的方法，其中IEC步骤为阴离子交换色谱(AEC)步骤。
36.用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素，该方法包含：
a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物的混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；
b)使反应产物的混合物经历阴离子交换色谱(AEC)步骤，得到AEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；
AEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于AEC材料；并且
c)收集来自步骤b)的AEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，
其中进行两个或多个步骤a)、b)和c)的循环，其中通过从AEC材料中洗脱AEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。
37.根据陈述32-36任一项的方法，其中反应产物的混合物包含至少约20％的非-聚乙二醇化蛋白质。
38.根据陈述32-37任一项的方法，其中该方法包含三、四或五个循环，其中在每个循环的步骤b)中，回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于下一个循环中的步骤a)的聚乙二醇化反应。
39.根据陈述32-38任一项的方法，其中步骤c)还包含汇集收集自每个IEC步骤的流通溶液，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。
40.根据陈述35-39任一项的方法，其中步骤c)还包含汇集收集自每个AEC步骤的流通溶液，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。
41.根据陈述32-40任一项的方法，其中从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。
42.根据陈述35-40任一项的方法，其中从AEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。
43.根据陈述32-42任一项的方法，其中将循环的IEC洗脱液直接添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。
44.根据陈述35-42任一项的方法，其中将循环的AEC洗脱液直接添加至下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应。
45.根据陈述32-44任一项的方法，其中回收非-聚乙二醇化蛋白质并且在下一个循环的步骤a)的聚乙二醇化反应中使用，并且，其中还将新鲜的非-聚乙二醇化蛋白质添加至步骤a)，以便维持每个循环的步骤a)中的基本上恒定的聚乙二醇化反应条件。
46.根据陈述32-45任一项的方法，其中IEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。
47.根据陈述35-45任一项的方法，其中AEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。
48.根据陈述32-47任一项的方法，其中：
i.反应产物的混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或
ii.IEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质。
49.根据陈述35-47任一项的方法，其中：
i.反应产物的混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或
ii.AEC流通溶液包含至少90％聚乙二醇化蛋白质。
50.根据陈述35-49任一项的方法，其中
i.AEC材料为Toyopearl Super Q 650M；和/或
ii.AEC步骤在约7.0-9.0的pH下进行；和/或
iii.AEC步骤在约1.0-3.0mS/cm的电导率下进行；和/或
iv.将反应产物的混合物施加于作为包含约10-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约1-10mM Na2SO4的AEC负载溶液的AEC材料。
51.根据陈述50的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。
52.根据陈述32-51任一项的方法，其中聚乙二醇化反应在约7.0-9.0的pH下进行，并且，其中PEG/蛋白质的摩尔比约为0.6-1.0。
53.用于生产包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质的单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该方法包含：
使通过陈述32-51任一项生产的包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物经历分离单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的纯化过程；并且
回收单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对于聚乙二醇化蛋白质混合物增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
54.陈述53的方法，其中纯化过程包含使聚乙二醇化蛋白质混合物以流通模式经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到HIC流通溶液，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对于聚乙二醇化蛋白质混合物增加，
HIC步骤包含将聚乙二醇化蛋白质混合物在适合于结合寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于HIC材料，其中HIC流通得到单-聚乙二醇化蛋白质组合物。
55.陈述53的方法，其中纯化过程包含使聚乙二醇化蛋白质混合物以结合和洗脱模式经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到HIC洗脱液，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对于聚乙二醇化蛋白质混合物增加，HIC步骤包含：
将第二混合物在适合于结合单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于HIC材料，
从HIC材料中洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到HIC洗脱液，其中HIC洗脱液得到单-聚乙二醇化蛋白质。
56.根据陈述32-55任一项的方法，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。
Figure IDA0002637417820000011
Figure IDA0002637417820000021
Figure IDA0002637417820000031

Claims (21)

1.用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：
a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；
b)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；
IEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；和
c)从步骤b)中收集IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，
其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。
4.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC步骤为阴离子交换(AEC)步骤。
5.根据上述权利要求任一项的方法，其中进行步骤a)、b)和c)的两个或多个循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。
6.根据权利要求5的方法，其中该方法包含3、4或5个循环，其中在每个循环的步骤b)中，回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应。
7.根据权利要求5或权利要求6的方法，其中步骤c)还包含汇集从每个IEC步骤中收集的流通溶液，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。
8.根据上述权利要求任一项的方法，其中从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。
9.根据上述权利要求任一项的方法，其中将步骤b)IEC的洗脱液直接添加到随后的聚乙二醇化反应中。
10.根据上述权利要求任一项的方法，其中回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应，并且，其中还将新鲜的非-聚乙二醇化蛋白质加入到随后的聚乙二醇化反应中，以便在每次聚乙二醇化反应维持基本上恒定的聚乙二醇化反应条件。
11.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。
12.根据上述权利要求任一项的方法，其中：
i.反应产物的混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或
ii.IEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质。
13.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC步骤为AEC步骤，并且其中
i.AEC材料为Toyopearl Super Q 650M；和/或
ii.AEC步骤在约7.0-9.0的pH下进行；和/或
iii.AEC步骤在约1.0-3.0mS/cm的电导率下进行；和/或
iv.将反应产物的混合物施加于AEC材料作为包含约10-30mM N，N-二(羟乙基)甘氨酸和约1-10mM Na2SO4的AEC负载溶液。
14.根据上述权利要求任一项的方法，其中聚乙二醇化反应在约7.0-9.0的pH下进行，并且其中PEG/蛋白质摩尔比约为0.6-1.0。
15.用于生产单-聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，该组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质，所述方法包含：
使通过权利要求1-14任一项的方法生产的包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物经历纯化过程，从而分离单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；和
回收单-聚乙二醇化蛋白质组合物，其中单-聚乙二醇化蛋白质相对于聚乙二醇化蛋白质混合物的级分增加，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约90％的单-聚乙二醇化蛋白质。
16.根据权利要求15的方法，其中纯化过程包含使聚乙二醇化蛋白质混合物以流通模式经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到HIC流通溶液，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对于聚乙二醇化蛋白质混合物增加，
HIC步骤包含将聚乙二醇化蛋白质混合物在适合于结合寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于HIC材料，其中HIC流通提供单-聚乙二醇化蛋白质组合物。
17.根据权利要求15的方法，其中纯化过程包含使聚乙二醇化蛋白质混合物以结合和洗脱模式经历疏水作用色谱(HIC)步骤，得到HIC洗脱液，其中单-聚乙二醇化蛋白质的级分相对于聚乙二醇化蛋白质混合物增加，HIC步骤包含：
将第二混合物在适合于结合单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于HIC材料，
从HIC材料中洗脱单-聚乙二醇化蛋白质，得到HIC洗脱液，其中HIC洗脱液提供单-聚乙二醇化蛋白质。
18.根据上述权利要求15-17任一项的方法，其中单-聚乙二醇化蛋白质组合物包含至少约95％、98％、99％或99.9％的单-聚乙二醇化蛋白质。
19.根据上述权利要求任一项的方法，其中
i.IEC步骤和HIC步骤在基本上相同pH下进行；或
ii.聚乙二醇化反应、IEC步骤和HIC步骤在基本上相同pH下进行。
20.根据上述权利要求任一项的方法，其中单-聚乙二醇化蛋白质包含具有至少约20kDa的分子量的PEG残基。
21.根据上述权利要求任一项的方法，其还包含用药学上可接受的载体配制蛋白质组合物，得到药物组合物。
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