ES2610964T3 - Células madre multipotentes postnatales de ligamento periodontal humano y usos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una matriz de polímero o un gel de polímero y una célula madre multipotente postnatal aislada de ligamento periodontal clonogénico, donde la célula madre expresa STRO-1 y MUC18, donde la célula madre es capaz de diferenciarse en un cementoblasto, un cementocito, un adipocito y una célula formadora de fibra de colágeno.

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre multipotentes postnatales de ligamento periodontal humano y usos Campo de la invencion

La invencion se refiere, en terminos generales, a las celulas madre del ligamento periodontal postnatal (PDLSC) y a sus metodos de uso. Mas concretamente, la invencion se refiere a las PDLSC, el uso de las celulas para la regeneracion del tejido periodontal para el tratamiento de enfermedades periodontales, la diferenciacion de las celulas y metodos de criopreservacion de tejidos.

Antecedentes de la invencion

Las celulas madre postnatales (es decir, aquellas presentes tras el nacimiento) son celulas no especializadas que se pueden renovar en gran medida y convertirse en celulas mas maduras con funciones especializadas. Las celulas madre se pueden inducir bajo determinadas condiciones fisiologicas o experimentales para que se conviertan en celulas con funciones especiales, como celulas latentes del musculo cardfaco o celulas pancreaticas productoras de insulina. El proceso por el que una celula se convierte en una celula con funciones especiales se conoce como diferenciacion. La diferenciacion se puede inducir mediante el uso de multiples senales que pueden incluir sustancias qufmicas secretadas por otras celulas, contacto ffsico con celulas vecinas y determinadas moleculas del microentorno. De este modo, las celulas madre se pueden tratar con senales especfficas para que se conviertan en tipos de celulas especfficas con funciones utiles. Estas nuevas celulas diferenciadas se pueden utilizar despues para generar reemplazos para celulas que se pierden como consecuencia del deterioro y desgaste normales, de lesiones o enfermedades.

Las enfermedades periodontales (de las encfas), entre las que se incluyen la gingivitis y la periodontitis, son infecciones graves que pueden provocar la perdida de piezas dentales si no se tratan. En efecto, las enfermedades periodontales son una causa importante de perdida de piezas dentales y suponen una carga sustancial para la sanidad publica. Las enfermedades periodontales se caracterizan por la destruccion del periodoncio (el tejido que soporta los dientes, es decir, las encfas), incluyendo el ligamento periodontal (PDL), el cemento, el hueso alveolar y las encfas. La enfermedad periodontal puede afectar a una o varias piezas dentales. Se han desarrollado multiples metodos para el tratamiento de los defectos periodontales, incluyendo la regeneracion de tejido guiada, el uso de factores de crecimiento y el uso de protefnas de la matriz del esmalte, pero ninguno de estos metodos ofrece un resultado uniformemente predecible. Por consiguiente, persiste la necesidad de encontrar nuevos metodos para el tratamiento de las enfermedades periodontales. Lekic et al., Anatomical Record, v262, n.° 2, 2001, pag. 193-202 divulga el trasplante de celulas de ligamento periodontal en heridas periodontales.

Resumen de la invencion

La invencion se define en las reivindicaciones. Se proporciona metodos y materiales en relacion con las mencionadas necesidades. La presente invencion se basa en una nueva poblacion de celulas madre postnatales derivadas del ligamento periodontal (PDL) humano, denominadas celulas madre del ligamento periodontal (PDLSC). La invencion proporciona una celula madre multipotente aislada del ligamento periodontal postnatal humano, un metodo para implante de una celula periodontal en un organismo, un metodo para implante de un adipocito en un organismo y un metodo para generar tejido periodontal, incluyendo cemento y ligamento periodontal, in vivo e in vitro.

Las celulas madre multipotentes de ligamento periodontal postnatal se pueden diferenciar en celulas formadoras de fibras de colageno (fibroblastos), cementoblastos, cementocitos y adipocitos. Las celulas madre se pueden obtener del ligamento periodontal y se pueden almacenar para su posterior uso. La celula madre multipotente de ligamento periodontal se puede cultivar en un medio de cultivo tisular. Preferiblemente, el medio de cultivo tisular incluye suero. Preferiblemente, el medio de cultivo tisular no incluye suero. El medio de cultivo tisular puede incluir uno o mas factores de crecimiento.

La divulgacion tambien proporciona metodos para generar tejido periodontal, incluyendo ligamento periodontal y cemento, mediante la implantacion en un sujeto de una celula madre de ligamento periodontal o una celula progenitora diferenciada de esta. Por lo general, el metodo implica la implantacion de una celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal en un sujeto. Preferiblemente, el sujeto es un mamffero. Mas preferiblemente, el sujeto es un ser humano. La celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal se puede obtener de un sujeto e implantarse en un sujeto diferente.

Preferiblemente, la celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal se obtiene del mismo sujeto en el que se implanta. La celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal se puede expandir ex vivo antes de ser implantada en el sujeto. La celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal se puede inducir para su diferenciacion antes de ser implantada en el sujeto. Una celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal que no esta combinada con un portador se puede implantar en un sujeto. Una celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal que esta combinada con un portador se puede implantar en un sujeto. Preferiblemente, el portador contiene hidroxiapatita. Mas preferiblemente, el portador contiene fosfato tricalcico. Mas preferiblemente, el portador contiene hidroxiapatita y fosfato tricalcico. El metodo puede ser empleado para generar

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celulas/tejido periodontal en respuesta a un traumatismo en el periodoncio.

Preferiblemente, el traumatismo es una erosion del periodoncio. Mas preferiblemente, el traumatismo es el resultado de una enfermedad periodontal.

La divulgacion proporciona un metodo para producir tejido adiposo en un sujeto. Por lo general, el metodo implica la implantacion de una celula madre de ligamento periodontal en un organismo.

Preferiblemente, la celula madre de ligamento periodontal es una celula madre multipotente de ligamento periodontal.

Mas preferiblemente, la celula madre de ligamento periodontal es una celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal humano. Preferiblemente, el sujeto es un mamffero. Mas preferiblemente, el sujeto es un ser humano. La celula madre de ligamento periodontal se puede expandir ex vivo antes de ser implantada en el organismo. Preferiblemente, se induce la adipogenesis de la celula madre de ligamento periodontal antes de su implantacion en el sujeto. Una celula madre de ligamento periodontal que no esta combinada con un portador se puede implantar en un sujeto. Una celula madre de ligamento periodontal que esta combinada con un portador se puede implantar en un sujeto.

La divulgacion tambien proporciona un metodo para la criopreservacion de tejido del que posteriormente se pueden aislar celulas madre periodontales funcionales, sumergiendo una porcion de un ligamento periodontal aislada en suero que contiene aproximadamente entre un 1% y un 20% de dimetilsulfoxido (DMSO) y congelando rapidamente el ligamento periodontal sumergido, criopreservando de este modo las celulas madre periodontales. En un metodo preferible, el suero incluye aproximadamente un 10% de DMSO. Preferiblemente, el ligamento periodontal es de mamffero. Mas preferiblemente, el ligamento periodontal es un ligamento periodontal humano. Generalmente, el tejido criopreservado se descongela a una temperatura de entre 35°C y 39°C aproximadamente. Tras la descongelacion, el ligamento se somete a digestion o disrupcion mecanica para formar una suspension de celulas individuales y esta suspension de celulas individuales se siembra en un recipiente para el cultivo tisular (por ejemplo, un matraz de cultivo tisular) en presencia de un medio, como un medio de celulas madre.

La divulgacion preve asimismo el uso de las PDLSC en terapia medica, incluyendo, entre otros, el tratamiento de un traumatismo en el periodoncio. La divulgacion preve asimismo el uso de PDLSC en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un traumatismo en el periodoncio. El traumatismo puede estar causado, por ejemplo, por una enfermedad periodontal, un procedimiento dental o un traumatismo ffsico, como un accidente.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 ilustra el aislamiento de PDLSC humanas. A) Tercer molar humano extrafdo en el que se muestra el

PDL unido a la superficie de las rafces (flecha). B) Colonias individuales formadas despues de colocar las PDLSC en placas a baja densidad y cultivarlas como se describe a continuacion. C) Los grupos de celulas obtenidos del PDL formaron una unica colonia tenida con azul de toluidina al 0,1%. D) La eficacia del marcado con bromodesoxiuridina (BrdU) de las PDLSC y DPSC fue evaluada incorporando BrdU durante 24 horas. El numero de celulas BrdU positivas se expreso como un porcentaje del numero total de celulas cuyo recuento se realizo en seis cultivos replicados como se muestra en el diagrama de caja.

Las PDLSC demostraron un mayor fndice de absorcion que las DPSC, aunque no se produjo una diferencia estadfsticamente significativa (p=0,294). Las lfneas horizontales son los valores medios.

Las barras muestran los valores maximos y mfnimos. E-F) La tincion inmunocitoqufmica demostro que las PDLSC cultivadas expresaban STRO-1 (Figura E) y CD146/MUC18 (Figura F), dos marcadores de progenitores mesenquimales tempranos. G-H) El tejido de PDL fue positivo al anticuerpo STRO-1 con tincion inmunohistoqufmica (Figura G) y fluorescencia (Figura H).

I) Se hicieron reaccionar suspensiones de celulas individuales recien aisladas de PDL humano con el anticuerpo STRO-1 tras inmunoseleccion con perlas magneticas Dynal, tal como se describe a continuacion. Posteriormente se realizaron ensayos clonogenicos con fracciones de celulas no fraccionadas (en bruto), STRO-1 negativas (STRO-1-) y STRO-1 positivas (STRO-1+). Los datos obtenidos de cinco muestras de PDL individuales se muestran en el diagrama de caja.

Las lfneas horizontales resaltadas en los diagramas de caja son los valores medios. J) La RT-PCR (izquierda) y el analisis Northern Blot (derecha) demostraron que las PDLSC cultivadas (P) expresaron unos niveles superiores de escleraxis, un factor de transcripcion que se expresa especfficamente en las celulas del tendon, en comparacion con las DPSC (D) y BMSSC (B). GAPDH = gliceraldehfdo-fosfato- deshidrogenasa (control).

La Figura 2 muestra la expresion del fenotipo cementoblastico/osteoblastico en las PDLSC. La tincion con rojo alizarina demostro unas cantidades limitadas de formacion de nodulos mineralizados en los cultivos de PDLSC (A). En comparacion con los cultivos de DPSC inducidas (B), los cultivos de PDLSC acumularon una menor cantidad de calcio que las DPSC (p = 0,0026, C). D) La tincion inmunocitoqufmica demostro que las PDLSC expresaban marcadores cementoblasticos/osteoblasticos, incluyendo fosfatasa

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alcalina (ALP), protefna extracelular de la matriz (MEPE), sialoprotefna osea (BSP), osteocalcina (OSC) y receptor de TGF tipo I (TGFpRI). E). El analisis de Western blot confirmo la expresion de los marcadores cementoblasticos/osteoblasticos;

se utilizo HSP90 para valorar la cantidad de protefna cargada por muestra.

La Figura 3 demuestra la diferenciacion adipogenica de las PDLSC. A)

Las PDLSC cultivadas formaron grupos de lfpidos positivos en aceite rojo O despues de tres semanas de induccion, en presencia de 0,5 pM isobutilmetilxantina, 0,5 pM hidrocortisona y 60 pM indometacina. B) El medio de cultivo estandar no indujo ningun grupo de lfpidos positivos en aceite rojo O. C) Se observo una importante regulacion al alza de los marcadores adipogenicos PPARy2 y lipoproteinlipasa (LPL) en el grupo inducido con el coctel adipogenico (Adipo) en comparacion con el grupo de control (Cont) mediante RT-PCR.

La Figura 4 demuestra la generacion de estructuras similares a cemento y PDL in vivo por las PDLSC. A) Ocho semanas despues del trasplante, las PDLSC se diferenciaron en celulas similares a cementoblastos (flechas) que formaron una estructura similar al cemento (C) sobre la superficie del portador de fosfato tricalcico de hidroxiapatita (HA); tambien se generaron celulas similares a cementocitos (triangulos) y tejido similar a PDL (PDL). B) Se utilizo el trasplante de BMSSC como control, para mostrar la formacion de una estructura de hueso/medula que contiene osteoblastos (flechas), osteocitos (triangulos) y elementos de hueso (B) y medula hematopoyetica (HP). B) El trasplante de DPSC tambien se utilizo como control, para mostrar una estructura similar a dentina/pulpa que contiene odontoblastos (flechas) y tejido similar a la dentina (D) y similar a la pulpa (Pulp). D) La tincion inmunohistoqufmica demostro que las PDLSC generaron una estructura similar al cemento (C) y se diferenciaron en celulas similares a cementoblastos (flechas) y celulas similares a cementocitos (triangulos) que mostraron una tincion positiva para el anticuerpo mitocondrial especffico humano. Parte del tejido similar a PDL (PDL) tambien mostro una tincion positiva para el anticuerpo mitocondrial especffico humano (dentro de la lfnea discontinua). E) De 13 cepas seleccionadas de PDLSC obtenidas de una unica colonia, ocho (61%) generaron estructuras similares a cemento/PDL in vivo, tal como se muestra en el aumento inferior (aproximadamente 20x). Se formo una nueva estructura similar a cemento (C) adyacente a las superficies del portador (HA) y asociada con el tejido similar a PDL (PDL). F) Las otras cinco cepas no generaron tejidos similares a PDL ni mineralizados in vivo.

La Figura 5 ilustra la generacion de fibras de colageno por las PDLSC in vivo. A) Tincion con hematoxilina y eosina de tejido de PDL humano que muestra fibras de colageno (flechas). B) Las fibras de colageno de PDL humano fueron positivas para la tincion con anticuerpo anti-colageno de tipo I (flechas). C) Las PDLSC trasplantadas generaron fibras de colageno (flechas) junto con la estructura similar a cemento de reciente formacion (C). D) Estas fibras fueron positivas para la tincion con anticuerpo anti-colageno de tipo I (flechas), similar al PDL humano. E) Las PDLSC trasplantadas formaron estructuras similares a cemento (C) que conectaron con las fibras de colageno de reciente formacion (lfneas discontinuas amarillas) similares a la estructura de las fibras de Sharpey. F) Las PDLSC generaron una cantidad importante de fibras de colageno (flechas). G) Estas fibras de colageno fueron positivas para la tincion de anticuerpos antimitocondriales especfficos humanos. H) Se utilizo preinmunosuero como control negativo del trasplante de PDLSC para el anticuerpo antimitocondrial especffico humano.

La Figura 6 ilustra PDLSC en la reparacion de tejido periodontal en ratas inmunosuprimidas. La tincion inmunohistoqufmica del tejido de trasplante recuperado con anticuerpos antimitocondriales especfficos humanos demostro que las PDLSC humanas: A) estaban ubicadas en el compartimento del PDL (triangulos); B) participaban en la union del PDL a la superficie del diente (flechas); y C) participaban en la reparacion del hueso alveolar (flechas) y del PDL (triangulo).

La Figura 7 demuestra el aislamiento de C-PDLSC. A) Las PDLSC recuperadas de PDL criopreservado durante seis meses eran capaces de formar grupos de una sola colonia heterogenea tras ser tratadas en placas a baja densidad y se cultivaron con un medio de cultivo habitual durante 10 dfas, tal y como se describe en los metodos.

El numero de colonias individuales obtenidas del PDL criopreservado (CP) se redujo notablemente (*p < 0,05) en comparacion con el PDL fresco no congelado (P) cuando se colocaba el mismo numero de celulas (5000) en las placas. B) Las tasas de proliferacion se valoraron por incorporacion de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 12 horas. Las C-PDLSC (CP) mantienen un elevado fndice de proliferacion, similar a las PDLSC habituales (P), lo que demuestra que no existe ninguna diferencia significativa entre las PDLSC habituales y las C-PDLSC. C) Tincion con hematoxilina y eosina (H-E) de tejido de PDL humano no congelado. D y E) Tincion con H y E de PDL criopreservado durante seis meses. La mayorfa de las areas del tejido de PDL mostraban una estructura histologica normal. Sin embargo, en el PDL congelado se observo cierta anisocariosis nuclear (E, flecha), lo que indica que la criopreservacion puede generar algunos danos tisulares. F-M) Las C-PDLSC expresaron STRO-1, uno de los marcadores de los progenitores tempranos de las celulas madre mesenquimales. Las C-PDLSC pueden expresar conjuntamente STRO-1 con sialoprotefna osea (BSP) y receptor de TGFp de tipo I (TGFpRI), tal y como se muestra en las figuras fusionadas. Algunas C-PDLSC pueden expresar STRO-1 y BSP por separado.

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La Figura 8 ilustra la caracterizacion in vitro de las C-PDLSC. A y B) La tincion con rojo alizarina demostro la formacion de nodulos mineralizados (A). En condiciones regulares de cultivo, las C-PDLSC no fueron capaces de formar nodulos mineralizados (B). C y D) Las C-PDLSC fueron capaces de formar grupos de lfpidos positivos en aceite rojo O (C). El medio de cultivo habitual no podrfa inducir ningun grupo de lfpidos positivo en aceite rojo O en las C-PDLSC (D). E) Cuando las PDLSC se cultivaron con 10 ng/ml de TGFpl durante cuatro semanas formaron distintas fibras de colageno in vitro (flechas abiertas). F) Las fibras generadas in vitro fueron positivas para la tincion del anticuerpo anti-colageno tipo I (flechas abiertas). G) Por el contrario, las DPSc no fueron capaces de formar fibras de colageno in vitro en las mismas condiciones de cultivo. H) Las C-PDLSC tambien fueron capaces de generar agregados de colageno in vitro cuando se cultivaron con 10 ng/ml de TGFpl durante cuatro semanas. I) Los agregados de reciente formacion fueron positivos para la tincion del anticuerpo anti-colageno tipo I. J) Control de pre- inmunosuero negativo para la tincion inmunohistoqufmica del anticuerpo anti-colageno tipo I.

La Figura 9 ilustra la caracterizacion in vivo de las C-PDLSC. A) Ocho semanas despues del trasplante, las CPDLSC fueron capaces de formar una estructura similar al cemento (C) en las superficies del portador de tricalcio e hidroxiapatita (HA) que estaba conectado al tejido similar al PDL (PDL). B) Las celulas responsables de la formacion de cemento (C) fueron positivas para la tincion del anticuerpo antimitocondrial especffico humano (flechas negras). Los datos de la tincion inmunohistoqufmica indicaron que las C-PDLSC trasplantadas se diferenciaron en cementoblastos/cementocitos y generaron cemento in vivo. C y D) Las C-PDLSC trasplantadas fueron capaces de formar cemento (C) sobre las superficies de las partfculas de HA/TCP (HA) y fueron capaces de generar fibras de Sharpey (flechas negras) insertadas en el cemento y que fueron continuas con el tejido similar a PDL (PDL), tal como muestra la tincion con HE (C) y tricromica (D). E y F) De seis cepas seleccionadas de C-PDLSC obtenidas de una unica colonia, cuatro (67%) fueron capaces de generar una estructura similar a cemento/PDL (E). El cemento de reciente formacion (C) se encontraba adyacente a las superficies del portador de HA/TCP (HA) y estaba conectado con el tejido similar al PDL (PDL) a traves de fibras de Sharpey (flechas negras). El 33% restante (2 de 6) de las cepas de C-PDLSC obtenidas de una unica colonia no fueron capaces de generar cemento in vivo (F). G y H) El cemento de reciente formacion (C) fue positivo para la tincion del anticuerpo anti-colageno tipo I (G) y las celulas cementogenicas fueron positivas para la tincion del anticuerpo anti- BSP (flechas abiertas en H). I) Control de preinmunosuero negativo para la tincion inmunohistoqufmica de anticuerpos anti-colageno tipo I y anti-BSP.

La Figura 10 demuestra la recuperacion de celulas madre funcionales de tejido estromal de medula osea humana criopreservado. Las celulas formadoras de colonias tambien se pueden recuperar del tejido estromal de medula osea congelado obtenido de fragmentos de hueso facial, tal como se describe en los metodos. A-D) Las BMSSC obtenidas de tejidos estromales de medula osea criopreservados unidos a los fragmentos de hueso, similares a las BMSSc habituales, expresaron STRO-1 y ALP en el cultivo. E y F) Tras el trasplante de BMSSC obtenidas de tejido estromal de medula osea criopreservada, las BMSSC se diferenciaron en osteoblastos (flechas negras) y formaron hueso (B) y elementos de medula hematopoyetica asociados (BM), tal como demostro la tincion con H-E (E) y la hibridacion in situ de la secuencia Alu especffica humana (F).

Descripcion detallada de la invencion

La invencion incluye celulas madre multipotentes de ligamento periodontal postnatal humano que pueden dar lugar a diversos tipos de celulas. En una realizacion preferible, las celulas son aisladas de tejido humano. Como se expone mas adelante, por primera vez se demuestra que el PDL contiene celulas madre postnatales que son capaces de diferenciarse en cementoblastos, cementocitos, adipocitos y celulas formadoras de fibras de colageno (fibroblastos). Tal y como se demuestra en los ejemplos siguientes, las PDLSC son capaces de formar una estructura de cemento/PDL in vivo. Por tanto, las PDLSC son utiles para generar PDL y cemento para el tratamiento de la enfermedad periodontal. Adicionalmente, las PDLSC son utiles para generar adipocitos para la formacion de grasa. Asimismo, las PDLSC tambien pueden ser utiles para el tratamiento del ictus y defectos oseos, incluyendo fracturas y osteoporosis.

El ligamento periodontal (PDL) se ha caracterizado como un tejido conectivo blando y especializado que conecta el cemento de la pieza dental con el hueso alveolar del maxilar y la mandfbula para mantener la pieza dental en su posicion, contribuir a la funcion de las piezas dentales y preservar la homeostasis del tejido. Se ha dado por supuesto que el PDL es un tejido altamente renovable con una solida capacidad para la regeneracion tisular, al tiempo que mantiene el espacio necesario para la funcion normal de las piezas dentales. Tal como se describe en el presente, las celulas madre multipotentes fueron aisladas del ligamento periodontal humano. Se descubrio que las celulas madre de ligamento periodontal (PDLSC) aisladas expresan marcadores de las celulas madre mesenquimales, incluyendo STRO-1 y MUC18, junto con un elevado nivel de un marcador especffico del tendon, escleraxis (SCX). Estos marcadores se pueden utilizar para distinguir las PDLSC de las celulas madre adyacentes, tales como las celulas madre de la pulpa dental (DPSC) y las celulas madre de tejido estromal de la medula osea (BMSSC).

Las celulas madre aisladas del ligamento periodontal son capaces de diferenciarse en diversos tipos de celulas. Estos tipos de celulas incluyen cementoblastos, cementocitos, adipocitos y fibroblastos. Tambien se descubrio que las celulas madre de ligamento periodontal son capaces de generar tejido periodontal.

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Por ejemplo, cuando se trasplantaron en ratones inmunosuprimidos, las PDLSC generaron una estructura similar a cemento, junto con un tejido conectivo similar al ligamento periodontal. Por tanto, la presente divulgacion proporciona un metodo para la regeneracion de tejidos mediada por celulas madre, para reparar lesiones de la region periodontal, incluyendo las lesiones resultantes de enfermedades periodontales (que se caracterizan por la destruccion del periodoncio (el tejido que sujeta el diente)), como la periodontitis, una infeccion cronica del ligamento periodontal y los tejidos adyacentes.

Tal como se describe en el presente, las celulas madre multipotentes de ligamento periodontal representan una nueva poblacion de celulas madre postnatales con capacidad de proliferacion extensiva y diferenciacion multipotencial, incluyendo diferenciacion en cementoblastos, cementocitos, adipocitos y fibroblastos. Por tanto, el ligamento periodontal puede ser un recurso ideal de las celulas madre para reparar el tejido periodontal danado o para crear grasa cuando sea necesario.

Por consiguiente, la divulgacion incluye metodos para generar tejido periodontal. El metodo implica trasplantar celulas madre de ligamento periodontal en un sujeto. Preferiblemente, el sujeto es un mamffero. Mas preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Las celulas madre de ligamento periodontal pueden ser celulas madre multipotentes de ligamento periodontal postnatal humano. Preferiblemente, las celulas madre de ligamento periodontal (PDLSC) expresan marcadores de celulas madre mesenquimales, incluyendo STRO-1 y MUC18, junto con un elevado nivel de un marcador especffico del tendon, escleraxis (SCX).

Esta nueva capacidad descubierta para generar tejido periodontal reparativo representa un gran avance tecnico, porque permite la generacion restaurativa del periodoncio perdido, es decir, cemento, hueso alveolar y ligamento periodontal. Esto, a su vez, tiene un gran valor practico, porque permite al odontologo o al medico proporcionar una mejor atencion al paciente que precisa este tratamiento. Por ejemplo, el protocolo actual para el tratamiento de la enfermedad periodontal implica el uso de cirugfa para la reparacion del traumatismo. Esto puede provocar dolor y requerir que el paciente se someta a otro tratamiento doloroso e incurra en costes adicionales. La aplicacion de los metodos de la invencion a un sujeto que necesita tratamiento para una enfermedad periodontal o para otra lesion en el periodoncio permite colocar las celulas madre de ligamento periodontal en la region traumatizada mediante un procedimiento mfnimamente invasivo para producir tejido periodontal regenerativo. Por tanto, se cree que el uso del metodo puede reducir los costes y el dolor asociados al tratamiento dental.

Una realizacion de la invencion preve la criopreservacion de tejido humano y la recuperacion de celulas madre funcionales (por ejemplo, mesenquimales) del tejido humano criopreservado (por ejemplo, ligamento periodontal o tejido estromal de los huesos). Por tanto, proporciona un planteamiento practico para la preservacion de tejidos, como tejido humano, para el posterior aislamiento de celulas madre postnatales y la regeneracion del tejido.

Definiciones:

Abreviaturas: Ligamento periodontal (PDL), celula madre de ligamento periodontal (PDLSC), escleraxis (SCX), celulas madre de piezas dentales deciduas exfoliadas (SHED), celula madre estromal de medula osea (BMSSC), celula madre de pulpa dental de una pieza dental permanente (DPSC), solucion salina fosfatada (PBS), protefna morfogenetica osea 4 (BMP-4), sialoprotefna de dentina (DSP), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento fibroblastico basico (bFGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), fosfatasa alcalina (ALP), fosfoglicoprotefna extracelular de la matriz (MEPE), acido glutamico descarboxilasa (GAD).

"Postnatal" se refiere a cualquier momento posterior al nacimiento, incluyendo inmediatamente despues del nacimiento y cualquier momento posterior.

Para los fines del presente, "celula madre" se refiere a una celula relativamente no diferenciada que se puede inducir para que prolifere y que puede producir una progenie que posteriormente se diferencia en uno o mas tipos de celulas maduras. En multiples ejemplos biologicos, las celulas madre son "multipotentes" porque pueden producir una progenia de mas de un tipo de celulas distintas, aunque esto no es necesario para su condicion de celulas madre. La autorrenovacion es la otra caracterfstica clasica de la definicion de celula madre. En teorfa, la autorrenovacion se puede producir por cualquiera de dos mecanismos importantes. Las celulas madre se pueden dividir de forma asimetrica, de forma que una celula resultante conserva la condicion de celula madre, mientras que la otra expresa algun otro fenotipo o una funcion especffica distinta. Alternativamente, algunas de las celulas madre de una poblacion se pueden dividir de forma simetrica en dos celulas madre, manteniendo asf algunas celulas madre en el conjunto de la poblacion, mientras que otras celulas de la poblacion dan lugar unicamente a una progenie diferenciada. Ademas, es posible que las celulas que comienzan siendo celulas madre evolucionen hacia un fenotipo diferenciado, para despues "invertir" el proceso y reexpresar el fenotipo de la celula madre.

Para los fines del presente, "diferenciacion se refiere al proceso evolutivo por el que las celulas asumen un fenotipo especializado, es decir que adquieren una o mas caracterfsticas o funciones distintas de las que presentan otros tipos de celulas.

Los terminos "implante" y "trasplante" son intercambiables y se refieren a un injerto de tejido o de una

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celula o celulas en un sujeto. El tejido o la celula puede proceder del mismo sujeto al que se va a trasplantar la celula o el tejido, o bien puede proceder de un sujeto diferente (es decir, tejido o celula trasplantado de un donante a un receptor; en algunos casos el sujeto puede ser tanto donante como receptor).

El termino "portador" se refiere a un vehfculo con el que se puede mezclar una celula madre antes de ser implantada en un sujeto. Entre los ejemplos de portadores se incluyen, entre otros, gelatina, esponjas de polivinilo, matrices de colageno y ceramica de hidroxiapatita/fosfato tricalcico. Los portadores se pueden preparar de multiples formas. Por ejemplo, se pueden formar portadores en forma de bloques, en polvo, en tiras y similares. Los portadores son conocidos en la tecnica y han sido descritos (Krebsbach et al., Transplantation, 63: 1059 (1997)).

Una "celula madre de ligamento periodontal" se refiere a una celula madre postnatal que es aislada del ligamento periodontal. Una "celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal humano" se refiere a una celula madre que es aislada del ligamento periodontal humano.

El termino "aislada" significa que una celula de la invencion no esta en el estado en el que se encuentra naturalmente. Por ejemplo, la celula esta libre de uno o mas contaminantes o uno o mas tipos de celulas con los que se encuentra naturalmente una celula de la invencion. Por otra parte, una celula aislada de la invencion puede estar presente de una forma que es suficientemente pura como para ser utilizada con fines terapeuticos o para la investigacion. El termino "aislada" no requiere que una celula de la invencion este libre de todos los contaminantes.

"Expansion" se refiere a la propagacion de una celula o celulas sin diferenciacion.

Una "celula receptora" es una celula en un sujeto que pasa a estar proxima a una celula madre cuando se implanta esta ultima en el sujeto. Una celula receptora puede estar en contacto directo con una celula madre implantada o no estar en contacto directo con la celula implantada pero aun asf verse influida por la celula implantada. Por ejemplo, una celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal humano implantada puede provocar que una celula receptora forme cemento sin estar realmente en contacto con la celula receptora.

El termino "traumatismo" se refiere a un evento que provoca que una celula experimente un cambio perjudicial. Entre los ejemplos de traumatismo se incluyen lesiones ffsicas resultantes de un accidente o tratamiento medico, incluyendo la cirugfa, una enfermedad (como una enfermedad periodontal), una degeneracion y similares.

Para los fines del presente, "sujeto" se refiere a cualquier vertebrado, preferiblemente un mamffero, mas preferiblemente un ser humano. Entre los mamfferos se incluyen, entre otros, los seres humanos, animales de granja, animales que participan en competiciones deportivas y mascotas.

Para los fines del presente, "tratar" o "tratamiento" incluye tratar, prevenir, mejorar o inhibir un dano ffsico o relacionado con una enfermedad y/o un sfntoma de un dano ffsico o relacionado con una enfermedad de un sujeto.

Para los fines del presente, por lo general una "cantidad efectiva" significa una cantidad que ofrece el rendimiento o efecto sistemico o local deseado. Por ejemplo, una dosis efectiva es una cantidad suficiente para provocar un resultado clfnico beneficioso o deseado.

El termino "comprende" o "contiene" y similares puede tener el significado que se le atribuye en la Ley de Patentes USA y puede significar "incluye", "incluyendo" o similares. Para los fines del presente, "incluyendo" o "incluye" o similares significa incluyendo, entre otros.

I. Una celula madre multipotente aislada de ligamento periodontal postnatal humano

La invencion se refiere a celulas madre multipotentes aisladas de ligamento periodontal postnatal. Estas celulas y los metodos para aislarlas se divulgan en detalle en el presente documento.

(a) Un cultivo de PDLSC

Las PDLSC se pueden mantener y se puede dejar que se expandan en un medio de cultivo consolidado en la tecnica y comercializado por American Type Culture Collection (ATCC). Entre estos medios de cultivo se incluyen, entre otros, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), DMEM F12 medium®, Eagle's Minimum Essential Medium®, F-12K medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium®, RPMI-1640 medium®.

Tambien se contempla la posibilidad de complementar el medio de cultivo celular con suero de mamffero. A menudo los sueros contienen factores celulares y componentes que son necesarios para la viabilidad y expansion. Entre los ejemplos de sueros se incluyen suero bovino fetal (FBS), suero bovino (BS), suero de ternero (CS), suero de ternero fetal (FCS), suero de ternero recien nacido (NCS), suero de cabra (GS), suero de caballo (HS), suero humano, suero de pollo, suero porcino, suero de oveja, suero de conejo, sustitutos de suero, y fluido embrionico bovino. Los sueros se pueden inactivar por calor a 55-65°C si se considera necesario inactivar los componentes de la cascada del complemento.

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Tambien se pueden utilizar suplementos adicionales para suministrar a las celulas oligoelementos para su optimo crecimiento y expansion. Entre estos suplementos se incluyen insulina, transferrina, selenito de sodio y combinaciones de ellos. Estos componentes se pueden incluir en una solucion salina, como por ejemplo, entre otras, Hanks' Balanced Salt Solution® (HBSS), Earle's Salt Solution®, suplementos antioxidantes, suplementos MCDB- 201®, solucion salina fosfatada (PBS), acido ascorbico y acido ascorbido-2-fosfato, asf como otros aminoacidos. Muchos medios de cultivo de celulas ya contienen aminoacidos; sin embargo, a algunos es necesario anadir suplementos antes de cultivar las celulas. Estos aminoacidos incluyen, entre otros, L-alanina, L- arginina, acido L-aspartico, L-asparagina, L-cistefna, L- cistina, acido L-glutamico, L-glutamina, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina y L-valina.

Los antibioticos tambien se utilizan tfpicamente en el cultivo de celulas para mitigar la contaminacion por bacterias, micoplasmas y hongos. Tfpicamente, los compuestos antibioticos y antimicoticos utilizados son combinaciones de penicilina/estreptomicina, pero tambien pueden incluir, entre otros, anfotericina (Fungizone ®), ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, kanamicina, mitomicina, acido micofenolico, acido nalidfxico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetracilina, tilosina y zeocina.

Tambien se pueden utilizar ventajosamente hormonas en el cultivo celular, incluyendo, entre otras, D- aldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, p-estradiol, hidrocortisona, insulina, prolactina, progesterona, somatostatina/hormona del crecimiento humano (HGH), tirotropina, tiroxina y L-tironina.

Las citoquinas, los factores de crecimiento y/o los factores de diferenciacion tambien se pueden utilizar en el cultivo de celulas, incluyendo, entre otros, el factor 1 de celulas estromales (SDF-1), factor de celulas madre (SCF), angiopoyetina-1, factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), cualquier agente que promueva la expresion de moleculas de adhesion endoteliales, tales como ICAM y VCAM, cualquier agente que facilite el proceso de direccionamiento guiado (homing), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento de fibroblastos (como FGF4, FGF8, bFGF), Wntl 1, DKK1, acido ascorbico, isoproterenol, endotelina, cualquier agente que promueva la angiogenesis, incluyendo VEGF, aFGF, angiogenina, angiotensina-1 y angiotensina-2, betacelulina, bFGF, Factor X y Xa, HB-EGF, PDGF, angiomodulina, angiotropina, angiopoyetina-1, prostaglandina E1 y E2, esteroides, heparina, 1 -butiril-glicerol, y amida nicotfnica, cualquier agente que reduzca la apoptosis, incluyendo, entre otros, p- bloqueantes, inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (inhibidores aCe), carvedilol, antagonistas del receptor de angiotensina II tipo 1, inhibidores de caspasas, cariporida, eniporida o una combinacion de estos.

Tambien se pueden emplear lfpidos y portadores de lfpidos para complementar los medios de cultivo de celulas, en funcion del tipo de celula y del destino de la celula diferenciada. Entre estos lfpidos y vehfculos se pueden incluir, entre otros, ciclodextrina (a, p, y), colesterol, acido linoleico conjugado con albumina, acido linoleico y acido oleico conjugados con albumina, acido linoleico sin conjugar, acido linoleico-oleico- araquidonico conjugado con albumina, acido oleico sin conjugar y conjugado con albumina, entre otros.

Asimismo, se contempla el uso de capas de celulas sustentadoras. Las celulas sustentadoras se utilizan para favorecer el crecimiento de celulas cultivadas, incluyendo celulas madre. Las celulas sustentadoras son celulas normales que han sido inactivadas por radiacion gamma. En el cultivo, la capa de celulas sustentadoras actua de capa basal para otras celulas y suministra importantes factores celulares sin que se produzca su propio crecimiento o division posterior (Lim, J. W. y Bodnar, A., 2002). Algunos ejemplos de celulas que forman la capa de celulas sustentadoras son las celulas diploides tfpicas de pulmon humano, los fibroblastos embrionicos de raton, los fibroblastos embrionicos de ratones Swiss, aunque puede ser cualquier celula postmitotica capaz de suministrar factores y componentes celulares que sean ventajosos para permitir el optimo crecimiento, viabilidad y expansion de las celulas madre.

Las celulas en cultivo se pueden mantener en suspension o unidas a un soporte solido, como los componentes de la matriz extracelular y los biopolfmeros o polfmeros sinteticos. A menudo las celulas madre requieren factores adicionales que favorezcan su union a un soporte solido, como colageno de tipo I, tipo II y tipo IV, concanavalina A, sulfato de condroitina, fibronectina, "superfibronectina" y polfmeros similares a la fibronectina, gelatina, laminina, poli-D-lisina y poli-L-lisina, trombospondina y vitronectina.

B. Criopreservacion de celulas madre/tejido conteniendo celulas madre

Las celulas madre multipotentes de ligamento periodontal postnatal humano se pueden recoger y conservar para su uso en el futuro mediante tecnicas de preservacion, como la congelacion con nitrogeno lfquido. Se preve que estas celulas se podrfan recoger del ligamento periodontal de un sujeto, conservarse e implantarse en el mismo sujeto en un momento posterior. Este protocolo resultana util para sustituir las celulas perdidas a consecuencia de la edad o de un traumatismo. Por ejemplo, las celulas conservadas se podrfan utilizar durante procedimientos de reconstruccion periodontal practicados en un momento posterior de la vida. Por otra parte, las celulas se pueden tratar con factores para provocar que formen diferentes fenotipos (por ejemplo, diferenciacion).

En el presente tambien se divulga el primer informe de aislamiento de celulas madre funcionales de tejido solido congelado/descongelado. Tal como se describe en el presente, las PDLSC criopreservadas

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humanas (C-PDLSC) aisladas de tejido congelado mantuvieron las caracterfsticas de las celulas madre y la capacidad de regeneracion del tejido in vivo, lo que sugiere un gran potencial para el uso de las C- PDLSC con fines clfnicos, incluyendo, entre otros, la regeneracion del tejido periodontal.

C. Metodos para alterar geneticamente las PDLSC

Las PDLSC se pueden transfectar con una estructura de acido nucleico preseleccionada que podrfa causar que las celulas expresen un producto preseleccionado. Estas celulas se podrfan implantar en el sujeto, a fin de administrar el producto preseleccionado al sujeto. Entre los ejemplos de productos preseleccionados se incluyen, entre otros, factores de crecimiento, citoquinas, quimiocinas, factores relacionados con la hemofilia y similares. Se cree que la obtencion e implantacion de celulas en un mismo sujeto evita numerosas complicaciones resultantes del rechazo inmunologico.

Las PDLSC aisladas con los metodos descritos en el presente se pueden modificar geneticamente mediante la introduccion de ADN o ARN en la celula, con diversos metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por lo general, estos metodos se agrupan en cuatro categorfas principales: 1) transferencia viral, incluyendo el uso de vectores virales de ADN o ARN (por ejemplo, retrovirus (como lentivirus), virus del simio 40 (SV40), vectores de alfavirus, incluyendo, entre otros, virus Sindbis, papilomavirus bovino, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes recombinante y similares); 2) transferencia qufmica, incluyendo transfeccion de fosfato calcico y metodos de transfeccion de DEAE-dextrano; 3) transferencia de fusion de membrana utilizando vesfculas membranosas cargadas de ADN, tales como liposomas, eritrocitos fantasma y protoplastos, por ejemplo; y 4) tecnicas de transferencia ffsica, como microinyeccion, electroporacion, nucleofeccion, transferencia genica por microproyectiles o transferencia directa de ADN "desnudo".

Los metodos para preparar estructuras de acido nucleico son conocidos en la tecnica y han sido descritos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)).

Entre los vectores virales para el uso en PDLSC geneticamente modificantes se incluyen, entre otros, vectores adenovirales (Patente USA n.° 5 824 544; Patente USA n.° 5 707 618; Patente USA n.° 5 693 509; Patente USA n.° 5 670 488; Patente USA n.° 5 585 362), retrovirales (Patente USA n.° 5 888 502; Patente USA n.° 5 830 725; Patente USA n.° 5 770 414; Patente USA n.° 5 686 278; Patente USA n.° 4 861 719), virales adenoasociados (Patente USA n.° 5 474 935; Patente USA n.° 5 139 941; Patente USA n.° 5 622 856; Patente USA n.° 5 658 776; Patente USA n.° 5 773 289; Patente USA n.° 5 789 390; Patente USA n.° 5 834 441; Patente USA n.° 5 863 541; Patente USA n.° 5 851 521; Patente USA n.° 5 252 479), hfbridos virales adenoasociados (Patente USA n.° 5 856 152), vector lentiviral, de virus vaccinia o herpesviral (Patente USA n.° 5 879 934; Patente USA n.° 5 849 571; Patente USA n.° 5 830 727; Patente USA n.° 5 661 033; Patente USA n.° 5 328 688).

La administracion de estructuras de expresion a traves de vectores no virales tambien se contempla. Esta administracion puede emplear microinyeccion (Patente USA n.° 5 612 205), electroporacion (Patente USA n.° 5 507 724; Patente USA n.° 5 869 326; Patente USA n.° 5 824 547; Patente USA n.° 5 789 213; Patente USA n.° 5 749 847; Patente USA n.° 5 019 034), coprecipitacion con fosfato de calcio, introduccion de DEAE dextrano, introduccion mediada por receptores, introduccion mediada por liposomas (Patente USA n.° 5 631 018; Patente USA n.° 5 620 689; Patente USA n.° 5 861 314; Patente USA n.° 5 855 910; Patente USA n.° 5 851 818; Patente USA n.° 5 827 703; Patente USA n.° 5 785 987), tecnologfa de dendrfmeros (Patente USA n.° 5 795 581; Patente USA n.° 5 714 166; Patente USA n.° 5 661 025), inyeccion de ADN desnudo, bombardeo de partfculas (Patente USA n.° 5 836 905; Patente USA n.° 5 120 657) y nucleofeccion (Lakshmipathy, U., et al., Stem Cells. 22:531 -543 (2004)).

Las PDLSC se pueden alterar geneticamente mediante la insercion de ADN aislado preseleccionado, mediante la sustitucion de un segmento de genoma celular con ADN aislado preseleccionado, o mediante la delecion o inactivacion de al menos una parte del genoma celular de la celula. La delecion o inactivacion de al menos una porcion del genoma celular se puede realizar por diversos medios, incluyendo, entre otros, la recombinacion genetica, la tecnologfa antisentido (que puede incluir el uso de acidos nucleicos peptfdicos o PNA), o mediante tecnologfa de ribozimas, por ejemplo. La insercion de una o mas secuencias de ADN preseleccionadas se puede realizar mediante la recombinacion de homologos o por la integracion viral en el genoma de la celula hospedadora.

La secuencia genetica deseada tambien se puede incorporar en la celula, particularmente en su nucleo, utilizando un vector de expresion de plasmidos y una secuencia de localizacion nuclear. Los metodos para dirigir los polinucleotidos al nucleo se han descrito en la tecnica. El material genetico se puede introducir utilizando promotores que permitiran inducir el gen de interes positiva o negativamente, utilizando determinados productos qufmicos/farmacos, que se eliminaran despues de la administracion de un determinado farmaco/producto qufmico, o se puede marcar para permitir la induccion a traves de productos qufmicos (incluyendo, entre otros, el receptor de estrogeno mutado que responde al tamoxifeno) para su expresion en compartimentos especfficos de la celula (incluyendo, entre otros, la membrana celular). Tambien se pueden incluir otros elementos que pueden mejorar la expresion, como un facilitador o un sistema que produce niveles elevados de expresion. Adicionalmente, en algunos casos, resulta deseable que se produzca la secrecion del producto genetico. En estos casos, el producto

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genetico contiene preferiblemente una secuencia de senal secretoria que facilita la secrecion de la protefna.

Cualquiera de estas tecnicas tambien se puede aplicar para introducir una secuencia reguladora transcripcional en las PDLSC, a fin de activar un gen endogeno deseado. Esto se puede hacer mediante recombinacion de homologos (por ejemplo, Patente USA n.° 5 641 670) o no homologos (por ejemplo, Patente USA n.° 6 602 686).

La transduccion o transfeccion con exito de celulas diana se puede demostrar utilizando marcadores geneticos. Se ha demostrado que la protefna fluorescente verde de Aequorea victoria, por ejemplo, es un marcador efectivo para identificar y controlar celulas modificadas geneticamente (Persons, D. et al., Nature Medicine, 4: 1201-1205 (1998)). Otros marcadores alternativos que se pueden seleccionar incluyen el gen p-Gal, el receptor truncado del factor de crecimiento nervioso (incluyendo, entre otros, NEO, MTX, higromicina).

En otra realizacion, las PDLSC se pueden obtener de animales transgenicos y, de este modo, en cierto sentido ya se encuentran modificadas geneticamente. En la actualidad se utilizan varios metodos para generar animales transgenicos. La tecnica que se utiliza mas a menudo es la microinyeccion directa de ADN en huevos fertilizados de una sola celula.

Otras tecnicas incluyen la transferencia mediada por retrovirales o la transferencia genetica en celulas madre embrionicas. El uso de estos animales transgenicos tiene ciertas ventajas, incluyendo el hecho de que no es necesario transfectar las celulas sanas. Las PDLSC obtenidas de animales transgenicos exhibiran una expresion genetica estable. Utilizando animales transgenicos, resulta posible producir nuevas combinaciones geneticas. El animal transgenico puede tener integrado en su genoma cualquier gen util.

Cuando la modificacion genetica esta orientada a la produccion de una sustancia biologicamente activa, por lo general la sustancia sera una que resulte util para el tratamiento de una determinada lesion y/o enfermedad. Por ejemplo, puede que se desee modificar geneticamente las celulas de forma que secreten un determinado factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento o citoquina.

II. Un metodo para producir tejido periodontal y adiposo dentro de un organismo

La divulgacion proporciona un metodo para producir tejido periodontal y adiposo en un sujeto. El metodo para producir tejido periodontal o adiposo implica trasplantar una celula o celulas madre multipotentes de ligamento periodontal posnatal en el sujeto, de manera que se forme el producto deseado. La celula madre de ligamento periodontal postnatal puede ser una celula madre multipotente de ligamento periodontal postnatal humano.

A. Uso de las PDLSC

Las celulas madre postnatales de la invencion se pueden trasplantar en un organismo para prevenir o reducir numerosas enfermedades. Por ejemplo, una celula madre postnatal de la invencion se puede trasplantar en el tejido del periodoncio traumatizado de un sujeto, como un humano, para el tratamiento de la enfermedad periodontal u otra lesion. En otro ejemplo, una celula madre postnatal de la invencion se puede implantar en un sujeto para crear grasa cuando sea necesario. Esta creacion de grasa se puede emplear para reducir o mejorar graves trastornos (lipodistrofias) en los que hay ausencia de grasa en diferentes partes del cuerpo o en todas ellas. Estos sujetos a menudo experimentan graves problemas relacionados con el metabolismo de la energfa, que depende en gran medida de la grasa.

La divulgacion proporciona un metodo para generar tejido periodontal. Las celulas madre de ligamento periodontal se pueden obtener de un sujeto, como un ser humano, diferente del sujeto en el que se trasplantaran las celulas. Alternativamente, las celulas madre de ligamento periodontal se pueden obtener del mismo sujeto, como un ser humano, en el que se van a trasplantar. El rechazo inmunologico de las celulas trasplantadas se puede evitar obteniendo celulas del mismo sujeto en el que se van a trasplantar.

Los metodos se pueden practicar in vitro en condiciones de cultivo de celulas y/o en condiciones in vivo. Brevemente, las celulas madre de ligamento periodontal se pueden cultivar en condiciones de cultivo tisular, opcionalmente pueden ser modificadas geneticamente y, a continuacion recogidas. Las celulas recogidas se colocan despues en una region periodontal de interes en un sujeto, de forma que las celulas madre de ligamento periodontal produzcan tejido o celulas periodontales, incluyendo ligamento periodontal y cemento. Las celulas madre periodontales se pueden trasplantar en combinacion con un portador o no combinarse con un portador.

La produccion de tejido periodontal regenerativo permite sustituir material biologico por otro material biologico de reciente formacion, en lugar de los materiales artificiales o injertos tradicionales. Esto puede evitar la reaccion inmunologica o alergica a un material artificial implantado en un sujeto y puede causar menos dolor al sujeto que los tratamientos actualmente disponibles. Por otra parte, los materiales biologicos se pueden mantener mejor con el paso del tiempo que los materiales artificiales, gracias a la constante renovacion celular.

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Tras la administracion, la tolerancia inmunologica del sujeto a las PDLSC o a la progenie obtenida de las mismas se puede testar con diversos metodos conocidos en la tecnica, a fin de valorar la tolerancia inmunologica del sujeto a las PDLSC. En los casos en los que la tolerancia del sujeto a las PDLSC no llega a ser la optima (por ejemplo, el sistema inmunitario del sujeto rechaza las PDLSC exogenas), se puede aplicar al paciente un tratamiento inmunosupresor accesorio terapeutico, conocido en la tecnica.

B. Administracion

Para los fines descritos en el presente, las PDLSC autologas, alogenicas o xenogenicas se pueden administrar al sujeto, en forma diferenciada o no diferenciada, geneticamente modificadas o sin modificar, mediante inyeccion directa en el lugar del tejido, sistemicamente, o sobre la superficie o alrededor de la superficie de una matriz aceptable, encapsuladas o en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable. Las celulas madre postnatales se pueden expandir ex vivo antes de ser implantadas en un organismo.

Las PDLSC se pueden administrar a un sujeto a traves de diversos metodos conocidos en la tecnica. Las PDLSC se pueden administrar a un sujeto por inyeccion localizada o sistemica, incluyendo, entre otros, por inyeccion intramuscular e inyeccion intravenosa. Las PDLSC se pueden administrar en un punto o en las proximidades de un punto que requiere nuevas celulas, masa o una funcion optimizada. Alternativamente, se pueden administrar en un lugar remoto.

En una realizacion, se introduce una suspension de celulas en una jeringa y se administra a un sujeto. Se pueden aplicar multiples inyecciones utilizando este procedimiento. El uso de estos procedimientos de suspension celular proporciona muchas ventajas. Por ejemplo, estos metodos dirigen las celulas hacia cualquier sitio predeterminado y son relativamente poco traumaticos.

Tfpicamente, el numero de celulas trasplantadas en un sujeto sera una "cantidad terapeuticamente efectiva". Para los fines del presente, una "cantidad terapeuticamente efectiva" se refiere al numero de celulas trasplantadas que es necesario para aplicar el tratamiento de la lesion o enfermedad en concreto para la que se busca tratamiento. Por ejemplo, cuando el tratamiento es para una lesion de tejidos, el trasplante de una cantidad terapeuticamente efectiva de celulas producira tfpicamente una reduccion de la cantidad y/o la gravedad de los sfntomas asociados a la lesion. Los expertos en la tecnica entenderan como determinar las dosis de celulas adecuadas.

Una celula madre postnatal de la invencion se puede cultivar induciendo unas condiciones que causen que la celula madre postnatal se diferencie en un tipo de celula deseado. Este cultivo se puede realizar antes del trasplante de la celula diferenciada o parcialmente diferenciada en un sujeto. Por ejemplo, una celula madre postnatal de la invencion se puede someter a induccion de adipocitos.

Alternativamente, las PDLSC y su progenie se pueden inducir para que proliferen y/o se diferencien in vivo, mediante la administracion al hospedador de cualquier factor o factores de crecimiento, citoquina o citoquinas, composicion o composiciones farmaceuticas que induciran la proliferacion o diferenciacion de las celulas. Estos factores de crecimiento, citoquinas o composiciones farmaceuticas incluyen cualquier factor de crecimiento, citoquina o composicion farmaceutica conocido en la tecnica, incluyendo los factores de crecimiento y citoquinas que se describen en el presente para la proliferacion y diferenciacion in vitro.

Entre las citoquinas se incluyen, entre otras, el factor 1de celulas estromales (SDF-1), factor de celulas madre (SCF), angiopoyetina-1, factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF) y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) Entre las citoquinas se incluyen tambien cualquiera que promueva la expresion de moleculas de adhesion endoteliales, como ICAM y VCAM.

La diferenciacion de las PDLSC en un fenotipo deseado se puede intensificar cuando se emplean factores de diferenciacion.

La viabilidad de los tejidos de reciente formacion se puede intensificar por angiogenesis. Entre los factores de diferenciacion que promueven la angiogenesis se incluyen, entre otros, VEGF, aFGF, angiogenina, angiotensina-1 y angiotensina-2, betacelulina, bFGF, Factor X y Xa, HB-EGF, PDGF, angiomodulina, angiotropina, angiopoyetina-1, prostaglandina E1 y E2, esteroides, heparina, 1 -butiril-glicerol, y amida nicotfnica.

Los factores que reducen la apoptosis tambien pueden promover la formacion de tejido nuevo. Entre los factores que reducen la apoptosis se incluyen, entre otros, p- bloqueantes, inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (inhibidores ACE), carvedilol, antagonistas del receptor de angiotensina II tipo 1, inhibidores de caspasas, cariporida y eniporida.

Se pueden administrar factores exogenos (como citoquinas, factores de crecimiento, factores de diferenciacion y factores antiapoptosis) antes o despues que las PDLSC o al mismo tiempo que estas. Por ejemplo, una forma de administracion concomitante consistirfa en combinar un factor de interes en los medios de suspension de las PDLSC antes de la administracion. Las dosis para las administraciones son variables, y pueden incluir una administracion inicial seguida de administraciones posteriores; sin embargo, pueden ser discernidas por un experto en la tecnica, a partir de la presente divulgacion, los

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documentos citados aquf y el conocimiento de la tecnica.

Un metodo para incrementar potencialmente la supervivencia de las celulas consiste en incorporar PDLSC en el implante de una matriz adecuada, incluyendo, entre otras, una matriz de biopolfmero o de polfmero sintetico o de polfmero (a fin de encapsular las celulas antes de la introduccion en el organismo del sujeto, por ejemplo en una capsula de polfmero). En funcion del estado del sujeto, el punto de inyeccion podrfa resultar poco adecuado para el sembrado y proliferacion de las celulas debido a la existencia de cicatrices u otros impedimentos. Entre los ejemplos de biopolfmeros se incluyen, entre otros, celulas mezcladas con biopolfmeros como fibronectina, fibrina, fibrinogeno, trombina, colageno y proteoglicanos, que pueden ser qufmicamente modificados o conformados. Esto se podrfa construir con o sin citoquinas, diferenciacion o material genetico adicional. Por otra parte, podrfan hacerse en suspension, aunque el tiempo de permanencia en los lugares sujetos a flujos serfa nominal.

Otra alternativa es un gel tridimensional con las celulas encapsuladas en los intersticios de la mezcla celula/biopolfmero. Una vez mas, los factores de diferenciacion o citoquinas se podrfan incluir en el gel. Estos se podrfan administrar por inyeccion a traves de diversas vfas.

La cantidad de celulas a administrar variara en funcion del sujeto tratado. En una realizacion, entre aproximadamente 103 y 104 o 108 o entre 105 y 107, o aproximadamente 3 x 107 celulas. Sin embargo, la determinacion precisa de la dosis efectiva se puede basar en factores individuales para cada sujeto, incluyendo su tamano, su edad, el tamano de la necrosis u otro dano del organo y la cantidad de tiempo transcurrido desde que se produjo el dano. Por tanto, las dosis pueden ser facilmente discernidas por los expertos en la tecnica, a partir de la presente divulgacion y el conocimiento de la tecnica.

El experto en la tecnica puede determinar facilmente la cantidad de celulas y los aditivos, vehfculos y/o portadores opcionales de las composiciones a administrar de los metodos de la invencion. Tfpicamente, cualquier aditivo (ademas de la celula o celulas madre y/o citoquina o citoquinas) se encuentra presente en una cantidad de 0,001 a 50% en peso de la solucion y el ingrediente activo se encuentra presente en terminos de microgramos a miligramos, como aproximadamente de 0,0001 a 5% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,0001 a 1% en peso, mas preferiblemente de aproximadamente 0,0001 a 0,05% en peso, o aproximadamente de 0,001 a 20% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 10% en peso y mas preferiblemente de aproximadamente 0,05 a 5% en peso.

Por supuesto, para cualquier composicion que se vaya a administrar a un animal o ser humano, y para cualquier metodo concreto de administracion, es preferible determinar por tanto la toxicidad, por ejemplo determinando la dosis letal (LD) y LD50 en un modelo animal apto, como un roedor (por ejemplo, un raton) y la dosis de la composicion o composiciones, la concentracion de sus componentes y el tiempo de administracion de la composicion o composiciones que provocan una respuesta adecuada. Estas determinaciones no requieren de experimentacion innecesaria gracias al conocimiento del experto en la tecnica, a esta divulgacion y a los documentos citados en ella. Por otra parte, los tiempos de las administraciones secuenciales se pueden averiguar sin necesidad de experimentacion.

Adicionalmente, se pueden anadir varios aditivos que mejoren la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevencion de la accion de los microorganismos se puede garantizar a traves de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, tales como parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares.

En muchos casos, resultara deseable incluir agentes isotonicos, como azucares, cloruro sodico y similares. La absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable se puede conseguir mediante el uso de agentes que retrasan la absorcion, como monoestearato de aluminio y gelatina. Sin embargo, de acuerdo con la presente invencion, todo vehfculo, diluyente o aditivo empleado utilizado tendrfa que ser compatible con las celulas.

Se pueden preparar soluciones inyectables esteriles incorporando las celulas utilizadas para la practica de la presente invencion en la cantidad requerida del solvente apropiado con diversas cantidades de los demas ingredientes, segun sea necesario.

Algunos ejemplos de composiciones que comprenden PDLSC incluyen preparaciones lfquidas para la administracion, incluyendo suspensiones y preparaciones para la administracion intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administracion inyectable), como emulsiones o suspensiones esteriles. Estas composiciones pueden encontrarse en una mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua esteril, suero fisiologico, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones tambien se pueden utilizar liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampon del pH, aditivos que favorecen la gelificacion o viscosidad, conservantes, aromatizantes, colorantes y similares, en funcion de la via de administracion y de la preparacion deseada. Se pueden consultar textos estandar, como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edicion, 1985, para realizar preparaciones adecuadas sin necesidad de experimentacion.

Las composiciones de la invencion se proporcionan convenientemente como preparaciones lfquidas, tales como soluciones acuosas isotonicas, suspensiones, emulsiones o composiciones viscosas, que pueden

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ser tamponadas a un pH seleccionado. Por lo general, las preparaciones liquidas son mas faciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones solidas. Por otra parte, las composiciones liquidas son en cierto modo mas comodas de administrar, en particular por inyeccion. Por otra parte, se pueden formular composiciones viscosas dentro del rango de viscosidad apropiado, a fin de conseguir periodos de contacto mas prolongados con tejidos especfficos.

La eleccion de los portadores adecuados y de otros aditivos dependera de la via de administracion exacta y de la naturaleza de la forma de la dosis concreta, como una forma de la dosis lfquida (por ejemplo, si la composicion va a ser formulada en una solucion, una suspension, un gel u otra forma lfquida, como una forma de liberacion prolongada o una forma rellena de lfquido).

Normalmente las soluciones, las suspensiones y los geles contienen una cantidad importante de agua (preferiblemente agua purificada, esterilizada) ademas de las celulas. Tambien pueden estar presentes pequenas cantidades de otros ingredientes, como reguladores del pH (por ejemplo, una base como NaOH), agentes emulsionantes o dispersantes, agentes tampon, conservantes, agentes humectantes y agentes gelificadores (como metilcelulosa). Las composiciones pueden ser isotonicas, es decir que pueden tener la misma presion osmotica que la sangre y el fluido lagrimal.

La isotonicidad deseada de las composiciones de esta invencion se puede lograr utilizando cloruro sodico u otros agentes farmaceuticamente aceptables, tales como dextrosa, acido borico, tartrato sodico, glicol de propileno u otros solutos inorganicos u organicos. El cloruro sodico es preferible particularmente para los tampones que contienen iones de sodio.

La viscosidad de las composiciones, si se desea, se puede mantener en el nivel seleccionado utilizando un agente espesante farmaceuticamente aceptable. La metilcelulosa es preferible porque es facil de conseguir y economica, ademas de que resulta sencillo trabajar con ella. Entre otros agentes espesantes adecuados se incluyen, por ejemplo, goma xantina, celulosa de carboximetilo, celulosa de hidropropilo, carbomero y similares. La concentracion preferible del espesante dependera del agente seleccionado. Lo importante es utilizar una cantidad con la que se consiga la viscosidad seleccionada. Normalmente las composiciones viscosas se preparan a partir de soluciones, mediante la adicion de estos agentes espesantes.

Se puede emplear un conservante o estabilizador celular farmaceuticamente aceptable para incrementar la vida util de las composiciones. Preferiblemente, si se necesitan conservantes, es competencia del experto en la tecnica seleccionar composiciones que no afecten a la viabilidad o eficacia de las PDLSC descritas en la presente invencion.

Los expertos en la tecnica reconoceran que los componentes de las composiciones se deben seleccionar para que sean qufmicamente inertes. Esto no supondra ningun problema para los expertos en la tecnica farmaceutica y qufmica, o bien los problemas se podran evitar facilmente consultando textos estandar o experimentos sencillos.

Las composiciones se pueden administrar en dosis y a traves de tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica medica y veterinaria, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso y la condicion del sujeto en cuestion, asf como la forma de la composicion empleada para la administracion (por ejemplo, solida o lfquida).

Las pautas adecuadas para la administracion inicial y las dosis posteriores en el caso de administraciones secuenciales tambien son variables: pueden incluir una administracion inicial seguida de administraciones posteriores; sin embargo, podran ser discernidas por un experto en la tecnica, a partir de la presente divulgacion, los documentos citados en ella y al conocimiento de la tecnica.

La invencion se ilustra asimismo a traves del ejemplo siguiente, que no debera interpretarse que impone ninguna limitacion a su ambito de aplicacion.

Por el contrario, se debera entender claramente que se puede recurrir a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes que, tras leer la descripcion del presente, puedan sugerir los expertos en la tecnica, sin desviarse del ambito de aplicacion de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Aislamiento. Caracterizacion y uso de PDLSC Materiales y metodos Muestras y cultivo de celulas

Se recogieron terceros molares impactados humanos normales (n=25) de 16 individuos (19-29 anos) en la clfnica Dental Clinic of the National Institute of Dental & Craniofacial Research, USA, siguiendo las directrices aprobadas por los National Institutes of Health Office of Human Subjects Research. El ligamento periodontal (PDL) se separo suavemente de la superficie de la rafz y despues fue procesado en una solucion de 3 mg/ml de colagenasa tipo I (Worthington Biochem, Freehold, NJ) y 4 mg/ml de dispasa

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(Roche, Mannheim, Alemania) durante una hora a 37°C. Las muestras de PDL de diferentes individuos se agruparon y se obtuvieron suspensiones de una unica celula, haciendo pasar las celulas a traves de un tamiz de 70 pm (Falcon, BD Labware, Franklin Lakes, NJ, USA).

Para identificar las celulas madre putativas, las suspensiones de una unica celula (1 a 1 x 104 celulas) se sembraron en placas de cultivo de 10 cm (Costar, Cambridge, MA) con modificacion alfa del medio de Eagle (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) complementado con suero de ternero fetal al 15% (Equitech- Bio Inc, Kerrville, TX, USA), 100 pmol/l de acido ascorbico 2-fosfato (WAKO, Tokio, Japon), 2 mmol/l de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Biofluids Inc, Rockville, MD, USA) y, a continuacion se incubaron a 37°C en un 5% de CO2.

Para valorar la eficacia de la formacion de colonias, los cultivos del dfa 10 se fijaron con un 4% de formalina y, a continuacion, se tineron con azul de toluidina al 0,1%. Los agregados de 50 o mas celulas se puntuaron como colonias. El fndice de proliferacion de cultivos subconfluentes (primer paso) de celulas madre se valoro mediante la incorporacion de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 24 horas, con un kit de tincion BrdU de Zymed Laboratories (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). La acumulacion de calcio se indujo tal como se describe en Miura et al. (2003), y se detecto mediante tincion con rojo de alizarina S al 2% (pH 4.2). La concentracion de calcio se midio utilizando un kit de calcio Sigma 587-A (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA). La induccion de la adipogenesis se realizo tal como se documenta en Gronthos et al. (2000).

Las celulas madre de pulpa dental (DPSCs) y las celulas madre estromales de medula osea (BMSSCs) se aislaron y cultivaron tal como se ha descrito anteriormente (Gronthos et al. 2000; Krebsbach et al., 1997; Shi et al. , 2003). En algunos experimentos, las celulas madre de PDL (PDLSC) y las DPSC se obtuvieron del mismo donante o donantes. Las BMSSC se obtuvieron de un medio comercializado (AllCells LLC, Berkeley, CA, USA). Todas las celulas primarias empleadas en este estudio eran de 2- 4 pasos. Para cada experimento se uso el mismo paso de PDLSC, DPSC y BMSSC.

Anticuerpos

Entre los anticuerpos de conejo utilizados se incluyeron anti-HSP90 y TGFp1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA, USA) ; anti-CBFA1 (Oncogene Research Product, Cambridge, MA, USA); anti- endostatina y anti-mitocondria especffica humana (Chemicon, Temecula, CA, USA) ; anti-fosfatasa alcalina (LF- 47), anti-osteocalcina (LF-32), anti-protefna de la matriz extracelular (MEPE; LF-155), anti- colageno tipo I (LF-67), antifibromodulina (LF-150) del Dr. Larry Fisher del National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health (Miura et al. , 2003). Entre los anticuerpos de raton utilizados se incluyeron antiCD146/MUC18, y anti-STRO-1 (Dr. Stan Gronthos; Shi et al. , 2003); anti- sailoprotefna de hueso (LF-25, del Dr. Larry Fisher). Tambien se utilizaron anticuerpos de control negativos con coincidencia de isotipo de conejo y murino de Caltag Laboratories (Burlingame, CA, USA).

RT-PCR

Entre los cebadores de la PCR se incluyeron: PPARy2 - sentido, 5'- CTCCTATTGACCCAGAAAGC-3' (SEC ID. N.°: 1; 114-133), antisentido, 5'- GTAGAGCTGAGTCTTCTCAG-3' (SEC. ID. N.°: 2; 441-460, Numero de registro Genbank: XM_003059); LPL - sentido, 5'- ATGGAGAGCAAAGCCCTGCTC-3' (SEC. ID. N.°: 3; 175-195), antisentido, 5'- GTTAGGTCCAGCTGGATCGAG-3' (SEC. ID. N.°: 4; 718-738, Numero de registro Genbank: XMJM4682); GAPDH - sentido, 5'- AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3' (SEC. ID. N.°: 5; 12-32), antisentido, 5'- TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3' (SEC. ID. N.°: 6; 807-827, Numero de registro Genbank: M33197). El aislamiento de ARN total, la sfntesis de ADNc de la primera cepa y los procesos de PCR fueron tal y como se ha descrito anteriormente (Gronthos et al., 2002).

Analisis de Northern Blot

15 pg de ARN completo de cultivos de PDLSC, DPSC y BMSSC primarios se sometieron a electroforesis y despues se transfirieron a una membrana de nylon. Se genero una sonda de los productos de PCR purificados con cebadores de escleraxis (SCX) (sentido, 5'- CTGGCCTCCAGCTACATCTC-3' 900-919 (SEC. ID. N.°:7), antisentido, 5'- CTTTCTGTGGTTGCTGAGGC-3', 1090-1109 (SEC. ID. N.°: 8), Numero de registro Genbank: Bk000280) marcando aleatoriamente con (y-32P) dCTP (Dupont New England Nucleotide) utilizando el kit de marcado Stratagene Prime It II (Stratagene). Tras la prehibridacion en solucion de hibridacion QuickHyb (Stratagene, Cedar Creek, TX) a 68°C durante 15 minutos, las membranas se hibridaron con una sonda de SCX a 68°C durante una hora. Las membranas se lavaron dos veces en 2XSSC, 0,1% (en peso) de SDS durante 15 minutos a temperatura ambiente y, a continuacion, se lavaron una vez en 0,1% de SSC y 0,1% (en peso) de SDS a 68 °C durante 30 minutos. Las membranas fueron expuestas en una cassette PhosphoImager (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA, USA) durante 16-72 horas.

Inmunohistoquimica

Las PDLSCs fueron subcultivadas en portaobjetos de ocho camaras (2 x 104 celulas/pocillo) (NUNC Inc, Naperville, IL, USA). Las celulas se fijaron en formaldehido al 4% durante 15 minutos y, a continuacion, se bloquearon e incubaron con anticuerpos primarios (a diluciones que oscilaron desde aproximadamente 1:200 hasta aproximadamente 1:500) durante una hora. Posteriormente, las muestras se incubaron con

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anticuerpos secundarios de cabra de IgG-rojo de rodamina o IgG-Cy2 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), durante 45 minutos. Los anticuerpos de control con coincidencia de isotipo se utilizaron en las mismas condiciones. En el caso de la tincion inmunohistoqufmica enzimatica, se utilizo el kit AEC de inmunoperoxidasa de amplio espectro Zymed (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, USA) de acuerdo con el protocolo indicado por el fabricante.

Analisis de Western Blot

Los anticuerpos primarios utilizados para el analisis Western Blot fueron los mismos que los que se emplearon en las tinciones inmunohistoqufmicas a diluciones que oscilaban entre aproximadamente 1:200 hasta aproximadamente 1:1000. El analisis Western Blot se realizo tal y como se documenta en Shi et al., 2001.

Aislamiento inmunomagnetico

Este procedimiento se documento anteriormente en Shi y Gronthos, 2003.

Dicho brevemente, las suspensiones unicelulares de PDLSC se incubaron con el supernatante de STRO- 1 (BMSSC murina anti-humano, IgM) durante una hora sobre hielo. Posteriormente las celulas se lavaron con PBS/1% albumina de suero bovino y se resuspendieron con perlas de Dynal conjugadas con IgM de rata anti-raton en cuatro lechos por celula (Dynal, Oslo, Norway) durante 45 en una mezcladora giratoria a 4°C. Las celulas positivas a las perlas fueron aisladas con un concentrador de partfculas magneticas Dynal MPC-1 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Trasplante

Aproximadamente 4,0 x 106 PDLSC expandidas in vitro se trasplantaron subcutaneamente en la superficie dorsal de doce ratones beige inmunosuprimidos de 10 semanas de edad (NIH-bg-nu-xid, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, USA), tal y como se describe en Gronthos et al. 2000 y Krebsbach et al, 1997. Se empleo el mismo numero de DPSC y BMSSC expandidas in vitro como controles. Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con las especificaciones de un protocolo aprobado para animales (NIDCR #02-222).

Las PDLSC se trasplantaron en el area periodontal en seis ratas inmunodeficientes, tal y como se habfa descrito anteriormente (Melcher 1970). Dicho brevemente, 2.0 x 106 PDLSC se mezclaron con 40 mg de partfculas de ceramica de fosfato tricalcico/hidroxiapatita (Zimmer, Warsaw, IN, USA) y se trasplantaron en dos defectos periodontales de 2mm2 que se habfan creado quirurgicamente en la corteza bucal del molar mandibular de las ratas (NIH-rnu, Taconic, Germantown, NY, USA).

Estos procedimientos se realizaron de conformidad con las especificaciones de un protocolo aprobado para animales de pequeno tamano (NIDCR #03-264). Los trasplantes se recuperaron a las 6-8 semanas contadas desde el trasplante, se fijaron con un 4% de formalina, se descalcificaron con una solucion tampon al 10% de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) (pH 8.0) y, a continuacion, se introdujeron en parafina. Las secciones se desparafinaron y se tineron con hematoxilina y eosina.

Analisis estadfstico

Se utilizo la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon para analizar la significacion entre los dos grupos. Los valores p inferiores a 0,05 se consideraron estadfsticamente significativos.

Resultados

Para identificar las celulas madre putativas, se generaron suspensiones de una unica celula de PDL humano (Figuras 1A y 1B). La capacidad de las celulas obtenidas de PDL para formar grupos de celulas clonogenicas adherentes de celulas similares a fibroblastos, similares a los registrados en el caso de las poblaciones de celulas madre mesenquimales diferentes, se puso de manifiesto mediante la formacion de unas 170 colonias unicas (Figura 15 1C), generadas con 105 celulas unicas cultivadas a baja densidad (Figura 11). La poblacion de celulas formadoras de colonias, que en el presente se denominan celulas madre de ligamento periodontal (PDLSC) presenta una elevada tasa de absorcion de bromodesoxiuridina, similar a la tasa observada en las DPSC (Figura 1D).

Las PDLSC expandidas ex vivo expresaron las moleculas de la superficie celular STRO-1 y CD146/MUC18, dos marcadores tempranos de las celulas madre mesenquimales tambien presentes en las BMSSC y DPSC (Figura 1E y 1F). Tambien se mostro que las celulas STRO-1 positivas se localizaban en el tejido del PDL mediante tincion inmunohistoqufmica (Figura 1G y 1H). Cuando se utilizo el anticuerpo anti-STRO-1 para aislar las PDLSC liberadas por el tejido de pDl recien recogido, se revelo que la mayorfa de las celulas formadoras de colonias se encontraban dentro de la poblacion de celulas STRO-1 positivas, lo que confirma la condicion de STRO-1 como marcador de los progenitores tempranos de las PDLSC (Figura 11).

El nivel de expresion de escleraxis, un factor de transcripcion especffico del tendon, se evaluo en las PDLSC, dado que el PDL es similar al tendon por lo que respecta a su estructura de fibra de colageno densa y a su capacidad para absorber tension mecanica durante la actividad fisiologica normal. Las

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PDLSC expresaron un nivel superior de escleraxis que las BMSSC y las DPSC (Figura 1J), lo que sugiere que las PDLSC podnan pertenecer a una unica poblacion de celulas madre mesenquimales postnatales.

Para investigar el potencial de las PDLSC para someterse a diferenciacion cementoblastica/osteoblastica, los cultivos de PDLSC secundarios establecidos se complementaron con L-ascorbato-2 fosfato, dexametasona y fosfato inorganico para inducir la mineralizacion in vitro, tal como se haWa descrito anteriormente (Gronthos et al., 2000). Se formaron pequenos nodulos redondos positivos en rojo de alizarina en los cultivos de PDLSC tras cuatro semanas de induccion, lo que indica una acumulacion de calcio in vitro (Figura 2A). Sin embargo, en comparacion con las DPSC, las PDLSC formaron menos nodulos mineralizados, correlacionados con unas concentraciones inferiores de calcio en la matriz extracelular (Figura 2A-2C). La tincion inmunohistoqmmica (Figura 2D) y el analisis Western Blot (Figura 2E) demostraron que las PDLSC cultivadas expresaban una serie de marcadores cementoblasticos/osteoblasticos, incluyendo fosfatasa alcalina, MEPE, sialoprotema osea, osteocalcina y receptor de TGFp de tipo I. Tras la diferenciacion de las celulas en cementoblastos y cementocitos, continuaron expresando marcadores de hueso/cemento, tales como BSP, MEPE, OSC y colageno de tipo I. El cemento de reciente formacion expresaba un marcador espedfico, fibromodulina, que no se expresaba en el hueso generado por otras celulas.

Se investigo si las PDLSC, al igual que las DPSC, teman el potencial de diferenciarse en otras lmeas de celulas, tales como adipocitos. Despues de tres semanas de cultivo con un coctel inductivo adipogenico, las PDLSC se diferenciaron en celulas de grasa cargadas de lfpidos positivas en aceite rojo O (Figura 3A y 3B). Este hecho estaba correlacionado con una regulacion al alza de la expresion de dos elementos transcritos espedficos de los adipocitos, PPARy2 y lipasa de lipoprotema, detectados por RT-PCR (Figura 3C).

Para validar la capacidad de las PDLSC para diferenciarse en celulas funcionales similares a cementoblastos, las PDLSC expandidas ex vivo se trasplantaron en ratones inmunosuprimidos. Se regenero una estructura tfpica similar al cemento/PDL, en la que se formo una fina capa de tejido similar al cemento sobre la superficie del portador, junto con fibras de colageno condensadas con celulas dispersas que recordaban a las estructuras de PDL (Figura 4A). Las estructuras similares al cemento/PDL paredan totalmente diferentes de las estructuras tfpicas de hueso/medula generadas por las BMSSC y de las estructuras similares a dentina/pulpa generadas por las DPSC (Figuras 4B y 4C). Estas conclusiones demostraron la diferencia de capacidad de regeneracion de tejido existente entre las PDLSC y las BMSSC/DPSC in vivo. Los trasplantes de PDLSC conteman celulas formadoras de cemento positivas en mitocondrias espedficas humanas y una estructura similar al PDL que contema PDLSC humanas, asf como celulas receptoras (Figura 4D). De 13 clones de PDLSC obtenidas de una unica colonia y trasplantadas en ratones inmunosuprimidos, ocho (61%) demostraron una capacidad para formar un tejido similar a cemento/PDL, lo que equivale a las PDLSC obtenidas de multiples colonias (Figura 4E). Los cinco clones restantes no formaron tejidos similares a cemento/PDL (Figura 4F).

Las PDLSC humanas trasplantadas fueron capaces de formar un tejido denso similar a PDL positivo de colageno tipo I dentro de los trasplantes (Figuras 4A a 5D). Lo que es mas importante es que las fibras de colageno generadas in vivo fueron capaces de unirse a las estructuras de cemento de reciente formacion, imitando la union fisiologica de la fibra de Sharpey (Figura 5E), lo que es necesario para formar una union funcional de las estructuras de cemento/PDL. Estos resultados sugieren que las PDLSC pueden contener una subpoblacion de celulas capaces de diferenciarse en cementoblastos/cementocitos y celulas formadoras de colageno in vivo. Las PDLSC humanas fueron responsables de la formacion de fibra de colageno dentro de los trasplantes, tal y como se demuestra por la reactividad de estas celulas ante el anticuerpo anti-mitocondrial espedfico humano (Figuras 5F a 5H).

Para evaluar si las PDLSC fueron capaces de ayudar a reparar el tejido periodontal, las PDLSC humanas fueron trasplantadas en defectos creados quirurgicamente en la zona periodontal de los molares mandibulares de ratas inmunosuprimidas.

Las PDLSC humanas trasplantadas se integraron en el compartimento del PDL en dos de las seis muestras examinadas (Figura 6A) y ocasionalmente se unieron a las superficies del hueso alveolar y las piezas dentales (Figuras 6B y 6C), dependiendo de las areas examinadas. Estas conclusiones sugieren un potencial papel funcional de las PDLSC humanas para la regeneracion de tejido periodontal.

Debate

Por lo que respecta al desarrollo de las piezas dentales, el PDL se obtiene del folfculo dental que rodea a los dientes en desarrollo, proporcionando un conjunto de celulas formadoras de cemento (Handa et al. 2002; Zhao et al, 2002). Las conclusiones presentadas en el presente documento demuestran que el PDL humano contiene una poblacion de celulas madre postnatales multipotentes que se pueden aislar y expandir in vitro, proporcionando una reserva unica de celulas madre de un recurso de tejido accesible. Es importante senalar que el PDL recogido de una pieza dental puede dar lugar a multiples celulas madre, debido a su capacidad de proliferacion ex vivo. Por tanto, la regeneracion de tejido mediada por PDLSC humanas podna tener potencial como tratamiento celular practico para las enfermedades periodontales.

Experimentos previos han demostrado que la medula osea y la pulpa de tejido dental humano contienen

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celulas postnatales que son capaces de diferenciarse en osteoblastos/odontoblastos, adipocitos y celulas similares a las neuronales. Estas celulas madre se caracterizaron como progenitores STRO-1/CD146 positivos obtenidos de un nicho perivascular dentro de la medula osea y de microentornos de pulpa dental. (Gronthos et al. , 2000; Shi et al. , 2003; Gronthos et al., 2002) En el presente estudio, se ha demostrado que las PDLSC son similares a otras celulas madre mesenquimales por lo que respecta a su expresion de STRO-1/CD146, lo que sugiere que las PDLSC tambien se podrfan obtener de una poblacion de celulas perivasculares. (Gould et al., 1977; McCulloch et al., 1985).

Las conclusiones presentadas en el presente documento sugieren que las PDLSC representan una poblacion novedosa de celulas madre multipotentes, tal y como demuestra su capacidad para diferenciarse en celulas similares a cementoblastos, adipocitos in vitro y tejido similar a cemento/PDL in vivo, asf como su elevado nivel de expresion de escleraxis, un factor de transcripcion especffico asociado con las celulas de tendon. (Brent et al. , 2003) Las PDLSC tambien demostraron su capacidad para formar fibras de colageno, similares a las fibras de Sharpey, que se unen al tejido similar al cemento, lo que sugiere el potencial de regenerar la union al PDL. Estos datos respaldan el concepto de que las PDLSC son una poblacion unica de celulas madre postnatales. Sin embargo, debido a la heterogeneidad de las celulas madre mesenquimales STRO-1/CD146 positivas (Shi et al. , 2003), es posible que las PDLSC descritas en el presente puedan representar una poblacion enriquecida de celulas madre heterogeneas que contiene algunas celulas progenitoras tempranas sin una funcion.

El potencial osteogenico de las celulas de PDL se ha evaluado con anterioridad utilizando diversos metodos de cultivo de celulas y se ha documentado la capacidad de estos cultivos para formar una matriz mineralizada. (Lekic et al., 2001; Ohno et al., 2002). Los datos presentados en el presente demuestran el potencial de las PDLSC para formar depositos calcificados in vitro, tal como han demostrado anteriormente otras poblaciones de celulas mesenquimales como las BMSSC y las DPSC. Sin embargo, las PDLSC formaron nodulos calcificados dispersos en comparacion con sus homologas de tejido de la pulpa o de la medula espinal. A pesar de que se observo que las PDLSC expresan un conjunto de marcadores cementoblasticos/osteoblasticos, no formaron dentina, hueso ni sus componentes hematopoyeticos asociados in vivo.

Los datos presentados en el presente utilizaron seleccion de colonias y marcadores de STRO-1/CD146 para aislar las PDLSC del PDL. El trasplante in vivo demostro que las PDLSC expandidas in vitro generan un complejo similar al cemento/PDL que se caracteriza por una capa de tejidos similares al cemento alineados y tejidos similares al PDL claramente asociados. Las PDLSC, al igual que las DPSC, demuestran un mayor numero de duplicaciones de la poblacion que las BMSSC en cultivo; los potenciales mecanismos que contribuyen a la prolongada vida util de las PDLSC y las DPSC no estan claros. A pesar de que las PDLSC,DPSC y BMSSC son celulas madre mesenquimales y comparten algunos perfiles de expresion de protefnas comunes, las PDLSC difieren notablemente en sus potenciales de desarrollo in vivo y en su capacidad para diferenciarse en tejidos distintos representativos de los microentornos de los que se han obtenido in vivo.

La conclusion presentada en el presente demuestra que las PDLSC postnatales son celulas clonogenicas, altamente proliferativas y capaces de regenerar tejidos similares a cemento/PDL que las definen efectivamente como celulas madre. Por consiguiente, las PDLSC ofrecen potencial para su uso en la regeneracion de tejido periodontal.

Los resultados presentados en el presente demuestran que las PDLSC humanas participan en el proceso de reparacion de tejido periodontal en ratas inmunosuprimidas.

EJEMPLO 2

Recuperacion de celulas madre postnatales funcionales de tejidos

mesenquimales humanos criopreservados, como ligamento periodontal Introduccion

Introduccion

Se aislaron con exito celulas madre postnatales de diversos tejidos humanos, incluyendo medula espinal, sangre periferica, tejido neural, musculo esqueletico, epitelio, pulpa dental y ligamento periodontal (Bianco y Robey, 2001, Evers et al. , 2003; Gronthos et al., 2000; Korbling y Estrov, 2003; Seo et al. , 2004). Con los recientes avances de las terapias con celulas madre y de la ingenierfa de los tejidos, la preservacion efectiva de celulas madre supone un problema para el tratamiento clfnico mediado por celulas madre (Korbling y Estrov, 2003). Durante decadas las clfnicas han utilizado celulas madre hematopoyeticas criopreservadas para el tratamiento de enfermedades. Recientemente, se ha documentado que las celulas madre hematopoyeticas se pueden usar con exito para el trasplante de celulas madre tras 15 anos de criopreservacion (Broxmeyer et al., 2003), lo que sugiere que la criopreservacion a largo plazo es un metodo fiable para el almacenamiento de celulas madre. Por otra parte, la capacidad para criopreservar con exito celulas reproductivas, incluyendo espermatozoos y ovocitos, tejidos reproductivos, embriones y material nuclear tiene implicaciones significativas para la medicina y la tecnologfa en el campo de la reproduccion (He et al. , 2003; Hoffman et al. , 2003; Hubel, 1997; Rowley et al., 2003; Woods et al. ,

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2004). Sin embargo, se desconoce si el tejido humano solido criopreservado es un recurso para la recuperacion de celulas madre funcionales.

Tal y como se describe aquf, las celulas madre de ligamento periodontal humano (PDLSC) se aislaron y caracterizaron como una poblacion de celulas madre multipotentes capaces de formar cemento y tejidos de ligamento periodontal tras el trasplante in vivo. El tejido de ligamento periodontal recogido de las piezas dentales extrafdas es un tejido humano de facil acceso que no solamente puede servir como recurso practico para las potenciales terapias mediadas por celulas madre, sino tambien proporcionar un numero suficiente de muestras de tejido para el analisis de las caracterfsticas de las celulas madre.

Materiales y metodos

Sujetos, criopreservacion y cultivo de celulas

Se recogieron inmediatamente despues de la extraccion terceros molares impactados humanos normales junto con los fragmentos de hueso unidos de un total de 10 adultos (19-29 anos) en la clfnica Dental Clinic of the National Institute of Dental & Craniofacial Research, de conformidad con las directrices aprobadas establecidas por los National Institutes of Health Office of Human Subjects Research. Los ligamentos periodontales se separaron suavemente de la superficie de la rafz y, a continuacion, se cortaron en pequenas porciones (0,5 mm3 de tamano). Los tejidos estromales de medula osea se retiraron por medios mecanicos de los fragmentos de hueso (Krebsbach et al., 1997; Kuznetsov et al., 1997).

Los tejidos de PDL o tejidos estromales de medula osea obtenidos de los diferentes individuos se mezclaron y la mitad de las muestras de tejido se utilizo para aislar celulas madre recien obtenidas, mientras que la otra mitad se mezclo con suero fetal de ternero (Equitech-Bio Inc, Kerrville, TX) que contenfa un 10% de dimetil sufoxido (DMSO) a 4°C y, a continuacion, se almaceno directamente en nitrogeno lfquido. Tras haber estado congelados durante 3 y 6 meses, los tejidos se descongelaron rapidamente a 37°C y, a continuacion, fueron procesados en una solucion de 3 mg/ml de colagenasa de tipo I (Worthington Biochem, Freehold, NJ, USA) y 4 mg/ml de dispasa (Roche, Mannheim, Alemania) durante una hora a 37 °C. Las suspensiones de celulas unicas (104 celulas) se sembraron en un matraz T25 (Costar, Cambridge, MA) con modificacion alfa del medio de Eagle (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA), se complementaron con un 15% de suero fetal de ternero (Equitech-Bio Inc, Kerrville, TX, USA), 100 mM L-acido ascorbico-2-fosfato (WAKO, Tokyo, Japon), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina 45 y 100 mg/ml de estreptomicina (Biofluids Inc, Rockville, MD, USA) y, a continuacion, se incubaron a 37 °C en un 5% de CO2.

Para evaluar la eficiencia de la formacion de colonias, los cultivos del dfa 10 se fijaron con formalina al 4% y, a continuacion, se tineron con azul de toluidina. Los agregados de > 50 celulas se puntuaron como colonias. La tasa de proliferacion de los cultivos subconfluentes (primer paso) de PDLSC se evaluo mediante la incorporacion de bromodesoxiuridina (BrdU) utilizando un kit de tincion Zymed Laboratories (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Las condiciones para la induccion de la acumulacion de calcio y la adipogenesis se habfan documentado con anterioridad (Gronthos et al., 2000; Gronthos et al. , 2002). Para la generacion de colageno de tipo I in vitro, se cultivaron las perlas de PDLSC (2 X 106) durante 6 semanas en tubos de polipropileno de 15 ml en un ml de medio DMEM con un elevado nivel de glucosa (4,5 g/l), complementado con 1% ITS+, 100 mM L- acido ascorbico 2-fosfato (WAKO, Tokyo, Japon), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (Biofluids Inc, Rockville, mD, USA), 2 mM de piruvato y 10 ng/ml de TGF- pi recien anadidos. El medio se cambio dos veces a la semana.

Anticuerpos

Entre los anticuerpos de conejo se incluyeron anti-TGFpRI (Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA, USA), anti-mitocondrial especffico humano (Chemicon, Temecula, CA, USA), y anti-colageno de tipo I (LF-67), sialoprotefna osea (BSP LF-120), fosfatasa alcalina (ALP LF-47) del Dr. Larry Fisher del NIDCR/NIH (Miura et al., 2003). Los anticuerpos de raton inclufan STRO-1 (Dr. Stan Gronthos). Tambien se utilizaron anticuerpos de control negativos con coincidencia de isotipo de conejo y murino (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Trasplante

Aproximadamente 2,0 x 106 C-PDLSC o BMSSC expandidas in vitro se mezclaron con 40 mg de partfculas de ceramica de hidroxiapatita/fosfato tricalcico (HA/TCP) (Zimmer Inc. Warsaw, IN, USA) y, a continuacion, se trasplantaron subcutaneamente en la superficie dorsal de ratones beige inmunosuprimidos de 10 semanas de edad (NIH-bg-nu-xid, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, USA), tal y como se habfa descrito anteriormente (Krebsbach et al. , 1997; y en el presente documento). Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con las especificaciones de un protocolo aprobado para animales (NIDCR #02-222). Los trasplantes se recuperaron a las 6-8 semanas contadas desde el trasplante, se fijaron con un 4% de paraformaldehfdo, se descalcificaron con una solucion tampon al 10% de EDTA (pH 8.0) y, a continuacion, se introdujeron en parafina. Las secciones se desparafinaron y se tineron con hematoxilina y eosina.

Inmunohistoquimica

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Las C-PDLSC fueron subcultivadas en portaobjetos de ocho camaras (2 x 104 celulas/pocillo) (NUNC Inc, Naperville, IL, USA). Las celulas se fijaron en paraformaldehudo al 4% durante 15 minutos y, a continuacion, se bloquearon e incubaron con anticuerpos primarios (a diluciones que oscilaron desde aproximadamente 1:200 hasta aproximadamente 1:500) durante una hora. Posteriormente, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios de cabra de IgG-rojo de rodamina o IgG-Cy2 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), durante 45 minutos. En el caso de la tincion inmunohistoqmmica enzimatica, se utilizo el kit de AEC de inmunoperoxidasa de amplio espectro Zymed (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, USA) de acuerdo con el protocolo indicado por el fabricante.

Hibridacion in situ de Alu humana

Se realizo la hibridacion in situ de la secuencia Alu espedfica humana, tal y como se habfa descrito anteriormente (Shi et al., 2002). Dicho brevemente, entre los cebadores para Alu (Numero de registro Genbank X53550) se incluyeron: sentido, 5'-TGGCTCACGCCTGTAATCC-3' numero de base 90-108; SEC. ID. N.° 9), y antisentido: 5'-TTTTTTGAGACGGAGTCTCGC-3' (numero de base 344-364; SEC. ID. N°: 10). Las secciones de trasplantes de BMSSC de ocho semanas se desparafinaron e hibridaron con sonda de Alu marcada con digoxigenina, utilizando el kit localizador de ARNm Hyb Kit (Cat # 1800; Ambion, Inc. , Austin TX). Tras la hibridacion, la presencia de celulas positivas de Alu espedficas humanas detecto la inmunorreactividad con fosfatasa alcalina de antidigoxigenina conjugada con fragmentos Fab (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA).

Analisis estadistico

Se utilizo la prueba de T-Student para analizar la significacion entre los dos grupos. Los valores p inferiores a 0,05 se consideraron estadfsticamente significativos.

Resultados

Para examinar si el tejido criopreservado contema celulas madre postnatales se preservaron pequenas porciones de PDL congeladas en nitrogeno lfquido durante 3 y 6 meses; a continuacion, el PDL congelado se utilizo como recurso de tejido para aislar las celulas madre postnatales. Al menos el 40% de las cepas de una unica colonia heterogenea de PDLSC se pudo recuperar del PDL congelado/descongelado, al colocarlas en placas a baja densidad (5000 celulas por matraz T-25) (Figura 7A). A pesar de que el numero de colonias unicas de PDLSC obtenidas de PDL criopreservado se redujo notablemente en comparacion con las PDLSC recien aisladas, manteman una elevada capacidad proliferativa en terminos de marcado con BrdU durante 12 horas (Figura 7B).

Tras el examen histologico de las PDL criopreservadas, el tejido de PDL congelado presentaba varios tipos normales de estructuras microscopicas en la mayona de las areas examinadas (Figuras 7C y 7D). Sin embargo, se observo dano celular, como anisocariosis, un tamano variable del nucleo y la agrupacion de celulas (Figura 7E). Estas celulas tambien fueron negativas para la tincion con la tecnica de TUNEL, lo que indica muerte celular no apoptotica probablemente causada por la nucleacion de hielo intracelular letal.

Se observo que las PDLSC criopreservadas (C-PDLSC) expandidas ex vivo expresaban la molecula de la superficie celular STRO-1, un marcador temprano de las celulas madre mesenquimales, junto con la coexpresion de marcadores del TGF cementoblasticos/osteoblasticos (Figuras 7F-7M). Por otra parte, las C-PDLSC exhidan una expresion separada y no solapada de STRO-1 con BSP (Figuras 2F-2I), lo que indica sus caractensticas de heterogeneidad.

Para evaluar la capacidad de diferenciacion multipotencial in vitro, los cultivos de C-PDLSC secundarios establecidos se complementaron con L-ascorbato-2-fosfato, dexametasona y fosfato inorganico, a fin de inducir una diferenciacion osteogenica/cementogenica, tal y como se habfa descrito previamente (Miura et al., 2003; y vease mas arriba). Los resultados demostraron la formacion de nodulos positivos en rojo de alizarina en los cultivos de C-PDLSC cuatro semanas despues de la induccion, lo que indica una acumulacion de calcio in vitro (Figuras 8A y 8B). A continuacion, se examino el potencial de las PDLSC para diferenciarse en adipocitos. De forma analoga a lo que se habfa demostrado anteriormente con respecto a las PDLSC y C-PDLSC adultas, se observo que las C-PDLSC tambien ofredan el potencial de diferenciarse en celulas de grasa cargadas de lfpidos positivas en aceite rojo O despues de cinco semanas de cultivo con un coctel inductivo adipogenico (Figuras 8C y 8D).

Como ya se demostro anteriormente, las PDLSC humanas trasplantadas eran capaces de formar tejidos similares a PDL positivos en colageno de tipo I dentro de los trasplantes y tambien el TGFpl podfa inducir la expresion de colageno en las BMSSC. Tambien se examino si el TGFpl era capaz de regular al alza la expresion de colageno de tipo 1, el principal tipo de colageno presente en el tejido del PDL. Bajo la induccion de TGFpl, las PDLSC y C-PDLSC produjeron colageno de tipo I en cultivo, lo que confirma su capacidad unica de formacion de colageno (Figuras 8E- 8J). Por lo contrario, las DPSC no fueron capaces de producir fibras de colageno bajo las mismas condiciones de cultivo (Figura 8G).

Se ha demostrado que las PDLSC fueron capaces de formar tejidos similares a cemento/PDL tras el trasplante in vivo. Para confirmar la capacidad de regeneracion del tejido, las C-PDLSC se trasplantaron

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subcutaneamente en ratones inmunosuprimidos utilizando hidroxiapatita/fosfato tricalcico (HA/TCP) como portador. Se genero una estructura tfpica similar a cemento/PDL en la que se formo una fina capa de cemento sobre la superficie del HA/tCp y las estructuras similares al PDL se unieron al cemento recien regenerado (Figura 9A). Los trasplantes de C-PDLSC produjeron cementoblastos/cementocitos positivos en mitocondria especffica humana, lo que indica una diferenciacion in vivo de las C-PDLSC humanas (Figura 9B). Por otra parte, las fibras de colageno se insertaron perpendicularmente en el tejido similar a cemento (Figuras 9C y 9D), imitando a las fibras de Sharpey naturales del ligamento periodontal. Para entender mejor la diferenciacion in vivo de las C-PDLSC, se seleccionaron seis cepas de una unica colonia de C-PDLSC y se trasplantaron en ratones inmunosuprimidos, tal como se ha descrito anteriormente.

Cuatro de las seis colonias pudieron generar cemento y estructuras de PDL con cantidades variables de cemento/fibras de PDL, mientras que las dos colonias restantes solamente revelaron tejido fibroso dentro de los trasplantes (Figuras 9E y 9F), lo que sugiere que las C-PDLSC mantienen las caracterfsticas heterogeneas de las PDLSC normales. Adicionalmente, se observo que el cemento y los cementoblastos regenerados eran positivos para la tincion con el anticuerpo anti-colageno de tipo I y BSP (Figuras 9G-9I). Estos datos confirmaron que las C-PDLSC eran capaces de diferenciarse en cementoblastos y de formar cemento in vivo.

Para determinar si la criopreservacion puede influir en el cariotipo de las PDLSC criopreservadas, se realizo un cariotipo con banda G para examinar la estabilidad cromosomica de las C-PDLSC. Las C- PDLSC presentaban un cariotipo con banda G normal en comparacion con las PDLSC normales (datos no mostrados). Estos datos sugieren que las C-PDLSC pueden ser utilizadas con fines terapeuticos.

Para valorar si otro tejido criopreservado tambien contiene celulas madre postnatales, se recuperaron BMSSC humanas de tejido estromal de medula osea congelada/descongelada obtenido de fragmentos de hueso. Estas celulas madre mesenquimales recuperadas expresaban el marcador de las celulas madre STRO-1 y fosfatasa alcalina (Figuras 10A-10D).

Tras la expansion ex vivo, las BMSSC trasplantadas dieron lugar a una estructura de hueso/medula in vivo (Figura 10E), similar a lo ocurrido con el trasplante de BMSSC normal. Las BMSSC se diferenciaron en celulas osteogenicas identificadas por la secuencia Alu especffica humana por hibridacion in situ (Figura 10F). Estos datos indicaron que se podfan recuperar celulas madre postnatales funcionales de tejidos congelados, cuando estos se criopreservaban conforme a los metodos descritos en el presente.

Debate

Los experimentos previos han demostrado que las PDL humanas recien aisladas contienen celulas madre que son capaces de diferenciarse en celulas cementoblasticas/osteoblasticas in vitro y de formar tejidos similares a cemento/PDL in vivo (tal y como se ha descrito en este documento). El presente estudio demuestra que las celulas madre postnatales humanas se pueden recuperar de PDL humano criopreservadas, aportando asf un metodo clfnico practico para la utilizacion de tejidos congelados para el aislamiento de celulas madre. Es importante el hecho de que las C-PDLSC mantienen las caracterfsticas de las celulas madre y la capacidad de regeneracion de tejido in vivo, lo que sugiere un gran potencial de uso de las C-PDLSC para la regeneracion de tejido periodontal.

La base logica del aislamiento de celulas madre postnatales humanas de tejidos congelados es preservar de forma practica y eficaz las muestras clfnicas para la posterior recuperacion de celulas madre y para potenciales terapias mediadas por celulas madre. Parece razonable especular que la criopreservacion de tejidos en la clfnica resultara mucho mas sencilla que el aislamiento de celulas madre que puede requerir equipos adicionales o personal profesional. En este estudio se determino que las C-PDLSC son similares a las PDLSC por lo que respecta a sus caracterfsticas de STRO-1 positivo. Por tanto, las C-PDLSC se pueden obtener de una poblacion de celulas perivasculares (Gould et al., 1977; McCulloch, 1985). Por otra parte, las C-PDLSC muestran una naturaleza heterogenea que puede reflejar diferencias en sus fases de evolucion o pueden incluso representar diferentes lfneas de celulas de PDL analogas a las PDLSC no congeladas. Esto se pone de manifiesto en los experimentos en los que cada lfnea de celulas clonales de C-PDLSC obtenidas de una colonia demostro una capacidad variable para generar cemento, que oscilaba entre una ausencia total de cualquier cementogenesis hasta unos niveles comparables a las poblaciones obtenidas de multiples colonias. Cabe senalar que las PDLSC y C-PDLSC fueron capaces de formar agregados de colageno cuando se cultivaron con TGFpl in vitro, lo que refleja una especificidad de estas celulas madre para formar fibras de colageno para el mantenimiento de la homeostasis del tejido de PDL. Estos datos respaldan ademas la idea de que las C-PDLSC son similares funcionalmente a las PDLSC.

Es interesante senalar que se pueden recuperar progenitores hematopoyeticos tras la criopreservacion de medula osea completa donde las celulas de los individuos fueron suspendidas dentro de una fase lfquida (Lundell et al. , 1999). Este es el primer informe/estudio que utiliza tejido humano congelado/descongelado para aislar celulas madre postnatales (previamente identificadas como celulas madre a nivel funcional). A pesar de que el numero recuperado de colonias unicas de PDL congelado durante seis meses fue inferior a las PDLSC obtenidas del PDL fresco, observo ninguna diferencia por lo que respecta a las caracterfsticas de las celulas madre, incluyendo la expresion de marcadores, la tasa de proliferacion, el

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cariotipo con banda G y la capacidad de regeneracion de tejido in vivo. Por otra parte, no se observo ninguna diferencia entre los periodos de preservacion por congelacion de 3 y 6 meses por lo que respecta a la tasa de recuperacion de celulas madre, lo que indica que la duracion de la criopreservacion de hasta 6 meses o mas puede no ser perjudicial para la supervivencia de las C-PDLSC.

Se desconoce la razon por la que la tasa de recuperacion de colonias de celulas madre es inferior. Existen multiples factores que pueden influir en la viabilidad de las celulas madre criopreservadas con exito, entre los que se incluyen el procesamiento previo a la congelacion, las variaciones de temperature y la duracion del almacenamiento, asf como los procedimientos posteriores a la congelacion (Hubel, 1997). La causa mas comun de muerte celular es la formacion de hielo intracelular durante el proceso de congelacion/descongelacion (Rowley et al., 2003; Woods et al., 2004). La criopreservacion se puede mejorar para incrementar la tasa de supervivencia tras la congelacion de las celulas madre criopreservadas, utilizando, por ejemplo, trehalosa, un disacarido no reductor de la glucosa (Eroglu et al., 2000; Guo et al., 2000).

Por tanto, las celulas madre postnatales se pueden recuperar de tejidos humanos. Este es el primer reporte de que se pueden recuperar celulas madre postnatales de tejido humano congelado solido.

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10 La anterior memoria descriptiva ha sido descrita en relacion con determinadas realizaciones de la misma y se han ofrecido numerosos detalles a tftulo ilustrativo; sin embargo, para los expertos en la materia resultara evidente que la invencion es susceptible de realizaciones adicionales y que algunos de los detalles descritos en el presente pueden variar considerablemente sin apartarse de la invencion reivindicada.

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   1. Una composicion que comprende una matriz de polfmero o un gel de polfmero y una celula madre multipotente postnatal aislada de ligamento periodontal clonogenico, donde la celula madre expresa STRO-1 y MUC18, donde la celula madre es capaz de diferenciarse en un cementoblasto, un cementocito, un adipocito y una celula formadora de fibra de colageno.
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, donde la matriz comprende un biopolfmero.
3. 3. La composicion de la reivindicacion 2, donde la matriz comprende fibronectina, fibrina, fibrinogeno, trombina, un colageno, un proteoglicano, concanavalina A, sulfato de condroitina, gelatina, laminina, poli- D-lisina o poli-L-lisina.
4. 4. La composicion de la reivindicacion 1, donde la matriz comprende un polfmero sintetico.
5. 5. La composicion de la reivindicacion 4, donde el polfmero es esponja de polivinilo o donde el gel comprende gelatina.
6. 6. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende tambien una citoquina, un factor de diferenciacion o un material genetico adicional.
7. 7. La composicion de la reivindicacion 1 o 6 que comprende tambien un regulador del pH, un emulsionante, un agente dispersante, un agente tampon, un conservante, un agente humectante, un agente gelificador, un aditivo que mejore la viscosidad, un agente aromatizante, un colorante, cloruro sodico, dextrosa, acido borico, tartrato sodico o glicol de propileno.
8. 8. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la celula madre es de mamffero.
9. 9. La composicion de la reivindicacion 8, donde la celula madre es humana.
10. 10. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la celula madre expresa tambien escleraxis, fosfatasa alcalina, MEPE, receptor de TGFp tipo I, BSP, OSC, y endostatina.
11. 11. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como medicamento en un metodo para producir celulas o tejido periodontal en un sujeto, que comprende la administracion de la composicion al sujeto.
12. 12. La composicion para el uso segun la reivindicacion 11, donde el tejido periodontal producido comprende ligamento periodontal, cementocitos, cementoblastos o cemento.
13. 13. La composicion para el uso segun la reivindicacion 12, donde los cementocitos o cementoblastos expresan BSP, OSC, MEPE o cualquier combinacion de estos.
14. 14. La composicion para el uso segun la reivindicacion 11, donde el cemento expresa colageno de tipo I y/o fibromodulina.
15. 15. La composicion para el uso segun la reivindicacion 14, donde la composicion se utiliza para reducir o mejorar un traumatismo en el sujeto.
16. 16. La composicion para el uso segun la reivindicacion 15, donde el traumatismo es una enfermedad periodontal o lesion ffsica.
17. 17. La composicion para el uso segun la reivindicacion 16, donde la lesion ffsica se debe a un procedimiento dental.
18. 18. La composicion para el uso segun la reivindicacion 11, donde la composicion se puede trasplantar al tejido periodontal del sujeto.
19. 19. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para el uso como medicamento en un metodo para producir tejido adiposo humano en un sujeto, que comprende la administracion de la composicion al sujeto.
20. 20. La composicion para el uso segun la reivindicacion 11, donde la composicion se implanta tras la induccion de adipocitos.
21. 21. La composicion para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, donde el sujeto es mamffero.
22. 22. La composicion para el uso segun la reivindicacion 11, donde el mamffero es un humano.
23. 23. La composicion para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, donde la celula madre se expande ex vivo.
24. 24. Un metodo para obtener una celula madre multipotente postnatal aislada de ligamento periodontal clonogenico, donde la celula madre expresa STRO-1 y MUC18, donde la celula madre es capaz de diferenciarse en un cementoblasto, un cementocito, un adipocito y una celula formadora de fibra del

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    colageno, y donde dicho metodo comprende el uso de un anticuerpo anti-STRO-1 para aislar la celula madre de una muestra de tejido de ligamento periodontal.
25. 25. El metodo de la reivindicacion 24, que comprende tambien el posterior almacenamiento de la celula madre.
26. 26. El metodo de la reivindicacion 24 o 25 que comprende tambien el cultivo de la celula madre en un medio de cultivo tisular.
27. 27. El metodo de la reivindicacion 26, donde el medio de cultivo tisular incluye suero.
28. 28. El metodo de la reivindicacion 26 o 27, donde el medio de cultivo tisular incluye uno o mas factores de crecimiento.
29. 29. El metodo de la reivindicacion 28, que comprende tambien la criopreservacion del ligamento periodontal antes de aislar la celula madre.
30. 30. El metodo de la reivindicacion 29, donde el paso de criopreservacion comprende la inmersion de una porcion del ligamento periodontal en suero que contiene un 1-20% de dimetilsulfoxido y la congelacion rapida del ligamento.
31. 31. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, donde el paso de aislar la celula madre comprende la descongelacion del ligamento, la digestion o disrupcion mecanica del ligamento para formar una suspension de celulas individuales y la introduccion de la suspension en un recipiente para el cultivo tisular, en presencia de un medio de cultivo tisular.
32. 32. El metodo de la reivindicacion 31, donde el medio de cultivo tisular es un medio de celulas madre.
33. 33. Un metodo para criopreservar una celula madre multipotente postnatal aislada de ligamento periodontal clonogenico, donde la celula madre expresa STRO-1 y MUC18, donde la celula madre es capaz de diferenciarse en un cementoblasto, un cementocito, un adipocito y una celula formadora de fibra del colageno, y donde dicho metodo comprende la inmersion de una porcion del ligamento periodontal aislado en suero que contiene un 1-20% de dimetilsulfoxido y la congelacion rapida del ligamento, particularmente donde la celula madre es tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.