KR100645843B1 - 에리트로포이에틴 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴 당단백질을 포함하는, 폴리(에틸렌 글리콜)과 에리트로포이에틴의 접합체에 관한 것으로, 이때 상기 에리트로포이에틴 당단백질은 N-말단 α-아미노기를 갖고; 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 가지며; 인간 에리트로포이에틴, 및 1 내지 6개의 글리코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 N-말단 α-아미노기와 아미드 결합을 형성하는 화학식 -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(여기서, R은 저급 알킬이고, x는 2 또는 3이고, m은 약 450 내지 약 1,350임)의 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 -CO에 의해 상기 화학식의 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 공유결합된다.

Description

에리트로포이에틴 접합체{ERYTHROPOIETIN CONJUGATES}
적혈구 생성(erythropoiesis)은 세포 파괴를 보충하기 위해 발생하는 적혈구의 생산이다. 적혈구 생성은 충분한 적혈구 세포가 적절한 조직 산소공급에 이용되게 하는 제어된 생리 기작이다. 자연적으로 발생하는 인간 에리트로포이에틴(EPO)은 신장에서 생산되고, 적혈구 생산을 자극하는 체액 혈장 인자이다(문헌[Carnot, P. and Deflandre, C., C.R. Acad. Sci. 143: 432 (1906)], [Erslev, A.J., Blood 8: 349 (1953)], [Reissmann, K.R., Blood 5: 372 (1950)], [Jacobson, L.O., Goldwasser, E., Freid, W. and Plzak, L.F., Nature 179: 6331-4 (1957)]). 자연적으로 발생하는 EPO는 골수에서 수임 적혈구 선구물질의 분열 및 분화를 자극하고, 적혈구 전구체 상의 수용체와 결합함으로써 생물학적 활성을 나타낸다(문헌[Krantx, B.S., Blood 77: 419(1991)]).
에리트로포이에틴은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생합성적으로 제조되었고(문헌[Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)]), 중국산 햄스터 난소 조직 세포(CHO 세포)에 삽입되어 발현된 클로닝된 인간 EPO 유전자의 산물이다. 우세하고 완전히 가공된 형태의 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 일차구조는 도 1에 예시되어 있다. Cys7과 Cys161 및 Cys29과 Cys33 사이에 두 개의 이황 가교가 존재한다. 당 부분이 없는 EPO의 폴리펩티드 쇄의 분자량은 18,236Da이다. 완전한 EPO 분자에서, 단백질 상의 글리코실화 부위에서 그 단백질을 글리코실화시키는 탄수화물 기는 분자량의 약 40%를 차지한다(문헌[Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A. and Fukuda, M., J. Biol. Chem. 262: 12059 (1987)]).
인간 에리트로포이에틴은 적혈구 형성에 필수적이기 때문에, 상기 호르몬은 낮은 적혈구 생성 또는 결손 적혈구 생성에 의해 특징지어지는 혈액질환의 치료에 유용하다. 임상적으로, EPO는 만성 신부전(CRF) 환자의 빈혈 치료(문헌[Eschbach, J.W., Egri, J.C., Downing, M.R. et al., NEJM 316: 73-78 (1987)], [Eshcbach, J.W., Abdulhadi, M.H., Browne, J.K. et al., Ann. Intern. Med. 111: 992 (1989)], [Egrie, J.C., Eschbach, J.W., McGuire, T. and Adamson, J.W., Kidney Intl. 33: 262 (1988)], [Lim, V.S., Degowin, R.L., Zavala, D. et al., Ann. Intern. Med. 110: 108-114 (1989)]) 및 화학요법을 받는 AIDS 및 암 환자의 빈혈 치료(문헌[Danna, R.P., Rudnick, S.A., Abels, R.I. In: MB, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p. 301-324])에 사용된다. 그러나, EPO와 같은 시판되는 단백질 치료제의 생체 이용률은 그의 짧은 플라즈마 반감기 및 프로테아제 분해에 대한 민감성에 의해 제한된다. 따라서, 예를 들어 페길레이트화된 EPO 유도체가 이들 단점을 극복하기 위해 제안되었다.
페길레이트화된 단백질에 대한 통상적인 경로는 모노- 및 올리고-페길레이트화된 단백질의 혼합물을 생성한다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 화합물은 단백질 표면상의 이용가능한 반응기의 양 및 반응성에 따라 단백질의 몇몇 위치에 결합된다. 이러한 혼합물은 심각한 결함을 나타낼 수 있는데, 즉 PEG는 단백질 특이적 수용체와 상호작용하고, 결과적으로 치료학적 효능을 감소시키거나 심지어 억제하는 위치에 결합될 수 있다. 이 단점을 해결하기 위해, 이러한 혼합물의 활성 성분의 분리 및 정제, 또는 상기 혼합물의 형성을 피하기 위한 선택적인 합성 경로가 요구된다. 혼합물의 임의의 형성을 확실히 피하면, 본질적으로 고 수율로 단일 위치 이성질체의 면에서 순수한 활성 약학 성분을 수용하기 쉬워진다. PEG-단백질 혼합물의 위치 이성질체의 분리는 생산 규모로 통상적인 도구를 사용하여서는 불가능할 수 있다.PEG-단백질 혼합물은 국제 공개 공보 WO 00/32772 호, WO 97/03106 호 및 WO 00/42175 호에 언급되어 있다. WO 00/32772 호는 중합체 유도되고 비글리코실화된 에리트로포이에틴 화합물, 및 연결기가 없는 알데하이드 변형 방법의 사용을 포함하는 이들 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. WO 97/03106 호에는 생물공학적 용도, 예를 들어 단백질 접합체를 생산하기 위한 숙신이미딜에스테르의 용도를 위한 프로피온산 또는 부탄산으로 일치환된 폴리(에틸렌 글리콜) 및 관련된 중합체, 및 작용성 유도체를 개시하고 있다. WO 00/42175 호는 유리 시스테인을 갖는 가용성 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법에서는 숙주 세포를 시스테인 차단제에 노출시킨다. 이어서, 상기 방법에 의해 제조된 가용성 단백질은 변형되어 이들의 효율을 증가시킬 수 있다. 이러한 변형은 PEG 잔기를 부착시켜 페길레이트화된 단백질을 형성하는 것을 포함한다.
재조합으로 생산된 폴리펩티드의 선택적인 변형을 위한 몇몇 방법이 제안되어 왔다.
유럽 특허출원 EP 651,761 호에는 말단 α-탄소 반응기에서의 재조합으로 생산된 폴리펩티드의 선택적인 변형이 개시되어 있다. 이 방법의 제 1 단계는 생물학적으로 첨가된 보호기를 갖는 말단 α-탄소 반응기에서 보호되도록 재조합으로 생산된 폴리펩티드를 형성하는 것이다. 생물학적으로 첨가된 보호기는 바람직하게는 효소적으로 또는 화학적으로 절단될 수 있는 하나 이상의 부위를 포함하고, 바람직하게는 목적하는 폴리펩티드의 서열에 존재하지 않는 서열을 갖는 아미노산, 펩티드 및/또는 폴리펩티드이다. 일단 형성되면, 생물학적으로 보호된 폴리펩티드를 화학 보호제와 반응시켜 측쇄 기를 보호하고, 이어서 생물학적으로 첨가된 보호기에 특이적인 절단 시약으로 절단한다. 이들 수단에 의해, 보호되지 않은 N-말단 아미노기 및 보호된 측쇄 반응기를 갖는 폴리펩티드가 생산된다. 보호되지 않은 N-말단 아미노기를 변형제로 변형시켜 N-말단 변형되고 측쇄 보호된 폴리펩티드를 형성한다. 이어서, 이를 탈보호하여 N-말단 변형된 폴리펩티드를 형성한다. EP 651,761 호에는 아미노산의 임의의 서열은 생물학적으로 첨가된 보호기로서 부착될 수 있다는 것이 교시되어 있다. 그러나, 포유동물 발현 시스템에서 EPO는 가공된 성숙한 EPO를 수득하기 위해 신호 펩티다제에 의해 절단되는 선도 신호 서열과 함께 발현된다. 이러한 신호 펩티다제는 P1' 및 P3' 절단 부위에 있는 제한된 아미노산 잔기만을 인식한다(문헌[R.E. Dalbey et al. Protein Sci. 6, 1129 (1997)]). 결과적으로, 생물학적으로 첨가된 보호 펩티드는 신호 서열의 절단을 위한 3개 이상의 아미노산의 N-말단 아미노산 서열, 이어서 보호기의 효소적 또는 화학적 제거를 위한 하나의 아미노산 서열로부터 구성되어야 한다. 신호 펩티다제 및 절단 프로테아제 모두의 인식 서열이 동일하거나 밀접하게 관련된 경우, 생물학적으로 첨가된 보호기의 서열은 소수의 아미노산으로 감소될 수 있다.
또한, N-말단 선택적 변형은 알데하이드(또는 케톤)-작용화 표적 거대분자에 대한 화학선택적 연결에 의해 달성되었다(EP 788,375 호 및 문헌[Gaertner, H.F., Offord, R.E., Bioconjugate Chem., 7(1), 38-44 (1996)]). 그러나, 이 방법은 N-말단 세린 또는 트레오닌에만 작용한다.
N-말단 알라닌에서의 선택적 변형은 피루베이트로의 알라닌의 트랜스아민화에 의해 증명되었다(EP 964,702 호 및 EP 605,963 호). 이 방법의 단점은 형성된 EPO 유도체가 감소된 생체외 활성을 나타낸다는 것이다. 형질전환제인 Cu2+/글리옥실산/NaOAc도 또한 EPO 분자내에서 부반응을 생성할 수 있다.
부위 특이적 N-말단 변형은 또한 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체의 트랜스글루타미나제 매개 혼입에 의해 나타났다(문헌[Sato, H., Yamamoto, K, Hayashi, E, Takahara, Y, Bioconjugate Chem. 11(4), 502-509 (2000)]). 그러나, 이 방법은 낮은 수율만을 나타내고, N-말단에 펩티드 태그의 혼입을 필요로 하며, 따라서 폴리펩티드 구조를 변형시킨다.
글리옥실릴계 라벨링 시약을 사용한 변형도 또한 선택적 N-말단 변형을 가능하게 하지만(문헌[Zhao, Z.G., Im, J.S., Clarke, D.F., Bioconjugate Chem. 10, 424-430 (1999)]), 시스테인에 제한된다.
도 1은 인간 EPO(165 아미노산)의 일차구조이다.
도 2는 인간 EPO(166 아미노산)의 일차구조이다.
도 3은 일차구조 및 APPRIEGR-EPO의 상응하는 핵산 서열이다. 밑줄 친 아미노산 서열은 분비 신호 서열에 상응하고, 파선은 단백질 분해성 절단 부위에 특이적인 아미노산 서열에 상응한다.
도 4는 일차구조 및 APP-EPO의 상응하는 핵산 서열이다. 밑줄 친 아미노산 서열은 분비 신호 서열에 상응하고, 파선은 단백질 분해성 절단 부위에 특이적인 아미노산 서열에 상응한다.
도 5는 일차구조 및 APPGAAHY-EPO의 상응하는 핵산 서열이다. 밑줄 친 아미노산 서열은 분비 신호 서열에 상응하고, 파선은 단백질 분해성 절단 부위에 특이적인 아미노산 서열에 상응한다.
본 발명은 에리트로포이에틴 접합체를 제공하는데, 이때 상기 접합체는 N-말단 α-아미노기를 갖고, 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 가지며, 인간 에리트로포이에틴, 및 1 내지 6개의 글리코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 에리트로포이에틴 당단백질을 포함하고; 이때 상기 당단백질은 상기 N-말단 α-아미노기와 아미드 결합을 형성하는 화학식 -CO-(CH2)x-(OCH2CH2 )m-OR(여기서, R은 저급 알킬이고, x는 2 또는 3이고, m은 약 450 내지 약 1,350임)의 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 -CO에 의해 상기 화학식의 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 공유결합된다.
변형되지 않은 EPO(즉, PEG가 부착되지 않은 EPO) 및 통상적인 PEG-EPO 접합체에 비해, 본 발명의 접합체는 증가된 순환 반감기 및 플라즈마 체류 시간, 감소된 제거율 및 증가된 생체내 임상 활성을 갖는다. 본 발명의 접합체는 EPO와 동일한 용도를 갖는다. 특히, 본 발명의 접합체는 EPO를 사용하여 환자를 치료하는 동일한 방식으로 골수에서 수임 적혈구 선구물질의 분열 및 분화를 자극함으로써 환자를 치료하는데 유용하다.
본 발명은 에리트로포이에틴 접합체를 제공하는데, 이때 상기 접합체는 N-말단 α-아미노기를 갖고, 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 가지며, 인간 에리트로포이에틴, 및 1 내지 6개의 글리코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 에리트로포이에틴 당단백질을 포함하고; 이때 상기 당단백질은 상기 N-말단 α-아미노기와 아미드 결합을 형성하는 화학식 -CO-(CH2)x-(OCH2CH2 )m-OR(여기서, R은 저급 알킬이고, x는 2 또는 3이고, m은 약 450 내지 약 1,350이며, 즉 m은 접합체의 분자량에서 에리트로포이에틴 당단백질을 뺀 분자량이 약 20 내지 60kDa(킬로달톤)가 되도록 선택됨)의 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 -CO(즉, 카보닐)에 의해 상기 화학식의 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 공유결합된다.
본 발명의 접합체는 변형되지 않는 EPO와 동일한 방식으로 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 본 발명의 접합체는 증가된 순환 반감기 및 플라즈마 체류 시간, 감소된 제거율 및 증가된 생체내 임상 활성을 갖는다. 개선된 이들 특성으로 인해, 본 발명의 접합체는 변형되지 않는 EPO의 경우 주 3회 투여하는 대신에 주 1회 투여될 수 있다. 투여 회수가 감소되면 환자 순응이 개선되어 치료 결과를 향상시키고 환자의 삶의 질을 향상시키는 것으로 기대된다. 폴리(에틸렌 글리콜)에 결합된 EPO의 통상적인 접합체에 비해, 본 발명의 접합체의 분자량 및 연결기 구조를 갖는 접합체는 향상된 효능, 안정성, 곡선하의 면적(area under the curve, AUC) 및 순환 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다.
"N-말단 α-아미노기"란 용어는 펩티드의 N-말단 아미노 잔기, 즉 유리 α-아미노(NH2-)기를 갖는 아미노산을 갖는 펩티드 또는 단백질 쇄의 말단을 지칭한다.
"에리트로포이에틴" 또는 "EPO"란 용어는 도 1(서열번호: 1) 또는 도 2(서열번호: 2), 바람직하게는 도 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 당단백질을 지칭하며, 이들의 생물학적 특성은 골수에서 적혈구 생산을 자극하고 수임 적혈구 선구물질의 분열 및 분화를 자극하는 것과 관련이 있다. 본원에서 사용된 이들 용어는, 예를 들어 부위 지정 돌연변이(site directed mutagenesis) 또는 자연발생적 돌연변이(accidentally through mutation)에 의해 의도적으로 변형된 단백질을 포함한다. 이들 용어는 또한 글리코실화를 위한 1 내지 6개의 추가의 부위를 갖는 유사체, 당단백질의 카르복실 말단에 하나 이상의 추가의 아미노산을 갖고 추가의 아미노산이 1 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 유사체, 및 1 이상의 글리코실화 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체를 포함한다. 이들 용어는 천연 인간 에리트로포이에틴 및 재조합으로 생성된 인간 에리트로포이에틴 모두를 포함한다.
"중간체 EPO"란 용어는 N-말단 연장 서열을 갖는 에리트로포이에틴 당단백질 유도체를 지칭한다. 바람직하게는, 아미노산 연장 서열은 분비 신호 서열, 선택적으로 정제 태그(예를 들어, 히스티딘 태그)(예를 들어, 문헌[H.M. Sassenfeld, Trends in Biotechnol. 8, 88-93 (1990)]에 기술된 바와 같음), 이어서 하기에서 정의된 바와 같은 에리트로포이에틴 당단백질 아미노산 서열이 다음에 오는 단백질의 소화를 위한 효소 인식 서열을 포함한다.
"변형된 EPO"란 용어는 분비 신호가 절단되어 EPO 당단백질을 형성하는 중간체 EPO, 예를 들어 단백질 분해성 절단 부위, 예를 들어 서열 APPRIEGR(즉, APPRIEGR-EPO(서열번호: 3), APP(즉, APP-EPO(서열번호: 4), APPGAAHY(즉, APPGAAHY-EPO(서열번호: 5) 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열(도 3 내지 도 5도 참조)에 의해 N-말단에서 연장된 중간체 EPO를 지칭한다.
"보호되고 변형된 EPO"란 용어는 화학 보호제에 의한 ε-아미노기의 아실화, 예를 들어 시트라코닐화에 의해 수용되는 변형된 EPO를 지칭한다.
"보호된 EPO"란 용어는 보호되고 변형된 EPO의 단백질 분해성 절단 이후에 수득되는 EPO 유도체, 즉 ε-아미노기가 유리 N-말단 α-아미노기를 갖는 화학적 보호제를 사용하여 변형된 EPO를 지칭한다.
"상동성인 아미노산 서열"이란 용어는 상응하는 아미노산 서열이 상응하는 단백질 분해성 절단 서열 또는 도 1 또는 도 2에 나타낸 상응하는 에리트로포이에틴 아미노산과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 목적하는 생물학적 활성(상응하는 프로테아제에 의해 절단되거나 명세서 및 특허청구범위에서 정의된 바와 같은 페길레이트화된 에리트로포이에틴 화합물의 경우에 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 가짐)을 나타낸다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상동성은 90%이고, 더욱 바람직하게는 95%이다.
본 발명의 에리트로포이에틴 접합체는 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:
P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
상기 식에서,
x, m 및 R은 상기에서와 같다. 화학식 I에서, P는 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 본원에서 기술된 에리트로포이에틴 당단백질의 잔기(즉, 화학식 I에서 나타낸 카보닐과 아미드 결합을 형성하는 N-말단 α-아미노기가 없음)이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, R은 메틸이다. 바람직하게는, m은 약 550 내지 약 1,000이고, 더욱 바람직하게는 약 650 내지 약 750이다.
본 발명의 가장 바람직한 실시태양에서, R은 메틸이고, m은 약 650 내지 약 750이며, 즉 상기에서 정의된 바와 같은 접합체는 화학식 CH3O(CH2CH2O) mCH2CH2CH2CO-NH-P(여기서, M은 650 내지 750이고, P는 상기에서 정의된 바와 같음)를 갖는다. 바람직하게는, m은 약 730의 평균을 갖는다.
바람직하게는, 상기에서 정의된 바와 같은 접합체의 당단백질은 인간 에리트로포이에틴이다. 상기 인간 에리트로포이에틴 및 유사 단백질은 내생 유전자 활성화에 의해 발현될 수 있다. 바람직한 인간 에리트로포이에틴 당단백질은 도 1 또는 도 2에 나타나 있고, 가장 바람직하게는, 도 1에 나타낸 인간 에리트로포이에틴 당단백질이다.
또한, P는 인간 에리트로포이에틴 및 1 내지 6개의 추가의 글리코실화 부위를 갖는 그의 유사체의 잔기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하기에서 상세하게 기술된 바와 같이, EPO의 제조 및 정제는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. EPO는, 천연 또는 재조합 세포를 사용한 조직, 단백질 합성, 세포 배양과 같은 임의의 통상적인 공급원으로부터 수득되는, 천연 또는 재조합 단백질, 바람직하게는 인간 단백질을 의미한다. 뮤테인 또는 달리 변형된 단백질과 같은 EPO의 활성을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 재조합 EPO는 재조합 DNA 기술 또는 내생 유전자 활성화에 의해 CHO, BHK, COS, HeLa 또는 PER.C6 세포주, 또는 동물 또는 인간 기원의 기타 적절한 세포주에서의 발현을 통해 제조할 수 있다. 내생 유전자 활성화에 의한 단백질(EPO를 포함함)의 발현은 당해 기술분야에 널리 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제 5,733,761 호, 제 5,641,670 호 및 제 5,733,746 호, 및 국제 공개 공보 제 WO 93/09222 호, 제 WO 94/12650 호, 제 WO 95/31560 호, 제 WO 90/11354 호, 제 WO 91/06667 호 및 제 WO 91/09955 호에 개시되어 있다(이들 각각의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있음). 에리트로포이에틴 당단백질 생성물의 제조에 바람직한 EPO 종은 인간 EPO 종이다. 더욱 바람직하게는, EPO 종은 도 1 또는 도 2, 더욱 바람직하게는 도 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 EPO이다.
한 실시태양에서, P는 1 내지 6개의 추가의 글리코실화 부위를 갖는 당단백질 유사체의 잔기일 수 있다. 하나 이상의 올리고당 기를 갖는 단백질의 글리코실화는 폴리펩티드 주쇄를 따라 특정의 위치에서 발생하고, 단백질의 안정성, 분비, 아세포 배치 및 생물학적 활성과 같은 단백질의 물리적 특성에 큰 영향을 미친다. 글리코실화는 통상적으로 2개의 유형이 존재한다. O-결합된 올리고당은 세린 또는 트레오닌 잔기에 결합하고, N-결합된 올리고당은 아스파라긴 잔기에 결합한다. N-결합 및 O-결합된 올리고당 모두에서 발견되는 올리고당의 한가지 유형은 9개 이상의 탄소 원자를 함유하는 아미노당의 일종인 N-아세틸뉴라민산(시알산)이다. 시알산은 통상적으로 N-결합 및 O-결합된 올리고당 모두에 존재하는 말단 잔기이고, 이는 음전하를 갖기 때문에 당단백질에 산성 특성을 부여한다. 165개의 아미노산을 갖는 인간 에리트로포이에틴은 당단백질의 전체 분자량의 약 40%를 구성하는 3개의 N-결합 및 1개의 O-결합된 올리고당 쇄를 함유한다. N-결합된 글리코실화는 24, 38 및 83번 위치에 위치한 아스파라긴 잔기에서 발생하고, O-결합된 글리코실화는 126번 위치에 위치한 세린 잔기에서 발생한다. 올리고당 쇄는 말단 시알산 잔기로 변형된다. 글리코실화된 에리트로포이에틴으로부터 모든 시알산을 효소적으로 제거하면, 에리트로포이에틴의 시알릴화가 간 결합 단백질에 의해 그의 결합 및 후속적인 제거를 방해하기 때문에 생체내 활성을 잃지만 생체외 활성은 잃지 않는다.
본 발명의 당단백질은 시알산 부착 부위의 수를 증가시키는 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열의 하나 이상의 변화를 갖는 인간 에리트로포이에틴의 유사체를 포함한다. 이들 당단백질 유사체는 글리코실화에 이용가능한 부위를 증가시키거나 변화시키는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 갖는 부위 지정 돌연변이에 의해 생성할 수 있다. 인간 에리트로포이에틴에서 발견되는 것 보다 더 많은 양의 시알산을 갖고 있는 당단백질 유사체는 생물학적 활성에 필요한 일차구조 또는 삼차구조를 방해하지 않는 글리코실화 부위를 부가함으로써 생성된다. 본 발명의 당단백질은 N-결합 또는 O-결합된 부위에 인접한 하나 이상의 아미노산의 치환을 통상적으로 포함하는, 글리코실화 부위에서의 탄수화물 부착점이 증가한 유사체를 또한 포함한다. 본 발명의 당단백질은 에리트로포이에틴의 카르복실 말단으로부터 연장되고, 하나 이상의 추가의 탄수화물 부위를 제공하는 하나 이상의 아미노산을 갖는 유사체를 또한 포함한다. 본 발명의 당단백질은 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체를 또한 포함한다. 이러한 글리코실화 부위의 재배열은 인간 에리트로포이에틴에서 하나 이상의 글리코실화 부위의 결실 및 하나 이상의 비천연적으로 발생하는 글리코실화 부위의 부가를 포함한다. 에리트로포이에틴 상의 탄수화물 쇄의 수를 증가시켜 에리트로포이에틴 분자당 시알산의 수를 증가시키면, 용해도의 증가, 단백질 분해에 대한 보다 큰 저항성, 면역성의 감소, 혈청 반감기의 증가 및 생물학적 활성의 증가와 같은 유리한 특성이 부여될 수 있다. 추가의 글리코실화 부위를 갖는 에리트로포이에틴 유사체는 엘리어트(Elliot)에 의해 유럽 특허출원 제 640,619 호(1995년 3월 1일자로 공개됨)에 보다 상세하게 개시되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 당단백질은 하기로부터 선택된 변형에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 포함하는 에리트로포이에틴(이에 제한되지는 않음)과 같은, 하나 이상의 추가의 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
아미노산 서열의 변형에 대해 본원에서 사용된 표시법은 위첨자의 번호(들)로 표시된 대응하는 변형되지 않은 단백질(예를 들어, 도 1 및 도 2의 hEPO)의 위치(들)가 각각의 위첨자의 번호(들)에 바로 선행하는 아미노산(들)으로 변경된다는 것을 의미한다.
당단백질은 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체일 수도 있다. 재배열은 인간 에리트로포이에틴에서 임의의 N-결합된 탄수화물 부위의 결실 및 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열의 88번째 위치에서 N-결합된 탄수화물 부위의 부가를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 당단백질은 Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser 87 Asn88 Thr90 EPO; 및 Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO로 이루어진 군으로부터 선택된 유사체이다.
본원에서 사용된 "저급 알킬"이란 용어는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. 저급 알킬기의 예는 메틸, 에틸 및 이소프로필을 포함한다. 본 발명에 따라, R은 임의의 저급 알킬이다. R이 메틸인 접합체가 바람직하다.
"m"이란 부호는 폴리(에틸렌 옥사이드) 기중의 에틸렌 옥사이드 잔기(OCH2CH2)의 수를 나타낸다. 에틸렌 옥사이드의 단일 PEG 소단위는 약 44Da의 분자량을 갖는다. 따라서, 접합체의 분자량(EPO의 분자량을 제외함)은 "m" 값에 의존한다. 본 발명의 접합체에서, "m"은 약 450 내지 약 1,350(약 20 내지 약 60kDa의 분자량에 대응함), 바람직하게는 약 650 내지 약 750(약 30kDa의 분자량에 대응함), 가장 바람직하게는 약 730이다. "m" 값은 얻어진 본 발명의 접합체가 변형되지 않은 EPO에 필적하는 생리적 활성(이 활성은 변형되지 않은 EPO의 대응하는 활성과 동일한 활성, 보다 큰 활성 또는 활성의 일부를 나타낼 수 있음)을 갖도록 선택된다. "약" 특정 값의 분자량은 이것이 통상적인 분석 기술에 의해 결정된 값의 합리적인 범위내에 있다는 것을 의미한다. "m" 값은 에리트로포이에틴 당단백질에 공유결합된 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 분자량이 약 20 내지 약 60kDa, 바람직하게는 약 32kDa이 되도록 선택된다.
상기 화합물의 제조 방법의 단계는 단일 복사 에리트로포이에틴 당단백질이 N-말단 α-아민에서 하나 이상이 생물학적으로 첨가된 보호기에 의해 보호되도록 재조합 단일 복사 에리트로포이에틴 당단백질 또는 이의 일부를 형성하는 것을 포함한다. 이어서, 재조합 에리트로포이에틴을 보호제와 반응시켜 반응성 측쇄 아미노기를 선택적으로 보호하고, 이로써 아미노 측쇄 기가 페길레이트화 시약에 의해 변형되지 않게 할 수 있다. 에리트로포이에틴 당단백질을 생물학적 보호기에 특이적인 하나 이상의 절단 시약으로 절단하여 보호되지 않은 말단 아미노산 α-탄소 반응성 아미노기를 형성할 수 있다. 보호되지 않은 말단 아미노산 α-탄소 반응성 아미노기를 페길레이트화 시약으로 변형시킬 수 있다. 이어서, 측쇄 보호되고 말단 변형된 에리트로포이에틴 당단백질을 측쇄 기에서 탈보호하여 말단 변형(페길레이트화)된 재조합 에리트로포이에틴 당단백질을 형성한다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 단백질 분해성 절단 부위를 포함하는 N-말단 펩티드성 연장 서열을 포함하는 재조합 EPO 단백질의 발현, 및 바람직하게는 무혈청 발효,
b) ε-아미노기의 보호,
c) N-말단 펩티드성 연장 서열의 단백질 분해성 절단,
d) N-말단 α-아미노기의 페길레이트화,
e) 에리트로포이에틴 당단백질의 ε-아미노기의 탈보호, 및
f) 선택적으로, 상기 각각의 단계를 수행한 후의 정제 단계.
본 발명은 또한 재조합 EPO가 도 1 내지 도 5에서 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 상기 방법에 관한 것이다. ε-아미노기는 시트라코닐화에 의해 보호될 수 있고, N-말단 α-아미노기는 하기 화학식 II의 화합물로 페길레이트화될 수 있다:
상기 식에서,
R 및 m은 상기에서 정의된 바와 같다.
더욱 상세하게는, 상기 단계는 다음과 같이 수행될 수 있다.
A) 변형된 EPO의 발현, 발효 및 정제
EPO 및 EPO 관련 분자를 위한 클로닝 및 발현 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 인간 에리트로포이에틴(EPO)은 적혈구의 형성을 자극하는 인간 당단백질이다. 이의 제조 및 치료학적 용도는, 예를 들어 미국 특허 제 5,547,933 호, 미국 특허 제 5,621,080 호, EP-B 0 148 605 호, 문헌[Huang, S.L., Proc, Natl. Acad. Sci. USA(1984) 2708-2712], EP-B 0 205 564 호, EP-B 0 209 539 호, EP-B 0 411 678 호, 문헌[Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261(1986) 3116-3121] 및 [Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262(1987) 12059-12076]에 상세하게 기술되어 있다. 치료 용도를 위한 에리트로포이에틴은 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다(EP-B 0 148 605 호, EP-B 0 209 539 호 및 문헌[Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al., (1986) Immunobiol. 72: 213-224]).
무혈청 배지에서의 에리트로포이에틴의 발현 및 제조 방법은, 예를 들어 1996년 11월 14일자로 공개된 버그(Burg)의 WO 96/35718 및 1992년 6월 12일자로 공개된 코크(Koch)의 유럽 특허공개 제 513 738 호에 기술되어 있다. 상기의 공개공보 이외에, EPO 유전자를 함유하는 재조합 CHO 세포의 무혈청 발효를 수행할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 EP-A 0 513 738 호 및 EP-A 0 267 678 호에 기술되어 있고, 문헌[Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130(1983) 445-453], EP-A 0 248 656 호, 문헌[Kowar, J. and Franek, F., Methods in Enzymology 421(1986) 277-292], 문헌[Bavister, B., Exp. Zoology 271(1981) 45-51], EP-A 0 481 791 호, EP-A 0 307 247 호, EP-A 0 343 635 호 및 WO 88/00967에 일반적인 형태로 기술되어 있다.
에리트로포이에틴 및 이의 유도체의 정제 방법도 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다.
EP-A 0 267 678 호에는 투석 이후에 무혈청 배지에서 생성된 EPO의 정제를 위한 S-세파로스상의 이온 교환 크로마토그래피, C8 컬럼상의 제조용 역상 HPLC 및 겔 여과 크로마토그래피가 기술되어 있다. 이와 관련하여, 겔 여과 크로마토그래피 단계는 빠른 유속의 S-세파로스상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 대체될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 이전에 블루 트리스아크릴 컬럼 상의 염료 크로마토그래피를 수행할 수 있다는 것이 또한 제안되어 있다.
재조합 EPO의 정제 방법은 문헌[Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107(1990) 352-359]에 기술되어 있다. 그러나, 이 방법에서 EPO는 정제 단계 이전에 트윈(Tween, 등록상표) 20, 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 에틸말레이미드, 펩스타틴 A, 황산구리 및 옥삼산의 용액으로 처리한다. 1996년 11월 14일자로 공개된 버그의 WO 96/35718을 비롯한 간행물은 무혈청 발효 방법으로 에리트로포이에틴(EPOsf)을 제조하는 방법을 개시하고 있다.
B) 반응성 측쇄 아미노기를 선택적으로 보호하기 위한 보호제와의 반응: 보호되고 변형된 EPO의 제조
적합한 화학 보호제는 보호되지 않은 측쇄 아민에서 결합을 형성하고, N-말단에서의 결합보다 덜 안정하며, 이와는 상이하다. 다수의 화학 보호제가 공지되어 있다(예를 들어, EP 651,761 호 참조). 말레산 무수물 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 환형 디카복실산 무수물이 바람직하다.
시트라코닐화는 표적 폴리펩티드 또는 융합 단백질(본원에서 변형된 EPO로 지칭됨) 특성이 보호를 위한 약 알칼리성 조건 및 탈보호를 위한 산성 조건을 허용하는 경우에 바람직한 방법이다(문헌[Dixon, HBF; Perham, RN: Biochem. J. 109(2), 312-14(1968)] 및 문헌[Atassi, MZ, Habeeb, AFSA: Methods Enzymol. 25(Pt. B), 546-53(1972)]).
선택적으로, 보호되고 변형된 EPO는 정제된 후 다음 단계가 수행될 수 있다.
C) 보호되고 변형된 EPO의 단백질 분해성 절단: 보호된 EPO의 제조
융합 단백질을 절단하기에 적합한 프로테아제는 문헌[Carter, P: Site-specific proteolysis of fusion proteins. in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes, ACS, Washington DC, pp. 181-193 (1990)]에 기술되어 있다. 이러한 프로테아제는 이들의 인식 서열에서 선택적으로 절단하고 표적 단백질 서열에서는 어떠한 곳에서도 절단하지 않기 위해 좁은 특이성을 필요로 한다. 예로는 IEGR↓에서 절단하는 인자 Xa 및 DDDDK↓에서 절단하는 엔테로키나제가 있다. 또한, 엔테로키나제는 P1' 및 P2' 부위에서 인터루킨에 대한 특이성을 나타내는 DDDDK↓AP를 절단하는 것으로 보고되어 있다(카터(P. Carter)). 그러나, 리신의 측쇄 ε-아미노기를 보호하기 위한 화학 보호제가 도입되어야 하는 경우에 엔테로키나제는 바람직하지 않다. 이 경우, 효소는 원하는 절단 부위에서 더 이상 작용하지 않는다.
많은 것들 중에서, IgA 프로테아제는 PP↓XP(X=T, S 및 A)에서 우선적으로 절단하는데 유용하다. XP 서열은 인터루킨 및 에리트로포이에틴(EP 513,073 호)에 적합하다. 또 다른 적합한 프로테아제는 HY↓에서 절단하는 서브틸리신 BPN'(제네나제TM, 게넨코 인터네셔날 인코포레이티트(Genecor Int. Inc.))이다.
선택적으로, 보호된 EPO 단백질은 이 단계에서 정제될 수 있다.
D) 페길레이트화 시약에 의한 변형
인간 EPO는 9개의 유리 아미노기, 아미노-말단 아미노기 및 8개의 리신 잔기의 ε-아미노기를 함유한다. 페길레이트화 시약이 화학식 II의 SBA 화합물인 경우, pH 7.5, 1:3의 단백질:PEG 비 및 20 내지 25℃의 반응 온도에서 모노-, 디- 및 소량의 트리-페길레이트화된 종이 EPO와 반응하는 경우에 생산된다. 페길레이트화된 EPO는 혼합물로서 또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 상이한 페길레이트화된 종으로서 투여될 수 있다. 반응 조건(예를 들어, 시약의 비율, pH, 온도, 단백질 농도, 반응 시간 등)을 조절함으로써, 상이한 페길레이트화된 종의 상대적인 양을 변경할 수 있다.
보호된 EPO에 대해 본원에서 명시된 바와 같은 방법을 사용하면, 보호된 EPO의 N-말단 알라닌의 N-말단 α-아미노기만이 페길레이트화된다. 리신 측쇄의 모든 ε-아미노기가 보호되므로, 디- 및 올리고-페길레이트화되고 보호된 EPO는 형성되지 않는다.
상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 II의 화합물을 단계 c)의 에리트로포이에틴 당단백질과 축합반응시킴으로써 공지된 중합체성 물질로부터 제조할 수 있다:
화학식 II
상기 식에서,
R 및 m은 상기에서 기술한 바와 같다. x가 3인 화학식 II의 화합물은 폴리(에틸렌 글리콜)의 α-저급 알콕시, 부티르산 숙신이미딜 에스테르(저급 알콕시-PEG-SBA)이다. x가 2인 화학식 II의 화합물은 폴리(에틸렌 글리콜)의 α-저급 알콕시, 프로피온산 숙신이미딜 에스테르(저급 알콕시-PEG-SPA)이다. 활성화된 에스테르를 아민과 반응시켜 아미드를 형성하는 임의의 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 상기 반응에서, 예시된 숙신이미딜 에스테르는 아미드 형성을 야기하는 이탈기이다. 단백질과 접합체를 생성하기 위한 화학식 II의 화합물과 같은 숙신이미딜 에스테르의 사용은 미국 특허 제 5,672,662 호(1997년 9월 30일자로 헤리스(Harris) 등에게 허여됨)에 개시되어 있다.
페길레이트화 반응은 5㎎/㎖ 이하의 최종 단백질 농도까지 1:5(EPO 대 PEG-SBA 시약)의 몰비로 수행될 수 있다. 바람직한 페길레이트화 시약은 R이 메틸이고, x가 3이고, m이 650 내지 750(평균: 약 730, 약 32kDa의 평균 분자량에 상응함)인 화학식 II의 화합물인 메톡시 PEG-SBA이다(메톡시-PEG-SBA는 시판됨: 쉬어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers, Inc.)).
반응 혼합물로부터의 반응 생성물의 정제는 실시예에서 기술된 바와 같은 통상적인 크로마토그래피 정제에 의해 달성될 수 있다.
E) ε-아미노기(측쇄 아미노기)의 탈보호
보호제의 절단은 통상적인 방법(상기 참조)에 의해 달성될 수 있다. 탈시트라코닐화의 경우에, 단백질의 탈보호는 용액을 주위 온도에서 낮은 pH, 예를 들어 2.5에서 5시간 동안 교반함으로써 달성될 수 있다. 수산화나트륨을 사용하여 pH를 4.5로 조절함으로써 반응을 정지시키고, 정제할 준비가 될 때까지 용액을 -20℃에 냉동저장한다.
반응 혼합물로부터의 반응 생성물의 정제는 실시예에서 기술된 바와 같은 통상적인 크로마토그래피 정제에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 EPO 또는 EPO 접합체의 특이적 활성은 당해 기술분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 정제된 EPO 단백질의 생물학적 활성은 인간 환자에게 EPO 단백질을 주사로 투여했을 경우에 대상의 주사되지 않은 군, 즉 대조군과 비교해서 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키도록 하는 정도의 활성이다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 EPO 단백질 또는 이의 단편의 생물학적 활성은 문헌[Annable et al., Bull. Wld. Hlth. Org.(1972) 47, 99-112] 및 [Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997(2)]에 따른 방법에 의해 시험할 수 있다. EPO 단백질의 활성을 측정하기 위한 또 다른 생물학적 분석법인 정적혈구병(normocythaemic) 마우스 분석법은 실시예 4에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 접합체는 EPO가 투여되는 동일한 방식으로 치료학적 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료학적 유효량은 골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성에 필요한 접합체의 양이다. 접합체의 정확한 양은 치료되는 질병의 정확한 유형, 치료를 받는 환자의 상태 및 조성물중의 기타 성분과 같은 상기 인자에 종속되는 선택의 문제이다. 예를 들어, 체중 1㎏당 0.01 내지 10㎍, 바람직하게는 체중 1㎏당 0.1 내지 3㎍이, 예를 들어 주당 1회 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 상응하는 약학 조성물에 관한 것이다.
접합체를 함유하는 약학 조성물은 다양한 수단에 의해 낮거나 결핍된 적혈구 생성을 특징으로 하는 혈액 질환을 앓고 있는 인간 환자에게 투여하기에 효과적인 농도로 제제화될 수 있다. 접합체의 평균 치료학적 유효량은 변경될 수 있고, 특히 유자격 의사의 추천 및 처방을 기초로 해야 한다.
본 발명에 따라 제조된 에리트로포이에틴 당단백질 생성물은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 담체 및 비히클을 주사하기에 적합한 약학 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 적절한 조성물은 WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 및 WO 99/07401에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 강장제, 예를 들어 132mM 염화나트륨을 포함하는 pH 7의 10mM 인산나트륨/인산칼륨 완충액으로 제제화될 수 있다. 선택적으로, 약학 조성물은 본존제를 함유할 수도 있다. 약학 조성물은 상이한 양의 에리트로포이에틴, 예를 들어 10 내지 10,000㎍/㎖, 예를 들어 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖를 함유할 수 있다.
바람직하게는, 약학 조성물은 상기 접합체, 용액 pH를 약 5.5 내지 약 7.0의 범위로 유지하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 완충액중의 다중 하전된 무기 음이온, 및 선택적으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 예를들어 조성물은 약 10 내지 약 10,000㎍/㎖의 에리트로포이에틴 단백질, 10 내지 200mmol/ℓ의 황산, 약 10 내지 약 50mmol/ℓ의 인산염(pH 6.0 내지 6.5), 선택적으로 1mM 이하의 CaCl2 및 선택적으로 약 1 내지 5%의 폴리올을 포함한다. 적합한 조성물의 예는 다음과 같다:
a) 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ 에리트로포이에틴 접합체, 10mM 인산나트륨/인산칼륨, 100mM NaCl(pH 7.0),
b) 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ 에리트로포이에틴 접합체, 10mM 인산나트륨, 120mM 황산나트륨(pH 6.2),
c) 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ 에리트로포이에틴 접합체, 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3% 만니톨(pH 6.2)
d) 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ 에리트로포이에틴 접합체, 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3% 만니톨, 7.5μM CaCl2(pH 6.2),
e) 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ 에리트로포이에틴 접합체, 50mM 아르기닌, 100mM 황산나트륨, 1mM CaCl2(pH 6.2), 및
f) 50㎍/㎖ 또는 400㎍/㎖ 에리트로포이에틴 접합체, 50mM 아르기닌, 30mM 황산나트륨, 3% 만니톨, 1mM CaCl2(pH 6.2).
또 다른 바람직한 조성물은 10 내지 10,000㎍/㎖의 에리트로포이에틴, 바람직하게는 25 내지 2,500㎍/㎖의 에리트로포이에틴, 및
(a) 10mM 인산나트륨/인산칼륨, 100mM NaCl(pH 7.0),
(b) 10mM 인산나트륨, 120mM 황산나트륨(pH 6.2),
(c) 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3%(중량/부피)의 만니톨(pH 6.2),
(d) 10mM 인산나트륨, 30mM 황산나트륨, 3%(중량/부피) 만니톨, 10mM 메티오닌, 0.01%(중량/부피) 플루로닉 F68(pH 6.2),
(e) 40mM 아르기닌, 40mM 황산나트륨, 3%(중량/부피) 만니톨(pH 6.2), 또는
(f) 40mM 아르기닌, 30mM 황산나트륨, 3%(중량/부피) 만니톨, 10mM 메티오닌, 0.01%(중량/부피) 플루로닉 F68(pH 6.2)을 포함한다.
가장 바람직한 실시태양에서, 조성물은 에리트로포이에틴 단백질을 50, 100, 400, 800 또는 2,500㎍/㎖의 양으로 포함한다. 가장 바람직한 조성물은 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3%(중량/부피) 만니톨, 10mM 메티오닌, 0.01%(중량/부피) 플루로닉 F68(pH 6.2)을 포함하거나 40mM 아르기닌, 30mM 황산나트륨, 3%(중량/부피) 만니톨, 10mM 메티오닌, 0.01%(중량/부피) 플루로닉 F68(pH 6.2)을 포함한다.
본 발명의 접합체는 만성 신부전(CRE) 환자의 빈혈과 관련된 질병 및 AIDS의 치료 또는 예방, 및 화학요법을 받고 있는 암 환자의 치료에 유용한 약제를 제조하기에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 약제의 제조, 특히 만성 신부전(CRE) 환자의 빈혈과 관련된 질병 및 AIDS의 치료 또는 예방, 및 화학요법을 받고 있는 암 환자의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시태양은 상기 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 신부전(CRE) 환자의 빈혈과 관련된 질병, AIDS 및 화학요법을 받고 있는 암 환자의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 만성 신부전(CRE) 환자의 빈혈과 관련된 질병, AIDS 및 화학요법을 받고 있는 암 환자의 치료를 위한 상기한 바와 같은 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 바와 같은 방법에 의해 제조된 상기 화합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 단백질 분해성 절단 부위를 나타내는 N-말단 펩티드 연장 서열을 가지며, 선택적으로 N-말단 정제 태그를 포함하는 도 1 및 도 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 에리트로포이에틴 당단백질에 관한 것이다. 이들 펩티드의 예로는 APPRIEGR-EPO, APP-EPO 및 APPGAAHY-EPO가 있다(도 3 내지 도 5도 또한 참조). 본 발명의 한 실시태양은 도 3 내지 도 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 에리트로포이에틴 당단백질에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 발명을 예시하지만 제한하지는 않는 하기 실시예를 참고로 하면 좀 더 충분히 이해될 것이다.
실시예 1: 변형된 EPO의 발현, 발효 및 정제
(1) 변형된 EPO 구조체의 발현
a) 시약
달리 언급하지 않으면, 사용된 모든 생화학 시약은 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH, 독일 맨하임 소재)사의 것이고, 모든 세포 배양 시약은 깁코(Gibco)-BRL(독일 에겐스타인 소재)의 것이다.
b) 야생형 EPO 발현 구조체의 클로닝
차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포에서 안정하게 발현시키기 위해, pcDNA3(인비트로겐(Invitrogen) BV, 네덜란드 그로닌겐 소재), pCI-neo(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)와 같은 표준 진핵 발현 벡터는 G418-저항성을 위해 코딩된 neo 유전자로 마우스 데하이드로폴레이트 환원효소(DHFR, 문헌[Crouse et al. J. Biol. Chem. 257, 7887-7897 (1982)])를 치환함으로써 변형되었는데, 이 유전자의 발현량은 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터 및 말기 폴리아데닐화 신호에 의해 조절된다. pcDNA3의 경우에, 얻어진 벡터는 p.11381로 명명되었다(문헌[(M. Tacke et al. Hepatology 26, 1626-1633 (1997)]).
야생형 에리트로포이에틴 코딩 단편은 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌[Jacobs K. et al., Nature 313, 806-10 (1985)]에 기술된 방법에 따라 수득될 수 있다. 바람직하게는, 코딩 단편은 프라이머 EPO-EcoRI 5'-GAGCCTGAATTCACCACC 및 EPO-SalI 5'-AGGTGGGTCGACCTGGTCATCTGTCCCCTG를 사용하여 증폭된다. PCR 단편은 EcoRI 및 SalI(이 부위는 프라이머 서열에서 밑줄 쳐 있음)에 의해 절단되고, 미리 절단된 pCI-dhfr 벡터 단편의 다중 클로닝 부위내로 클로닝되었다. 따라서, EPO 유전자의 발현은 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 중간-초기 증폭 유전자/프로모터 영역, 조절된 발현의 최적화된 키메릭 인트론 및 SV40 말기 폴리아데닐화 신호의 조절을 받는다.
c) APPRIEGR-EPO 발현 구조체의 클로닝
APPRIEGR 펩티드는 2개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드(APPRIEGRfor, 5'-CGCCCCCCCCCGAATCGAGGGCCG 및 APPRIEGRrev, 5'-CGCGGCCCTCGATTCGGGGGGGGG)(NarI 부위의 잔류물은 밑줄 쳐 있음)에 의해 NarI DNA 단편으로서 조립되고, N-말단 신호 서열과 성숙한 EPO 코딩 영역 사이에 클로닝되었다.
d) APP-EPO 발현 구조체의 클로닝
APP 펩티드는 2개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드(APPfor, 5'-CGCCCCCCC 및 APPrev, 5'-CGGGGGGGG)(NarI 부위의 잔류물은 밑줄 쳐 있음)에 의해 NarI DNA 단편으로서 조립되고, N-말단 신호 서열과 성숙한 EPO 코딩 영역 사이에 클로닝되었다.
e) APPGAAHY-EPO 발현 구조체의 클로닝
APPGAAHY 펩티드는 2개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드(APPGAAHYfor, 5'-CGCCCCCCCCGGCGCCGCCCACTA 및 APPGAAHYrev, 5'-CGTAGTGGGCGGCGCCGGGGGGGG)(NarI 부위의 잔류물은 밑줄 쳐 있음)에 의해 NarI DNA 단편으로서 조립되고, N-말단 신호 서열과 성숙한 EPO 코딩 영역 사이에 클로닝되었다.
f) 세포 배양 과정
dhfr 효소 유전자가 결핍된 돌연변이된 세포주 CHO/dhfr-(ATCC-9096)은 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션(American Type Tissue Culture Collection, 미국 버지니아주 매나사스 소재)로부터 구입하였다. 형질도입되지 않은 세포는 α-MEM, 5% 투석된 우 태아 혈청(FCS), 2mM 글루타민에서 배양하였다. 세포는 FuGENE 6 형질도입 시약을 사용하여 EOP 플라스미드로 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 10% 투석된 FCS 및 2mM 글루타민으로 보충된 α-MEM 결핍 뉴클리오시드(α-MEM-)에서 선별하였다. 단일 콜로니는 FACS에 의해 단리하고, 배양하고, 배양 상층액은 효소 면역 흡착법(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay, ELISA)에 의해 EPO의 생산 및 분비를 분석하였다. EPO의 발현량은 증가된 농도의 메토트렉세이트(MTM, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 컴파니(Sigma Chemical Co.))를 함유하는 배양 배지에서 dhfr 및 EPO 유전자의 증폭에 의해 여러 배 증가되었다.
(2) 발효
변형된 EPO의 발효 및 정제는 하기에 기술되어 있다.
접종물 제조 및 발효
변형된 EPO-생산 CHO 세포주(dhfr 효소 유전자가 결핍된 숙주 세포주: ATCC CRL-9096)로부터 유래한 세포 은행(Cell Bank)의 하나의 바이얼을 액체 질소 저장 탱크의 증기상으로부터 꺼낸다. 세포를 유리 교반 플라스크로 옮기고, 습윤 CO2 배양기에서 탄산수소-완충된 배지에서 배양한다. 접종물 제조 및 발효를 위해 사용되는 전형적인 무혈청 배지는 1992년 6월 12일자로 공개된 코크의 유럽 특허 출원 제 513 738 호 또는 1996년 11월 14일자로 공개된 버그의 WO 96/35718에 개시되어 있고, 예를 들어 배지로서 DMEM/F12(예를 들어, 미국 덴버 소재의 JRH 바이오사이언스/해즐턴 바이올로직스(JRH Biosciences/Hazleton Biologics), 주문 번호 제 57-736 호) 및 추가적으로 탄산수소 나트륨, L+글루타민, D+글루코즈, 재조합 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 디아미노부탄, 히드로코티손, 제 2 황산철, 아스파라긴, 아스파르트산, 세린 및 포유류 세포용 안정제, 예를 들어 폴리비닐 알콜, 메틸 셀룰로스, 폴리덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 플루로닉 F68, 혈장 증량제 폴리겔린(HEMACCEL, 등록상표) 또는 폴리비닐 피롤리돈을 함유된다.
오염 미생물의 부재를 확인하기 위해 배지를 현미경으로 체크하고, 세포 농도를 측정한다. 각각의 분할 단계에서 이들 시험을 수행한다.
초기 성장 기간 이후에 세포 배양액을 초기 세포 농도가 되도록 신선한 배지로 희석하고, 또 한번의 성장 사이클을 수행한다. 유리 교반 플라스크당 약 2 ℓ의 배양 부피를 수득할 때까지 이 과정을 반복한다. 약 12배 수행 이후에 1 내지 5 ℓ의 상기 배양액을 얻을 수 있으며, 이는 이어서 10 ℓ접종물 발효기용 접종물로서 사용된다.
3 내지 5일 후에, 10 ℓ발효기내의 배양액을 100 ℓ접종물 발효기용 접종물로서 사용할 수 있다.
3 내지 5일 동안 추가로 배양한 후에, 100 ℓ배양기내의 배양액을 1000 ℓ생산 발효기용 접종물로서 사용할 수 있다.
수거 및 세포 분리
회분식 재공급 방법을 사용하는데, 즉, 목적하는 세포 밀도에 도달했을 때 배양액의 약 80%를 수거한다. 나머지 배양액에 신선한 배양 배지를 다시 공급하고, 다음에 수거할 때까지 배양한다. 1회 생산 공정은 최고 10회 연속 수거, 즉 9회의 부분적 수거 및 발효 말기의 1회의 전체 수거로 이루어진다. 3 내지 4일마다 1회씩 수거한다.
측정된 수거량을 냉각된 용기에 옮긴다. 원심분리 또는 여과에 의해 세포를 제거하여 버린다. 원심분리 단계에서의 변형된 EPO 함유 상층액을 직렬 여과하고, 제 2의 냉각된 용기에 수집한다. 수거물 각각은 정제 동안에 별도로 가공한다. 변형된 EPO-단백질의 전형적인 정제 방법은 하기에 설명되어 있다.
(3) 변형된 EPO의 정제
EPO-단백질의 전형적인 정제 방법은 1996년 11월 14일자로 공개된 버그의 WO 96/35718에 개시되어 있다. 상기 정제 방법은 변형된 EPO에 적용할 수 있고, 하기에 설명되어 있다.
(1) 블루 세파로스 크로마토그래피
블루 세파로스(Blue Sepharose, 파마시아(Pharmacia))는 세파로스 비드로 이루어지며, 이들 비드 표면에 시바크론 블루(Cibacron blue) 염료가 공유결합되어 있다. 변형된 EPO는 대부분의 비-단백질성 오염물 및 단백질성 불순물보다 블루 세파로스에 더 강하게 결합하므로, 이 단계에서 변형된 EPO를 풍부하게 할 수 있다. 블루 세파로스 컬럼의 용출을 pH뿐만 아니라 염 농도를 증가시킴으로써 수행한다.
컬럼을 블루 세파로스로 충전하고, NaOH로 재생시키고, 평형화 완충액(염화나트륨/염화칼슘 및 아세트산나트륨)으로 평형화시킨다. 산성화되고 여과된 발효 상층액을 적재한다. 적재가 끝난 후, 컬럼을 높은 염화나트륨 농도를 갖는 평형화 완충액과 비슷한 완충액으로 먼저 세척하고, 이어서 트리스-염기 완충액으로 세척한다. 생성물을 1M NaCl을 함유하는 트리스-염기 완충액으로 용출하고, 단일 분획으로 수집한다.
(2) 부틸 토요펄 크로마토그래피
부틸 토요펄 650 C(Butyl Toyopearl 650 C, 토소 하스(Toso Haas))는 지방족 부틸-잔기가 공유결합된 폴리스티렌계 기질이다. 변형된 EPO는 대부분의 불순물보다 이 겔에 더 강하게 결합하므로, 이소프로판올을 함유하는 완충액으로 용출될 수 있다.
컬럼을 부틸 토요펄 65 C로 채우고, NaOH로 재생시키고, 트리스-염기 완충액으로 세척하고, 이소프로판올을 함유하는 트리스-염기 완충액으로 평형화시킨다.
블루 세파로스 용출액을 컬럼 평형화 완충액 중의 이소프로판올 농도로 조절하고, 컬럼에 적재한다. 이어, 컬럼을 높은 이소프로판올 농도를 갖는 평형화 완충액으로 세척한다. 생성물을 용출 완충액(높은 이소프로판올 함량을 갖는 트리스-염기 완충액)으로 용출하고 단일 분획으로 수집한다.
(3) 하이드록시아파타이트 울트로겔 크로마토그래피
하이드록시아파타이트 울트로겔TM(Hydroxyapatite UltrogelTM, 바이오세프라 (Biosepra))는 기계적 특성을 개선시키기 위해 아가로스 기질내에 혼입되어 있는 하이드록시아파타이트로 이루어져 있다. 변형된 EPO는 하이드록시아파타이트에 대해 낮은 친화성을 갖고, 따라서 단백질 분순물보다 낮은 인산염 농도에서 용출될 수 있다.
컬럼을 하이드록시아파타이트 울트로겔로 충전하고, 인산칼륨/염화칼슘 완충액 및 NaOH로 재생시킨 후, 트리스-염기 완충액으로 재생시킨다. 이어, 이를 소량의 이소프로판올 및 염화나트륨을 함유하는 트리스-염기 완충액으로 평형화시킨다.
부틸 토요펄 크로마토그래피의 변형된 EPO 함유 용출액을 트리스-염기 완충액으로 희석하고, 컬럼에 적재한다. 이어, 컬럼을 평형화 완충액 및 이소프로판올 및 염화나트륨이 없는 트리스-염기 완충액으로 세척한다. 생성물을 저농도의 인산칼륨을 함유하는 트리스-염기 완충액으로 용출하고, 단일 분획으로 수집한다.
하이드록시아파타이트 울트로겔 컬럼을 농축하고, 시트라코닐화 완충액에 대해 투석여과한다. 10kDa 차단 밀리포어 펠리콘 XL(Millipore Pellicon XL) 막이 장착된 밀리포어 랩스케일TM TFF 시스템(Millipore LabscaleTM TFF System)을 사용하여 농축/투석여과를 수행한다.
실시예 2: 변형된 EPO의 시트라코닐화, 단백질 분해성 절단 및 보호된 EPO의 정제
변형된 EPO의 용액을 pH 8.5 내지 9.0으로 조절하고, 실온에서 교반한다. 교반된 용액에 시트라코닐산 무수물(메르크(Merck) 8.41321.0100)을 소량씩 천천히 가하고, pH-스태트(stat)를 사용하여 0.5N NaOH를 가함으로써 pH 9.0을 유지한다. 시트라코닐산 무수물의 총량은 변형된 EPO중의 리신의 ε-아미노기의 5배 몰 과량에 상응한다. 시트라코닐산 무수물의 첨가가 끝난 후, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한다. 2M 에탄올아민 용액을 가함으로써 잔여 시트라코닐산 무수물을 제거하고, pH 9.0으로 조절한다.
절단 프로테아제를 가함으로써 변형되고 보호된 EPO의 절단을 달성한다. 실시예 1(1c)에서 기술된 바와 같은 구조체의 경우에, 인자 Xa(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals), 주문 번호 제 602388 호)를 변형된 EPO에 1:100(중량/중량)으로 가하고, 실온에서 여러 시간 동안 교반한다. 절단 과정은 시료를 취하고 절단 생성물을 분석함으로써 조절된다. 낮은 분할 속도의 경우에, 프로테아제의 양을 증가시킬 수 있다.
IgA 프로테아제(EP 513,073 호에 기술된 바와 같이 제조됨) 및 제네나제TM(GenenaseTM, 게넨코 인터네셔날 인코포레이티트(Genencor Int. Inc.))와 같은 기타 프로테아제를 적용하는 경우, 과정은 그에 맞게 수행한다.
반응 혼합물로부터의 프로테아제의 제거는 수퍼덱스TM(SuperdexTM) 75pg(파머시아) 또는 RP-HPLC상의 크기 배재 크로마토그래피(SEC)에 의해 달성된다.
수퍼덱스 75 pg 재료는 가교결합된 아가로스 및 덱스트란 비드로 이루어져 있다. 적재한 후, 컬럼을 NaOH로 재생하고, 100mM 염화나트륨을 갖는 인산 완충액 시스템으로 평형화시킨다.
이전 단계로부터의 반응 혼합물을 10kDa 차단 밀리포어 펠리콘 XL 막이 장착된 밀리포어 랩스케일TM TFF 시스템상에서 10㎎/㎖로 농축한다. 이 용액의 약 1 내지 5%의 컬럼 부피를 한 단계로 컬럼에 적용한다. 평형화 완충액 시스템에서 크로마토그래피를 수행한다. 생성물을 분석용 rpHPLC에 의해 분석된 이들의 순도에 따라 모은 분획으로 수거한다.
모은 분획을 10kDa 차단 밀리포어 펠리콘 XL 막이 장착된 밀리포어 랩스케일TM TFF 시스템상에서 7 내지 8㎎/㎖로 농축한다.
실시예 3: N-말단 페길레이트화된 EPO의 제조
페길레이트화 반응은 5㎎/㎖의 최종 단백질 농도에서 1:5(보호된 EPO 대 PEG-SBA 시약)의 몰비로 수행된다. 사용된 페길레이트화 시약은 화학식 II의 화합물(R은 메틸이고, x는 3이고, m은 650 내지 750(평균: 약 730, 약 32kDa의 평균 분자량에 상응함)임)인 메톡시 PEG-SBA이다.
30kDa PEG-SBA(쉬어워터 폴리머스 인코포레이티드)를 1mM HCl에 용해시킨다. 충분한 양의 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)을 가하여 반응 혼합물에서 최종 인산 농도가 20mM이 되게 한다. 보호된 EPO(반응 혼합물중의 약 3㎎/㎖)를 가하고, 반응 혼합물을 주위 온도(20 내지 25℃)에서 교반한다. 2시간 후, 산으로 pH를 2.5로 조절함으로써 반응을 정지시킨다.
단백질의 탈시트라코닐화는 용액을 2.5의 pH에서 주위 온도에서 5시간 동안 교반함으로써 달성된다. 수산화나트륨을 사용하여 pH를 4.5로 조절함으로써 반응을 정지시키고, 정제할 준비가 될 때까지 용액을 -20℃에 저장한다.
과량의 시약, 반응 부산물 및 페길레이트화되지 않은 EPO로부터의 N-말단 페길레이트화된 EPO(PEG-A1-EPO)의 분리는 SP-세파로스 FF(파머시아)상의 크로마토그래피에 의해 달성된다. SP-세파로스 재료는 세파로스 비드의 표면에 공유결합된 설포프로필(SP)-기로 이루어져 있다. SP-세파로스로 컬럼을 충전하고, 인산 및 NaOH로 재생하고, 아세트산나트륨 완충액으로 평형화시킨다.
이전 단계로부터의 반응 혼합물을 아세트산나트륨 완충액(pH 3.0)으로 1:5로 희석하고, SP-세파로스 컬럼에 적용한다. 평형화 완충액으로 컬럼을 세척하여 과량의 시약 및 반응 부산물을 제거한다. 그리고 나서, 100mM NaCl로 세척한다. 이어서, PEG-A1-EPO를 200mM NaCl로 용출한다. 생성물을 고성능 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 이들의 순도에 따라 모은 분획으로 수거한다. 컬럼상에 잔류하는 페길레이트화되지 않은 EPO를 750mM NaCl로 용출한다.
이어서, PEG-A1-EPO 수거물은 약 4.5 내지 약 7.5㎎/㎖로 농축하고, 저장 완충액(10mM 인산칼륨, 100mM NaCl, pH 7.5)내로 투석여과한다. 10kDa 차단 밀리포어 펠리콘 XL 막이 장착된 밀리포어 랩스케일TM TFF 시스템을 사용하여 농축/투석 여과를 주위 온도에서 수행한다. 농축된 PEG-A1-EPO를 멸균여과하고, -20℃에서 냉동저장한다.
실시예 4: 정적혈구병 마우스 분석법에 의해 측정된 PEG-A1-EPO의 생체내 활성
정적혈구병 마우스 생체분석법은 당행 기술분야(문헌[Pharm. Europa. Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]) 및 Ph. Eur. BRP.의 에리트로포이에틴의 모노그래피의 방법에 공지되어 있다. 시료를 BSA-PBS로 희석한다. 7 내지 15주된 표준의 건강한 마우스에게 실시예 1 내지 3으로부터의 PEG-A1-EPO 용액, EPO 용액 및 대조군으로서의 완충액 0.2㎖를 피하투여한다. 6일 동안, 꼬리 정맥에 구멍을 뚫어 혈액을 채취하고, 1㎕의 혈액이 1㎖의 0.15μmol 아크리딘 오렌지 염색 용액에 존재하도록 희석한다. 염색 시간은 3 내지 10분이다. 망상적혈구 수는 적색 형광 히스토그램의 분석법에 의해 유동 세포분석기에서 미세형광분석에 의해 수행된다. 망상적혈구 수는 절대값(분석된 30,000개의 혈구 세포당)으로 나타낸다. 제시된 데이터에 있어서, 각각의 군은 1일당 5마리의 마우스로 이루어졌고, 마우스로부터 오직 1회의 혈액을 채취하였다.
그 결과는 표 1에 나타나 있다.
상기 결과는 CHO 세포로부터 유래된 EPO에 비해, 마우스당 동일한 투여량(100ng)을 사용함으로써 망상적혈구 수의 상당한 증가 및 망상적혈구 수의 최대값의 이동에 의해 나타난 PEG-A1-EPO 종의 우수한 활성 및 반감기의 증가를 나타낸다.
EPO PEG-A1-EPO 대조군 완충액
72시간 2,404 2,911 857
96시간 1,814 3,713 697
120시간 901 측정되지 않음 701
144시간 536 3,424 708
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> ERYTHROPOIETIN CONJUGATES <130> Case 20805 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 3 <211> 174 <212> PRT <213> CHO/dhfr- <400> 3 Ala Pro Pro Arg Ile Glu Gly Arg Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp 1 5 10 15 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn 20 25 30 Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr 35 40 45 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 50 55 60 Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp 85 90 95 Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 100 105 110 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser 115 120 125 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp 130 135 140 Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys 145 150 155 160 Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 170 <210> 4 <211> 169 <212> PRT <213> CHO/dhfr- <400> 4 Ala Pro Pro Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu 1 5 10 15 Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys 20 25 30 Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys 35 40 45 Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val 50 55 60 Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly 65 70 75 80 Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu 85 90 95 His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu 100 105 110 Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala 115 120 125 Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu 130 135 140 Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 5 <211> 174 <212> PRT <213> CHO/dhfr- <400> 5 Ala Pro Pro Gly Ala Ala His Tyr Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp 1 5 10 15 Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn 20 25 30 Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr 35 40 45 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 50 55 60 Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp 85 90 95 Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 100 105 110 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser 115 120 125 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp 130 135 140 Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys 145 150 155 160 Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 170

Claims (33)

  1. N-말단 α-아미노기를 갖고,
    골수 세포가 망상적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 가지며,
    인간 에리트로포이에틴, 및 하기 제1군으로 구성된 군에서 선택되는 1 내지 6개의 글리코실화 부위의 부가 또는 하기 제2군으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는
    에리트로포이에틴 당단백질을 포함하고; 이때 상기 당단백질은 상기 N-말단 α-아미노기와 아미드 결합을 형성하는 화학식 -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(여기서, R은 저급 알킬이고, x는 2 또는 3이고, m은 약 450 내지 약 1,350임)의 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 -CO에 의해 상기 화학식의 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 공유결합된 접합체:
    제1군
    Asn30Thr32;
    Asn51Thr53;
    Asn57Thr59;
    Asn69;
    Asn69Thr71;
    Ser68Asn69Thr71;
    Val87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Thr90;
    Ser87Asn88Gly89Thr90;
    Ser87Asn88Thr90Thr92;
    Ser87Asn88Thr90Ala162;
    Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
    Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
    Asn89Ile90Thr91;
    Ser87Asn89Ile90Thr91;
    Asn136Thr138;
    Asn138Thr140;
    Thr125; 및
    Pro124Thr125
    제2군
    Gln24Ser87Asn88Thr90;
    Gln38Ser87Asn88Thr90 ; 및
    Gln83Ser87Asn88Thr90.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 I의 접합체:
    화학식 I
    P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
    상기 식에서,
    x, m 및 R은 제 1 항에서 정의된 바와 같고,
    P는 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 아미드 결합을 형성하는 N-말단 α-아미노기가 없는 제 1 항에 따른 에리트로포이에틴 당단백질 및 그의 유사체의 잔기이다.
  3. 제 1 항에 있어서,
    R이 메틸인 접합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    m이 550 내지 1,000인 접합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    m이 약 650 내지 약 750인 접합체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    R이 메틸이고, m이 약 650 내지 약 750인 접합체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    화학식 CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH-P(여기서, m은 650 내지 750이고, P는 제 2 항에서 정의된 바와 같음)를 갖는 접합체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    당단백질이 인간 에리트로포이에틴인 접합체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    인간 에리트로포이에틴 당단백질이 내생 유전자 활성화에 의해 발현되는 접합체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    당단백질이 도 1 또는 도 2에 나타낸 서열을 갖는 접합체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    당단백질이 1 내지 6개의 글리코실화 부위의 부가에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 접합체.
  12. 삭제
  13. 제 1 항에 있어서,
    당단백질이 하나 이상의 글리코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 접합체.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 만성 신부전(CRF) 환자의 빈혈과 관련된 질병 및 AIDS의 치료 또는 예방, 및 화학요법을 받는 암 환자의 치료를 위한 약학 조성물.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 하기 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 제조 방법:
    a) 단백질 분해성 절단 서열을 포함하는 N-말단 펩티드성 연장 서열을 포함하는 재조합 EPO 단백질의 발현,
    b) ε-아미노기의 보호,
    c) N-말단 펩티드성 연장 서열의 단백질 분해성 절단,
    d) N-말단 α-아미노기의 페길레이트화,
    e) 에리트로포이에틴 당단백질의 ε-아미노기의 탈보호, 및
    f) 선택적으로, 상기 각각의 단계를 수행한 후의 정제 단계.
  21. 제 20 항에 있어서,
    재조합 EPO가 도 1 내지 도 5에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    단계 b)에서 ε-아미노기가 시트라코닐화에 의해 보호되는 방법.
  23. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    N-말단 α-아미노기가 하기 화학식 II에 의해 페길레이트화되는 방법:
    화학식 II
    상기 식에서,
    R, m 및 x는 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  24. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 20 항에 따른 방법에 의해 제조되는 접합체.
  25. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    만성 신부전(CRF) 환자의 빈혈과 관련된 질병, AIDS 및 화학요법을 받는 암 환자의 치료를 위한 접합체.
  26. 단백질 분해성 절단 부위를 나타내는 N-말단 펩티드성 연장 서열을 갖는 도 1 및 도 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 에리트로포이에틴 당단백질.
  27. 삭제
  28. 단백질 분해성 절단 부위를 나타내는 N-말단 펩티드성 연장 서열을 갖는 도 1 및 도 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고 N-말단 정제 태그를 포함하는 에리트로포이에틴 당단백질.
  29. 하기 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 제조 방법:
    a) 단백질 분해성 절단 서열을 포함하는 N-말단 펩티드성 연장 서열을 포함하는 재조합 EPO 단백질의 발현 및 무혈청 발효,
    b) ε-아미노기의 보호,
    c) N-말단 펩티드성 연장 서열의 단백질 분해성 절단,
    d) N-말단 α-아미노기의 페길레이트화,
    e) 에리트로포이에틴 당단백질의 ε-아미노기의 탈보호, 및
    f) 선택적으로, 상기 각각의 단계를 수행한 후의 정제 단계.
  30. 제 29 항에 있어서,
    재조합 EPO가 도 1 내지 도 5에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    단계 b)에서 ε-아미노기가 시트라코닐화에 의해 보호되는 방법.
  32. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    N-말단 α-아미노기가 하기 화학식 II에 의해 페길레이트화되는 방법:
    화학식 II
    상기 식에서,
    R, m 및 x는 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
  33. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 29 항에 따른 방법에 의해 제조되는 접합체.
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