ES2905105T3 - Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada - Google Patents

Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada

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ES2905105T3 ES18830892T ES18830892T ES2905105T3 ES 2905105 T3 ES2905105 T3 ES 2905105T3 ES 18830892 T ES18830892 T ES 18830892T ES 18830892 T ES18830892 T ES 18830892T ES 2905105 T3 ES2905105 T3 ES 2905105T3
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Abstract

Un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; b) someter la mezcla de proteínas a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) en dos fases, que comprende: aplicar la mezcla de proteínas a un primer material de CIH para proporcionar una primera solución de flujo continuo de CIH; y aplicar la primera solución de flujo continuo de CIH a un segundo material de CIH para proporcionar una segunda solución de flujo continuo de CIH, en el que el segundo material de CIH es diferente del primer material de CIH; y en el que la etapa de CIH en dos fases se realiza en condiciones de CIH en dos fases, siendo dichas condiciones de CIH en dos fases adecuadas para unir la proteína oligo-PEGilada al primer material de CIH y unir la proteína mono-PEGilada al segundo material de CIH; y c) eluir la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH, en el que el segundo eluido de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de proteína PEGilada, en particular, procedimientos para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de eritropoyetina (EPO) mono-PEGilada.
Antecedentes
La PEGilación o pegilación de proteínas se refiere a la adición de uno o más grupos de PEG (polietilenglicol) a una proteína. La PEGilación es, en particular, útil para proteínas terapéuticas, por ejemplo, porque incrementa la semivida en circulación in vivo. Sin embargo, la PEGilación también puede reducir la actividad biológica de las proteínas terapéuticas, reduciendo, de este modo, su eficacia. Por lo tanto, se ha de encontrar un equilibrio entre el tiempo en circulación incrementado y la eficacia terapéutica reducida.
Para determinadas proteínas terapéuticas, la mono-PEGilación es, en particular, deseable porque proporciona una estabilidad mejorada sin comprometer significativamente la eficacia terapéutica. Las proteínas terapéuticas mono-PEGiladas incluyen Mircera®, Peglntron® y Pegasys®. Micera® es una forma mono-PEGilada de eritropoyetina (EPO) y se usa para tratar la anemia.
Las reacciones de PEGilación tienden a producir mezclas que comprenden proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar), proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Las condiciones de reacción que favorecen un alto grado de PEGilación (tales como tiempos de reacción largos, alta proporción molar de PEG/proteína) tienden a producir una mezcla con una alta proporción de proteína oligo-PEGilada, lo que da como resultado bajos rendimientos cuando la proteína mono-PEGilada es el producto deseado. Las condiciones de reacción que favorecen un bajo grado de PEGilación (tales como tiempos de reacción cortos, baja proporción molar de PEG/proteína) tienden a producir mezclas con una alta proporción de proteína sin reaccionar (no PEGilada), lo que también da como resultado bajos rendimientos cuando la proteína mono-PEGilada es el producto deseado.
Las proteínas terapéuticas, a menudo, son costosas de fabricar y, por lo tanto, los procedimientos que proporcionan buenos rendimientos de proteína terapéutica mono-PEGilada (desperdicio mínimo de proteína terapéutica sin reaccionar y/u oligo-PEGilada) son económicamente favorables y, por lo tanto, son, en particular, deseables.
Se han desarrollado procedimientos de PEGilación de una proteína de interés mientras está unida a una columna de cromatografía de intercambio iónico en un intento de manipular la especificidad de la PEGilación y mejorar, de este modo, los rendimientos de proteínas con un grado deseado de PEGilación (los así llamados procedimientos "en columna"). Dichos procedimientos son técnicamente complejos y requieren mucho tiempo y, en consecuencia, tienen una baja productividad. Dichos procedimientos también pueden consumir cantidades relativamente grandes de reactivo de PEGilación, lo que los hace económicamente desfavorables. Se analizan diversos procedimientos de PEGilación "en columna" en Pfister (Reac React. Chem. Eng., 2016, 1,204), Ingold (2016) y Fee y Van Alstine (2006).
Los procedimientos de provisión de proteínas mono-PEGiladas pueden comprender realizar una reacción de PEGilación para proporcionar una mezcla que comprende proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar), proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada, y, a continuación, realizar una etapa de purificación para purificar la proteína mono-PEGilada.
Los documentos WO 2009/010270 y WO 2012/035037 se refieren a procedimientos para purificar EPO mono-PEGilada de una mezcla que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Los procedimientos de purificación implican someter la mezcla que resulta de una reacción de PEGilación a al menos una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CIC). La etapa de CIC se realiza en modo de unión y elución y las diferentes facciones de elución comprenden principalmente EPO no PEGilada, mono-PEGilada u oligo-PEGilada. Dichos procedimientos de CIC se deben llevar a cabo por debajo del punto isoeléctrico de la proteína, que en el caso de la EPO (punto isoeléctrico en el intervalo de 4,0 a 5,5) implica la CIC a un pH de alrededor de 3,0.
Los procedimientos para producir proteínas mono-PEGiladas realizando una reacción de PEGilación y, a continuación, purificando la proteína mono-PEGilada de la mezcla resultante pueden implicar reciclar la proteína sin reaccionar (no PEGilada). Estos procedimientos implican recuperar la proteína sin reaccionar y añadirla a una reacción de PEGilación posterior. Dicho reciclado mejora el rendimiento global de proteína mono-PEGilada.
Pfister (Biotech and Bioeng, 2016) describe un procedimiento en el que se realiza una reacción de PEGilación seguida de purificación de proteína mono-PEGilada de una mezcla que comprende proteína sin reaccionar (no PEGilada), mono-PEGilada y oligo-PEGilada. En el procedimiento, la proteína sin reaccionar se recupera y usa en una reacción de PEGilación posterior. El procedimiento de purificación comprende una cromatografía de intercambio catiónico (CIC) en modo de unión y elución, en el que la proteína sin reaccionar, la proteína mono-PEGilada y la proteína oligo-PEGilada se separan en elución secuencial. La proteína sin reaccionar se eluye, por último, usando un tampón de elución con alto contenido de sal. La elución de la proteína sin reaccionar en la fase final de la CIC retrasa el reciclado de la proteína sin reaccionar, puesto que se procesa por diafiltración antes del reciclado, reduciendo, de este modo, la productividad global del procedimiento.
La presente invención se ha concebido en vista de las consideraciones anteriores.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. Los procedimientos de la invención son, en particular, adecuados para proporcionar composiciones de EPO mono-PEGilada. Las ventajas del procedimiento descrito en el presente documento incluyen alto rendimiento y productividad y alta pureza del producto mono-PEGilado.
La presente invención se refiere a un procedimiento en el que una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada se somete a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) en dos fases. La etapa de CIH en dos fases implica aplicar la mezcla de proteínas a dos materiales de CIH en condiciones específicas ("condiciones de CIH en dos fases"): el primer material de CIH solo se une a la proteína oligo-PEGilada en esas condiciones, y el segundo material de CIH se une a la proteína mono-PEGilada en esas mismas condiciones. Es decir, el primer material de CIH se une a la proteína oligo-PEGilada, pero no a la proteína no PEGilada o proteína mono-PEGilada en las condiciones de CIH en dos fases. El segundo material de CIH se une a la proteína mono-PEGilada en las condiciones de CIH en dos fases, y se puede unir a la proteína oligo-PEGilada en las condiciones de CIH en dos fases, pero, en los procedimientos divulgados en el presente documento, sustancialmente toda la proteína oligo-PEGilada ya se puede haber retirado por el primer material de CIH, por lo que al llevar a cabo la invención, el segundo material de CIH no se une necesariamente a la proteína oligo-PEGilada, o no se une a cantidades significativas de proteína oligo-PEGilada.
En particular, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; b) someter la mezcla de proteínas a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) en dos fases, que comprende: aplicar la mezcla de proteínas a un primer material de CIH para proporcionar una primera solución de flujo continuo de CIH; y aplicar la primera solución de flujo continuo de CIH a un segundo material de CIH para proporcionar una segunda solución de flujo continuo de CIH, en el que el segundo material de CIH es diferente del primer material de CIH; y en el que la etapa de CIH en dos fases se realiza en condiciones de CIH en dos fases, siendo dichas condiciones de CIH en dos fases adecuadas para unir la proteína oligo-PEGilada al primer material de CIH y unir la proteína mono-PEGilada al segundo material de CIH; y c) eluir la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH, en el que el segundo eluido de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada.
El "segundo eluido de CIH" también se puede denominar "segundo eluido de material de CIH", porque es el eluido del segundo material de CIH en la etapa de CIH en dos fases.
En los procedimientos divulgados en el presente documento, la composición de proteína mono-PEGilada puede contener una proporción relativamente alta de proteína mono-PEGilada. Por ejemplo, la composición de proteína puede comprender al menos aproximadamente un 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de proteína mono-PEGilada.
La proteína puede ser eritropoyetina (EPO). La proteína puede ser una hormona. La proteína puede ser una hormona, una citocina, una enzima o un anticuerpo.
Las proteínas mono-PEGiladas pueden ser deseables porque proporcionan un equilibrio entre una semivida incrementada y una actividad biológica comparable con respecto a las versiones no PEGiladas y oligo-PEGiladas de la proteína. Sin embargo, las reacciones de PEGilación tienden a producir mezclas que comprenden proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar), proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Las proteínas, especialmente las proteínas terapéuticas, a menudo, son costosas de fabricar y, por lo tanto, los procedimientos que proporcionan buenos rendimientos de proteína terapéutica mono-PEGilada son, en particular, deseables. Son, en particular, deseables los procedimientos que proporcionan buenos rendimientos de EPO mono-PEGilada (Mircera®).
Los procedimientos divulgados en el presente documento son ventajosos porque pueden posibilitar la rápida recuperación de la proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar) para su procesamiento y reciclado posteriores en una reacción de PEGilación posterior. Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden posibilitar un rendimiento relativamente alto porque la EPO no PEGilada se puede recuperar y reciclar, por tanto, una mayor proporción de la proteína de partida se mono-PEGila.
Los procedimientos divulgados en el presente documento son ventajosos con respecto a los procedimientos que reciclan la proteína no PEGilada en los que la proteína no PEGilada se recupera después de la proteína mono-PEGilada. Esto se debe a que los procedimientos divulgados en el presente documento posibilitan la recuperación de la proteína no PEGilada en una fase temprana del procedimiento, antes de la recuperación de la proteína mono-PEGilada, lo que significa que la proteína no PEGilada se puede procesar y reciclar en paralelo con fases más tardías del procedimiento. Esto incrementa la productividad global de los procedimientos que implican una etapa de reciclado de proteína no PEGilada. Los procedimientos divulgados en el presente documento son ventajosos porque implican la CIH, que se puede realizar a un pH cercano a pH fisiológico. Esto puede mejorar la estabilidad de la proteína. Los procedimientos de la invención son, en particular, adecuados para producir composiciones de EPO mono-PEGilada. Esto es ventajoso sobre los procedimientos que implican la cromatografía de intercambio catiónico (CIC) para producir EPO mono-PEGilada que, en general, se realizan a un pH de 3,0 o menor. Las condiciones ácidas de aproximadamente pH 3,0 o menor pueden tener efectos adversos sobre la calidad de la EPO, dichos efectos adversos se reducen en los procedimientos de la presente invención, que no requieren la CIC y, por tanto, no requieren las condiciones de pH bajo necesarias para la purificación basada en CIC de EPO.
Además, las formas ácidas (variantes ácidas) de EPO pueden tener una alta actividad terapéutica, lo que las hace, en particular, útiles. Sin embargo, la recuperación de formas ácidas mono-PEGiladas de EPO por CIC puede ser mala porque sus condiciones de elución en CIC son similares a las de las formas no ácidas di-PEGiladas de EPO. Las condiciones ácidas dan como resultado la oxidación de las cadenas laterales de los aminoácidos en una molécula de proteína. A medida que la CIC separa las moléculas de proteína de acuerdo con su carga, las variantes básicas de una especie se eluirán más tarde que las variantes ácidas. Por este motivo, el perfil de elución de CIC de formas no ácidas di-pegiladas de EPO se tiende a solapar con las formas ácidas mono-PEGiladas de EPO. La mala recuperación de estas formas de EPO ácidas mono-PEGiladas útiles por CIC se reduce en los procedimientos divulgados en el presente documento, que no se basan en la CIC para separar EPO mono-PEGilada de la oligo-PEGilada.
La purificación de proteínas por CIH se basa en la hidrofobia de la proteína en lugar de en la carga. Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser ventajosos porque relativamente no se ven afectados por formas ácidas o por variantes de glucosilación que afectan a la carga de la proteína. Debido a que la PEGilación puede afectar en gran medida a la hidrofobia de una proteína, los procedimientos divulgados en el presente documento son, en particular, útiles para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada.
Las ventajas asociadas con la invención para proporcionar EPO mono-PEGilada se pueden aplicar a otras proteínas, en particular, a otras proteínas terapéuticas. Es decir, evitar las condiciones de pH bajo y la recuperación de variantes ácidas puede hacer que la invención sea útil para proporcionar proteínas mono-PEGiladas distintas de EPO mono-PEGilada.
Los procedimientos divulgados en el presente documento son para producir una composición de proteína mono-PEGilada usando una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada. En los procedimientos divulgados en el presente documento, se usan dos materiales de CIH en serie en una etapa de CIH en dos fases. Los dos materiales de CIH son diferentes entre sí y se seleccionan de modo que, en las condiciones usadas para la etapa de CIH en dos fases, el primer material de CIH se una a la proteína oligo-PEGilada (pero no a la proteína mono-PEGilada), el segundo material de CIH se una a la proteína mono-PEGilada, y ni el primer ni el segundo material de CIH se una a la proteína no PEGilada. Por tanto, a medida que la mezcla de proteínas pasa por el primer material de CIH, la proteína oligo-PEGilada se secuestra (y se puede eluir más tarde) y a medida que pasa por el segundo material de CIH, la proteína mono-PEGilada se secuestra (para su elución más tardía). La proteína no PEGilada pasa tanto por los primer como segundo materiales de CIH y se puede retirar en el flujo continuo de la etapa de CIH en dos fases, y se puede reciclar posteriormente. Por tanto, la proteína no PEGilada (sin reaccionar) se recupera muy rápidamente de la mezcla de proteínas para su reciclado. La proteína mono-PEGilada, a continuación, se eluye del segundo material de CIH para proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada.
Las mismas condiciones de CIH se usan para la CIH que implica tanto a los primer como segundo materiales de CIH (estas se pueden denominar "condiciones de CIH en dos fases"). Esto significa que no se necesita cambiar los tampones entre las primera y segunda fases de la etapa de CIH. Las condiciones de CIH en dos fases pueden ser isocráticas. No se necesita acondicionar o alterar la composición de la solución de flujo continuo del primer material de CIH antes de aplicarla al segundo material de CIH. La solución de flujo continuo del primer material de CIH se puede aplicar directamente al segundo material de CIH. Esto ahorra el ajuste que requiere mucho tiempo de las condiciones de CIH, mejorando, de este modo, la eficacia y productividad. Esto significa que el primer material de CIH y segundo material de CIH se pueden conectar directamente en serie, de modo que la solución de flujo continuo del primer etapa de CIH se pueda suministrar rápida y eficazmente al segundo material de CIH. El procedimiento global es relativamente rápido, barato y eficaz.
La etapa de CIH en dos fases usa dos materiales de CIH diferentes. El primer material de CIH se usa para capturar (es decir, secuestrar, unir, retirar) solo o principalmente la proteína oligo-PEGilada. El segundo material de CIH se usa para capturar solo o principalmente la proteína mono-PEGilada. Una ventaja de esto es que la capacidad de unión del primer material de CIH se usa solo o principalmente para unir la proteína oligo-PEGilada no deseada (un contaminante en este contexto), y el segundo material de CIH se usa solo o principalmente para unir la proteína mono-PEGilada deseada (el producto en este contexto). Esto significa que el procedimiento tiene una productividad relativamente alta con respecto a la cantidad de material de CIH empleado. Debido a que la mayor parte de o toda la capacidad de unión disponible se usa para unir el contaminante o el producto, la carga puede ser relativamente alta. Es decir, la cantidad de mezcla de proteínas que se aplica a los materiales de CIH puede ser relativamente alta. Esto significa que el procedimiento global tiene una productividad relativamente alta, porque puede producir grandes cantidades de composición de proteína mono-PEGilada dentro de un periodo de tiempo o por ciclo.
El procedimiento se puede llevar a cabo usando soluciones tampón que comprenden un tampón, tal como HEPES. Las soluciones tampón pueden tener un pH fisiológico, por ejemplo, pH 7,0-8,0 o alrededor de pH de 7,5. Las soluciones tampón pueden contener cantidades variables de sal, tal como Na2SO4. En general, los tampones de equilibrado y los tampones de lavado contienen concentraciones de sal relativamente altas (por ejemplo, aproximadamente 400-600 mM o aproximadamente 500 mM), mientras que los tampones de elución contienen concentraciones de sal relativamente bajas (por ejemplo, aproximadamente 0-300 mM).
Los materiales de CIH pueden comprender ligandos de fenilo. El primer material de CIH puede ser Phenyl Sepharose HP (por ejemplo, HiTrap Phenyl HP disponible de GE Healthcare). El segundo material de CIH puede ser Toyopearl Phenyl 650 M (Tosoh Bioscience LLC). En particular, si la proteína mono-PEGilada es EPO mono-PEGilada, el primer material de CIH puede ser Phenyl Sepharose High HP y el segundo material de CIH puede ser Toyopearl Phenyl 650 M.
Sumario de las figuras
Los modos de realización y experimentos que ilustran los principios de la invención se analizarán ahora con referencia a las figuras adjuntas.
Figura 1. Cromatograma comparativo. Comparación de los cromatogramas UV de columnas de los materiales de CIH Toyopearl Phenyl 650M, Phenyl Sepharose HP y Toyopearl PPG 600M. La conductividad de las fracciones de la columna Phenyl Sepharose HP se muestra por la línea de puntos. Las columnas se equilibran a 60 mS/cm. El primer pico para cada columna es EPO no PEGilada, que está en la solución de flujo continuo de la columna. La EPO mono-PEGilada y la EPO oligo-PEGilada se eluyen por un gradiente de sal descendente, que disminuye la conductividad a aproximadamente 1 mS/cm (esto se logra incrementando la proporción de tampón con bajo contenido de sal B de un 0 % a un 100 %, lo que disminuye la concentración de Na2SO4 de aproximadamente 500 mM a aproximadamente 0 mM). El trazado con los picos más altos es Toyopearl PPG 600M, el trazado con el pico para e Po mono-PEGilada más temprano es Phenyl Sepharose HP y el trazado restante es Toyopearl Phenyl 650M.
Figura 2. Cromatograma detallado de Phenyl Sepharose HP. Las líneas verticales indican las fracciones a-f obtenidas para el análisis por HPLC. El valor de pH es de aproximadamente 7,5 en todo momento. Se muestra la proporción de tampón con bajo contenido de sal B, que se incrementa de un 0 % a un 100 %, al igual que la conductividad de las fracciones.
Figura 3. Cromatograma comparativo. Comparación de los cromatogramas UV de las columnas Phenyl Sepharose HP y Toyopearl Phenyl 650M. El trazado con el pico para EPO mono-PEGilada más temprano es Phenyl Sepharose HP, y el trazado restante es Toyopearl Phenyl 650M. El valor de pH es de aproximadamente 7,5 en todo momento. Se muestra la proporción de tampón con bajo contenido de sal B, que se incrementa de un 0 % a un 100 %, al igual que la conductividad de las fracciones de la columna Phenyl Sepharose HP.
Figura 4. Esquema que muestra el modo de realización del procedimiento como se divulga en el presente documento. La figura 4A muestra columnas del primer material de CIH (CIH 1) y el segundo material de CIH (CIH 2) conectados en serie. Un recipiente de reacción de PEGilación proporciona una mezcla de proteínas que se aplica al primer material de CIH. Puede existir una etapa de acondicionamiento intermedia para preparar la mezcla de proteínas para su carga sobre el primer material de CIH (acondicionamiento). La etapa de CIH en dos fases implica aplicar la mezcla de proteínas al primer material de CIH para obtener una primera solución de flujo continuo de CIH, que se aplica al segundo material de CIH para obtener una segunda solución de flujo continuo de CIH. La segunda solución de flujo continuo de CIH contiene una proporción relativamente alta de proteína no PEGilada, que se puede reciclar en una reacción de PEGilación posterior. La figura 4B muestra la elución del segundo material de CIH con un tampón de elución, esta elución recupera la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH. El eluido del segundo material de CIH proporciona una composición de proteína mono-PEGilada (el producto deseado). La figura 4C muestra la elución del primer material de CIH con un tampón de elución, esta elución retira la proteína oligo-PEGilada del primer material de CIH.
Figura 5. Cromatograma de la combinación de columnas (columna del primer material de CIH y columna del segundo material de CIH). Durante la carga por medio de ambas columnas, la EPO no PEGilada está en las soluciones de flujo continuo. La elución de la segunda columna a 41 mS/cm muestra que principalmente se eluye EPO mono-PEGilada en la elución por etapas, pero algo de EPO oligo-PEGilada se eluye en la elución por gradiente. Durante la elución de la segunda columna, iniciándose a 54,5 mS/cm, se eluyen pequeñas cantidades de EPO mono-PEGilada. En el gradiente, la EPO oligo-PEGilada se eluye completamente. El valor de pH es de aproximadamente 7,5 en todo momento. Se muestra la proporción de tampón con bajo contenido de sal B, que se incrementa de un 0 % a un 100 %, al igual que la conductividad de las fracciones. Las composiciones de los picos de 1 a 5 se resumen en la tabla 6 a continuación.
Descripción detallada de la invención
Los aspectos y modos de realización de la presente invención se analizarán ahora con referencia a las figuras adjuntas. Otros aspectos y modos de realización serán evidentes para los expertos en la técnica.
La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar una composición de proteína que comprende al menos un 90 % de proteína mono-PEGilada. En particular, la presente invención proporciona procedimientos para proporcionar una composición de EPO que comprende al menos un 90 % de EPO mono-PEGilada.
Composiciones de proteína mono-PEGilada
En el presente contexto, una composición de proteína mono-PEGilada es una composición que comprende una proteína, en la que una proporción relativamente alta de la proteína presente en la composición está presente como proteína mono-PEGilada. Una composición de proteína mono-PEGilada puede comprender al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % de proteína mono-PEGilada.
Una composición de proteína que comprende al menos un x % de proteína mono-PEGilada se refiere a una composición de proteína en la que al menos un x % de la proteína presente en esa composición está mono-PEGilada. Por ejemplo, una composición de proteína que comprende al menos un 99 % de proteína mono-PEGilada es una composición de proteína en la que al menos un 99 % de esa proteína presente en la composición está mono-PEGilada. Las composiciones de proteína producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % de proteína mono-PEGilada.
En particular, en el presente contexto, una composición de EPO mono-PEGilada es una composición que comprende EPO, en la que una proporción relativamente alta de la EPO presente en la composición está presente como EPO mono-PEGilada. Una composición de EPO que comprende al menos un "x %" de EPO mono-PEGilada se refiere a una composición de EPO en la que al menos un "x %" de la EPO presente en esa composición está mono-PEGilada. Por ejemplo, una composición de EPO que comprende al menos un 99 % de EPO mono-PEGilada es una composición de EPO en la que al menos un 99 % de la EPO presente en la composición está mono-PEGilada. Las composiciones de EPO producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % de proteína mono-PEGilada. Las composiciones de EPO producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 98 % de EPO mono-PEGilada. Las composiciones de EPO producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 99 % de EPO mono-PEGilada.
Son conocidos procedimientos para la determinación de la pureza para los expertos en la técnica. La pureza de una proteína no PEGilada, mono-PEGilada u oligo-PEGilada se puede determinar por cualquier procedimiento de análisis adecuado (por ejemplo, intensidad de banda en gel, ELISA, HPLC y similares). La determinación de la pureza puede implicar usar una curva de calibración generada usando un material de referencia de pureza conocida. La pureza también se puede determinar en una base de peso a peso. La pureza de una proteína no PEGilada o PEGilada expresada en el presente documento en términos de porcentaje (%) se puede determinar, por ejemplo, usando valores de "área bajo la curva" relativos, que típicamente se pueden obtener para picos en un cromatograma, tal como un cromatograma de HPLC. Los procedimientos de determinación de la pureza incluyen RP-HPLC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Cromatografía de interacción hidrófoba
La cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) separa moléculas en base a diferencias en su hidrofobia superficial. Se puede usar para separar moléculas de proteína. En CIH, una mezcla incluyendo una proteína de interés se puede pasar por un material de CIH. La interacción entre proteínas y un material de CIH se altera por la presencia de determinadas sales. El incremento de la concentración de sal incrementa la interacción y la reducción de la concentración de sal reduce la interacción. Para la elución selectiva, la concentración de sal se puede reducir y los componentes de la mezcla se eluyen en orden de hidrofobia, eluyéndose, por último, los componentes más hidrófobos. En el presente contexto, esto significa que las proteínas no PEGiladas salen, en primer lugar, del material de CIH, y las proteínas mono-PEGiladas se eluyen antes que las proteínas oligo-PEGiladas.
Un "material" de cromatografía en el presente contexto, tal como un material de CIH, se refiere a la fase estacionaria o fase sólida. Esto también se puede denominar resina, matriz o medio. El "material" en este contexto proporciona una matriz a la que se puede unir un componente de una mezcla, tal como una proteína de interés. El material puede ser o puede comprender una columna, por ejemplo, un lecho expandido o una columna de lecho de relleno. El material puede estar en forma de partículas o microesferas discretas. El material puede estar en forma de membrana. El material puede estar en forma de un material monolítico poroso. El material puede estar en forma de fibra funcionalizada, vellón o malla. El material está en forma de cualquier otro soporte sólido que pueda llevar grupos funcionales o que presente propiedades de CIH. En el presente contexto, la fase móvil fluye a través de la fase estacionaria y lleva consigo las sustancias que se van a separar por cromatografía. La fase móvil es una mezcla, tal como una mezcla de proteínas o una solución de flujo continuo. Un tampón, tal como un tampón de elución o tampón de lavado, también es una fase móvil.
En el presente contexto, el término "carga" se refiere a una etapa de poner en contacto una mezcla o composición sobre material de cromatografía. El material de cromatografía se puede equilibrar antes de la etapa de carga.
El equilibrado implica aplicar un tampón de equilibrado al material de cromatografía. El pH y la fuerza iónica del tampón de equilibrado se seleccionan para garantizar que, cuando se carga una mezcla de proteínas sobre la matriz de cromatografía, se logre la unión deseada y/o flujo continuo o proteínas o contaminantes específicos.
Las condiciones de carga pueden promover la unión de componentes no deseados de la mezcla (por ejemplo, contaminantes). En este modo, la proteína de interés puede fluir a través de una matriz del material de intercambio iónico y obtenerse. Este tipo de procedimiento se conoce como modo de "flujo continuo". La composición que se obtiene después de fluir a través de una matriz de material de intercambio iónico es el "flujo continuo" o "solución de flujo continuo". La solución de flujo continuo que sale de la matriz y contiene la proteína de interés también se puede denominar "efluente". A diferencia del modo de "unión y elución", que implica un cambio en la conductividad y/o pH para eluir la proteína de interés de la columna, el modo de "flujo continuo" se lleva a cabo en condiciones isocráticas.
La elución de un material de cromatografía, tal como un material de cromatografía de interacción hidrófoba, se puede lograr disminuyendo la fuerza iónica de un tampón usando elución por gradiente o elución por etapas. La elución por gradiente, o elución por gradiente lineal, se puede usar cuando muchos componentes de interés individual están unidos al material y se pueden eluir de forma diferente, y para una separación de alta resolución. La elución por etapas es útil para retirar un único componente (o retirar conjuntamente un grupo específico de componentes) de un material de cromatografía. La elución por etapas es relativamente rápida y consume menos tampón. La elución por etapas se puede usar para eluir una proteína de interés de un material de cromatografía en una forma relativamente concentrada. La solución que sale del material de cromatografía en la etapa de elución y contiene la proteína de interés puede ser conocido como eluyente o eluido.
Materiales de CIH
Los materiales de CIH pueden comprender una matriz base que se haya funcionalizado con un ligando hidrófobo. Los ligandos hidrófobos en materiales de CIH pueden interactuar con superficies hidrófobas de proteínas. El ligando y el grado de sustitución ("sus.", sustitución, alta o baja) en un material de CIH pueden contribuir a su hidrofobia final y, de este modo, a su selectividad. El ligando puede contener grupos alquilo o arilo. La hidrofobia de los materiales de CIH se incrementa a través de la serie de ligandos: éter, polipropilenglicol (PPG), fenilo, butilo y hexilo. Una matriz base puede ser Sepharose o un polímero metacrílico.
Los materiales de CIH incluyen Toyopearl Ether 650M, Toyopearl Hexyl 650C, Toyopearl Butyl 650M, Toyopearl PPG 600M, Toyopearl Phenyl 650 M (todos de Tosoh Bioscience LLC); Phenyl Sepharose FF (sus. alta), Phenyl Sepharose FF (sus. baja), Phenyl Sepharose HP, Butyl Sepharose FF, Butyl-S Sepharose FF, Butyl Sepharose HP, Capto Butyl ImpRes, Capto Phenyl (sus. alta).
Los materiales de CIH incluyen Toyopearl Phenyl 650S, TSKgel Phenyl 5PW, Butyl Sepharose 4 FF, Butyl-S Sepharose FF, Octyl Sepharose 4 fF, Phenyl Sepharose BB, Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose 6 FF High Sub, Phenyl Sepharose 6 FF con sus. baja, Source I SETH, Source 151 SO, Source 1 SPHE, Phenyl Sepharose BB, Cellufine Butyl, Cellufine Octyl, Cellufine Phenyl, WP Hl-Propyl (C3), Macroprep t-Butyl, Macroprep methyl. Los materiales de CIH incluyen cualquier otro soporte sólido adecuado que pueda llevar grupos funcionales o que presente propiedades de CIH.
Los procedimientos de la invención comprenden una etapa de CIH en dos fases. La etapa de CIH en dos fases implica dos materiales de CIH diferentes. Los dos materiales diferentes se pueden seleccionar por un procedimiento de cribado.
En el procedimiento de cribado, los materiales de CIH se criban para determinar su capacidad de unirse a versiones no PEGiladas, mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas de una proteína en una etapa de CIH que implica la carga, el lavado y la elución por gradiente lineal de proteínas. Los materiales de CIH se criban para determinar la capacidad de separar formas no PEGiladas, mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas de la proteína. Los materiales de CIH que pueden separar formas no PEGiladas, mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas de la proteína se presentan como candidatos y los materiales de CIH restantes se excluyen de una consideración adicional.
Se comparan los cromatogramas de CIH de los materiales de CIH candidatos y se selecciona un par de materiales de CIH que presenten buena resolución entre picos para la proteína mono-PEGilada. La figura 1 muestra cromatogramas de CIH para tres materiales de CIH candidatos. Cada material de CIH puede separar EPO no PEGilada, EPO mono-PEGilada y EPO oligo-PEGilada. En la CIH, el material se equilibra con una solución con alto contenido de sal y las proteínas se eluyen disminuyendo la concentración de sal (en una elución por etapas o por gradiente), eluyéndose, por último, las especies más hidrófobas. El primer pico para cada trazado es EPO no PEGilada, que no se une a los materiales de CIH y sale en la solución de flujo continuo. El segundo pico para cada trazado es EPO mono-PEGilada y el tercer pico es EPO oligo-PEGilada.
Como se puede ver en los cromatogramas comparativos de la figura 1, los picos para EPO mono-PEGilada (el segundo pico de cada trazado) muestran la mayor separación para Phenyl Sepharose HP y Toyopearl Phenyl 650M. Esto significa que este par de materiales de CIH es adecuado para su uso en los procedimientos divulgados en el presente documento porque en las mismas condiciones de CIH (misma concentración de sal) los dos materiales muestran diferentes capacidades para unirse a EPO mono-PEGilada. El material de CIH más hidrófilo (en este caso, Phenyl Sepharose HP) se usa como primer material de CIH, y el material más hidrófobo (en este caso, Toyopearl Phenyl 650M) se usa como segundo material de CIH.
Como se puede ver en la figura 1, a aproximadamente 60 mS/cm, ni Phenyl Sepharose HP ni Toyopearl Phenyl 650M se unen a EPO no PEGilada. Esto significa que se puede aplicar una mezcla de proteínas a ambos materiales de CIH, el primero y, a continuación, el segundo, y la EPO no PEGilada se recuperará en la solución de flujo continuo del segundo material de CIH.
La figura 1 también muestra que, a 54,5 mS/cm, Phenyl Sepharose HP (el primer material de CIH) no se une a EPO mono-PEGilada, mientras que Toyopearl Phenyl 650M (el segundo material de CIH) se une a EPO mono-PEGilada. Esto significa que se puede aplicar una mezcla de proteínas al primer material de CIH y, a continuación, al segundo material de CIH en las mismas condiciones y la e Po mono-PEGilada solo se unirá al segundo material de CIH. La figura 1 también muestra que, a 54,5 mS/cm, Phenyl Sepharose HP (el primer material de CIH) todavía se une a EPO oligo-PEGilada y, por lo tanto, el primer material de CIH secuestrará toda o la mayor parte de la EPO oligo-PEGilada antes de que alcance el segundo material de CIH.
La figura 1 también muestra que, a aproximadamente 41 mS/cm, Toyopearl Phenyl 650M (el segundo material de CIH) ya no se une a EPO mono-PEGilada y, por lo tanto, la EPO mono-PEGilada se puede eluir del segundo material de CIH a alrededor de esta conductividad.
Los resultados mostrados en la figura 1 demuestran que los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden realizar usando Phenyl Sepharose HP como el primer material de CIH y Toyopearl Phenyl 650M como el segundo material de CIH.
Los valores de conductividad (concentraciones de sal) adecuados para los diferentes tampones durante la etapa de CIH en dos fases y la etapa de elución del segundo material de CIH se pueden determinar a partir del tipo de estudio cromatográfico comparativo mostrado en la figura 1.
El procedimiento de cribado descrito en el presente documento se puede repetir para otros tipos de materiales de CIH para encontrar otros pares de materiales de CIH adecuados para realizar los procedimientos de la presente invención, en mezclas de EPO que comprenden EPO no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada o bien en otras mezclas de proteínas que comprenden EPO no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada.
El experto en la técnica familiarizado con las técnicas de CIH puede realizar el procedimiento de cribado descrito en el presente documento para identificar otros pares de materiales de CIH y condiciones de CIH en dos fases adecuadas para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. Esto se debe a que está bien establecido en el campo de CIH que la selección de materiales de CIH y componentes de muestra normalmente se hace de forma empírica, porque el comportamiento hidrófobo de una proteína es difícil de predecir. Por lo tanto, es una práctica común en la CIH determinar el material de CIH más adecuado y el tipo y concentraciones de sal que se van a usar caso a caso.
Se sabe que el rendimiento de los materiales de CIH (selectividad, resolución y capacidad de unión) está influenciado por muchos parámetros: propiedades de la proteína, tipo de ligando, grado de sustitución del ligando, concentración y tipo de sal usada durante la aplicación de la proteína y presencia de detergentes. En menor grado, la temperatura, el pH y el tipo de matriz base (por ejemplo, Sepharose) pueden tener algún efecto. Los parámetros más importantes para determinar el rendimiento del material de CIH para una proteína específica son el tipo de ligando y el grado de sustitución del ligando (la hidrofobia del material de CIH, la fase estacionaria) y el tipo y concentración de sal (la conductividad de las soluciones carga y tampón, la fase móvil).
Los ligandos más comunes usados en los materiales de CIH son fenilo, butil-S, butilo, octilo, éter e isopropilo.
Un mayor grado de sustitución del ligando (mayor densidad de ligando) proporciona un material de CIH más hidrófobo. Por ejemplo, un material de CIH con un nombre que incluya "sus. alta" será más hidrófobo que el correspondiente material de CIH con "sus. baja".
La capacidad de una sal particular para promover la interacción hidrófoba entre una proteína y un material de CIH depende de las especies iónicas presentes y su concentración. Se pueden someter a prueba varios tipos de sales cuando se criba la idoneidad de un material de CIH particular para su uso en los procedimientos divulgados en el presente documento. A medida que se incrementa la concentración de sal, la cantidad de proteína unida al material de CIH se incrementa hasta el punto de precipitación para la proteína. Las sales comúnmente usadas en CIH incluyen (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl, KCl y CH3COONH4. Las sales pueden incluir cualquiera de los siguientes aniones en combinación con cualquiera de los siguientes cationes. Los aniones, en orden de efecto de precipitación decreciente, son PO43-, SO42", CH3COO-, Cl-, Br, NO3", ClO4", I", SCN\ Los cationes, en orden de efecto caotrópico creciente, son NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+.
El experto en la técnica puede variar el tipo y grado de sustitución del ligando en el material de CIH, y el tipo y concentración de la sal, para proporcionar o cribar para determinar un perfil de proteína particular. Por ejemplo, si la especie proteínica de interés no se une en condiciones de alto contenido de sal, entonces se puede usar un medio más hidrófobo. Si una especie proteínica que se desea que permanezca en la solución de flujo continuo (tal como una proteína no PEGilada) se une al material de CIH en condiciones de alto contenido de sal al inicio del procedimiento, la concentración de sal en el tampón de equilibrado se puede disminuir y/o se puede usar un medio de CIH menos hidrófobo.
Tanto el primer material de CIH como el segundo material de CIH pueden separar proteínas no PEGiladas, mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas en condiciones específicas. Este rasgo característico se puede identificar usando un cromatógrafo UV de un procedimiento de CIH en condiciones específicas. Las condiciones pueden comprender aplicar una mezcla de proteínas al material de CIH en condiciones de alto contenido de sal y aplicar un gradiente descendente de concentración de sal para eluir a las proteínas. Los materiales de CIH adecuados en condiciones de alto contenido de sal (condiciones de partida) no se unen a la proteína no PEGilada, de modo que se pueda recuperar en la solución de flujo continuo. Los materiales de CIH adecuados también separan proteínas mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas durante el gradiente de elución. Los materiales de CIH, en particular, adecuados son aquellos que muestran picos de elución relativamente estrechos, relativamente altos y/o relativamente simétricos para cada una de las especies mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas.
Los procedimientos divulgados en el presente documento comprenden una etapa de CIH en dos fases que usa dos materiales de CIH diferentes: un primer material de CIH y un segundo material de CIH. El primer material de CIH y segundo material de CIH se pueden denominar par de materiales de CIH.
Se puede identificar un par adecuado de materiales de CIH para su uso en los procedimientos divulgados en el presente documento superponiendo los cromatogramas de CIH para una mezcla de proteínas específica en condiciones de CIH específicas, para proporcionar un cromatograma de CIH comparativo. Un par adecuado de materiales de CIH puede tener una buena resolución de picos de elución mono-PEGilados. Es decir, los picos de elución para la proteína mono-PEGilada cuando se superponen en un cromatograma de CIH comparativo se deben solapar lo menos posible. Un par adecuado de materiales de CIH puede ser un par que no tenga sustancialmente ningún solapamiento de picos de elución para la proteína mono-PEGilada. Es decir, sustancialmente no existe solapamiento del pico de elución para la proteína mono-PEGilada de los dos materiales de CIH. Un par adecuado de materiales de CIH puede ser un par que tenga poco solapamiento de picos de elución para la proteína mono-PEGilada. Se puede hacer referencia a dichos pares de materiales de CIH como que tienen tener picos bien separados para el producto mono-PEGilado.
La resolución (Rs) entre dos picos de elución se puede definir como la distancia entre los máximos de pico en comparación con el ancho de base promedio de los dos picos (véase Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography, Principies and Methods, GE Handbook, 2006). Los volúmenes de elución y los anchos de pico se miden con las mismas unidades para dar un valor de resolución adimensional Rs que proporcione una medida de la separación relativa entre dos picos.
La resolución, Rs, una medida de lo bien que están separados dos picos, se puede expresar como:
tr2 - tr1
Rs Wb2 + W bi)/2
donde tri y Wbi son el tiempo de retención y el ancho de la línea base, respectivamente, para el pico que se eluye en primer lugar, y tr2 y Wb2 son el tiempo de retención y el ancho de la línea base, respectivamente, para el pico que se eluye en segundo lugar.
En los procedimientos divulgados en el presente documento, un material de CIH puede separar proteínas mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas en condiciones específicas para proporcionar un cromatograma de CIH en el que los respectivos picos de elución tienen una resolución (Rs) de al menos 0,5, 0,8, 1,0, 1,2 o 1,5.
Un material de CIH para su uso en los procedimientos divulgados en el presente documento puede mostrar picos de elución bien separados para la proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada.
Un material de CIH para su uso como segundo material de CIH en los procedimientos divulgados en el presente documento puede mostrar un pico de elución para la proteína mono-PEGilada que tiene una composición de al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % o de aproximadamente un 100 % de proteína mono-PEGilada. Por ejemplo, en los experimentos descritos a continuación, se descubrió que Toyopearl Phenyl 650M proporciona una fracción CIH de e Po mono-PEGilada que comprende aproximadamente un 100 % de EPO mono-PEGilada (tablas 3 y 6).
En los procedimientos divulgados en el presente documento, un par de materiales de CIH puede proporcionar un cromatograma de CIH comparativo en el que los picos para la proteína mono-PEGilada para cada respectivo material de CIH tienen una resolución (Rs) de al menos 0,8, 1,0, 1,2 o 1,5. Se puede hacer referencia a un par de materiales de CIH de este tipo como que tiene picos bien separados para el producto mono-PEGilado. Un cromatograma de CIH comparativo es una superposición de trazados de cromatograma para dos o más materiales de CIH diferentes en las mismas condiciones de CIH. Un cromatograma de CIH comparativo permite comparar los picos de elución para materiales de CIH diferentes en las mismas condiciones.
Un par de materiales de CIH puede proporcionar un cromatograma de CIH comparativo en el que los respectivos picos de elución para la proteína mono-PEGilada y/u oligo-PEGilada tengan máximos separados por volúmenes de retención de al menos 3 ml cuando se usa el diseño de cromatografía en el ejemplo 1 (figura 4), o que tengan máximos con volumen de retención, o en el que el pico de elución del segundo material de CIH sea más de un 10 %, 15 % o 20 % mayor en términos de volumen de retención que el correspondiente pico de elución del primer material de CIH.
En un cromatograma de CIH comparativo para un par adecuado de materiales de CIH, se puede usar el material de CIH para el que el pico de elución para la proteína mono-PEGilada es más temprano (el volumen de retención es menor) como el primer material de CIH. El primer material de CIH se puede describirse como más hidrófilo (o menos hidrófobo) que el segundo material de CIH.
Procedimientos para producir composiciones de proteína mono-PEGilada
La presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada. La presente invención proporciona un procedimiento para purificar proteína mono-PEGilada de una mezcla que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada.
La presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; b) someter la mezcla de proteínas a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) en dos fases, que comprende: aplicar la mezcla de proteínas a un primer material de CIH para proporcionar una primera solución de flujo continuo de CIH; y aplicar la primera solución de flujo continuo de CIH a un segundo material de CIH para proporcionar una segunda solución de flujo continuo de CIH, en el que el segundo material de CIH es diferente del primer material de CIH; y en el que la etapa de CIH en dos fases se realiza en condiciones de CIH en dos fases, siendo dichas condiciones de CIH en dos fases adecuadas para unir la proteína oligo-PEGilada al primer material de CIH y unir la proteína mono-PEGilada al segundo material de CIH; y c) eluir la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH, en el que el segundo eluido de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada.
La proteína puede ser EPO. La proteína puede ser una hormona. La proteína puede ser una hormona, una citocina, una enzima o un anticuerpo.
Las condiciones de CIH en dos fases se pueden denominar, de forma alternativa, único conjunto de condiciones o condiciones fijas. No existe ningún ajuste de las condiciones de CIH entre la aplicación de la mezcla de proteínas al primer material de CIH y la aplicación de la primera solución de flujo continuo de CIH al segundo material de CIH. Las condiciones de CIH en dos fases son las condiciones de sal, tampón para pH y pH usadas en la etapa de CIH en dos fases. Las condiciones de CIH en dos fases se pueden referir a la composición de la mezcla de proteínas (o composición de carga), tampón de equilibrado y tampón de lavado usados en la etapa de CIH en dos fases.
El término "condiciones" en el contexto de la presente divulgación se refiere a la composición de la fase móvil. En particular, se refiere al tipo y concentración de sal en la fase móvil. También se puede referir al tipo y concentración de otros sustituyentes en la fase móvil, tales como tampón para pH o detergente.
La mezcla de proteínas se aplica en ambos materiales de CIH en la etapa de CIH en dos fases. La primera solución de flujo continuo de CIH se puede aplicar directamente al segundo material de CIH sin ninguna etapa de acondicionamiento o ajuste intermedia. El primer material de CIH y segundo material de CIH se pueden conectar directamente. El primer material de CIH y segundo material de CIH se pueden conectar directamente en serie. Por ejemplo, el primer material de CIH está comprendido en una primera columna de CIH y el segundo material de CIH está comprendido en una segunda columna de CIH, y la primera columna de CIH está conectada directamente a la segunda columna de CIH. La primera solución de flujo continuo de CIH de la primera columna de CIH se puede suministrar directamente a la segunda columna de CIH. Puede existir una conexión en línea entre la primera columna de CIH y la segunda columna de CIH. Puede existir un mecanismo que permita el flujo continuo entre la primera columna de CIH y la segunda columna de CIH. Las etapas del procedimiento se pueden realizar de forma continua. Las etapas del procedimiento se pueden realizar en paralelo, es decir, la etapa (b) se puede comenzar antes de que se complete la etapa (a), de modo que las etapas (a) y (b) se desarrollen en paralelo. La realización del procedimiento de forma continua (o en paralelo) es ventajoso porque es relativamente rápido y eficaz.
Las etapas del procedimiento de la invención se pueden realizar de forma secuencial. El procedimiento puede comprender las etapas secuenciales de: (a) proporcionar una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; (b) someter la mezcla de proteínas a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) en dos fases, que comprende: aplicar la mezcla de proteínas a un primer material de CIH para proporcionar una primera solución de flujo continuo de CIH; y aplicar la primera solución de flujo continuo de CIH a un segundo material de CIH para proporcionar una segunda solución de flujo continuo de CIH, en el que el segundo material de CIH es diferente del primer material de CIH; y en el que la etapa de CIH en dos fases se realiza en condiciones de CIH en dos fases, siendo dichas condiciones de CIH en dos fases adecuadas para unir la proteína oligo-PEGilada al primer material de CIH y unir la proteína mono-PEGilada al segundo material de CIH; y (c) eluir la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH, en el que el segundo eluido de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada.
El término "secuencial" significa que no se produce ninguna etapa de cromatografía intermedia y/o ninguna etapa de acondicionamiento o ajuste intermedia entre cualquiera de las etapas de a a c (ninguna etapa intermedia entre las etapas (a) y (b) o (b) y (c)). El término "secuencial" significa que no se produce ninguna etapa intermedia entre cualquiera de las etapas enumeradas en una cualquiera de las reivindicaciones. Las etapas de los procedimientos de la invención se pueden realizar directamente, lo que significa que cada una de las etapas (b) y (c) se realiza directamente tras la etapa previa. El procedimiento puede consistir en las etapas de (a) a (c). El procedimiento puede consistir en las etapas enumeradas en una cualquiera de las reivindicaciones. El procedimiento se puede realizar de forma continua y secuencial.
El primer material de CIH y segundo material de CIH son diferentes entre sí. Pueden ser diferentes en términos del tipo de ligando y/o el grado de sustitución del ligando (la densidad del ligando). El primer material de CIH puede ser más hidrófilo que el segundo material de CIH. El primer material de CIH puede ser Phenyl Sepharose HP. El segundo material de CIH puede ser Toyopearl Phenyl 650M.
En las condiciones de CIH en dos fases, el primer material de CIH no se une, o no se une significativamente, a la proteína no PEGilada. En las condiciones de CIH en dos fases, el segundo material de CIH no se une, o no se une significativamente, a la proteína no PEGilada. La fracción de proteína no PEGilada en la primera solución de flujo continuo de CIH y/o en la segunda solución de flujo continuo de CIH es sustancialmente la misma que en la mezcla de proteínas.
En las condiciones de CIH en dos fases, el primer material de CIH no se une, o no se une significativamente a la proteína mono-PEGilada. La fracción de proteína mono-PEGilada en la primera solución de flujo continuo de CIH es sustancialmente la misma que en la mezcla de proteínas.
En el presente contexto, el término "no se une significativamente" puede significar que el material de CIH se une a menos de aproximadamente un 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,01 % de la especie proteínica a la que se hace referencia. En el presente contexto, el término una fracción de una especie proteínica que sea "sustancialmente la misma" está dentro de aproximadamente ± un 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2,5 %, 5 % o 10 % del valor de referencia. Por ejemplo, una primera solución de flujo continuo de CIH que contiene una fracción de proteína mono-PEGilada que es sustancialmente la misma que la de la mezcla de proteínas puede contener una proporción de proteína mono-PEGilada que esté dentro de aproximadamente ± un 1 % de la proporción de proteína mono-PEGilada en la mezcla de proteínas.
En los procedimientos divulgados en el presente documento, el primer material de CIH es más hidrófilo que el segundo material de CIH, expresado, de forma alternativa, el segundo material de CIH es más hidrófobo que el segundo material de CIH. El primer material de CIH se puede determinar como más hidrófilo que el segundo material de CIH porque en un cromatograma comparativo eluye, en primer lugar, la proteína mono-PEGilada. El tiempo de retención de la proteína mono-PEGilada durante la elución por gradiente es menor para el primer material de CIH que para el segundo material de CIH.
La referencia a la capacidad de unión dinámica en el presente documento se refiere a la capacidad de unión dinámica en las condiciones elegidas para el procedimiento o etapa de cromatografía. La capacidad de unión dinámica de un medio de cromatografía en condiciones de cromatografía particulares para una proteína particular se puede considerar como la máxima cantidad de esa proteína que se puede cargar sobre el medio de cromatografía sin provocar una pérdida de proteína innecesaria. Es decir, la máxima cantidad de proteína de interés que se puede cargar sin provocar un "arrastre". Se puede supervisar el arrastre de proteínas por espectrofotometría, por ejemplo, a 280 nm (A280). El umbral de arrastre puede ser de un 10 %. Las condiciones de cromatografía pueden ser el pH, la conductividad y el caudal, y las concentraciones de cualquier sal u otros aditivos con respecto a la fase móvil. La capacidad de unión dinámica del primer o segundo material de CIH se puede determinar en las condiciones de funcionamiento para los procedimientos de CIH en dos fases de la invención. Por ejemplo, las condiciones de CIH en dos fases pueden ser condiciones en las que el primer material de CIH tiene una capacidad de unión dinámica relativamente alta para la proteína oligo-PEGilada. Las condiciones de CIH en dos fases pueden ser condiciones en las que el segundo material de CIH tiene una capacidad de unión relativamente alta para la proteína mono-PEGilada. Las condiciones de CIH en dos fases y los materiales de CIH se pueden seleccionar para ajustar, u optimizar, la capacidad de unión dinámica de los primer y segundo materiales de CIH para que la proteína oligo-PEGilada se retenga (se una fuertemente) por el primer material de CIH y la proteína mono-PEGilada se retenga (se una fuertemente) por el segundo material de CIH.
Las condiciones de CIH en dos fases pueden ser de tal modo que la cantidad de proteína oligo-PEGilada aplicada al primer material de CIH sea menor que, o aproximadamente un 80-95 % de, o aproximadamente 2, 5, 10, 20 o 30 veces menor que la capacidad de unión dinámica del primer material de CIH para la proteína oligo-PEGilada. Las condiciones de CIH en dos fases pueden ser de tal modo que sustancialmente ninguna proteína oligo-PEGilada "se arrastre" en el primer material de CIH. Las condiciones de CIH en dos fases pueden ser de tal modo que la mayor parte de, o sustancialmente toda, la proteína oligo-PEGilada se retiene por el primer material de CIH. El primer material de CIH, en las condiciones de CIH en dos fases, puede tener una capacidad de unión dinámica para la proteína oligo-PEGilada que sea mayor que, o aproximadamente 2, 5, 10, 20 o 30 veces mayor que, la cantidad de proteína oligo-PEGilada cargada sobre el material. El uso de un primer material de CIH con una capacidad de unión dinámica relativamente baja para la proteína oligo-PEGilada es ventajoso, por ejemplo, porque se puede cargar una cantidad relativamente grande de proteína (una cantidad relativamente grande de mezcla de proteínas) sobre el primer material de CIH. Esto posibilita, por ejemplo, el uso de una columna más pequeña, lo que es económicamente ventajoso.
Las condiciones de CIH en dos fases pueden ser de tal modo que la cantidad de proteína mono-PEGilada aplicada al segundo material de CIH sea menor que, o aproximadamente un 80-95 % de, o aproximadamente 2, 5, 10, 20 o 30 veces menor que la capacidad de unión dinámica del segundo material de CIH para proteína mono-PEGilada. El segundo material de CIH, en las condiciones de CIH en dos fases, puede tener una capacidad de unión dinámica para la proteína mono-PEGilada que sea mayor que, o aproximadamente 2, 5, 10, 20 o 30 veces mayor que, la cantidad de proteína mono-PEGilada cargada sobre el material. El uso de un segundo material de CIH con una capacidad de unión dinámica relativamente baja para la proteína mono-PEGilada es ventajoso, por ejemplo, porque se puede cargar una cantidad relativamente grande de proteína (una cantidad relativamente grande de la primera solución de flujo continuo de CIH) sobre el segundo material de CIH. Esto posibilita, por ejemplo, el uso de una columna más pequeña, lo que es económicamente ventajoso.
En los cromatogramas de elución de CIH comparativos, el primer material de CIH y el segundo material de CIH pueden tener picos de elución bien separados para la proteína mono-PEGilada. Los picos bien separados son picos con poco o ningún solapamiento. En los cromatogramas de elución de CIH comparativos, el primer material de CIH y el segundo material de CIH pueden tener picos de elución para la proteína mono-PEGilada para la que Rs es de al menos, o de al menos aproximadamente, 0,8, 1,0, 1,2 o 1,5.
El primer material de CIH puede ser Phenyl Sepharose HP (por ejemplo, HiTrap Pheny1HP; GE Healthcare). El primer material de CIH puede ser un material de CIH que tenga sustancialmente la misma selectividad que Phenyl Sepharose HP. El primer material de CIH puede ser un material de CIH que tiene sustancialmente la misma selectividad que Phenyl Sepharose HP para EPO mono-PEGilada en un gradiente descendente de Na2SO4 500 mM a 0 mM, en h Ep ES 25 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente. La proteína puede ser eritropoyetina.
El segundo material de CIH puede ser Toyopearl Phenyl 650M (Tosoh Bioscience LLC). El segundo material de CIH puede ser un material de CIH que tenga sustancialmente la misma selectividad que Toyopearl Phenyl 650M. El segundo material de CIH puede ser un material de CIH que tiene sustancialmente la misma selectividad que Toyopearl Phenyl 650M para EPO mono-PEGilada en un gradiente descendente de Na2SO4500 mM a 0 mM, en HEp Es 25 mM, pH 7,5, a temperatura ambiente. La proteína puede ser eritropoyetina.
Sustancialmente la misma selectividad para EPO mono-PEGilada se puede referir a tener sustancialmente los mismos máximos de pico de elución, lo que puede significar un tiempo de retención o volumen de ± un 10 %, o se puede referir a tener una resolución en un cromatograma comparativo para la que Rs sea al menos, o al menos aproximadamente, 0,8, 1,0, 1,2 o 1,5.
Un material de CIH usado en los procedimientos divulgados en el presente documento puede comprender un ligando de fenilo. Puede comprender una resina metacrílica funcionalizada con un ligando de fenilo. El material de CIH puede comprender una matriz base de Sepharose o polímero metacrílico hidroxilado. HiTrap Pheny1HP (alto rendimiento) comprende una matriz base de Sepharose con un ligando de fenilo a una densidad de ligando de 25 |jmol/ml de medio. El primer material de CIH puede comprender una matriz base (por ejemplo, una matriz de Sepharose) con un ligando de fenilo a aproximadamente 20-30 jmol/ml de medio, o a aproximadamente 25 jmol/ml de medio. El segundo material de CIH puede comprender una matriz base (por ejemplo, una matriz de Sepharose) con un ligando de fenilo a aproximadamente 40-50 jmol/ml de medio, o a aproximadamente 40 o 50 jmol/ml de medio. Toyopearl Phenyl 650M comprende una matriz base de polímero metacrílico hidroxilado con un ligando de fenilo. El segundo material de CIH puede comprender una matriz base de polímero metacrílico hidroxilado con un ligando de fenilo. El primer material de CIH puede ser más hidrófilo que el segundo material de CIH. Los materiales de CIH usados en los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En los procedimientos divulgados en el presente documento, la proteína mono-PEGilada se eluye del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH (etapa c). El segundo eluido de CIH proporciona una composición de proteína mono-PEGilada. El segundo eluido de CIH comprende una fracción incrementada de proteína mono-PEGilada con respecto a la mezcla de proteínas. El segundo eluido de CIH puede comprender al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de proteína mono-PEGilada. La proteína mono-PEGilada se puede eluir del segundo material de CIH por un gradiente lineal, que puede ser una concentración de sal descendente. La proteína mono-PEGilada se puede eluir del segundo material de CIH por un gradiente por etapas, que puede ser una concentración de sal disminuida.
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden comprender eluir la proteína oligo-PEGilada del primer material de CIH para proporcionar un primer eluido de CIH. El "primer eluido de CIH" también se puede denominar "primer eluido de material de CIH", porque es el eluido del primer material de CIH en la etapa de CIH en dos fases. El primer eluido de CIH proporciona una composición de proteína oligo-PEGilada. El primer eluido de CIH comprende una fracción incrementada de proteína oligo-PEGilada con respecto a la mezcla de proteínas. El primer eluido de CIH puede comprender al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de proteína oligo-PEGilada. La proteína oligo-PEGilada se puede eluir del material de CIH lineal por un gradiente lineal, que puede ser una concentración de sal descendente. La proteína oligo-PEGilada se puede eluir del primer material de CIH por un gradiente por etapas, que puede ser una concentración de sal disminuida.
La mezcla de proteínas comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada. Puede tener sustancialmente la misma composición de aditivos que el tampón de equilibrado usado en la etapa de CIH en dos fases. Puede tener sustancialmente la misma composición de aditivos que el tampón con alto contenido de sal (tampón A). Una mezcla de proteínas de este tipo también se puede denominar en el presente documento composición de carga, solución de carga o muestra. La mezcla de proteínas se puede preparar concentrando la proteína, por ejemplo, por centrifugación, y suspendiéndola en un tampón con alto contenido de sal. La mezcla de proteínas se puede preparar por intercambio de tampón. La mezcla de proteínas o composición de carga puede tener una concentración de proteínas de 0,1 - 1,0 mg/ml, 0,2-0,5 mg/ml o aproximadamente 0,25 mg/ml. La concentración de proteínas se puede determinar por espectroscopia UV a 280 nm.
Los procedimientos de CIH divulgados en el presente documento implican tampones de diversas concentraciones de sal. Los procedimientos pueden implicar usar un tampón con alto contenido de sal (tampón A) y un tampón con bajo contenido de sal (tampón B) y preparar otras diversas soluciones tampón usando proporciones variables de tampón A y tampón B.
El tampón con alto contenido de sal (tampón A) comprende una sal, que puede ser Na2SO4. La sal puede ser (NH4)2So 4, Na2SO4, NaCl, KCl y CH3COONH4. El tampón con alto contenido de sal puede comprender Na2SO4 400-600 mM, Na2SO4 450-550 mM o Na2SO4 aproximadamente 500 mM. El tampón con alto contenido de sal puede comprender una sal alternativa a las mismas concentraciones que se menciona para Na2SO4400-600 mM, o a concentraciones que proporcionen una fuerza iónica o conductividad equivalente. El tampón con alto contenido de sal puede comprender un tampón para pH, tal como HEPES. Por ejemplo, puede comprender tampón para pH aproximadamente 10-50 mM, tampón para pH aproximadamente 20-30 mM o tampón para pH aproximadamente 25 mM, que puede ser HEPES. El tampón con alto contenido de sal puede tener un pH de aproximadamente 7,0­ 8,0 o de aproximadamente 7,5. El tampón con alto contenido de sal puede comprender HEPEs aproximadamente 25 mM, a aproximadamente pH 7,5, y Na2SO4 aproximadamente 500 mM. El tampón con alto contenido de sal puede tener una conductividad de aproximadamente 40-80 mS/cm, 50-70 mS/cm, 55-65 mS/cm o de aproximadamente 60 mS/cm.
El tampón con bajo contenido de sal (tampón B) no comprende ninguna sal o comprende una baja concentración de sal. El tampón con bajo contenido de sal puede comprender sal menos de 10 mM. El tampón con bajo contenido de sal puede tener el mismo tampón para pH, sustancialmente a la misma concentración, y sustancialmente el mismo pH que el tampón con alto contenido de sal. El tampón con bajo contenido de sal puede tener una conductividad de aproximadamente 0,5-5 mS/cm, 0,5-2,5 mS/cm o de aproximadamente 1 mS/cm. El tampón con bajo contenido de sal puede tener una conductividad de menos de aproximadamente 5 mS/cm o 2,5 mS/cm.
La mezcla de proteínas puede tener sustancialmente la misma sal, tampón para pH y pH que el tampón con alto contenido de sal. Por ejemplo, la mezcla de proteínas (o composición de carga, o muestra) puede comprender proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada en una solución de HEPES 25 mM, pH 7,5, Na2SO4500 mM.
Los materiales de CIH se pueden equilibrar antes de que se les aplique la mezcla de proteínas para la etapa de CIH en dos fases. El tampón de equilibrado tiene una concentración de sal relativamente alta. El tampón de equilibrado puede comprender aproximadamente un 10-20 % de tampón B y el resto de tampón A. El tampón de equilibrado puede comprender un 13,5 % de tampón B y un 86,5 % de tampón A. El tampón de equilibrado puede comprender un tampón para pH, tal como HEPES. Por ejemplo, puede comprender tampón para pH aproximadamente 10-50 mM, tampón para pH aproximadamente 20-30 mM o tampón para pH aproximadamente 25 mM, que puede ser HEPES. El tampón de equilibrado puede tener un pH de aproximadamente 7,0-8,0 o de aproximadamente 7,5. El tampón de equilibrado puede tener una concentración de sal de sal aproximadamente 400 - 450 mM, o aproximadamente 420-450 mM o aproximadamente 432,5 mM, que puede ser Na2SO4. El tampón de equilibrado puede tener una conductividad de aproximadamente 50-60 mS/cm, o de aproximadamente 54­ 55 mS/cm, o de aproximadamente 54,5 mS/cm.
Después de que la mezcla de proteínas se haya aplicado al primer material de CIH, los primer y segundo materiales de CIH se pueden lavar con un tampón de lavado como parte de la etapa de CIH en dos fases. El tampón de lavado para la etapa de CIH en dos fases puede ser el mismo que el tampón de equilibrado. El tampón de lavado comprende tampón para pH aproximadamente 10-50 mM, tampón para pH aproximadamente 20-30 mM o tampón para pH aproximadamente 25 mM, que puede ser HEPES. El tampón de lavado puede tener un pH de aproximadamente 7,0-8,0 o aproximadamente 7,5. El tampón de lavado puede tener una concentración de sal de sal aproximadamente 400 - 450 mM, o aproximadamente 420-450 mM o aproximadamente 432,5 mM, que puede ser Na2SO4. El tampón de lavado puede tener una conductividad de aproximadamente 50-60 mS/cm, o de aproximadamente 54-55 mS/cm, o de aproximadamente 54,5 mS/cm. Se pueden usar al menos 3, 5 o 10 volúmenes de columna (VC) de tampón de lavado, o se pueden usar 2-25, 5-20, 10-20 o aproximadamente 15 VC de tampón de lavado.
Después de que se hayan lavado los materiales de CIH en la etapa de CIH en dos fases, se eluye la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH (etapa c). La elución del segundo material de CIH puede comprender una elución por etapas. La elución por etapas puede usar un tampón de elución que sea aproximadamente un 30-50 % de tampón B y el resto de tampón A, o aproximadamente un 40 % de tampón B y el resto de tampón A. El tampón de elución puede comprender un tampón para pH, tal como HEPES. Por ejemplo, puede comprender tampón para pH aproximadamente 10-50 mM, tampón para pH aproximadamente 20-30 mM o tampón para pH aproximadamente 25 mM, que puede ser HEPES. El tampón de elución puede tener un pH de aproximadamente 7,0-8,0 o de aproximadamente 7,5. El tampón de elución puede tener una concentración de sal de sal aproximadamente 250-350 mM, 275-325 mM o aproximadamente 300 mM, que puede ser Na2SO4. El tampón de elución puede tener una conductividad de aproximadamente 35-45 mS/cm, de 40-45 mS/cm o de aproximadamente 41,25 mS/cm. La elución por etapas puede comprender el uso de aproximadamente 5-10 o aproximadamente 8 VC de tampón de elución. El tampón de elución puede tener una conductividad al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 mS/cm menor que la conductividad de las condiciones de CIH en dos fases.
La elución del segundo material de CIH puede comprender además un gradiente de elución hasta aproximadamente un 70-90 %, un 75-85 % o aproximadamente un 80 % de tampón B, en aproximadamente 5-20, o 10-15 VC o dentro de 10 VC, o dentro de 14 o 15 VC. El gradiente de elución puede ser de sal aproximadamente 50-200 mM, 50-150 mM, 75-125 mM o aproximadamente 100 mM, que puede ser Na2SO4.
La proteína oligo-PEGilada se puede eluir del primer material de CIH (etapa d). La elución del primer material de CIH puede comprender lavar con tampón de lavado para 5-10 o aproximadamente 8 VC, a continuación, aplicar un gradiente de elución hasta al menos un 90 % o hasta un 100 % de tampón B dentro de 10, 15 o 20 VC y eluir con este tampón para otros 5-10 u 8 VC.
Los materiales de CIH se pueden regenerar con agua pura.
Los procedimientos divulgados en el presente documento son, en particular, adecuados para preparar una composición de proteína mono-PEGilada a partir de una mezcla de proteínas que comprende una proporción relativamente alta de proteína oligo-PEGilada. Los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar con mezclas de proteínas que comprenden al menos un 50 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 30 % de proteína oligo-PEGilada, o aproximadamente un 5-20 % o 10-30 % de proteína oligo-PEGilada.
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada de pureza relativamente alta. Como se describe a continuación, se preparó una composición de proteína mono-PEGilada (un segundo eluido de CIH) que contenía un 100 % de EPO mono-PEGilada usando los procedimientos descritos en el presente documento (tabla 4). El pico 2 de la figura 5 es un segundo eluido de CIH y comprende un 100 % de EPO mono-PEGilada.
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden proporcionar un rendimiento relativamente alto, de modo que una proporción relativamente alta de la proteína mono-PEGilada en la muestra de partida (la mezcla de proteínas) se recupere en la composición de proteína mono-PEGilada. Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada en la que al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 % u 85 % de la proteína mono-PEGilada se recupera de la mezcla de proteínas. Como se describe a continuación, aproximadamente un 89,5 % de la EPO mono-PEGilada se recuperó de una muestra de reacción de PEGilación (mezcla de proteínas) usando los procedimientos divulgados en el presente documento (tabla 7).
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden proporcionar un rendimiento relativamente alto, de modo que una proporción relativamente alta de la proteína no PEGilada en la muestra de partida (la mezcla de proteínas) se recupere en la segunda solución de flujo continuo de CIH, esta proteína no PEGilada se puede reciclar. Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden proporcionar una segunda solución de flujo continuo de CIH en la que al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de la proteína no PEGilada se recupera de la mezcla de proteínas. Como se describe a continuación, aproximadamente un 100 % de la EPO no PEGilada se recuperó de una muestra de reacción de PEGilación (mezcla de proteínas) usando los procedimientos divulgados en el presente documento (tabla 7).
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada de pureza relativamente alta.
El pH de las condiciones de CIH debe ser adecuado para la estabilidad y actividad de las proteínas. El pH puede ser de aproximadamente 5,0-8,5. El pH fisiológico puede ser deseable, en particular, para proteínas terapéuticas o biológicamente activas.
La selección de tampones para pH normalmente no es crítica para la CIH. Se pueden usar tampones fosfato, tampones HEPES u otros tampones de Good. Se pueden usar tampones que tengan un pKa de aproximadamente 6-10. Los tampones que no contengan una amina primaria son, en particular, adecuados (porque una amina primaria puede actuar como compañero para el reactivo PEG, lo que da como resultado algunas moléculas tampón PEGiladas).
Los caudales para las etapas de cromatografía se pueden seleccionar y ajustar de acuerdo con técnicas convencionales. Los caudales más rápidos disminuirán la capacidad de unión, lo que significa que se puede alcanzar un equilibrio entre el logro de la máxima capacidad de unión dinámica y una separación rápida, en particular, cuando se aplican grandes volúmenes de mezclas de proteínas que se van a separar. Los caudales adecuados pueden ser de 50 - 400 cm/h. Los tiempos de residencia pueden ser de 3-5 minutos, o posiblemente menores, dependiendo del material de cromatografía usado. Pueden ser deseables caudales más rápidos y tiempos de residencia más cortos para mejorar la productividad del procedimiento global.
Las etapas de cromatografía se pueden realizar en condiciones "adecuadas para unir" una proteína particular (o forma de PEGilación de una proteína). El experto en la técnica está familiarizado con las técnicas de cromatografía y puede encontrar las condiciones adecuadas para unir de forma empírica una proteína particular, usando su conocimiento general común y guiado por la presente divulgación. Los parámetros tales como material de cromatografía, tipo y/o concentración de sal, pH, tampones, temperatura y caudal se pueden alterar para proporcionar condiciones adecuadas para unir una proteína particular (o forma de PEGilación de una proteína) en cromatografía.
En el presente contexto, las etapas de cromatografía pueden retirar un "contaminante" de una mezcla o una solución (tal como una mezcla de proteínas o una primera solución de flujo continuo de CIH), en el que el contaminante es una forma no deseada de proteína. Un contaminante también se puede denominar impureza. Por ejemplo, puesto que la forma deseada de proteína en el presente contexto es proteína mono-PEGilada, la etapa de cromatografía puede retirar la proteína no PEGilada o la proteína oligo-PEGilada. La etapa de cromatografía también puede retirar otros contaminantes, tales como agregados de proteínas o reactivos de PEGilación.
PEG
El poli(etilenglicol) o PEG es un poliéter hidrófilo neutro. El término "peso molecular" (en kDa) en el presente contexto se ha de entender como el peso molecular medio del PEG porque PEG, como compuesto polimérico, no se obtiene con un peso molecular definido, sino que, de hecho, tiene una distribución de peso molecular; el término "aproximadamente" indica que algunas moléculas, o residuos, de PEG pesarán más y otras menos que el peso molecular indicado, es decir, el término "aproximadamente" en este contexto se puede referir a una distribución de peso molecular en la que un 95 % de las moléculas de PEG tienen un peso molecular dentro de /- un 10 % del peso molecular indicado. Por ejemplo, un peso molecular de 30 kDa puede indicar un intervalo de desde 27 kDa a 33 kDa.
Un residuo de PEG puede contener otros grupos químicos, que son necesarios para las reacciones de unión, que resultan de la síntesis química de la molécula PEGilada, o que son espaciadores para la distancia óptima de partes de la molécula. Estos otros grupos químicos no se usan para el cálculo del peso molecular del residuo de PEG. Además, un residuo de PEG de este tipo puede consistir en una o más cadenas de PEG que están enlazadas covalentemente entre sí. Los residuos de PEG con más de una cadena de PEG se llaman residuos de PEG con múltiples ramas o ramificado. Se pueden preparar residuos de PEG ramificado, por ejemplo, por la adición de poli(óxido de etileno) a diversos polioles, incluyendo glicerol, pentaeritriol y sorbitol. Se informa de residuos de PEG ramificado, por ejemplo, en los documentos EP 0473 084, US 5.932.462. Una molécula de PEG usada en una reacción de PEGilación, y un residuo de PEG en una proteína PEGilada, pueden tener cada uno un peso molecular de al menos aproximadamente 12 kDa, o de al menos aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 20 kDa a 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. Un residuo de PEG puede tener un peso molecular de 20 kDa a 35 kDa y ser un residuo de PEG lineal. Un residuo de PEG puede tener un peso molecular de 35 kDa a 40 kDa y ser un residuo de PEG ramificado.
Una EPO mono-PEGilada puede comprender un único residuo de PEG que tenga un peso molecular de al menos aproximadamente 12 kDa, o de al menos aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 20 kDa a 40 kDa, de aproximadamente 20 kDa o de aproximadamente 30 kDa. Un residuo de PEG puede tener un peso molecular de al menos aproximadamente 20 kDa.
Una proteína mono-PEGilada es una proteína que comprende un único residuo de PEG. Es decir, la proteína mono-PEGilada solo tiene un residuo de PEG. Una proteína oligo-PEGilada comprende al menos dos residuos de PEG. Por ejemplo, una proteína oligo-PEGilada puede ser una proteína di-, tri o tetra-PEGilada. El término proteína oligo-PEGilada (o proteína poli-PEGilada) se puede referir a un grupo de moléculas de proteína oligo-PEGilada que tienen grados variables de PEGilación (dos, tres o más residuos de PEG). El término proteína PEGilada se refiere a proteínas mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas. El término proteína PEGilada se puede referir a una proteína que consiste en una proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada. Una proteína no PEGilada es una proteína que no comprende ningún residuo de PEG. Una proteína no PEGilada, en el contexto de una reacción de PEGilación, también se puede denominar proteína sin reaccionar. Una proteína no PEGilada se puede denominar proteína natural, o proteína no PEGilada o proteína libre.
El término "PEGilación" significa un enlace covalente de un residuo de PEG con una proteína. En particular, se puede referir a un enlace covalente en el extremo N del polipéptido y/o un residuo de lisina interno. La PEGilación de proteínas es ampliamente conocida en el estado de la técnica y se revisa, por ejemplo, por Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. El PEG se puede enlazar usando diferentes grupos funcionales y polietilenglicoles con diferentes pesos moleculares, PEG lineales y ramificados, así como diferentes grupos de enlace (véase también Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier 30 Systems 9 (1992) 249-304). Se puede realizar la PEGilación de eritropoyetina en solución acuosa con reactivos de PEGilación como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/44785, en un modo de realización usando moléculas de PEG lineal o ramificado activado con NHS de un peso molecular entre 5 kDa y 40 kDa. También se puede realizar la PEGilación en la fase sólida de acuerdo con Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. También se puede producir de forma no aleatoria, de forma N terminal, el polipéptido PEGilado de acuerdo con el documento Wo 94/01451. También se revisan reacciones de PEGilación en los documentos WO 2009/010270 y WO 2012/035037.
Los derivados de PEG adecuados son moléculas de PEG activado con un peso molecular promedio de desde aproximadamente 5 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa. En un modo de realización, el derivado de PEG es un PEG lineal o uno ramificado. Se puede obtener una amplia variedad de derivados de PEG adecuados para su uso en la preparación de conjugados de PEG-proteína y PEG-péptido a partir de Shearwater Polymers (Huntsville, AL, EE. uU.; www.nektar.com). Los derivados de pEg activado son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363­ 368.
Se puede realizar una reacción de PEGilación a un pH de aproximadamente 6,5 a 9,5, de aproximadamente 7,0 a 9,0 o de aproximadamente 7,5 a 8,5 o de aproximadamente 8,0. El pH al que se realiza la reacción de PEGilación puede depender del reactivo de PEG usado. El reactivo de PEG puede ser mPEG-NHS, mPEG-SPA, mPEG-SVA o mPEG-CI. La reacción de PEGilación se puede realizar a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, o de aproximadamente 7,5 a 8,5, o aproximadamente 8,0 usando reactivo de PEG activado (NHS). La reacción de PEGilación se puede realizar a aproximadamente 15-25 °C, o a aproximadamente 18-22 °C, o a aproximadamente 20 °C. La reacción de PEGilación se puede llevar a cabo durante al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50 o 60 minutos, o aproximadamente 30-90, o 30-60 minutos, o aproximadamente 40, 50 o 60 minutos.
Se puede realizar una reacción de PEGilación en una solución que comprende una sal y un tampón. La sal puede ser Na2SO4 y el tampón puede ser bicina. La sal puede estar presente en una cantidad de 5-10 mM o aproximadamente 7,5 mM. El tampón puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 10-50 mM, 20­ 30 mM o aproximadamente 25 mM. La reacción de PEGilación se puede realizar en Na2SO4 7,5 mM y bicina 25 mM.
El pH de la reacción de PEGilación puede ser sustancialmente el mismo que el pH de las condiciones de CIH en dos fases. El pH de la reacción de PEGilación se puede seleccionar para que sea sustancialmente el mismo que el pH de las condiciones de CIH en dos fases, de modo que la mezcla de proteínas resultante de la reacción de PEGilación se cargue directamente sobre el primer material de CIH. En este contexto, sustancialmente el mismo significa dentro de 1,0, 0,9, 0,8, 0,6, 0,7, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 unidades de pH. En dichos procedimientos, la mezcla de proteínas es la mezcla de productos de reacción que resulta de la reacción de PEGilación. Estos procedimientos son relativamente eficaces y rápidos. En este contexto, "cargado directamente" significa que no se lleva a cabo ningún ajuste de pH de la mezcla de productos de reacción antes de que se aplique al primer material de CIH. El tampón para la reacción de PEGilación puede ser el mismo que el tampón para las condiciones de CIH en dos fases.
EPO
El término "eritropoyetina" y su abreviatura "EPO" se refieren a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, o una proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a la misma, relacionándose sus propiedades biológicas a la estimulación de la producción de glóbulos rojos y a la estimulación de la división y diferenciación de precursores eritroides sensibilizados en la médula ósea. Se puede preparar eritropoyetina recombinante por medio de expresión en células eucariotas, por ejemplo, en células CHO, o células BHK, o células HeLa por tecnología de ADN recombinante o por activación de genes endógenos, es decir, la glucoproteína eritropoyetina se expresa por activación de genes endógenos, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.733.761, US 5.641.670, US 5.733.746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955. La EPO puede ser EPO humana. La EPO puede ser EPO glucosilada.
La EPO humana puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La EPO humana puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. El término "EPO" también indica variantes de la proteína de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, en la que se han cambiado, delecionado o insertado uno o más residuos de aminoácido, y que tiene actividad biológica comparable a la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, se informa en los documentos EP 1064 951 o US 6.583.272. El número de aminoácidos cambiados, delecionados o insertados puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20 o 1-10. El término EPO indica proteínas que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma. Una variante puede tener la secuencia de aminoácidos de eritropoyetina humana que tiene de 1 a 6 sitios adicionales para la glucosilación. La actividad específica de la eritropoyetina PEGilada se puede determinar por diversos ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de la eritropoyetina PEGilada purificada es de tal modo que la administración de la proteína por inyección a pacientes humanos da como resultado células de médula ósea que incrementan la producción de reticulocitos y glóbulos rojos en comparación con grupos de sujetos no inyectados o de control. La actividad biológica de la eritropoyetina PEGilada obtenida y purificada de acuerdo con el procedimiento como se informa en el presente documento se puede someter a prueba por procedimientos de acuerdo con Bristow, A, Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48.
Las variantes de secuencia de aminoácidos de EPO se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica la EPO, o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de la eritropoyetina. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea actividad biológica comparable con la EPO humana.
En la tabla 1, se muestran sustituciones aminoacídicas conservadoras bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe a continuación en referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en eritropoyetina humana y los productos cribarse para determinar la retención de la actividad biológica de eritropoyetina humana.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
La EPO puede ser una EPO variante. La EPO puede estar comprendida en una proteína de fusión con otra proteína, o se puede conjugar a otro resto además de PEG.
La PEGilación química de eritropoyetina, en general, da como resultado una preparación de proteína que comprende eritropoyetina que está PEGilada en uno o más grupos £-amino de residuos de lisina y/o en el grupo amino N terminal. La PEGilación selectiva en el aminoácido N terminal se puede realizar de acuerdo con Felix (1997). Se puede lograr la PEGilación N terminal selectiva durante la síntesis en fase sólida por acoplamiento de un derivado de aminoácido PEGilado en Na al aminoácido terminal N-1 de la cadena peptídica. Se puede realizar la PEGilación de cadena lateral durante la síntesis en fase sólida por acoplamiento de derivados de lisina PEGilados en NE a la cadena en crecimiento. La PEGilación N terminal y de cadena lateral combinada es viable como se describe anteriormente dentro de la síntesis en fase sólida o bien por síntesis en fase de solución aplicando reactivos de PEG activado a un péptido con amino desprotegido.
TABLA 1
Figure imgf000018_0001
Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Proteínas
Los procedimientos de la invención son especialmente adecuados para producir composiciones de EPO mono-PEGilada. La referencia a una proteína o proteína de interés en el presente documento se puede referir a EPO. Los procedimientos de la invención pueden ser adecuados para producir composiciones de proteína mono-PEGilada de otras proteínas, en particular, proteínas terapéuticas. Por ejemplo, interleucina-2 (IL-2), peginterferón alfa-2a, hormona del crecimiento humana (hGH), proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7), proteína morfogenética ósea 15 (BMP-15), neurotrofina-3 (NT-3), proteasa del factor de Von Willebrand (vWF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, activador del plasminógeno de tipo tisular (IPA), leptina, hirudina, urocinasa, DNasa humana, insulina, proteína de superficie de hepatitis B (HbsAg), toxina diftérica-IL-2 quimérica, gonadotropina coriónica humana (hCG), peroxidasa tiroidea (TPO), alfagalactosidasa, alfa-L-iduronidasa, beta-glucosidasa, alfa-galactosidasa A, a-glucosidasa ácida (maltasa ácida), antitrombina III (AT III), hormona foliculoestimulante (FSH), péptido I similar a glucagón (GLP-1), péptido 2 similar a glucagón (GLP-2), factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF-7), factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21), factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF-23), factor X, factor XIII, procineticina, extendina-4, CD4, receptor del factor de necrosis tumoral (TNF-R), ligando I de glucoproteína para P-selectina (PSGL-I) a-CD20, complemento, transferrina, molécula de adhesión celular dependiente de glucosilación (GlyCAM), molécula de adhesión celular neural (N-CAM), proteína de fusión del receptor de INF-región Fc de IgG. Dichas proteínas también incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales frente a uno cualquiera de: virus sincicial respiratorio, proteína F del virus sincicial respiratorio, INF-a, glucoproteína IIb/IIIa, CD20, v Eg F-A, PSGL-1, CD4, a-CD3, EGF, antígeno carcinoembrionario (CEA), receptor de TNFa e I L-2.
Los procedimientos de la invención pueden ser adecuados para producir composiciones mono-PEGiladas de proteínas tales como hormonas, citocinas o enzimas. Dicha proteína puede ser eritropoyetina. La proteína puede ser interferón-a-2a o interferón-a-2b. La proteína puede ser el factor estimulante de colonias de granulocitos, hormona del crecimiento humana o urato oxidasa.
La invención es, en particular, útil para proteínas terapéuticas que tienen una semivida relativamente corta, porque la PEGilación incrementa la semivida en circulación in vivo. En general, las hormonas y citocinas tienen una semivida relativamente corta. Las moléculas biológicas más pequeñas tienden a tener una semivida relativamente corta. El perfil farmacocinético de moléculas biológicas relativamente pequeñas se puede mejorar por PEGilación y así la presente invención también puede ser, en particular, útil para proteínas terapéuticas relativamente pequeñas. En general, es más probable que las proteínas y péptidos menores de aproximadamente 70 kDa se eliminen por filtración renal que las proteínas más grandes. Las moléculas biológicas o proteínas, más pequeñas se pueden definir como aquellas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa. La eritropoyetina tiene un peso molecular de aproximadamente 37 kDa. La invención es útil para proteínas terapéuticas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa (en su forma no PEGilada). La invención es útil para proteínas terapéuticas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa o 40 kDa, o que tienen un peso molecular de aproximadamente 10-70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa o 30-40 kDa. La invención es útil para hormonas o citocinas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa o 40 kDa, o que tienen un peso molecular de aproximadamente 10­ 70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa o 30-40 kDa.
La proteína puede ser un anticuerpo. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo biológicamente funcional. Los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, anticuerpos de dominio único (sdAb o dAB), fragmentos de la región determinante de la complementariedad, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario, minicuerpos, diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Muchos fragmentos de anticuerpo tienen una semivida in vivo relativamente corta, lo que resulta de su tamaño relativamente pequeño y de que ya no tienen una región Fc. La invención es, en particular, útil para fragmentos de anticuerpo que tienen un tamaño relativamente pequeño, tales como anticuerpos de dominio único, Fab, Fab' y scFv. La invención es útil para fragmentos de anticuerpo que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa o 40 kDa, o que tienen un peso molecular de aproximadamente 10­ 70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa o 30-40 kDa.
Las composiciones de proteína mono-PEGilada se pueden formular como composiciones farmacéuticas. Las composiciones de proteína mono-PEGilada producidas por los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden formular con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y/o se pueden formular en un tampón fisiológicamente aceptable, tal como solución salina fisiológica. Las sales y/o tampones usados en los tampones de equilibrado, lavado o elución de la etapa de CIH se pueden retirar antes de formular la composición de proteína mono-PEGilada como una composición farmacéutica. Por ejemplo, las composiciones de proteína mono-PEGilada se pueden dializar. La proteína mono-PEGilada de la composición de proteína mono-PEGilada se puede liofilizar. La proteína mono-PEGilada de la composición de proteína mono-PEGilada se puede aislar y reformular en una composición farmacéutica.
Los procedimientos de lo divulgado en el presente documento pueden ser procedimientos a escala industrial. Un procedimiento a escala industrial puede ser un procedimiento que produzca al menos aproximadamente 5 g, 10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 250 g o 500 g por lote o por ciclo. Un lote o ciclo en este contexto puede ser un procedimiento que comprende todos las etapas de a) a c) como se divulga en el presente documento. Un procedimiento a escala industrial puede ser un procedimiento en el que el volumen de la mezcla de proteínas (que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada) que se somete a las etapas de CIH sea de al menos 100 l, 500 l, 1000 l, 5000 l, 10000 l, 50000 l o 100000 l.
La temperatura ambiente puede ser de aproximadamente 18-25 °C, 20-22 °C, de aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 21 °C o de aproximadamente 22 °C. Los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden realizar a temperatura ambiente. La CIH se puede realizar a temperatura ambiente. La CIH se puede realizar a una temperatura de 15-25 °C. Para la reproducibilidad, los procedimientos pueden realizar la CIH a una temperatura específica y estable. Una temperatura estable puede ser una temperatura específica de ± 1,0 °C o de ± 1,0 °C. El procedimiento se puede realizar a cualquier temperatura de aproximadamente 4 a 40 °C, siempre que la proteína sea estable en dichas condiciones.
La invención incluye la combinación de los aspectos y rasgos característicos preferentes descritos excepto cuando una combinación de este tipo es claramente inadmisible o se evita expresamente.
Los rasgos característicos divulgados en la descripción anterior, o en las siguientes reivindicaciones, o en los dibujos adjuntos, expresados en sus formas específicas o en términos de un medio para realizar la función divulgada, o un procedimiento para obtener los resultados divulgados, según sea apropiado, se pueden utilizar, por separado, o en cualquier combinación de dichos rasgos característicos para realizar la invención en diversas formas de la misma.
Aunque la invención se ha descrito junto con los modos de realización ejemplares descritos anteriormente, muchas modificaciones y variaciones equivalentes serán evidentes para los expertos en la técnica cuando se les proporcione la presente divulgación. En consecuencia, los modos de realización ejemplares de la invención expuestos anteriormente se consideran ilustrativos y no limitantes.
Para evitar cualquier duda, las explicaciones teóricas proporcionadas en el presente documento se proporcionan con el propósito de mejorar el entendimiento de un lector. Los autores de la invención no desean verse vinculados a ninguna de estas explicaciones teóricas.
Cualquier encabezado de sección usado en el presente documento solo es con propósitos organizativos y no se debe interpretar como limitante de la materia objeto descrita.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprenden" e "incluyen", y variaciones tales como "comprende", "que comprende" y "que incluye", implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
Cabe destacar que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Los intervalos se pueden expresar en el presente documento como de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, otro modo de realización incluye de un valor particular y/o al otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, por el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otro modo de realización. El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico es opcional y significa, por ejemplo, /- un 10 %.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación de EPO PEGilada para cromatografía
Materiales:
- 0,87 mg/ml de eritropoyetina PEGilada reciclada en fosfato de Na/K 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5 (molécula de PEG usada en reacciones de PEGilación y residuos de PEG en una proteína PEGilada, teniendo cada uno un peso molecular de aproximadamente 30 kDa);
- tampón con alto contenido de sal (HEPES 25 mM, Na2SO4500 mM, pH 7,5, filtrado de forma estéril);
- concentradores de centrifugación con MWCO de 10 kDa Vivaspin 20 (Sartorius, n.° VS2002).
Cromatografía
Para la cromatografía de alto contenido de sal, la eritropoyetina PEGilada se puede someter a intercambio de tampón y concentrarse. Para este propósito, se pipetean 7 ml de eritropoyetina PEGilada en un concentrador de centrifugación con MWCO de 10 kDa y se centrifugan durante 40 min a 4700 g. Posteriormente, la mezcla se somete a intercambio de tampón con 10 ml de tampón con alto contenido de sal y se centrifuga, de nuevo, durante 40 minutos a 4700 g. Si, en una de las etapas, el volumen de concentrado es > 0,5 ml, la centrifugación se extiende en consecuencia. Después del intercambio de tampón, se disuelven aproximadamente 0,2 ml de retenido en 3 ml de tampón con alto contenido de sal y la concentración se determina espectrofotométricamente a 280 nm.
Antes de cada cromatografía, el concentrado de EPO así preparado se diluye con tampón con alto contenido de sal a una concentración de 0,25 mg/ml para la carga de la columna. Como regla general, la columna se carga con 2 ml, lo que corresponde a una muestra de 0,5 mg. La concentración de carga se determina por espectroscopia UV/Vis a 280 nm.
Después de la PEGilación de eritropoyetina, la eritropoyetina no PEGilada (EPO) y la eritropoyetina PEGilada de forma única (EPO mono-PEG) se deben separar de la eritropoyetina PEGilada de forma múltiple (oligo-PEG EPO).
Después de la evaluación de los diversos medios de cromatografía, se debe someter a prueba la purificación por cromatografía en dos etapas. Para este propósito, se seleccionan dos columnas para el experimento y se conectan en serie en el ÁKTA de tal manera que, con la misma concentración de sal, más analitos hidrófobos (oligo-PEG-EPO) se unen a la primera columna, mientras que más analitos hidrófilos (mono-PEG-EPO) se unen a la segunda columna. Los analitos muy hidrófilos (EPO sin PEGilar) no se deben unir, sino que eluir durante la aplicación de la muestra. Además, es necesario controlar las columnas de forma independiente entre sí para eluir los analitos de la columna por separado entre sí.
La fase móvil A consiste en HEPES 25 mM, Na2SO4500 mM, pH 7,5 (aproximadamente 60 mS/cm). La fase móvil B consiste en HEPES 25 mM, pH 7,5 (aproximadamente 1 mS/cm). Se ajusta el flujo volumétrico a 61,5 cm/h y se lleva a cabo la cromatografía a temperatura ambiente. Las conductividades determinadas en la figura 1 no se pueden incorporar directamente en el programa de cromatografía. Más bien, la conductividad se puede ajustar variando las proporciones de las fases móviles (% de B). Las fracciones resultantes de las fases móviles se incorporan, a continuación, al programa de cromatografía.
El equilibrado de la columna se lleva a cabo inicialmente con un 13,5 % de tampón B. A continuación, la columna se carga con 2 ml de la muestra preparada por medio de la bomba de muestra. A continuación, las columnas se lavan con un 13,5 % de tampón B para 15 VC y se ajustan las condiciones de partida para la elución. Puesto que la EPO está en el desarrollo, el desarrollo se fracciona del 3.° VC al 13.° VC para otros análisis.
La elución de la segunda columna se inicia en primer lugar porque el producto deseado mono-PEG-EPO se debe eluir más temprano para facilitar tiempos de procedimiento más rápidos. La elución de la mono-PEG-EPO comienza con una elución por etapas hasta un 40 % de B (41,25 mS/cm) para 8 VC seguido de un gradiente hasta un 80 % de B dentro de 14 VC. Se mantiene un 80 % de B para otros 8 VC y, por tanto, se termina la elución.
La segunda elución, que eluye la oligo-PEG-EPO de la primera columna, comienza con un 13,5 % de B para 8 VC seguido de un gradiente hasta un 100 % de B dentro de 20 VC. A continuación, se mantiene un 100 % de B para otros 8 VC y, de este modo, se termina la elución.
El lavado de columna y la etapa de limpieza in situ (CIP) se realizan simultáneamente para ambas columnas a un flujo incrementado de 1 ml/min (186,5 cm/h). Para esto, se conecta, de nuevo, la segunda columna y ambas columnas se lavan en agua ultrapura para 8 VC. El desarrollo se obtiene completamente en una fracción.
Ejemplo 2
Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)
La composición de las fracciones obtenidas de la CIH se analiza usando HPLC.
Equipo
- sistema de HPLC Dionex UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc.);
- columna RP-C18, RP-Poroshell 300SB 2,1 x 75 mm; 300Á (Agilent Technologies);
Las fracciones de CIH congeladas obtenidas se descongelan, en cada caso, se pipetean 100 |jl de muestra en los frascos del muestreador automático y se colocan en el muestreador automático que se ha enfriado a 10 °C. Se aplican 25 j l de muestra, se calientan durante 0,5 min en el horno de columna a 60 °C y se aplican a la columna. El caudal es 1 ml/min. Después de la serie analítica, la cromatografía comienza con un gradiente de un 40 % de B a un 52 % de B en 4 minutos. A continuación, se mantiene un 52 % de B durante 3 minutos. Durante este tiempo, la EPO pura (no PEG) normalmente se eluye en el gradiente. A continuación, el segundo gradiente pasa de un 52 % a un 58 % de B dentro de 3 min seguido de 4 min mantenido a un 58 % de B. Durante el gradiente de un 52 % a un 58 % o poco después de esto, normalmente se eluye la mono-PEG-EPO. La elución de la oligo-PEGEPO tiene lugar en el gradiente de un minuto de un 58 % de B a un 62 % de B. Se mantiene un 62 % de B durante otros 4 minutos. A continuación, tiene lugar la regeneración de la columna con un 100 % de B durante 1 min.
Las proporciones de los componentes en la muestra se determinan por integración del cromatograma UV. Para este propósito, los límites de integración se establecen en los correspondientes picos con ayuda de un programa informático. A continuación, se calculan las áreas. La proporción p del respectivo componente se calcula como sigue:
área del pico del componente
p_componente en % = 100%
área de todos los picos
Ejemplo 3
Cribado de los materiales de CIH
Se cribaron dieciséis materiales de CIH para determinar la selectividad (por ejemplo, picos de elución bien separados) para la proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada. Tres materiales de CIH (Toyopearl PPG-600M y Toyopearl Phenyl-650M de Tosoh Bioscience LLC, y Phenyl Sepharose HP (HiTrap Phenyl h P) de GE Healthcare) mostraron la mejor selectividad en comparación con las columnas restantes y se pueden describir como columnas con hidrofobia media. Los cromatogramas son similares entre sí en perfil. Consisten en tres picos cada uno. El primer pico aparece durante la carga de la columna, los segundo y tercer picos aparecen como un pico doble ancho durante el gradiente. Durante la etapa de lavado con agua, aparece el cuarto pico. La HiTrap Phenyl HP en la figura 2 es un ejemplo de estas tres columnas. Sin embargo, difiere en el volumen de retención de los picos y en la forma de los picos de las otras dos columnas. Después de alcanzar el máximo, el tercer pico inicialmente disminuye aproximadamente tan fuertemente como en las otras dos columnas, pero avanza hacia el final y no alcanza la línea base hasta la etapa de lavado. Por otra parte, las otras dos columnas alcanzan, de nuevo, la línea base después de que haya descendido el tercer pico.
Para una mejor comparación, los cromatogramas UV de las tres columnas se muestran en la figura 1. Además, se representa la conductividad para Phenyl HP como ejemplo, de modo que más tarde se pueda estimar la composición de la fase móvil para la elución de los componentes individuales. Esta figura muestra, sobre todo, además de los perfiles de elución similares, las diferencias entre las columnas con respecto a los volúmenes de elución. En la tabla 1, además, se enumeran los volúmenes de retención de los picos en el máximo. El error del dispositivo para el volumen de retención depende principalmente del caudal de la bomba y se especifica por el fabricante a un 1,5 %, y el error debido a diferentes cargas de gel y rellenos de columna se estima que es un 5 %, lo que significa que el error total es de un 6,5 %. El primer pico (máximo) está muy cerca de 2,2 ml para Toyopearl PPG y 2,8 ml para Phenyl Sepharose HP, pero, para las tres columnas, los volúmenes de retención de los segundo y tercer picos difieren de forma más marcada. El volumen de retención para el pico 2 es 19,8 ml y el pico 3 es 22.4 ml. Por tanto, los volúmenes de retención para Toyopearl Phenyl 650M son mayores que los de PPG-600M y Phenyl Sepharose HP. La Phenyl Sepharose HP tiene los volúmenes de retención más bajos con 15,7 ml para el pico 2 y 18,7 ml para el pico 3. Los volúmenes de retención de Toyopearl PPG-600M están más cerca de los de Phenyl Sepharose HP que de Toyopearl Phenyl-650M.
Los picos de los analitos que se eluyen en Toyopearl Phenyl-650M y Phenyl Sepharose HP durante el gradiente muestran las mayores diferencias en el volumen de retención (4,1 ml en el pico 2 y 3,7 ml en el pico 3). Por otra parte, la diferencia entre los volúmenes de retención entre Toyopearl PPG-600M y Phenyl Sepharose HP es bastante pequeña y los picos se solapan extensamente.
La conductividad de las fases móviles para la combinación de columnas se determina por medio de la conductividad y el perfil de elución en la figura 1. Durante la carga, la conductividad de la fase móvil debe ser de 54.5 mS/cm. Con esta conductividad, la EPO está en el desarrollo y se puede reutilizar de inmediato. La oligo-PEG-EPO se debe unir a la primera columna (verde, Phenyl Sepharose HP). Por otra parte, la mono-PEG-EPO y la oligo-PEG-EPO que se arrastra potencialmente, solo se unen en la segunda columna (naranja, Toyopearl Phenyl-650M). La elución del producto mono-PEG-EPO tiene lugar por elución de la segunda columna a 41 mS/cm (naranja).
Tabla 1: comparación de los volúmenes de retención (en ml) de los tres picos principales de las tres columnas más selectivas. Se asume un 6,5 % como un error total.
Figure imgf000022_0001
Las concentraciones de sal deseadas para la elución de los componentes se pueden estimar durante el curso de las conductividades de las secuencias cromatográficas.
Equilibrio de masas
Los equilibrios de masas para las columnas elegidas se muestran en la tabla 2. La cantidad de muestra inyectada en el circuito de muestra se enumera como entrada. Como se describe anteriormente, la concentración de la muestra se determinó sin diluir usando un fotómetro. A continuación, se inyectó en el circuito de muestra. De ello se deduce que el error para la entrada depende principalmente del error del dispositivo y es de un 1 %. La salida representa la cantidad de muestra calculada durante todo el desarrollo de cromatografía, iniciándose en la inyección hasta el final de la elución, por medio de la medición de la absorción e integración de la curva de absorción. El error está relacionado principalmente con la medición del caudal y la medición UV. El error de caudal es de un 1,5 % si la bomba funciona apropiadamente. El error de medición Uv se indica por el fabricante a un 2,0 %. Se estima que el error aleatorio es de un 10 %, puesto que solo están disponibles mediciones únicas. Por lo tanto, el error total es de un 13,5 %. Tabla 2: comparación de la cantidad de muestra en mg antes de la aplicación a la columna con la cantidad de muestra eluida muestra una buena concordancia con respecto a la exactitud de la medición. La cantidad de entrada se determinó por un fotómetro, mientras que la cantidad de salida se determinó integrando los cromatogramas UV.
Tabla 2:
Figure imgf000023_0001
EJEMPLO 4
Caracterización de la separación por HPLC
Para comprobar la separación de los componentes de muestra EPO, mono-PEG-EPO y oligo-PEG-EPO durante la cromatografía, se obtuvieron seis fracciones para cada desarrollo cromatográfico y se caracterizaron por HPLC. Las letras a - f se asignan a las fracciones caracterizadas, que están indicadas para Phenyl Sepharose HP en la figura 2 para poder comparar los resultados en la tabla 3 más fácilmente con los cromatogramas de la CIH.
Tabla 3: la composición de los picos en el cromatograma se caracterizó por análisis por HPLC. Las respectivas proporciones p en % de EPO (no PEG), mono-PEG-EPO (mono) y oligo-PEG-EPO (oligo) se enumeran para cada fracción obtenida. Las posiciones de las fracciones (a-f) se muestran en el respectivo cromatograma. LD: límite de detección <0,2 %.
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0001
A partir de los resultados del análisis por HPLC, se ve que el desarrollo en las tres columnas durante la carga de la muestra es de un 100 % de EPO no PEGilada. El pico 2 consiste mayoritariamente en mono-PEG-EPO y el pico 3 en oligo-PEG-EPO. Sin embargo, la composición del pico 2 y pico 3 difiere en las diferentes columnas. La Phenyl Sepharose HP también contiene un 0,7 % de EPO en el pico 2 además de un 99,3 % de mono-PEG-EPO. Sin embargo, en el pico 2 de Toyopearl Phenyl-650M y PPG-600M, ya no se puede detectar EPO. El pico 2, el pico 3 y la transición consisten en diferentes proporciones de mono-PEG-EPO y oligo-PEG-EPO. En Toyopearl Phenyl, la proporción de mono-PEG-EPO en la fracción b del pico 2 es de un 100 % y en Toyopearl PPG-600M, es de un 99,4 % de mono-PEG-EPO.
Ejemplo 5
Implementación de la combinación de columnas
Toyopearl Phenyl-650M y Phenyl Sepharose HP eran muy adecuadas como medios de cromatografía para la separación de EPO, mono-PEG-EPO y oligo-PEG-EPO en las condiciones de CIH en dos fases usadas en el presente documento. Se usa Phenyl Sepharose HP (menos hidrófoba que Toyopearl Phenyl-650M) como la primera columna. Se usa Toyopearl Phenyl-650M (más hidrófoba) como la segunda columna. La figura 5 muestra el cromatograma de la combinación de estas dos columnas. Se reconocen un total de 5 picos. El primer pico es el desarrollo durante la aplicación de la muestra por las dos columnas. Los segundo y tercer picos aparecen, respectivamente, durante la elución de la Toyopearl Phenyl-650M. Los picos cuatro y cinco aparecen durante la elución de la Phenyl Sepharose HP. El pH desciende de 7,6 a 7,3 durante la cromatografía, asciende a un valor de pH de 7,5 al comienzo de la segunda elución y desciende a 7,2 en la etapa de lavado. La columna se equilibró con un 13,5 % de B, que corresponde a una conductividad de 54,6 mS/cm. Durante la aplicación de la muestra, la conductividad asciende a 60,7 mS/cm y, a continuación, desciende, de nuevo, a 54,6 mS/cm. La primera elución comienza con una etapa a un 40 % de B, que corresponde a una conductividad de 41,3 mS/cm. En la fase de un 40 % de B, aparece el pico más grande, que constituye un 49 % del área total bajo el cromatograma UV. En el gradiente hasta un 80 % de B, aparece el tercer pico; este es significativamente más pequeño, con un 7,5 por ciento de área. La segunda elución (Phenyl Sepharose HP) se inicia en condiciones de equilibrado con un 13,5 % de B. La elución comienza con el pico más pequeño en el cromatograma, que representa un 3,4 por ciento de área. A continuación, en el gradiente posterior hasta un 100 % de B, aparece el segundo pico más grande con un 28,0 por ciento de área.
A continuación, se determinó la composición de las fracciones obtenidas por análisis por HPLC. En la tabla 4 se enumeran las composiciones de los picos individuales de EPO (no PEG), mono-PEG-EPO (mono) y oligo-PEG-EPO (oligo). Por tanto, el pico 1 consiste en un 100 % de EPO. El pico 2 consiste en un 100 % de mono-PEG-EPO. Los demás picos, por otra parte, son mezclas de mono-PEG-EPO y oligo-PEG-EPO. La salida representa la composición del material eluido total. Para esto, las cantidades de proteína determinadas por absorción se dividieron por su composición en los picos. Por tanto, se puede comparar el grado en que cambia la composición de entrada (carga) durante la cromatografía. Puesto que la reacción es independiente, la composición de entrada debe coincidir con la de salida.
Tabla 4: la composición de los picos se determinó por análisis por HPLC. Se calculó la composición de salida. LD: límite de detección <0,2 %.
Figure imgf000024_0002
La comparación de la composición de entrada con la de salida se representa en la tabla 5 por el cálculo de la recuperación. La recuperación se calcula como sigue:
% de recuperación = ^sallda * 100%
pentrada
La recuperación se calcula por separado para cada porción p de los componentes.
Tabla 5: cálculo de la recuperación en %. La composición de entrada se compara con la composición del material de muestra eluido total (salida). El respectivo procedimiento de análisis con el que se determinó la composición se indica entre paréntesis.
Figure imgf000025_0001
Asimismo, se debe igualar el equilibrio de masas, como la recuperación. Las masas de los componentes individuales obtenidos se muestran en la tabla 6. Cabe destacar que la masa aplicada de (1,54 ± 0,21) mg de proteína se desvía fuertemente de la masa calculada de (1,03 ± 0,14) mg en la salida. Como resultado de la inspección visual normal, se pueden descartar filtraciones del sistema y la pérdida de muestra resultante. Debido a esta marcada desviación de un 33 %, otros cálculos de rendimientos y pérdidas se referirán a la masa calculada en la salida de la muestra de 1,03 mg.
Tabla 6: las cantidades de proteína obtenidas en los picos se calcularon por medio de la composición de los picos (análisis por HPLC) y la integración de las absorciones UV en el cromatograma. LOD = límite de detección.
Figure imgf000025_0002
La tabla 7 muestra los rendimientos y pérdidas resultantes en la cromatografía en dos etapas. Si se considera el pico 1, que representa el pico para EPO, un 100 % de la EPO cargada se puede recuperar para su reutilización. El rendimiento con respecto a la cantidad total de mono-PEG-EPO en la carga es de un 89,5 % cuando se obtiene el pico 2. La pérdida de un 40,0 % de proteína total se refiere a la masa de proteína total en la carga, que se produciría durante la cromatografía al descartar los picos 3, 4 y 5. Como se enumera en la tabla 6, estos picos contienen principalmente oligo-PEG-EPO y solo pequeñas cantidades de mono-PEG-EPO.
Tabla 7: rendimientos y pérdidas de las fracciones útiles (véase tabla 6) en la cromatografía en dos etapas realizada. Los rendimientos se refieren a la proporción total del respectivo componente en la salida. La pérdida se refiere a la muestra total (1,03 mg).
Figure imgf000025_0003
Referencias
Anteriormente se cita una serie de publicaciones para describir y divulgar más completamente la invención y el estado de la técnica al que pertenece la invención. Las citas completas de estas referencias se proporcionan a continuación.
Para técnicas de biología molecular estándar, véase Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3.a ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Bristow, A, Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48
Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier 30 Systems 9 (1992) 249-304)
Fee y Van Alstine, Chemical Engineering Science, 2016, 61,924-939
Felix, A. M., ACS Symposium Series, 680: 218-238, (1997)
Francis, G.E., et a l, Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18
Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography, Principles and Methods, GE Handbook, 2006 Ingold et al, React. Chem. Eng., 2016, 1,218.
Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229
Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368.
Pfister et al, Reac React. Chem. Eng., 2016, 1,204
Pfister et al. Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113, 1711-1718.
Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417.
Documento WO 94/12650
Documento WO 90/11354
Documento WO 91/06667
Documento WO 91/09955
Documento WO 93/09222
Documento WO 94/01451
Documento WO 95/31560
Documento WO 00/44785
Documento WO 2009/010270
Documento WO 2012/035037
Documento EP 0473084
Documento EP 1064951
Documento US 5.733.761
Documento US 5.641.670
Documento US 5.733.746
Documento US 5.932.462
Documento US 6.583.272

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar una mezcla de proteínas que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada;
b) someter la mezcla de proteínas a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) en dos fases, que comprende:
aplicar la mezcla de proteínas a un primer material de CIH para proporcionar una primera solución de flujo continuo de CIH; y
aplicar la primera solución de flujo continuo de CIH a un segundo material de CIH para proporcionar una segunda solución de flujo continuo de CIH,
en el que el segundo material de CIH es diferente del primer material de CIH; y
en el que la etapa de CIH en dos fases se realiza en condiciones de CIH en dos fases, siendo dichas condiciones de CIH en dos fases adecuadas para unir la proteína oligo-PEGilada al primer material de CIH y unir la proteína mono-PEGilada al segundo material de CIH; y
c) eluir la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH para proporcionar un segundo eluido de CIH, en el que el segundo eluido de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína es una hormona, una citocina, una enzima o un anticuerpo.
3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es eritropoyetina.
4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer material de CIH y el segundo material de CIH están conectados directamente en serie.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, en las condiciones de CIH en dos fases, el primer material de CIH no se une a la proteína no PEGilada o proteína mono-PEGilada, y en el que el segundo material de CIH no se une a la proteína no PEGilada.
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en los cromatogramas de elución de CIH comparativos, el primer material de CIH y el segundo material de CIH tienen picos bien separados para la proteína mono-PEGilada.
7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que a) el primer material de CIH tiene sustancialmente la misma selectividad que Phenyl Sepharose HP en las condiciones de CIH en dos fases; y
b) el segundo material de CIH tiene sustancialmente la misma selectividad que Toyopearl Phenyl 650M en las condiciones de CIH en dos fases.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que a) el primer material de CIH es Phenyl Sepharose HP; y/o
b) el segundo material de CIH es Toyopearl Phenyl 650M.
9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la otra etapa de:
d) eluir la proteína oligo-PEGilada del primer material de CIH para proporcionar un primer eluido de CIH.
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que eluir la proteína oligo-PEGilada del primer material de CIH comprende una elución por gradiente lineal.
11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que
i. las condiciones de CIH en dos fases son a una conductividad de aproximadamente 54-55 mS/cm; y/o ii. la elución de la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH es a una conductividad de aproximadamente 40-41 mS/cm; y/o
iii. la elución de la proteína oligo-PEGilada del primer material de CIH se lleva a cabo por gradiente lineal de aproximadamente 54-55 mS/cm a aproximadamente 1-5 mS/cm
y en el que opcionalmente la proteína es EPO.
12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento se lleva a cabo usando una mezcla de tampón A y tampón B, en el que el tampón A comprende HEPES 25 mM, pH 7,5, Na2SO4500 mM, y en el que el tampón B comprende HEPES 25 mM, pH 7,5, y en el que i. las condiciones de CIH en dos fases son a aproximadamente un 13,5 % de tampón B; y/o
ii. la elución de la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH es a aproximadamente un 40 % de tampón B; y/o
iii. la elución de la proteína oligo-PEGilada del primer material de CIH se lleva a cabo por gradiente lineal de aproximadamente un 13,5 % a aproximadamente un 80 % de tampón B
y en el que opcionalmente la proteína es EPO.
13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la elución de la proteína mono-PEGilada del segundo material de CIH comprende una elución por etapas, opcionalmente seguida de una elución por gradiente.
14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición de proteína mono-PEGilada comprende al menos aproximadamente un 99 % de proteína mono-PEGilada.
15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla de proteínas comprende al menos un 10 % de proteína oligo-PEGilada.
16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína mono-PEGilada comprende un residuo de PEG que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 20 kDa.
17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición de proteína mono-PEGilada es una composición farmacéutica, comprendiendo el procedimiento además formular el segundo eluido de CIH con un excipiente farmacéutico.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3731873T1 (sl) * 2017-12-29 2022-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek za zagotavljanje sestavka PEGiliranih beljakovin
EP4096802A1 (en) * 2020-01-29 2022-12-07 Merck Sharp & Dohme LLC Methods of separating host cell lipases from an anti-lag3 antibody production

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990008822A1 (en) * 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
AU635844B2 (en) 1989-11-06 1993-04-01 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
DE69034135T3 (de) 1989-12-22 2012-08-23 Laboratoires Serono S.A. DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
AU673190B2 (en) 1992-07-13 1996-10-31 Bionebraska, Inc. Method for modification of recombinant polypeptides
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5886155A (en) * 1997-06-18 1999-03-23 Bioresources International Inc. Purification of miraculin glycoprotein using tandem hydrophobic interaction chromatography
PT1157037E (pt) 1999-01-29 2003-12-31 Hoffmann La Roche Conjugados de gcsf
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JP3108767B1 (ja) * 1999-10-20 2000-11-13 農林水産省食品総合研究所長 ｃｈｉｂ２型キチナーゼの製造法
DK1545428T3 (da) * 2002-09-20 2010-05-03 Pharmacia Corp Fremgangsmåde til formindskelse af aggregatmængder af pegylerede proteiner
AU2003301122B2 (en) 2002-12-19 2009-11-26 Nektar Therapeutics Cyanovirin variant-polymer conjugates
KR20070042567A (ko) 2004-08-31 2007-04-23 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 글리세롤 분지쇄 폴리에틸렌 글리콜 인간 성장 호르몬공액체, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법
WO2007010552A2 (en) 2005-03-17 2007-01-25 Serum Institute Of India Limited N- terminal peg conjugate of erythropoietin
US8969532B2 (en) * 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
WO2011018515A1 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
CN102639553A (zh) 2009-11-24 2012-08-15 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 纯化聚乙二醇化蛋白质的方法
CN102234310B (zh) * 2010-04-30 2017-02-08 杭州九源基因工程有限公司 一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法
CA2808748C (en) 2010-09-14 2018-09-11 Roberto Falkenstein Method for purifying pegylated erythropoietin
CN102453087B (zh) * 2010-10-22 2013-12-25 广东赛保尔生物医药技术有限公司 一种单取代peg-epo的纯化及制备方法
CA2867609A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Belrose Pharma, Inc. Polymeric conjugates of c1-inhibitors
CN104513306B (zh) * 2014-12-15 2016-08-17 山西瑞亚力科技有限公司 载脂蛋白A1的纯化方法和ApoAI蛋白注射抗原
CN105037523B (zh) * 2015-06-25 2019-02-19 北京三元基因药业股份有限公司 干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物
CA2995385A1 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Genentech, Inc. Purification of fkpa and uses thereof for producing recombinant polypeptides

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Publication number Publication date
KR102500631B1 (ko) 2023-02-15
JP7410860B2 (ja) 2024-01-10
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US11518781B2 (en) 2022-12-06

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