KR20010071207A

KR20010071207A - 단백질 생산 및 전달을 위한 인간 과립구 콜로니-자극인자 유전자의 코딩 영역 상류의 지놈 서열

Info

Publication number: KR20010071207A
Application number: KR1020007012303A
Authority: KR
Inventors: 더글라스에이. 트레코; 마이클더블유. 하트라인; 리차드에프. 셀던
Original assignee: 추후제출; 트랜스카리오틱 쎄라피즈, 인코포레이티드
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2001-07-28
Also published as: NO20005586D0; HUP0101355A3; EP1075530A1; JP2002513579A; US6242218B1; AU3788799A; CN1308680A; HUP0101355A2; CA2328476A1; ZA200005744B; AR016263A1; AU762969B2; WO1999057291A1; CZ299460B6; CZ20003807A3; PL344391A1; IL139431A0; NZ507451A; TR200003272T2; NO20005586L

Abstract

G-CSF 유전자의 코딩 영역 상류의 특정 지놈 영역과 엄격한 조건하에서 혼성화하거나 또는 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 분리된 핵산 분자, 및 상기 DNA 분자를 상동 재조합용 타겟팅 서열로 포함하는 DNA 구조물(construct).

Description

단백질 생산 및 전달을 위한 인간 과립구 콜로니-자극 인자 유전자의 코딩 영역 상류의 지놈 서열{Genomic sequences upstream of the coding region of the G-CSF gene for protein production and delivery}

치료용 단백질(therapeutic protein)로 질병을 처치하려는 현재의 접근방법은 시험관내(in vitro)에서 생산된 단백질 투여(administration)와 유전자 치료를 포함한다. 시험관내 단백질 생산은 일반적으로 관심있는 단백질을 코딩하는 외인성(exogenous) DNA를 배양중인 적절한 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 한편, 유전자 치료방법은 환자에게 관심있는 치료용 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 세포, 플라스미드 또는 바이러스를 투여하는 것을 포함한다.

어떤 치료용 단백질은 또한 유전자 타겟팅(gene targeting) 기술에 의하여 원하는 방식으로 그들의 내인성(endogenous) 유전자의 발현을 변화시킴으로써 생산될 수도 있다(참조: 예를 들면, 미국특허 제 5,641,670호, 제 5,733,761호 및 제5,272,071호; 국제공개 제 91/06666호, 제 91/06667호 및 제 90/11354호). 상기 문헌들은 전문 그대로 참조문헌으로서 포함된다.

[발명의 요약]

본 발명은 인간 과립구 콜로니-자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, "G-CSF") 유전자의 코딩서열에 대해 5'에 있는 지놈 DNA의 규명 및 서열분석에 근거한다. 상기 DNA는 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 세포의 지놈내로 통합(integration)시 포유동물 세포에서 내인성(endogenous) G-CSF 유전자의 발현을 변화(예를 들면, 증가)시키는 DNA 구조물(construct)에 사용될 수 있다. "내인성 G-CSF 유전자"란 G-CSF를 코딩하는 유전자의 지놈(즉, 염색체) 카피를 의미한다. 상기 구조물은 신규한 5' 비코딩 서열을 포함하거나 또는 그로부터 유래된 타겟팅 서열, 및 전사 조절 서열을 포함한다. 상기 전사 조절 서열은 바람직하게는 내인성 G-CSF 유전자의 전사 조절 서열과는 서열면에서 다르다. 상기 타겟팅 서열은 상기 조절 서열의 상기 타겟 유전자의 G-CSF 코딩 서열의 내부 또는 상류 영역으로의 통합을 디렉트하여, 상기 조절 서열이 상기 내인성 코딩 서열에 작동가능한 방식으로 연결되도록 한다. "작동가능한 방식으로 연결된(operatively linked)"이란 상기 조절 서열이 내인성 G-CSF-코딩 서열의 발현을 디렉트할 수 있음을 의미한다. 상기 구조물은 또한 그 구조물을 안정하게 도입시킨 세포의 선별을 용이하게 하는 선별가능한 미커 유전자, 및/또는 프로모터에 작동가능한 방식으로 연결된 또 다른 코딩 서열을 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 DNA 구조물은 (a)타겟팅 서열, (b)조절 서열, (c)엑손, 및 (d)스플라이스-공여체 사이트(splice-donor site)를 포함한다. 상기 타겟팅 서열은 그 자신과 (b)-(d) 요소(element)의 상기 타겟 유전자의 G-CSF-코딩 서열의 내부 또는 상류 영역내로의 통합을 디렉트한다. 일단 통합되면, (b) 요소는 (c)와 (d) 요소 및 상기 내인성 유전자의 모든 하류 코딩 서열의 전사를 디렉트할 수 있다. 상기 구조물에서, 상기 엑손은 일반적으로 상기 조절서열의 3'이고, 상기 스플라이스-공여체 사이트는 상기 엑손의 3' 말단에 있다.

다른 일실시예에서, 상기 DNA 구조물은 (a)타겟팅 서열, (b)조절 서열, (c)엑손, (d)스플라이스-공여체 사이트, (e)인트론, 및 (f)스플라이스-수용체 사이트(splice-acceptor site)를 포함하며, 상기에서 타겟팅 서열은 그 자신과 (b)-(f) 요소의 통합을 디렉트하여, 상기 (b)-(f) 요소가 내인성 유전자의 내부 또는 상류에 있도록 한다. 상기 조절 서열은 그리고 나서 상기 (c)-(f) 요소뿐만 아니라 내인성 G-CSF-코딩 서열을 포함하는 전사체(transcript)의 생산을 디렉트한다. 바람직하게는, 상기 구조물-유래의 인트론과 스플라이스-수용체 사이트는 상기 구조물 내에서 상기 스플라이스-공여체 사이트로부터 하류에 위치한다.

상기 타겟팅 서열은 상동 재조합이 일어나게 될 지놈내의 미리 선택된 타겟 사이트와 상동적(homologous)이다. 그것은 인간 G-CSF 유전자의 해독 개시 사이트에 대하여 뉴클레오티드 -6578에서 -364까지를 나타내는 서열 5 중의 적어도 20개(예를 들면, 적어도 50 또는 100개)의 인접한(contiguous) 뉴클레오티드를 포함한다. "상동적(homologous)"이란 타겟팅 서열이 그의 지놈 타겟 사이트와 동일하거나 또는 충분히 비슷하여, 상기 타겟팅 서열과 타겟 사이트 간에 상동 재조합이 일어날 수 있음을 의미한다. 상동 재조합이 유용한 빈도로 일어날 수 있는 한, 적은 퍼센트의 염기쌍 미스매치(mismatch)는 허용 가능하다. 상동 재조합을 촉진시키기 위하여, 상기 타겟팅 서열은 바람직하게는 적어도 약 20개(예를 들면, 적어도 50, 100, 250, 400 또는 1000개)의 염기쌍("bp") 길이이다. 상기 타겟팅 서열은 또한 서열 5에 의하여 커버되는 영역 외부로부터의 지놈 서열을 포함할 수 있는데, 단 상기 영역 중의 뉴클레오티드를 적어도 20개 이상 포함하여야 한다. 예를 들면, 부가적인 타겟팅 서열은 서열 5와 G-CSF 유전자의 내인성 전사 개시 서열 사이에 위치한 서열로부터 유래될 수 있다.

G-CSF 유전자 영역에 존재하는 다형성(polymorphism)때문에, 모든 주어진 지놈 타겟 사이트의 뉴클레오티드 조성에 있어 적은 변동이 모든 주어진 포유동물 종에서 일어날 수 있다. 서열 5의 그러한 다형적 변이체(variant), 특히 인간의 다형적 변이체에 해당되는 타겟팅 서열은 본 발명의 범위 내에 있다.

상동 재조합이 일어나면, 상기 구조물의 조절 서열은 세포 염색체내의 G-CSF 유전자의 코딩 서열 상류에 있는 미리 선택된 영역으로 통합된다. 그로부터 생성되는, 상기 구조물 유래의 조절 서열을 포함하는 새로운 전사 단위(unit)는 타겟 G-CSF 유전자의 발현을 변화시킨다. 그와 같이 생산된 G-CSF 단백질은 변화되지 않은 내인성 유전자에 의하여 코딩되는 G-CSF 단백질과 서열이 동일하거나, 또는 상동 재조합의 결과로서 도입된 변화때문에 야생형(wild type) G-CSF 단백질에 비하여 부가적인, 치환된 또는 더 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

유전자 발현을 변화시킨다는 것은 수득된 세포 내에서 정상적으로는 침묵하는(silent, 즉 근본적으로는 발현되지 않는) 유전자를 활성화시키는 것(또는 발현을 야기하는 것), 유전자의 발현수준을 증가 또는 감소시키는 것, 및 유전자의 조절 패턴을 바꾸어, 그 패턴이 수득된 세포에서의 패턴과 달라지도록 하는 것을 포함한다. "수득된 세포(cells as obtained)"란 상동 재조합 이전의 세포를 의미한다.

또한, 포유동물 세포에서 내인성 G-CSF 유전자의 발현을 변화시키기 위하여 본 발명의 DNA 구조물을 사용하는 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 방법은 (i)포유동물 세포내로 상기 DNA 구조물을 도입하는 단계, (ii)상기 세포를 상기 구조물과 상기 타겟팅 서열과 상동적인 지놈 타겟 서열 간에 상동 재조합이 일어나도록 허용하는 조건하에서 유지하여 상동 재조합 세포(homologously recombinant cell)를 생산하는 단계, 및 (iii)상기 상동 재조합 세포를 상기 구조물 유래의 조절 서열의 통제하에 G-CSF 코딩 서열의 발현을 허용하는 조건하에서 유지하는 단계를 포함한다. 지놈 타겟 사이트의 적어도 한 부분은 내인성 G-CSF 유전자의 코딩 서열에 대하여 5'이다. 즉, 상기 지놈 타겟 사이트는 코딩 서열 뿐만 아니라 5'-비코딩 서열도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 세포 내에서 상기 구조물이 내인성 G-CSF 유전자의 하나 또는 두 개의 대립유전자(allele)에 있는 내인성 ATG 개시 코돈 상류의 지놈 DNA와 상동 재조합된, 형질전이(transfection)된 또는 감염(infection)된 세포를 특징으로 한다. 상동 재조합 세포(homologously recombinant cell)라고 불리기도 하는그러한 형질전이된 또는 감염된 세포는 변화된 G-CSF 발현 패턴을 가지고 있다. 이러한 세포는 특히 시험관내 G-CSF 생산과 유전자 치료를 통한 G-CSF 전달에 유용하다. 그러한 세포를 만들고 사용하는 방법 또한 본 발명에 포함된다. 상기 세포는 포유동물(예를 들면, 인간, 인간이 아닌 영장류, 젖소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 토끼, 마우스, 기니아 피그, 햄스터 또는 랫트) 기원과 같은 척추동물 기원일 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 구조물을 상동 재조합을 통하여 숙주세포의 지놈내로 도입함으로써 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 포유동물의 G-CSF 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 상동 재조합 세포는 이어서 전사, 해독, 그리고 선택적으로 G-CSF 단백질의 분비를 허용하는 조건하에서 유지된다.

본 발명은 또한 서열 5 또는 그의 상대물(complement)의 적어도 20개(예를 들면, 적어도 30, 50, 100, 200 또는 1000개)의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 타겟 서열과의 상동 재조합을 방해하지 않는 다형성 변이나 다른 소수의 변이(예를 들면, 서열의 5% 이하의)를 제외하고는 서열 5와 동일한 서열의 분리된 핵산을 특징으로 한다. 일실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 서열 5의 인접한 100bp 구역을 포함한다. 예를 들면, 상기 분리된 DNA는 서열 5 또는 그의 상대물의 뉴클레오티드 1부터 100까지, 101부터 200까지, 201부터 300까지, 301부터 400까지, 401부터 500까지, 501부터 600까지, 601부터 700까지, 701부터 800까지, 801부터 900까지, 901부터 1000까지, 1001부터 1100까지, 1101부터 1200까지, 1201부터 1300까지, 1301부터 1400까지, 1401부터 1500까지, 1501부터 1600까지, 1601부터 1700까지, 1701부터 1800까지, 1801부터 1900까지, 1901부터 2000까지, 2001부터 2100까지, 2101부터 2200까지, 2201부터 2300까지, 2301부터 2400까지, 2401부터 2500까지, 2501부터 2600까지, 2601부터 2700까지, 2701부터 2800까지, 2801부터 2900까지, 2901부터 3000까지, 3001부터 3100까지, 3101부터 3200까지, 3201부터 3300까지, 3301부터 3400까지, 3401부터 3500까지, 3501부터 3600까지, 3601부터 3700까지, 3701부터 3800까지, 3801부터 3900까지, 3901부터 4000까지, 4001부터 4100까지, 4101부터 4200까지, 4201부터 4300까지, 4301부터 4400까지, 4401부터 4500까지, 4501부터 4600까지, 4601부터 4700까지, 4701부터 4800까지, 4801부터 4900까지, 4901부터 5000까지, 5001부터 5100까지, 5101부터 5200까지, 5201부터 5300까지, 5301부터 5400까지, 5401부터 5500까지, 5501부터 5600까지, 5601부터 5700까지, 5701부터 5800까지, 5801부터 5900까지, 5901부터 6000까지, 6001부터 6100까지, 6101부터 6200까지, 또는 6136부터 6235까지를 포함할 수 있다. 서열 5 및 그의 상대물의 이러한 구역은 또한 본 발명의 구조물에 있어서 타겟팅 서열로서 유용하다.

상기 분리된 DNA에서, 서열 5로부터 유래된 서열은 전체 길이의 G-CSF-코딩 서열에 연결되지 않거나, 또는 적어도 모든 야생형 지놈에서 일어나는 것과 같은 배열(즉, 동일한 비코딩 서열에 의하여 분리되는)로는 연결되지 않는다. 여기에서 사용되는 "분리된 DNA(isolated DNA)"란 이와 같이, 서열 5의 일부 또는 전부를 포함할 뿐만 아니라, 완전한 G-CSF 코딩 서열 및 G-CSF 코딩 서열과 세포의 지놈에 존재하는 서열 5에 해당하는 서열 간에 놓여있는 서열 전부를 포함하는 염색체 또는 거대한 지놈 DNA 조각(코스미드 또는 이스트 인공 염색체내로 삽입될 수 있는)을 의미하지는 않는다. 그것은 (i)플라스미드 또는 바이러스내로 삽입되거나, 또는 (ii)다른 서열로부터 독립된 개별 분자, 예를 들면 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 제한효소 처리에 의하여 생산된 단편으로 존재하는 DNA를 포함하지만, 그에 한정되지는 않는다. 상기 분리된 DNA는 바람직하게는 완전한 G-CSF 전구체(precursor, 즉 내인성 분비 시그날 펩티드를 가지는 완전한 G-CSF)를 포함하지 않는다.

본 발명은 또한 적어도 길이가 100(예를 들면, 적어도 200, 400 또는 1000개) 뉴클레오티드이며, 매우 엄격한 조건(highly stringent condition) 또는 적당히 엄격한 조건(moderately stringent condition)하에서 서열 5 또는 서열 5의 상대물과 혼성화(hybridization)하는 서열을 포함하는 가닥(strand)을 포함하는 분리된 DNA를 포함한다. 상기 서열은 G-CSF 코딩 서열에 연결되지 않거나, 또는 적어도 모든 야생형 지놈에서 일어나는 것과 동일한 배열로는 연결되지 않는다. "적당히 엄격한 조건(moderately stringent condition)"이란 처치 완충액(Church buffer: 7% SDS, 0.5% NaHPO₄, 1M EDTA, 1% 소혈청 알부민) 중에서 50℃에서 혼성화시키고, 2X SSC로 50℃에서 세척함을 의미한다. "매우 엄격한 조건(highly stringent condition)"이란 50% 포름아미드 존재하에 42℃에서 혼성화시키고, 1% SDS를 포함하는 2X SSC로 65℃에서 일차 세척한 다음, 0.1X SSC로 65℃에서 이차 세척함을 의미한다.

또한, 본 발명은 길이가 적어도 100(예를 들면, 200, 400 또는 1000) 뉴클레오티드이고, 서열 5 또는 그의 상대물로부터 유래된 동일 길이의 단편과 적어도 80%(예를 들면, 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 98%)의 서열 상동성을 공유하는 서열을 포함하는 가닥을 포함하는 분리된 DNA를 포함한다. 상기 서열은 G-CSF 코딩 서열에 연결되지 않거나, 또는 적어도 모든 야생형 지놈에서 일어나는 것과 동일한 배열로는 연결되지 않는다.

특정한 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 참조 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 대하여 특이적인 퍼센트 상동성(identity) 또는 보존성(conservation)을 가지고 있다고 기술함에 있어서, 상기 퍼센트 상동성 또는 보존성은, 갭 길이 페널티(gap length penalty) 12와 갭 페널티 4를 그러한 파라미터가 요구되는 곳에 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함되어 있는 마이어스와 밀러(Myers and Miller)의 알고리즘인 CABIOS(1989) 또는 그의 등가물(equivalent)에 의하여 결정된다. 모든 다른 파라미터들은 그들의 디폴트(default) 위치에 세트된다. ALIGN은 쉽사리 접근해서 이용할 수 있다(참조: 예를 들면, 인터넷 상의 http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi).

본 발명은 또한 내인성 G-CSF 유전자가 여기에 기술된 바 대로 활성화된 세포를 제공하고, 그 세포를 동물에 이식하여 그 동물에서 상기 세포가 G-CSF를 분비하도록 함으로써, G-CSF를 동물(예를 들면, 인간, 인간이 아닌 영장류, 젖소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 토끼, 마우스, 기니아 피그, 햄스터 또는 랫트와 같은 포유동물)에 전달하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 내인성 G-CSF유전자가 여기에 기술된 바 대로 활성화된 세포를 제공하고 그 세포를 G-CSF의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 시험관내 배양함으로써 G-CSF를 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명의 분리된 DNA는 예를 들면, 내인성 G-CSF 유전자의 조절 영역 및/또는 코딩 서열을 수득하는데 사용하기 위한 상류 PCR 프라이머(적절한 하류 프라이머와 함께 사용될 때)의 소스로 사용되거나, 또는 인간 염색체의 제조(preparation)시 17번 염색체의 존재를 알려주기 위한 혼성화 프로브로 사용될 수 있다. 상기 분리된 DNA는 또한 후술하는 바와 같이, 척추동물 세포에서 내인성 G-CSF 유전자의 발현을 변화시키기 위한 방법에 사용될 수 있다.

달리 정의되지 않으면, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예시적인 방법 또는 재료가 후술되지만, 여기에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법 또는 재료 또한 본 발명을 실현하거나 테스하는데 사용될 수 있다. 여기에서 언급되는 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 다른 참조문헌은 전문 그대로 참조문헌으로서 포함된다. 내용이 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 기준이 될 것이다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명을 제한하려는 의도로 이해되어서는 안된다.

본 발명의 다른 특징 및 장점들은 하기의 상세한 설명과 청구항으로부터 명백해질 것이다.

본 발명은 지놈 유전자에 관한 것이다.

도 1은 인간 G-CSF 유전자의 지놈 구조를 보여주는 개략도이다.

도 2는 플라스미드 pHGCSF1 및 pHGCSF4의 삽입체(insert)에 포함된 인간 G-CSF 지놈 영역을 보여주는 개략도이다.

도 3은 ATG 개시 코돈에 대하여 5'에 있는 서열의 6,578 뉴클레오티드를 포함하는 인간 G-CSF 유전자의 일부 서열(서열 1)을 나타낸다. 또한, 코딩 서열에 의하여 코딩되는 일부 폴리펩티드 서열(서열 2)을 도시하였다. G-CSF/3 파아지 클론내의 상기 지놈 삽입체와 파아지 팔(arm) 간의 연결부위로부터 유래된 서열은 밑줄 그어져 있다.

도 4는 본 발명의 구조물을 보여주는 개략도이다. 상기 구조물은 제 1 타겟팅 서열(1); 증폭가능한 마커 유전자(AM); 선별가능한 마커 유전자(SM); 조절 서열; CAP 사이트; G-CSF의 시그날 펩티드의 일부를 코딩하는 엑손; 짝지어 지지 않은 스플라이스-공여체 사이트(SD); 및 제 2 타겟팅 서열(2)을 포함한다. 검은색 박스는 코딩 DNA를 나타내고, 점묘된 박스는 전사되지만 해독되지 않는 서열을 나타낸다.

도 5는 인간 G-CSF 전사 개시 사이트 상류의 지놈 서열인 서열 5를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 구조물에 사용된 제 1 타겟팅 서열(서열 6)을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 구조물에 사용된 제 2 타겟팅 서열(서열 7)을 나타낸다.

본 발명은 인간 G-CSF 유전자의 코딩 서열의 상류에 있는 서열의 뉴클레오티드 조성의 발견에 기초한다.

G-CSF는 조혈 선조 세포(hematopoietic progenitor cell)의 호중구/과립구 혈통으로의 증식 및 분화를 자극하는 사이토카인이다. G-CSF는 통상 화학치료에 의하여 유발된 호중구 감소증의(neutropenia) 예방 및 골수이식과 연관하여 사용된다. 만성, 특발성 및 선천성 호중구성 질병 또한 G-CSF의 투여 후에 향상을 보인다.

인간 G-CSF 유전자는 30개 아미노산의 시그날 펩티드를 포함하는 204 또는 207개 아미노산의 전구체 단백질을 코딩한다. 인간 G-CSF 유전자의 지놈 지도를 도 1에 도시하였다. 상기 지도는 해독 개시 사이트에 대하여 -363 위치에서 시작하는 2,960bp의 공개된 서열(HUMGCSFG, GenBank accession number X03656)에 근거하여 제작된 것이다(달리 지정되지 않으면, 여기에서 언급되는 모든 위치는 해독 개시 사이트에 대하여 상대적이다). 상기 유전자는 5개의 엑손과 4개의 인트론을 포함하는데, 첫번째 엑손은 시그날 펩티드의 13과 2/3개 아미노산을 코딩한다(즉, 상기 첫번째 엑손은 시그날 펩티드를 코딩하는 13개의 코돈과 14번째 코돈의 첫 두 뉴클레오티드를 포함한다).

인간 G-CSF 유전자 5'의 서열

G-CSF 유전자 상류의 서열을 포함하는 지놈 DNA를 얻기 위하여, λ EMBL3내의 인간 백혈구(leukocyte) 지놈 라이브러리(Clontech 카탈로그 # HL1006d)를 PCR에 의해 생성된 729bp 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)로 스크리닝하였다. 상기 프로브는 G-CSF의 엑손 1 및 엑손 2를 포함하며, 이용가능한 G-CSF 지놈 DNA 서열로부터 디자인되고 각각 102와 105로 명명된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 인간 지놈 DNA로부터 증폭되었다(참조: 도 1). 상기 프라이머 102의 5' 말단은 -345 위치에 해당되고, 이 프라이머의 서열은 5'-TATCAGCGGCTCAGCCTTTG-3'(서열 3)이다. 상기 프라이머 105의 5' 말단은 +384 위치에 해당되고, 이 프라이머의 서열은 5'-CCACCTCACTCACCAGCTTCTC-3'(서열 4)이다.

약 150만 개의 재조합 파아지(phage)를 방사성동위원소로 표지된 상기 729bp 프로브로 스크리닝하였다. 4개의 독립적인 파아지 플라크(plaque)를 분리하였다. 그들 중 하나를 G-CSF/3 클론이라 명명하고, 뒤이은 연구에 사용하였다.

상기 파아지 G-CSF/3으로 부터 유래된 6.5kb의 HindIII-KpnI 단편을 pBluescript II SK+(Stratagene, LaJolla, CA)에 서브클로닝하여, G-CSF 유전자의 상류 서열 및 전체 단백질-코딩 영역을 포함하는 pHGCSF1을 제조하였다. pHGCSF1의 삽입체와 약 0.4kb 정도 중복되는, 추가적인 상류 서브클론 pHGCSF4를 3.3kb SalI 단편으로부터 제조하였다(참조: 도 2).

상기 pHGCSF1 및 pHGCSF4 플라스미드를 생어(Sanger) 방법으로 서열분석하였다. 상기 서열 데이타를 정렬하여, 인간 G-CSF 유전자의 전사 개시 코돈 바로 상류의 -6,578 위치에서 시작하는 6.6kb 영역의 서열을 얻었다. 이 서열은 서열 1의일부이며, 도 3에 도시하였다.

서열 1의 5' 말단에 있는 19bp(도 3에서 밑줄 그어진 부분)는 G-CSF/3 파아지 클론에 있는 지놈 삽입체와 파아지 팔(arm) 간의 연결부위로부터 유래된 것이다. 따라서, 상기 19bp 영역에 있는 SalI 사이트는 상기 파아지 라이브러리가 유래된 인간 지놈에는 없다. -6,578에서 -364 위치 사이에 있는 서열(서열 5)은 이전에 공지된 G-CSF 지놈 서열의 상류 영역으로부터 유래된 인간 지놈 서열이며, 이전에는 보고된 적이 없다.

내인성 G-CSF 유전자의 발현을 변화시키기 위해서, 서열 5의 뉴클레오티드 1470에서 4723까지를 포함하는 DNA 단편을 플라스미드 pGG13의 CMV 프로모터와 네오마이신 내성 유전자의 상류에 클로닝하였다. 뉴클레오티드 1470-4723(서열 6)은 도 4에 개략적으로 나타낸 제 1 타겟팅 서열을 나타낸다. 도 4의 제 2 타겟팅 서열을 위해서, G-CSF 유전자 서열의 해독 개시 사이트에 대하여 뉴클레오티드 4728에서 5979까지(서열 7)를 포함하는 DNA 단편을 상기 CMV 프로모터와 네오마이신 내성 유전자의 하류에 클로닝하였다. 상기 pGG13 플라스미드를 G-CSF 유전자를 거의 또는 전혀 발현하지 않는 인간 섬유아 세포(fibroblast cell)에 도입하여, 내인성 G-CSF 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하였다. 플라스미드 도입 후에 G418에 대하여 내성을 가지는 세포를 스크리닝하여, pGG13과 지놈 DNA 간의 상동 재조합이 내인성 G-CSF 유전자 근처에서 일어났을 경우에 예상되는 증가된 G-CSF 유전자 발현을 보이는 세포들을 확인하였다.

일반적인 방법론

내인성 G-CSF 발현의 변화

상술한 G-CSF 상류 서열을 이용하여, 미국특허 제 5,641,670호에 일반적으로 기술된 방법에 의하여 내인성 인간 G-CSF 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 한 가지 방법을 도 4에 도시하였다. 이 방법에 있어서, 타겟팅 구조물은 상기 유전자 상류의 제 1 타겟 사이트와 상동적인 제 1 타겟팅 서열; 증폭가능한 마커 유전자; 선별가능한 마커 유전자; 조절 영역; CAP 사이트; G-CSF 시그날 펩티드의 첫 13과 2/3개 아미노산의 서열과 동일하거나 또는 기능적으로 그에 상당하는 아미노산 서열을 코딩하는 엑손(즉, 첫번째 엑손은 시그날 펩티드를 코딩하는 13개의 코돈과 14번째 코돈의 첫 두 뉴클레오티드를 포함한다); 스플라이스-공여체 사이트; 및 상기 제 1 타겟 사이트 하류의 제 2 타겟 사이트와 상동적이며, G-CSF 코딩 서열 내부 또는 상류에서 끝나는 제 2 타겟팅 서열을 포함하도록 고안된다.

이 방법에 따르면, 제 1 및 제 2 타겟 사이트는 상동 재조합 이전에는 염색체 내에서 바로 인접해 있으나, 이러한 배열이 요구되는 것은 아니다(하기를 참조할 것). 상동 재조합 세포는 외인성 엑손; 스플라이스-공여체 사이트; 및 G-CSF 인트론, 엑손 및 3'의 해독되지 않는 영역을 포함하는, 상기 스플라이스-공여체 사이트와 G-CSF 유전자의 전사 종료 서열 사이의 모든 서열에 해당하는 mRNA 전구체를 생산할 것이다(참조: 도 4). 이러한 전사체의 스플라이싱은 외인성 엑손이 내인성 G-CSF 유전자의 엑손 2에 융합된 mRNA를 초래한다. 상기 mRNA의 해독은 G-CSF 전구체를 생산한다. 상기 DNA 구조물에 코딩 서열을 포함시키는 것은 시그날 펩티드에 어떤 바람직한 변형을 가하는 것을 가능케 한다.

다른 접근방법 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 제 1 및/또는 제 2 타겟 사이트는 G-CSF 유전자의 첫번째 인트론 내에 있을 수 있다. 이와 달리, 상기 DNA 구조물은 5'에서 3'까지에 제 1 타겟팅 서열, 증폭가능한 마커유전자, 선별가능한 마커유전자, 조절 영역, CAP 사이트, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 인트론, 스플라이스-수용체 사이트, 및 제 2 타겟팅 서열을 포함하도록 고안될 수 있다. 이러한 방법을 위하여, 제 2 타겟 사이트의 5' 말단은 원하지 않는 ATG 개시 코돈을 피할 수 있도록, 바람직하게는 정상 G-CSF 해독 개시 사이트로부터 60bp 이하 상류이다. 상기 상동 재조합된 영역으로부터 생산된 mRNA 전구체는 외인성 엑손, 외인성 스플라이스-공여체 사이트, 외인성 인트론, 외인성 스플라이스-수용체 사이트, 제 2 타겟팅 서열, 및 상기 제 2 타겟팅 서열과 내인성 유전자 3'의 전사되지 않는 영역 사이의 모든 서열을 포함할 것이다. 상기 전사체의 스플라이싱은 정상 G-CSF 분비 시그날 서열 또는 유전적으로 조작된 분비 시그날 서열을 가지는, 인간 G-CSF의 전구체를 생산하도록 해독될 수 있는 mRNA를 생성할 것이다. 외인성(exogenous) 인트론의 크기와 상기 유전자의 코딩 영역에 상대적인 외인성 조절 영역의 위치는 상기 조절 영역의 기능을 최적화하기 위하여 달라질 수 있다.

모든 활성화 방법에 있어서, 제 1 및 제 2 타겟 사이트는 바로 인접해있거나 또는 서로 가까이에 있을 필요 조차 없다. 그들이 서로 바로 인접해있지 않을 때, G-CSF 유전자의 정상적인 상류 영역의 한 부분 및/또는 코딩 영역의 한 부분이 상동 재조합시 결실될 것이다.

DNA 구조물

본 발명의 DNA 구조물은 최소한 타겟팅 서열과 조절 서열을 포함한다. 그것은 추가적으로 엑손; 또는 엑손 및 짝지어지지 않은 스플라이스-공여체 사이트; 또는 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 인트론 및 스플라이스-수용체 사이트를 포함할 수 있다. 상기 엑손은 만약 있다면 조절 영역의 3'이고, 상기 짝지어지지 않은 스플라이스-공여체 사이트는 상기 엑손의 3' 말단에 있다. 상기 인트론과 스플라이스-수용체 사이트는 만약 있다면 스플라이스-공여체 사이트의 3'이다. 또한, 상기 짝지어지지 않은 스플라이스-공여체 사이트가 측접하고 있는 엑손에 선행하는(즉, 5'에) 다수 개의 엑손 및 인트론이(적절한 스플라이스-공여체 및 수용체 사이트와 함께) 있을 수 있다. 상기 구조물내의 DNA는 원래 숙주 세포 지놈의 일부분이 아니기 때문에 외인성(exogenous)이라고 일컬어진다. 외인성 DNA는 형질전이 또는 바이러스 벡터에 의해 감염되기 전의 세포에 있는 내인성 지놈 DNA의 부분들과 동일하거나 또는 상이한 서열을 가질 수 있다. 여기에서, "형질전이(transfection)"란 화학적 또는 물리적 수단, 예를 들면 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 동시 침전법(co-precipitation), DEAE-덱스트란-매개 형질전이, 리포펙션(lipofection), 일렉트로포레이숀(electroporation), 마이크로인젝숀(microinjection), 마이크로프로젝타일(microprojectile), 또는 바이오리스틱-매개 흡수(biolistic-mediated uptake)에 의하여 세포내로 플라스미드를 도입하는 것을 의미한다. "감염(infection)"이란 바이러스 감염에 의하여 바이러스 핵산을 세포내로 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 DNA 구조물에 포함된다양한 요소들을 하기에서 상세히 설명한다.

상기 DNA 구조물은 또한 시스-액팅(cis-acting) 또는 트랜스 액팅(trans-acting) 바이러스 서열(예를 들면, 포장 시그날)을 포함함으로써, 구조물을 바이러스 벡터에 의한 감염을 통해 세포 핵내로 전달할 수 있다. 필요한 곳에서, 상기 DNA 구조물은 레트로 바이러스의 인테그라아제-매개 통합(integrase-mediated integration) 또는 에피좀 유지(episome maintenance)와 같은 바이러스 일생 주기(life cylce)의 다양한 단계로부터 유리될 수 있다. 유리(disengagement)는 레트로 바이러스 벡터내의 인테그라아제 코딩 영역의 결실과 같이 바이러스 서열을 적절히 결실 또는 변이시킴으로서 이루어질 수 있다. 상기 구조물 및 바이러스 벡터의 사용에 관련된 추가적인 상세한 설명은 여기에 참조문헌으로서 포함된 로빈스 등의 문헌(Robbins et al., Pharmacol. Ther. 80:35-37, 1998) 및 군즈버그 등의 문헌(Gunzburg et al., Mol. Med. Today 1:410-417, 1995)에서 찾아볼 수 있다.

타겟팅 서열

타겟팅 서열은 숙주 지놈에 있는 선택된 사이트로 원하는 서열을 상동 재조합시키는 것을 가능케 한다. 타겟팅 서열은 숙주 지놈에 있는 그들 각자의 타겟 영역과 상동적이다(즉, 상동 재조합할 수 있다).

환형 DNA 구조물은 한개의 타겟팅 서열, 또는 둘 또는 그 이상의 분리된 타겟팅 서열을 포함할 수 있다. 선형 DNA 구조물은 둘 또는 그 이상의 분리된 타겟팅 서열을 포함할 수 있다. 주어진 타겟팅 서열과 상동적인 타겟 사이트는 G-CSF 유전자의 엑손 및/또는 인트론 내에, 상기 코딩 영역의 상류이자 바로 인접한 곳에, 또는 상기 코딩 영역의 상류이자 멀리 떨어진 곳에 위치할 수 있다.

상기 구조물내의 두 개의 타겟팅 서열 중 첫번째(또는, 만약 구조물 내에 한 개의 타겟팅 서열만이 있다면, 전체 타겟팅 서열)는 적어도 일부는 G-CSF-코딩 서열의 상류에 있는 신규한 지놈 영역으로부터 유래된다. 이러한 타겟팅 서열은 서열 1의 한 부분, 즉 -6,578에서 -364 위치에 해당하는 서열(서열 5)로부터 유래된 적어도 20개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 구조물내의 두 개의 타겟팅 서열 중 두번째는 코딩 서열 상류의 지놈 영역(예를 들면, 서열 5의 일부 또한 포함하는)을 타겟팅하거나, 또는 상기 유전자의 엑손 또는 인트론을 타겟팅할 수 있다.

상기 타겟팅 서열은 구조적으로 규명되지 않았지만 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 지도화(map)될 수 있는 훨씬 상류의 영역뿐만 아니라, 여기에 기술된 것들을 포함하여 G-CSF 유전자의 공개된 영역으로부터 유래된 서열을 추가로 포함할 수 있다.

타겟팅 서열로서 사용될 수 있는 지놈 단편은 서열 5의 전체 또는 일부를 포함하는 프로브에 혼성화하는 그들의 능력으로써 확인될 수 있다. 그러한 프로브는 서열 1로부터 유래된 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 생성될 수 있다.

조절 서열

상기 DNA 구조물의 조절 서열은 하나 또는 그 이상의 프로모터(예를 들면, 항상 발현되는(constitutive), 조직-특이적, 또는 유도가능한(inducible) 프로모터), 인핸서(enhancer), 스캐폴드-부착(scaffold-attachment) 영역 또는 기질 부착 (matrix attachment) 사이트, 음성 조절 인자(negative regulatory element), 전사인자 결합 사이트, 또는 이러한 요소들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 조절 영역은 진핵세포(예를 들면, 포유동물) 또는 바이러스의 지놈으로부터 유래될 수 있다. 유용한 조절 서열은 SV40 초기(early) 또는 말기(late) 유전자, 사이토메갈로바이러스 유전자, 및 아데노바이러스 주요 말기(major late) 유전자의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그들은 또한 마우스 메탈로티오닌-I, 신장인자(elongation factor)-1α, 콜라겐(예를 들면, 콜라겐 Iα1, 콜라겐 Iα2 및 콜라겐 IV), 액틴(예를 들면, γ-액틴), 면역글로블린, HMG-CoA 환원효소, 인산 글리세르알데히드 탈수소효소, 3-포스포글리세라테키나아제(3-phosphoglyceratekinase), 교원효소(collagenase), 스트로멜리신, 피브로넥틴, 비멘틴, 플라스미노겐 활성화물질 저해물질 I, 티모신 β4, 메탈로단백질분해효소(metalloproteinase)의 조직 저해물질, 리보좀 단백질, MHC(major histocompatibility complex) 분자, 및 인간 백혈구 항원을 코딩하는 유전자로부터 유래된 조절영역을 포함한다.

상기 조절 서열은 바람직하게는 TATA 박스, CCAAT 박스, AP1, Sp1, 또는 NF-κB 결합 사이트와 같은 전사 인자 결합 사이트를 포함한다.

마커 유전자

만약 원한다면, 상기 구조물은 그 자신의 프로모터에 작동가능한 방식으로 연결되어 있는 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이에 대한 일례는 타겟팅 여부의 확인을 용이하게 하는데 사용될 수 있는 마커 유전자를 포함한다. 증폭가능한 마커 유전자 또한 함께 증폭된 측접하는(flanking) DNA 서열을 가지고 있는 세포의 선별을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 상기 증폭가능한 마커 유전자의 증폭된 카피를 포함하고 있는 세포는 그 증폭가능한 유전자의 발현에 대하여 선택적인 물질의 존재 하에 성장시켜 봄으로써 구별될 수 있다. 활성화된 내인성 G-CSF 유전자는 전형적으로 상기 증폭된 선별가능한 마커 유전자와 일렬로(in tandem) 증폭될 것이다. 활성화된 내인성 유전자의 다수 개의 카피를 포함하는 세포는 매우 높은 수준의 G-CSF 유전자를 생산할 수 있고, 따라서 시험관내 단백질 생산 및 유전자 치료에 유용하다.

상기 선별가능한 마커 유전자와 증폭가능한 마커 유전자는 서로 바로 인접하여 위치할 필요는 없다. 상기 증폭가능한 마커 유전자 및 선별가능한 마커 유전자는 동일한 유전자일 수 있다. 상기 마커 유전자 중의 하나 또는 둘 모두는 DNA 구조물의 인트론 내에 위치할 수 있다. 적절한 증폭가능한 마커 유전자와 선별가능한 마커 유전자는 미국특허 제 5,641,670호에 개시되어 있다.

외인성 엑손

상기 DNA 구조물은 엑손, 즉 RNA로 카피되며 성숙한(mature) mRNA 분자 내에 존재하는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 구조물내의 엑손은 여기에서 "외인성 엑손"이라고 불리워진다. 상기 외인성 엑손은 인간 G-CSF 유전자의 첫번째 엑손과 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 이와 달리, 상기 외인성 엑손은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 코딩하거나, 또는 한 아미노산 잔기를 부분적으로 코딩한다(즉, 한 코돈의 하나 또는 두 개의 뉴클레오티드를 포함한다). 상기 엑손이 코딩 서열을 포함할 때, 상기 DNA 구조물은 전사 및 스플라이싱시에 최종적으로 생성되는 mRNA의 해독틀(reading frame)이 타겟 G-CSF 유전자의 코딩 영역과 틀에 맞도록(in-frame) 고안되어야 한다. 즉, 상기 외인성 엑손은 내인성 엑손으로부터 유래된 mRNA 부분의 적절한 해독틀을 변화시키지 않는 방식으로 내인성 엑손으로 스플라이싱 된다.

타겟팅 구조물 내에 코딩 엑손을 포함시키는 것은 내인성 G-CSF 단백질 서열 및 외인성 단백질 서열 둘 다를 포함하는 융합 단백질의 생산을 가능케 한다. 그러한 혼성 단백질(hybrid protein)은 두 개 또는 그 이상의 단백질로부터 유래된 구조적, 효소적(enzymatic), 또는 리간드- 또는 수용체-결합 특성을 하나의 폴리펩티드내로 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 외인성 엑손은 세포막 고정체(anchor), 세포 분비를 향상시키는 시그날 펩티드, 리더 서열, 효소 영역, 보조인자(co-factor) 결합 영역, 또는 상기 재조합 유전자 영역으로부터 생산된 G-CSF 혼성 단백질의 정제를 용이하게 하는 에피토프(epitope) 태그를 코딩할 수 있다.

스플라이스-공여체 사이트

스플라이스-공여체 사이트는 상기 외인성 엑손의 3' 말단에 측접한다. 상기 스플라이스-공여체 사이트는 RNA 전사체의 한 엑손의 스플라이싱을 그 전사체의 다른 엑손의 스플라이스-수용체 사이트로 디렉트하는 서열이다. 전형적으로, 첫 번째 엑손은 두 번째 엑손의 5'에 위치하고, 첫 번째 엑손의 3' 말단에 위치한 스플라이스-공여체 사이트는 두 번째 엑손의 5'쪽에 있는 스플라이스-수용체 사이트와 짝을 이룬다. 스플라이스-공여체 사이트는 (A/C)AGGURAGU(여기에서 R은 퓨린 뉴클레오티드를 나타낸다)로 나타내어지는 특징적인 공통서열(consensus sequence)을 가지고 있는데, 여기에서 네 번째와 다섯 번째 위치에는 GU가 요구된다(참조: Jakson, Nucleic Acids Research 19:3715-3798, 1991). 상기 스플라이스-공여체 공통 사이트의 첫 세 염기는 엑손의 마지막 세 염기이다: 즉, 그들은 스플라이싱되어 나간다. 스플라이스-공여체 사이트는 mRNA 스플라이싱 경로 내에서 적절한 반응을 행하는 그들의 능력에 의하여 기능적으로 정의된다.

일례로서, 하나 또는 그 이상의 사이에 끼어있는 뉴클레오티드가 외인성 엑손이 상기 타겟 유전자의 두 번째 엑손과 틀에 맞게 되는데 요구되지 않을 때, 상기 스플라이스-공여체 사이트는 ATG 코돈의 3'에 바로 인접하여 위치될 수 있다. 상기 외인성 엑손이 타겟 유전자의 코딩 서열과 틀에 맞게 하나 또는 그 이상의 아미노산을 코딩할 때, 상기 스플라이스-공여체 사이트는 바람직하게는 그의 3'쪽에서 상기 외인성 코딩 서열에 바로 인접하여 위치될 수 있다.

상기 외인성 엑손에 측접한 스플라이스-공여체 사이트는 상기 구조물내에서 짝을 이루고 있지 않다. 즉, 상기 구조물 그 자체에는 스플라이스-공여체 사이트가 스플라이싱 될 수 있는, 스플라이스-공여체 사이트 하류의 동반하는 스플라이스-수용체 사이트가 없다. G-CSF 코딩 서열 상류의 타겟 사이트로의 상동 재조합에 이어, 상기 구조물의 짝지워지지 않은 스플라이스-공여체 사이트는 G-CSF의 내인성 엑손의 내인성 스플라이스-수용체 사이트와 기능적을 짝을 이룬다. 상기 상동 재조합된 G-CSF 유전자로부터 유래된 전사체의 프로세싱은 상기 외인성 엑손의 내인성 엑손의 스플라이스-수용체 사이트로의 스플라이싱을 초래한다.

본 발명의 구조물은 또한 스플라이스-수용체 사이트를 포함할 수 있다. 이러한 사이트는 스플라이스-공여체 사이트와 함께 한 엑손의 다른 엑손으로의 스플라이싱을 디렉트한다. 스플라이스-수용체 사이트는 (Y)₁₀NYAG로 나타내어지는 특징적인 서열(서열 8)을 가지고 있는데, 여기에서 Y는 모든 피리미딘을 나타내고, N은 모든 뉴클레오티드를 나타낸다(참조: Jakson, Nucleic Acids Research 19:3715-3798, 1991).

인트론

상기 DNA 구조물은 선택적으로 인트론을 포함할 수 있다. 인트론은 스플라이스-공여체 사이트와 스플라이스-수용체 사이트 사이에 위치한 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열로, 성숙한 mRNA 분자 형성시 스플라이싱에 의하여 전구체RNA 분자로부터 제거된다.

캡 사이트(CAP site)

상기 DNA 구조물은 선택적으로 캡 사이트를 포함할 수 있다. 캡 사이트는 조절 영역과 결합되어 있으며 그에 의하여 이용되는 특정한 전자 개시 사이트이다. 이러한 캡 사이트는 상기 구조물내의 조절 서열과 관련된 위치에 위치해 있어서, 상동 재조합에 뒤이어 상기 조절 서열이 상기 캡 사이트에서 시작하는 전사체의 합성을 디렉트하도록 한다. 이와 달리, 캡 사이트가 구조물에 포함되어 있지 않고, 캡 사이트가 없을 시 전사 기구(apparatus)가 타겟 유전자 내에 있는 캡 사이트로 이용되기에 적절한 사이트를 찾을 것이다.

부가적인 DNA 요소(element)

상기 구조물은 상동 재조합에 의해 생산된 RNA나 단백질의 구조 또는 안정성에 영향을 주는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 DNA 구조물은 박테리아 또는 다른 적절한 클로닝/숙주 시스템에서 대규모 플라스미드 증식을 가능케하는, 박테리아의 복제 기점(replication origin) 및 박테리아의 항생제 내성 마커나 다른 선별가능한 마커를 포함할 수 있다.

DNA 구조물의 상술한 모든 요소들은 서로에 대하여 작동가능한 방식으로 연결되어 있거나 기능가능한 방식으로 위치해 있다. 즉, 상기 구조물과 타겟 지놈 DNA 간의 상동 재조합이 일어나면, 조절 서열은 캡 사이트(선택적으로 상기 구조물에 포함되는)에서 시작하며, (i)만약 있다면, 상기 구조물의 엑손 및 스플라이스-공여체 사이트에 해당하는 서열 및 (ii)그 스플라이스-공여체 사이트와 내인성 유전자의 전사 종료 사이트 사이에 위치한 서열을 포함하는, 일차 RNA 전사체의 생산을 디렉트할 수 있다. 상기의 스플라이스-공여체 사이트와 내인성 유전자의 전사 종료 사이트 사이에 위치한 서열은 G-CSF 유전자의 내인성 조절 영역 및 정상적으로는 전사되지 않는 그 영역 근처의 서열을 포함할 수 있다. 작동가능한 방식으로 연결된 배열에서, 상기 타겟팅 구조물의 스플라이스-공여체 사이트는 내인성 G-CSF 유전자의 엑손들 중 하나에 측접하는 스플라이스-수용체 사이트로 스플라이싱을 디렉트하여, 완전하게 스플라이싱된 성숙한(mature) 전사체로부터 원하는 단백질이 생산될 수 있도록 한다. 상기 스플라이스-수용체 사이트는 스플라이싱이 내인성 엑손으로 디렉트되도록 내인성일 수 있다. 스플라이스-수용체 사이트가 상기 타겟팅 구조물 내에 포함되어 있는 다른 구현에서, 스플라이싱은 상기 타겟팅 구조물에 의해 도입된 외인성 인트론을 제거한다.

상기 DNA 구조물 내에서 상기 요소들의 배열 순서는 다양할 수 있다. 구조물이 환형 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 경우, 최종적인 구조에 있어서 요소들의 상대적인 순서는 예를 들면, 타겟팅 서열, 플라스미드 DNA(미생물 또는 다른 적절한 숙주 내에서 타겟팅 플라스미드의 선별 및/또는 복제를 위하여 사용되는 서열을 포함하는), 선별가능한 마커(들), 조절 서열, 엑손, 그리고 짝지어지지 않은 스플라이스-공여체 사이트의 순일 수 있다.

구조물이 선형인 경우, 그 순서는 예를 들면, 제 1 타겟팅 서열, 선별가능한마커 유전자, 조절 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 그리고 제 2 타겟팅 서열의 순이거나; 또는 이와는 달리, 제 1 타겟팅 서열, 조절 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 선별가능한 마커 유전자, 그리고 제 2 타겟팅 서열의 순일 수 있다. 상기 요소들의 순서는 또한 제 1 타겟팅 서열, 선별가능한 마커 유전자, 조절 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 인트론, 스플라이스-수용체 사이트, 선택적으로 내부 리보좀 도입 사이트, 그리고 제 2 타겟팅 서열의 순일 수 있다.

한편, 그 순서는 제 1 타겟팅 서열, 제 1 선별가능한 마커 유전자, 조절 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 제 2 타겟팅 서열, 그리고 제 2 선별가능한 마커 유전자의 순이거나; 또는 제 1 타겟팅 서열, 조절 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 제 1 선별가능한 마커 유전자, 제 2 타겟팅 서열, 그리고 제 2 선별가능한 마커 유전자의 순일 수 있다. 제 1 선별가능한 마커 유전자에 측접한 타겟팅 서열과 숙주 지놈의 상동 서열 간의 재조합은, 제 2 선별가능한 마커는 통합되지 않으면서 제 1 선별가능한 마커의 타겟팅된 통합을 초래한다. 원하는 형질전이된 또는 감염된 세포는 제 2가 아니라 제 1 선별가능한 마커로 안정하게 형질전이 또는 감염된 세포이다. 그러한 세포는 제 1 마커의 발현에 대하여 선택적인 제제와 제 2 마커의 발현에 반하여 선택적인 다른 제제를 포함하는 배지에서 성장시킴으로써 선별될 수 있다. 상동 재조합 이외의 다른 메카니즘에 의하여 타겟팅 구조물을 부적절하게 통합시킨, 형질전이 또는 감염된 세포는 제 2 마커 유전자를 발현할 것으로 예상되며, 그에 따라 선별 배지에서 죽을 것이다.

양성적으로 선별가능한 마커가 그 마커의 증폭된 카피를 포함하는 세포를 선별할 수 있도록 때때로 구조물 내에 포함된다. 이러한 구현에서, 구조물 구성요소들의 배열순서는 예를 들면, 제 1 타겟팅 서열, 증폭가능한 양성적으로 선별가능한 마커, 제 2 선별가능한 마커(선택적임), 조절 서열, 엑손, 스플라이스-공여체 사이트, 그리고 제 2 타겟팅 DNA 서열의 순일 수 있다.

상기 구조물의 다양한 요소들은 천연 소스(예를 들면, 지놈 DNA)로부터 얻어지거나, 또는 유전공학 기술이나 합성 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 상기 구조물의 조절 영역, CAP 사이트, 스플라이스-공여체 사이트, 인트론 및 스플라이스-수용체 사이트는 예를 들면, 인간 신장인자-1α 유전자(Genbank 서열 HUMEF1A) 또는 사이토메갈로바이러스(Genbank 서열 HEHCMVP1)의 즉시 초기(immediately early) 유전자로부터 완전한 단위(unit)로 분리될 수 있다. 이러한 구성요소들은 별개의 유전자로부터 분리될 수도 있다.

형질전이 또는 감염 및 상동 재조합

본 발명의 DNA 구조물은 단일 DNA 구조물로서, 또는 형질전이 또는 감염된 세포의 염색체 또는 핵 DNA내로 도입되는 별개의 DNA 서열로서, 일차, 이차, 또는 영생화된(immotalized) 세포와 같은 세포내로 도입될 수 있다. 상기 DNA는 선형, 이중가닥(한쪽 또는 양쪽 말단에 한 가닥 영역이 있거나 또는 없는), 한가닥, 또는 환형 분자로서 도입될 수 있다. 상기 DNA 구조물 또는 그의 RNA 등가물은 또한 바이러스 핵산으로서 도입될 수도 있다.

상기 구조물이 두 개의 별개의 DNA 단편으로 숙주 세포내로 도입될 때, 하나는 제 1 타겟팅 서열을 지니고 있고, 다른 하나는 제 2 타겟팅 서열을 지니고 있으며, 그 두 단편은 한 단편의 3' 말단과 다른 한 단편의 5' 말단에 서열 상동성(오버랩)을 공유한다. 세포내로 도입되면, 그 두개의 단편은 상동 재조합을 거쳐 제 1 및 제 2 타겟팅 서열들이 상기 두 개의 단편 간에 오버랩되는 영역에 측접해 있는 단일 분자를 형성한다. 그러면, 그 생성물 분자는 세포의 타겟 사이트와 상동 재조합을 하기에 적절한 형태로 있게 된다. 두 개 이상의 단편이 사용될 수 있는데, 이때 그들 각각은 상술한 바와 같이 서로 상동 재조합을 거쳐 결국 세포의 타겟 사이트와 상동 재조합을 하기에 적절한 생성물을 형성하도록 고안된다.

본 발명의 DNA 구조물은, 만약 선별 유전자 자체를 포함하고 있지 않다면, 그러한 마커를 포함하는 다른 구조물과 함께 동시에 형질전이 또는 감염될 수 있다. 형질전이 또는 감염 전에 타겟팅 플라스미드를 하나 또는 그 이상의 사이트에서 제한효소로 절단하여, 선형 또는 단절된 분자를 생성할 수 있다. 그로부터 얻어진 자유로운 DNA 말단은 원하는 상동 재조합이 일어날 확률을 증가시킨다. 게다가, 원하는 상동 재조합이 일어날 확률을 증가시키고자 상기 자유로운 DNA 말단을 엑소뉴클레아제로 처리하여, 돌출된(overhanging) 5' 또는 3' 한가닥 DNA 말단(예를 들면, 적어도 길이가 30 뉴클레오티드, 바람직하게는 100-1000뉴클레오티드인)을 생성할 수 있다. 이러한 구현에 있어서, 타겟팅 서열과 지놈 타겟 간의 상동 재조합은 상기 도입된 플라스미드 내에 포함된 요소들에 측접하는 두 카피의 타겟팅 서열을 초래할 것이다.

상기 DNA 구조물은 일렉트로포레이숀, 마이크로인젝숀, 마이크로프로젝타일충격(microprojectile bombardment), 인산 칼슘 침전법, 리포좀 전달, 또는 폴리브렌- 또는 DEAE 덱스트란-매개 형질전이를 포함하는 다양한 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 세포내로(바람직하게는 시험관내에서) 형질전이 될 수 있다.

형질전이 또는 감염된 세포는 당업계에서 개시된 바와 같이 상동 재조합을 허용하는 조건하에서 유지된다(참조: 예를 들면, Capecchi, Science 24:1288-1292, 1989). "형질전이된 세포(transfected cell)"란 바이러스 벡터 이외의 다른 수단에 의하여 DNA 분자가 도입된(또는 그의 조상에 도입된) 세포를 의미한다. "감염된 세포(infected cell)"란 바이러스 벡터를 사용하여 DNA 또는 RNA 분자가 도입된(또는 그의 조상에 도입된) 세포를 의미한다. 벡터로서 유용하다고 알려진 바이러스에는 아데노 바이러스(adenovirus), 아데노-결합 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 멈프스 바이러스(mumps virus), 폴리오 바이러스(poliovirus), 렌티 바이러스(lentivirus), 레트로 바이러스(retrovirus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 및 카나리 폭스 바이러스(canary pox virus)와 같은 종두 바이러스(vaccinia virus)가 포함된다. 상기 상동 재조합 세포가 DNA 전사를 허용하기에 충분한 조건하에서 유지될 때, DNA 구조물에 의하여 도입된 조절 영역이 G-CSF 유전자의 전사를 변화시킬 것이다.

상동 재조합 세포(즉, 원하는 상동 재조합을 겪은 세포)는 형태학적 스크리닝을 행함으로써 또는 G-CSF에 대한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 세포 상등액을 분석함으로써 확인될 수 있다. G-CSF 검출을 위한 상업적인 ELISA 킷트는 알앤디 시스템즈(R&D Systems, Minneapolis, MN)에서 구입 가능하다. 상동재조합된 세포는 또한 서던 및 노던 분석, 또는 PCR(polymerase chain reaction) 스크리닝에 의하여 구별될 수 있다.

여기에서 사용된 "일차 세포(primary cell)"는 (i)척추동물 조직 소스로부터 분리된 세포의 현탁액에 있는 세포(플레이팅 되기 전의 즉, 디쉬 또는 플라스크와 같은 티슈 배양 물체에 부착되기 전의), (ii)조직으로부터 유래된 체외이식조직(explant)에 있는 세포, (iii)처음으로 플레이팅된 세포, 및 (iv)이러한 플레이팅된 세포로부터 유래된 세포 현탁액을 포함한다. 일차 세포는 또한 인간 또는 동물에서 자연적으로 발생한 세포일 수 있다.

이차 세포는 배양에 있어서 뒤이은 모든 단계에 있는 세포이다. 즉, 플레이팅된 일차 세포를 처음으로 배양 물체로부터 제거하여 재플레이팅(계대, passage)하였을 때, 다음 계대의 모든 세포들과 마찬가지로 그 세포들을 2차 세포라고 한다. 2차 세포주(cell strain)는 일회 또는 그 이상 계대된 2차 세포들로 구성된다. 2차 세포는 전형적으로 배양시 제한된 수의 평균 집단배가(population doubling)를 시현하고, 접촉에 의해 저해받으며 고정-의존적인 성장 특성을 보인다(고정-의존성은 현탁 배양으로 증식되는 세포들에는 적용되지 않는다). 일차 및 이차 세포들은 영생화되지 않는다.

영생화된 세포는 배양시 분명하게 무제한의 수명을 보이는 세포계(cell line: "cell strain"에 반대되는 개념임, "strain"은 일차 및 이차 세포에만 사용됨)이다.

형질전이 또는 감염을 위하여 선별되는 세포는 4가지 형태 또는 카테고리로구분될 수 있다: (i)수득된 그대로는 단지 극소량의 G-CSF 단백질을 만들거나 가지고 있는 세포, (ii)원하는 양 이외의 다른 양만큼(예를 들면, 수득된 세포 형태에 있어 생리적으로 정상적인 수준 이하의 양으로) G-CSF 단백질을 만들거나 가지고 있는 세포, (iii)수득된 세포 형태에 있어 생리적으로 정상적인 수준으로 G-CSF 단백질을 만들지만, 상기 단백질의 함량 또는 생산을 증강시키고자 하는 세포, 및 (iv)G-CSF 단백질을 코딩하는 유전자의 조절 또는 유도 패턴을 변화시키고자 하는 세포.

본 발명의 방법에 의하여 형질전이 또는 감염될 일차, 이차 및 영생화된 세포는 다양한 조직으로부터 얻을 수 있으며, 배양으로 유지 가능한 모든 적절한 세포 형태를 포함한다. 예를 들면, 적절한 일차 및 이차 세포는 섬유아세포, 케라틴세포, 상피세포(예를 들면, 유방 상피세포, 장 상피세포), 내피세포, 신경교세포, 신경세포, 혈액의 유형요소(예를 들면, 림프구, 골수 세포), 근육세포, 및 이러한 체세포 형의 전구세포들을 포함한다. 유전자 치료에 상동 재조합된 세포가 사용되는 경우, 일차 세포는 바람직하게는 형질전이 또는 감염된 일차 또는 이차 세포가 투여될 개체로부터 얻어진다. 그러나, 일차 세포는 동일 종의 공여자(즉, 수혜자 이외의 다른 개체)로부터 얻어질 수 있다.

단백질 생산 및 유전자 치료에 유용한 영생화된 인간 세포계의 예에는 2780AD 난소 종양 세포(참조: Van der Blick et al., Cancer Res., 48:5927-5932, 1988), A549(American Type Culture Collection ("ATCC") CCL 185), BeWo(ATCC CCL 98), 바우즈(Bowes) 흑색종 세포(ATCC CRL 9607), CCRF-CEM(ATCC CCL 119), CCRF-HSB-2(ATCC CCL 120.1), COLO201(ATCC CCL 224), COLO205(ATCC CCL 222), COLO320DM(ATCC CCL 220), COLO320HSR(ATCC CCL 220.1), 다우디(Daudi) 세포(ATCC CCL 213), 디트로이트(Detroit) 562(ATCC CCL 138), 헬라 세포 및 헬라 세포의 유도체(ATCC CCL 2, 2.1 및 2.2), HCT116(ATCC CCL 247), HL-60 세포(ATCC CCL 240), HT1080 세포(ATCC CCL 121), IMR-32(ATCC CCL 127), 져캣 세포(ATCC TIB 152), K-562 백혈병 세포(ATCC CCL 243), KB 종양세포(ATCC CCL 17), KG-1(ATCC CCL 246), KG-1a(ATCC CCL 246.1), LS123(ATCC CCL 255), LS174T(ATCC CCL CL-188), LS180(ATCC CCL CL-187), MCF-7 유방암 세포(ATCC BTH 22), MOLT-4 세포(ATCC CRL 1582), 나말와(Namalwa) 세포(ATCC CRL 1432), NCI-H498(ATCC CCL 254), NCI-H508(ATCC CCL 253), NCI-H548(ATCC CCL 249), NCI-H716(ATCC CCL 251), NCI-H747(ATCC CCL 252), NCI-H1688(ATCC CCL 257), NCI-H2126(ATCC CCL 256), 라지(Raji) 세포(ATCC CCL 86), RD(ATCC CCL 136), RPMI 2650(ATCC CCL 30), RPMI 8226 세포(ATCC CCL 155), SNU-C2A(ATCC CCL 250.1), SNU-C2B(ATCC CCL 250), SW-13(ATCC CCL 105), SW48(ATCC CCL 231), SW403(ATCC CCL 230), SW480(ATCC CCL 227), SW620(ATCC CCL 227), SW837(ATCC CCL 235), SW948(ATCC CCL 237), SW1116(ATCC CCL 233), SW1417(ATCC CCL 238), SW1463(ATCC CCL 234), T84(ATCC CCL 248), U-937 세포(ATCC CRL 1593), WiDr(ATCC CCL 218), 및 WI-38VA13 서브라인 2R4 세포(ATCC CLL 75.1)와 인간세포와 다른 종의 세포를 융합하여 생성된 이종하이브리도마(heterohybridoma) 세포가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. WI-38(ATCC CCL 75) 및 MRC-5(ATCC CCL 171)과 같은 이차 인간 섬유아 세포주를 사용할 수도 있다. 또한, 일차, 이차 또는 영생화된 인간 세포 뿐만 아니라, 다른 종으로부터 얻어진 일차, 이차 또는 영생화된 세포를 시험관내 단백질 생산 또는 유전자 치료에 사용할 수 있다.

G-CSF-발현 세포

본 발명의 상동 재조합 세포는 원하는 수준으로 G-CSF를 발현하며, 시험관내 단백질 생산 및 유전자 치료 모두에 유용하다.

단백질 생산

본 발명에 따른 상동 재조합 세포는 시험관내 G-CSF 생산에 사용될 수 있다. 상기 세포들은 당업계에서 개시된 바와 같이, 단백질 발현을 초래하는 조건하에서 유지된다. G-CSF 단백질은 세포 용해질(lysate) 또는 세포 상등액으로부터 정제될 수 있다. 상기 G-CSF 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 당업계에서 알려진 통상의 약제학적 루트(예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 비내, 폐, 점막을 통해서, 피내, 피부를 통해서, 직장, 포막내, 피하, 복강내 또는 병소내)에 의해 인간 또는 동물에 전달될 수 있다. 구강 투여는 위장관 내에서 단백질이 분해되는 것을 방지하기 위한 방법의 사용(예를 들면, 중합체로 된 마이크로 캡슐 내에 캡슐화함으로써)을 요할 수 있다.

유전자 치료

본 발명의 상동 재조합 세포는 상동 재조합 세포계의 집단으로서, 상동 재조합된 일차 또는 이차 세포의 집단으로서, 상동 재조합된 영양계(clonal) 세포주 또는 세포계로서, 상동 재조합된 이종(heterogenous) 세포주 또는 세포계로서, 그리고 상술한 상동 재조합 세포의 4가지 카테고리 중 하나에 속하는 적어도 하나의 대표적인 세포가 포함된 세포 혼합물로서 유용하다. 그러한 세포는 조혈 선조 세포의 증식 및 분화를 자극하기 위한 전달 시스템, 또는 G-CSF로 처치 가능한 다른 상태들을 위한 전달 시스템에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 화학치료에 의하여 유발된 호중구 감소증의 예방; 골수이식을 받는 중이거나 또는 예전에 받은 적이 있는 환자의 처치; 또는 만성, 특발성 및 선천성 호중구성 질병의 처치에 사용될 수 있다.

상동 재조합된 일차 세포, 영양계 세포주 또는 이종 세포주는 비정상적이거나 바람직하지 않은 상황이 처치 또는 예방되어야 하는 개체내로 충분한 양으로 적절한 루트에 의해 투여되어, 생리적으로 적절한 수준(physiologically relevant level)으로 상기 단백질 또는 외인성 DNA를 발현하거나 사용한다. 생리적으로 적절한 수준이란 산물이 체내에서 정상적으로 생산되는 수준에 근접하거나 또는 비정상적이거나 바람직하지 않은 상황의 개선을 초래하는 수준이다. 상기 세포가 면역적합성(immunocompetent) 수혜자에 대하여 공통 유전형(syngenic)이라면, 상기 세포는 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 복강내로, 망내로(intraomentally), 신섬유막하로(subrenal capsularly), 포막내로, 두개내로, 또는 근육내로 투여 또는 이식될 수 있다.

만약, 상기 세포가 공통 유전형이 아니고 수혜자가 면역적합성이라면, 상기 투여될 상동 재조합 세포는 하나 또는 그 이상의 반투과성 장벽 장치(semipermeable barrier device)에 싸일 수 있다. 상기 장벽의 투과 특성은 상기 세포가 대상에 이식되었을 때 그 장치를 떠나는 것은 방지하지만, 치료용 단백질은 자유로이 투과 가능하여 그 장벽 장치를 떠나 이식부 주변의 국지적인 공간으로 들어가거나 전신 순환으로 들어가도록 한다. 미국특허 제 5,641,670호, 제 5,470,731호, 제 5,620,883호, 제 5,487,737호, 및 공동소유의 "Delivery of Therapeutic Proteins"라는 제목으로 1999년 4월 16일자에 출원된 미국특허출원(발명자: Justin C. Lamsa 및 Douglas A. Treco)이 여기에 참조문헌으로 포함된다. 상기 장벽 장치는 적절한 모든 사이트, 예를 들면, 복강내에, 포막내에, 피하에, 근육내에, 신낭(kidney capsule)내에, 또는 대망내에 이식될 수 있다.

장벽 장치는 상동 재조합된 영생화된 세포, 다른 종으로부터의 상동 재조합된 세포(상동 재조합된 외인성 세포), 또는 조직적합성이 일치하지 않는 공여자로부터의 세포(상동 재조합된 면역반응유발성(allogenic) 세포)가 대상의 처치를 위하여 이식되는 데 특히 유용하며 이를 가능케 한다. 상기 장치는 상기 세포를 숙주의 면역계로부터 보호하는 동시에, 생체내에서 고정된 위치에 유지시킨다. 장벽 장치는 또한 처치법이 어떠한 이유에 의하여 중단되어야 할때 상기 세포를 즉각적으로 제거하는 것을 가능케 함으로써, 간편한 단기(즉, 일시적인) 치료를 허용한다. 형질전이 또는 감염된 외인성 및 면역반응유발성 세포는 또한 장벽 장치 없이 단기 유전자 치료에 사용될 수 있다. 그러한 경우에, 상기 세포에 의해 생산되는G-CSF는 그 세포가 숙주의 면역계에 의하여 거부될 때까지 생체내에서 전달될 것이다.

다수의 합성, 반합성, 또는 천연 여과막이 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 여기에는 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리비닐 클로라이드 중합체, 및 폴리비닐 클로라이드 유도체의 중합체가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 장벽 장치는 다른 종으로부터의 일차, 이차 또는 영생화된 세포가 인간에서 유전자 치료를 목적으로 사용되는 것을 허용하기 위하여 이용될 수 있다.

본 발명의 유전자 치료에 유용한 또 다른 형태의 장치는 그 안에 상기 세포가 함입된 이식가능한 콜라겐 기질이다. 세포가 부착되는 비드를 함유할 수 있는 그러한 장치는 여기에 참조문헌으로 포함된 국제공개 제 97/15195호에 개시되어 있다.

주어진 투여량 또는 이식에 필요한 세포의 수는 그 단백질의 발현 수준, 숙주 동물의 크기와 상태, 및 이식 과정과 연관된 제한요인을 포함하는 몇몇 인자에 의존한다. 일반적으로, 성인 또는 유사한 크기의 다른 동물에 이식되는 세포의 수는 1X10⁴내지 5X10¹⁰, 바람직하게는 1X10⁸내지 1X10⁹의 범위내에 있다. 원한다면, 그것들은 일회, 또는 수 개월 또는 수 해의 기간에 걸쳐, 환자의 다수의 부위에 이식될 수 있다. 투약은 필요로 하는 한 반복될 수 있다.

다른 구현

본 발명이 그의 상세한 설명과 연관하여 기술되어 오는 동안, 상술한 바는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 첨부된 청구항의 범위에 의하여 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

다른 측면, 장점 및 변형은 하기의 청구항의 범위 내에 있다.

Claims

(i)서열 5의 적어도 20개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 타겟팅 서열 및 (ii)전사 조절 서열을 포함하는 상동 재조합에 의해 세포의 지놈내로 통합될 때 포유동물 세포내의 내인성 G-CSF 유전자의 발현을 변화시키는 DNA 구조물.
제 1항에 있어서,

상기 구조물은 엑손 및 스플라이스-공여체 사이트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
제 2항에 있어서,

상기 구조물은 상기 스플라이스-공여체 사이트로부터 하류에 인트론 및 스플라이스-수용체 사이트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
제 1항에 있어서,

상기 구조물은 선별 가능한 마커 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
제 1항에 있어서,

상기 타겟팅 서열은 서열 5의 적어도 50개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물.
전체 길이의 G-CSF를 코딩하지 않는, 서열 5 또는 그의 상대물(complement)의 적어도 20개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산.
제 6항에 있어서,

상기 분리된 핵산은 서열 5 또는 그의 상대물의 적어도 50개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 6항에 있어서,

상기 분리된 핵산은 서열 5 또는 그의 상대물의 적어도 100개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 6항에 있어서,

상기 분리된 핵산은 서열 5 또는 그의 상대물의 적어도 200개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 6항에 있어서,

상기 분리된 핵산은 서열 5 또는 그의 상대물의 적어도 500개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 6항에 있어서,

상기 분리된 핵산은 서열 5 또는 그의 상대물의 뉴클레오티드 1470부터 4723까지를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 6항에 있어서,

상기 분리된 핵산은 서열 5 또는 그의 상대물을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
(i)길이가 적어도 100 뉴클레오티드이고 (ii)매우 엄격한 조건하에서 서열 5 또는 그의 상대물과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가닥을 포함하는 분리된 핵산.
제 13항에 있어서,

상기 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 200 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 13항에 있어서,

상기 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 400 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 13항에 있어서,

상기 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 1,000 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
(i)길이가 적어도 100 뉴클레오티드이고 (ii)동일한 길이를 가지는 서열 5의 단편과 적어도 80%의 서열 상동성을 공유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 가닥을 포함하는 분리된 핵산.
제 17항에 있어서,

상기 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 200 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 18항에 있어서,

상기 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 400 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 18항에 있어서,

상기 뉴클레오티드 서열은 길이가 적어도 1,000 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
DNA 구조물이 내인성 G-CSF 코딩 서열의 ATG 개시 코돈 상류의 지놈 DNA와 상동 재조합된, 제 1항의 DNA 구조물로 안정하게 형질전이된 상동 재조합 세포.
DNA 구조물이 내인성 G-CSF 코딩 서열의 ATG 개시 코돈 상류의 지놈 DNA와 상동 재조합된, 제 2항의 DNA 구조물로 안정하게 형질전이된 상동 재조합 세포.
DNA 구조물이 내인성 G-CSF 코딩 서열의 ATG 개시 코돈 상류의 지놈 DNA와 상동 재조합된, 제 3항의 DNA 구조물로 안정하게 형질전이된 상동 재조합 세포.
DNA 구조물이 내인성 G-CSF 코딩 서열의 ATG 개시 코돈 상류의 지놈 DNA와 상동 재조합된, 제 4항의 DNA 구조물로 안정하게 형질전이된 상동 재조합 세포.
세포내로 제 1항의 DNA 구조물을 도입하는 단계;

상기 구조물과 타겟팅 서열과 상동적인 지놈 타겟 사이트 간에 상동 재조합이 일어나도록 허용하는 조건하에서 상기 세포를 유지하여 상동 재조합 세포를 생산하는 단계; 및

상기 상동 재조합 세포를 전사 조절 서열의 조절 하에 G-CSF 코딩 서열의 발현을 허용하는 조건하에서 유지하는 단계를 포함하는 포유동물 세포에서 내인성 G-CSF 유전자의 발현을 변화시키는 방법.
세포내로 제 4항의 DNA 구조물을 도입하는 단계;

상기 구조물과 타겟팅 서열과 상동적인 지놈 타겟 사이트 간에 상동 재조합이 일어나도록 허용하는 조건하에서 상기 세포를 유지하여 상동 재조합 세포를 생산하는 단계; 및

상기 상동 재조합 세포를 전사 조절 서열의 조절 하에 G-CSF 코딩 서열의 발현을 허용하는 조건하에서 유지하는 단계를 포함하는 포유동물 세포에서 내인성 G-CSF 유전자의 발현을 변화시키는 방법.
제 21항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 동물에 이식하여 상기 세포가 상기 동물 내에서 G-CSF를 분비하도록 하는 단계를 포함하는 G-CSF를 동물에 전달하는 방법.
제 22항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 동물에 이식하여 상기 세포가 상기 동물 내에서 G-CSF를 분비하도록 하는 단계를 포함하는 G-CSF를 동물에 전달하는 방법.
제 23항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 동물에 이식하여 상기 세포가 상기 동물 내에서 G-CSF를 분비하도록 하는 단계를 포함하는 G-CSF를 동물에 전달하는 방법.
제 24항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 동물에 이식하여 상기 세포가 상기 동물 내에서 G-CSF를 분비하도록 하는 단계를 포함하는 G-CSF를 동물에 전달하는 방법.
제 21항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 G-CSF의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 시험관내(in vitro) 배양하는 단계를 포함하는 G-CSF 생산방법.
제 22항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 G-CSF의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 시험관내 배양하는 단계를 포함하는 G-CSF 생산방법.
제 23항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 G-CSF의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 시험관내 배양하는 단계를 포함하는 G-CSF 생산방법.
제 24항의 세포를 제공하고, 상기 세포를 G-CSF의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 시험관내 배양하는 단계를 포함하는 G-CSF 생산방법.