CN112301056B - 一种针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人源化NPLG IL3 GM‑CSF Kitlg小鼠的制备方法，所述方法包括对重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠IL3，GM‑CSF（CSF2）和Kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换。并在此方法获得的小鼠基础上，进一步制备人源化免疫系统小鼠，该人源化免疫系统小鼠拥有更高的人源细胞重建比例及成功率，更长的寿命，可以更好的发挥其应用价值。

Description

一种针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途
技术领域
本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰技术领域，具体为针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途。
背景技术
在生物医药实验中，为了更好地研究和治疗人类疾病，往往需要利用多种不同种属的动物，如大小鼠等等，来模拟人类疾病，在其中进行相关研究。但是啮齿类动物和人往往有较大的种属差异，基于大小鼠的动物模型所取得的实验结果往往和人群中的结果有较大的差距，并不能如实反映人体中药物的作用情况。而灵长类动物的应用则受到成本，动物福利和伦理学等的诸多限制。在此情况下，为了更好的研究人类血和免疫系统的功能，人源化免疫系统小鼠应运而生。申请人此前研发了用于制作人源化免疫系统小鼠所用的重度免疫缺陷的转基因NPLG小鼠(CN2020103733565)，及具有髓系细胞的人源化免疫系统小鼠(CN2020102909601)，较好的满足了新药评价需求。
此前的免疫系统人源化小鼠，包括第一代人源化免疫系统小鼠，及具有髓系免疫细胞的人源化小鼠，均有各自的缺点。其中第一代人源化免疫系统小鼠，由于其体内的鼠源髓系免疫细胞功能基本完整，且促进髓系免疫细胞发育的细胞因子在人和小鼠之间基本没有同源性，故其体内移植的人源干细胞只能发育成为T，B淋巴细胞，而基本不能发育成髓系免疫细胞。故第一代人源化免疫系统小鼠体内的人源髓系免疫系统是基本缺失的，无法用于针对髓系免疫细胞相关靶点的药物筛选。而目前的具有髓系免疫细胞的人源化免疫系统小鼠，基本均是基于在极重度免疫缺陷小鼠体内，通过转基因技术，过表达促进人髓系免疫细胞发育的细胞因子，包括GM-CSF (CSF2), IL3, G-CSF或M-CSF等。通过表达这些细胞因子，可以促进小鼠体内移植的人源造血干细胞发育为髓系免疫细胞。但是，普通的转基因手段转入的人源细胞因子表达的相关基因，均使用功能较强的启动子和增强子，且不可再次调控。故相关细胞因子在小鼠体内的表达量远高于正常的生理水平，可达正常人体水平的1000倍以上。在高剂量的GM-CSF和IL3等细胞因子的作用下，人源髓系免疫细胞会过度发育，得到高于正常水平的髓系免疫细胞，包括巨噬细胞，粒细胞和DC细胞等等。而髓系细胞的发育过程和淋巴细胞不同，不会因其在小鼠体内发育就与小鼠的组织相兼容。过高的髓系免疫细胞会造成小鼠贫血，并产生针对小鼠的移植物抗宿主反应，即髓系GVHD。导致其寿命相比第一代人源化免疫系统小鼠缩短，从超过一年缩减到半年左右，可能影响药物的给药周期，从而限制了该动物的使用。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明设计并制作了新一代具有髓系免疫细胞的人源化小鼠。这种小鼠将此前常见的人源细胞因子转基因过表达技术，改为直接对小鼠的髓系免疫细胞发育的细胞因子基因进行人源基因的原位替换。该技术可以解决此前的人源免疫细胞小鼠中常见的具有过高水平的人源细胞因子及髓系免疫细胞的问题，可以在保证拥有人源髓系免疫功能的同时，有效延长小鼠的寿命。同时，由于小鼠的相关细胞因子基因被替换，使小鼠的髓系免疫系统发育受到了进一步抑制。这在一定程度上解除了小鼠髓系免疫细胞，对移植的人源造血干细胞及其发育得来的人源免疫细胞的攻击和抑制。从而使其可以更好的定植在小鼠体内，并提高人源细胞移植的成功率和重建比例。总之，在此技术上发展得来的人源化免疫系统小鼠，拥有更高的人源细胞重建比例及成功率，更长的寿命，可以更好的发挥其应用价值。
为解决上述技术问题，本发明提供一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，所述方法包括对重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠的IL3，GM-CSF（CSF2）和Kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换。
进一步的，具体包括如下步骤：
1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠；
2）制备人源化Kitlg小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化Kitlg 纯合小鼠；
3）将步骤1）获得的人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠与步骤2）获得的人源化Kitlg纯合小鼠杂交，得到人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠。
进一步的，所述步骤3），还包括将人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行PCR鉴定，获得IL3 GM-CSF Kitlg纯合小鼠。
进一步的，所述人源化IL3 GM-CSF小鼠是将NPLG小鼠IL3基因的p.A27信号肽至GM-CSF基因的TGA终止密码子区段整体替换为如下区段： 人类IL3基因的p.A20信号肽至TGA终止密码子序列 + 小鼠IL3基因的UTR非翻译区序列 + 小鼠IL3基因5号外显子下游500bp的序列 + 小鼠CSF2基因ATG起始密码子上游5kbp的序列 + 小鼠CSF2基因的p.M1到p.S17信号肽序列 + 人类CSF2基因的p.A18信号肽到TGA终止密码子序列。小鼠IL3的信号肽p.M1-p.Q26及小鼠CSF2的信号肽p.M1-p.S17将保留在该敲入策略中。
进一步的，所述人源化Kitlg小鼠是将NPLG小鼠Kitlg基因2号外显子的部分蛋白编码区(CDS区)替换为人Kitlg基因的CDS区(p.E26-p.V273 + 3×SV40 polyA)。小鼠的信号肽(p.M1-p.T25)将保留在该敲入策略中。
优选的，所述步骤1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ ID NO 1；将Cas9，gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；进一步优选的，所述gRNA选自：
gRNA-A1 (与正向序列互补): GGACTCCAAGCTTCAATCAG-TGG（SEQ ID NO 3）；
gRNA-A2 (与反向序列互补): GGCCTGGGCTTCCTCATTTT-TGG（SEQ ID NO 4）；
和
gRNA-B1 (与正向序列互补): CCCGGCCACTGATTGAAGCT-TGG（SEQ ID NO 5）；
gRNA-B2 (与反向序列互补): GGGCTTCCTCATTTTTGGAC-TGG（SEQ ID NO 6）。
优选的，所述步骤2）制备人源化Kitlg小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ ID NO 2；将Cas9, gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；进一步优选的，所述gRNA选自：
gRNA-C1 (与正向序列互补): ATCTCCTTGGTTTTGACGAG-AGG（SEQ ID NO 10）；
gRNA-C2 (与反向序列互补): TCAAAACCAAGGAGATCTGC-GGG（SEQ ID NO 11）。
进一步的，所述步骤1）PCR扩增鉴定筛选采用如下引物：
同源臂引物Primer F: GCTCCTGATGCTCTTCCA（SEQ ID NO 7）
插入片段引物Primer R1: TGATTGTCATAACAATCC （SEQ ID NO 8）
小鼠基因组引物Primer R2: TGAAGACCCCTGGCAGCG（SEQ ID NO 9）。
进一步的，所述步骤2）PCR扩增鉴定筛选采用如下引物：
human KITLG Prime 1F: TCTGCAGGAATCGTGTGA（SEQ ID NO 12）；
human KITLG Prime 1R: GTAGGCTGGAGTCTCCAG（SEQ ID NO 13）；
同源臂引物Prime 2F: AAAGATGGACACCAAGAA（SEQ ID NO 14）
同源臂引物Prime 2R: GGTCAGCAAGCACAGGGA（SEQ ID NO 15）。
所述小鼠IL3基因的p.A27信号肽至GM-CSF基因的TGA终止密码子区段的核苷酸序列为（19578bp）：SEQ ID NO 16。
所述人类IL3基因的p.A20信号肽至TGA终止密码子序列为（2028bp）：SEQ ID NO17。
所述小鼠IL3基因的UTR非翻译区序列（101bp）为：SEQ ID NO 18。
所述小鼠IL3基因5号外显子下游500bp的序列为：SEQ ID NO 19。
所述小鼠IL3的信号肽p.M1-p.Q26核苷酸序列（78bp）为：SEQ ID NO 20。
所述小鼠CSF2基因ATG起始密码子上游5kbp的序列为：SEQ ID NO 21。
所述小鼠CSF2基因的p.M1到p.S17信号肽序列（51bp）为：SEQ ID NO 22。
所述人类CSF2基因的p.A18信号肽到TGA终止密码子序列（1978bp）为：SEQ ID NO23。
所述人Kitlg基因的CDS区中p.E26-p.V273核苷酸序列（747bp）为：SEQ ID NO 24。
所述人Kitlg基因的CDS区中3×SV40 polyA的核苷酸序列（843bp）为：SEQ ID NO25。
所述小鼠Kitlg基因p.M1-p.T25信号肽（75bp）序列为：SEQ ID NO 26。
本发明还提供一种人源化免疫系统小鼠的制备方法，使用本发明方法制备的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠制备人源化免疫系统小鼠，包括如下步骤：
选用新生或1至5周龄的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠，全身辐照或给予化疗药物清髓；清髓后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞；干细胞接种12周后，对小鼠外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25%的小鼠即为人源化免疫系统小鼠。
优选的，所述辐照的放射源是X射线、或者Co60/Cs137来源的Gamma射线，射线的剂量为0.5-2Gy每只小鼠。
进一步优选的，所述的CD34阳性的人源造血干细胞注射剂量为1×104~1×106每只小鼠，并根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整。
本发明还提供一种上述方法制备的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠或人源化免疫系统小鼠在肿瘤免疫治疗单抗的药效评价中的应用。
本发明所述的NPLG小鼠是指重度免疫缺陷小鼠；优选按照专利CN202010373356.5公开的方法获得的重度免疫缺陷小鼠。其是通过CRISPR/Cas9技术敲除小鼠染色体中编码白介素-2受体的gamma链的基因，选择白介素-2受体的gamma链的基因的外显子1和2作为敲除位点，然后Cas9信使RNA和引导RNA被共同通过显微注射进小鼠的受精卵内，从而获得重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠。因此，CN202010373356.5公开的内容全文引入本申请。
本发明的有益效果：
1）将此前的人源细胞因子过表达技术，改为使用小鼠的天然的相应细胞因子表达调控原件来进行表达量控制。使得小鼠体内的人源细胞因子恢复到了正常的生理水平，解决了此前同类小鼠中常见的具有过高水平的人源细胞因子，及人髓系免疫细胞带来的GVHD和贫血等问题。可以在保证人源髓系免疫系统得以发育的同时，有效延长小鼠的寿命。且相关细胞因子的表达更为稳定，动物的个体差异得到有效控制。
2）由于小鼠的髓系免疫系统发育相关的细胞因子基因被人源基因替换，使小鼠的髓系免疫系统发育受到了进一步抑制。在一定程度上减轻了小鼠髓系免疫细胞，对移植的人源造血干细胞及其发育得来的人源免疫细胞的攻击和抑制。从而使其可以更好的定植在小鼠体内，并提高人源细胞移植的成功率和重建比例。
3）在具体的人源化小鼠制备过程中，设计筛选了合适的gRNA，确保本申请制备方法能够高效的获得阳性克隆，获得较好的阳性率。特别针对IL3和GM-CSF (CSF2)的基因敲入，设计筛选到合适的gRNA，一次性同时替换2个基因，省去一次小鼠的杂交过程。此外，也设计筛选到合适的PCR扩增引物，使制备过程中，能够顺利筛选出目标小鼠。
附图说明
图1 IL3 GM-CSF (CSF2)基因敲入策略图；
图2 IL3 GM-CSF (CSF2)基因线性化的载体设计图；
图3 IL3 GM-CSF (CSF2)基因重组载体限制性内切酶消化产物电泳图；
图4 Kitlg基因敲入策略图；
图5 Kitlg基因线性化的载体设计图；
图6 Kitlg基因重组载体限制性内切酶消化产物电泳图；
图7 IL3 和CSF2人源化小鼠的鉴定；
图8 Kitlg人源化小鼠的鉴定；
图9 Kitlg人源化纯合小鼠的鉴定和筛选；
图10A至图10C F1子代小鼠IL3 CSF2 Kitlg人源化纯合小鼠鉴定，其中：
图10A为使用引物Primer F，Primer R1以及Primer R2进行F1代小鼠的基因组PCR扩增鉴定；
图10B为使用引物Prime 1F 以及Prime 1R对F1代小鼠基因组进行PCR扩增鉴定；
图10C为使用引物Prime 2F 以及Prime 2R进行PCR扩增鉴定；
图11人源化免疫系统小鼠外周血人源免疫细胞占比；
图12人源化免疫系统小鼠外周血人源髓系免疫细胞占比；
图13不同品系的小鼠经人源化重建后的红细胞含量；
图14不同品系的小鼠经人源化重建后血红蛋白含量；
图15 不同品系的小鼠经人源化重建后的生存状况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述和说明。
基于发明人此前研发制作的重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠(CN202010373356.5)，在该小鼠的基础上进一步使用基于CRISPR Cas9技术，对NPLG小鼠的IL3，GM-CSF(CSF2)和Kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换。
一、基因敲入位点确定和供体载体构建
1、各基因分布情况
小鼠IL3基因（Ensembl数据库转录本：MGP_NODShiLtJ_T0028883.1）位于小鼠染色体11上。已鉴定出5个外显子，其中第1外显子为ATG起始密码子，第5外显子为TAA终止密码子。
人类IL3基因（NCBI数据库参考序列：NM_000588.4）位于人类5号染色体上。已鉴定出5个外显子，其中外显子1为ATG起始密码子，外显子5为TGA终止密码子。
小鼠GM-CSF(CSF2)基因（Ensembl数据库转录本：MGP_NODShiLtJ_T0028882.1）位于小鼠11号染色体上。已鉴定出4个外显子，其中外显子1为ATG起始密码子，外显子4为TGA终止密码子。
人类GM-CSF(CSF2)基因（NCBI数据库参考序列：NM_000588.4）位于人类5号染色体上。已鉴定出4个外显子，其中外显子1为ATG起始密码子，外显子4为TGA终止密码子。
小鼠Kitlg基因（Ensembl转录本：MGP_NODShiLtJ_T0026766.1）位于小鼠10号染色体上。已鉴定出10个外显子，第1外显子的ATG起始密码子，第9外显子的TAA终止密码子。
人类Kitlg基因(NCBI数据库参考序列：NM_000899.5)位于人类12号染色体上。已鉴定出10个外显子，第1外显子的ATG起始密码子，第9外显子的TAA终止密码子。
、IL3和GM-CSF (CSF2)的基因敲入策略及供体载体的构建
2.1 IL3和GM-CSF (CSF2)的基因敲入策略
因IL3和GM-CSF (CSF2)的基因均位于11号染色体的同一条同源臂上，且相隔距离不远，故本方法通过设计合适的gRNA (guideRNA, 引导RNA)， 一次性同时替换2个基因，即可省去一次小鼠的杂交过程。对IL3和CSF2基因的敲入策略如图1所示，将小鼠IL3基因的p.A27信号肽到小鼠CSF2基因的TGA终止密码子区段整体替换为如下区段：
“人类IL3基因的p.A20信号肽至TGA终止密码子序列 + 小鼠IL3基因的UTR非翻译区序列 + 小鼠IL3基因5号外显子下游500bp的序列 + 小鼠CSF2基因ATG起始密码子上游5kb的序列 + 小鼠CSF2基因的p.M1到p.S17信号肽序列 + 人类CSF2基因的p.A18信号肽到TGA终止密码子序列。”
小鼠IL3的信号肽（p.M1-p.Q26）及CSF2的信号肽（p.M1-p.S17）将保留在该敲入策略中。
和GM-CSF (CSF2)基因线性化的载体构建
为了构建敲除用载体，使用NPLG小鼠的基因组作为模板，通过高保真Taq酶，使用PCR反应生成目标区段的同源臂。随后，将其和重组位点及选择标记一同组装进载体中。线性化的载体设计如图2所示。
将重组完成的载体，通过限制性内切酶消化。对消化产物片段的尺寸进行电泳，验证结果如图3所示。其理论酶切产物为：
1. XmnI: 8.7/4.8/3.6/0.9
2. AflII+EcoRV: 7.1/4.2/3.6/1.9/1.0/0.1
3. ApaLI+NheI: 9.4/4.6/2.0/1.2/0.7
4. AscI: 18.0
从电泳条带显示，酶切结果符合理论预期。
最终的供体载体经测序验证含有如下核苷酸序列：SEQ ID NO 1，符合预期。
、Kitlg基因敲入策略和供体载体的构建
3.1 Kitlg基因敲入策略
Kitlg基因单独存在于小鼠第10号染色体，故对其单独进行基因打靶敲入。其敲入策略如图4所示，将小鼠2号外显子的部分蛋白编码区(CDS区)替换为人Kitlg基因的CDS区(p.E26-p.V273 + 3×SV40 polyA), 小鼠的信号肽(p.M1-p.T25)将保留在该敲入策略中。
基因线性化的载体构建
为了构建敲除用载体，使用NPLG小鼠的基因组作为模板，通过高保真Taq酶，使用PCR反应生成目标区段的同源臂。随后，将其和重组位点及选择标记一同组装进载体中。线性化的载体设计如图5所示。将重组完成的载体，通过限制性内切酶消化。对消化产物片段的尺寸进行电泳，结果如图6所示。其理论酶切产物为：
1. NcoI: 4.4/1.8/1.5/0.6
2. ApaLI+BamHI: 2.7/2.3/1.2/1.0/0.7/0.2
3. AvaI+SspI: 3.4/2.1/1.5/1.0/0.1/0.1/0.1
4. PvuI+NotI: 3.6/2.8/1.0/0.9
可见电泳条带显示，酶切结果符合理论预期。
最终的供体载体经测序验证含有如下核苷酸序列：SEQ ID NO 2，符合预期。
二、显微注射流程
第一天，选取3-4周龄的NPLG雌性小鼠，作为供体，每只小鼠腹腔注射5IU PMSG；47~48小时后，每只小鼠腹腔注射5IU HCG，并与性成熟的正常公鼠合笼交配；交配后的次日，即第四天进行阴道栓检查，并将供体雌鼠拿出用于受精卵采集，同天准备好适龄的代孕母鼠。
采集受精卵时，安乐死供体雌鼠，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3 mg/M2液中，显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，洗涤和采集受精卵，最终将受精卵放在5%CO2，37℃培养箱培养待用。在显微镜下观察，挑选形态正常，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵用于显微注射。通过加样器，将混合的供体载体、Cas9和引导RNA加入到注射针内；安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。200-400倍镜下进行显微注射，将混合的供体载体、Cas9和引导RNA注射到受精卵细胞质中；注射400枚左右受精卵，注射完毕后，放入5% CO2，37℃培养箱培/0.5-1h，筛选掉即时死亡的受精卵；
将受体代孕鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口，将注射后的受精卵移植到代孕鼠输卵管内，每只母鼠移植20-30枚注射后受精卵；移植完毕后，将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤，将小鼠放到干净的笼盒内，待苏醒后，转移到动物饲养间饲养；定期观察手术后代孕鼠的健康和怀孕情况；手术后19~21天母鼠分娩，待幼崽出生2-3周后，剪耳、编号，剪尾，进行PCR和测序鉴定，确认基因是否敲入成功。
三、人源化基因小鼠的制备及鉴定筛选
1、制备人源化IL3 GM-CSF小鼠及其鉴定筛选
将Cas9, gRNA和IL3 GM-CSF (CSF2)基因供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠。
其中打靶用的gRNA序列如下：
gRNA-A1 (与正向序列互补): GGACTCCAAGCTTCAATCAG-TGG（SEQ ID NO 3）
gRNA-A2 (与反向序列互补): GGCCTGGGCTTCCTCATTTT-TGG（SEQ ID NO 4）
gRNA-B1 (与正向序列互补): CCCGGCCACTGATTGAAGCT-TGG（SEQ ID NO 5）
gRNA-B2 (与反向序列互补): GGGCTTCCTCATTTTTGGAC-TGG
（SEQ ID NO 6）
敲入成功的IL3 CSF2 F1子代小鼠均为杂合小鼠，将其进行同胞交配，并进行PCR鉴定，直到最终获得IL3 CSF2纯合小鼠；为了鉴定纯合、杂合和野生型小鼠，共设计了3条PCR引物：
同源臂引物Primer F: GCTCCTGATGCTCTTCCA（SEQ ID NO 7）
插入片段引物Primer R1: TGATTGTCATAACAATCC （SEQ ID NO 8）
小鼠基因组引物Primer R2: TGAAGACCCCTGGCAGCG（SEQ ID NO 9）
用上述三条引物同时对小鼠基因组进行PCR扩增，仅出现418bp大小条带的，为纯合IL3 CSF2人源化小鼠；仅出现314bp大小条带的，为野生型小鼠，出现两条带的则为杂合小鼠。鉴定结果如图7所示，可见，其中1，4，8号为野生型小鼠，3,5,6,7号为杂合小鼠，2号为敲入人源IL3 CSF2的纯合小鼠。
2、制备人源化Kitlg小鼠及其鉴定筛选
将Cas9, gRNA和Kitlg基因供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠。
其中打靶用的gRNA序列如下：
gRNA-C1 (与正向序列互补): ATCTCCTTGGTTTTGACGAG-AGG（SEQ ID NO 10）
gRNA-C2 (与反向序列互补): TCAAAACCAAGGAGATCTGC-GGG（SEQ ID NO 11）
敲入成功的Kitlg小鼠亦均为杂合小鼠，将其进行同胞交配，并进行PCR鉴定，直到最终取得Kitlg纯合小鼠；为了鉴定敲入是否成功，使用如下引物对小鼠基因组进行PCR扩增：
human KITLG Prime 1F: TCTGCAGGAATCGTGTGA（SEQ ID NO 12）
human KITLG Prime 1R: GTAGGCTGGAGTCTCCAG（SEQ ID NO 13）
如果人源Kitlg基因敲入成功，则会出现578bp条带，否则为野生型小鼠。结果如图8所示，除6及12号小鼠为野生型外，其余均为敲入人源Kitlg基因的纯合或杂合小鼠。进一步对非野生型小鼠，用如下引物再次对基因组进行PCR扩增：
同源臂引物Prime 2F: AAAGATGGACACCAAGAA（SEQ ID NO 14）
同源臂引物Prime 2R: GGTCAGCAAGCACAGGGA（SEQ ID NO 15）
如为杂合小鼠，则会出现200bp大小的条带，如为人源化Kitlg纯合小鼠，则因为引物间序列长度过长无法扩增。结果如图9所示，1号，2号，4号，7号，8号，11号为人源化Kitlg纯合小鼠。
3、制备人源化IL3 GM-CSF Kitlg小鼠及其鉴定筛选
将上述步骤获得的IL3 CSF2纯合小鼠和Kitlg纯合小鼠进行杂交，得到IL3 CSF2Kitlg杂合小鼠，再次将此杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行PCR鉴定，直到最终获得人源化IL3 CSF2 Kitlg纯合小鼠。具体如下：
将杂交后的F1子代小鼠用上述引物进行PCR扩增：
用Primer F，Primer R1以及Primer R2对F1代小鼠的基因组进行PCR扩增；结果如图10A所示，其中3号为敲入人源IL3 CSF2基因的纯合小鼠。
使用Prime 1F 以及Prime 1R对F1小鼠基因组进行PCR扩增；结果如图10B所示，其中1号，6号，12号为野生型小鼠，其余为敲入Kitlg的纯合或杂合小鼠。
将剩余非野生型小鼠再次使用Prime 2F 以及Prime 2R进行PCR扩增；结果如图10C所示，除14号和17号外，其他均为人源化Kitlg纯合小鼠。
综上所述，根据本次鉴定结果，3号小鼠为敲入人源IL3 CSF2 Kitlg基因的纯合小鼠。
鉴定出更多敲入人源IL3 CSF2 Kitlg基因的纯合小鼠后，使用该小鼠制作CD34造血干细胞移植的人源化免疫系统小鼠，进行功能验证。
四、人源化免疫系统小鼠的制备及功能验证
1、人源化免疫系统小鼠的制备
使用上述方法制备的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠进行制备：选用新生，或年龄为1至5周龄的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitl小鼠。小鼠进行全身辐照清髓，放射源是X射线、或者Co60/Cs137来源的Gamma射线，射线的剂量为0.5-2Gy每只小鼠，或者通过给予化疗药物来代替辐照。
经辐照或化疗药物处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1×104~1×106每只小鼠，根据前处理情况，包括辐照剂量及周龄进行调整；干细胞接种12周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25%，则说明造模成功。
2、人源化免疫系统小鼠功能验证
本发明方法获得的人源化免疫系统小鼠的人源免疫细胞及其中的髓系免疫细胞重建情况如图11和图12所示。经过人源CD34造血干细胞移植后，GM-CSF和IL3过表达小鼠中，髓系免疫细胞所占百分比显著高于普通NPLG小鼠中的重建情况，接近外周血免疫细胞的30%。该比例的人源髓系免疫细胞，包括巨噬细胞等，会对宿主小鼠产生较强的排斥作用，且会吞噬小鼠的红细胞，造成贫血并影响小鼠寿命。而NPLG IL3 GM-CSF和Kitlg原位敲入小鼠，因可以表达生理水平的相应细胞因子，故其体内的人源髓系免疫细胞更加接近真实情况，介于普通NPLG和GM-CSF IL3过表达小鼠两者之间。
不同品系的小鼠经人源化重建后的红细胞及血红蛋白含量如图13和图14所示，可见该原位替换人源细胞因子的NPLG IL3 GM-CSF Kitlg基因敲入小鼠，其经重建后，小鼠红细胞和血红蛋白含量相比普通的人源化NPLG小鼠略有下降，但相比GM-CSF IL3过表达小鼠更高。证明该小鼠可在保证基础的免疫细胞功能和数量的基础上，改善小鼠的贫血情况，延长其寿命。
从图15不同品系的小鼠经人源化重建后的生存状况来看，证明了采用本发明方法获得的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠可以在保证拥有人源髓系免疫功能的同时，有效延长小鼠的寿命，从而使其在药物筛选中具有更大的应用价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
序列表
<110> 澎立生物医药技术（上海）有限公司
<120> 一种针对人源化免疫系统小鼠的基因编辑方法及其用途
<141> 2020-10-15
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagcaaca atggagaggt caagaaacaa accctggtct ctagggtcca ggggcctctt 60
ctgagtccca gtcactggta gatttaaatc agagcttctt gtgtgctata gagggtcttg 120
tcaaaatgaa agtctgaaag ccaagagtgt ggtgctgacc ctgcaggccc gaggaccact 180
agaaaaggaa cagagcatta gtctgccttt ccctcgaggc tgaggtctgt cctatctatg 240
gttcctgcac acagcaatta cttaacataa gttatttgat gagtaatgcc tcctgggcac 300
ccaaactggt tcccaaaccc ccaaatgctc cctagtgaga ttccccttaa gtgtagagta 360
tgctctgagc tggatccagg agtccagtct cctagtacaa ggtctgcttg gctggacctg 420
gagtatacag gccatagaca gcatctcttc aatcagtctt tgtccccctt gatgtctcac 480
ccttatcttt caccatattt gcttctgctt tgaagacaga agcacccagt ttcccctgcc 540
tcagcataac gtgctaacct tcatcgtctt acgctgatta catcacacca caacccgacc 600
caaaccctgg tttctctacc atgctctgct tccctgcacc ccagcccagt catcttaaag 660
aaatatttag ccagcctcat cacacccatc ttttaccaaa acttcatctg gctccctatt 720
gtgtgctgtg gcctgccaac ctgtcccatg gagaaggggg ctagtgtccc ctggctctcc 780
tccctcctgg cctccctact ttctccctag ctgtggtttc tcaggtcctt tgagaacttc 840
ccctaactgt ccctgttttc ttcccacctc tgcaggcctg atctgcaggc aggctcccat 900
cacattcatg ctccagggcc aactgggata taaatccctc aatatggctt tccttcaggg 960
caatgctctc ctctcttcac ttgcactccc tgtttagact tggctatacc acctgctaaa 1020
ccatcccaca gcttccagga atactattct cgaggcccac ctttgtcctt aggtccccag 1080
tcctaattgc ctgggttatc agaaggatac cctagtgttt gcagccatat ctccatcgag 1140
ggttttgtcc tctggatgtg ggccttcatg cattgcctta ctgcactcag actaggccaa 1200
tgaaagggtg agctgaactc catatccacc tgcaaagaat aagagtcaac gggaaagctg 1260
cctagagata cacttagctc tggctaccac cagccagacg actagcccac acatggaagt 1320
ttaaccatgt gccagaatgc ctaccaagtt caagtctgct ccagtgactc tggtgactac 1380
ctctatcagg tagggtgtac agtcaccaca taggctgtac agtcagggtc aagtttgtgc 1440
aagggatggt aggatgagat tccactgcat agaaagccca agctggctca gagccaggct 1500
acttcctccc acaacctgtt tccactccgt ccatctctat gacaaaggaa gaagatggcc 1560
tttgaataag cagtctttct tcccatgtcg ataatcttga gtactagaaa gtgatgaata 1620
agtttgtggt ttgctatgga ggttccatgt cagataaagc tgcttctgat gcctgccctc 1680
ccccctgccc cgccgggccc cgccccaccc ctctctgaat acatataagg tgaaggctcc 1740
tgtggcttct tcagaacccc ttggaggacc agaacgagac aatggttctt gccagctcta 1800
ccaccagcat ccacaccatg ctgctcctgc tcctgatgct cttccacctg ggactccaag 1860
ctcccatgac ccagacaacg cccttgaaga caagctgggt taactgctct aacatgatcg 1920
atgaaattat aacacactta aagcagccac ctttgccttt gctggtgagt agcttggata 1980
agactggcct gcagcagtga ggggtggtgg ctgcctaagg ccaaaaggcc tcatgggcct 2040
ttctctccct tcacccccac aggacttcaa caacctcaat ggggaagacc aagacattct 2100
gatggtaaga gctcagcccg tggatcccga tccacttcct gcctgggtga cttcagccat 2160
gtcattccat cttacctagc cttgctttct tcatctgtaa aatagggtta atagcaccta 2220
tctcagtggg attgttatga caatcaaatg gcacaatgtg catgttctgg cccagcatct 2280
ggcacttaag agttcaatac atggccacag ccatggctat aataatgaaa atgactttta 2340
aattagaaaa tgaaaaggca gttctaggtg aggaatacca agggccttaa ggtcagtgtt 2400
tggtagggca gactctggac tgacagacag aaatttcccc ctcagatgtg ccagcttctt 2460
tttcccttaa aaaattgagt ttgtgttttc caccctcatt ggctgtggca ttatcattta 2520
cagttatttt tcatggttcc agttggttgc agttgttctg tctcaccttt gcatgacatt 2580
tcttgggtca aacaagaagt ggaagccttt gctgagttcc tgggccatct gtgtttgggg 2640
cactcacagc tcacatgctg cacccatttc catgctgggg tctctgtgat tttcttcttg 2700
atttctagga gactttaatt cagtcagggc atgaacactg ttatcagcct ctgagctaca 2760
aatacttccc ttggaaaacc ccctgtcttt tgtagagctt ctttttggag atattttttc 2820
ccccaagtgc agaaagatcc acctaggtac cccctcccca cccatttttt tttttttttt 2880
tgagacaaga gtctcactct gttgcccagg ctggagtgca gtggcacgat ctcagctcac 2940
tgctacctct gcctcctgag ttcaagcaat tctcctgtct cagcctccca agtagctagg 3000
attacaggca tgcaccacca ctcccatttt tgtattttta gtagagacgg ggtttcacca 3060
tattggtcag gctggtcttg aactcgacct caggttatct gcctgcctcg gcctcccaaa 3120
gtgctgggat tacaggcttg agccactgcg cccagcccac ctaggccctt tatgtagctc 3180
aaatggagcc agagactggg ggcttgagga aaccaggtcc tgcctgccac tcacttctag 3240
gcctgtgccc ttgggcaggg acccacctga ggcaagaacg ggactaggag ggaacccgag 3300
gatgtcccca acagtgggct tgggaaactg tgggggtgac ttccacctgc ttgtgggagg 3360
gatactctgt aacctttccc ccttaagtgt attctctgcc ccgttaggaa aataaccttc 3420
gaaggccaaa cctggaggca ttcaacaggg ctgtcaagag tttacagaac gcatcagcaa 3480
ttgagagcat tcttaaagta tgtgaagctg ttgagggttt gggatccctg tgttggccct 3540
gccctgcctc tggggaggag agcagggccc actccctttc caagggaatc tctgaccatc 3600
tgctttggtc tctttccaca gaatctcctg ccatgtctgc ccctggccac ggccgcaccc 3660
acggtaagct gtcccccaag atgcccgtca tggcttgctc ctcagctggt catcaccatt 3720
acagcctgga ctcacctaat gccaccttct tggtttcttt atagcgacat ccaatccata 3780
tcaaggacgg tgactggaat gaattccgga ggaaactgac gttctatctg aaaacccttg 3840
agaatgcgca ggctcaacag acgactttga gcctcgcgat cttttgaaac agcaggcaga 3900
gcacctaaag tctgaatgtt cctcatggcc catggtcaaa aggattttac attcctttat 3960
gccatcaaat gtcttatcaa tttatctact ttctgaaatt tgcaactctc ctttggcttt 4020
acctaattat gttcctattt tattccatta aggctattta tttatgtatt tatgtattta 4080
tttatttatt gccttctgtg atgtgagtat atctgtttta gctgaggagg agtttctcca 4140
aagaaaattc caaggaagac tggggccatg ttcatttgtc cctttgtttt aaacaggctt 4200
ttaaaccctt gtggaaataa ataactttga acaaatgggt ttggtttcgt ccagtttctt 4260
gaggagtttg gattgatctc tgtaacagtc ctagaggata cttgtccgga catcacatgc 4320
ggctacacag catgcaacat gtatcagatc ttggtctgga catttaacct ttactattta 4380
atctactctt cactccaaac cagaatgtgt gatctctgtt ttatgggact acagaagtcc 4440
agtttggcaa agttagacca agtaaatgca gcttctaact agtgccccca tgggaacatc 4500
atgaggcact ccgcatggcg atgaaatctc tccatcaaag acaacttaat ctacttcact 4560
gacctgcaca gaccccggtg aagattctct ttctttgacc attggggaaa ctgagactgg 4620
aatggaggcc tcccaactag tctaaactga aaacccaagc agaaaatctt catacactta 4680
gctcttggtt gatatttaag aagctcctct aggtgtctcc aggcatctct gcagtgacct 4740
gcagaggtct ccatcccctc atgaagatga aggtcgggca cagagaagga aagtagtttt 4800
aagcacagtg gccaggtctg aagactgatc tgagtctgca gctctgcatc caggacaatg 4860
gaggctgatg cttcctgggg ggactatgag ggacttggca gcactcttgc cgggatgtag 4920
cagtctaggg tgtggaaatg ggtgtgtgtt tgggaggaag tagtgaggag ctggtggccc 4980
taggggtggg atgtccccaa ggacttcttc ctgccacctg cagacaggca ctctgaggac 5040
cctctcagtt tatgatcacc ttttatgact tctttttgca cttcagctgg agtggtacag 5100
gtgggcctta ctcatatgag ggatcatagg gactctagga ggtgttgaaa ggacattgac 5160
agctgctctg tgtgtgtgtg ggggggggca gcattgccca gagacaaaga tcctgtgaac 5220
attatttaag gccagagcct tctgggatct gaaatccaga gagacaatca acatacccga 5280
cagacagggg ctccaggaaa gagtgaagga gcctggaaga cccaaacagc tctgtgaatg 5340
gctccttcta ggaccctgtc ctgatgaaaa tataaagcag caaccaccgc tttgattatg 5400
gcccctcagc tcctgaagct ggcaggtgtc agagccaacc aagggtctgc aactcccact 5460
acacctaggg ttggaagaag ggcccttagc acttcaggag gttaggatgg cttctcccct 5520
catttctcct ttggtctttt ccccatgcac tcccagagat tctttcaagg ggcacagata 5580
aagacagtgt cccctctggg tgcctgctga cctctcagtt ggagataagg cttggggcag 5640
aattgagggg tgggacacat tcctaaccat ggagggagaa ttctgggtag agaatcccag 5700
gcagtggagg gcattgtgag aggcaggccc agtgctgctt tcatgggtcc tgtgcccata 5760
gcacttaact gactatatgg gcttggcatg gtttctaggt tctggggaga cagcaaagaa 5820
gccctaagaa caagaaataa agccaaagag gaggtcttac tatacttgat ctattctcaa 5880
aagctggcat tccagcataa tccagttcac gcagcttgta cggtactgga acaccccagt 5940
gacctctcag ggtctcaagt gctggatcca tattgcagta attagccaag cattctcaga 6000
caatactggc tttttctttc ccttatccag tctagtctgg ctgacacccc aaaccttact 6060
gcttgcctat agtttcctca ctgaagcaaa taattactaa cctagctggc ttccctggga 6120
cagagacaga cactgtcatt ctgtctgccc catacccact tcccatggtt gtttgttttt 6180
ttatgcatat cttatttggc cctctcaacc atgtgcctat aaatctaggt ctggttgtcc 6240
ctgtcctcta ctccgtgggg ctacaggcat gaattctctg agagctagga ccatattata 6300
tagcctcctg gaggcttggc tgaatggatg ctaccctcag gtcctccccg attcatcaga 6360
gctcaccagt gccagggacc tgaggatacc caggcagctg agacagaact agaaggaaag 6420
ttggcctttt aaaatagatt ggggtgggtc aaagacagag aatgtggatg gggtcattca 6480
ggagtggaga cagagaaggc tagagctgtg gctctatgtg cctagagtag cagggaggga 6540
gtaggaccac cttctcaagg acatacaagc cacccagggt gttgagctgt actgtggctc 6600
tcaaagtggg acaagactcc acaagctttg tctctgggtg gaaaccatct ctctacttca 6660
ctacgtctgt ccagagagat gctcccagag gctgggacag gacaagggac aacagtcctt 6720
ggacattcca gaaattctgg gtcttctgcc aggttaggac ttccccagga tggggaaggt 6780
atcagaatgc tgcctccctc tgggaaaaat ctttctataa actttccaac aacagataca 6840
gcatccatca agtggatgat gcaatggagc ctttggaggg gtactttcct gggatattcc 6900
agaattcatg gtggctgagt agggagaaaa gagcccaagc ctggggtata gtgatatcta 6960
gatagagggc agaatatgct aggaaaattc tcctacagct ccaagatgtc cttggtacag 7020
tcacaggcca ctcctgcctt cccaccaata gagctgccct gatggacaag tgtgttaggt 7080
ccaccatttt ctggactagg caggtggcca gaatttgctg tgtggcccat tcccctagag 7140
caggagaaag catccatgta tggactgagc tgcaagtggt ctcttagatc tcagactcca 7200
ttaaggacga aggcctccct gaagaatgtt gatcatcagg atgggtcaga ccatcttaaa 7260
tgctcatgtg tctgtcccgt gggatgagag ggactttggg gcccatttcc ttccctcctg 7320
gtgttgactt cctcttgtga taaagatcct ggggcagcca cacgcttctg gttcccccag 7380
ggcccatgtc aagggacact ccccggaaac tccttccaga gggttctctc ctggccttgt 7440
gggctgggag gccaaagagg ggtcactcca cccatctggt ccccacctcc gccctgccac 7500
agccccactg aggcccttga gtcagcaagg ctgtctgatg ctattgccgc ttctttccat 7560
gcgtgcaatc taggaatgcc tgcccgtgtc accgcctcca ccctgatgtc atctttctag 7620
gagaaagata catatctacc cacaaactgc atccccaagc ccttagaatc ctgccccata 7680
agtgacaact ttggcacctg tagaccatat ccttgacgtg agtcttgact ctggggcctc 7740
tgctttcctc ttagccacca ccctgccaca cgcttgggct aagacgaatg cctttagttc 7800
ttcaacatgg ccattctggc cccccagtct ctctttctac atgattcctg tggtcttgtc 7860
ctgagttcca cctgttatct gaccctcgaa agccctcact tctgtctggt ttcatcagtc 7920
cactgaatca gcttcttggg ccctaaagca tgtttcttgg ctaggggccc cctctcatat 7980
caagagggca ccgccagaag cccaagggtt ctcacaaagc aggcaaaaca agtgtggctc 8040
atgttagatg cacccttatg taaaacctcc tccaccttga catgttccta tgagtacata 8100
tatatccaac accaccagca tacacacatg actgaagaga tacacatatg tatccccatg 8160
gtctcaaact tcctgtatag gaaggcttgg gccagatccc ttgggcaaac acaaactcgt 8220
gccgtcttct ccaaaagcca ttgtgaaaat caaacacttg ttagcccctt gagaccatgc 8280
tgcctttcca gaagcagttc ctgattccac agagagcttc tggagaggga ggtgggctgg 8340
agcaaggggc tgtgcaacag actaagcctg ggagaacttg ccagggaagc gggggttggg 8400
gcgcacgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgcgtgc 8460
gcgtgtgcgt gtgtgcgtgc ctggttattg tgttacagct agctactatg ttacagccag 8520
cctcagagac ccaggtatcc cataatggta cagatagcag taatgtgtcc tttttgaatg 8580
gcaggctgct ctgaagaggg taaagaggct cacataactc aaaggaagag tcgcttggca 8640
aagggggagg gcagaatcag cagtcaaacg ggagtagcct tacctgcccc agccagaagc 8700
tctagccatg ctgtgaattt ttaggattga acatgccttt gtaactggga ttgtagcagt 8760
cagttgggat ggtatcataa gagaacatgg tatagtctgc ctggcttcta tacccattgc 8820
tgtcattctc actgctccca aggtggcagg ggtggggctt ggctgggcag agtttgccca 8880
gaatggtctc ctcagtggga gtctgtggag accattatag aattgtgtca ttgggctgga 8940
ccttatttaa ttagataatg aggtggactt gtgagaagtg tatatctcag aaggtggctg 9000
gaaagagaac gggccaggac tggggctgga atgagccacc agagtaggta gagcttgccc 9060
aaaggcctcc aggaacagca ggtgctatgg aagcaagagc cccactcagt atctcccaaa 9120
ccccgcccca gccactccag gccaggaaat ccaaatatgc ctggaggccc ctcaaaaagg 9180
agaggctagc cagaggctgg gtcagactgc ccaggcaggg tgggaaaggc ctttaaagca 9240
gcccgcaggt gggctgccag ttcttggaag ggcttattaa tgaaaacccc ccaagcctga 9300
caacctgggg gaaggctcac tggccccatg tatagctgat aagggccagg agattccaca 9360
actcaggtag ttcccccgcc cccctggagt tctgtggtca ccattaatca tttcctctaa 9420
ctgtgtatat aagagctctt ttgcagtgag cccagtactc agagagaaag gctaaggtcc 9480
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cacccgcccg ctcgcccagc cccagcacgc agccctggga gcatgtgaat gccatccagg 9600
aggcccggcg tctcctgaac ctgagtagag acactgctgc tgagatggta agtgagagaa 9660
tgtgggcctg tgcctaggcc acccagctgg cccctgactg gccacgcctg tcagcttgat 9720
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cctccaggta agatgcttct ctctgacata gctttccaga agcccctgcc ctggggtgga 9840
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ggctgcagga ggagggggta gcaactgggt gctcaagagg ctgctggccg tgcccctatg 9960
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caggagtcac caggggacag gtggtaaagt gggggtcact tcatgagaca ggagctgtgg 10080
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ctccagcagg aatgtcttaa tctagggggt ggggtcgaca tggggagaga tctatggctg 10680
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ctgaaggact ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagga 11520
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tattttctac tgatagggac cattatattt atttatatat ttatattttt taaatattta 11760
tttatttatt tatttaattt tgcaactcta tttattgaga atgtcttacc agaataataa 11820
attattaaaa cttttgtttg tatagttatc tggtttattt tgaaagggga gaaattgggc 11880
ataggtggag tgggggagct attgggatat ggtattgatg agagtcaatg ctgtcatggc 11940
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ccttggtgga acttctgggg tgctcaagag catctgtccc agagaaaggt tcaccaggaa 12060
gttgaagtaa ccggttcaca gacgtggctt agagaagggg tgtcatcctt tctaggaact 12120
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atactgttcc catttgagat cacagaccct gtgtcactat tctgccctca cacttggggc 12240
ctcaacaact cttaaagtaa atcagcaagt agactaactg ttcggagaaa aagaaactaa 12300
accacagggg tcagatctca gcatatttac ccaactttcc ccccagtggg tgatcttaat 12360
ctttatcagt cagaatggca gtatggtgta tgttggggca tagctcaaag gtggcacttt 12420
tcttatattt ttggttgtga gcctaacctt taacggctga gccatctctc cagcccaggt 12480
ggcactttcc ttaactggtt tttatttttc cattaaactt tgactctcat gggtattttc 12540
cactaaaatc catggccttg gggctgagaa atgtagctat cttctgtctt tgtttgacaa 12600
ccaggcttcc cccatttatt actccgagtt cttcctaagg atcatcaggg agggtgagtg 12660
tgttcccaaa tcttgggggt gggcagtgga cccagccttc ttgcaggtag cctggggaag 12720
ctgtctatct gcagtttaag gccctcacag gtgctaggat gcagtgattg ctcactgctc 12780
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aaactctgtc aagcaagcca agctcagact tcctgagtca cctctaagac tatgtttctg 13260
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caagaagaca taccatgtaa gtctgacttt cctttaatgt ccacacacgc ctgtggccct 13440
ttcaagatcg ggtttctctt gtttgcagag gtacttcagt agactccaga acaccagtga 13500
gataagaaga gtttaacttc tgtgaccttt ctggccatag ctgaaagggg agagagggat 13560
tgcctcagtc ggcaaacagt ggagatatga atgagagatg ccaaggattt gagaaccaaa 13620
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gccactgccc caacataacc cccagatgca agaggagatg aaagcatcta ttgcattcac 13740
tgcatagcct gcagggtcca aaagcctccc ataggagaat cagaattagg gcctttggtc 13800
cagggctcca tcagaccagg gt 13822
<210> 2
<211> 4137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaagggaga tcgagtaatg aagtgttatg tccccatagt gctcaaagta actctaaata 60
aacttaggta ctattactgc tgaaggggat cctgagcagt gaaagaataa ggggttttaa 120
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gttcctttta gctaacgtgt agctagccac ataagtagaa aaaattctag ccatgtgcac 300
gtgtgcttct gtgtaatttt tagatgccat agatgaatgt cagttcccaa aagatctaac 360
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ttctttacca gtgtttacaa agtcctcatg tttttagttc taacccgaga gacagatgtc 480
acattttcac tctgggtttc cctggcgatg ctttcttacc ctttgtctcc tcttgagatt 540
aattgattaa ttgctttctt ctctgtgttc ccaaaaacat ttatcatggg ctgaggtatt 600
atttatttac ctgcctctga gtttcgagga catcttcatc atcttccttt ccctggtgac 660
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aaatcagatg ctcaagtttg gaaaagtcta taatatactg tgagaaagaa aaacaaatca 900
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gacacaccct tctgccagac cgtggagcag tgtgctggta tagaggtcta agtgaaagtt 1320
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agaacgctta caacagaagt taacagtaaa gccattgaaa gagtaattca aacaggactg 1560
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attatgatcc tctagagtcg cagatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 3180
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tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 3300
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atgtggtatg gctgattatg atcctctaga gtcgcagatc ctctagagtc gcagatctgc 3420
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atgtaaaaga cattacaaaa ctggtaagta aggaatgatt tttggcatct atgactcttc 3540
cctgtgcttg ctgaccacat aggtttaggg cactccctac acaagtccct agaatctgaa 3600
gtgctttttc tgggccaatg ggagatgcgt acaccttgga ggatttgtcc atgtaactgg 3660
ccctttgaac aacaacagag tgactttggt tcttagctgg tcttgtcttc tcggtcaaag 3720
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gagagcaaag cgcaatggag atgcagtatt tcctactctc ctaacttagg aaagagattt 4020
tgtatttact tggactactg aaaatgattt cggtatcatc ataatttgag ccaggcatga 4080
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcctgggct tcctcatttt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggcttcctc atttttggac 20
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<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctcctgatg ctcttcca 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgattgtcat aacaatcc 18
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<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgaagacccc tggcagcg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atctccttgg ttttgacgag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtaggctgga gtctccag 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaagatggac accaagaa 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtcagcaag cacaggga 18
<210> 16
<211> 19578
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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gtcaaggaga ttatagggaa gctcccagtg agtaactggc tgaggttggc ctggtgcagg 120
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caggaacctg aactcgaaac tgatgatgaa ggaccctctc tgagggtaag agccctgctt 240
tgggatattc ttgggttcca tctatctcct gcctgggtga cttcagccat cactccacga 300
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tctcaagcct cagtatatac ctcagtcagc tgcaataatg aaagttacct tttaggatat 420
acaatgaaga cagctgtggg tgaaccctgc ctgctgcagg cctctggctc cactttcagt 480
ggggatgcca ttgccctctg tgacttttgt gtcttttgct tttcttcctc ctccaaaact 540
gaagtttgtg ttttctactt ccgccagccc cagacattac tatttgtagt tattttccta 600
gtttgataca atagttatgt cttgttttta tttgtttgga cctaacatga agttctttgc 660
aagagtgctg aatgtctata tttcccctcc ctaggaacat gttggagcct ataggatttt 720
cttctaggta tcgagaaatt cttaattaaa ttaaagcatt ggcctgggtt tttggcatct 780
tggtattttc cttggccaac cttctgcctt ttctagagct tttctggagg gatgtgtttt 840
cctcaagtac agacaaatct gcttagatcc ttcacacagc tcacaggctg ccaggagtta 900
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ggataatgaa gggacaggaa taaggctgtt caaagaaatc tcaaatagca ggcacacttc 1020
cctagctctg atctctccag ctctcacttc ccaactctca cctccccagc tctttccttt 1080
ccagttctca cctccctggc tctcacctct ctggatctca tctccctggc tctcaactcc 1140
caagctcttt catttccagt tctcacctcc cagctctcac atccctgggt cttacataaa 1200
gatttcttgc cctcttagaa taagagcttt cggagagtaa acctgtccaa attcgtggaa 1260
agccaaggag aagtggatcc tgaggacaga tacgttatca agtccaatct tcaggtgtgt 1320
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tttggagagg aaagtagggc cttctccact ttaggaggga tctgactatg ccttggtgtc 1440
tctccacaga aacttaactg ttgcctgcct acatctgcga atgactctgc ggtaagctgc 1500
ccttccccca cgtgtttagt aggctgtgcc cttgcccatg accagactta tagtttgctg 1560
tggcccgcag caacatgttc acatctaatg ccttcttttc tggttcctca cagctgccag 1620
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ctcctaaccg tggaaccgtg gaatgttaaa acagcaggca gagcacctaa agtctgaatg 1800
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acgctgtggg agctccagca aacaaaagcg ctgtggcttt ccagaccttc cccctccctt 2880
tctttctacc taaactttca gccaccttca gctcagtccc actgtagggt tcctactgtc 2940
tggttctgga ttgtccaaga tgacccatga cagggctttc ctctaaaagg gaaggatagg 3000
gaggggacca caagaaggac aaccatatgg tgtcttggtt gcagaaaaca gcctgaatgg 3060
tgggatctgg gacaccacca aggtgggatt cagtctacca tctgactctt tggtactgtg 3120
tgcctcccag cccggctccc tgaaccctgc ccggtggtgc ctggtgaatc ctctagcctt 3180
ggagccagct gggacaaggg gccaaatgag ccttcttttt ctgtcaccac actagggaat 3240
agtatcctcc ctgattcctc aagagcccca taaggcagct ttgggtactg acatcagatc 3300
ctggggctca tttcccttta tttttctttt ctatctttat ctctttaggc tcccagtgag 3360
gaacagccca gttgttgaag atgtaggagg aagtgggcag tttatctgcc actagctcag 3420
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tgctcacagg gctgagaagt cagaggtttg tttctgcagt tcgtgaaatg accactagag 3600
gaagaaaatg cccctagtct tagggttcac ttaggtgctg tgggggaaga tgggtctaat 3660
atgttcagtt aacttggatt ctagactaga ttccccaatt ctcctgggta tccacttcac 3720
ccacttgcct tcactcatga acttttgtgc ctggtcctat tccatcctag ctgaaacagc 3780
atctgtgctt tatttcatgc cccatgcaga gtcatagctc atcctcagcc tcgcctccct 3840
ctagggtcct gctacctgct gccccgtcca gccgtgcttc cccagtaacg agtccacata 3900
gtaacaagac ccagtgtcag tggtgagctg agaccaccat actgactcat ggaaccaatt 3960
gttcaatgtt taaaaagaaa ttccagaaca ttctgggcaa ggtggtagat tagaagctga 4020
agttcgtgca tagatgaaaa ctaggttaaa agcacaatag ctctattcat atagaaaagg 4080
aaatatgttt aaagaaaaca gaaataagcc gaggtgggag tttctccaca aaggagccaa 4140
gccactggta tcagccacaa ctctgctcct gctggtcaac tgcaaattaa gtataggtgg 4200
acacctcggg agctggaaag aggggtccag gctctggaaa tgcagccaaa ggctggataa 4260
ggcatgcaca gattttggct ggtgcaaccc agagacccaa ggctgaagac caggagatat 4320
tgccagagaa gacactgcct ggtgagccac cttgaactgt gagagtatgc tgtgggagct 4380
gttacggtgc cctgatggcg cacaaaggta agctcatgtg tgtgggcctc atacacttcc 4440
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tgtggagact gataggccca cagttcttac ttctgcagta gtttcttctt ggacttcaca 4680
cctgtgcctt ttctcttttc atccttaact gttacctcct ccttctccat ttcttccatg 4740
cttctatttc accagttaca tactgatatc cttagctcta acagaaacga taaactacac 4800
tttccccaga cacaaacatg ttgtgtctaa accttatcag agacaacccc aaagtacaca 4860
gatatcttct gcaaagccaa tggcaggaca gctgttaaat ctcatatgtt actgcagttg 4920
ccccccacct tactaacagc aggtgtagac gactcacata aaataaaaca agcaaacgag 4980
gagtagggga aagcagggga ccataaaaag aaaaggacaa atctacctta acagatgcat 5040
aagacataac agaaagatca caaaagctct tacctctctt aagacctctg tttcctctct 5100
catggtcctc cttctacttc cgggacctat gaccacaccc acgtaagaga cacatgcata 5160
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tgggttactt ctgtcttagt tagggtttta ctgctgtgaa cagacaccat gaccaaggca 5280
agtcttataa aaaacaacat ttacttgggg ctggcttaca ggttcagagg ttcagtccat 5340
tatcatcatg gtgggagcat ggcagtatcc aggcaggcat ggtgcaggca gagctgagag 5400
ttctacatct tcatccagtg gctgctgatg ggagactgac ttccaggcaa ctagggtgag 5460
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tactccctgg cccccataga tttgttcaaa cacatgaatc tatggggtgg ggcatactta 5640
aacatagcat aatgcaaaat gcatttagac caactttcaa agtcctcata gtctatagca 5700
ggctcaacaa tgttaaaagt ccaaagttca aggcctcttc tgagattcat ccaatcactt 5760
aattgtaatc cccaaagaaa gacaggaaac caactgggca aacttcaaac tctgcatctc 5820
catggctgat gttaaagcag tcttcagatc tccactcctt tttcatcttt gttgactgca 5880
acaaactgct ttctcctggg ctggttccac tccctgttag cagctttcct cagcatgtat 5940
cccatcagca tgtataccat ctcaataggt acagaaaagg catttggcaa agttttattg 6000
tgccttcacg ataaaggtcc caaagaaatt tagaaggcac ataccacaac ataataaata 6060
ctatatgtgg caaacctgta gtcaacaata tactaaacag gcaaaaactg aaagcatttc 6120
ttcaaaatct agaacagggt aagggtttcc actttctcca cttttattca gtattgggct 6180
tctagtcctt gtccaagcaa tagacaaaga aaagaaacaa aaacagatat aagtagagaa 6240
taaagtcaaa ttacccttaa ctacagatgg catgaatatg cttaaaagac cttagagctc 6300
ccaatagaaa atccttaggt ttgacaaatg ttctcagcaa cgtttcagaa cacaaaatct 6360
tcatataaaa gtttgtagct tttctaaata ctaataacaa cttttatgag aaaggaacca 6420
gaaatacaca ccattcacag tagcttcaaa atttaaaata cccagaaagg atattaattc 6480
taggcagaga gctgatagga ttctacaata aaaactttaa gacattgaaa atagaaatta 6540
ttggcagaaa gaatattgtg aaagtggtta cattgccaaa aaaaaaatag tctacagatt 6600
caaggtaatt ttcatcaaaa ttccagtaac attcttcaca gaaccagaag aaaaaattta 6660
taaagttctt ataccccaaa aagcttagag agtcccagac aaaaagaaca gtactagaag 6720
tattataata tctgacctca aaatatactg caaagccata gtgacaaata cagcactaaa 6780
cagatatgtc tgccaatagg gcccaacaat aaacccacac agttactgcc atctaatttt 6840
tgaaaaaggc attaaaagac acactggggg tggaggggaa actcttcaaa atggtgtttg 6900
gaaaaccggc tatccacata cagaataatg gaagtagacc tttatctccc acgctgtaca 6960
aaaatcgatt aaaaacaaat ctcagacttg actataaagt gctgaaactg atagaaatat 7020
agacatgggc aagaacactt aaagggactc ccgccacaca agagataaga actgacaaac 7080
agcattacca aaatacaagg gttctacaca actaaagaac tctcaacaat gtgaagagac 7140
agactacaga ataatagaaa gctttaacta gctgtctgtc tgacagctag ttaggggttt 7200
aatatctacc atatacaaag aaccgaaaaa aatgtgaaca ccaaacctcc acatcttcca 7260
aacacaaatg gaaggctgag ataaagagac aattctcaga gaagaaacag atggccaata 7320
aatatttgga aaaattatat atattataaa tatataattt tagtcatcag ggcaatctaa 7380
attaagacta ctttgagatt acatctcact cagctagaat acacacacac acacacacac 7440
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ttattgctta cttagttggg ggtattaact ggtacaacca ctatggaaat caatatggga 7560
gcctgtcgcc accaagaagt agaactacca tttgcacact tttgcatcta aaagactcta 7620
attcctatca tagagacact tgagcgttcg tgtttcttgc tgtattcttc gcagtagcca 7680
ggaaatggaa ccagcctaga tgtccatcaa cagatgtcta gataaaggaa atgtcgttta 7740
cagagtggag ttttatacag taacaaagaa aaatgaaatc atgggatttc caggacttgg 7800
ggaagataga aatggaaatg tctatatgta agagaagtaa cccagactta gaaagacaaa 7860
tatcacatac cttttctcta ataaaggccc tatattaaca tttttatgta tgtgtctcta 7920
atgtgggtgt ggtcataggt cccggaagta gaaggaggac catgagagag gaaacagagg 7980
gtcttaagag aggtggatgg gggagtaggt aacagaatac atgtgctatt gaagcagaat 8040
caggggggca ggggaaggaa gaggaatgac aggaggggaa tggggagaat gaagtgggga 8100
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gtggagttta caagcatgca aatcgggaag cattctctgt attagtttgc ttctccgttg 8280
tgctaaagca ctgaccaaaa gcatcttgtg caggaaagga tttcgttcag tttacagacc 8340
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tgtctgggga cagcacagcc ttgcccaaac actgccctag gttagaatcc agaatcaagt 9180
tgtggttggt tcttgatagg atttggagga atatttatgt gccttggact tagactgagt 9240
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aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agacggacgg actccgggct aaagagattg 9420
ctcagtggct aagagcatgg actgctcata tggaaggccc aagttcagtt cttaacacct 9480
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ctgtctgtga actgggcggg gggggggggc taacaagcaa ctgggctgat tggttctttc 9720
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ctgccctttg tactaggtca gtaagtccat ccaaagggca gcagagggca gcaacactcc 9960
atggtagatc tgagaggaca ggctgataag gccaccttct agagagtagg tcacaccagc 10020
cactagcaat ttcacttatc ttttatctta attttacaag tacagctttc caggagggca 10080
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aggagaaatt tccagaaagg caagtattta aggaaaggaa cctggctaaa caatttgaga 10200
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gagtcaggta tccggttctg agtggtaaag acatagatgt ctttagtgta gggtgagtta 10560
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tggaggcagg atcccttctg acctcagctg gccccttcac ctcattctta cttctctatt 10680
cccagaacag cccaaccagc atgacaacca tggagataac aaaactaaat gaccgaggtc 10740
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gagacacaga gaagcccagg ccgtgggact catgagcttc tggagcacta atcctcactg 11160
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cggatcccta ctgatagcct gtgctcccac atgcttcaag ttctagcctg agtatgcacc 11280
tgtcactgcg ctcctttgca ctcccagaag caccccataa tactttcaca tgcttttctg 11340
tccctctttc ctacttccct gcctcccccc tacaccagag cttagatccc tctgtgattt 11400
cctctgtgtc cccaacctcc cccccccatg cctctgagag atagcgttta tgaactcact 11460
gcaatcccta cagtcactgt cactcggggc ttcctctgtt tctcatacag ctgctggaga 11520
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cctagaagta cccagacatg tcctggagac caatccaaat agcacagaca actgatgtgg 11760
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aggcttcaca tctggcacca ggacataagt ctcccttctt ccccccttct ctaagcatat 11880
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acacatccag gccagtaaga aggcttggtg gcacttgtgg ccaaacatga ccaccagagt 12000
ttgatttcta ggacttgcaa cagtgggtta aagcacttgc catcaaagct gatggccgag 12060
gtctgtccta ggttctcaga gtggaacgag agaactgtcc tctgactcct acatgcaagg 12120
catgcgtacc atcacacaaa caactgaata ttaaaacgtc ataataaaaa agacagccac 12180
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attatggccc ctcagctcct gaagctggca ggtgtcagag ccaaccaagg gtctgcaact 13500
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acttcactac gtctgtccag agagatgctc ccagaggctg ggacaggaca agggacaaca 14760
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tatctagata gagggcagaa tatgctagga aaattctcct acagctccaa gatgtccttg 15060
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cttaaatgct catgtgtctg tcccgtggga tgagagggac tttggggccc atttccttcc 15360
ctcctggtgt tgacttcctc ttgtgataaa gatcctgggg cagccacacg cttctggttc 15420
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tgcccagaat ggtctcctca gtgggagtct gtggagacca ttatagaatt gtgtcattgg 16980
gctggacctt atttaattag ataatgaggt ggacttgtga gaagtgtata tctcagaagg 17040
tggctggaaa gagaacgggc caggactggg gctggaatga gccaccagag taggtagagc 17100
ttgcccaaag gcctccagga acagcaggtg ctatggaagc aagagcccca ctcagtatct 17160
cccaaacccc gccccagcca ctccaggcca ggaaatccaa atatgcctgg aggcccctca 17220
aaaaggagag gctagccaga ggctgggtca gactgcccag gcagggtggg aaaggccttt 17280
aaagcagccc gcaggtgggc tgccagttct tggaagggct tattaatgaa aaccccccaa 17340
gcctgacaac ctgggggaag gctcactggc cccatgtata gctgataagg gccaggagat 17400
tccacaactc aggtagttcc cccgcccccc tggagttctg tggtcaccat taatcatttc 17460
ctctaactgt gtatataaga gctcttttgc agtgagccca gtactcagag agaaaggcta 17520
aggtcctgag gaggatgtgg ctgcagaatt tacttttcct gggcattgtg gtctacagcc 17580
tctcagcacc cacccgctca cccatcactg tcacccggcc ttggaagcat gtagaggcca 17640
tcaaagaagc cctgaacctc ctggatgaca tgcctgtcac attggtgagt gagggagaga 17700
gttgggttgt tcccaggcca cccattggcc cttgtcttgc cctgcctttc agcttggtaa 17760
cacggcactt cctttttaca gaatgaagag gtagaagtcg tctctaacga gttctccttc 17820
aaggtaagct gcttctcttt tgctcttctc ttttggtgta gcttcccggg ttgccctgca 17880
gggctgcttt aaatagcctc ttgcaaggct ttctacactc ttccctgcca gtggctgcca 17940
gcgggagggg gcagaatctg ggtagtcaag atctctatat ccattcctct gtagcagtca 18000
cgtgcactct tttatcgtcc agagccatgc ccctgtggca gtcatgtgca ctctttttat 18060
caagtgagca ataagtttgg gcagagctag ctttcaaagg tcagaggtct tcagggattg 18120
atgggagcat gagagtcact ttatgagttg gccttgttgc cttcaagttc tctctgtgcc 18180
ccgtgaccat ggagagaggg tattgattat acaggggcac agagggtatt gattatacag 18240
gggcacagag ggtattgatt atacagggca cagaggggct tttgaaatag tgcttcccca 18300
cacagaagtt tgggctctgg ccatctcctt cttctagaat ggcagcaagt agcctttgct 18360
tacaaatttt tttttttggg ggggggacag cacttggaac tgggaacctc tatggtacca 18420
gactataaac atggctgtgg tagctgaggg tggcctggac caggcaagaa gaagggcagt 18480
gctcaggaca gtgttatgac tagccccaac ctgtaccact tggtgggagc agaagggagt 18540
agggagaagt tagcttgtat tctatggaca cttggctttt gcttatcaac aaatggatgc 18600
ttcccacaga agctaacatg tgtgcagacc cgcctgaaga tattcgagca gggtctacgg 18660
ggcaatttca ccaaactcaa gggcgccttg aacatgacag ccagctacta ccagacatac 18720
tgccccccaa ctccggtgag tacacagcat cagggtctta gtctgggagg gtgcggccag 18780
taaggagaga cttctggctg tagctgttca gggccccagt aagtggtttc tgtatcgtta 18840
gatgtttcct aggagccccc caagaacagg ccatagctcc tattcatccc tagaccctaa 18900
gctgagaaac agcagagagc ccactgctct tcctaggagg aaccatctgc ccatgtcaca 18960
catgccattg tcagtcatga ggtcagaggt gaggcaaacc caaggaagct cagggcctgc 19020
ccaagcccag gagagccaag agccagcacc cagatgccac ttcctggcag gactttcctg 19080
taaggatgcc tgtattccat ggatacaagg aggaggctcc tagaatgggc agacacccca 19140
aacattccta tttcctttcc tcatcaaaga cagtgagcct tgtgtctttt tagaggtgag 19200
gagatgcctc aggctggttg cttgcttctc ggtgggaacc aaagaggcag acctgagaca 19260
gtccttctgt aagggcacag tccctgggtg ccattggcag agctgtgcat gccttaggca 19320
gcacacgggc agctatagtg tcacctgatc cttacaaatg ggcttctggc ctctgagttc 19380
tcagcagcga gagagaaata cacagttctt tccccacgtg gcccacttac ctggactcaa 19440
gtgctgttta tttttttcca ttccctccag gaaacggact gtgaaacaca agttaccacc 19500
tatgcggatt tcatagacag ccttaaaacc tttctgactg atatcccctt tgaatgcaaa 19560
aaaccagtcc aaaaatga 19578
<210> 17
<211> 2028
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctcccatga cccagacaac gcccttgaag acaagctggg ttaactgctc taacatgatc 60
gatgaaatta taacacactt aaagcagcca cctttgcctt tgctggtgag tagcttggat 120
aagactggcc tgcagcagtg aggggtggtg gctgcctaag gccaaaaggc ctcatgggcc 180
tttctctccc ttcaccccca caggacttca acaacctcaa tggggaagac caagacattc 240
tgatggtaag agctcagccc gtggatcccg atccacttcc tgcctgggtg acttcagcca 300
tgtcattcca tcttacctag ccttgctttc ttcatctgta aaatagggtt aatagcacct 360
atctcagtgg gattgttatg acaatcaaat ggcacaatgt gcatgttctg gcccagcatc 420
tggcacttaa gagttcaata catggccaca gccatggcta taataatgaa aatgactttt 480
aaattagaaa atgaaaaggc agttctaggt gaggaatacc aagggcctta aggtcagtgt 540
ttggtagggc agactctgga ctgacagaca gaaatttccc cctcagatgt gccagcttct 600
ttttccctta aaaaattgag tttgtgtttt ccaccctcat tggctgtggc attatcattt 660
acagttattt ttcatggttc cagttggttg cagttgttct gtctcacctt tgcatgacat 720
ttcttgggtc aaacaagaag tggaagcctt tgctgagttc ctgggccatc tgtgtttggg 780
gcactcacag ctcacatgct gcacccattt ccatgctggg gtctctgtga ttttcttctt 840
gatttctagg agactttaat tcagtcaggg catgaacact gttatcagcc tctgagctac 900
aaatacttcc cttggaaaac cccctgtctt ttgtagagct tctttttgga gatatttttt 960
cccccaagtg cagaaagatc cacctaggta ccccctcccc acccattttt tttttttttt 1020
ttgagacaag agtctcactc tgttgcccag gctggagtgc agtggcacga tctcagctca 1080
ctgctacctc tgcctcctga gttcaagcaa ttctcctgtc tcagcctccc aagtagctag 1140
gattacaggc atgcaccacc actcccattt ttgtattttt agtagagacg gggtttcacc 1200
atattggtca ggctggtctt gaactcgacc tcaggttatc tgcctgcctc ggcctcccaa 1260
agtgctggga ttacaggctt gagccactgc gcccagccca cctaggccct ttatgtagct 1320
caaatggagc cagagactgg gggcttgagg aaaccaggtc ctgcctgcca ctcacttcta 1380
ggcctgtgcc cttgggcagg gacccacctg aggcaagaac gggactagga gggaacccga 1440
ggatgtcccc aacagtgggc ttgggaaact gtgggggtga cttccacctg cttgtgggag 1500
ggatactctg taacctttcc cccttaagtg tattctctgc cccgttagga aaataacctt 1560
cgaaggccaa acctggaggc attcaacagg gctgtcaaga gtttacagaa cgcatcagca 1620
attgagagca ttcttaaagt atgtgaagct gttgagggtt tgggatccct gtgttggccc 1680
tgccctgcct ctggggagga gagcagggcc cactcccttt ccaagggaat ctctgaccat 1740
ctgctttggt ctctttccac agaatctcct gccatgtctg cccctggcca cggccgcacc 1800
cacggtaagc tgtcccccaa gatgcccgtc atggcttgct cctcagctgg tcatcaccat 1860
tacagcctgg actcacctaa tgccaccttc ttggtttctt tatagcgaca tccaatccat 1920
atcaaggacg gtgactggaa tgaattccgg aggaaactga cgttctatct gaaaaccctt 1980
gagaatgcgc aggctcaaca gacgactttg agcctcgcga tcttttga 2028
<210> 18
<211> 101
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aacagcaggc agagcaccta aagtctgaat gttcctcatg gcccatggtc aaaaggattt 60
tacattcctt tatgccatca aatgtcttat caatttatct a 101
<210> 19
<211> 500
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctttctgaaa tttgcaactc tcctttggct ttacctaatt atgttcctat tttattccat 60
taaggctatt tatttatgta tttatgtatt tatttattta ttgccttctg tgatgtgagt 120
atatctgttt tagctgagga ggagtttctc caaagaaaat tccaaggaag actggggcca 180
tgttcatttg tccctttgtt ttaaacaggc ttttaaaccc ttgtggaaat aaataacttt 240
gaacaaatgg gtttggtttc gtccagtttc ttgaggagtt tggattgatc tctgtaacag 300
tcctagagga tacttgtccg gacatcacat gcggctacac agcatgcaac atgtatcaga 360
tcttggtctg gacatttaac ctttactatt taatctactc ttcactccaa accagaatgt 420
gtgatctctg ttttatggga ctacagaagt ccagtttggc aaagttagac caagtaaatg 480
cagcttctaa ctagtgcccc 500
<210> 20
<211> 78
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atggttcttg ccagctctac caccagcatc cacaccatgc tgctcctgct cctgatgctc 60
ttccacctgg gactccaa 78
<210> 21
<211> 5000
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
catgggaaca tcatgaggca ctccgcatgg cgatgaaatc tctccatcaa agacaactta 60
atctacttca ctgacctgca cagaccccgg tgaagattct ctttctttga ccattgggga 120
aactgagact ggaatggagg cctcccaact agtctaaact gaaaacccaa gcagaaaatc 180
ttcatacact tagctcttgg ttgatattta agaagctcct ctaggtgtct ccaggcatct 240
ctgcagtgac ctgcagaggt ctccatcccc tcatgaagat gaaggtcggg cacagagaag 300
gaaagtagtt ttaagcacag tggccaggtc tgaagactga tctgagtctg cagctctgca 360
tccaggacaa tggaggctga tgcttcctgg ggggactatg agggacttgg cagcactctt 420
gccgggatgt agcagtctag ggtgtggaaa tgggtgtgtg tttgggagga agtagtgagg 480
agctggtggc cctaggggtg ggatgtcccc aaggacttct tcctgccacc tgcagacagg 540
cactctgagg accctctcag tttatgatca ccttttatga cttctttttg cacttcagct 600
ggagtggtac aggtgggcct tactcatatg agggatcata gggactctag gaggtgttga 660
aaggacattg acagctgctc tgtgtgtgtg tggggggggg cagcattgcc cagagacaaa 720
gatcctgtga acattattta aggccagagc cttctgggat ctgaaatcca gagagacaat 780
caacataccc gacagacagg ggctccagga aagagtgaag gagcctggaa gacccaaaca 840
gctctgtgaa tggctccttc taggaccctg tcctgatgaa aatataaagc agcaaccacc 900
gctttgatta tggcccctca gctcctgaag ctggcaggtg tcagagccaa ccaagggtct 960
gcaactccca ctacacctag ggttggaaga agggccctta gcacttcagg aggttaggat 1020
ggcttctccc ctcatttctc ctttggtctt ttccccatgc actcccagag attctttcaa 1080
ggggcacaga taaagacagt gtcccctctg ggtgcctgct gacctctcag ttggagataa 1140
ggcttggggc agaattgagg ggtgggacac attcctaacc atggagggag aattctgggt 1200
agagaatccc aggcagtgga gggcattgtg agaggcaggc ccagtgctgc tttcatgggt 1260
cctgtgccca tagcacttaa ctgactatat gggcttggca tggtttctag gttctgggga 1320
gacagcaaag aagccctaag aacaagaaat aaagccaaag aggaggtctt actatacttg 1380
atctattctc aaaagctggc attccagcat aatccagttc acgcagcttg tacggtactg 1440
gaacacccca gtgacctctc agggtctcaa gtgctggatc catattgcag taattagcca 1500
agcattctca gacaatactg gctttttctt tcccttatcc agtctagtct ggctgacacc 1560
ccaaacctta ctgcttgcct atagtttcct cactgaagca aataattact aacctagctg 1620
gcttccctgg gacagagaca gacactgtca ttctgtctgc cccataccca cttcccatgg 1680
ttgtttgttt ttttatgcat atcttatttg gccctctcaa ccatgtgcct ataaatctag 1740
gtctggttgt ccctgtcctc tactccgtgg ggctacaggc atgaattctc tgagagctag 1800
gaccatatta tatagcctcc tggaggcttg gctgaatgga tgctaccctc aggtcctccc 1860
cgattcatca gagctcacca gtgccaggga cctgaggata cccaggcagc tgagacagaa 1920
ctagaaggaa agttggcctt ttaaaataga ttggggtggg tcaaagacag agaatgtgga 1980
tggggtcatt caggagtgga gacagagaag gctagagctg tggctctatg tgcctagagt 2040
agcagggagg gagtaggacc accttctcaa ggacatacaa gccacccagg gtgttgagct 2100
gtactgtggc tctcaaagtg ggacaagact ccacaagctt tgtctctggg tggaaaccat 2160
ctctctactt cactacgtct gtccagagag atgctcccag aggctgggac aggacaaggg 2220
acaacagtcc ttggacattc cagaaattct gggtcttctg ccaggttagg acttccccag 2280
gatggggaag gtatcagaat gctgcctccc tctgggaaaa atctttctat aaactttcca 2340
acaacagata cagcatccat caagtggatg atgcaatgga gcctttggag gggtactttc 2400
ctgggatatt ccagaattca tggtggctga gtagggagaa aagagcccaa gcctggggta 2460
tagtgatatc tagatagagg gcagaatatg ctaggaaaat tctcctacag ctccaagatg 2520
tccttggtac agtcacaggc cactcctgcc ttcccaccaa tagagctgcc ctgatggaca 2580
agtgtgttag gtccaccatt ttctggacta ggcaggtggc cagaatttgc tgtgtggccc 2640
attcccctag agcaggagaa agcatccatg tatggactga gctgcaagtg gtctcttaga 2700
tctcagactc cattaaggac gaaggcctcc ctgaagaatg ttgatcatca ggatgggtca 2760
gaccatctta aatgctcatg tgtctgtccc gtgggatgag agggactttg gggcccattt 2820
ccttccctcc tggtgttgac ttcctcttgt gataaagatc ctggggcagc cacacgcttc 2880
tggttccccc agggcccatg tcaagggaca ctccccggaa actccttcca gagggttctc 2940
tcctggcctt gtgggctggg aggccaaaga ggggtcactc cacccatctg gtccccacct 3000
ccgccctgcc acagccccac tgaggccctt gagtcagcaa ggctgtctga tgctattgcc 3060
gcttctttcc atgcgtgcaa tctaggaatg cctgcccgtg tcaccgcctc caccctgatg 3120
tcatctttct aggagaaaga tacatatcta cccacaaact gcatccccaa gcccttagaa 3180
tcctgcccca taagtgacaa ctttggcacc tgtagaccat atccttgacg tgagtcttga 3240
ctctggggcc tctgctttcc tcttagccac caccctgcca cacgcttggg ctaagacgaa 3300
tgcctttagt tcttcaacat ggccattctg gccccccagt ctctctttct acatgattcc 3360
tgtggtcttg tcctgagttc cacctgttat ctgaccctcg aaagccctca cttctgtctg 3420
gtttcatcag tccactgaat cagcttcttg ggccctaaag catgtttctt ggctaggggc 3480
cccctctcat atcaagaggg caccgccaga agcccaaggg ttctcacaaa gcaggcaaaa 3540
caagtgtggc tcatgttaga tgcaccctta tgtaaaacct cctccacctt gacatgttcc 3600
tatgagtaca tatatatcca acaccaccag catacacaca tgactgaaga gatacacata 3660
tgtatcccca tggtctcaaa cttcctgtat aggaaggctt gggccagatc ccttgggcaa 3720
acacaaactc gtgccgtctt ctccaaaagc cattgtgaaa atcaaacact tgttagcccc 3780
ttgagaccat gctgcctttc cagaagcagt tcctgattcc acagagagct tctggagagg 3840
gaggtgggct ggagcaaggg gctgtgcaac agactaagcc tgggagaact tgccagggaa 3900
gcgggggttg gggcgcacgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3960
gtgtgcgcgt gcgcgtgtgc gtgtgtgcgt gcctggttat tgtgttacag ctagctacta4020
tgttacagcc agcctcagag acccaggtat cccataatgg tacagatagc agtaatgtgt 4080
cctttttgaa tggcaggctg ctctgaagag ggtaaagagg ctcacataac tcaaaggaag 4140
agtcgcttgg caaaggggga gggcagaatc agcagtcaaa cgggagtagc cttacctgcc 4200
ccagccagaa gctctagcca tgctgtgaat ttttaggatt gaacatgcct ttgtaactgg 4260
gattgtagca gtcagttggg atggtatcat aagagaacat ggtatagtct gcctggcttc 4320
tatacccatt gctgtcattc tcactgctcc caaggtggca ggggtggggc ttggctgggc 4380
agagtttgcc cagaatggtc tcctcagtgg gagtctgtgg agaccattat agaattgtgt 4440
cattgggctg gaccttattt aattagataa tgaggtggac ttgtgagaag tgtatatctc 4500
agaaggtggc tggaaagaga acgggccagg actggggctg gaatgagcca ccagagtagg 4560
tagagcttgc ccaaaggcct ccaggaacag caggtgctat ggaagcaaga gccccactca 4620
gtatctccca aaccccgccc cagccactcc aggccaggaa atccaaatat gcctggaggc 4680
ccctcaaaaa ggagaggcta gccagaggct gggtcagact gcccaggcag ggtgggaaag 4740
gcctttaaag cagcccgcag gtgggctgcc agttcttgga agggcttatt aatgaaaacc 4800
ccccaagcct gacaacctgg gggaaggctc actggcccca tgtatagctg ataagggcca 4860
ggagattcca caactcaggt agttcccccg cccccctgga gttctgtggt caccattaat 4920
catttcctct aactgtgtat ataagagctc ttttgcagtg agcccagtac tcagagagaa 4980
aggctaaggt cctgaggagg 5000
<210> 22
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgtggctgc agaatttact tttcctgggc attgtggtct acagcctctc a 51
<210> 23
<211> 1978
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcacccgccc gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa tgccatccag 60
gaggcccggc gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatggt aagtgagaga 120
atgtgggcct gtgcctaggc cacccagctg gcccctgact ggccacgcct gtcagcttga 180
taacatgaca ttttcctttt ctacagaatg aaacagtaga agtcatctca gaaatgtttg 240
acctccaggt aagatgcttc tctctgacat agctttccag aagcccctgc cctggggtgg 300
aggtggggac tccattttag atggcaccac acagggttgt ccactttctc tccagtcagc 360
tggctgcagg aggagggggt agcaactggg tgctcaagag gctgctggcc gtgcccctat 420
ggcagtcaca tgagctcctt tatcagctga gcggccatgg gcagacctag cattcaatgg 480
ccaggagtca ccaggggaca ggtggtaaag tgggggtcac ttcatgagac aggagctgtg 540
ggtttggggc gctcactgtg ccccgagacc aagtcctgtt gagacagtgc tgactacaga 600
gaggcacaga ggggtttcag gaacaaccct tgcccaccca gcaggtccag gtgaggcccc 660
acccccctct ccctgaatga tggggtgaga gtcacctcct tccctaaggc tgggctcctc 720
tccaggtgcc gctgagggtg gcctgggcgg ggcagtgaga agggcaggtt cgtgcctgcc 780
atggacaggg cagggtctat gactggaccc agcctgtgcc cctcccaagc cctactcctg 840
ggggctgggg gcagcagcaa aaaggagtgg tggagagttc ttgtaccact gtgggcactt 900
ggccactgct caccgacgaa cgacattttc cacaggagcc gacctgccta cagacccgcc 960
tggagctgta caagcagggc ctgcggggca gcctcaccaa gctcaagggc cccttgacca 1020
tgatggccag ccactacaag cagcactgcc ctccaacccc ggtgagtgcc tacggcaggg 1080
cctccagcag gaatgtctta atctaggggg tggggtcgac atggggagag atctatggct 1140
gtggctgttc aggaccccag ggggtttctg tgccaacagt tatgtaatga ttagccctcc 1200
agagaggagg cagacagccc atttcatccc aaggagtcag agccacagag cgctgaagcc 1260
cacagtgctc cccagcagga gctgctccta tcctggtcat tattgtcatt atggttaatg 1320
aggtcagagg tgagggcaaa cccaaggaaa cttggggcct gcccaaggcc cagaggaagt 1380
gcccaggccc aagtgccacc ttctggcagg actttcctct ggccccacat ggggtgcttg 1440
aattgcagag gatcaaggaa gggaggctac ttggaatgga caaggacctc aggcactcct 1500
tcctgcggga agggagcaaa gtttgtggcc ttgactccac tccttctggg tgcccagaga 1560
cgacctcagc ccagctgccc tgctctgccc tgggaccaaa aaggcaggcg tttgactgcc 1620
cagaaggcca acctcaggct ggcacttaag tcaggccctt gactctggct gccactggca 1680
gagctatgca ctccttgggg aacacgtggg tggcagcagc gtcacctgac ccaggtcagt 1740
gggtgtgtcc tggagtgggc ctcctggcct ctgagttcta agaggcagta gagaaacatg 1800
ctggtgcttc cttcccccac gttacccact tgcctggact caagtgtttt ttatttttct 1860
ttttttaaag gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt tcaaagagaa 1920
cctgaaggac tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc aggagtga 1978
<210> 24
<211> 747
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaagggatct gcaggaatcg tgtgactaat aatgtaaaag acgtcactaa attggtggca 60
aatcttccaa aagactacat gataaccctc aaatatgtcc ccgggatgga tgttttgcca 120
agtcattgtt ggataagcga gatggtagta caattgtcag acagcttgac tgatcttctg 180
gacaagtttt caaatatttc tgaaggcttg agtaattatt ccatcataga caaacttgtg 240
aatatagtgg atgaccttgt ggagtgcgtg aaagaaaact catctaagga tctaaaaaaa 300
tcattcaaga gcccagaacc caggctcttt actcctgaag aattctttag aatttttaat 360
agatccattg atgccttcaa ggactttgta gtggcatctg aaactagtga ttgtgtggtt 420
tcttcaacat taagtcctga gaaagattcc agagtcagtg tcacaaaacc atttatgtta 480
ccccctgttg cagccagctc ccttaggaat gacagcagta gcagtaatag gaaggccaaa 540
aatccccctg gagactccag cctacactgg gcagccatgg cattgccagc attgttttct 600
cttataattg gctttgcttt tggagcctta tactggaaga agagacagcc aagtcttaca 660
agggcagttg aaaatataca aattaatgaa gaggataatg agataagtat gttgcaagag 720
aaagagagag agtttcaaga agtgtaa 747
<210> 25
<211> 843
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
attaagggtt ccggatcagc ttgatgggga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt 60
tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc 120
tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat 180
tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct 240
ctacaaatgt ggtatggctg attatgatcc tctagagtcg cagatccaga catgataaga 300
tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 360
gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 420
aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa 480
agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atcctctaga gtcgcagatc 540
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 600
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 660
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 720
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg tatggctgat tatgatcctc 780
tagagtcgca gatcctctag agtcgcagat ctgcaagcta attcctgcag gtcgagggac 840
cta 843
<210> 26
<211> 75
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgaagaaga cacaaacttg gattatcact tgcatttatc ttcaactgct cctatttaat 60
cctctcgtca aaacc 75

Claims (9)

1.一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，所述方法包括对重度免疫缺陷小鼠NPLG小鼠的IL3，GM-CSF（CSF2）和Kitlg基因进行人源基因的原位敲入替换；其特征在于包括如下步骤：
1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠；
2）制备人源化Kitlg小鼠；并通过PCR扩增鉴定筛选人源化Kitlg 纯合小鼠；
3）将步骤1）获得的人源化IL3 GM-CSF纯合小鼠与步骤2）获得的人源化Kitlg纯合小鼠杂交，得到人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠；
所述人源化IL3 GM-CSF小鼠是将NPLG小鼠IL3基因的p.A27信号肽至GM-CSF基因的TGA终止密码子区段：SEQ ID NO 16整体替换为如下区段： 人类IL3基因的p.A20信号肽至TGA终止密码子序列：SEQ ID NO 17+ 小鼠IL3基因的UTR非翻译区序列：SEQ ID NO 18 + 小鼠IL3基因5号外显子下游500bp的序列：SEQ ID NO 19 + 小鼠CSF2基因ATG起始密码子上游5kbp的序列：SEQ ID NO 21+ 小鼠CSF2基因的p.M1到p.S17信号肽序列：SEQ ID NO 22+ 人类CSF2基因的p.A18信号肽到TGA终止密码子序列：SEQ ID NO 23；并且保留小鼠IL3的信号肽p.M1-p.Q26序列SEQ ID NO 20及小鼠CSF2的信号肽p.M1-p.S17序列：SEQ ID NO 22；
所述人源化Kitlg小鼠是将NPLG小鼠Kitlg基因2号外显子的部分蛋白编码区-替换为人Kitlg基因的CDS区，即p.E26-p.V273序列： SEQ ID NO 24 + 3×SV40 polyA序列：SEQID NO 25；并且保留小鼠Kitlg基因的信号肽p.M1-p.T25序列：SEQ ID NO 26；
所述步骤1）制备人源化IL3 GM-CSF小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ IDNO 1；将Cas9，gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠；
所述步骤2）制备人源化Kitlg小鼠包括构建供体载体，其含有核苷酸序列SEQ ID NO2；将Cas9，gRNA和供体载体共同显微注射到小鼠受精卵中，以产生拥有目标敲入基因片段的小鼠。
2.根据权利要求1所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于所述步骤3）还包括将人源化IL3 GM-CSF Kitlg杂合小鼠通过多次同胞交配，并进行PCR鉴定，获得IL3 GM-CSF Kitlg纯合小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于步骤1）涉及的gRNA选自：
gRNA-A1，与正向序列互补:SEQ ID NO 3；
gRNA-A2，与反向序列互补:SEQ ID NO 4；
或
gRNA-B1，与正向序列互补: SEQ ID NO 5；
gRNA-B2，与反向序列互补:SEQ ID NO 6。
4.根据权利要求1或2所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于步骤2）涉及的gRNA选自：
gRNA-C1，与正向序列互补: SEQ ID NO 10；
gRNA-C2，与反向序列互补:SEQ ID NO 11。
5.根据权利要求1或2所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于所述步骤1）PCR扩增鉴定筛选采用如下引物：同源臂引物Primer F: SEQ ID NO7；插入片段引物Primer R1: SEQ ID NO 8；小鼠基因组引物Primer R2: SEQ ID NO 9。
6.根据权利要求1或2所述的一种人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠的制备方法，其特征在于所述步骤2）PCR扩增鉴定筛选采用如下引物： human KITLG Prime 1F:SEQ ID NO12；human KITLG Prime 1R: SEQ ID NO 13；同源臂引物Prime 2F: SEQ ID NO 14；同源臂引物Prime 2R: SEQ ID NO 15。
7.一种人源化免疫系统小鼠的制备方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项方法获得的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠按如下步骤制备获得：选用新生或1至5周龄的人源化NPLG IL3 GM-CSF Kitlg小鼠，全身辐照或给予化疗药物清髓；清髓后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞；干细胞接种12周后，对小鼠外周血中，人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过25%的小鼠即为人源化免疫系统小鼠。
8.根据权利要求7所述的一种人源化免疫系统小鼠的制备方法，其特征在于所述辐照的放射源是X射线、或者Co60/Cs137来源的Gamma射线，射线的剂量为0.5-2Gy每只小鼠。
9.根据权利要求7或8任一项所述的一种人源化免疫系统小鼠的制备方法，其特征在于所述的CD34阳性的人源造血干细胞注射剂量为1×104~1×106每只小鼠。
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