CN111719003A - 一种rbp1基因和应用及绵羊卵巢体外发育质量评估方法与扩增引物 - Google Patents

一种rbp1基因和应用及绵羊卵巢体外发育质量评估方法与扩增引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RBP1基因和应用及绵羊卵巢体外发育质量评估方法与扩增引物。其中：分子标记为绵羊第1号染色体RBP1基因，该RBP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；评估方法是，选择绵羊第1号染色体RBP1基因的启动子区域设计扩增引物；加上保护碱基的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。本发明提供了一种适于评估绵羊卵巢组织中卵母细胞发育质量的分子标记基因RBP1，利用该分子标记，能够根据绵羊卵巢组织中卵母细胞发育质量进行评估，快速有效地优化绵羊卵巢组织体外培养体系，为建立利用绵羊卵巢组织中卵母细胞奠定基础。

Description

一种RBP1基因和应用及绵羊卵巢体外发育质量评估方法与扩 增引物
技术领域
本发明涉及一种RBP1基因，以及该RBP1基因作为分子标记在评估绵羊卵巢体外培养发育质量中的应用，还涉及绵羊卵巢体外发育质量评估方法与扩增引物。
背景技术
生殖健康是当前生命活动的主旋律，生命新个体的代代相传维持了自然界的欣欣向荣。在生殖健康的相关研究中，卵母细胞的发生发育是生殖发育的重点和难点。卵母细胞在机体的卵巢组织中生长发育，卵巢组织为卵母细胞的生长发育提供了丰富和大量的营养物质和环境，从而保证优质卵母细胞的生长发育。机体的卵巢组织中包含有大量的卵母细胞，为卵母细胞的生长发育和基因表达调控等相关研究提供了重要的实验研究材料。通过对卵母细胞发生发育机制的相关研究为生命有机体的优生优育奠定坚实的理论基础。
绵羊作为家畜成员为人类提供优质的肉、奶及羊毛制品，极大地丰富和提高了人们的生活水平。随着人们生活水平的不断提高，人们需要具有不同特色和特点的绵羊品种为人类服务，培育提高满足人们不同需要的绵羊品种个体日益成为现代畜牧业的时代要求。绵羊品种的改良和培育离不开绵羊卵母细胞为基础的生殖发育相关研究，绵羊的卵母细胞广泛来源于羊屠宰后遗弃的卵巢组织，或流产的胎羊体内卵巢。卵巢组织中有数以万计的早期卵母细胞，利用屠宰后遗弃的卵巢组织或流产的胎羊体内卵巢组织，能够为绵羊卵母细胞发生发育的相关研究提供重要的实验材料，同时，结合现代细胞工程和分子工程技术能够极大地加快绵羊的品种改良和培育速度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种作为评估绵羊卵巢体外发育质量的分子标记的RBP1基因。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种评估绵羊卵巢体外培养发育质量的方法。
对于一种RBP1基因，该RBP1基因为评估绵羊卵巢体外培养发育质量的分子标记，且该RBP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，上述分子标记RBP1基因在评估绵羊卵巢体外培养发育质量中的应用。
对于评估绵羊卵巢体外培养发育质量的方法，本发明采用的技术方案是，选择绵羊第1号染色体(Chromosome 1-NC_040252.1)RBP1基因的启动子区域设计扩增引物。
作为优选，扩增引物的核苷酸序列如下所示：
其中上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-AGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-GTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
作为进一步优选，上述扩增引物前添加酶切位点；
其中，上游扩增引物添加Cla I酶切位点后的核苷酸序列如下：
F：5’-ATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
下游扩增引物添加BsmB I酶切位点后的核苷酸序列如下：
R：5’-CGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
更进一步的优选是，选择前面添加酶切位点的扩增引物5’端加上保护碱基：
其中，在添加Cla I酶切位点后的上游扩增引物5’端添加CCA，得到加上保护碱基的上游扩增引物，其核苷酸序列为：
F：5’-CCAATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
添加BsmB I酶切位点后的下游扩增引物5’端添加TGC，得到加上保护碱基的下游扩增引物，其核苷酸序列为：
R：5’-TGCCGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
再进一步的优选，上述方法还包括具有如下核苷酸序列的鉴定引物：
其中上游鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-ATTGGAGTGGGAGGAGAA-3’，
下游鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-GGCATTTATGGGAGTATTGT-3’。
再进一步的优选，上述方法还包括如下步骤：
(1)绵羊卵巢组织基因组的提取；
(2)绵羊RBP1基因启动子的扩增；
(3)RBP1基因启动子序列同pLV-mCherry构建重构载体；
(4)介导RBP1基因启动子-mCherry转染病毒包装；
(5)绵羊卵巢组织的体外培养；
(6)RBP1基因启动子-mCherry在绵羊卵巢组织卵母细胞中的表达；
(7)红色荧光蛋白mCherry在绵羊卵巢卵母细胞中荧光表达水平检测；
(8)绵羊卵巢组织和卵母细胞体外培养体系的完善和优化。
本发明的有益效果是：
通过现代分子细胞技术找到了一种适于评估绵羊卵巢组织中卵母细胞发育质量的分子标记基因RBP1，利用该分子标记，能够根据绵羊卵巢组织中卵母细胞发育质量进行评估，快速有效地优化绵羊卵巢组织体外培养体系，为建立利用绵羊卵巢组织中卵母细胞奠定基础。
具体实施方式
具体操作步骤如下：
1、绵羊卵巢组织基因组的提取；
绵羊卵巢组织DNA基因组的提取按照组织基因组DNA提取试剂盒(天根试剂公司产品)操作说明书进行。具体步骤为：取绵羊卵巢组织打碎形成细胞悬液，然后10,000rpm离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加入20μl蛋白酶K混匀后，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作上一步步骤。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、绵羊RBP1基因启动子的扩增引物的设计；
取绵羊RBP1基因启动子上游扩增引物F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体核苷酸序列为：5’-CCAATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’，下游扩增引物R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体核苷酸序列为：5’-TGCCGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’，根据引物合成说明书加灭菌双蒸水将引物配制成100μM的贮存液和10μM的工作液。
扩增引物的设计
上述扩增引物是以基本的扩增引物为基础，经在扩增引物前添加酶切位点，再在得到的添加酶切位点后的扩增引物5’端加上保护碱基而得到的，具体做法如下：
1)首先设计核苷酸序列如下所示的基本的扩增引物：
其中基本的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-AGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
基本的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-GTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
2)然后在上述基本的扩增引物前添加酶切位点，得到了添加酶切位点后的扩增引物，其核苷酸序列如下所示：
其中，基本的上游扩增引物添加Cla I酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-ATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
基本的下游扩增引物添加BsmB I酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-CGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
3)最后，选择在添加酶切位点后的扩增引物的5’端加上保护碱基：
其中，在添加Cla I酶切位点后的上游扩增引物5’端添加CCA，得到加上保护碱基的上游扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-CCAATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
在添加BsmB I酶切位点后的下游扩增引物5’端添加TGC，得到加上保护碱基的下游扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-TGCCGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
PCR扩增RBP1基因启动子
在灭菌的PCR扩增管中加入如下反应物构成50μl反应体系。EasyTaq DNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司产品。
Figure BDA0002582753140000061
PCR扩增反应条件如下，共35个循环。
94℃预热5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min 30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
1％琼脂糖凝胶电泳回收RBP1基因启动子序列
1％琼脂糖凝胶板的制备，取200ml的三角烧瓶一只，称取0.7g的琼脂糖，加70ml 1×TAE缓冲液，放入微波炉加热(高火3min)至溶化透明为止。冷却至50℃左右加EB(溴化乙锭)至终浓度0.5μg/ml，倒入凝胶槽，选择合适的梳齿，待冷却成型后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，电泳槽中倒入1×TAE溶液，缓冲液淹没过胶1～2mm为止。凝胶板上第一孔中加入Marker 20006μl，后续孔中加入样本，方法为取少量6×DNA上样缓冲液混合于扩增管中，将50μl相应的扩增基因加入后续孔中。采用U 160V、I 200mA、T 30min条件进行电泳，待溴酚蓝移至凝胶的1/2～2/3距离时，关闭电源。电泳结束后取出凝胶块，使用紫外分析仪和凝胶成像仪进行检测分析。
通过与DNA Marker 2000片段大小比较，回收RBP1基因启动子序列，RBP1基因启动子序列片段为1939bp。借助紫外分析仪切割回收含有RBP1基因启动子序列的琼脂块，放入1.5ml的离心管中。按照DNA凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)说明书操作回收相应DNA基因片段。
具体步骤为：
(1)紫光荧光下切下RBP1基因启动子序列凝胶带，放入1.5ml离心管。
(2)取1ml结合缓冲液加入含有RBP1基因启动子序列凝胶带的离心管内，75℃水浴10min，使凝胶融化，加热融胶时，每2min钟混匀一次。
(3)将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心1min。
(4)取下UNIQ-10吸附柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10吸附柱放入同一收集管中，加入750ml洗脱液，8000rmp室温离心1min。
(5)重复上述步骤(4)。
(6)取下UNIQ-10吸附柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，1200rmp室温离心1min。
(7)将UNIQ-10吸附柱放入一根新的离心管中，在柱子膜中央加30μl洗脱液室温放置2min。
(8)12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片断。
3、RBP1基因启动子序列和pLV-mCherry构建重构载体；
分别用限制性内切酶Cla I(Thermo产品)和BsmB I(Thermo产品)切RBP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，50μl酶切体系，体系组成如下：
Figure BDA0002582753140000071
Figure BDA0002582753140000081
酶切后采用1％琼脂糖凝胶电泳分别回收RBP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，T4连接酶连接RBP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，构建重构载体。具体操作步骤如下：
在200μl PCR扩增管中混匀酶切后的RBP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体组分，反应体系如下：
Figure BDA0002582753140000082
构成总体积为5μl的连接反应体系，16℃连接过夜。
连接产物转化到Stbl3感受态细胞，具体操作步骤如下：
(1)取出50μl冻存于-70℃的感受态细胞，室温下解冻，解冻后立即置于冰上。
(2)取1μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min。
(3)42℃水浴中热激90s，迅速置于冰上冷却2～3min。
(4)在超净台内向管中加入500μl LB液体培养基，混匀后在摇床上200rpm，37℃振荡1h。
(5)将菌液接种于90mm含有Amp的LB培养基平板上，使其分布均匀。
(6)37℃恒温培养箱培养12～16h。
取连接转化好的菌落平皿，在超净台内进行进行挑菌培养。取配置好的TB培养基90ml，添加磷酸氢二钾、磷酸二氢钾缓冲液10ml和50mg/ml Amp溶液100μl混合于试剂瓶中。把混合好的TB培养基2ml倒入10ml的离心管中，用牙签从平板中挑取菌落放入上述离心管中，挑圆形的菌落，每一个菌落放入一个离心管中，共取10个聚落放入10个离心管。把10个离心管放入恒温振荡器中，200rpm，37℃振荡6～7h。
取绵羊RBP1基因启动子鉴定引物，上游鉴定引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体核苷酸序列为：5’-ATTGGAGTGGGAGGAGAA-3’，下游鉴定引物R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，具体核苷酸序列为：5’-GGCATTTATGGGAGTATTGT-3’，鉴定片段长度为258bp，根据引物合成说明书加灭菌双蒸水将引物配制成100μM的贮存液和10μM的工作液。
对含重构载体的菌液进行PCR鉴定，具体操作步骤如下：在25μl反应体系PCR扩增管中加入如下成分：
Figure BDA0002582753140000091
PCR扩增反应条件如下，94℃预热5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。共25个循环。菌体PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外分析仪内依据扩增片段的有无和大致长度，鉴定RBP1基因启动子-mCherry重构载体菌液是否为阳性。在超净台内，对于鉴定为阳性的菌液，取0.8ml于1.5ml的离心管中，再加入0.2ml 80％灭菌甘油液，混匀。-80℃保存菌种。从阳性的菌液中提取RBP1基因启动子-mCherry重构载体，取10μl RBP1基因启动子-mCherry重构载体测序，以检测重构载体中RBP1基因启动子序列是否正确。
4、介导RBP1基因启动子-mCherry转染病毒包装；
用60mm培养皿包装含pLv-RBP1基因启动子-mCherry质粒的病毒，具体步骤如下：包毒前24h传293T细胞，密度约1×106/60mm皿，第二天观察细胞，细胞要边界分明圆滑，不聚团，饱满，有三到四个突起，大概汇合50％～60％时即可进行包装。包装前2h细胞换新鲜培养液。
取出两个1.5mL离心管，记为A管和B管，B管内加入250μL的2×HBS，A管内先加入胚胎培养水，再加入25μL的2.5M的CaCl2，混匀，再依次加入载体质粒和辅助质粒，其中载体粒1个：pLv-RBP1基因启动子-mCherry质粒：5μg；辅助质粒3个：pMDLg/pRRE：2μg，pRSV REV：2μg，pVSV-G：2μg。混匀，使得A管的终体积为250μL，可根据质粒的总体积调整水的总体积。混匀后将A管的溶液缓慢的加入到B管中，边加边混匀。
室温放置5～10min。将混合液逐滴加入293T细胞中，轻轻晃匀。10～16h后换新鲜293T细胞培养液。换液后48h左右收集含pLv-RBP1基因启动子-mCherry质粒的病毒液。
5、绵羊卵巢组织的体外培养；
取绵羊的卵巢组织，用添加双抗的无钙镁的PBS液洗涤，在超净工作台中，分离出绵羊卵巢的皮质部分，将分离的皮质部分用显微分割刀片分割成1mm3大小的组织块，将分离的组织块接种到0.1％明胶事先包被的培养皿上，组织培养液为含10％FBS的DMEM/F12和α-MEM(1:1)，培养液具体组分为：DMEM/F12和α-MEM(体积比为1:1)、FBS(体积比为10％)、丙酮酸(体积比为1％)、谷氨酰胺(体积比为1％)、非必须氨基酸(体积比为1％)、FSH(100μg/ml)，LH(20μg/ml)和双抗(各50U/ml)，培养液4℃保存，使用前37℃预热。
6、RBP1基因启动子-mCherry在绵羊卵巢组织卵母细胞中的表达；
病毒包装48h左右收集病毒液，将包装病毒培养液转移到15mL离心管中，4℃，1500rpm离心3min以沉淀细胞碎片。将上清病毒液用0.45μm的滤膜过滤，过滤后病毒液转移到100KD超滤管(Millipore产品)中，4℃、4000rpm离心45min，将病毒液浓缩约30倍左右，将浓缩病毒液转移到15mL离心管中，加入新鲜卵巢组织培养液和Polybrene储存液，使Polybrene终浓度为10ug/mL。吸除待感染的卵巢组织培养液，换上含浓缩病毒和Polybrene的新鲜培养液，12h后换上新鲜的卵巢组织培养液，根据绵羊卵巢组织生长和病毒感染情况，进行重复感染操作。
7、红色荧光蛋白mCherry在绵羊卵巢卵母细胞中荧光表达水平的检测；
绵羊卵巢组织用含病毒的培养液作用12h后，更换上新鲜的卵巢组织培养液培养48h，荧光显微镜下检测绵羊卵巢组织中卵母细胞红色荧光蛋白mCherry表达情况。绵羊卵巢卵母细胞中红色荧光蛋白mCherry表达亮度越强，显示绵羊卵巢卵母细胞发育质量越好，卵母细胞发育潜力越大，这样的卵母细胞能够用于深入的发育研究和生产应用。因此该方法提供了一个直观有效的绵羊卵巢组织中卵母细胞培养发育体系的平台。
8、绵羊卵巢组织体外培养体系的完善和优化。
RBP1是绵羊卵巢组织卵母细胞胞质阶段性表达基因，高表达于晚期发育卵母细胞的胞质中，根据荧光显微镜下绵羊卵巢组织中卵母细胞红色荧光蛋白的表达水平的高低，结合绵羊卵巢组织卵母细胞生长发育情况，能够很好地指示绵羊卵巢组织培养体系和绵羊卵母细胞培养体系是否适宜，从而能够调整、优化、完善绵羊卵巢组织和卵母细胞体外培养体系。
RBP1基因作为绵羊卵巢组织中卵母细胞生长发育的阶段性特异指标基因，选择RBP1基因启动子构建红色荧光蛋白表达驱动载体，能够准确检测反映绵羊卵巢组织和卵母细胞体外培养体系，从而为优化绵羊卵巢组织和卵母细胞的培养体系提供重要科学依据。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 安徽省天长市周氏羊业有限公司
<120> 一种RBP1基因和应用及绵羊卵巢体外发育质量评估方法与扩增引物
<130> NO
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26499
<212> DNA
<213> 绵羊(Ovis aries)
<400> 1
atggatcctc ccgccggctt tgtgcgcgcc tgcaatccag ctgtcgccgc cccgagagcc 60
ccctgcctcc ggaggacgca catttccggg ccgcccacca cccagatcgc accgcctgcc 120
cacatctact ccggcccgtt cggtccccgt cgggccccag tcgtcccccc gaaatgccgg 180
tcgactttac cgggtactgg aagatgctgg ccaacgagaa tttcgaggag tacttgcgcg 240
cgctgggtaa gcgctgcccg ccgcgctctg cccgggcgcc cggccagacg tctgagggtg 300
ggatccccgc gcccttccga gccggccgcc cgtctgcctg cctcggttag gccttaccgc 360
cggccagagc acccgggccg cggacggggc gggggttgtt tggggtcatg gtggtcggtg 420
tctgatattt ggctctcgac gtggaggatt tcattagaaa agttgggctt ggttggctag 480
tttttgtttt caaaggttta gcatagggca gaaaactttg ttgtggaaga aaaggaaaga 540
aagaaaagga caagccagct gcacgcagag gccgtgttaa tcgagcaagg aactccagtg 600
gttttcttag gggcgggggg agcaggctcg tagggcccca ctaccttggc agcagttctc 660
caaatgtttt cagccaactc tctaccctgg cactctctgc agatgtcaat gtggccttgc 720
gcaaaatcgc caacttgctg aagccagaca aagagatcgt gcaggaaggc gaccacatga 780
tcatccgcac gctgagcact tttaggaact acatcatgga cttccaggtt gggaaggagt 840
ttgaggagga tctgacgggc atagacgacc gcaagtgcat ggtgaggctt tgtgtttgcc 900
tgcgcatctc cttcccaggg ttcctgacaa aggtggggct gggtgatccc agaggggagc 960
aagggccctg tgttctgagg ggcgggagat gttcccagtc ccagccccca aggtaggcag 1020
cacctgactc atcaagttcc ccttacatcc taaccagaca gtaacaggaa agctgtggct 1080
tgttgactgg ctaccatgtc ctggctttga gccaatgctt tctttatatg cttgacttca 1140
tccaatcatc acaacccttg agggaggtct gaggatgccc attttacaga tgaggaaaca 1200
gtctcaaaga gatgtgcctg gagtagcaca gctagggcag ggctgggcag gaattccagg 1260
caaatctgtt gactctatct gtacggtagc atgggggaga aaagagagaa gggaggaagg 1320
caaggccaaa cataggcaac ctttttcaag tgtaaacttt ctacatggca gagcatgaag 1380
tcactttagg gagcaggggg cactgtgatc tatgccttct gccctgcccc tcctcatccc 1440
caaactgggg tttggctccc ggccagtgcc ttccctatct tccactgctt ccaggcggct 1500
ggctgccttt gaaccccgca gccagcacct actcagtggg tcaatgcccc tgcagcccag 1560
gccagaagga gcagcagtgg aggaggggag taagccaccc gtaaacaagg gtgggaagtt 1620
ggtgacctgg agaccccaat tagcgccacc aggctgcctc cggaaggtca gccttgggcc 1680
tccatcaaca tcctggagat cgctgggagg tcagggtgcc gtctgcctcg ctctcacagt 1740
cgtgggtccg gacctagggg cctgccttgc ttcctgatga gattctcctc attcttcttc 1800
cccgtccctt cccacccttc actgaggggc tactccatgc cttgcactgt gccagctgtt 1860
ttactccaca gtgaaggagg gattactaac ctcatatttc tcaatgactg aggctcccag 1920
gcgaagagat tgaagaggtg ggactttgag gcccagactc ctgctctggg ctaagctcct 1980
ctgtaggtag cctttgtgga accccgtgcc tgggctttgg ttgactgtgg ttgaaggagt 2040
gccagtgtct ggggataaag agccccaggc caggatgact cacccttcct gacttgttga 2100
ttcatctgaa ggggatcagg agtcagtgat tacactcgga atagtggcgg aagagggggt 2160
ggctggcaag gcggatcctc agagaggccg ctggagggag aaaacactgt ggttgtagtg 2220
aaatgtcagg tcatgcttct aaacgcccaa ggcctcttaa tcctcaaaga ggctcacagt 2280
gggaaaggag actttcagtc agagtctgcc ttgataaagt gggggccctg cctgtcggac 2340
cactgcccaa ggtctggtcc ctggctcctt gcctggaacc gaatgtgaga accgtccttg 2400
tccccagcct actcttgagg tacttagaag gcacagcaag catctctgtt tattttgggt 2460
cattgccact tctggaatgt gctggcttat acttgcttgg ctaattatct ttgctctttc 2520
attctcactc tcatccatta atgcatgaag catttattga tcacctggta atactagtta 2580
atacaagcag acctcggaga gattgcaggt ccagccccag atctctgcaa taaaatgaac 2640
atcgaaataa agcgagtcat acagagtttt ccttttccca gtgcatataa aacttttggc 2700
tatcctagac tgtggtttat taaatttgca attatattac gtgtaaataa tagtgtatac 2760
accttaactg aaatgctcac catcatctga gccctgggca agttataatc tttttgcaat 2820
atagtactgt caaagattac tgatcacaga tcaccataac aaatagtgaa aaagtgtgaa 2880
atactgggag aattaccaaa gtgtgacaca gagaccaaat gtgagcaaat gctgttggaa 2940
aaatggcaaa tgctgttgga aaaatggcat caatcaatca gacaaaaatg acttgtctga 3000
tgcaaatttg ccacacacct tcgatctaaa aagcgcagtg tcatcaggga ctccccgagt 3060
ggtccagtgg ttaagaccct gcacttccaa tgcaggttca atcctttgtt agagaactaa 3120
gatcccacat gcccagcagc atggccaaaa taaaaaccca cagtatttcc gaagtgcaat 3180
aaaacaaggc atgcctgtac tcattgagtg ctgaagtact gttcccgttt tattttaact 3240
cactgaattt tcacaacact gattttaacc ccattttaca gacaagaaaa ccaaggcaag 3300
atttcttgtt gtgtgacctt ggtggattaa gaaagtggcc gagggagggt ttgcatgtgg 3360
tctgacccag tggaacatgt cgcaatctct gatgtccagg aacccacagt ctttgtggtg 3420
gagacagatg cacagaggct cagaacacag tgtgatcagt ggtgacaaag ggaagcacca 3480
gaggagggga tcccagaagg agttctggag gtggtgacat cacaacttac tgtaacagaa 3540
aatgggaagg tgggtgggtg ggtgggcagg agggaggaag ggaagggttt ggccaccctc 3600
ttttcttagc cattagttct gccataggtg aacagatcag ggagcccagc agttgggcaa 3660
actcagtgac attgggtgag gactcacggt cacgtctgct gtctcaggat tcagggaggc 3720
cccctctcga gtagacagca ggcactcacc ttgctgttgc gaatggagaa gatggactgc 3780
cctctctctg ctctagcctt cctttggccc ctgactgcag agaagtcctt cttcccagct 3840
gtccagtcgt attgggtagc cacagggaag agcatggcta agggagggtg caggataata 3900
caatgatagc aactatctag cctgcccttg tgaatggagg ggagctgcct gcaagaggcc 3960
acatagccca ggccagggcg gttctgagca aggtggtagc caaagataat gtcccttctg 4020
ctccccgtgc tctgcaccca gcaggaggag ctgtggctgg aggaagacag ttctcagcat 4080
cagttggcct cattctaaca cgttcttccc agcacattac aagtagctca ttttcaccta 4140
ttatgttcat tcctttcttg gtcctacaag catttcgttg gtgtttatct ttgcagccct 4200
cgtgttactg acatgaatca cacgggagtc ctgccctcct ggagctcagt gtaatgggag 4260
gcaacagacc aaagcagccg atcatactga gatggtgtgc tgacggggag ggacaggcag 4320
agaaggaccc ccgggtctgg gaggtcagaa gctattcccg cagaaagtgg agtctcagca 4380
gtggcttagg ataggcagga aattggcaga caacagaaag gatgagaaca aagccaaggc 4440
caagagaata gctcttgttt ttatcgttgt tcagtcactc ggttgtgtct gactctgcaa 4500
ccccatggac tgcagcccac caggcttccc tgtccttcac cttctcccag agcttgctca 4560
aactcatgtt cattgagtca gtgataccat ccaaccatct catcctctgt catccctttc 4620
tcctcctgct ttcagtcttt cccagcatca gggtcttttc caatgagtca gttcttccca 4680
tcagctggcc aaagtattgg agattcagct tcagcatcag tccttccaat gaatagtcag 4740
ggttgatttc tttttgggtc aatcctaaaa gatttggttt gatctccttg cagtccaagg 4800
gggtctcaag tgtcttctcc aacagcactt ggtacttgct atttcaaacc tgtcccacac 4860
cagccctggg ctcagcctgg ggacacaaag gcacccaggc cagtggagga gccagacaca 4920
tcctcaggcc tttacacccg gtgcagtggt ggaagcacag tggactggga acacagggct 4980
ggtagggcga agagcaggca gtggtcaagg agggttccct ggagccgtgg ggagccttga 5040
aggacaagta agaattgggc ccagaggtca gagaaggcct agctgtgagg ggttttacca 5100
gggaaagagg tgcagcctgc acagacttca tgtggccaag tatagggtgt ggctggagaa 5160
gagggcagtg ctggggcccc agtagggggc ctggaggtaa ccagatgggc gccagagagc 5220
ctgggagagg tgtggtcagg ctgccaccct ccccaaaggg cccagagagc tctgctcctg 5280
catgtttccc tggaaacctt atctgtcttc tagaacagca gccagaggat gaaatccggc 5340
ctgcagatgt gttttgtttg gcttgtaccg tgtttgacaa atttcagagc caattgccag 5400
tgattgccaa agattgttat gtcataggaa aatccataat cctggctgtt cataccccag 5460
cagaatcaag actgctgaaa aggctgggtg cccttttagt tctgtgccat gtagatcccc 5520
ggaacatggt cgcagttgct cccatttgat gggacctttt ccacttttcc ccagctcttg 5580
cccactccat tacctgaagt ccaggatcaa acagccatat atcattgttt gtgttgtgcg 5640
ttcctgagag cagtggttcc cagagctgag atcagcagca gcagcagtgt gtgaggactt 5700
gttagaaaaa cagattttcc agccagaccc ctggcctccc agatcaggaa ctttgggggc 5760
gaggcctaca atctgggttc caataagcca ccaggtggtt ctggttgaac taaaccttga 5820
gaaccaccac tttggagaaa agagacctct ctgtaattgc gtctctagaa aaagtggaaa 5880
acactcagcg atagttttta ggcccagtgt agagggccac atgccaccag atggcttagc 5940
ccattcctgg acccctccgg acatggcagc catgtccagc accacctaaa atggctctgc 6000
agtctctccc caggctgacg ggtggaggga ctcagatcta tggagcccag gatcactcag 6060
ctcacatttc cagttggttg tgttcagatc tttacatgac cgcaagcagt cagggctgtc 6120
atcttggtgg aaatgtgtca agcctgggtc cagcttttct ccaccacctc ctgcatgcct 6180
ttatccatta agatgaaatt gcaggcccag tttaaaacca atattattta ttgaatctag 6240
cagatggagg ccttggcaga gtgggggacc tgacaaaaga gaggtgctct ttcacttcaa 6300
atactgttcc ccacacccag gccaaggagc ccctcagtgc aaagaatgat ctgactcttg 6360
attccagctc ccccggcact agctgctttt atgggagaag actagcctcg gccagggtct 6420
cagccagaag cctggctctg tgtgctggtg gcagaagggc catttgtcat cccaccatgg 6480
accccaggga aactgcagct ttgttcactc aggagcgggc tcctcctccc aggcagaggc 6540
ctcgcttcca gctccagcct tgaactcagg atgacccctt ccacagagcc tgccttccgc 6600
ttccagcctt ctgttgctgc tgtctgtttt tatggtaaaa gaaaaaaaaa agaattcaaa 6660
cagcacagga gaaagtggac tgagaaggaa aggccccttc cttactcagc ctcattccca 6720
ctccccagag gtaatcactg gtactgtttc tggctggtct gtcccaaaat cgtcctcaaa 6780
tacagaagcc agcagctctg cagctattga gtagataact ggtcaattgt tattagtgaa 6840
ctaagttgtg actcttgcga tcccatgaac tgtagtcctc caggttcctc tgtccgtggg 6900
attttccaga caagaatact agaatggatt tccatttcct tctccagggg atctttccga 6960
cccagggatc aaacccacat ctcctgcatt agcaggcaga ttctttacca ctgagccacc 7020
tgggaagctc cccccaaatt ggtcaatatt tctactaaaa gccagaaaaa acagaaagag 7080
aaacagagag agagaggagg gagggagggg aaagaaggaa ggagaaaaag aaaagaggga 7140
agaaagaaaa gatctacctc tttgtacatt gttttctcaa taatatttct tcagcatctt 7200
tctatatcag cacttacatg tttcatttcc ttccctcctt gacttacttt catccatcca 7260
ttcatgcatc taagtatctg ccaaacctct gttaacagtt tggcttaaac ccttttgcca 7320
gctttctgat cctattcttg attcattaaa cagatttctt tgattcttat ttttaaaaaa 7380
acaaaaacac gatgtcaatg gcagaattca ctccctgggc tgcagagctg agaatgccag 7440
tgggtttgag agctttctga gagccgcccc tgcccagatc agggccccag catttggctg 7500
ggtcctttcc aggaaggaaa cacggagtgt ctttcatgtc ttagctaaag ttcttcgacc 7560
tttgaaatga gtgtctgcag catgcttttg aggattacaa aaaggagaat taaagcaacc 7620
caaataaaat tcacaaagta gctttcaaga atcacacttg tttgttaggt ttcgggtttt 7680
gttaggaaca aagggaaata acatgtgcta aatccttacc aagtgccatg cctgcccctg 7740
atgattttag cacttttttc tctcttggtc cccacaacaa atgctgttcg gtaagtaaca 7800
ttatgcccac tttacagatg gaaatctgag gctcccgggt gaggaatctt tttagcccaa 7860
agtcactcag tcagctggta gcagaggaag gattccaact tgtctgttta taacactcta 7920
cattacaaaa tctttcatgg agctctgcta aggactagca cctcaattcc ttattgtgag 7980
cctcatcaca acctggaaga gagtggtgag aaggcttggg ggtgtggaga aaggagtgct 8040
ggtattagag ttagacatct ggttttgaat cctcccctct tacttagtta acaaagtgac 8100
cttaaatgac tgaacacact gcctctgttt tcacatctgc taaatgggca ttgtgattgc 8160
cgctccacct ggctcacagc acattctgag gactagggtg atagcacagg aaatagggcc 8220
ttgtgaagcc actatactat gtccaacaag cagggggaaa tccctctgag accctggcct 8280
acaggcagtg ctcttgtgat ggccacatgt ttactggagg attacaacta tttgtttttc 8340
tcatcaacat tgctctgcta cccacccaaa gaaggacctt ctttttcgtg ggaatgaccc 8400
ctacttacct gtgggttctg gtgaagctgc aaatcccagt acgtcgtctc tcctgggttg 8460
agcaccttaa accagggccg tgacagtgtc ctgtggcctg tcccgcgatt gtgtgtgtga 8520
ctgggccagt cgtatgtttc ctgccacctt ccatggctgc aggaaaaatc gaacagaagg 8580
aaaaaataaa atgaggccag tagataagca gaaataactg agaaagagag agggagagag 8640
aaaccacgac actggagggc tgctggaact cctgatacaa caccattccg agacttctca 8700
catccttgaa ccagctagta tgttcctttt ctttttcccc tgaagcgttt tgcagttttc 8760
ctgttgcttg catctaaaaa catcttgtga catagactcc tacatatcat aggttaagaa 8820
ccacgtagga gttagagcag tagttctcaa acttaaactt gccccacatc ccgattttct 8880
gattcagaaa gtctcgagta ggaaccaaga gcttttctaa caagttcctg actgatgctg 8940
atgctgtggg ttcaaagagc atgcttatga taactactaa gaaagagaaa tgaggaagtg 9000
ggctggccca tgcccaggtt ccgatgatgt tcttttcatg gttcagtgtg ctggagttaa 9060
gggtgcccat tgatggggac tgaatgaaag tggagagatg ccctccagtc catgtggatg 9120
cctggagaca ccaaacttgc agcagcccac gatggtttgt gactcagggt ccgagtaagt 9180
gacaccaaca gtctgtgcag ctggacaagt ccaggataca gcagagcaac tgggagtctt 9240
ggctttgaga tggacctgga tttgaatcct gggtccaccc tccagctgtg tttcctttgg 9300
gaacatactc tatctctttg gacctcagtg ttctcatttg taaacaggag ccaaagatat 9360
taacagtacc actgatagga ttgttgtgaa aactatgtgg tgatgaatta tcgcaaattt 9420
ctattgctat gtaacaaacc actccaaaac ttagtgctcc aagactccaa aacaataaca 9480
gttctgtatt ttcttcatga atctgcaatt tgggcagggc tcaaaaaggc aggctggtcc 9540
ctgctgtgtg ccacatctgt gaggcattgg agggtccact ttccagatgg ctcactcata 9600
ctcactctct actggctgct tgagcttcct cacaacatgg caaccgggtt ccaagaaaaa 9660
gggggccaag agaataaagg agaagtatat gacgttctta taatctgctt agcctctgaa 9720
gtcatataga aagaattttg ccatactctg ttggttcagg cagtcccgaa ggcccaccca 9780
tcttcccaag gaagggaaca tggactccac acctcagtgc agatgtggca aggttctaag 9840
agagcacatc aggtggaaga tactttacaa aattctatgt gctaaatgca agctaagcgg 9900
ttaccacagt gttggtgtat ggtgagtaca cagtgggagt tggaatatta ttctctgact 9960
aaagcttgga ggtctgctag tactgggctc ttgtttctga ctaatctcaa gcagcagctg 10020
agcccacaag gactctgagg gggtgggaga gggtgtgtgg tgcctggaga tgggtctctg 10080
caggcagagc gggagctcca cctccctggg ccgcccatcc aaggcaggcc ccacatgaga 10140
ggctggagtg tgggttgaag gggagaagga cagcctcagg gtgttgggag tgatccaggg 10200
cttcaccttc agccgtgttg tacccacctc caaaagtccc agatagacag gtctgaacac 10260
tgtgtctaaa cacagctgaa actgtgcatg tgtgctcagc gtgggagcct cctttttgct 10320
ggtttaccat cccagtcact caggatttct aggccctcac aggtgcacag gacctggaac 10380
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gacttcaagt tgactagaag ctcctctgac agcagagact gcctgattca caaaagcttc 10560
ctccctggga agcatttttg tagctgtctg tgttgtataa atggagttgt gctagagcgt 10620
cacacacgca cattcacaca caccacccct tgtcctcaaa gaggaacccc aggtcacctc 10680
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acttgtttcc tatagtatgc aaatagctta gattccttct tccctccctc ctttctttct 10800
tgacctgagg gtccaaggac aacatagtct gggggaaaac tataaagcaa gatgagtgtg 10860
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ttacagtaaa actggccctg cactcagaaa atgagcaggg cgggccgggg gtgggggtgg 10980
gggagggtgg gtggcggggg gaatccagtg ttcaatgagt cagaaaaatc atcttattct 11040
ttgactcaga gatccactta tggaattaca ttccaggaaa agcattcaga agataggctg 11100
tatctattaa tatttgtaca aagaaaattg tagaagctgg gcagtaataa tccccaacag 11160
cccatagaat cagagccacc ctctgagggc tatgtatggc aggctccgcc ctagtgcctg 11220
atgtataatg tattatatat tcagtcctct aacaatccta gagccgagag gtactcttct 11280
ttttaacaga caggggccca tggtcctgcc agcgtcacac tcctggttaa ccatagtcca 11340
ggattcaact tcagacctct gactcccaac tttgcgtggt ttacacaaca ggccgcctcc 11400
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taatctccca tctaccatcc ttcacattct gaagagggaa atgggggttt ccctggaagt 11760
ccagtgatta agactccaca cttccaatgc agggtgaaag ggttcaatcc ctggtcagga 11820
aactaagatc tcacatgctg catggaatgg gcaaaaaaat ttttttaata aaaagagaaa 11880
tggatcacgc ttctactccc cagctcaaaa tccgaagagt ctccccaggg ctgatgggca 11940
aaatccagac agcattcagg acctcagaac atggcagcgc ttgcctatct agccccacac 12000
tcgcctcaca cctttcactt agccccatcc caccatttgc acacaccatc ctcttttgca 12060
cctctttgca ctcttccctg ggataagtac cctgcttcct ctgcctggga ggatacttaa 12120
cttatggtca ggaccagccc aggtttaact gctccacaga cctcatcctg acttcccatc 12180
ccccttcatc ctcccctctg cctccttgtc cctctctgca ggtgctgccc cagggcgcct 12240
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cctggcacaa ttagctccag tgtgtttatg aaatgagtag aaaaacagtg gaacctcaaa 12360
cagtataggt ggtcatcatc caccatatct acgagatcta cttgccatta aaagctagct 12420
aatgtgtgtt ggtaatatgg attctaaaca ctattgcatt ctaaacacta ttgcattaat 12480
tctttgaatc ctcacaattc tatgataaag atgccaaaat tcttcctaga ttgaaggaaa 12540
tattaataag aaatgaatag atatcatttg tctgagatca gggagctagc tggtagagcc 12600
aggatttaga tccaggctgt ctaacttcag gttgttacca gagaaagatg gaagcattgt 12660
tatgttaagg ggtcagggct ctgaattaat ttctctgcga gacttttgca gtctcaaatg 12720
ctgtgtcccc cagggaagct gtgatgtcct gggacgggat gggtagggga ggtgagaggt 12780
ttggctttca tctcattctc cctggcagtg gaggctgccc tgctggccaa gatctgcagc 12840
ttccaggccg agggtagctg ttttggcctt cctctaaact cttgcttgtc cgcagtccat 12900
tttccttcgt ggcagggcct ggggttcata attggttcag ttcatctttg gagtcccatc 12960
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ttgtctatga aatgggaata attatcaagt aagggatatc tgcttcacaa agaggattag 13080
gtgcaggaaa gcctgcagtc aactgttcca tcagtaggag ttgttatcag taactcgctc 13140
actttataaa ctgtcctcca ggagccaaat tctgcaggtg gtattgtgtg aagagacacc 13200
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ttctgttgag tcaacaaaca atactgtgca ttttctttgt tttagatgct aaggtagggg 14100
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ctgacctgct tgaccttccc tggttactga gttgccatct cttatcttcc gggaattgtt 14220
tctgtttgct ttgaaagata aacaaaaaaa tagaggccag aagtccccat ggaagagatg 14280
aggcctcccc cgagtaggct ctgctcttct gagcctctct gagcaccttc tggcaggaca 14340
gcccctcctt tattccacct ccactgcagg tggacttggg aataaaccaa ttccttgtac 14400
ctgcccaagt agtagagcca actctgcctg ccagataggc aaatatttag attttctatt 14460
gtaccaggtt tggcgggttg gagccacaaa gttgtgaagt gagaaaaaag agatgctggt 14520
acattctggg gttggaggtg cggaattagt cttcttgagg ggtatctttc cagaagggtc 14580
cagccaggca aagcccattt tggaagcctc actcatgcag ccccctgagc tccctgcatc 14640
tgtacaagct attctcttag cctgaaattc cctcattcct cttttacaat ttctgtttct 14700
taacctaact cttgatgttt tctggcatcg attccagcat cacctcctcc aggaagcctt 14760
ccctgatgga cctgtctcca cttcagagtc tgatgaggtg ccctcccact tccacagtta 14820
ccatcacgtg cctctagcag cacttgccat tctgcagaaa ttctctgtct gtcttcaata 14880
gtctgtgagc tctttagagc agaaccttca ccttccctgc cttctgtttc tagcatgtga 14940
ggctggtttg caacctgtct ttgctgaatg ttgttcactt acacagaaaa gtgacagttg 15000
ttagtcactc agtcgtgtcc aagtctgcaa ccccatagac tgtaacccgc caggctcctc 15060
agtccatggg attctcctgg caagaacact ggagtgggta gccattctct tctccagggg 15120
gtcctcccaa cccaggaatt gaaccccggt ctctctcatt gcaggcagat tctttattgt 15180
ctgagcctgc agggaagccc ttgattacac agagctgtga tgcaaaacct tattgttcat 15240
tcaagggtca gcttatatca gggaaatgca gagcccagta gccaagagca tacgctctga 15300
ggtcagacct catctcccca cttcatgact gggggacctt ttttcaaaag ttatctatta 15360
tttttggctt ctttaggccc tctagtggca gcgagtgggc tgtttagttg tagtgccctg 15420
acttagttgt tccagggcat atgggatctt agttccctga ccagagatca aacccatgtc 15480
ccctgtactg gaaggtggag tcttaaccac caaataacta gggaagtccc aatggctgag 15540
tgaccataaa gcctcagtct ccacataagt aaactgggga gaagcatccc tgccccagag 15600
gtttagggaa tcaaatatgt taatcaaatc aatcaaatca gatatgttgt cgccaagtca 15660
tgcctgactc ttcgcaatcc catggactgc agcacaccgg gcttccctat ctctcaccat 15720
ctcccaaagt ttgcccaagg tcatgtccat caagtcagtg atgccatcca accatctcat 15780
cctccggccc tcttctcctt ctgtcctcaa tctttctcag catcaggtct tttccagtga 15840
gtcagttgtt cacatcatgt ggccaaagtg ttgatatgac ccacacttta ataccctgcc 15900
cagcatgcag tgagtattca gttcctgatt tgggggggat gatgatgatg gcaataatgc 15960
caggatgccg ttacttccac caggaaggac ccagcaaaca ggacgcaggt ggcactggtg 16020
ctagttggca tgtctgcctt ccctccaggc tgagctgctt catggcagaa tttgggtcca 16080
gtacagactt tgggccatcc tcagcactga gcccctggaa tgactgagcc cagttccatg 16140
ggaaccccgt gactttctcc agcctcactc cctcttcctc agaacgttgg cctcacggga 16200
ccctgagctc tctgatagtt tgttgtttta aaattaatcc tgggtacttt ctggaatttt 16260
taaggacttt taaaaatgac ttgtcaagat ttaacatttt attgttttgt ttgtcctaag 16320
attcacggta tcatttgctc ttggcttctt catggtgttg gaatcacatt tgtccatgcc 16380
cacggaggcc tactgtggct ttacgggtct atagctgttg cttctgatgg cttttatgta 16440
cctaattact tattcgtgtt ttaaggtctt attaatccag ttttaacctg cttttagaat 16500
gaatcggctt ttcccctgaa tgtgctaatt ttaagtcatt gccagccccc tggtaatgga 16560
tcagaagatc acccagcctg gcctcctggg caggggagct cgtgaagtca gccagaaaga 16620
aatgggttca agtgatggct caacccctaa ccctgagatg gcttggccgg gttacttaac 16680
aagcctaatt ttgatcagct gtaaagcttg agctgtaacg ctcccagtac catacccagc 16740
acttggtagg gtctcattta ctttccctgt ccttcttacc ctcccacttc catatttaac 16800
agtactggag tctaaaaaca tcctcctttt cccagaaacc ctcaaaaggt gaagcaccaa 16860
actccaggag gaatggccaa tttgtatctt ttatcctttc acaacacgta tagaaaatgt 16920
ctagtcactg tctggatttt caattttccc cttaaattta aagagcacag gctttggagg 16980
gctctggcct ttgcaggcag aaccaaccat ggacaagacc tcccctctta ggacttggct 17040
gtggaaccac agaggcaatc aggtccagcc ctaggcctcc aagcagaggc ctcccagagc 17100
tgggagggca agtgccgaag gaccactgat ccatcatccc cctgtttgtg ggagtggatg 17160
tttggggctc taaggatcgt tataaattct tggcagtgaa gttgaatttc actgtctgtg 17220
gctcatgcca ggtcactggg tccatttagt gggaatggtc tgtcactccc agtataggtc 17280
actcagacag agtgagaggc ctcaaggcat ccttggaacc agcttcctca ggctgcttgg 17340
gggacctgag ttttctatgt cacctccatg ccagctcggg tttctgagtg gtcaggggaa 17400
ctggataatg acttttgaag tggcagtccc ctgtcagagg actgactgtc ttcactcatc 17460
tttcggtaca agtgtttctg ggaaagttgc tgacaaggcc aaagtgtggg gggttattag 17520
tttttaatag aagagttgga ccggctttgc tttataacca gccaccttgg tctgcagctc 17580
gtttgcagac ttcagatggt ctgtgagaat tactgttagg aggggagctg aaggtggcca 17640
tacgttcccc ttgtccttga cttgtctggg cttcagttcc aaagaggggc cccagagccc 17700
atggtgcgga ggtgggggga caccgcactg tctctgtgat ctgtaccgta ccacctcagc 17760
tcccactggc acctgccttc ctgtgcctct tataaagcac caggaacatc ctcttgccta 17820
aaagtgcccc actagaccct gattacagga ttaagccatg atgagtgtcc aagctgggaa 17880
actgaattga atgacctctt aaagaccctt tcagatctgc attcacaatg caagctgagc 17940
ctcattccag gctttgcctg atgtgccaaa ggtggctact caccacagag ggaggtcaca 18000
gaagaagtcc ttgggttccg ggaaagattg ttatcataag ctatgttttg tgtcatatga 18060
aaacaagcaa ccattgtttg ttacccaccc atttcccaac atcctttcct tctgtcctct 18120
tacgcgttta tagatgatca ccctcctccc tgactcccca ccccttttct gttcttagga 18180
caaatctgtt cctctaggaa atggctggtt tattcccaca ggatacaaag cttaaaaaag 18240
aaaaatccat gtccaccaag tatgaacagg gaatagcaaa gtgggagaac tcaatcgcat 18300
tttcagagcc accgcagctg tcagtgggga gtctccaaat aggtcttcta cttaaacaaa 18360
gactaattaa attttagggg aagcagacat cccagggctc ccaggcaccc gagtcagcag 18420
gcagccctgc agggtctcct cttggatcca agtcttctgg aagcgaaggc gcttctgaaa 18480
cattaagcca tggtaattag cttgtccatc acttctctaa actccaactt taaaaagaaa 18540
ggcttaaaaa aagagaaaca aatgctttag ttattgttcc actttgacaa gcgaatccca 18600
cccttatctg agttctggac gtcatgatca ccattaccta gggccccata cacaggccct 18660
atgcaattta tgtacatttt ctctcatcct cagcataaac tggtaaagtg catcttgtcg 18720
ttatccaaag ccacttaaca aaccacccca aaatgtaaga tgttaaaaca accaccattt 18780
actctcactc atggttctgt gggttgatgg ggtactcgca gcttcatatg aatgcattca 18840
gctgaaggct tggttgagga gcctcagttc tcctacagtg atcacttttt ctcatcctct 18900
ggagcttatc atgcggtctt tcactccagt agaagagcct cagttcagtt cagttcagtt 18960
gttcagttgt gtccaactct atgaccccat agactgcagc atgccagacc tccctgtcca 19020
tcgccaactt ccggagttta ctcaaattca tgtccattga gtcagtgatg ccatccagcc 19080
atctcatcct ctgtcgtccc cttctcctcc tgccttcaat ctttcccagc atcagggtct 19140
cttccaatga gtcagttctt ctcatcaagt ggccaaagta ttggagtttc agcttcagcc 19200
tgagtccttc caatgagtat tcaggactga tttcctttag gatggactgg ttggatctcc 19260
ttgaagtcca agggactcac aagagtcttc tccaatacca caattcaaaa gcatcaattc 19320
tccggcactc agctttcttt atagtccaac tctcacatcc atacatgact actggaaaaa 19380
ccatagcctt gactagaggg acctttgttg ttggcaaagt gatgtctcta ctttttaata 19440
tgctgtctag gttggtcata acattccttc caaggagtaa gcgtctttta atttcatggc 19500
tgcagtcacc atctgcagtg attttggagc ccaagaagat aaagtctgtc actgtttccc 19560
catctatttg ccatgaagtg atgggaccag atgccatgta gaatagcctg cacttcctta 19620
aagcacagca gctccatccc aagaggcagg atcctgagat gatgagcccc cagtaagccc 19680
ccagggcttc tgaaagcact gtttgtattg tgcttcctgc tgtcccattg gccaaagcaa 19740
ctcacaccac caaggccaga atccgtgtgg gagggggctt cccaaggatg tgaacatcat 19800
atgacccacc agggctcctg atggaacagt ctgccacaga aggtactgtg aatccctctt 19860
ttatagatga gggccccgag gctcagagag gttcctcctg ttgcccaggg tcattcccca 19920
cagctcagga cagagggtcc aggtctgttg actccaggga atgtgttctt tgctgacaat 19980
actgggtcaa cctgatacag catgggaggg agacagacac caagagctga gcttcccagc 20040
ctctttaacc cagaggacag cccagaaggc tctctggccc cttggtgagt gttccaccag 20100
cagaccagag ccatggggct atgtgagggc aaaggcagca tcaggaagca ctgaagacat 20160
gctctgggcc cctgtcacag ttatagtcca ggtcctgtct acctcgccct ccttcagcac 20220
tggactgctt gtctgtaatg actggaatgc cttcccactt tagaaagcta gtcacatttc 20280
ctcgagaatg agggccctcc tgcctctgtg cttcccctga cgccagcgcc tacaacactg 20340
agctataacc acctggcatg tcactgtccc cccttctctg tggtggtctc ttaggggcat 20400
gggtcttcag gacccaactc tggcacggca cccacaccca gcaatggttg ggctgaactg 20460
aagggtcttc cttcttgggg cagctcagag tcttagcgta atgcccatgt tttctctgca 20520
gcccctcaaa atttaccaga catctgctgg gtaccctgca tgggctggga aacaagagga 20580
cactgcgtca tgtaaggccc atgttccagc ccaggttctt ttcttcatta gctgggtgac 20640
actgagaaag tcacctaacc tctctgagct cagcctctcc tggatcttca atacagacaa 20700
gaaccggtct cttttctgcc taactcaccc agggtcaaga gtcaacaaga attctaggct 20760
gagaaagtac ctcctgtgga aactgacata gcgtttctgt gtttgggatc cttctctttg 20820
agggtctgat ttgtagggct ttgatgcatt agagaaggaa atggcaaccc actccagtgt 20880
tcttgcctgg agaatcccgg ggacggggta gcctggtggg ctgccatcta tggggtcgca 20940
cagagtcaga cacgactgaa gtgacttagc agcagcagca gcagcaacaa agagttctct 21000
acactccaag agctttctac ttcctgaatc cctagatcta tcatgaagcc tgaaattgca 21060
ccatccatca ttcttttgat aaggtatttt tattatctat atccaaatgg tccctattaa 21120
aagatgccaa atgatctgga aagggtaacg tgttagcacc ggagcaaagc ctgctttacc 21180
attaatgaac atctcttgca agcttgttct ctgaaattga tgtgggaagg caagcaggtg 21240
tgagccttct ggagaccaag gtggtgatat ttatcaaaag ccttaaaggt gtgctcactc 21300
tttcatgcaa ggctttttgc ctcagaattt attctaacaa aacattgtgt tcaaaactgt 21360
atacatggaa gtcttattta tagtagcaca gaattataaa taacctaaat gtccaagaat 21420
aggtaacagg ctaaataatg gtgcatgtac aaggaaatac tgccaggact gctttccatg 21480
ggcctgtgat caggcagctc cacaggctcc tgttcccaga aggacccctg ccttggttta 21540
atgctctgct gtcactgtct taaaattctt gtgtgcttgc taagtcgctt cagttgtgtc 21600
cgactctttg caaccccaga actatagcct gccaggctcc tctgtctatg ggattctcca 21660
ggcaagaata ctggagtggg ttgccatgcc tttctccagg ggatcttccc aacccaggaa 21720
tcttacatct cctgcattgg caggcgggtt ctttaccatc cttaatcatt ctttaaaaag 21780
gggtcttcat tttcattttt tcctggctgg gccttacaaa ttatgtatcc atttcctata 21840
tactacataa caattaaaat gatgcttatg gagaatattt gtcaaagtgg aaaattgctt 21900
ctgttaaatg aagaaacggg tacaaaacca taattaatgc aaccctgaaa ccggcgtgtc 21960
ttatgtcttc tgcgttggca ggcgggttct ttaccacttg ggaagcccac tcttttaaaa 22020
aacaaaaaca ttatacatag agatcctggc aggttacagt ccatggggtc gaaaagagtg 22080
gaacacagct gagcaactaa cactttcaac tttcatacat agaggaaaaa agactggaca 22140
gaaatgcacc aaaatgttag agtaattatc tgtgaagaag caagattaca atattccttt 22200
tattactgtg atcttttttg agcatttctt gcattttcta ggatggaggg taggaatatg 22260
ctccttggct ctaatgtttc cagtagagac aaaagtgtat ctcttgtaac tgagcatcac 22320
ggttctttct tggcctctgg gtgcatctgg agccctctgt atgcagggga gacttctgaa 22380
taaacataaa gggcagctca gttgatgagg aggccaagtg ttcttatgag ctccttaaag 22440
ttgatttcag tccccacttc ccttcacagg ctgggtgtgc acaaggcgct cagcgaacgg 22500
tcattctgtc tatggcttga ggtcattggc agcctttacc ctacacccac cttctcagac 22560
gttcattctg ctctgactga ggtggaacct tccctctggc ttggggctgg acatgcgccc 22620
ccccaagtga tctctggacc agggaaagaa gccgctctca ccccaagtcc ccccatgccc 22680
ctcgccctct gggctccggg agcagagggc agcttgattc ctgggtggaa ctggggacac 22740
accggctcca cctgtcccct ttgtgcccgc ctctcacggc aggcttcatc ccaacagtag 22800
ggggcggtag agatcagcaa acccaggctg gagactgggg gtggagtagg aaggggcagg 22860
tggtggtcca gtagggagtg gacccctcac tccacaccca cttcctagat tcctcctgct 22920
ctcctaaatc cttttcaggc aattgctaac tgtcttctca gctaagcagg gcaggaacac 22980
aagaatccta gaagcttacc tctgtgtagc caaggcctct tgagttcatg gcctctgacc 23040
acctcatatg acaaatgagg acactggggc tcagagaagt gatggacttg ctcagagcct 23100
cacagtgaag ggacacatgg ggttctgacc tctccaggag gtagggcaga gctcaatgga 23160
ccggaggtgg gcagctgcag ataggggaga cgcccactgc tcacaggtcc cagtctagcc 23220
catgggcttc cgggctgtct cccgtctaaa ttccagcact cccagctctg tatttctggg 23280
tagatccatg tgcagagact gggcctcctc ctgctgtctg tctggccatc agcacgccca 23340
gtacctgtgg tggcacacga ggcgcaggga agatgtgaga gctcaaaggt ggggtagggg 23400
gcaggggttg gcggcctgac cagaagggca gacaggttgc ttcttcctct ttccccactg 23460
cggtcccctg gaacctgaac cggacacgga acccatcttg aggagcttcc tgagcatgtt 23520
ccgcatccgt gcccgcccca gccccattct cagcctttgc actgtcagcc ccaccccagt 23580
gactttttct ctcctaatta cccatttaca tttatgaagg tttttgtaaa ttttaaaact 23640
gatttgcatg tgatgggcaa ggagcacgag gctgtagatt tctctaatga aactgacttg 23700
agcgcaccct ggattctcaa ggttggggct gcccctaccc caaagcccag gggctgctgg 23760
ctccagaatg acaactgtat ttttttgcct cggcagacca cggtgagctg ggatggggac 23820
aagctcgagt gtgtgcagaa gggcgagaag cagggacgtg gctggaccca gtggattgag 23880
ggtgacgagc tgcacctggt aggttctgga ggtcgggaag gtggatgggt aagccacgct 23940
ggaccccaca ggtcctggtc atgctggggc ctgagcggac tttggaaaaa tgcaccattt 24000
ctgggccttg gctttgctct gaaacttctc ttccaaggcc ctggagaaga tgcttgagtg 24060
atttgaaaaa cagagcaatg tgtttaaggt ctgggctgac ccaattgtcc aatcagaggg 24120
aggtgaggag gtgcatctgc taaccatcag atgtggaacc tttagcattc catatctctt 24180
tccattgtct cagcaaccat atgggccagg tactgttgtg attcttcttt tggagacgac 24240
gtggaggctc acatcccagt aacacagcta gaagatgaca taacttacat gtgctcccaa 24300
atgatacccg ttttcaccat gccaaattgt ggctagccag aaccagggtg acttctctaa 24360
gcttctcaag acatgatctt gctaccccag aactgggttc acctcttggt gggtgtcaag 24420
cccaaagata caaccaagcc acagactggg agaaggaagg atttattact tgcagcaagt 24480
aagaacactg ggcatttttc tgaaagccat gtcttcccaa acagcaaaat tggggaagtt 24540
ttaagccaag ggctcatgcg tattcatgaa gggacttgag cagagaagaa ttcagcattg 24600
agatgggaca aaggtcgaca gagtccaagc tttaattgat ggaagttgca agggtcagaa 24660
aatgtccatc cttcacctga gcgggggctt tagttccttc agaacccaga gattgttatg 24720
tgcatccctt gagaaggaac ccagcctctg tttatcacag ttccttgact ccttttcctt 24780
gattcctgca tttcttcact tcccttaaga tcattactta ctcagacctg tttgagggca 24840
ggcattagat cacaaaatgg cttcagtcaa aagtggtttc ttttatgtcc aaggaccccc 24900
taccctatct gctcacaatc tcaacagtct gggtcgggag aggagaagcc tttcttggct 24960
caggtgtggg cccctccctc acccggtcct ccagcctggg accgctggtt aaagccgcgt 25020
ctacgctatc attatcggga aaaagcacat ccgcatccag agtaggggcc ttagcccctg 25080
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aactctgtgt tctgagaagg gagccacata caggtgacca gggttctatt ctgactcgcc 25200
aggtactttg gggagctgct ttctttccct caacctcatc tggaaaacac catcctacca 25260
caaagggctt ctgccaagat cagggtctgt aggagcttca ggacgtgtgt gccctaagaa 25320
gaggcacaag gacatcatat tcagaggcag cttaatagcc tgggctgcaa tgcctgacct 25380
gaccctgagc ctccacttcc ccagctgcag agcaatcagg gtgggttatg tgatgatctt 25440
catcagccct ttcagctcaa aagttccgtg actttttgcc agaggttaca aagtaggggc 25500
cacaggcatc ttttatttgg ccatccatgg gcttcacact ttttcagcta acaacttaaa 25560
aattaggaga tgttacataa atattcaaat ttccagcctc ctgcccaaaa aaaaaaaaaa 25620
aaaaattgga aggtgtagaa acactgtgct atcgttcttg ctggcgacat tcagcagggg 25680
ctgccctgct gcattttagt actacctggg agcttttaat gtagcaattc caggactcca 25740
cccactgaaa tgctgatata actagtctag cctgggaccc aggcattttt caaactccct 25800
aggtaacgcc aatgtgcagc tggagcttag aaccaccatg ccagtttgca accctggtct 25860
cagtgacctg agacctgtta agccctttag gggttgagcc ttgcttctgg ccctgatttc 25920
ttgcaaatct gggcacggtc tctgacctgg gctcaggcct ggtgttctta aagccttttg 25980
gctccttgag ggtagtggga ggaaggaggc atccgagggt cctcttggtc agctctgagc 26040
cacatctgtc tccagccagc tctatctaga gggcatagcc aagactgatg tcccccgacc 26100
cagctcatct gactctccaa ggaattgtct cattcagacc aactcttgcg gaaaaatagc 26160
agtcacagag tattttcaga gttcctgccc ctggacatgc tgagccccaa gtgtgacctt 26220
gctttggcca ataacaagaa tctgtttttg tttcaggaga tgagagtgga gggtgtggtc 26280
tgcaagcaag tattcaaaaa ggtgaactga agcttgagca catcttggtc tctaggaatg 26340
agtgacatga cgggacaccg gggtcccccc ctttctgcac agcatgggcg cagagatgcc 26400
tggctacccc cgcctctgtt agcagagtct gtctcttggt gttgtctgtt ttccttgtct 26460
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9

Claims (8)

1.一种RBP1基因，其特征在于，所述RBP1基因为评估绵羊卵巢体外培养发育质量的分子标记，且所述RBP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的分子标记RBP1基因在评估绵羊卵巢体外培养发育质量中的应用。
3.一种评估绵羊卵巢体外培养发育质量的方法，其特征在于，选择绵羊第1号染色体RBP1基因的启动子区域设计扩增引物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如下所示：
上游扩增引物F：5’-AGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
下游扩增引物R：5’-GTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增引物前添加酶切位点；
其中，上游扩增引物添加Cla I酶切位点后的核苷酸序列如下：
F：5’-ATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
下游扩增引物添加BsmB I酶切位点后的核苷酸序列如下：
R：5’-CGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，选择前面添加酶切位点的扩增引物5’端加上保护碱基：
其中，在添加Cla I酶切位点后的上游扩增引物5’端添加CCA，得到加上保护碱基的上游扩增引物，其核苷酸序列为：
F：5’-CCAATCGATAGCAGGGTGACAGTCTACAG-3’；
添加BsmB I酶切位点后的下游扩增引物5’端添加TGC，得到加上保护碱基的下游扩增引物，其核苷酸序列为：
R：5’-TGCCGTCTCGTTCCTCAGACCTTCAGTTC-3’。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括具有如下核苷酸序列的鉴定引物：
上游鉴定引物F：5’-ATTGGAGTGGGAGGAGAA-3’，
下游鉴定引物R：5’-GGCATTTATGGGAGTATTGT-3’。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
(1)绵羊卵巢组织基因组的提取；
(2)绵羊RBP1基因启动子的扩增；
(3)RBP1基因启动子序列同pLV-mCherry构建重构载体；
(4)介导RBP1基因启动子-mCherry转染病毒包装；
(5)绵羊卵巢组织的体外培养；
(6)RBP1基因启动子-mCherry在绵羊卵巢组织卵母细胞中的表达；
(7)红色荧光蛋白mCherry在绵羊卵巢卵母细胞中荧光表达水平检测；
(8)绵羊卵巢组织和卵母细胞体外培养体系的完善和优化。
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