CN114395586A - 非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了非整合慢病毒载体系统在制备碱基编辑器递送产品中的应用，所述非整合慢病毒载体系统转染宿主细胞后能获得非整合的慢病毒，所述非整合慢病毒载体系统包括表达碱基编辑器的重组慢病毒载体、表达整合酶的质粒和表达VSV囊膜G蛋白的质粒。本发明提供的利用慢病毒载体递送碱基编辑器的方法，可以将碱基编辑器完整的插入同一载体中，并且将整合酶进行突变，使其不能整合至宿主染色体中，能够高效且相对安全的递送碱基编辑器至靶细胞中，实现特定位点的基因编辑。

Description

非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用。

背景技术

遗传疾病是临床治疗的难题，目前绝大部分遗传疾病都没有有效的治疗手段。基因编辑是消除这类疾病的有效方法之一，利用基因编辑技术只需一次治疗就可长期改变病人的DNA，达到永久治愈的效果。迄今为止，已知的人类致病性突变中，约一半是点突变(也称为单核苷酸多态性,single nucleotide polymorphism,SNP)。高效、准确地纠正致病性SNP对于研究和治疗遗传性疾病具有重要意义。

碱基编辑(base editing,BE)无需产生DNA双链断裂，也无需供体DNA的参与，可实现靶位点的精准点突变，在单核苷酸遗传疾病治疗上具有重大应用前景。现有的碱基编辑器主要有胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor，CBE)，可将一定窗口内的胞嘧啶核苷酸转化为胸腺嘧啶核苷酸(C>T)；腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor，ABE)，可将一定窗口内的腺嘌呤核苷酸转化为鸟嘌呤核苷酸(A>G)以及新型糖基化酶碱基编辑器(Glycosylase base editor,GBE)，在大肠杆菌中可将胞嘧啶核苷酸编辑成腺嘌呤核苷酸、在哺乳动物细胞中可将胞嘧啶核苷酸特异性编辑成鸟嘌呤核苷酸。

如何将碱基编辑器高效递送至靶细胞是当前基因治疗领域面临的一大难题。主要的递送载体包括病毒类载体和非病毒类载体，其中病毒类载体包括慢病毒、AAV病毒(腺相关病毒)和腺病毒。其中AAV病毒是目前应用比较广的一种载体，但是其一个缺点是其包装容量有限，仅能包装4.7kb以内的片段，而碱基编辑器一般在5kb以上，因此在同一载体中不能容纳整个碱基编辑器，需要将碱基编辑器进行拆分成两段才能通过AAV进行递送。慢病毒载体的包装容量较大，可以将碱基编辑器完整的插入同一载体中，但是经典的慢病毒载体会将其基因组整合至宿主染色体中，从而存在一定的插入突变的风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何用慢病毒载体系统实现碱基编辑器非整合递送。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供非整合慢病毒载体系统在制备碱基编辑器递送产品中的应用，所述非整合慢病毒载体系统转染宿主细胞后能获得非整合的慢病毒，所述非整合慢病毒载体系统包括表达碱基编辑器的重组慢病毒载体、表达整合酶的质粒和表达VSV囊膜G蛋白的质粒。

本发明中，所述非整合慢病毒载体系统可为载体组合物。

本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。

进一步地，上述的应用中，所述整合酶是将HIV整合酶的第64位氨基酸由D(天冬氨酸)突变为V(缬氨酸)，保持HIV整合酶的其它氨基酸不变得到的蛋白质。

本发明中，所述整合酶是氨基酸序列是SEQ ID No.6所示的蛋白质。

上述突变获得的突变整合酶丧失了整合活性，没有将慢病毒载体上的基因整合到宿主基因组中的能力。

进一步地，上述的应用中，所述碱基编辑器为CBE碱基编辑器、ABE碱基编辑器或PE碱基编辑器中的一种或几种；

所述CBE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和胞嘧啶脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述ABE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和腺嘌呤脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述PE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和逆转录酶，所述定位系统为pegRNA。

进一步地，上述的应用中，所述Cas9n为具有单条链切割活性的突变体Cas9(D10A)或为具有单条链切割活性的突变体Cas9(H840A)。

本发明中，所述重组慢病毒载体还含有筛选基因，所述筛选基因包括但不限于嘌呤霉素基因。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供递送碱基编辑器的非整合慢病毒载体的制备方法，包括下述步骤：

a)构建表达碱基编辑器的重组慢病毒载体；

b)将步骤a)的重组慢病毒载体与表达整合酶的质粒和表达VSV囊膜G蛋白的质粒转染宿主细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞；

c)收获步骤b)的培养物，从所述培养物中收集慢病毒载体颗粒，该慢病毒载体颗粒即为所述非整合慢病毒载体。

进一步地，上述的方法中，a)中所述碱基编辑器选自：CBE碱基编辑器、ABE碱基编辑器或PE碱基编辑器中的一种或几种，

所述CBE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和胞嘧啶脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述ABE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和腺嘌呤脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述PE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和逆转录酶，所述定位系统为pegRNA。

可用现有的碱基编辑器表达载体构建步骤a)的重组慢病毒载体。如可用BE4max或hyeA3A-BE3构建表达所述CBE碱基编辑器的重组慢病毒载体，可用SpRY-ABE构建表达所述ABE碱基编辑器的重组慢病毒载体，可用pCMV-PE2构建表达所述PE碱基编辑器的重组慢病毒载体。

本发明中，所述BE4max在Addgene公司购买，货号为#112099。

本发明中，所述hyeA3A-BE3在Addgene公司购买，货号为#113410。

本发明中，所述SpRY-ABE在Addgene公司购买，货号为#140003。

本发明中，所述pCMV-PE2在Addgene公司购买，货号为#132775。

本发明中，CBE碱基编辑器和ABE碱基编辑器所述的Cas9n蛋白可为Cas9(D10A)。

本发明中，PE碱基编辑器所述的Cas9n蛋白可为Cas9(H840A)。

本发明中，所述Cas9(D10A)可为由SEQ ID No.1第844-4944位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，所述Cas9(H840A)可为由SEQ ID No.4第58-4158位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，所述胞嘧啶脱氨酶可为由SEQ ID No.1第64-747位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质，或所述胞嘧啶脱氨酶可为由SEQ ID No.2第103-696位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，所述腺嘌呤脱氨酶可为由SEQ ID No.3第58-555和第652-1149位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，所述逆转录酶可为由SEQ ID No.4第4258-6351位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，CBE碱基编辑器中所述的融合蛋白可为由SEQ ID No.1第64-5502位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质，或所述的融合蛋白可为由SEQ ID No.2第103-5889位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，ABE碱基编辑器中所述的融合蛋白可为由SEQ ID No.3第58-5346位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

本发明中，PE碱基编辑器中所述的融合蛋白可为由SEQ ID No.4第58-6351位核苷酸所示的编码基因编码的蛋白质。

进一步地，上述的方法中，b)中所述宿主细胞为HEK293T细胞。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供重组细胞，所述重组细胞含有上述应用中的所述非整合慢病毒载体系统。

进一步地，上述的重组细胞中，所述细胞选自下述C1)-C3)中任一种：

C1)真核细胞；

C2)酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞；

C3)人细胞。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述方法获得的非整合慢病毒载体。

本发明提供了一种利用慢病毒载体递送碱基编辑器的方法，将碱基编辑器和gRNA完整的插入同一载体中，通过突变慢病毒的整合酶实现慢病毒载体不能整合至宿主染色体中的目的。该方法能够高效且相对安全的递送碱基编辑器至靶细胞中，实现特定位点的基因编辑。因此，利用慢病毒包装碱基编辑器，在感染宿主细胞时使其不整合至宿主染色体，在宿主细胞中发挥瞬时基因编辑的作用，是一种相对安全且高效的方法。

附图说明

图1为重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-BE4max-gRNA的图谱。

图2为慢病毒载体递送碱基编辑器BE4max的编辑效率。

图3为慢病毒载体递送碱基编辑器hA3ABE3max的编辑效率。

图4为BE4max非整合慢病毒的编辑效率。

图5为hyeA3ABE3max非整合慢病毒的编辑效率。

图6为重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-hyeA3ABE3max-gRNA的图谱。

图7为重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax-gRNA的图谱。

图8为慢病毒载体递送碱基编辑器SPRY ABEmax的编辑效率。

图9为SPRY ABEmax非整合慢病毒的编辑效率。

图10为重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-PE-pegRNA的图谱。

图11为慢病毒载体递送PE碱基编辑器的编辑效率。

图12为PE非整合慢病毒的编辑效率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

碱基编辑器pCMV_BE4max_P2A_GFP在Addgene公司购买，货号为#112099，本发明中简称BE4max。

碱基编辑器pCMV hA3A-BE3在Addgene公司购买，货号为#113410，本发明中简称hyeA3A-BE3。

碱基编辑器pCMV-T7-ABEmax(7.10)-SpRY-P2A-EGFP(RTW5025)在Addgene公司购买，货号为#140003，本发明中简称SpRY ABEmax。

碱基编辑器pCMV-PE2在Addgene公司购买，货号为#132775，本发明中简称PE。

慢病毒载体pLentiCRISPRV2，购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号是P0114。

pspAX2质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号是P0261。

pMD2.G质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号是P0262。

HEK293T细胞(实施例中用293T表示)为本实验室保存，在文献“Dongdong Zhao,JuLi,Siwei Li,Xiuqing Xin,Muzi Hu,Marcus A Price,Susan J Rosser,Changhao Bi,Xueli Zhang New base editors change C to A in bacteria and C to G inmammalian cells.Nature Biotechnol 2020-07”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、非整合性慢病毒递送CBE实现特定位点的编辑

利用非整合性慢病毒包装CBE碱基编辑器，收获病毒粒子后感染靶细胞，可以实现特定位点的基因编辑，是一种相对安全且高效的方法。

实验过程：将目前常用的BE4max和hyeA3ABE3max CBE碱基编辑器的编码基因分别构建至慢病毒载体中，同时在载体中表达嘌呤霉素基因，可以用于后续的筛选。此外在N端U6启动子后面通过Golden gate的方式插入对应的gRNA序列。

具体的构建方法如下：

步骤1：以BE4max碱基编辑器表达载体的全长质粒为模板，以下述引物对BE4max-F/BE4max-R作为扩增引物分别进行PCR扩增获得目的片段。

具体引物序列如下(小写表示同源臂)：

BE4max-F：5'-aacacaggaccggttctagaGCCACCATGAAACGGAC-3'；

BE4max-R：5'-aagtttgttgcgccggatccGACTTTCCTCTTCTTCT-3'。

以hyeA3ABE3max碱基编辑器表达载体的全长质粒为模板，以下述引物对hyeA3ABE3max-F/hyeA3ABE3max-R作为扩增引物分别进行PCR扩增获得目的片段。

具体引物序列如下(小写表示同源臂)：

hyeA3ABE3max-F：5'-aacacaggaccggttctagaGGTTTAGTGAACCGTCA-3'；

hyeA3ABE3max-R：5'-aagtttgttgcgccggatccGACTTTCCTTTTCTTCT-3'。

步骤2：通过XbaI和BamHI双酶切慢病毒载体pLentiCRISPRV2，获得线性化的酶切片段。将上述PCR产物分别与上述酶切产物(酶切获得的大片段)同源重组连接，获得含有碱基编辑器编码基因的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-BE4max和重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-hyeA3ABE3max。

步骤3：选择ZNF410基因组的特定序列5'-TAGCCTCCGAAAACATCTGG-3'作为gRNA的靶标位点，将其命名为ZNF410-gRNA-9#。ZNF410-gRNA-9#位于ZNF410基因组，ZNF410基因的GenBank编号为KJ903016.1，共计1425bp。设计引物退火合成含有靶标位点的DNA片段，分别通过Goleden gate的方式(BsmbI购自NEB公司)构建至步骤2获得的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-BE4max和重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-hyeA3ABE3max，获得重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-BE4max-gRNA和重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-hyeA3ABE3max-gRNA。

测序结果表明：重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-BE4max-gRNA是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的所示的基因替换慢病毒载体pLentiCRISPRV2的XbaI和BamHI识别位点间的片段(XbaI和BamHI识别位点间的小片段)，同时将慢病毒载体pLentiCRISPRV2第2239-4119位位替换为ZNF410-gRNA-9#，保持pLentiCRISPRV2的其它序列不变得到的重组表达载体。

SEQ ID No.1第64-747位为胞嘧啶脱氨酶APOBEC-1的编码基因，第844-4944位为Cas9(D10A)的编码基因，第4975-5223和5254-5502位为尿嘧啶糖基化抑制酶(UGI)的编码基因。

重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-hyeA3ABE3max-gRNA是用核苷酸序列是SEQ IDNo.2的所示的基因替换慢病毒载体pLentiCRISPRV2的XbaI和BamHI识别位点间的片段(XbaI和BamHI识别位点间的小片段)，同时将慢病毒载体pLentiCRISPRV2第2239-4119位位替换为ZNF410-gRNA-9#，保持pLentiCRISPRV2的其它序列不变得到的重组表达载体。

SEQ ID No.2第103-696位为胞嘧啶脱氨酶hA3A的编码基因，第793-1134位为HumanRAD51-1-114的编码基因，第1231-5331位为Cas9(D10A)的编码基因，第5362-5610和5641-5889位为尿嘧啶糖基化抑制酶(UGI)的编码基因。

步骤3获得的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-BE4max-gRNA和pLentiCRISPRV2-hyeA3ABE3max-gRNA的图谱分别如图1和图6所示。

首先将HEK293T细胞按5×10⁵个铺24孔板，待每个孔细胞长至40％-60％时，将步骤3获得的重组慢病毒质粒转染至293T细胞中，每孔转染质粒的量为0.5μg，PEI 1.5μl。具体转染过程如下：在两个1.5mL EP管中分别加入无血清的DMEM 25μL，其中一管中加入0.5μg含有碱基编辑器的慢病毒质粒混匀，另一管中加入1.5μl的转染试剂PEI混匀，然后将含有转染试剂的DMEM转入含有质粒的EP管中混匀，室温静置15min，然后将混合物均匀的滴入24孔板中。每种质粒组合转染设3个重复，转染24小时后添加4ug/ml嘌呤霉素(Merck USA)到培养基中。转染72小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp～300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行Sanger测序计算编辑效率(金唯智，中国)。

然后构建整合酶功能缺失的突变质粒pspAX2-D64V，pspAX2-D64V质粒是在pspAX2的基础上获得的整合酶失活的突变质粒。具体的构建方式如下：设计点突变上游引物F：ctagTAtgtacacatttagaaggaaaagt和下游引物R：atgtgtacaTActagctgccatattcct，用以上引物以psPAX2质粒为模板进行PCR，获得片段胶回收后用DpnI进行酶切消化去除模板质粒，然后进行转化后送测序，经测序正确后用于后续实验。测序结果表明pspAX2-D64V第5220至6086位核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码的整合功能缺失的整合酶是氨基酸序列是SEQ ID No.6所示的蛋白质。将pspAX2-D64V与步骤3获得的重组慢病毒载体以及表达VSV囊膜G蛋白的质粒pMD2.G共转染至293T 150mm的细胞培养皿中，转染6小时后换取新鲜的含有血清和双抗的培养基DMEM(购买自Gibco公司)，转染48小时后收获病毒上清，高速离心去除细胞碎片后进行超速离心，收集病毒沉淀，用1mL DMEM进行重悬，然后过滤后感染293T细胞，其中293T细胞铺于24孔板中，感染剂量为100ul/孔，感染36小时换取含有2ug/ml嘌呤霉素(Merck,USA)的培养基进行筛选。筛选72小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp～300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行高通量测序计算编辑效率(金唯智，中国)。

实验结果：将转染后细胞裂解PCR后进行测序，结果显示通过慢病毒载体递送的碱基编辑器BE4max或者hyeA3ABE3max转染293T细胞后可以在特定位点进行基因编辑，结果如图2和图3所示所示。图2中，特定编辑位点为左起第七位碱基C，其突变为T的比例为67％；图3中，特定编辑位点为左起第七位碱基C，其突变为T的比例为66％。所以，BE4max碱基编辑器在ZNF410-gRNA-9#位点的C>T的编辑效率为67％(图2)；hyeA3ABE3max碱基编辑器在ZNF410-gRNA-9#位点的C>T的编辑效率为66％(图3)。该结果证明将碱基编辑器装载至慢病毒中，能够正常表达，且发挥其基因编辑功能。

利用该整合酶功能缺失的慢病毒载体包装的病毒粒子感染293T细胞，经过嘌呤霉素筛选后取细胞进行测序分析，结果显示非整合慢病毒载体可以成功地将碱基编辑器递送至293T细胞中，并且对特定位点可以进行高效的编辑，结果如图4和图5所示。图4中，特定编辑位点为左起第七位碱基C，其突变为T的比例为36％；图5中，特定编辑位点为左起第七位碱基C，其突变为T的比例为29％。所以，非整合慢病毒包装的BE4max碱基编辑器在ZNF410-gRNA-9#位点的C>T的编辑效率为36％(图4)；非整合慢病毒包装的hyeA3ABE3max碱基编辑器在ZNF410-gRNA-9#位点的C>T的编辑效率为29％(图5)。

实施例2、非整合性慢病毒递送ABE实现特定位点的编辑

利用非整合性慢病毒包装ABE碱基编辑器，收获病毒粒子后感染靶细胞，可以实现特定位点的基因编辑，是一种相对安全且高效的方法。

实验过程：将目前常用的SpRY ABEmax碱基编辑器的编码基因构建至慢病毒载体中，具体的构建方法如下：

步骤1：以SpRY ABEmax碱基编辑器的全长质粒为模板，以下述引物对SpRYABEmax-F/SpRY ABEmax-R作为扩增引物分别进行PCR扩增获得目的片段。

具体引物序列如下(小写碱基为同源臂)：

SpRY ABEmax-F：5'-aacacaggaccggttctagaATGAAACGGACAGCCGA-3'；

SpRY ABEmax-R：5'-aagtttgttgcgccggatccGACTTTCCTCTTCTTCT-3'。

步骤2：通过XbaI和BamHI双酶切慢病毒载体pLentiCRISPRV2，获得线性化的酶切片段。将步骤1的PCR产物分别与上述酶切产物(酶切获得的大片段)同源重组连接，获得含有ABE碱基编辑器的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax。

步骤3：选择36H基因组的特定序列5'-GCATAGACTGCGGGGCGGGC-3'作为gRNA的靶标位点，将其命名为36H-gRNA。36H-gRNA位于36H基因组，36H基因的GenBank编号为AC093241.4。设计引物退火合成含有靶标位点的DNA片段，分别通过Goleden gate的方式(BsmbI购自NEB公司)构建至步骤2获得的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax，获得重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax-gRNA。

测序结果表明：重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax-gRNA是用核苷酸序列是SEQ ID No.3的所示的基因替换慢病毒载体pLentiCRISPRV2的XbaI和BamHI识别位点间的片段(XbaI和BamHI识别位点间的小片段)，同时将慢病毒载体pLentiCRISPRV2第2239-4119位替换为36H-gRNA，保持pLentiCRISPRV2的其它序列不变得到的重组表达载体。

SEQ ID No.3第58-555位和第652-1149位为腺嘌呤脱氨酶TadA的编码基因，第1246-5346位为Cas9(D10A)的编码基因。

步骤3获得的重组慢病毒载体的图谱如图7所示。

首先将HEK293T细胞按5×10⁵个铺24孔板，等每个孔细胞长至40％-60％时，将步骤3获得的慢病毒质粒pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax-gRNA转染至293T细胞中，每孔转染质粒的量为0.5μg，PEI 1.5μl。转染方法与实施例1相同。每种质粒组合转染设3个重复，转染24小时后添加4ug/ml嘌呤霉素(Merck,USA)到培养基中。转染72小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp～300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行高通量测序计算编辑效率(金唯智，中国)。

然后将整合酶功能缺失的突变质粒pspAX2-D64V(实施例1)与步骤3获得的慢病毒载体pLentiCRISPRV2-SpRY ABEmax以及表达VSV囊膜G蛋白的质粒pMD2.G共转染至293T150mm的细胞培养皿中，转染6小时后换取新鲜的含有血清和双抗的培养基DMEM(购买自Gibco公司)，转染48小时后收获病毒上清，高速离心去除细胞碎片后进行超速离心，收集病毒沉淀，用DMEM进行重悬，然后过滤后感染293T细胞，感染36小时换取含有2ug/ml嘌呤霉素(Merck,USA)的培养基进行筛选。转染72小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp～300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行高通量测序计算编辑效率(金唯智，中国)。

实验结果：选择36H gRNA位点进行编辑活性的分析。将转染后细胞裂解PCR后进行测序，结果显示通过慢病毒载体递送的碱基编辑器转染293T细胞后可以在特定位点进行基因编辑，结果如图8所示，图8中，特定编辑位点为第一行左起第5位碱基A，其突变为T的比例为63％，所以SpRY ABEmax碱基编辑器在36H-gRNA位点(A＞G)编辑效率为63％(图8)。该结果证明将碱基编辑器装载至慢病毒中，能够正常表达，且发挥其基因编辑功能。

利用该整合酶功能缺失的慢病毒载体包装的病毒粒子感染293T细胞，经过嘌呤霉素筛选后取细胞进行测序分析，结果显示慢病毒载体可以成功地将碱基编辑器递送至293T细胞中，并且对特定位点可以进行高效的编辑，结果如图9所示，图9中，特定编辑位点为第一行左起第5位碱基A，其突变为T的比例为42％，所以非整合慢病毒包装的SpRY ABEmax碱基编辑器在36H-gRNA位点(A＞G)的编辑效率为42％(图9)。

实施例3、非整合性慢病毒递送PE系统实现特定位点的编辑

利用非整合性慢病毒包装PE系统，收获病毒粒子后感染靶细胞，可以实现特定位点的基因编辑，是一种相对安全且高效的方法。

实验过程：将目前常用PE精准编辑系统的编码基因构建至慢病毒载体中，同时在载体中表达嘌呤霉素基因，可以用于后续的筛选。具体的构建方法如下：

步骤1：以PE碱基编辑器的全长质粒为模板，以下述引物对作为扩增引物分别进行PCR扩增获得目的片段。

具体引物序列如下(小写为同源臂)：

PE-F：5'-aacacaggaccggttctagaATGAAACGGACAGCCGA-3'；

PE-R：5'-aagtttgttgcgccggatccGACTTTCCTCTTCTTCT-3'。

步骤2：通过XbaI和BamHI双酶切慢病毒载体pLentiCRISPRV2，获得线性化的酶切片段。将步骤1的PCR产物分别与上述酶切产物(酶切获得的大片段)同源重组连接，获得含有PE碱基编辑器的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-PE。

步骤3：选择VEGFA基因组的特定序列5'-GATGTCTGCAGGCCAGATGA-3'作为gRNA的靶标位点，将其命名为VEGFA-gRNA。VEGFA-gRNA位于VEGFA基因组，VEGFA基因的GenBank编号为AC103801.2。RT模板的序列为AATGTGCCATCTGGAGCGGGCA，PBS的序列为TCTGGCCTGCAGA。由擎科公司合成该pegRNA基因，序列为AAAGGACGAAACACCGATGTCTGCAGGCCAGATGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAATGTGCCATCTGGAGCGGGCATCTGGCCTGCAGACTAGCTAGGTCTTGA(SEQ ID No.5)，通过退火的方式形成161bp的双链，然后pLentiCRISPRV2-PE载体则通过BsmBI和NheI进行酶切后获得载体片段，然后将两者通过同源重组的方式进行连接，经过测序正确后获得的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-PE-pegRNA进行后续实验。

测序结果表明：重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-PE-pegRNA是用核苷酸序列是SEQ ID No.4的所示的基因替换慢病毒载体pLentiCRISPRV2的XbaI和BamHI识别位点间的片段(XbaI和BamHI识别位点间的小片段)，同时用核苷酸序列是SEQ ID No.5第16-146位所示的基因替换慢病毒载体pLentiCRISPRV2的BsmBI和NheI识别位点间的片段(BsmBI和NheI识别位点间的小片段)，保持pLentiCRISPRV2的其它序列不变得到的重组表达载体。

SEQ ID No.4第58-4158位为Cas9(H840A)的编码基因，第4258-6351位为逆转录酶(RT)的编码基因。

步骤3获得的重组慢病毒载体pLentiCRISPRV2-PE-pegRNA的图谱如图10所示。

首先将HEK293T细胞按5×10⁵个铺24孔板，等每个孔细胞长至40％-60％时，将步骤3构建的pLentiCRISPRV2-PE转染至293T细胞中，每孔转染质粒的量为0.5μg，PEI 1.5μl。具体转染方法同实施例1。每种质粒组合转染设3个重复，转染24小时后添加4ug/ml嘌呤霉素(Merck,USA)到培养基中。转染72小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp～300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行高通量测序计算编辑效率(金唯智，中国)。

然后将整合酶功能缺失的突变质粒pspAX2-D64V与步骤3构建的pLentiCRISPRV2-PE以及表达VSV囊膜G蛋白的质粒pMD2.G共转染至293T 150mm的细胞培养皿中，转染6小时后换取新鲜的含有血清和双抗的培养基DMEM(购买自Gibco公司)，转染48小时后收获病毒上清，高速离心去除细胞碎片后进行超速离心，收集病毒沉淀，用DMEM进行重悬，然后过滤后感染293T细胞，感染36小时换取含有2ug/ml嘌呤霉素(Merck,USA)的培养基进行筛选。转染72小时后使用快速提取DNA提取液(Epicentre,USA)提取基因组DNA，对被编辑位点附近200bp～300bp区域利用Taq DNA聚合酶(康为世纪，中国)PCR，将PCR产物进行高通量测序计算编辑效率(金唯智，中国)。

实验结果：将转染后细胞裂解PCR后进行测序，结果显示通过慢病毒载体递送的碱基编辑器转染293T细胞后可以在特定位点进行基因编辑，结果如图11所示，图11中，特定编辑位点为第一行左起第2-4位碱基CCT，其突变为GGG的比例分别为42％、30％、33％(图11)。该结果证明将碱基编辑器装载至慢病毒中，能够正常表达，且发挥其基因编辑功能。

利用该慢病毒载体包装的病毒粒子感染293T细胞，经过嘌呤霉素筛选后取细胞进行测序分析，结果显示慢病毒载体可以成功地将碱基编辑器递送至293T细胞中，并且对特定位点可以进行定点编辑，结果如图12所示，图12中，特定编辑位点为第一行左起第2-4位碱基CCT，其突变为GGG的比例分别为16％、12％、16％(图12)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 非整合慢病毒载体系统在基因编辑器递送中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5565

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaccatga aacggacagc cgacggaagc gagttcgagt caccaaagaa gaagcggaaa 60

gtctcctcag agactgggcc tgtcgccgtc gatccaaccc tgcgccgccg gattgaacct 120

cacgagtttg aagtgttctt tgacccccgg gagctgagaa aggagacatg cctgctgtac 180

gagatcaact ggggaggcag gcactccatc tggaggcaca cctctcagaa cacaaataag 240

cacgtggagg tgaacttcat cgagaagttt accacagagc ggtacttctg ccccaatacc 300

agatgtagca tcacatggtt tctgagctgg tccccttgcg gagagtgtag cagggccatc 360

accgagttcc tgtccagata tccacacgtg acactgttta tctacatcgc caggctgtat 420

caccacgcag acccaaggaa taggcagggc ctgcgcgatc tgatcagctc cggcgtgacc 480

atccagatca tgacagagca ggagtccggc tactgctggc ggaacttcgt gaattattct 540

cctagcaacg aggcccactg gcctaggtac ccacacctgt gggtgcgcct gtacgtgctg 600

gagctgtatt gcatcatcct gggcctgccc ccttgtctga atatcctgcg gagaaagcag 660

ccccagctga ccttctttac aatcgccctg cagtcttgtc actatcagag gctgccaccc 720

cacatcctgt gggccacagg cctgaagtct ggaggatcta gcggaggatc ctctggcagc 780

gagacaccag gaacaagcga gtcagcaaca ccagagagca gtggcggcag cagcggcggc 840

agcgacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 900

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 960

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 1020

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 1080

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 1140

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 1200

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 1260

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 1320

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 1380

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 1440

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 1500

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 1560

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 1620

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 1680

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 1740

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 1800

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1860

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1920

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1980

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 2040

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 2100

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 2160

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 2220

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 2280

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 2340

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 2400

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 2460

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 2520

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 2580

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 2640

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 2700

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 2760

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 2820

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2880

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2940

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 3000

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 3060

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 3120

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 3180

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 3240

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 3300

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 3360

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 3420

gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 3480

aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 3540

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 3600

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 3660

actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 3720

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 3780

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3840

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3900

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3960

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 4020

cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 4080

gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 4140

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 4200

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 4260

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 4320

aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 4380

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 4440

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 4500

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 4560

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 4620

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 4680

atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 4740

cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 4800

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4860

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4920

gacctgtctc agctgggagg tgacagcggc gggagcggcg ggagcggggg gagcactaat 4980

ctgagcgaca tcattgagaa ggagactggg aaacagctgg tcattcagga gtccatcctg 5040

atgctgcctg aggaggtgga ggaagtgatc ggcaacaagc cagagtctga catcctggtg 5100

cacaccgcct acgacgagtc cacagatgag aatgtgatgc tgctgacctc tgacgccccc 5160

gagtataagc cttgggccct ggtcatccag gattctaacg gcgagaataa gatcaagatg 5220

ctgagcggag gatccggagg atctggaggc agcaccaacc tgtctgacat catcgagaag 5280

gagacaggca agcagctggt catccaggag agcatcctga tgctgcccga agaagtcgaa 5340

gaagtgatcg gaaacaagcc tgagagcgat atcctggtcc ataccgccta cgacgagagt 5400

accgacgaaa atgtgatgct gctgacatcc gacgccccag agtataagcc ctgggctctg 5460

gtcatccagg attccaacgg agagaacaaa atcaaaatgc tgtctggcgg ctcaaaaaga 5520

accgccgacg gcagcgaatt cgagcccaag aagaagagga aagtc 5565

<210> 2

<211> 5952

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtttagtga accgtcagat ccgctagaga tccgcggccg ccaccatgaa gaggaccgcc 60

gatggctctg agttcgagag ccccaagaag aagcggaagg tggaggcatc tccagcaagc 120

ggaccaaggc acctgatgga cccccacatc ttcacctcta actttaacaa tggcatcggc 180

aggcacaaga catacctgtg ctatgaggtg gagcgcctgg acaacggcac cagcgtgaag 240

atggatcagc acagaggctt cctgcacggc caggccaaga atctgctgtg cggcttctac 300

ggccggcacg cagagctgag atttctggac ctggtgccta gcctgcagct ggatccagcc 360

cagatctata gggtgacctg gttcatcagc tggtccccat gcttttcctg gggatgtgca 420

ggagaggtgc gcgccttcct gcaggagaat acacacgtgc ggctgagaat ctttgccgcc 480

cggatctacg actatgatcc tctgtacaag gaggccctgc agatgctgag agacgcagga 540

gcccaggtgt ccatcatgac ctatgatgag ttcaagcact gctgggacac atttgtggat 600

caccagggct gtccctttca gccttgggac ggactggatg agcactccca ggccctgtct 660

ggcaggctga gggccatcct gcagaaccag ggcaatagcg gaggatctag cggaggatca 720

agcggaagcg agactcctgg aaccagcgaa agcgcaaccc cagaaagcag cggaggaagt 780

agcggaggaa gcatggcaat gcagatgcag cttgaagcaa atgcagatac ttcagtggaa 840

gaagaaagct ttggcccaca acccatttca cggttagagc agtgtggcat aaatgccaac 900

gatgtgaaga aattggaaga agctggattc catactgtgg aggctgttgc ctatgcgcca 960

aagaaggagc taataaatat taagggaatt agtgaagcca aagctgataa aattctggct 1020

gaggcagcta aattagttcc aatgggtttc accactgcaa ctgaattcca ccaaaggcgg 1080

tcagagatca tacagattac tactggctcc aaagagcttg acaaactact tcaatctggc 1140

ggatctagcg gtggatctag cggctctgag acccctggaa catccgaatc cgccactcca 1200

gagagcagcg gaggctcttc tggaggatca gacaagaagt acagcatcgg cctggccatc 1260

ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa 1320

ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat cggagccctg 1380

ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc cagaagaaga 1440

tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc 1500

aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga agaggataag 1560

aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag 1620

taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg 1680

cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag 1740

ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc 1800

tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc 1860

ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc 1920

gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct gacccccaac 1980

ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac 2040

gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg 2100

gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag 2160

atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca ccaccaggac 2220

ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa agagattttc 2280

ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag ccaggaagag 2340

ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg 2400

aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc 2460

caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca 2520

ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat cccctactac 2580

gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa 2640

accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc 2700

atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac 2760

agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc 2820

gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg 2880

ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa 2940

atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg 3000

ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa 3060

aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga cagagagatg 3120

atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg 3180

aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg 3240

gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga 3300

aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc 3360

caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc 3420

gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg 3480

ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca gaccacccag 3540

aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat caaagagctg 3600

ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg 3660

tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac 3720

cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc 3780

atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc 3840

tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg 3900

attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg 3960

gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg 4020

gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg 4080

gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag 4140

ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta cctaaacgcc 4200

gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc 4260

gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag 4320

gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac cgagattacc 4380

ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag 4440

atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa 4500

gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg 4560

cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc taagaagtac 4620

ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag 4680

ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga 4740

agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa 4800

aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag 4860

agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct gccctccaaa 4920

tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat 4980

aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga gatcatcgag 5040

cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg 5100

tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa tatcatccac 5160

ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga caccaccatc 5220

gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc 5280

atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggtga cagcggcggg 5340

agcggcggga gcggggggag cactaatctg agcgacatca ttgagaagga gactgggaaa 5400

cagctggtca ttcaggagtc catcctgatg ctgcctgagg aggtggagga agtgatcggc 5460

aacaagccag agtctgacat cctggtgcac accgcctacg acgagtccac agatgagaat 5520

gtgatgctgc tgacctctga cgcccccgag tataagcctt gggccctggt catccaggat 5580

tctaacggcg agaataagat caagatgctg agcggaggat ccggaggatc tggaggcagc 5640

accaacctgt ctgacatcat cgagaaggag acaggcaagc agctggtcat ccaggagagc 5700

atcctgatgc tgcccgaaga agtcgaagaa gtgatcggaa acaagcctga gagcgatatc 5760

ctggtccata ccgcctacga cgagagtacc gacgaaaatg tgatgctgct gacatccgac 5820

gccccagagt ataagccctg ggctctggtc atccaggatt ccaacggaga gaacaaaatc 5880

aaaatgctgt ctggcggctc aaaaagaacc gccgacggca gcgaattcga gcccaagaag 5940

aagaggaaag tc 5952

<210> 3

<211> 5409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaacgga cagccgacgg aagcgagttc gagtcaccaa agaagaagcg gaaagtctct 60

gaagtcgagt ttagccacga gtattggatg aggcacgcac tgaccctggc aaagcgagca 120

tgggatgaaa gagaagtccc cgtgggcgcc gtgctggtgc acaacaatag agtgatcgga 180

gagggatgga acaggccaat cggccgccac gaccctaccg cacacgcaga gatcatggca 240

ctgaggcagg gaggcctggt catgcagaat taccgcctga tcgatgccac cctgtatgtg 300

acactggagc catgcgtgat gtgcgcagga gcaatgatcc acagcaggat cggaagagtg 360

gtgttcggag cacgggacgc caagaccggc gcagcaggct ccctgatgga tgtgctgcac 420

caccccggca tgaaccaccg ggtggagatc acagagggaa tcctggcaga cgagtgcgcc 480

gccctgctga gcgatttctt tagaatgcgg agacaggaga tcaaggccca gaagaaggca 540

cagagctcca ccgactctgg aggatctagc ggaggatcct ctggaagcga gacaccaggc 600

acaagcgagt ccgccacacc agagagctcc ggcggctcct ccggaggatc ctctgaggtg 660

gagttttccc acgagtactg gatgagacat gccctgaccc tggccaagag ggcacgcgat 720

gagagggagg tgcctgtggg agccgtgctg gtgctgaaca atagagtgat cggcgagggc 780

tggaacagag ccatcggcct gcacgaccca acagcccatg ccgaaattat ggccctgaga 840

cagggcggcc tggtcatgca gaactacaga ctgattgacg ccaccctgta cgtgacattc 900

gagccttgcg tgatgtgcgc cggcgccatg atccactcta ggatcggccg cgtggtgttt 960

ggcgtgagga acgcaaaaac cggcgccgca ggctccctga tggacgtgct gcactacccc 1020

ggcatgaatc accgcgtcga aattaccgag ggaatcctgg cagatgaatg tgccgccctg 1080

ctgtgctatt tctttcggat gcctagacag gtgttcaatg ctcagaagaa ggcccagagc 1140

tccaccgact ccggaggatc tagcggaggc tcctctggct ctgagacacc tggcacaagc 1200

gagagcgcaa cacctgaaag cagcgggggc agcagcgggg ggtcagacaa gaagtacagc 1260

atcggcctgg ccatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga cgagtacaag 1320

gtgcccagca agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat caagaagaac 1380

ctgatcggag ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg agagaacccg gctgaagaga 1440

accgccagaa gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca agagatcttc 1500

agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga gtccttcctg 1560

gtggaagagg ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg 1620

gcctaccacg agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt ggacagcacc 1680

gacaaggccg acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa gttccggggc 1740

cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc 1800

cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc cagcggcgtg 1860

gacgccaagg ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga aaatctgatc 1920

gcccagctgc ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc cctgagcctg 1980

ggcctgaccc ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa actgcagctg 2040

agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac 2100

gccgacctgt ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag cgacatcctg 2160

agagtgaaca ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa gagatacgac 2220

gagcaccacc aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct gcctgagaag 2280

tacaaagaga ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat tgacggcgga 2340

gccagccagg aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat ggacggcacc 2400

gaggaactgc tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg gaccttcgac 2460

aacggcagca tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct gcggcggcag 2520

gaagattttt acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat cctgaccttc 2580

cgcatcccct actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc ctggatgacc 2640

agaaagagcg aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga caagggcgct 2700

tccgcccaga gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc caacgagaag 2760

gtgctgccca agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga gctgaccaaa 2820

gtgaaatacg tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga gcagaaaaag 2880

gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca gctgaaagag 2940

gactacttca agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt ggaagatcgg 3000

ttcaacgcct ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga caaggacttc 3060

ctggacaatg aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct gacactgttt 3120

gaggacagag agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt cgacgacaaa 3180

gtgatgaagc agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag ccggaagctg 3240

atcaacggca tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct gaagtccgac 3300

ggcttcgcca acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac ctttaaagag 3360

gacatccaga aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca cattgccaat 3420

ctggccggca gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt ggtggacgag 3480

ctcgtgaaag tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat ggccagagag 3540

aaccagacca cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg gatcgaagag 3600

ggcatcaaag agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa cacccagctg 3660

cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta cgtggaccag 3720

gaactggaca tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc tcagagcttt 3780

ctgaaggacg actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa ccggggcaag 3840

agcgacaacg tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg gcggcagctg 3900

ctgaacgcca agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc cgagagaggc 3960

ggcctgagcg aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga aacccggcag 4020

atcacaaagc acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta cgacgagaat 4080

gacaagctga tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt gtccgatttc 4140

cggaaggatt tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca cgcccacgac 4200

gcctacctga acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa gctggaaagc 4260

gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc caagagcgag 4320

caggaaatcg gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaactttttc 4380

aagaccgaga ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat cgagacaaac 4440

ggcgaaaccg gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt gcggaaagtg 4500

ctgagcatgc cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg cggcttcagc 4560

aaagagtcta tcagacccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa gaaggactgg 4620

gaccctaaga agtacggcgg cttcctgtgg cccaccgtgg cctattctgt gctggtggtg 4680

gccaaagtgg aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct gctggggatc 4740

accatcatgg aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga agccaagggc 4800

tacaaagaag tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct gttcgagctg 4860

gaaaacggcc ggaagagaat gctggcctct gccaagcagc tgcagaaggg aaacgaactg 4920

gccctgccct ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga gaagctgaag 4980

ggctcccccg aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa gcactacctg 5040

gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc cgacgctaat 5100

ctggacaaag tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag agagcaggcc 5160

gagaatatca tccacctgtt taccctgacc agactgggag cccctagagc cttcaagtac 5220

tttgacacca ccatcgaccc caagcagtac agaagcacca aagaggtgct ggacgccacc 5280

ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc tcagctggga 5340

ggtgactctg gcggctcaaa aagaaccgcc gacggcagcg aattcgagcc caagaagaag 5400

aggaaagtc 5409

<210> 4

<211> 6351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaacgga cagccgacgg aagcgagttc gagtcaccaa agaagaagcg gaaagtcgac 60

aagaagtaca gcatcggcct ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc 120

gacgagtaca aggtgcccag caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc 180

atcaagaaga acctgatcgg agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc 240

cggctgaaga gaaccgccag aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg 300

caagagatct tcagcaacga gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa 360

gagtccttcc tggtggaaga ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc 420

gtggacgagg tggcctacca cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg 480

gtggacagca ccgacaaggc cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc 540

aagttccggg gccacttcct gatcgagggc gacctgaacc ccgacaacag cgacgtggac 600

aagctgttca tccagctggt gcagacctac aaccagctgt tcgaggaaaa ccccatcaac 660

gccagcggcg tggacgccaa ggccatcctg tctgccagac tgagcaagag cagacggctg 720

gaaaatctga tcgcccagct gcccggcgag aagaagaatg gcctgttcgg aaacctgatt 780

gccctgagcc tgggcctgac ccccaacttc aagagcaact tcgacctggc cgaggatgcc 840

aaactgcagc tgagcaagga cacctacgac gacgacctgg acaacctgct ggcccagatc 900

ggcgaccagt acgccgacct gtttctggcc gccaagaacc tgtccgacgc catcctgctg 960

agcgacatcc tgagagtgaa caccgagatc accaaggccc ccctgagcgc ctctatgatc 1020

aagagatacg acgagcacca ccaggacctg accctgctga aagctctcgt gcggcagcag 1080

ctgcctgaga agtacaaaga gattttcttc gaccagagca agaacggcta cgccggctac 1140

attgacggcg gagccagcca ggaagagttc tacaagttca tcaagcccat cctggaaaag 1200

atggacggca ccgaggaact gctcgtgaag ctgaacagag aggacctgct gcggaagcag 1260

cggaccttcg acaacggcag catcccccac cagatccacc tgggagagct gcacgccatt 1320

ctgcggcggc aggaagattt ttacccattc ctgaaggaca accgggaaaa gatcgagaag 1380

atcctgacct tccgcatccc ctactacgtg ggccctctgg ccaggggaaa cagcagattc 1440

gcctggatga ccagaaagag cgaggaaacc atcaccccct ggaacttcga ggaagtggtg 1500

gacaagggcg cttccgccca gagcttcatc gagcggatga ccaacttcga taagaacctg 1560

cccaacgaga aggtgctgcc caagcacagc ctgctgtacg agtacttcac cgtgtataac 1620

gagctgacca aagtgaaata cgtgaccgag ggaatgagaa agcccgcctt cctgagcggc 1680

gagcagaaaa aggccatcgt ggacctgctg ttcaagacca accggaaagt gaccgtgaag 1740

cagctgaaag aggactactt caagaaaatc gagtgcttcg actccgtgga aatctccggc 1800

gtggaagatc ggttcaacgc ctccctgggc acataccacg atctgctgaa aattatcaag 1860

gacaaggact tcctggacaa tgaggaaaac gaggacattc tggaagatat cgtgctgacc 1920

ctgacactgt ttgaggacag agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg 1980

ttcgacgaca aagtgatgaa gcagctgaag cggcggagat acaccggctg gggcaggctg 2040

agccggaagc tgatcaacgg catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc 2100

ctgaagtccg acggcttcgc caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg 2160

acctttaaag aggacatcca gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag 2220

cacattgcca atctggccgg cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag 2280

gtggtggacg agctcgtgaa agtgatgggc cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa 2340

atggccagag agaaccagac cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag 2400

cggatcgaag agggcatcaa agagctgggc agccagatcc tgaaagaaca ccccgtggaa 2460

aacacccagc tgcagaacga gaagctgtac ctgtactacc tgcagaatgg gcgggatatg 2520

tacgtggacc aggaactgga catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga cgctatcgtg 2580

cctcagagct ttctgaagga cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag 2640

aaccggggca agagcgacaa cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac 2700

tggcggcagc tgctgaacgc caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag 2760

gccgagagag gcggcctgag cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg 2820

gaaacccggc agatcacaaa gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag 2880

tacgacgaga atgacaagct gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg 2940

gtgtccgatt tccggaagga tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac 3000

cacgcccacg acgcctacct gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct 3060

aagctggaaa gcgagttcgt gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc 3120

gccaagagcg agcaggaaat cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc 3180

atgaactttt tcaagaccga gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg 3240

atcgagacaa acggcgaaac cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc 3300

gtgcggaaag tgctgagcat gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca 3360

ggcggcttca gcaaagagtc tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga 3420

aagaaggact gggaccctaa gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct 3480

gtgctggtgg tggccaaagt ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag 3540

ctgctgggga tcaccatcat ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg 3600

gaagccaagg gctacaaaga agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc 3660

ctgttcgagc tggaaaacgg ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag 3720

ggaaacgaac tggccctgcc ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat 3780

gagaagctga agggctcccc cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac 3840

aagcactacc tggacgagat catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg 3900

gccgacgcta atctggacaa agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc 3960

agagagcagg ccgagaatat catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc 4020

gccttcaagt actttgacac caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg 4080

ctggacgcca ccctgatcca ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg 4140

tctcagctgg gaggtgactc tggaggatct agcggaggat cctctggcag cgagacacca 4200

ggaacaagcg agtcagcaac accagagagc agtggcggca gcagcggcgg cagcagcacc 4260

ctaaatatag aagatgagta tcggctacat gagacctcaa aagagccaga tgtttctcta 4320

gggtccacat ggctgtctga ttttcctcag gcctgggcgg aaaccggggg catgggactg 4380

gcagttcgcc aagctcctct gatcatacct ctgaaagcaa cctctacccc cgtgtccata 4440

aaacaatacc ccatgtcaca agaagccaga ctggggatca agccccacat acagagactg 4500

ttggaccagg gaatactggt accctgccag tccccctgga acacgcccct gctacccgtt 4560

aagaaaccag ggactaatga ttataggcct gtccaggatc tgagagaagt caacaagcgg 4620

gtggaagaca tccaccccac cgtgcccaac ccttacaacc tcttgagcgg gctcccaccg 4680

tcccaccagt ggtacactgt gcttgattta aaggatgcct ttttctgcct gagactccac 4740

cccaccagtc agcctctctt cgcctttgag tggagagatc cagagatggg aatctcagga 4800

caattgacct ggaccagact cccacagggt ttcaaaaaca gtcccaccct gtttaatgag 4860

gcactgcaca gagacctagc agacttccgg atccagcacc cagacttgat cctgctacag 4920

tacgtggatg acttactgct ggccgccact tctgagctag actgccaaca aggtactcgg 4980

gccctgttac aaaccctagg gaacctcggg tatcgggcct cggccaagaa agcccaaatt 5040

tgccagaaac aggtcaagta tctggggtat cttctaaaag agggtcagag atggctgact 5100

gaggccagaa aagagactgt gatggggcag cctactccga agacccctcg acaactaagg 5160

gagttcctag ggaaggcagg cttctgtcgc ctcttcatcc ctgggtttgc agaaatggca 5220

gcccccctgt accctctcac caaaccgggg actctgttta attggggccc agaccaacaa 5280

aaggcctatc aagaaatcaa gcaagctctt ctaactgccc cagccctggg gttgccagat 5340

ttgactaagc cctttgaact ctttgtcgac gagaagcagg gctacgccaa aggtgtccta 5400

acgcaaaaac tgggaccttg gcgtcggccg gtggcctacc tgtccaaaaa gctagaccca 5460

gtagcagctg ggtggccccc ttgcctacgg atggtagcag ccattgccgt actgacaaag 5520

gatgcaggca agctaaccat gggacagcca ctagtcattc tggcccccca tgcagtagag 5580

gcactagtca aacaaccccc cgaccgctgg ctttccaacg cccggatgac tcactatcag 5640

gccttgcttt tggacacgga ccgggtccag ttcggaccgg tggtagccct gaacccggct 5700

acgctgctcc cactgcctga ggaagggctg caacacaact gccttgatat cctggccgaa 5760

gcccacggaa cccgacccga cctaacggac cagccgctcc cagacgccga ccacacctgg 5820

tacacggatg gaagcagtct cttacaagag ggacagcgta aggcgggagc tgcggtgacc 5880

accgagaccg aggtaatctg ggctaaagcc ctgccagccg ggacatccgc tcagcgggct 5940

gaactgatag cactcaccca ggccctaaag atggcagaag gtaagaagct aaatgtttat 6000

actgatagcc gttatgcttt tgctactgcc catatccatg gagaaatata cagaaggcgt 6060

gggtggctca catcagaagg caaagagatc aaaaataaag acgagatctt ggccctacta 6120

aaagccctct ttctgcccaa aagacttagc ataatccatt gtccaggaca tcaaaaggga 6180

cacagcgccg aggctagagg caaccggatg gctgaccaag cggcccgaaa ggcagccatc 6240

acagagactc cagacacctc taccctcctc atagaaaatt catcaccctc tggcggctca 6300

aaaagaaccg ccgacggcag cgaattcgag cccaagaaga agaggaaagt c 6351

<210> 5

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaggacgaa acaccgatgt ctgcaggcca gatgagtttt agagctagaa atagcaagtt 60

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg caatgtgcca 120

tctggagcgg gcatctggcc tgcagactag ctaggtcttg a 161

<210> 6

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala Gln Glu Glu His Glu Lys Tyr His

1 5 10 15

Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val

20 25 30

Ala Lys Glu Ile Val Ala Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu

35 40 45

Ala Met His Gly Gln Val Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Val

50 55 60

Cys Thr His Leu Glu Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala

65 70 75 80

Ser Gly Tyr Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu

85 90 95

Thr Ala Tyr Phe Leu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Thr

100 105 110

Val His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Ser Thr Thr Val Lys Ala

115 120 125

Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Lys Gln Glu Phe Gly Ile Pro Tyr Asn

130 135 140

Pro Gln Ser Gln Gly Val Ile Glu Ser Met Asn Lys Glu Leu Lys Lys

145 150 155 160

Ile Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln Ala Glu His Leu Lys Thr Ala Val

165 170 175

Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys Arg Lys Gly Gly Ile Gly

180 185 190

Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile Val Asp Ile Ile Ala Thr Asp Ile

195 200 205

Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg

210 215 220

Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Val Trp Lys Gly Pro Ala Lys

225 230 235 240

Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Val Pro Arg Arg Lys Ala Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly

260 265 270

Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val Ala Ser Arg Gln Asp Glu Asp

275 280 285

<210> 7

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60

gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120

gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180

tggcagctag tatgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240

agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300

ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360

ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420

attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480

attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540

ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600

gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660

caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720

ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780

ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840

gtggcaagta gacaggatga ggattaa 867

Claims (10)

1.非整合慢病毒载体系统在制备碱基编辑器递送产品中的应用，所述非整合慢病毒载体系统转染宿主细胞后能获得非整合的慢病毒，所述非整合慢病毒载体系统包括表达碱基编辑器的重组慢病毒载体、表达整合酶的质粒和表达VSV囊膜G蛋白的质粒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述整合酶是将HIV整合酶的第64位氨基酸由D(天冬氨酸)突变为V(缬氨酸)，保持HIV整合酶的其它氨基酸不变得到的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述碱基编辑器为CBE碱基编辑器、ABE碱基编辑器或PE碱基编辑器中的一种或几种；

所述CBE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和胞嘧啶脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述ABE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和腺嘌呤脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述PE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和逆转录酶，所述定位系统为pegRNA。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述Cas9n为具有单条链切割活性的突变体Cas9(D10A)或为具有单条链切割活性的突变体Cas9(H840A)。

5.递送碱基编辑器的非整合慢病毒载体的制备方法，包括下述步骤：

a)构建表达碱基编辑器的重组慢病毒载体；

b)将步骤a)的重组慢病毒载体与表达整合酶的质粒和表达VSV囊膜G蛋白的质粒转染宿主细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞；

c)收获步骤b)的培养物，从所述培养物中收集慢病毒载体颗粒，该慢病毒载体颗粒即为所述非整合慢病毒载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：a)中所述碱基编辑器选自：CBE碱基编辑器、ABE碱基编辑器或PE碱基编辑器中的一种或几种，

所述CBE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和胞嘧啶脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述ABE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和腺嘌呤脱氨酶，所述定位系统为sgRNA；所述PE碱基编辑器由融合蛋白和定位系统组成，所述融合蛋白含有Cas9n蛋白和逆转录酶，所述定位系统为pegRNA。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：b)中所述宿主细胞为HEK293T细胞。

8.重组细胞，其特征在于：所述重组细胞含有权利要求1-4中任一项所述应用中的所述非整合慢病毒载体系统。

9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于：所述细胞选自下述C1)-C3)中任一种：

C1)真核细胞；

C2)酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞；

C3)人细胞。

10.权利要求5-7中任一项所述方法获得的非整合慢病毒载体。

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