CN112175963A - 一种spp1基因及评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种SPP1基因及评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，SPP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。评估方法的具体步骤如下：绵羊卵巢组织基因组的提取；绵羊SPP1基因启动子的扩增；SPP1基因启动子序列同pLV‑mCherry构建重构载体；介导SPP1基因启动子‑mCherry转染病毒包装；绵羊卵巢卵泡的体外培养；SPP1基因启动子‑mCherry在绵羊卵巢卵泡中的表达和检测；绵羊卵泡体外培养体系的完善和优化。通过选择SPP1基因启动子构建红色荧光蛋白表达驱动载体，能够准确检测反映绵羊卵泡中高尔基体发育质量的培养体系，从而为优化绵羊卵泡中高尔基体高质量发育的培养体系提供重要科学依据。

Description

一种SPP1基因及评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法
技术领域
本发明涉及生物工程及基因分子标记技术领域，具体涉及一种SPP1基因及评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法。
背景技术
高尔基体亦称高尔基复合体、高尔基器,是真核细胞中内膜系统的组成之一，由扁平膜囊、大囊泡、小囊泡三个基本成分组成的以分泌为主要功能的细胞器。高尔基体在细胞的生长发育过程中发挥重要作用，主要功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、对比、分拣、与运输，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。高尔基体作为完成细胞分泌物(如蛋白)最后加工和包装的场所，从内质网送来的小泡与高尔基体膜融合，将内含物送入高尔基体腔中，在那里新合成的蛋白质肽链继续完成修饰和包装。另外，高尔基体还合成一些分泌到胞外的多糖和修饰细胞膜的材料。
卵母细胞简称卵子，是重要的生殖细胞之一。卵母细胞与精子的有效结合实现了自然界的繁荣昌盛。在生命有机体中，生殖系统是最脆弱的系统之一，这也是当今不孕不育日益高发的重要因素。有关卵母细胞的发生发育机制的相关研究，将为人类或动物的生殖健康提供重要的技术和理论保障。自然状态下卵巢中能用于体外受精的卵子数量有限，且卵子具有体积大、结构复杂等特点，是目前生殖细胞研究的重点和难点。因此，开发利用卵巢中的卵泡是生殖科学研究的重要焦点。有限的卵母细胞资源限制了生殖发育的相关研究，也限制了动物新品种的培育和改良。建立完善的卵母细胞发育培养体系，是高效利用有限卵母细胞资源的重要基础和保障。
绵羊作为家畜中的一种为人类提供丰富的肉、奶及羊毛制品的动物，极大地丰富和提高了人们的生活水平。随着人们生活水平的不断提高，人们需要具有不同特色和特点的绵羊品种为人类服务，培育提高满足人们不同需要的绵羊品种个体日益成为现代畜牧业的时代要求。绵羊卵母细胞可以来自体外培养的卵泡，卵泡分离于羊屠宰后遗弃的卵巢组织，或流产的胎羊体内卵巢。卵巢组织中有数以万计的卵泡，利用屠宰后遗弃的卵巢组织或流产的胎羊体内卵巢组织，从而为绵羊卵母细胞发生发育的相关研究提供重要的实验材料，绵羊品种的改良和培育离不开绵羊卵母细胞为基础的生殖发育的相关研究，利用现代细胞工程和分子工程技术能够加快绵羊的品种改良和繁育速度。高尔基体作为绵羊卵母细胞中的重要细胞器之一，高尔基体发育水平的高低是衡量卵母细胞胞质发育质量的重要检测指标，我们通过现代分子细胞技术找到了卵母细胞内高尔基体分子标记基因SPP1，该分子标记能够直接通过高尔基体发育水平评估绵羊单卵泡胞质发育质量，为加快绵羊的品种改良和繁育速度奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种SPP1基因及评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种SPP1基因，所述SPP1基因为评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的分子标记，且所述SPP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，选择绵羊第14号染色体SPP1基因的启动子区域设计扩增引物。
优选地，一种评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，具体步骤如下：
(1)绵羊卵巢组织基因组的提取；
(2)绵羊SPP1基因启动子的扩增；
(3)SPP1基因启动子序列同pLV-mCherry构建重构载体；
(4)介导SPP1基因启动子-mCherry转染病毒包装；
(5)绵羊卵巢卵泡的体外培养；
(6)SPP1基因启动子-mCherry在绵羊卵巢卵泡中的表达和检测；
(7)绵羊卵泡体外培养体系的完善和优化。
优选地，步骤(2)的具体过程如下：
(2.1)以基本的扩增引物为基础，经在扩增引物前添加酶切位点，再在得到的添加酶切位点后的扩增引物5’端加上保护碱基得到SPP1基因启动子，具体做法如下：
(2.1.1)首先，设计核苷酸序列如下所示的基本的扩增引物：
基本的扩增引物的核苷酸序列长度为1925bp，
上游引物F：5’-AGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
下游引物R：5’-AGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.1.2)然后，在上述基本的扩增引物前添加酶切位点，得到了添加酶切位点后的扩增引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物添加酶切位点为Cla I，
F：5’-ATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
下游引物添加酶切位点为BamH I，
R：5’-GGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.1.3)最后，选择在添加酶切位点后的扩增引物的5’端加上保护碱基：
上游引物添加保护性碱基为CTC，
F：5’-CTCATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
下游引物添加保护性碱基为CAT，
R：5’-CATGGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.2)PCR扩增SPP1基因启动子
(2.3)1％琼脂糖凝胶电泳回收SPP1基因启动子序列。
优选地，步骤(3)的具体过程如下：
分别用限制性内切酶Cla I和BamH I切SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，酶切后采用1％琼脂糖凝胶电泳分别回收SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，再用T4连接酶连接SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，构建重构载体。
优选地，在步骤(3)中，在完成构建出SPP1基因启动子序列同pLV-mCherry重构载体前，先采用绵羊SPP1基因启动子鉴定引物进行鉴定，以检测重构载体中SPP1基因启动子序列是否正确；其中，SPP1基因启动子鉴定引物的核苷酸序列如下：
上游引物F：5’-CGTGCAAATTATCCTGTT-3’，
下游引物R：5’-CAGTTTATGACCGAAAGC-3’，
鉴定片段序列长度为389bp。
优选地，步骤(4)的具体过程如下：
利用培养皿包装含pLV-SPP1基因启动子-mCherry质粒的病毒，并收集包装病毒培养液。
优选地，步骤(5)的具体过程如下：
取绵羊的卵巢组织，然后在体视显微镜下剥取绵羊单卵泡，清洗后，添加卵泡培养液置于培养箱中培养。
优选地，步骤(6)的具体过程如下：
将收集到的包装病毒培养液，经离心、过滤后，加入新鲜卵泡培养液和基因转染增加剂Polybrene，添加到卵泡培养体系中进行卵泡培养，荧光显微镜下检测绵羊卵泡卵母细胞中红色荧光蛋白表达水平和强度，即可评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量和相关培养体系。
本发明的有益效果在于：
本发明中的SPP1基因是绵羊卵泡卵母细胞生长发育过程中高尔基体发育质量的特异性分子标记基因，选择SPP1基因启动子构建红色荧光蛋白表达驱动载体，能够准确检测反映绵羊卵泡中高尔基体发育质量和体外培养体系，从而为优化绵羊卵泡中高尔基体发育质量和培养体系提供重要科学依据。
具体实施方式
一种评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，具体步骤如下：
1、绵羊卵巢组织基因组的提取
山羊卵巢组织DNA基因组的提取按照组织基因组DNA提取试剂盒(天根试剂公司)操作说明书进行。
具体步骤如下：
取山羊卵巢组织打碎形成细胞悬液，然后12,000rpm离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加入20μl蛋白酶K混匀后，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作上一步步骤。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、绵羊SPP1基因启动子的扩增
(2.1)取绵羊SPP1基因启动子上游引物F：5’-CTCATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’，下游引物R：5’-CATGGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’，启动子扩增引物的核苷酸序列长度为1925bp，根据引物合成说明书加灭菌双蒸水将引物稀释。
其中，启动子扩增引物的设计过程如下：
以基本的扩增引物为基础，经在扩增引物前添加酶切位点，再在得到的添加酶切位点后的扩增引物5’端加上保护碱基得到SPP1基因启动子，具体做法如下：
(2.1.1)首先，设计核苷酸序列如下所示的基本的扩增引物：
基本的扩增引物的核苷酸序列长度为1925bp，
基本的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-AGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
基本的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-AGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.1.2)然后，在上述基本的扩增引物前添加酶切位点，得到了添加酶切位点后的扩增引物，其核苷酸序列如下所示：
其中，基本的上游扩增引物添加Cla I酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-ATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
基本的下游扩增引物添加BamH I酶切位点后的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-GGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.1.3)最后，选择在添加酶切位点后的扩增引物的5’端加上保护碱基：
其中，在添加Cla I酶切位点后的上游扩增引物5’端添加CTC，得到加上保护碱基的上游扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体的核苷酸序列为：
F：5’-CTCATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
在添加BamH I酶切位点后的下游扩增引物5’端添加CAT，得到加上保护碱基的下游扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体的核苷酸序列为：
R：5’-CATGGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.2)PCR扩增SPP1基因启动子
在灭菌的PCR扩增管中加入如下反应物构成50μl反应体系。Easy Taq DNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司产品。
Figure BDA0002711438490000061
PCR扩增反应条件如下，共35个循环。
94℃预热5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
(2.3)1％琼脂糖凝胶电泳回收SPP1基因启动子序列，1％琼脂糖凝胶板的制备，取200ml的三角烧瓶一只，称取0.7g的琼脂糖，加70ml1×TAE缓冲液，放入微波炉加热(高火3min)至溶化透明为止。冷却至50℃左右加EB(溴化乙锭)至终浓度0.5μg/ml，倒入凝胶槽，选择合适的梳齿，待冷却成型后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，电泳槽中倒入1×TAE溶液，缓冲液淹没过胶1～2mm为止。凝胶板上第一孔中加入Marker 2000 6μl，后续孔中加入样本，方法为取少量6×DNA上样缓冲液混合于扩增管中，将50μl相应的扩增基因加入后续孔中。采用U160V、I200mA、T30min条件进行电泳，待溴酚蓝移至凝胶的1/2～2/3距离时，关闭电源。电泳结束后取出凝胶块，使用紫外分析仪和凝胶成像仪进行检测分析。
通过与DNA Marker 2000片段大小比较，回收SPP1基因启动子序列，SPP1基因启动子序列片段为1925bp。在紫外透射反射分析仪内用手术刀片切割含有相应基因片段的琼脂块，放入1.5ml的离心管中。按照DNA凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)说明书操作回收相应基因DNA片段。
具体步骤如下：
(1)紫光荧光下切下SPP1基因启动子序列凝胶带，放入1.5ml离心管。(2)取1ml结合缓冲液加入含有SPP1基因启动子序列凝胶带的离心管内，75℃水浴10min，使凝胶融化，加热融胶时，每2min钟混匀一次。(3)将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10吸附柱中，室温放置2分钟，8000rpm室温离心1min。(4)取下UNIQ-10吸附柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10吸附柱放入同一收集管中，加入750ml洗涤液，8000rmp室温离心1min。(5)重复步骤④。(6)取下UNIQ-10吸附柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10吸附柱放入同一收集管中，12000rmp室温离心1min。(7)将UNIQ-10吸附柱放入一根新的离心管中，在柱子膜中央加30μl洗脱液室温放置2min。(8)12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片断。
3、SPP1基因启动子序列同pLV-mCherry构建重构载体
酶切SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，分别用限制性内切酶Cla I(Thermo产品)和BamH I(Thermo产品)切SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，50μl酶切体系，体系组成如下：
Figure BDA0002711438490000071
混匀后37℃酶切3h。
酶切后采用1％琼脂糖凝胶电泳分别回收SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，T4连接酶连接SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，构建重构载体。具体操作步骤如下：
在微量离心管(200μl PCR扩增管)中混匀酶切后的SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体组分，反应体系如下：
Figure BDA0002711438490000081
构成总体积为5μl的连接反应体系，16℃连接过夜。
连接产物转化到Stbl3感受态细胞，具体操作步骤如下：
(1)取出50μl冻存于-70℃的感受态细胞，室温下解冻，解冻后立即置于冰上。(2)取1μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min。(3)42℃水浴中热激90s，迅速置于冰上冷却2～3min。(4)在超净台内向管中加入500μl LB液体培养基，混匀后在摇床上200rpm,37℃振荡45min～1h。(5)将菌液平铺于90mm含有Amp的LB培养基平板上，轻打平皿，使其分布均匀。(6)37℃恒温培养箱培养12～16h。
取连接转化好的菌落平皿，在超净台内进行以下操作：
(1)取配置好的TB培养基90ml，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾缓冲液10ml，50mg/ml Amp溶液100μl混合于试剂瓶中。(2)取10个灭过菌的10ml离心管标记。(3)取上述混合好的TB培养基2ml放入编号为1的离心管中，重复至10号。(4)用眼科镊夹取牙签(灭过菌)，从平板中挑取菌落连同牙签一起放入上述离心管中，挑圆形的菌落，每一个菌落放入一根离心管中，共取10个放入10个离心管。(5)把10个离心管放入水浴恒温振荡器中，200rpm，37℃振荡6～7h。
取绵羊SPP1基因启动子鉴定引物，上游鉴定引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体核苷酸序列为：5’-CGTGCAAATTATCCTGTT-3’，下游鉴定引物R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，具体核苷酸序列为：5’-CAGTTTATGACCGAAAGC-3’，鉴定片段序列长度为389bp，根据引物合成说明书加灭菌双蒸水将引物稀释。
含重构载体的菌体PCR鉴定，具体操作步骤如下：在灭菌的PCR扩增管中加入如下反应物构成25μl反应体系。
Figure BDA0002711438490000091
PCR扩增反应条件如下，94℃预热5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。共25个循环。菌体PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外分析仪内依据扩增片段的有无和大致长度，鉴定SPP1基因启动子-mCherry重构载体菌是否为阳性。在超净台内，对于鉴定为阳性的菌液，取0.8ml于1.5ml的离心管中，再加入0.2ml 80％甘油，混匀。-80℃保存菌种。从阳性的菌液中提取SPP1基因启动子-mCherry重构载体，取10μl SPP1基因启动子-mCherry重构载体测序，以检测重构载体中SPP1基因启动子序列是否正确。
4、介导SPP1基因启动子-mCherry转染病毒包装
用60mm培养皿包装pLV-SPP1基因启动子-mCherry病毒，具体步骤如下：包毒前24h传293T细胞，密度约1×106/60mm皿，第二天观察细胞，细胞要边界分明圆滑，不聚团，饱满，有三到四个突起，大概汇合50～60％时即可进行包装。包装前2h细胞换新鲜培养液。先取出两个1.5ml离心管，记为A管和B管，B管内加入250μl的2×HBS，A管内先加入胚胎培养水，再加入25μl的2.5M的CaCl2，混匀，再依次加入载体质粒和辅助质粒，混匀，使得A管的终体积为250μl，可根据质粒的总体积调整水的总体积。混匀后将A管的溶液缓慢的加入到B管中，边加边混匀。pLV-SPP1基因启动子-mCherry载体质粒：5μg，pMDLg/pRRE：2μg，pRSV REV：2μg，pVSV-G：2μg。室温放置5～10min。将混合液逐滴加入293T细胞中，轻轻晃匀。10～16h后换新鲜293T细胞培养液。换液后36～48h收集病毒。
5、绵羊卵巢卵泡的体外培养
卵巢卵泡培养液为为含10％FBS的DMEM/F12和α-MEM(1:1)，培养液具体组分为DMEM/F12和α-MEM(1:1)、FBS、丙酮酸、谷氨酰胺、非必须氨基酸、FSH、LH和双抗，卵泡培养微滴制作：用上述中制备好的卵泡培养液，在3.5cm培养皿(Thermo)内制作单卵泡培养液小液滴，15μl/滴/15个/皿，再覆盖2.5～3ml石蜡油；此步骤中将制备完成的单卵泡培养微滴皿置于37℃含5％CO2的饱和湿度培养箱中预热。
绵羊单卵泡获取：将收集的卵巢置于37℃条件下预热的含10％FBS的新鲜医用生理盐水中，在体视显微镜下剥取绵羊单卵泡，并用新的37℃条件下预热的含10％FBS的医用生理盐水清洗卵泡。
将上述剥取及清洗好的卵泡分别单个移入上述中预热后的单卵泡培养皿微滴中，继续将培养皿置于37℃含5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，待卵泡贴壁后采用下述病毒介导的转基因技术。
6、SPP1基因启动子-mCherry在绵羊卵巢卵泡中表达和检测
将上述步骤中收集的病毒液4℃离心(3500r/min)30min，弃掉上清液，首先向SPP1基因启动子-mCherry病毒沉淀中加入上述步骤中制备好的卵泡培养液250μl，重悬后将液体全部吸至SPP1基因启动子-mCherry病毒沉淀中继续重悬，再向此重悬混合液中加入感染增强剂Polybrone(添加量按1/1000体积比)，混匀后待用；
吸弃上述中的单卵泡贴壁后的培养微滴中液体，同时等体积(15μl/滴)补充上述中准备好的SPP1基因启动子-mCherry病毒感染液；
卵泡培养皿标记并置于37℃含5％CO2的饱和湿度培养箱中感染培养12h；
待上述卵泡感染培养12h后，利用同样的方式吸弃微滴中SPP1基因启动子-mCherry病毒感染液，换加等体积(15μl/滴)上述中制备好的卵泡培养液；将卵泡培养皿置于37℃含5％CO2的饱和湿度培养箱中继续培养；
上述中培养的绵羊单卵泡，每2天进行半换新培养液一次，每隔48h荧光显微镜拍照观察其发育情况，根据卵泡红色荧光蛋白表达情况，评估卵泡发育质量和完善培养体系。
卵泡基础培养液为10％FBS的TCM199/α-MEM(1:1)，培养液具体组分为TCM199/α-MEM(1:1)、FBS、丙酮酸、谷氨酰胺、非必须氨基酸、β-E2、FSH、LH、EGF和双抗；
卵泡培养皿制作：在3.5cm培养皿(Thermo)内制作卵泡培养液小液滴，20μl/滴/3个/皿，再覆盖3～4ml石蜡油；此步骤中将制备完成的卵泡培养微滴皿置于37℃含5％CO2的湿度培养箱中预热。
卵泡微滴培养48h后，荧光显微镜下检测绵羊卵泡卵母细胞中红色荧光蛋白表达水平。
7、绵羊卵泡体外培养体系的完善和优化
根据荧光显微镜下绵羊卵泡中卵母细胞红色荧光蛋白表达水平的高低，结合绵羊卵泡生长发育情况，调整、优化、完善绵羊卵泡体外培养体系。
SPP1基因是绵羊卵泡卵母细胞生长发育过程中高尔基体发育质量的特异性分子标记基因，选择SPP1基因启动子构建红色荧光蛋白表达驱动载体，能够准确检测反映绵羊卵泡中高尔基体发育质量和体外培养体系，从而为优化绵羊卵泡中高尔基体发育质量和培养体系提供重要科学依据。
SPP1基因为评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体核苷酸序列如下：
1gagcactgca tcagcatcac aggggactgg actcttctct gctgctgcag accaaggtaa
61gcctgcagtt tgctacttga cttctgtcct ccctgtgcgc tgcctcattt cactgggaag
121gtcagtttgt aaggaaaaga gtacaatggt aaacgctgtt aatcagactt gagttgttct
181tgtcttttga atatgcatgc cagatccagg gctgatgtcc tgcaggaaag gtggctggtt
241attttgaaag acagtcgaat ataaaactta aaaatatttc catggagtcc tcaaaagaac
301tgagactact ttttttcagt caggaaataa aagaaaaatt ctatgcccct ttgggatgat
361tgtatataca tcattttaaa tggatagatg accaagcatt ttaaaaggaa aatgcttttt
421agtattcata taagctgatt ttaacgctaa tttttaatga tttgatttat ccctttgtat
481ttagctatta aaatttcacc caaatatcta tatgatactg tttagactta caaatagaaa
541agctgttgac ttcagtgttt tcgttttcat ttcaaacttc tagaatacct tgaattacta
601actttagaga cagcttcatt tcacctaagt aatacctttt aaataattga aaatcacatt
661tgaaatgcac attggaaaat ggagacagca agtttctctt tcttatattt attttctctc
721ttcgtgtttt tcttctctga aatgtaaata ttctcattct tgctttatta ttttaattca
781attactgctg atctgttttt aggtttagat agctggagat atcaggaagt aatggtgtaa
841tctctgaaac tctaaatgtt aaagtcgaat aaatatagac ttgtaaaatt cttctctccc
901ttgcctaata gtgagagatg gaaaatagag gtggcagtac aaatattaac tcaaaagatc
961ataatattta aaagaaatca gtcgagtatt tccacacaaa atacatattt atttgtgatg
1021attttgtaat gtggtagcct caaaaaaagt atcactgttt tcaccttaga aaagataaaa
1081tatttcttac aaaatatttt gcagaaaaaa atcatgacca tgagaattgc agtgatttgc
1141ttctgcctct tgggcattgc ctccgccctt ccagtgagta caactgaatc tttttttaaa
1201aaaaaagccc ttaaaataaa tgaattgtgt gtttcaatgt tgctaggaac aggttcacac
1261tgtaatcttt cttcaccttt ctatttcaaa ggttaaaccg accagttctg gcagctctga
1321ggaaaagcag gtaagcatct tttcggttta ttatatagtt atttatgcaa ctgctgcaag
1381atgtactaca aacatatgac aattttactt atttgcacaa ataaaataac tgaaaagtat
1441ttattgggtg cctgctaggg ttctagtgca gtaccaagca tagcattgct tttaattaat
1501acagtctctt aaaactatac tagatttctt aatacaataa aatgatgctt taggtcgatc
1561atttctataa aatgagttct gtgaagttgt gtgactttat attcacagta tctctgaaga
1621tatttgctaa gaaacccatt atcttaaaaa aagtatattt atgctgtttg tatctattgt
1681gcttatcaga tgactttaga tttttctaac caaacataag accaaatcaa actcttcata
1741attattccac ccggcaccat agatgtacct gtccctccac aataggtgaa agcgtgccag
1801ccaaacaaca aacgggtatt gtcccaagga gcttgaacag aaaggcacac agggttcaat
1861tccagataaa cagaataaag gccaatacag agctgtctga ggtcactgca gttagattgc
1921tcaatgaaga tgttaggaga agtactgcag tgggtgttta gatatgcaaa taggcatgtg
1981taagtgtgtc tgttttccaa ctgatctaag aacacaagta ttgaaatcat aataataagc
2041cagaaaatta acatttccag agaaaataga ggtcacactc tttgaggcaa taattagtgc
2101ctttttaata gaataaaata gggcacatga agctatggca gtgtaagtgg ttaaatgtta
2161actaagagat aagtggagat gagaatcttc tagaatccta gaaatgtaga gctagtagga
2221agtatggaaa gtctagaaag agacacccct gaagatgaaa acacttgtta tctatgagtg
2281atatgattac tgaacaattt tagtttgttt ttcttatctg tatgttcttc atattacttt
2341ttaaaaatta taaatttatc ttatgaatac agataaagaa tgattacata tatcatcagg
2401aaaatatatt aattatatat caattataac atttctgtaa atattatata tatatttata
2461taaatacata ttttaaagaa aaaaacaggg aacctttgaa ctcatctaca gcaatagttt
2521tcacattttt tagttaaaga aaacccttct ttcagcgaaa accttcatag aagtccaata
2581tgaaactgct ctggttagag ccagacatgg ggaaacccaa agtgctagtg actagtttcc
2641ttcctttctt cccctccttg cctgtgaaag aattcttgaa acccctaggg taactcttct
2701cagtgacaga gatgtgaagt gattgccctg ggccatgcag cccaccagat gacacttatt
2761tagagcaatt tccactcctc tgcactagca tcttattgct atttcccaga taaataattt
2821ggctgagtga aagatcattc cattcatgtc tttggcagct tacaacaaga gaacttttat
2881gcaatggtgt tgatattaga tttctgcact gtccacaggt agccataaac acatgcggct
2941gttggacact cacaatgtag ctagtgccag agaagatagt tttctttatt aacttaaata
3001gccatgtgtt tcatggctag aggataccat tcaccacagc acagcctgag agagtttctt
3061cttacataga ggaaggaaaa aaggaagacc agtgctaatt aagggcagtt ctgccttagt
3121tgtgtttcat ctgaggaatt tcagctatca gacatagaac aggaaggcag tgtatcatca
3181gtgtgaggag ccattggagt taaaccctgg ctctgctact tattatcact taactttatt
3241gtgggcttcc catctggtgg ctcagatgct aaagagtctg cctgcagtgc aggagactcg
3301ggcttgatcc ctggatcagt caggaagatc ccctggagaa aggaatggct atctactcca
3361gtattcttgc ctggagaatt ccgtggacag agactgaagg aataataata atgatgatga
3421tgatgatgat actcatctca ggattaaatg aattagtatt tataagttac tttgaaagta
3481tgcctggctt acagtaagtg ctatgtaaaa gtctgttaaa tgaatctatc agaaagaata
3541attatgaaag acatcactaa ggttctaatt gactaaataa tgcatattat gcttatctgt
3601caagattggg gaagaatagt tgttatttca gcttatcact tagagaccct tgtttcttta
3661aaagataata ataataatga caaatatgca actctctttt gtagcttaac aacaaatacc
3721cagatgctgt agccacatgg ctaaagcctg acccatctca gaagcagact ttcctagaac
3781cccaggtatt ttttcatttt aattaagtct aaatattaaa attctcacaa ttaaagaaca
3841accactccaa aaaatagcca ccaagcaggc catttgagct ggttaaatgg atctttcctg
3901cctgtcgcgc ttccctgata gctcagttgg taaagaatcc gcctgcaatg gcttcctggt
3961ggctcagaca gtaaagcatc tgcctgcaaa ctgggagacc cgggttcagt ccctgggtcg
4021ggaagattcc ctggagaagg aaatggcaac ccactctagt actcttgcct ggaaaattgc
4081catggactga ggagcctggt aggctacagt ccacggggtc gcaaagagtc ggacacgact
4141gagcaacttc actccacttt cctgcctgtt tgtaaaagtg agcttaggac accaatggat
4201ctgtcaggtt gtctgcccgc ttaatccttc caccaaagag gctagaaaaa taagacctgc
4261tttggatgga aaaagctaac ttttgaataa aaagttaagt tgtatgatgt acactgattt
4321gtgtcttttc ttcttcagaa ttctgtgtcc tctgaggaaa ctgatgacaa caaacaaaat
4381gtgagttttc gctttgattc tgatgtctgc tgtgccttag actcaggaag gcactctttc
4441tcctaatgac attgcccagg ttcaaattct ggcaaaactc cgttagcaaa tcctccagga
4501actagttttt attgggacta ttcatatatt tgctgagcaa agggataagt taaatttgct
4561taagattcta tttgaagata ctgagaatct ataaaagaag ttagataaat gacccaggat
4621atttgcaaat cagaagtgta atagacatta actggttaac tgagctatag tttctacaca
4681tggataagag agtcaccttt tgattatcca ggctaatagg gaggtgattt tcgttttggg
4741ggtgtgcatt aatacatgga ttctctgatc ccctgagaat tttcatttca aatagaaaag
4801gtaacctcac aattatgtat atgtatttat tggattattg aatttggaaa ttagtgttta
4861atatgaacaa ggaaaaacag tatcattgat acaagtatta taactcatac atttggcttg
4921aaaatatcta tgaaaatagt ttttatgaga aagcaagaaa aatgccttag aataggattc
4981catttaccct tgtgttaaag gggaaattgg aataagctca ttttagcatt taaaagccat
5041taagtgcttt gttgtgaaca caaagattct aaaactaaat aaagatagta aaatgctaat
5101gcagtgtaaa gactaagggg caataaaaac cctgacaccc atttttctgg ccatcttgat
5161ttctagaccc tcccgagtaa gtccaatgaa agccctgagc aaacagacga tctagatgat
5221gatgatgaaa acagccagga agtcaactct gatgactccg acgatgctaa ccctgatgac
5281tctgaccatt ccaacgagtc tcaccattct gatgaatctg atgaagctga ttttcccact
5341gacattccaa caatcgcagt tttcactcca cctttcccta cggaaagcac aaatgatggc
5401cgaggtgata gtgtggctta tggactgaag tcaaaatcta agaagttccg ccgatctaac
5461gttgaggtaa gtcttgaata gacacatcag atggttatga ttagagccca attctaggaa
5521actagagtct gcgtgctcac ttatgtattc attcagcaag tattattact ttatgatcac
5581taaatacaaa agctttccca cttggttttt gcattcaagt ccacataatt tctccttaat
5641tttgtctctc aatcacaatg caatttttcc aaatcctgct tataaagcac ttattgtatt
5701cactttttta attgaaaaag acttcggaaa agagtcatta ttttcacaat atagtggtca
5761tatcttgaag ttaaacacct aagaactgga gagttgcaaa tcacagactt tatagtcaaa
5821ggatctggat atggcatata gccttgccat cttactattg accttacttt taactttcga
5881tccattttct ctttatgtaa aacagataat gagacctacc tcatagattt cctcacatac
5941ataattcatg tacttattaa actaaaggag atgacataat gaaagaactt ggttttttaa
6001aaggtaacat gctagtattt tccttttttg cctcagccag atttagacat ttttatagaa
6061tacttcggtg tggaagttag aaggcattag agaatacagt gcttccctcc ctagctgttc
6121actgaattct tctcctgttt gtgctgtgat tcagagtcca gatgccacag aggaggactt
6181cacatcacac atagagagtg aggagatgca tgacgcacct aagaagacga gtcagctgac
6241tgaccacagc gaagaaacca acagtgacga gcttcccaaa gaactcacgc caaaggccaa
6301ggaggaaagc aagcattcca atcggatcga gagtcaggaa aattccaaac tcagccaaga
6361attccatagc cttgaagaca agctagacct agatcataag agtgaagaag acaagcgcct
6421gaaaatccgc atttctcatg aattagatag tgtctcttct gaggtcaact gaaaggagaa
6481aatacaagtt cttactttgc ttttagtaaa aagaaaagga tatgttaaag cagggtggga
6541gacaatatga aatgcgtatt tctcagctta gttggtgaat gtatatgtgt gtagatctgg
6601aaacagatca tgtttttgat cattagttta gtgtgtggct tcatggtaac acccttataa
6661actaaaagct tcagggttta gtctatgttc tttccacata aaaaatgcaa accatcacag
6721cattttaatg tttgctaccc ttttatgaat agaaattcat gtagaagcaa acaaaatact
6781gttacacact tttaagaagg aatataaaat ttcacgtcac tatgatcttt tgttttttaa
6841attagtatat attttgttgt gattattttt tctgttgtga ataaatcttt tatcttgaat
6901gtaatgagag tctggtggta tcagttgtgt ttcttatttg gtttcctaca gttgcctagc
6961aattataaat gtaatcattt taattacatt agcatgctgg acataataca gagcaatcta
7021agacctgctg ggtcaattat acagactctg actgagctac agttcctgtc gaggaaagaa
7081gagtcaagca ggggttgata ttcaatcagg aatgctccaa ccatgcaagg gtccctgggt
7141cacttccacc tgatgaaagc agcctttttc taattttcac aacgctgata caaaagttaa
7201taagggcttc cctaatggct taatggttga gaatcctcct gccaatacag gggacatggg
7261ttcaatccct gatccaggaa gatcccacat gccgcccgag caccacaact actgagccca
7321catgcctaga gcccgcgttc cacaacaaga gaagccgcca caagaagcag ctcctgcact
7381gcaaccaaga gtagccccca ctccccacaa ccagagatgg ccggcgtgca acaacaaaga
7441cccagcagcc aaaaaagtaa ataaatcttt ttttaaaaaa agaaaagcta atgagtgcct
7501agatgcaaca acaaatcaat ttcactgttt cttgtcattc tccattgatt ctctcaatat
7561tggttccttg cccttggatg acaacttggt acttcccata gctattctga tcatctgtag
7621atattgaaca aatagtcctt tttttattgg aaaaaaccta aatgcagtct cagctaatac
7681tcaaaatttt caacttcatt caaaactaaa agttctggaa acctggagca cgttcctgta
7741tttcatgctt agctcctctg ctcttcctaa aactagaaac cccattggaa aatttttaat
7801tattaaacaa ctcttgggat aaagtggaaa atttttaatt gcagaatttc tttaaaagtg
7861ttgtaatgaa atgtaaactc aatagagtac agttaaactg gtgatcacag aaaatccata
7921gccttaaatt cttgcagcaa caacaaaaag aatgaaaata aatatataaa tacattgagt
7981tcccatctta aaaattagaa aagaacaaca aaggaaaaga aagcataagg aaggaaaaaa
8041taaagttaaa aataaaagta atgaggtaga gaacagaaaa gcaatagaaa ctaatcaaac
8101aaaatgctga ttctttgtta aaaaaaacaa atcagcacaa cagataaacc actagctgac
8161ccaataaagg aagaaaggga gaaaacacaa ataagaaata aaaacaagga gacaaccaag
8221gacatgacaa aattttataa atcaaaagtg actcactttg cacaagtcaa acagaaaata
8281taagtgaatt ggattatttc ctaggaaaat acaatttacc aaaattgact ttgctaatca
8341tagaaaacac aaatggaaat tttctatagt ggaaaaagaa aaagttatca aagaactatc
8401cataaaaact aggcccaaat gattttacag tggaatttaa tcaaaacttc aaagactaga
8461taatcccaat accatttaaa ttgtagtaga aaaggaaaac tctcaaatga cctttataaa
8521acaagtatta ctttgacaca aacctggtaa tgattgcaaa cacatacaca caccatacat
8581acacatacat acacaaccat aaatcagtct cacttgtgac tggcaatggg aaaatcctaa
8641ataaaatgcc agcaaacaca atctgaaatc aagtttaaag aatgcatcat aatcaggggg
8701atttatttcc aggaaatgat gcttcagtat tagcaaattc attcctataa tggatcatct
8761cattaaatct agattgaaag atgtcatatg attagatctc cgtctgaata ctagcatcat
8821tattaatgga gaaggattac aggtatttcc attaagaaca aggaccaagt aagcttctcc
8881tttctctctg ctattatata acatagcttt ggagatataa gctagcaatc ataagcattt
8941agaggcataa gaagtgagaa ataaattatg tttttatgta aactaatact atacctagaa
9001aacacagaat aagtactaaa aataacaact aacaagttct gtaaggaagc atgatataaa
9061attcagctga aagcatattt acaaaaaaca ctaagtgatc atttaaaaga tacaatgtta
9121ttaatataga aacaaagaaa gataaaatac ttaacagaaa atgtgctaaa actattttgg
9181aaaactgtga aacactcctg taaactaaaa aaaaaagagg cctgaaacaa atagaaaggc
9241tctgtttatt ctcacacagg aaaatccatc attaacatat caatactccc ttcataacat
9301aaatgcaatg tgattccaaa taaaagaaaa gtcatttttt ccctgaagct atgcaagcta
9361attctataat ccatatggaa aagtaaacat acaacaatat gaaggaaaat cctgaaaaat
9421aaaagcagta agcgagaact acccctaaca aatattaaga ccataaagcc tccctaataa
9481aaacactgtg gtatcagcaa ataaatacat ttgttgttgt tcagttgctc agttatggtt
9541aactctttgc aaccccatgg actgcagcat gccaggcttc cccgtccatc accatctcct
9601ggagcttgct cagactcatg tccattgagt cagcgatgcc atccaaccat ctgtcctctg
9661tcatcccctt ctcctgcctt caatctttcc caggatcagg gtcttttcta gtgtcagctc
9721tttgtatcag gtggccaaag tatgggagct tcagctcctt ccagtgaata ttcaggactg
9781atttccttca ggattaactg gtttgatatc cttgctgtcc aagggactct caagagtctt
9841ctccaacacc acaattcaaa aggatcaatt ctttagcact cagccttctt tatggtccaa
9901ctctcacatc catacatgac tactgggaaa accacagctt tgactagatg gacctttgtt
9961ggcaaagtaa tgtctctgct ttttaatatg ctgtctagtt tgtcatagct tttcttccaa
10021ggagcaagcg tcttttaatt tcatagctgc cgtcaccatc tgcagttgtgttggaacata
10081aggagataaa gtctgtcact gtttccattg tttccccatc tatttgccatgaagtgatgg
10141gaccagatgc aatgaccttc attttttgaa tgctgagttt taagccagtttttttcattc
10201tgctttttca ccttcatcaa gaggctcttt agttcctctt cgctttctgccataagggtg
10261gtgtcatctg catatctgag gttattgata tttctcctgg caatcttgattccatcttgt
10321gcttcgcata acatattctg catagaagtt aaataagcag tgtgacaatatacagccttg
10381acgtactctt ttcccaattt ggaaccattc tgttgttcca tgtctgattctaactgttgc
10441ttcttgactg aaataaatag gtagaatgaa ccaaaaagca agctacaccaaatctactga
10501tgctttgatg tactttccag cctccataac tgttggtatt tgtaaggcaccagtccatag
10561tagcccaaac agaccaagac accaccatcc ttgttgtcat cattagtcaaatatattgga
10621ctcccaatat acttgcttta attgtcagtt catcacaata aactgtaggtcatatcttta
10681ttaattgtta tggtatacca aagaagacaa gaactcattt cccattggtaagtggtttag
10741cactatactc aaatccaagg acatgaccaa gttaatcctg aaactgcagttttgaatggt
10801ggtaccatta aagaccatcc tctgcactgt atcggttaag attcagtgagcagacaagga
10861acacatcagt tattttaaga gggaaaattt aatataaaga cttattaacaagaagctggg
10921gatgaaccag aggacattaa aaaaaaaaat caccttaaca ataccataggatggcctgct
10981tactcagtca tatctgactc tttgcaaccc cacagactgc agcctgataggctcctcggt
11041agacggaatt ttccaggaag aatatactgg agctataaaa aggaacacatctgagtcagt
11101tctaatgaag tggatgaact gttatattat acagagtgaa gtaagtcagaaagagaaaga
11161caaatgtcat atattaatgc atatatatgg aatctagaaa gatagtactgacaatcctac
11221ttgcatggca gcaaaggaga cagacatttg gggcactgta ggagaagaaggtggcatgat
11281ttgggagaat agcactgaaa catatacatt atcatataca aaataaacagccagtggaac
11341aatgtatgat gcagtgaaca aaaagccagt gctctgtgac aacacagaggggtggatggg
11401gagggaggtg gaaggggtca agaagagggg ttcaagggtg ggaagagttcaagaaggaag
11461gtatacatgt atacttaatg ccgattcatg ttgatgtatg gcaaaaaccattacaatatt
11521gtaaagtaat tatcttctaa tttaaaaaca tttttaatta aaatttaaaaaaaagaatac
11581tggagtgagt tgctatttcc tcctccaggg catctttccg acccagggattgaactcatg
11641tgtcttgtgt ctcctgcatt ggcaagcaga cttgtttaca ctgcaccacctgggaagtcc
11701accctaggat tgagagtact caaggaacaa tttggaaaga ggggccctctccccaaggct
11761gagattcaga cttcattaaa gagagagtag ctgcagcgca gcggatgacggagcagtttg
11821tggcgttacc ctgggccaga cctggtccat agctggtggg ctgaagttgtcaaacagggc
11881acttccccct ggagtgtcca ggtctgcaca ggaaactgtg ggccacgactgagcagggga
11941ctgagtagga actgcctgcc agcatgacag caaaaccaac tggagggtgagctgcactga
12001acattctgca atcacattac ggcaactctt ccttggagca aaaagagaggacctacacaa
12061gcacgagcag cccgttcctg cggtgtcctt ccagtgccct ctgctgacgaagcctgccat
12121cgtgccagct ggcaaaggaa acatgctcac aaggtccaac tccgttattacaaagcagag
12181cagaggcaat ggactcagaa ggacagcagt caactgagag ctgtcacaggccattgggag
12241gaggaaaggt ttattcctgt tcttaagcaa aatgagttaa aaataggcctggaaaattgc
12301tttgatgata aaagcaagga atcattcaaa gacataatga aatcatatacaagggaccaa
12361agagcagact tcaaggagac ttctattggc caaaactgga gtaatttgagaataaaaaga
12421ataatggaag taatagatta tgacaaattg aatttcttaa ttccattagtacatagtgag
12481actgtaagag agcatgaaag aaaggtcttc tttgtagatg aatgccagttaataataata
12541aatgtagagg aaagagaaaa ttacaaactc attttgcaac ccacagtgtaatattgattc
12601aggaaatgat cactaatgaa tggcaaaaat ccttgcagag aaggttattgggaacaggaa
12661attcgactgg tctcagaaca ttactccact aatcactaat tccaaaggaagaagatgctt
12721ttaactagaa agatttacta ctcactctct tcatccagta atcagacagcttcactaatg
12781gaactgctaa atatgtgtct tctgccgctg ctgctgctaa gtcgattcagtcgtgtccga
12841ctctgtgcga ctccatagac ggcagcccac caggctccgc catccctgggattctccagg
12901caagaacact ggagtgg
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 安徽省天长市周氏羊业有限公司
<120> 一种SPP1基因及评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法
<130> NO
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12917
<212> DNA
<213> 绵羊(Ovis aries)
<400> 1
gagcactgca tcagcatcac aggggactgg actcttctct gctgctgcag accaaggtaa 60
gcctgcagtt tgctacttga cttctgtcct ccctgtgcgc tgcctcattt cactgggaag 120
gtcagtttgt aaggaaaaga gtacaatggt aaacgctgtt aatcagactt gagttgttct 180
tgtcttttga atatgcatgc cagatccagg gctgatgtcc tgcaggaaag gtggctggtt 240
attttgaaag acagtcgaat ataaaactta aaaatatttc catggagtcc tcaaaagaac 300
tgagactact ttttttcagt caggaaataa aagaaaaatt ctatgcccct ttgggatgat 360
tgtatataca tcattttaaa tggatagatg accaagcatt ttaaaaggaa aatgcttttt 420
agtattcata taagctgatt ttaacgctaa tttttaatga tttgatttat ccctttgtat 480
ttagctatta aaatttcacc caaatatcta tatgatactg tttagactta caaatagaaa 540
agctgttgac ttcagtgttt tcgttttcat ttcaaacttc tagaatacct tgaattacta 600
actttagaga cagcttcatt tcacctaagt aatacctttt aaataattga aaatcacatt 660
tgaaatgcac attggaaaat ggagacagca agtttctctt tcttatattt attttctctc 720
ttcgtgtttt tcttctctga aatgtaaata ttctcattct tgctttatta ttttaattca 780
attactgctg atctgttttt aggtttagat agctggagat atcaggaagt aatggtgtaa 840
tctctgaaac tctaaatgtt aaagtcgaat aaatatagac ttgtaaaatt cttctctccc 900
ttgcctaata gtgagagatg gaaaatagag gtggcagtac aaatattaac tcaaaagatc 960
ataatattta aaagaaatca gtcgagtatt tccacacaaa atacatattt atttgtgatg 1020
attttgtaat gtggtagcct caaaaaaagt atcactgttt tcaccttaga aaagataaaa 1080
tatttcttac aaaatatttt gcagaaaaaa atcatgacca tgagaattgc agtgatttgc 1140
ttctgcctct tgggcattgc ctccgccctt ccagtgagta caactgaatc tttttttaaa 1200
aaaaaagccc ttaaaataaa tgaattgtgt gtttcaatgt tgctaggaac aggttcacac 1260
tgtaatcttt cttcaccttt ctatttcaaa ggttaaaccg accagttctg gcagctctga 1320
ggaaaagcag gtaagcatct tttcggttta ttatatagtt atttatgcaa ctgctgcaag 1380
atgtactaca aacatatgac aattttactt atttgcacaa ataaaataac tgaaaagtat 1440
ttattgggtg cctgctaggg ttctagtgca gtaccaagca tagcattgct tttaattaat 1500
acagtctctt aaaactatac tagatttctt aatacaataa aatgatgctt taggtcgatc 1560
atttctataa aatgagttct gtgaagttgt gtgactttat attcacagta tctctgaaga 1620
tatttgctaa gaaacccatt atcttaaaaa aagtatattt atgctgtttg tatctattgt 1680
gcttatcaga tgactttaga tttttctaac caaacataag accaaatcaa actcttcata 1740
attattccac ccggcaccat agatgtacct gtccctccac aataggtgaa agcgtgccag 1800
ccaaacaaca aacgggtatt gtcccaagga gcttgaacag aaaggcacac agggttcaat 1860
tccagataaa cagaataaag gccaatacag agctgtctga ggtcactgca gttagattgc 1920
tcaatgaaga tgttaggaga agtactgcag tgggtgttta gatatgcaaa taggcatgtg 1980
taagtgtgtc tgttttccaa ctgatctaag aacacaagta ttgaaatcat aataataagc 2040
cagaaaatta acatttccag agaaaataga ggtcacactc tttgaggcaa taattagtgc 2100
ctttttaata gaataaaata gggcacatga agctatggca gtgtaagtgg ttaaatgtta 2160
actaagagat aagtggagat gagaatcttc tagaatccta gaaatgtaga gctagtagga 2220
agtatggaaa gtctagaaag agacacccct gaagatgaaa acacttgtta tctatgagtg 2280
atatgattac tgaacaattt tagtttgttt ttcttatctg tatgttcttc atattacttt 2340
ttaaaaatta taaatttatc ttatgaatac agataaagaa tgattacata tatcatcagg 2400
aaaatatatt aattatatat caattataac atttctgtaa atattatata tatatttata 2460
taaatacata ttttaaagaa aaaaacaggg aacctttgaa ctcatctaca gcaatagttt 2520
tcacattttt tagttaaaga aaacccttct ttcagcgaaa accttcatag aagtccaata 2580
tgaaactgct ctggttagag ccagacatgg ggaaacccaa agtgctagtg actagtttcc 2640
ttcctttctt cccctccttg cctgtgaaag aattcttgaa acccctaggg taactcttct 2700
cagtgacaga gatgtgaagt gattgccctg ggccatgcag cccaccagat gacacttatt 2760
tagagcaatt tccactcctc tgcactagca tcttattgct atttcccaga taaataattt 2820
ggctgagtga aagatcattc cattcatgtc tttggcagct tacaacaaga gaacttttat 2880
gcaatggtgt tgatattaga tttctgcact gtccacaggt agccataaac acatgcggct 2940
gttggacact cacaatgtag ctagtgccag agaagatagt tttctttatt aacttaaata 3000
gccatgtgtt tcatggctag aggataccat tcaccacagc acagcctgag agagtttctt 3060
cttacataga ggaaggaaaa aaggaagacc agtgctaatt aagggcagtt ctgccttagt 3120
tgtgtttcat ctgaggaatt tcagctatca gacatagaac aggaaggcag tgtatcatca 3180
gtgtgaggag ccattggagt taaaccctgg ctctgctact tattatcact taactttatt 3240
gtgggcttcc catctggtgg ctcagatgct aaagagtctg cctgcagtgc aggagactcg 3300
ggcttgatcc ctggatcagt caggaagatc ccctggagaa aggaatggct atctactcca 3360
gtattcttgc ctggagaatt ccgtggacag agactgaagg aataataata atgatgatga 3420
tgatgatgat actcatctca ggattaaatg aattagtatt tataagttac tttgaaagta 3480
tgcctggctt acagtaagtg ctatgtaaaa gtctgttaaa tgaatctatc agaaagaata 3540
attatgaaag acatcactaa ggttctaatt gactaaataa tgcatattat gcttatctgt 3600
caagattggg gaagaatagt tgttatttca gcttatcact tagagaccct tgtttcttta 3660
aaagataata ataataatga caaatatgca actctctttt gtagcttaac aacaaatacc 3720
cagatgctgt agccacatgg ctaaagcctg acccatctca gaagcagact ttcctagaac 3780
cccaggtatt ttttcatttt aattaagtct aaatattaaa attctcacaa ttaaagaaca 3840
accactccaa aaaatagcca ccaagcaggc catttgagct ggttaaatgg atctttcctg 3900
cctgtcgcgc ttccctgata gctcagttgg taaagaatcc gcctgcaatg gcttcctggt 3960
ggctcagaca gtaaagcatc tgcctgcaaa ctgggagacc cgggttcagt ccctgggtcg 4020
ggaagattcc ctggagaagg aaatggcaac ccactctagt actcttgcct ggaaaattgc 4080
catggactga ggagcctggt aggctacagt ccacggggtc gcaaagagtc ggacacgact 4140
gagcaacttc actccacttt cctgcctgtt tgtaaaagtg agcttaggac accaatggat 4200
ctgtcaggtt gtctgcccgc ttaatccttc caccaaagag gctagaaaaa taagacctgc 4260
tttggatgga aaaagctaac ttttgaataa aaagttaagt tgtatgatgt acactgattt 4320
gtgtcttttc ttcttcagaa ttctgtgtcc tctgaggaaa ctgatgacaa caaacaaaat 4380
gtgagttttc gctttgattc tgatgtctgc tgtgccttag actcaggaag gcactctttc 4440
tcctaatgac attgcccagg ttcaaattct ggcaaaactc cgttagcaaa tcctccagga 4500
actagttttt attgggacta ttcatatatt tgctgagcaa agggataagt taaatttgct 4560
taagattcta tttgaagata ctgagaatct ataaaagaag ttagataaat gacccaggat 4620
atttgcaaat cagaagtgta atagacatta actggttaac tgagctatag tttctacaca 4680
tggataagag agtcaccttt tgattatcca ggctaatagg gaggtgattt tcgttttggg 4740
ggtgtgcatt aatacatgga ttctctgatc ccctgagaat tttcatttca aatagaaaag 4800
gtaacctcac aattatgtat atgtatttat tggattattg aatttggaaa ttagtgttta 4860
atatgaacaa ggaaaaacag tatcattgat acaagtatta taactcatac atttggcttg 4920
aaaatatcta tgaaaatagt ttttatgaga aagcaagaaa aatgccttag aataggattc 4980
catttaccct tgtgttaaag gggaaattgg aataagctca ttttagcatt taaaagccat 5040
taagtgcttt gttgtgaaca caaagattct aaaactaaat aaagatagta aaatgctaat 5100
gcagtgtaaa gactaagggg caataaaaac cctgacaccc atttttctgg ccatcttgat 5160
ttctagaccc tcccgagtaa gtccaatgaa agccctgagc aaacagacga tctagatgat 5220
gatgatgaaa acagccagga agtcaactct gatgactccg acgatgctaa ccctgatgac 5280
tctgaccatt ccaacgagtc tcaccattct gatgaatctg atgaagctga ttttcccact 5340
gacattccaa caatcgcagt tttcactcca cctttcccta cggaaagcac aaatgatggc 5400
cgaggtgata gtgtggctta tggactgaag tcaaaatcta agaagttccg ccgatctaac 5460
gttgaggtaa gtcttgaata gacacatcag atggttatga ttagagccca attctaggaa 5520
actagagtct gcgtgctcac ttatgtattc attcagcaag tattattact ttatgatcac 5580
taaatacaaa agctttccca cttggttttt gcattcaagt ccacataatt tctccttaat 5640
tttgtctctc aatcacaatg caatttttcc aaatcctgct tataaagcac ttattgtatt 5700
cactttttta attgaaaaag acttcggaaa agagtcatta ttttcacaat atagtggtca 5760
tatcttgaag ttaaacacct aagaactgga gagttgcaaa tcacagactt tatagtcaaa 5820
ggatctggat atggcatata gccttgccat cttactattg accttacttt taactttcga 5880
tccattttct ctttatgtaa aacagataat gagacctacc tcatagattt cctcacatac 5940
ataattcatg tacttattaa actaaaggag atgacataat gaaagaactt ggttttttaa 6000
aaggtaacat gctagtattt tccttttttg cctcagccag atttagacat ttttatagaa 6060
tacttcggtg tggaagttag aaggcattag agaatacagt gcttccctcc ctagctgttc 6120
actgaattct tctcctgttt gtgctgtgat tcagagtcca gatgccacag aggaggactt 6180
cacatcacac atagagagtg aggagatgca tgacgcacct aagaagacga gtcagctgac 6240
tgaccacagc gaagaaacca acagtgacga gcttcccaaa gaactcacgc caaaggccaa 6300
ggaggaaagc aagcattcca atcggatcga gagtcaggaa aattccaaac tcagccaaga 6360
attccatagc cttgaagaca agctagacct agatcataag agtgaagaag acaagcgcct 6420
gaaaatccgc atttctcatg aattagatag tgtctcttct gaggtcaact gaaaggagaa 6480
aatacaagtt cttactttgc ttttagtaaa aagaaaagga tatgttaaag cagggtggga 6540
gacaatatga aatgcgtatt tctcagctta gttggtgaat gtatatgtgt gtagatctgg 6600
aaacagatca tgtttttgat cattagttta gtgtgtggct tcatggtaac acccttataa 6660
actaaaagct tcagggttta gtctatgttc tttccacata aaaaatgcaa accatcacag 6720
cattttaatg tttgctaccc ttttatgaat agaaattcat gtagaagcaa acaaaatact 6780
gttacacact tttaagaagg aatataaaat ttcacgtcac tatgatcttt tgttttttaa 6840
attagtatat attttgttgt gattattttt tctgttgtga ataaatcttt tatcttgaat 6900
gtaatgagag tctggtggta tcagttgtgt ttcttatttg gtttcctaca gttgcctagc 6960
aattataaat gtaatcattt taattacatt agcatgctgg acataataca gagcaatcta 7020
agacctgctg ggtcaattat acagactctg actgagctac agttcctgtc gaggaaagaa 7080
gagtcaagca ggggttgata ttcaatcagg aatgctccaa ccatgcaagg gtccctgggt 7140
cacttccacc tgatgaaagc agcctttttc taattttcac aacgctgata caaaagttaa 7200
taagggcttc cctaatggct taatggttga gaatcctcct gccaatacag gggacatggg 7260
ttcaatccct gatccaggaa gatcccacat gccgcccgag caccacaact actgagccca 7320
catgcctaga gcccgcgttc cacaacaaga gaagccgcca caagaagcag ctcctgcact 7380
gcaaccaaga gtagccccca ctccccacaa ccagagatgg ccggcgtgca acaacaaaga 7440
cccagcagcc aaaaaagtaa ataaatcttt ttttaaaaaa agaaaagcta atgagtgcct 7500
agatgcaaca acaaatcaat ttcactgttt cttgtcattc tccattgatt ctctcaatat 7560
tggttccttg cccttggatg acaacttggt acttcccata gctattctga tcatctgtag 7620
atattgaaca aatagtcctt tttttattgg aaaaaaccta aatgcagtct cagctaatac 7680
tcaaaatttt caacttcatt caaaactaaa agttctggaa acctggagca cgttcctgta 7740
tttcatgctt agctcctctg ctcttcctaa aactagaaac cccattggaa aatttttaat 7800
tattaaacaa ctcttgggat aaagtggaaa atttttaatt gcagaatttc tttaaaagtg 7860
ttgtaatgaa atgtaaactc aatagagtac agttaaactg gtgatcacag aaaatccata 7920
gccttaaatt cttgcagcaa caacaaaaag aatgaaaata aatatataaa tacattgagt 7980
tcccatctta aaaattagaa aagaacaaca aaggaaaaga aagcataagg aaggaaaaaa 8040
taaagttaaa aataaaagta atgaggtaga gaacagaaaa gcaatagaaa ctaatcaaac 8100
aaaatgctga ttctttgtta aaaaaaacaa atcagcacaa cagataaacc actagctgac 8160
ccaataaagg aagaaaggga gaaaacacaa ataagaaata aaaacaagga gacaaccaag 8220
gacatgacaa aattttataa atcaaaagtg actcactttg cacaagtcaa acagaaaata 8280
taagtgaatt ggattatttc ctaggaaaat acaatttacc aaaattgact ttgctaatca 8340
tagaaaacac aaatggaaat tttctatagt ggaaaaagaa aaagttatca aagaactatc 8400
cataaaaact aggcccaaat gattttacag tggaatttaa tcaaaacttc aaagactaga 8460
taatcccaat accatttaaa ttgtagtaga aaaggaaaac tctcaaatga cctttataaa 8520
acaagtatta ctttgacaca aacctggtaa tgattgcaaa cacatacaca caccatacat 8580
acacatacat acacaaccat aaatcagtct cacttgtgac tggcaatggg aaaatcctaa 8640
ataaaatgcc agcaaacaca atctgaaatc aagtttaaag aatgcatcat aatcaggggg 8700
atttatttcc aggaaatgat gcttcagtat tagcaaattc attcctataa tggatcatct 8760
cattaaatct agattgaaag atgtcatatg attagatctc cgtctgaata ctagcatcat 8820
tattaatgga gaaggattac aggtatttcc attaagaaca aggaccaagt aagcttctcc 8880
tttctctctg ctattatata acatagcttt ggagatataa gctagcaatc ataagcattt 8940
agaggcataa gaagtgagaa ataaattatg tttttatgta aactaatact atacctagaa 9000
aacacagaat aagtactaaa aataacaact aacaagttct gtaaggaagc atgatataaa 9060
attcagctga aagcatattt acaaaaaaca ctaagtgatc atttaaaaga tacaatgtta 9120
ttaatataga aacaaagaaa gataaaatac ttaacagaaa atgtgctaaa actattttgg 9180
aaaactgtga aacactcctg taaactaaaa aaaaaagagg cctgaaacaa atagaaaggc 9240
tctgtttatt ctcacacagg aaaatccatc attaacatat caatactccc ttcataacat 9300
aaatgcaatg tgattccaaa taaaagaaaa gtcatttttt ccctgaagct atgcaagcta 9360
attctataat ccatatggaa aagtaaacat acaacaatat gaaggaaaat cctgaaaaat 9420
aaaagcagta agcgagaact acccctaaca aatattaaga ccataaagcc tccctaataa 9480
aaacactgtg gtatcagcaa ataaatacat ttgttgttgt tcagttgctc agttatggtt 9540
aactctttgc aaccccatgg actgcagcat gccaggcttc cccgtccatc accatctcct 9600
ggagcttgct cagactcatg tccattgagt cagcgatgcc atccaaccat ctgtcctctg 9660
tcatcccctt ctcctgcctt caatctttcc caggatcagg gtcttttcta gtgtcagctc 9720
tttgtatcag gtggccaaag tatgggagct tcagctcctt ccagtgaata ttcaggactg 9780
atttccttca ggattaactg gtttgatatc cttgctgtcc aagggactct caagagtctt 9840
ctccaacacc acaattcaaa aggatcaatt ctttagcact cagccttctt tatggtccaa 9900
ctctcacatc catacatgac tactgggaaa accacagctt tgactagatg gacctttgtt 9960
ggcaaagtaa tgtctctgct ttttaatatg ctgtctagtt tgtcatagct tttcttccaa 10020
ggagcaagcg tcttttaatt tcatagctgc cgtcaccatc tgcagttgtg ttggaacata 10080
aggagataaa gtctgtcact gtttccattg tttccccatc tatttgccat gaagtgatgg 10140
gaccagatgc aatgaccttc attttttgaa tgctgagttt taagccagtt tttttcattc 10200
tgctttttca ccttcatcaa gaggctcttt agttcctctt cgctttctgc cataagggtg 10260
gtgtcatctg catatctgag gttattgata tttctcctgg caatcttgat tccatcttgt 10320
gcttcgcata acatattctg catagaagtt aaataagcag tgtgacaata tacagccttg 10380
acgtactctt ttcccaattt ggaaccattc tgttgttcca tgtctgattc taactgttgc 10440
ttcttgactg aaataaatag gtagaatgaa ccaaaaagca agctacacca aatctactga 10500
tgctttgatg tactttccag cctccataac tgttggtatt tgtaaggcac cagtccatag 10560
tagcccaaac agaccaagac accaccatcc ttgttgtcat cattagtcaa atatattgga 10620
ctcccaatat acttgcttta attgtcagtt catcacaata aactgtaggt catatcttta 10680
ttaattgtta tggtatacca aagaagacaa gaactcattt cccattggta agtggtttag 10740
cactatactc aaatccaagg acatgaccaa gttaatcctg aaactgcagt tttgaatggt 10800
ggtaccatta aagaccatcc tctgcactgt atcggttaag attcagtgag cagacaagga 10860
acacatcagt tattttaaga gggaaaattt aatataaaga cttattaaca agaagctggg 10920
gatgaaccag aggacattaa aaaaaaaaat caccttaaca ataccatagg atggcctgct 10980
tactcagtca tatctgactc tttgcaaccc cacagactgc agcctgatag gctcctcggt 11040
agacggaatt ttccaggaag aatatactgg agctataaaa aggaacacat ctgagtcagt 11100
tctaatgaag tggatgaact gttatattat acagagtgaa gtaagtcaga aagagaaaga 11160
caaatgtcat atattaatgc atatatatgg aatctagaaa gatagtactg acaatcctac 11220
ttgcatggca gcaaaggaga cagacatttg gggcactgta ggagaagaag gtggcatgat 11280
ttgggagaat agcactgaaa catatacatt atcatataca aaataaacag ccagtggaac 11340
aatgtatgat gcagtgaaca aaaagccagt gctctgtgac aacacagagg ggtggatggg 11400
gagggaggtg gaaggggtca agaagagggg ttcaagggtg ggaagagttc aagaaggaag 11460
gtatacatgt atacttaatg ccgattcatg ttgatgtatg gcaaaaacca ttacaatatt 11520
gtaaagtaat tatcttctaa tttaaaaaca tttttaatta aaatttaaaa aaaagaatac 11580
tggagtgagt tgctatttcc tcctccaggg catctttccg acccagggat tgaactcatg 11640
tgtcttgtgt ctcctgcatt ggcaagcaga cttgtttaca ctgcaccacc tgggaagtcc 11700
accctaggat tgagagtact caaggaacaa tttggaaaga ggggccctct ccccaaggct 11760
gagattcaga cttcattaaa gagagagtag ctgcagcgca gcggatgacg gagcagtttg 11820
tggcgttacc ctgggccaga cctggtccat agctggtggg ctgaagttgt caaacagggc 11880
acttccccct ggagtgtcca ggtctgcaca ggaaactgtg ggccacgact gagcagggga 11940
ctgagtagga actgcctgcc agcatgacag caaaaccaac tggagggtga gctgcactga 12000
acattctgca atcacattac ggcaactctt ccttggagca aaaagagagg acctacacaa 12060
gcacgagcag cccgttcctg cggtgtcctt ccagtgccct ctgctgacga agcctgccat 12120
cgtgccagct ggcaaaggaa acatgctcac aaggtccaac tccgttatta caaagcagag 12180
cagaggcaat ggactcagaa ggacagcagt caactgagag ctgtcacagg ccattgggag 12240
gaggaaaggt ttattcctgt tcttaagcaa aatgagttaa aaataggcct ggaaaattgc 12300
tttgatgata aaagcaagga atcattcaaa gacataatga aatcatatac aagggaccaa 12360
agagcagact tcaaggagac ttctattggc caaaactgga gtaatttgag aataaaaaga 12420
ataatggaag taatagatta tgacaaattg aatttcttaa ttccattagt acatagtgag 12480
actgtaagag agcatgaaag aaaggtcttc tttgtagatg aatgccagtt aataataata 12540
aatgtagagg aaagagaaaa ttacaaactc attttgcaac ccacagtgta atattgattc 12600
aggaaatgat cactaatgaa tggcaaaaat ccttgcagag aaggttattg ggaacaggaa 12660
attcgactgg tctcagaaca ttactccact aatcactaat tccaaaggaa gaagatgctt 12720
ttaactagaa agatttacta ctcactctct tcatccagta atcagacagc ttcactaatg 12780
gaactgctaa atatgtgtct tctgccgctg ctgctgctaa gtcgattcag tcgtgtccga 12840
ctctgtgcga ctccatagac ggcagcccac caggctccgc catccctggg attctccagg 12900
caagaacact ggagtgg 12917
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
agcagcagag aagagtccag 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ggatccagca gcagagaaga gtccag 26
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ctcatcgata gacatattcc acctgctcc 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
catggatcca gcagcagaga agagtccag 29
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cgtgcaaatt atcctgtt 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
cagtttatga ccgaaagc 18

Claims (9)

1.一种SPP1基因，其特征在于，所述SPP1基因为评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的分子标记，且所述SPP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于，选择绵羊第14号染色体SPP1基因的启动子区域设计扩增引物。
3.根据权利要求2所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)绵羊卵巢组织基因组的提取；
(2)绵羊SPP1基因启动子的扩增；
(3)SPP1基因启动子序列同pLV-mCherry构建重构载体；
(4)介导SPP1基因启动子-mCherry转染病毒包装；
(5)绵羊卵巢卵泡的体外培养；
(6)SPP1基因启动子-mCherry在绵羊卵巢卵泡中的表达和检测；
(7)绵羊卵泡体外培养体系的完善和优化。
4.根据权利要求3所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于：步骤(2)的具体过程如下：
(2.1)以基本的扩增引物为基础，经在扩增引物前添加酶切位点，再在得到的添加酶切位点后的扩增引物5’端加上保护碱基得到SPP1基因启动子，具体做法如下：
(2.1.1)首先，设计核苷酸序列如下所示的基本的扩增引物：
基本的扩增引物的核苷酸序列长度为1925bp，
上游引物F：5’-AGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
下游引物R：5’-AGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.1.2)然后，在上述基本的扩增引物前添加酶切位点，得到了添加酶切位点后的扩增引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物添加酶切位点为ClaI，
F：5’-ATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
下游引物添加酶切位点为BamH I，
R：5’-GGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.1.3)最后，选择在添加酶切位点后的扩增引物的5’端加上保护碱基：
上游引物添加保护性碱基为CTC，
F：5’-CTCATCGATAGACATATTCCACCTGCTCC-3’；
下游引物添加保护性碱基为CAT，
R：5’-CATGGATCCAGCAGCAGAGAAGAGTCCAG-3’；
(2.2)PCR扩增SPP1基因启动子
(2.3)1％琼脂糖凝胶电泳回收SPP1基因启动子序列。
5.根据权利要求3所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于：步骤(3)的具体过程如下：
分别用限制性内切酶Cla I和BamH I切SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，酶切后采用1％琼脂糖凝胶电泳分别回收SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，再用T4连接酶连接SPP1基因启动子序列和pLV-mCherry载体，构建重构载体。
6.根据权利要求5所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，在完成构建出SPP1基因启动子序列同pLV-mCherry重构载体前，先采用绵羊SPP1基因启动子鉴定引物进行鉴定，以检测重构载体中SPP1基因启动子序列是否正确；其中，SPP1基因启动子鉴定引物的核苷酸序列如下：
上游引物F：5’-CGTGCAAATTATCCTGTT-3’，
下游引物R：5’-CAGTTTATGACCGAAAGC-3’，
鉴定片段序列长度为389bp。
7.根据权利要求3所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于：步骤(4)的具体过程如下：
利用培养皿包装含pLV-SPP1基因启动子-mCherry质粒的病毒，并收集包装病毒培养液。
8.根据权利要求3所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于：步骤(5)的具体过程如下：
取绵羊的卵巢组织，然后在体视显微镜下剥取绵羊单卵泡，清洗后，添加卵泡培养液置于培养箱中培养。
9.根据权利要求3所述的评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量的方法，其特征在于：步骤(6)的具体过程如下：
将收集到的包装病毒培养液，经离心、过滤后，加入新鲜卵泡培养液和基因转染增加剂Polybrene，添加到卵泡培养体系中进行卵泡培养，荧光显微镜下检测绵羊卵泡卵母细胞中红色荧光蛋白表达水平和强度，即可评估绵羊单卵泡中高尔基体发育质量和相关培养体系。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103911374A (zh) * 2014-03-26 2014-07-09 中国农业大学 与奶牛乳脂率性状相关的分子标记及其应用
CN107155350A (zh) * 2014-07-30 2017-09-12 马修·库珀 用于诊断、预后和确认先兆子痫的方法与组合物

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