CN113502299B

CN113502299B - 一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法

Info

Publication number: CN113502299B
Application number: CN202110819041.3A
Authority: CN
Inventors: 韩红兵; 王梦瑶; 连正兴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113502299A

Abstract

本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法。具体地公开了一种将TLR2‑4嵌合基因(SEQ ID No.1)导入山羊的体细胞中，由转化的体细胞再生出遗传修饰山羊的方法，所述TLR2‑4嵌合基因包括TLR2基因的胞外区、TLR4基因的跨膜区与胞内区。本发明使用CRISPA/Cas9系统将TLR2‑4嵌合基因定点整合到山羊SETD5基因第一内含子上，利用体细胞核移植技术制备表达TLR2‑4嵌合蛋白的转基因山羊，构建的转基因山羊提高了抗金黄色葡萄球菌能力并且增强了免疫力，达到通过山羊自身的先天免疫有效防控金黄色葡萄球菌引起的山羊乳腺炎的目的。为抗金黄色葡萄球菌山羊新种质的制备奠定基础。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法。具体涉及在山羊细胞中表达嵌合TLR2-4基因抗金黄色葡萄球菌的方法。

背景技术

山羊乳腺炎(goat mastitis)是由病原菌引起的山羊最重要疾病之一。细菌学分析显示，山羊乳房分离的细菌以金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，S.aureus)最多(40.5％)。该病的临床表现为山羊乳房明显异常，疼痛、脓肿、发热，乳汁产量迅速下降，导致山羊泌乳机能受到严重影响，急性的乳腺炎甚至会造成山羊死亡。该病在全世界大范围流行，患病山羊生产的乳品对公共卫生构成严重风险，因为它可能与人类的乳源性疾病有关。除了造成卫生和健康问题外，产奶量下降、奶质差、过早扑杀动物和治疗成本的增加给畜牧业造成巨大的经济损失。山羊乳腺炎是对山羊养殖业危害最严重的疫病之一，因此，针对山羊乳腺炎急需一种良好的解决办法。

抗生素注射是治疗该病的常用手段，常用的乳房炎治疗抗生素有青霉素、四环素和链霉素，但由于S.aureus染色体DNA的固有耐药性以及抗生素的大量使用，S.aureus已经成为耐药菌感染的主要病原菌之一，呈现出对多种抗生素耐药的特点。除了对青霉素类、头孢菌素等常用抗生素耐药外，临床上分离到的S.aureus还对万古霉素、替考拉宁、利奈咗烷和大环内酯类抗生素药物具有不同程度的耐药性。而且抗生素药物残留在山羊体内，还存在严重的食品安全隐患，会给人类的健康带来影响。因此，抗生素治疗山羊乳腺炎的应用频率逐年变低，应用效果也越来越差。

疫苗接种是目前预防山羊乳腺炎的重要措施，既能增强山羊的抵抗能力和免疫能力，还不会有药物残留，能较大程度的保证乳汁安全和卫生，而且操作简便，成本不高。但由于山羊所处的环境、地域、气候各不相同，所以疫苗的免疫效果往往只是短期见效，不具备长期效应，预防效果欠佳。针对这种情况，国内外的相关兽医学专家也正在积极对奶山羊乳腺炎免疫接种进行持续评估，旨在研制效果更为显著的预防山羊乳腺炎的疫苗，但是目前尚未取得突破。因此，如何更早的发现和清除细菌，控制炎症的发生就显得尤为重要，目前针对金黄色葡萄球菌的先天免疫防御研究正受到广泛的关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何从分子水平、早期、有效地防控山羊乳腺炎，增强山羊的免疫力。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备遗传修饰山羊的方法，所述方法包括如下步骤：将TLR2-4嵌合基因导入作为转基因受体的山羊体细胞中，得到转化的体细胞，由所述转化的体细胞再生出所述遗传修饰山羊(又称为TLR2-4转基因山羊，表达TLR2-4融合蛋白的山羊)，所述TLR2-4嵌合基因编码的嵌合蛋白质包括TLR2的胞外区和TLR4的跨膜区与胞内区。

所述体细胞为离体的细胞。

上述方法中，所述嵌合蛋白质还包括信号肽和/或标签蛋白。

本领域技术人员应当理解，在研究某一目的蛋白功能时，将一个通过各种方法可以检测到的标签蛋白的基因和目的蛋白的基因进行重组融合，产生的融合蛋白除了目的蛋白本身，同时会带上可检测的标签蛋白，这样目的蛋白也一并检测到，其目的在于能够定位目的蛋白或研究蛋白相互作用，因此，适用于本申请的标签蛋白并不局限于特定种类。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

进一步地，所述信号肽可为TLR2的信号肽和/或所述标签蛋白可为Myc。

上述方法中，所述TLR2的胞外区为下述任一种蛋白质：

P1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第31-597位的蛋白质；

P2)将P1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与P1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

所述TLR4的跨膜区与胞内区为下述任一种蛋白质：

Q1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第598-805位的蛋白质；

Q2)将Q1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Q1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

所述嵌合蛋白质具体可由所述TLR2的胞外区和所述TLR4的跨膜区与胞内区连接而成，也可由所述信号肽、所述TLR2的胞外区和所述TLR4的跨膜区与胞内区连接而成，也可由所述标签蛋白、所述TLR2的胞外区和所述TLR4的跨膜区与胞内区连接而成，也可由所述标签蛋白、所述信号肽、所述TLR2的胞外区和所述TLR4的跨膜区与胞内区连接而成。

上述方法中，所述TLR2-4嵌合基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。

SEQ ID No.1所示的TLR2-4嵌合基因编码SEQ ID No.2所示的TLR2-4嵌合蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码TLR2-4嵌合蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TLR2-4嵌合蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TLR2-4嵌合蛋白质且具有TLR2-4嵌合蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本发明所述TLR2-4嵌合基因能显著提高山羊成纤维细胞对金黄色葡萄球菌的抗性，增加细胞因子和趋化因子的分泌。

上述方法中，所述将TLR2-4嵌合基因导入作为转基因受体的山羊体细胞中为将所述TLR2-4嵌合基因导入到山羊SETD5基因第一内含子中。

所述导入到山羊SETD5基因第一内含子中的具体位点为SETD5-IN；所述SETD5-IN是大小为2kb的双链DNA分子，所述SETD5-IN的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

所述导入可为通过显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、体细胞核移植法、精子载体介导法、受体介导法等，将所述TLR2-4嵌合基因导入受体动物。

在本发明的一个实施方案中，所述导入可为利用CRISPR/Cas9系统进行。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括如下A1)或A2)：

A1)sgRNA，所述sgRNA特异性靶向于SETD5-IN，所述SETD5-IN是大小为2kb的双链DNA分子，所述SETD5-IN的核苷酸序列为SEQ ID No.3；

A2)表达A1)所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

上述方法中，所述sgRNA识别区的核苷酸序列可为SEQ ID No.4。

所述sgRNA名称为SETD5-IN-sgRNA2，靶点序列(SEQ ID No.5)为：ACTACACATTATAGATGACT(SEQ ID No.3的第868-887)，相应sgRNA识别区序列如SEQ ID No.4所示，相应sgRNA识别区的编码DNA序列为：AGTCATCTATAATGTGTAGT。

上述方法中，所述再生出所述遗传修饰山羊为利用体细胞核移植技术进行。

上述方法中，所述方法包括如下步骤：

B1)构建CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体包括SEQ ID No.4所示的sgRNA；

B2)构建供体质粒，所述供体质粒包含SEQ ID No.1所示的TLR2-4嵌合基因；

B3)CRISPR/Cas9载体和供体质粒共转染山羊胎儿成纤维细胞；

B4)筛选、鉴定阳性克隆细胞作为供体细胞；

B5)将所述供体细胞注射到去核的山羊卵母细胞，得到重组胚胎，将所述重组胚胎植入同步发情的受体山羊输卵管中，获得所述遗传修饰山羊。

上述方法中，B2)所述供体质粒为双切型供体质粒，即以pRosa26-promoter为骨架载体，在上下游分别添加BamHI及XbaI酶切位点；双酶切pRosa26-promoter载体，将poly(A)克隆到载体上；用XbaI和ScaI-HF双酶切，通过无缝克隆将右同源臂HA-R插入poly(A)后；用Acc65I和ScalI双酶切载体，在pRosa26-promoter载体上游引入PacI酶切位点并插入左同源臂HA-L，得到重组载体pRosa26-HA，在同源臂外侧各添加一个sgRNA识别位点；用PmlI和EcoRI-HF双酶切pRosa26-HA，在pRosa26-promoter与poly(A)之间插入TLR2-4基因，得到重组载体pRosa26-TLR2-4；用SacI-HF单酶切pRosa26-TLR2-4，在HA-R下游插入CMV-tdtomato，获得完整的pRosa26-TLR2-4供体质粒，简称为pR-T2/4。

上述方法中，所述遗传修饰山羊为抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊。

所述遗传修饰山羊的巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬能力高于作为转基因受体的山羊的巨噬细胞。

所述遗传修饰山羊的巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除能力高于作为转基因受体的山羊的巨噬细胞。

本发明还提供了所述方法在动物育种和/或培育抗病山羊中的应用。

本发明提供了表达TLR2-4融合蛋白的山羊制备方法，利用CRISPR/Cas9系统将TLR2-4嵌合基因定点整合到山羊SETD5第一内含子上，筛选中靶细胞，利用体细胞核移植技术制备转基因山羊，从转基因山羊外周血分离TLR2-4巨噬细胞，使宿主机体获得更强的清除S.aureus的能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

表达TLR2-4嵌合蛋白的山羊制备方法，具体步骤如下：

(1)构建基因打靶载体pX458-Cas9-sgRNA

a、鉴于基因内含子对突变容忍度较高的特点，选择了其上游基因SETD5的第一内含子上的一段序列进行靶点筛选。该区域内不存在可变剪接结合位点，对其进行基因编辑不会对SETD5基因及邻近基因的表达产生影响。在该区域的DNA双链上寻找PAM区，获得了148个靶点序列，靶点的长度为20nt。与NCBI在线数据库进行比对评估脱靶效应，通过在线预测网站对sgRNA结构和自由能进行评估，筛选出8个CRISPR/Cas9基因编辑靶点，与表达GFP的Cas9载体PX458连接，并电转至山羊成纤维细胞中，通过T7E1酶切鉴定结果评估各靶点的基因编辑效率，综合选出最终靶点；

b、用RT-PCR方法分别扩增出TLR2胞外区和TLR4的跨膜区和胞内区，同时在TLR2外显子的5’端添加信号肽及Myc标签，在TLR2外显子的3’端添加20bp的TLR4胞内同源序列，overlap PCR获得TLR2-4嵌合基因(SEQ ID No.1)；为了提高同源重组的效率，构建了双切型供体质粒作为同源重组模板，即在同源臂外侧各添加一个sgRNA识别位点，并且在供体质粒上添加CMV-tdtomato片段，使转染了供体质粒的细胞能够瞬时表达红色荧光；

(2)打靶载体和供体质粒转染山羊胎儿成纤维细胞

将1-3代的山羊胎儿成纤维细胞培养至细胞达到80％汇合时，将打靶载体pX458-Cas9-sgRNA和供体质粒共同电转入山羊胎儿成纤维细胞，筛选出中靶细胞进行接种、扩大培养；

(3)中靶细胞的鉴定

打靶载体pX458-Cas9-sgRNA与供体质粒共转染至山羊成纤维细胞培养3天后，流式分选获得同时表达GFP和tdtomato的细胞。每500个细胞铺至100mm细胞培养皿中，培养约14天，用克隆环挑取细胞单克隆至96孔板中，扩大培养单克隆细胞进行PCR鉴定，细胞单克隆的红色、绿色荧光会在挑取单克隆后的大约7-10天消失；

(4)转TLR2-4基因克隆山羊的制备

将步骤(3)得到的所述中靶细胞核移植到去核后的卵母细胞的透明带下，放入融合液进行融合形成重组胚胎；将重组胚胎植入同步发情的受体羊输卵管中，得到转基因克隆山羊；

(5)转基因克隆山羊的检测

分离出生小羊外周血巨噬细胞，提取基因组DNA和蛋白，进行PCR和WB检测，结果显示TLR2-4基因成功整合并表达；

(6)转TLR2-4基因克隆山羊巨噬细胞清除金黄色葡萄球菌能力的检测

以MOI＝10对转TLR2-4基因山羊巨噬细胞和野生型WT山羊巨噬细胞进行攻菌，结果显示转TLR2-4基因山羊巨噬细胞清除S.aureus的能力明显增强。

本发明提供了一种抗金黄色葡萄球菌的遗传修饰山羊的生产方法，通过构建TLR2-4嵌合表达的基因打靶载体，使用CRISPA/Cas9系统将TLR2-4嵌合基因定点整合到山羊SETD5基因座位点(山羊SETD5基因第一内含子上)，筛选中靶细胞，利用体细胞核移植技术制备表达TLR2-4嵌合蛋白的转基因山羊，构建的转基因山羊提高了抗金黄色葡萄球菌能力并且增强了免疫力，达到防控金黄色葡萄球菌引起的山羊乳腺炎的目的。经过遗传修饰的TLR2-4转基因山羊巨噬细胞通过TLR2的胞外区域识别金葡菌，再通过TLR4的胞内机制增强对金葡菌的清除能力，达到通过山羊自身的先天免疫有效防控乳腺炎的目的，同时可以避免传统抗生素和疫苗的缺陷。为抗金黄色葡萄球菌山羊新种质的制备奠定基础。

附图说明

图1为本发明提供的TLR2胞外区与TLR4跨膜区和胞内区基因拼接的设计。

图2为本发明提供的打靶载体和供体质粒的结构示意图。

图3为本发明提供的中靶细胞PCR鉴定引物设计方案。

图4为本发明提供的TLR2-4转基因山羊。

图5为本发明提供的转基因山羊外周血巨噬细胞RT-PCR检测TLR2-4的表达结果。

图6为本发明提供的TLR2-4转基因克隆山羊外周血巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌后对细菌的吞噬指数。

图7为本发明提供的TLR2-4转基因克隆山羊外周血巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌后对细菌的吞噬率。

图8为本发明提供的TLR2-4转基因克隆山羊外周血巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌后对细菌的清除率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的PX458载体、pRosa26-promoter载体购于Addgene公司；pCMV-tdTomato载体购于Clontech公司；限制性核酸内切酶、T7E1酶、T4连接酶及Buffer购于NEB公司；引物合成及序列测定由苏州金唯智公司完成；无缝克隆试剂盒GeneArt GibsonAssembly购于Thermo Fisher公司。金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC29213)购自上海北诺生物科技有限公司

实施例1TLR2-4转基因山羊的制备

1、TLR2-4嵌合基因的制备

参照GenBank中山羊TLR2和TLR4的外显子序列设计并合成2对引物，引物序列如下：

TLR2基因扩增引物：

Forward：5’-GCCTCTGATCAGGCTTCTTC-3’

Reverse：5’-CCTAGGACCTTATTGCAGCT-3’

TLR4基因扩增引物：

Forward：5’-ATCATCAGCGTGTCGGTTGT-3’

Reverse：5’-TCAGGTGGAGGTGGTCGCTT-3’

提取山羊血液RNA，反转录合成cDNA，以此cDNA为模板利用上述引物，用RT-PCR方法扩增出山羊TLR2和TLR4基因片段，并利用下面的引物，在TLR2外显子的5’端添加信号肽及Myc序列，同时在TLR2胞外区外显子的3’端添加20bp的TLR4胞外区同源序列。

Forward：ATGCCACGTGCTTTGTGGACAGCGTGGGTCTGGGCTGTAATCAGCGTGTTCACGGAAGGAGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGGCCTCTGGCCTCTGATCAGGCTTCTTCCCGGTGGCATTCAGAAAGGGA

Reverse：ACAACCGACACGCTGATGATCCGGTGGCATTCAGAAAGGGA

将上述获得的TLR2胞外区外显子序列克隆至平末端载体。利用下面的引物进行Overlap PCR构建TLR2-4嵌合基因(图1)。

Forward：ATGCCACGTGCTTTGTGGAC

Reverse：TCAGGTGGAGGTGGTCGCTT

通过Overlap PCR获得的信号肽-Myc-TLR2-4嵌合基因(以下简称TLR2-4基因)如图1所示，嵌合基因PCR产物为2418bp(SEQ ID No.1)。

TLR2-4嵌合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，编码的嵌合蛋白TLR2-4的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

SEQ ID No.1的第91-2418位是TLR2的胞外区及TLR4的跨膜区与胞内区的核苷酸序列；

SEQ ID No.2的第31-805位是TLR2的胞外区及TLR4的跨膜区与胞内区的氨基酸序列。

SEQ ID No.2的第1-20位是TLR2的信号肽的氨基酸序列；

SEQ ID No.2的第21-30位是标签蛋白Myc的氨基酸序列；

SEQ ID No.2的第31-597位是TLR2的胞外区的氨基酸序列；

SEQ ID No.2的第598-805位是TLR4的跨膜区与胞内区的氨基酸序列；

SEQ ID No.1的第1-60位是TLR2的信号肽的核苷酸序列；

SEQ ID No.1的第61-90位是标签蛋白Myc的核苷酸序列；

SEQ ID No.1的第91-1791位是TLR2的胞外区的核苷酸序列；

SEQ ID No.1的第1792-2418位是TLR4的跨膜区与胞内区的核苷酸序列。

2、基因打靶载体和供体质粒的构建

PX458载体(购于Addgene公司)上已有嵌合gRNA支架结构，只需要将靶点对应的crRNA-oligo连接到酶切位点，其在山羊SETD5基因第一内含子区产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复。同时引入连有TLR2-4基因的供体质粒，双链断裂修复过程使TLR2-4基因特异的插入。同时，为了提高转基因细胞的筛选效率，我们在供体质粒上添加CMV-tdtomato片段，使转染了供体质粒的细胞能够瞬时表达tdtomato，构建的基因打靶载体和供体质粒结构如图2所示。

crRNA-oligo序列(靶点序列)如下：

ACTACACATTATAGATGACT(SEQ ID No.5)

sgRNA识别区核苷酸序列如下：

ACUACACAUUAUAGAUGACU(SEQ ID No.4)

2-1构建基因打靶载体pX458-Cas9-sgRNA

将SETD5基因的内含子区作为基因编辑靶点筛选区设计基因编辑靶点。在该区域的DNA双链上寻找PAM区(5’-NGG)，并将其5’端的20nt作为靶点序列。随后，选取PAM区5’端的13nt作为种子序列，与NCBI在线数据库进行比对以进行脱靶效应的估计，剔除掉除靶点外还有较多脱靶位点的靶点序列。使用sgRNA结构在线预测网站(http://unafold.rna.albany.edu/q＝mfold/RNA-Folding-Form/)评估各靶点对应的sgRNA的结构及自由能，筛选CRISPR/Cas9基因编辑靶点并进行细胞水平的验证。

pX458-Cas9-sgRNA打靶载体的具体构建方法如下：将合成的引物SETD5-IN-sgRNA2-F(5’-caccgACTACACATTATAGATGACT-3’)和引物SETD5-IN-sgRNA2-R(5’-aaacAGTCATCTATAATGTGTAGTc-3’)用ddH₂O稀释成100μM的溶液，在退火体系中添加SETD5-IN-sgRNA2-F和SETD5-IN-sgRNA2-R引物溶液各1μL，T4连接酶Buffer 1μL，ddH₂O 7μL，混匀。将上述退火体系放入PCR仪中：95℃，2min；以-5℃/s的速度降至25℃，随后置于冰上，令sgRNA退火体系中的F和R引物互补配对，形成含有黏性末端的双链寡核苷酸(oligo)；并取1μL oligo，用ddH₂O稀释100倍，得到oligo稀释液。

将PX458载体(购于Addgene公司)用限制性内切酶BbsI酶切并回收纯化，得到酶切后的线性骨架载体，并在连接体系中添加100ng酶切后的线性骨架载体；在连接体系中加入1μL上述oligo稀释液、1μL T4连接酶Buffer、1μL T4连接酶，并用ddH₂O补足至10μL，混匀，置于16℃过夜反应。通过常规转化法进行转化、涂板。待单菌落长成后，挑取数个扩大培养并测序验证，结果显示sgRNA识别区的编码DNA已成功连入骨架载体，得到sgRNA2-Cas9打靶载体pX458-Cas9-sgRNA。

2-2构建供体质粒(pR-T2/4)

为后续的无缝克隆试验，需要在获得的TLR2-4嵌合基因两侧添加同源序列。以山羊基因组DNA为模板，利用表1的引物扩增左右同源臂。

表1 PCR引物

通过表2的引物获得供体质粒pR-T2/4中所需元件CMV-tdtomato和poly(A)。

表2 PCR引物

表中pRosa26-promoter载体购自Addgene公司。pCMV-tdTomato载体购自Clontech公司。

以pRosa26-promoter为骨架载体，在Poly(A)上游引入EcoRI、PmlI酶切位点，上下游分别添加BamHI及XbaI酶切位点；用BamHI及XbaI同时双酶切pRosa26-promoter载体和poly(A)，将poly(A)克隆到pRosa26-promoter载体；用XbaI和ScaI-HF双酶切，通过无缝克隆将右同源臂HA-R插入Poly(A)后；用Acc65I和ScalI双酶切载体，在pRosa26-promoter载体上游引入PacI酶切位点并插入左同源臂HA-L，得到重组载体pRosa26-HA。pRosa26-HA是将pRosa26-promoter的限制性核酸内切酶BamHI和Xbal之间的小片段替换为核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA片段，保持pRosa26-promoter的其它核苷酸不变得到的重组载体。

用PmlI和EcoRI-HF双酶切pRosa26-HA，在pRosa26-promoter与poly(A)之间插入TLR2-4基因(SEQ ID No.1)，得到重组载体pRosa26-TLR2-4；用SacI-HF单酶切pRosa26-TLR2-4，在HA-R下游插入从pCMV-tdTomato载体中获得的CMV-tdtomato，获得完整的pRosa26-TLR2-4供体质粒，简称为pR-T2/4(图2)。

3、TLR2-4定点整合成纤维细胞株的筛选构建的基因编辑载体可表达GFP，供体质粒可表达tdtomato，将打靶载体(pX458-Cas9-sgRNA)与供体质粒(pR-T2/4)共转染至1-3代、80％汇合度的山羊胎儿成纤维细胞，在转染后3天通过流式分选获取同时表达红绿荧光的细胞(即同时表达GFP及tdtomato的细胞)，为了获取细胞单克隆，将约500个细胞均匀分散到100mm的细胞培养皿中，并使用含20％FBS的DMEM/F12培养基进行细胞单克隆的培养。培养约10-14天后，可见清晰的细胞单克隆，在倒置显微镜下观察并圈出单克隆的轮廓。用克隆环挑取单克隆并转移至96孔板中，用含20％FBS的DMEM/F12培养基继续培养。待96孔板中的细胞密度达到90％以上，取70％的细胞至新孔中继续培养，剩余细胞在原孔中培养，待新孔中的细胞长满后，消化并裂解细胞，PCR检测同源重组的情况。

4、TLR2-4定点整合成纤维细胞的PCR鉴定

设计鉴定引物如图3所示，利用PCR扩增打靶载体与基因组连接处的序列，确定打靶载体正确整合到打靶位点上。为去除供体质粒残留及NHEJ(非同源性末端接合)介导的随机插入的影响，将用于同源重组鉴定PCR的上游引物Primer U设计在同源臂HA-L上游，下游引物Primer L设计在同源臂外侧基因组上；

上述鉴定引物序列如下：

Primer U：ACAGCCAGTATGAGTGACACC

Primer L：TCCCCCTAAGACTCAGGCATC

Primer L1：AGACACCAGTTGGGTCACAAG

PCR鉴定的阳性克隆细胞(成功定点整合了TLR2-4嵌合基因)，即转基因细胞(TLR2-4)作为供体细胞进行下一步的体细胞核移植。

5、体细胞核移植技术制备TLR2-4转基因山羊

实验选用体重40±4.5kg的黑山羊。使用含300mg孕酮的控制药物释放装置(CIDR)给其注射孕酮。供体山羊在去除CIDR前60h开始，每12h注射240IU的卵泡刺激素，共注射6次，进行超数排卵。在停止CIDR时肌肉注射0.1mg前列腺素，并在CIDR停药38h后，肌肉注射100IU促黄体生成素以诱导山羊排卵。在停止供体CIDR的同时停止受体的CIDR，并给受体山羊注射250IU剂量的妊娠母马血清促性腺激素。

为了方便手术和减少术后肠粘连，所有山羊在采集卵母细胞前12h禁食。在CIDR去除后62h进行腹腔镜检查以检测排卵反应，显示有黄体的山羊即对超排处理有反应，用于卵母细胞收集。将套管连接到注射器上插入子宫输卵管，用20ml含0.3％BSA的温PBS溶液冲洗输卵管收集卵母细胞。用体式显微镜放大10到40倍寻找卵母细胞，将细胞转移到M199培养液中并记录每只山羊的卵母细胞总数。将带有颗粒细胞的卵母细胞放入含有0.1％透明质酸酶的M199培养液中消化5分钟，并通过轻轻吹打去除颗粒细胞。将合格的卵母细胞放在含有5g/ml Hoechst 33342和5g/ml细胞松弛素B(CB)的M199中孵育10分钟。在倒置荧光显微镜下，用安装在显微操作器上的去核针吸出第1极体及部分胞质，将TLR2-4成纤维细胞(转基因细胞TLR2-4)作为供体细胞注入到去核卵母细胞的透明带下，然后通过微电极挤压融合，两次直流电脉冲在20V，每次20μs的条件下进行融合。将融合的重构胚胎放入添加7.5μg/ml CB和10％FBS的M199培养液中，在38.5℃、5％CO2、饱合湿度下培养2-3h后观察融合情况。将融合的重构胚胎用含5μmol/L的离子霉素处理4min，然后在含有2mmol/L6-Dimethylaminopurine(6-DMAP)的培养液内培养3h，洗3次后转移到mSOF培养液中进行过夜培养。将这些胚胎移植到受体的输卵管中，胚胎移植后60天通过超声检查评估受体的妊娠状态。

如图4所示，本发明共移植转TLR2-4基因克隆胚胎126枚到12只同期发情的受体山羊体内，一个月后2只建立妊娠，3个月后2只维持妊娠并继续被监测，共生产转基因克隆山羊1只。

实施例2转基因山羊TLR2-4嵌合蛋白的RT-PCR鉴定

提取出生小羊外周血巨噬细胞RNA，进行RT-PCR检测和WB检测，结果显示转基因山羊巨噬细胞cDNA成功扩增出TLR2-4嵌合基因片段，PCR检测结果见图5。引物如下：

Primer P1:(TLR2-4嵌合基因扩增引物)

Forward：TGACTTCCTGTCCTTCACACA

Reverse：CTTTACCAGTTCATTCCGCA

Primer P2:(内参基因GAPDH扩增引物)

Forward：CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA

Reverse：GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTT

结果表明，在转基因山羊中已成功定点整合了TLR2-4嵌合基因并表达出TLR2-4嵌合蛋白。

实施例3转TLR2-4基因山羊巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌能力的鉴定

FITC标记的金黄色葡萄球菌以MOI＝10分别感染TLR2-4巨噬细胞和WT对照组山羊巨噬细胞1小时，PBS洗涤三次后，用含有200μg/ml庆大霉素的DMEM孵育细胞1h以清除黏附在细胞表面的细菌。流式细胞术检测两组细胞的吞噬指数(巨噬细胞中FITC的平均荧光强度)和吞噬率(FITC阳性细胞数/总细胞术×100％)。如图6所示，在感染30min，60min，120min时，TLR2-4巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬指数均显著高于两组野生型山羊巨噬细胞。如图7所示，在感染的所有时间段，TLR2-4巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率均显著高于两组野生型山羊巨噬细胞。实验结果说明在感染金葡菌后，表达TLR2-4嵌合蛋白能够作为山羊的先天免疫受体识别金葡菌，并且TLR2-4巨噬细胞对金葡菌的吞噬能力显著高于野生型山羊巨噬细胞。采用Origin 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’s t检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

实施例4转TLR2-4基因山羊巨噬细胞清除金黄色葡萄球菌能力的鉴定

金黄色葡萄球菌以MOI＝10分别感染TLR2-4巨噬细胞和WT对照组山羊巨噬细胞1小时，PBS洗涤三次后，用含有200μg/ml庆大霉素的DMEM培养液孵育细胞1小时以清除黏附在细胞表面的细菌。更换含有200μg/ml庆大霉素的DMEM培养液继续培养4h,8h,12h,24h。裂解细胞，通过cfu菌落计数的方法检测巨噬细胞中的金葡菌数。如图8所示，在感染后的4h,8h,12h,24h，TLR2-4巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除率均显著高于两组WT山羊巨噬细胞。实验结果表明TLR2-4巨噬细胞比对照组巨噬细胞更有效的清除了金黄色葡萄球菌。采用Origin 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’st检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2418

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgccacgtg ctttgtggac agcgtgggtc tgggctgtaa tcagcgtgtt cacggaagga 60

gagcagaaac tcatctctga agaggatctg gcctctgatc aggcttcttc tctgtcttgt 120

gacccaactg gtgtctgcga tggccattcc agatctttaa actccatccc ctctggtctc 180

acagcaggtg tgaaaagcct tgacctgtcc gacaacgaga tcacctatgt cggcaacaga 240

gacctgcaga ggtgtgtgaa cctgaagact ctgaggctgg gggccaatga aattcacacg 300

gtggaggaag attctttttt tcacctgagg aatcttgaat atttggactt atcctataat 360

cgcttatcta acttatcatc ttcctggttc aggtcccttt acgtcttgaa attcttaaac 420

ttactgggaa atttatacaa aacacttggg gaaacatctc ttttttctca tctcccaaat 480

ctgcggaccc tgaaagtagg aaatagtaac agcttcactc agattcatga aaaggatttc 540

actggactga cttttcttga ggagcttgag atcagtgctc aaaatctgca gttatatgtg 600

ccaaagagtt taaagtcgat ccagaacatt agccatctga ttcttcatct gaagcagcct 660

gttttactcc tggacattct tatagatatt gtaagttcct tagattattt agaactgaga 720

gatactaatt tgcacacttt ctatttttca gaagcatcca tcagtgaagt taatacatca 780

gttaaaaagc ttatatttag aaatgtgcaa ttcaccgatg aaagttttgt tgaagttgtc 840

aaactgttta actatgtttc tgggatcttg gaagtagagt ttgatgactg tacccatgat 900

ggaattggcg attttacagc actgactttg aacagaatta gatacctagg taacgtggag 960

acgttaacaa tacggaagtt gcatatccca cagtttttct tattttatga tctgagtagt 1020

atatatccac tcacaggcaa agttaaaaga gtcacaatag aaaacagtaa ggttttcctg 1080

gttccttgtt tactttcaca acatttaaaa tcactagaat atttggatct cagtgaaaac 1140

ttaatgtctg aagaaacctt gagaaactca gcctgtgagc atgcctggcc cttccttcaa 1200

accctggttt taaggcagaa tcgtttgaaa tcactagaaa aaactggaga acttttgctt 1260

actctgaaaa atctgaataa ccttgatatc agtaagaata attttctttc aatgcctgaa 1320

acttgtcagt ggccaggaaa aatgaaacag ttgaacttat ccagcacgag gatacacagt 1380

ttaacccagt gccttcccca gaccctggaa attttagatg ttagcaataa caatctcgat 1440

tcattttctt tgattttgcc gcaactcaaa gaactttata tttccagaaa taagttgaag 1500

actctaccag atgcctcctt cttacccgtg ttatcagtta tgagaattag cggaaatata 1560

ataaatactt tctcgaagga acaacttgat tcttttccac aactgaaggc tttggaggcc 1620

ggtggcaaca acttcatttg ctcctgtgac ttcctgtcct tcacacaggg acagcaggca 1680

ctggcccgtg tcctggtcga ctggccagat ggctaccgct gtgacgctcc ctcgcacgtg 1740

cggggccagc gggtgcagga cgcccggctc tccctttctg aatgccaccg gatcatcagc 1800

gtgtcggttg tcactgtact cctggtatct gtggtaggag tcctagtcta taagttctat 1860

ttccacctga tgcttcttgc tggctgcaaa aagtatggca gaggtgaaag cacctatgat 1920

gcctttgtaa tctactcgag ccaggatgaa gcctgggtgc ggaatgaact ggtaaagaac 1980

ttggaggagg gcgtgccccc ctttcagctc tgccttcact acagggactt tattcctggg 2040

gtggccatcg ccgccaacat catccaggaa ggtttccaca agagccgtaa ggtgattgtc 2100

gtggtgtccc agcacttcat ccagagccga tggtgtatct tcgagtatga gattgcccag 2160

acctggcagt ttctgagcag ccgtgctggc atcatcttca tcgtcctgca gaagctggag 2220

aagtctctcc tgcggcagca ggtggaactc tatcgccttc tgaacaggaa cacctacctg 2280

gagtgggagg acagtgtcct ggggcggcat gtcttctgga gaagactcag aaaagccttg 2340

ctggctggta aaccccggag tccagaagga acagcagatg cagagaccaa cccgcaggaa 2400

gcgaccacct ccacctga 2418

<210> 2

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Pro Arg Ala Leu Trp Thr Ala Trp Val Trp Ala Val Ile Ser Val

1 5 10 15

Phe Thr Glu Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ser

20 25 30

Asp Gln Ala Ser Ser Leu Ser Cys Asp Pro Thr Gly Val Cys Asp Gly

35 40 45

His Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ile Pro Ser Gly Leu Thr Ala Gly Val

50 55 60

Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Glu Ile Thr Tyr Val Gly Asn Arg

65 70 75 80

Asp Leu Gln Arg Cys Val Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Gly Ala Asn

85 90 95

Glu Ile His Thr Val Glu Glu Asp Ser Phe Phe His Leu Arg Asn Leu

100 105 110

Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Ser Asn Leu Ser Ser Ser

115 120 125

Trp Phe Arg Ser Leu Tyr Val Leu Lys Phe Leu Asn Leu Leu Gly Asn

130 135 140

Leu Tyr Lys Thr Leu Gly Glu Thr Ser Leu Phe Ser His Leu Pro Asn

145 150 155 160

Leu Arg Thr Leu Lys Val Gly Asn Ser Asn Ser Phe Thr Gln Ile His

165 170 175

Glu Lys Asp Phe Thr Gly Leu Thr Phe Leu Glu Glu Leu Glu Ile Ser

180 185 190

Ala Gln Asn Leu Gln Leu Tyr Val Pro Lys Ser Leu Lys Ser Ile Gln

195 200 205

Asn Ile Ser His Leu Ile Leu His Leu Lys Gln Pro Val Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Ile Leu Ile Asp Ile Val Ser Ser Leu Asp Tyr Leu Glu Leu Arg

225 230 235 240

Asp Thr Asn Leu His Thr Phe Tyr Phe Ser Glu Ala Ser Ile Ser Glu

245 250 255

Val Asn Thr Ser Val Lys Lys Leu Ile Phe Arg Asn Val Gln Phe Thr

260 265 270

Asp Glu Ser Phe Val Glu Val Val Lys Leu Phe Asn Tyr Val Ser Gly

275 280 285

Ile Leu Glu Val Glu Phe Asp Asp Cys Thr His Asp Gly Ile Gly Asp

290 295 300

Phe Thr Ala Leu Thr Leu Asn Arg Ile Arg Tyr Leu Gly Asn Val Glu

305 310 315 320

Thr Leu Thr Ile Arg Lys Leu His Ile Pro Gln Phe Phe Leu Phe Tyr

325 330 335

Asp Leu Ser Ser Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Lys Val Lys Arg Val Thr

340 345 350

Ile Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu Val Pro Cys Leu Leu Ser Gln His

355 360 365

Leu Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Glu Asn Leu Met Ser Glu

370 375 380

Glu Thr Leu Arg Asn Ser Ala Cys Glu His Ala Trp Pro Phe Leu Gln

385 390 395 400

Thr Leu Val Leu Arg Gln Asn Arg Leu Lys Ser Leu Glu Lys Thr Gly

405 410 415

Glu Leu Leu Leu Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asn Leu Asp Ile Ser Lys

420 425 430

Asn Asn Phe Leu Ser Met Pro Glu Thr Cys Gln Trp Pro Gly Lys Met

435 440 445

Lys Gln Leu Asn Leu Ser Ser Thr Arg Ile His Ser Leu Thr Gln Cys

450 455 460

Leu Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Val Ser Asn Asn Asn Leu Asp

465 470 475 480

Ser Phe Ser Leu Ile Leu Pro Gln Leu Lys Glu Leu Tyr Ile Ser Arg

485 490 495

Asn Lys Leu Lys Thr Leu Pro Asp Ala Ser Phe Leu Pro Val Leu Ser

500 505 510

Val Met Arg Ile Ser Gly Asn Ile Ile Asn Thr Phe Ser Lys Glu Gln

515 520 525

Leu Asp Ser Phe Pro Gln Leu Lys Ala Leu Glu Ala Gly Gly Asn Asn

530 535 540

Phe Ile Cys Ser Cys Asp Phe Leu Ser Phe Thr Gln Gly Gln Gln Ala

545 550 555 560

Leu Ala Arg Val Leu Val Asp Trp Pro Asp Gly Tyr Arg Cys Asp Ala

565 570 575

Pro Ser His Val Arg Gly Gln Arg Val Gln Asp Ala Arg Leu Ser Leu

580 585 590

Ser Glu Cys His Arg Ile Ile Ser Val Ser Val Val Thr Val Leu Leu

595 600 605

Val Ser Val Val Gly Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu Met

610 615 620

Leu Leu Ala Gly Cys Lys Lys Tyr Gly Arg Gly Glu Ser Thr Tyr Asp

625 630 635 640

Ala Phe Val Ile Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Ala Trp Val Arg Asn Glu

645 650 655

Leu Val Lys Asn Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe Gln Leu Cys Leu

660 665 670

His Tyr Arg Asp Phe Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala Ala Asn Ile Ile

675 680 685

Gln Glu Gly Phe His Lys Ser Arg Lys Val Ile Val Val Val Ser Gln

690 695 700

His Phe Ile Gln Ser Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr Glu Ile Ala Gln

705 710 715 720

Thr Trp Gln Phe Leu Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile Phe Ile Val Leu

725 730 735

Gln Lys Leu Glu Lys Ser Leu Leu Arg Gln Gln Val Glu Leu Tyr Arg

740 745 750

Leu Leu Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Glu Asp Ser Val Leu Gly

755 760 765

Arg His Val Phe Trp Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu Leu Ala Gly Lys

770 775 780

Pro Arg Ser Pro Glu Gly Thr Ala Asp Ala Glu Thr Asn Pro Gln Glu

785 790 795 800

Ala Thr Thr Ser Thr

805

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> 山羊（Capra hircus）

<400> 3

ttaaaaatgc catttcatca catactttgg aatttttggc agcaaggaat ggtgtcaatc 60

attatttatc ataggtacat tacactttga ggaatgactg aatttttttc tttttacaaa 120

taaccgccag ttgtattact aaatatatac tatctcataa ttttgcaggg ttgaagtttc 180

atttgtccta aataacaaaa aataagaaaa ctttatttta ttcataatcc actttttcac 240

tggtaagatg gatccaacaa tcactgattg tctttagctt ctgcccaata tttcataaat 300

taattgaata tgaagaggat aacgtaaaag tggttgtctg cacatatgca ttttgaacaa 360

tattattttc ctgtccaaag ggaaaaaatg aagtggccat cctcctccag aaaggccaaa 420

ataagtcccc aaagtatgta catttctaga cacaaaacac tatcagaaga cagtaaaaat 480

ttcaagcatg ctggtaaaat aaattctatg aaaaggcctt ctatgctctt aaggaaatga 540

tcttacgtta agatctcaaa ggagttccaa acaggaaata caagttaaaa acaattattt 600

tataaggtag ctttcatatt atataaaaga caacttacag acatttgtat ctatgttaaa 660

cagccagtat gagtgacacc atacttatct gatatggcat cttttatatg tgatagtaat 720

aagaattaga accacctaaa atgttatcca ttaaaggttc tgtttcatta ttccccttgc 780

aacactgaaa gacaatgcaa gtaacatttg tgaatgacaa aactcatttc cattctttct 840

ggttcccgcc acaaacgcca gagtcatact acacattata gatgactggg ttcatttaca 900

caaaaccgaa catactaaaa ttctgaagga aaaaaaaaat atatatatat ataggatgcc 960

tgagtcttag ggggagacaa taacaggcat ctatctgtta agtatcagat gtaactgatg 1020

gtatattggg ctggtgattc tccttcaagt acttccatat ttaacaaact gttctgctta 1080

atcagagatc ttcctaaact gtgggaaccg tggaagaaga cagactacat aaggggccta 1140

gatgctatca tctcaagtat cctgtatact agatttattc aatttctgag tattccttct 1200

agtctgtcat atttcaaatg gatcactgtc aaacatatag atccttgtga tcttagacaa 1260

ctatactcaa cacatattat aaatcaatat cacaggtcaa attctaaaga aataatctaa 1320

tttggagaaa tctattacta acacagaaaa taagaaaata cttgatattt atacatagaa 1380

atcgttctgc aaaggacagt tgtttctaga gtttaagacc ctaaatatag taaaatgttt 1440

agcaaaacat ctgttcaata aggtaactat ggtctaacaa ctggaaggaa gaagacgtac 1500

aagtattaaa attgatttaa tgattaaaaa gatggaggaa aacatgccag ctgcagaaaa 1560

atcaactgat attttctcca ttctggttct catgaagatc cttaaattct tattaccttg 1620

gttttaaaag gattgaaaaa ttaaaactca aatggaactt ctggtcctat ccaagcaaaa 1680

tccccagatt aaaaccaaaa atctgccaca aaaaccaaac agaaaagtct ttaactacgg 1740

ttcagtttcc aaatgctgat atccataaat gggtagaagg ttatgaattg ctaattctca 1800

tttccccacc aataaaatgc aaaccagcac agcagtgaaa attcccagga aagcaaggtt 1860

tccgtcttag ccctgaagca gccattgcct aagtgcagct ccctgcagcc aacagcatta 1920

atggacgctg cactgctgtc cttccctgga gacagcagcc agcactactc aagctcctca 1980

cgtagcaacc agagctccag 2000

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

acuacacauu auagaugacu 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

actacacatt atagatgact 20

<210> 6

<211> 5599

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

actacacatt atagatgact gggcccaagc tatggggtat ctactcaatt cagaatgaat 60

atacagcaga acatttttca taagactaac tgattaaaca aaatatgtac tgagaaatta 120

aagaaatgat aatctatcaa cctctcatga actaccctga atcttcacca caagagacat 180

cactgcgtca acagaaaggt taaaaatgcc atttcatcac atactttgga atttttggca 240

gcaaggaatg gtgtcaatca ttatttatca taggtacatt acactttgag gaatgactga 300

atttttttct ttttacaaat aaccgccagt tgtattacta aatatatact atctcataat 360

tttgcagggt tgaagtttca tttgtcctaa ataacaaaaa ataagaaaac tttattttat 420

tcataatcca ctttttcact ggtaagatgg atccaacaat cactgattgt ctttagcttc 480

tgcccaatat ttcataaatt aattgaatat gaagaggata acgtaaaagt ggttgtctgc 540

acatatgcat tttgaacaat attattttcc tgtccaaagg gaaaaaatga agtggccatc 600

ctcctccaga aaggccaaaa taagtcccca aagtatgtac atttctagac acaaaacact 660

atcagaagac agtaaaaatt tcaagcatgc tggtaaaata aattctatga aaaggccttc 720

tatgctctta aggaaatgat cttacgttaa gatctcaaag gagttccaaa caggaaatac 780

aagttaaaaa caattatttt ataaggtagc tttcatatta tataaaagac aacttacaga 840

catttgtatc tatgttaaac agccagtatg agtgacacca tacttatctg atatggcatc 900

ttttatatgt gatagtaata agaattagaa ccacctaaaa tgttatccat taaaggttct 960

gtttcattat tccccttgca acactgaaag acaatgcaag taacatttgt gaatgacaaa 1020

actcatttcc attctttctg gttcccgcca caaacgccag agtcatacta cacattatag 1080

atttaattaa gtcgactaga tgaaggagag cctttctctc tgggcaagag cggtgcaatg 1140

gtgtgtaaag gtagctgaga agacgaaaag ggcaagcatc ttcctgctac caggctgggg 1200

aggcccaggc ccacgacccc gaggagaggg aacgcaggga gactgaggtg acccttcttt 1260

cccccggggc ccggtcgtgt ggttcggtgt ctcttttctg ttggaccctt accttgaccc 1320

aggcgctgcc ggggcctggg cccgggctgc ggcgcacggc actcccggga ggcagcgaga 1380

ctcgagttag gcccaacgcg gcgccacggc gtttcctggc cgggaatggc ccgtacccgt 1440

gaggtggggg tggggggcag aaaaggcgga gcgagcccga ggcggggagg gggagggcca 1500

ggggcggagg gggccggcac tactgtgttg gcggactggc gggactaggg ctgcgtgagt 1560

ctctgagcgc aggcgggcgg cggccgcccc tcccccggcg gcggcagcgg cggcagcggc 1620

ggcagctcac tcagcccgct gcccgagcgg aaacgccact gaccgcacgg ggattcccag 1680

tgccggcgcc aggggcacgc gggacacgcc ccctcccgcc gcgccattgg cctctccgcc 1740

caccgcccca cacttattgg ccggtgcgcc gccaatcagc ggaggctgcc ggggccgcct 1800

aaagaagagg ctgtgctttg gggctccggc tcctcagaga gcctcggcta ggtaggggat 1860

cgggactctg gcgggagggc ggcttggtgc gtttgcgggg atccgaattc atgccacgtg 1920

ctttgtggac agcgtgggtc tgggctgtaa tcagcgtgtt cacggaagga gagcagaaac 1980

tcatctctga agaggatctg gcctctgatc aggcttcttc tctgtcttgt gacccaactg 2040

gtgtctgcga tggccattcc agatctttaa actccatccc ctctggtctc acagcaggtg 2100

tgaaaagcct tgacctgtcc gacaacgaga tcacctatgt cggcaacaga gacctgcaga 2160

ggtgtgtgaa cctgaagact ctgaggctgg gggccaatga aattcacacg gtggaggaag 2220

attctttttt tcacctgagg aatcttgaat atttggactt atcctataat cgcttatcta 2280

acttatcatc ttcctggttc aggtcccttt acgtcttgaa attcttaaac ttactgggaa 2340

atttatacaa aacacttggg gaaacatctc ttttttctca tctcccaaat ctgcggaccc 2400

tgaaagtagg aaatagtaac agcttcactc agattcatga aaaggatttc actggactga 2460

cttttcttga ggagcttgag atcagtgctc aaaatctgca gttatatgtg ccaaagagtt 2520

taaagtcgat ccagaacatt agccatctga ttcttcatct gaagcagcct gttttactcc 2580

tggacattct tatagatatt gtaagttcct tagattattt agaactgaga gatactaatt 2640

tgcacacttt ctatttttca gaagcatcca tcagtgaagt taatacatca gttaaaaagc 2700

ttatatttag aaatgtgcaa ttcaccgatg aaagttttgt tgaagttgtc aaactgttta 2760

actatgtttc tgggatcttg gaagtagagt ttgatgactg tacccatgat ggaattggcg 2820

attttacagc actgactttg aacagaatta gatacctagg taacgtggag acgttaacaa 2880

tacggaagtt gcatatccca cagtttttct tattttatga tctgagtagt atatatccac 2940

tcacaggcaa agttaaaaga gtcacaatag aaaacagtaa ggttttcctg gttccttgtt 3000

tactttcaca acatttaaaa tcactagaat atttggatct cagtgaaaac ttaatgtctg 3060

aagaaacctt gagaaactca gcctgtgagc atgcctggcc cttccttcaa accctggttt 3120

taaggcagaa tcgtttgaaa tcactagaaa aaactggaga acttttgctt actctgaaaa 3180

atctgaataa ccttgatatc agtaagaata attttctttc aatgcctgaa acttgtcagt 3240

ggccaggaaa aatgaaacag ttgaacttat ccagcacgag gatacacagt ttaacccagt 3300

gccttcccca gaccctggaa attttagatg ttagcaataa caatctcgat tcattttctt 3360

tgattttgcc gcaactcaaa gaactttata tttccagaaa taagttgaag actctaccag 3420

atgcctcctt cttacccgtg ttatcagtta tgagaattag cggaaatata ataaatactt 3480

tctcgaagga acaacttgat tcttttccac aactgaaggc tttggaggcc ggtggcaaca 3540

acttcatttg ctcctgtgac ttcctgtcct tcacacaggg acagcaggca ctggcccgtg 3600

tcctggtcga ctggccagat ggctaccgct gtgacgctcc ctcgcacgtg cggggccagc 3660

gggtgcagga cgcccggctc tccctttctg aatgccaccg gatcatcagc gtgtcggttg 3720

tcactgtact cctggtatct gtggtaggag tcctagtcta taagttctat ttccacctga 3780

tgcttcttgc tggctgcaaa aagtatggca gaggtgaaag cacctatgat gcctttgtaa 3840

tctactcgag ccaggatgaa gcctgggtgc ggaatgaact ggtaaagaac ttggaggagg 3900

gcgtgccccc ctttcagctc tgccttcact acagggactt tattcctggg gtggccatcg 3960

ccgccaacat catccaggaa ggtttccaca agagccgtaa ggtgattgtc gtggtgtccc 4020

agcacttcat ccagagccga tggtgtatct tcgagtatga gattgcccag acctggcagt 4080

ttctgagcag ccgtgctggc atcatcttca tcgtcctgca gaagctggag aagtctctcc 4140

tgcggcagca ggtggaactc tatcgccttc tgaacaggaa cacctacctg gagtgggagg 4200

acagtgtcct ggggcggcat gtcttctgga gaagactcag aaaagccttg ctggctggta 4260

aaccccggag tccagaagga acagcagatg cagagaccaa cccgcaggaa gcgaccacct 4320

ccacctgaca cgtgctgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 4380

gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 4440

tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 4500

caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggt 4560

ctagagggtt catttacaca aaaccgaaca tactaaaatt ctgaaggaaa aaaaaaatat 4620

atatatatat aggatgcctg agtcttaggg ggagacaata acaggcatct atctgttaag 4680

tatcagatgt aactgatggt atattgggct ggtgattctc cttcaagtac ttccatattt 4740

aacaaactgt tctgcttaat cagagatctt cctaaactgt gggaaccgtg gaagaagaca 4800

gactacataa ggggcctaga tgctatcatc tcaagtatcc tgtatactag atttattcaa 4860

tttctgagta ttccttctag tctgtcatat ttcaaatgga tcactgtcaa acatatagat 4920

ccttgtgatc ttagacaact atactcaaca catattataa atcaatatca caggtcaaat 4980

tctaaagaaa taatctaatt tggagaaatc tattactaac acagaaaata agaaaatact 5040

tgatatttat acatagaaat cgttctgcaa aggacagttg tttctagagt ttaagaccct 5100

aaatatagta aaatgtttag caaaacatct gttcaataag gtaactatgg tctaacaact 5160

ggaaggaaga agacgtacaa gtattaaaat tgatttaatg attaaaaaga tggaggaaaa 5220

catgccagct gcagaaaaat caactgatat tttctccatt ctggttctca tgaagatcct 5280

taaattctta ttaccttggt tttaaaagga ttgaaaaatt aaaactcaaa tggaacttct 5340

ggtcctatcc aagcaaaatc cccagattaa aaccaaaaat ctgccacaaa aaccaaacag 5400

aaaagtcttt aactacggtt cagtttccaa atgctgatat ccataaatgg gtagaaggtt 5460

atgaattgct aattctcatt tccccaccaa taaaatgcaa accagcacag cagtgaaaat 5520

tcccaggaaa gcaaggtttc cgtcttagcc ctgaagcagc cattgcctaa gtgcagctcc 5580

ctgcagccaa cagcattaa 5599

Claims

1.一种制备遗传修饰山羊的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将TLR2-4嵌合基因利用CRISPR/Cas9系统导入作为转基因受体的山羊体细胞中，得到转化的体细胞，由所述转化的体细胞经体细胞核移植技术制备所述遗传修饰山羊，所述TLR2-4嵌合基因编码的嵌合蛋白质包括TLR2的胞外区和TLR4的跨膜区与胞内区，所述TLR2的胞外区的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第31-597位，所述TLR4的跨膜区与胞内区的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第598-805位，所述TLR2-4嵌合基因的导入是将TLR2-4嵌合基因利用CRISPR/Cas9系统导入到山羊SETD5基因中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合蛋白质还包括信号肽和/或标签蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述TLR2-4嵌合基因的核苷酸序列为SEQID No.1。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述TLR2-4嵌合基因的导入是将所述TLR2-4嵌合基因导入到山羊SETD5基因第一内含子中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括如下A1）或A2）：

A1）sgRNA，所述sgRNA特异性靶向于SETD5-IN，所述SETD5-IN是大小为2kb的双链DNA分子，所述SETD5-IN的核苷酸序列为SEQ ID No.3；

A2）表达A1）所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA识别区的核苷酸序列为SEQ IDNo.4。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述遗传修饰山羊为抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊。

8.权利要求1-7中任一所述的方法在动物育种和/或培育抗病山羊中的应用。