CN107075501B - 炎症报道系统 - Google Patents

Abstract

一种炎症反应的检测方法，其特征在于，使用导入有载体的转化体或转基因非人动物，来检测通过炎症性刺激而在该转化体或转基因非人动物中引起的炎症反应，所述载体含有：编码炎症性细胞因子的基因的启动子、编码报道蛋白的基因、编码前述炎症性细胞因子的基因、及编码蛋白质分解信号序列的基因。

Description

炎症报道系统

技术领域

本发明涉及炎症反应的检测方法。

背景技术

炎症反应是与多种疾病症状均密切相关的生物体反应之一，在理解这些疾病的病情、考虑其治疗策略方面成为重要的研究对象。故而，可以检测炎症的实际状态的技术的开发是不可或缺的。

已经阐明，通常的炎症反应是通过如下机制而引起的。即，当细菌、病毒等感染源侵入体内时，感染源被细胞表面的受体感知，引起细胞因子的分泌。以该细胞因子为指标，巨噬细胞等免疫细胞游走到感染部位并击退感染源。由于在该击退时免疫细胞的活跃行为，炎症时引起特有的发红、发热、疼痛、肿胀。

作为与该炎症反应密切相关、也作为炎症标志物而受到关注的细胞因子，已知有白介素-1β(IL-1β)。已知的是，IL-1β在无炎症刺激时几乎不分泌，通过炎症刺激而在各组织中以非常高的水平产生并分泌(图1)。

还获知，IL-1β通过以下的特征性的两阶段控制而受到精密调节。在由炎症反应引起的转录因子NF-κB作用下，IL-1β的基因表达被活化，随着IL-1β基因表达的活化，作为前体型的proIL-1β的产生得到促进。然后，proIL-1β在通过炎性体而被活化的胱天蛋白酶作用下被切断，转变为可分泌的成熟型IL-1β(图2)。

关于以荧光素酶、红色荧光蛋白为报道分子的IL-1β基因表达的监测，已经有报道(非专利文献1、2)。这些报道显示：制作导入有报道分子的转基因小鼠，在该炎症模型中，可以检测报道信号，还能够用于生物成像解析。但我们认为，该方法仅借助于作为炎症反应级联中的1个因子的转录控制，作为生理性的炎症反应的监测是不充分的。

此外，还报道了通过炎性体进行控制的报道系统(非专利文献3)。在该报道中按照下述方式进行了设计：非炎症时为聚集结构而呈无活性状态的报道分子，通过炎症刺激，通过炎性体发挥作用而单体化并显示活性。但是，其也仅借助于炎性体，灵敏度不充分，此外，对于该系统在活体小鼠中是否发挥作用这一点没有进行验证。

另一方面，还尝试了通过各种体内刺激或外部刺激、例如氧化应激和内质网应激进行蛋白质表达，并将该现象可视化(专利文献1、2，非专利文献4、5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开2012/099279号小册子

专利文献2:日本专利第4446057号公报

非专利文献

非专利文献1:Li L.et al“Functional imaging of interleukin 1 betaexpression in inflammatory process using bioluminescence imaging intransgenic mice”BMC Immunol.，vol.9.，49(2008)

非专利文献2:Matsushima H.et al“Intravital imaging of IL-1betaproduction in skin”J.Invest.Dermatol.，vol.130，1571-1580(2010)

非专利文献3:Bartok E.et al“iGLuc：a luciferase-based inflammasome andprotease activity reporter”Nat.Methods.，vol.10.，147-154(2013)

非专利文献4:Scientific Reports 2012；2：229.Epub 2012 Jan 19.

非专利文献5:Nature Medicine 10，98102(1 January 2004)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供一种可以高效率·高灵敏度对特别是生物体内的微小区域内的局部性的炎症反应进行检测·测定的技术。此外目的在于，为了使本检测方法可以容易地利用而提供一种基因载体，进而为了可以在体内的研究开发中使用而提供一种导入有本报道系统的基因载体的转基因小鼠。

用于解决问题的方案

本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，利用通过IL-1β基因和炎性体以两阶段进行控制的炎症反应机制，从而可以构建可以高效率·高灵敏度地进行生理性的炎症反应的监视的报道系统，并通过构建该方法以及搭载有该方法的基因载体和转基因小鼠而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种载体，其含有：编码炎症性细胞因子的基因的启动子、编码报道蛋白的基因、编码前述炎症性细胞因子的基因、及编码蛋白质分解信号序列的基因。

(2)根据(1)中所述的载体，其中，炎症性细胞因子为白介素1β。

(3)根据(1)或(2)中所述的载体，其中，报道蛋白为荧光素酶。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的载体，其中，编码炎症性细胞因子的基因含有编码被胱天蛋白酶识别的肽的多核苷酸序列。

(5)一种转化体，其含有前述(1)～(4)中任一项所述的载体。

(6)一种转基因非人动物，其导入有前述(1)～(4)中任一项所述的载体。

(7)根据(6)所述的转基因非人动物，其中，非人动物为小鼠。

(8)根据(5)所述的转化体、或者根据(6)或(7)所述的转基因非人动物，其中，通过炎症性刺激，报道蛋白以发光信号形式被检测。

(9)一种炎症反应的检测方法，其特征在于，使用前述(5)所述的转化体或(6)～(8)中任一项所述的转基因非人动物，来检测通过炎症性刺激而在该转化体或转基因非人动物中引起的炎症反应。

(10)根据(9)所述的方法，其中，编码炎症性细胞因子的基因在由炎症反应引起的转录因子NF-κB作用下进行表达。

(11)根据(9)或(10)所述的方法，其中，通过炎症性刺激，以发光信号形式来检测报道蛋白。

(12)一种抗炎症物质的筛选方法，其特征在于，使前述(5)所述的转化体或(6)～(8)中任一项所述的转基因非人动物在炎症性刺激下接触候选物质，以有无炎症反应为指标来选择抗炎症物质。

(13)一种炎症反应检测用或抗炎症物质的筛选用试剂盒，其含有前述(5)所述的转化体或(6)～(8)中任一项所述的转基因非人动物。

发明的效果

根据本发明，可以提供可以高效率·高灵敏度地进行炎症反应的监视的报道系统。本发明的系统可以对炎症反应进行可视化，灵敏度及效率极高。

附图说明

图1为示出利用脂多糖(LPS)进行炎症刺激后的IL-1β值的变化的图。使用的LPS：sigma#L2654，使用浓度：3～4μg/g体重

图2为示出IL-1β的产生及分泌控制机制的图。

图3为示出利用IL-1β的炎症报道系统的构建的图。

图4为示出一过性地导入报道基因的RAW264中的报道活性的图。使用的LPS：sigma#L2654，使用浓度：2μg/ml

图5为示出由LPS刺激后的炎症报道小鼠发出的信号的图。使用的LPS：sigma#L2654，使用浓度：3～4μg/g体重

图6为示出一过性地导入报道基因的RAW264中的报道活性的图。使用的LPS：sigma#L2654，使用浓度：2μg/ml，处理时间：48h

图7为本发明的载体的构建图。

图8为示出对小鼠的系统间的LPS刺激前后的报道信号进行比较的结果的图。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

1.载体等及检测方法

本发明中使用的载体含有将多个基因连接而成的融合基因，在编码炎症性细胞因子的基因的启动子控制下表达报道分子、胱天蛋白酶识别序列及蛋白质分解信号序列的融合蛋白。

本发明中，“炎症性细胞因子”是指由通过细菌等抗原等被活化的辅助T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞等产生的细胞因子，是活化巨噬细胞和其它免疫细胞、血管内皮细胞、破骨细胞的细胞因子。作为这样的炎症性细胞因子,可以列举例如：IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)等。编码炎症性细胞因子的基因在由炎症反应引起的转录因子NF-κB作用下进行表达。

本发明中，可以使用编码这些炎症性细胞因子的基因或其部分序列。编码上述炎症性细胞因子的基因及这些基因的启动子的信息是公知的。部分序列只要具有炎症应答性则对长度没有特别限定，可以以炎症应答性表达增强、炎症应答性加工等为指标来决定长度及区域。

IL-1β：登录号NM＿008361.3

IL-6：登录号NM＿031168.1

IL-8：登录号NM＿009140.2

IL-12：登录号NM＿001159424.1

IL-13：登录号NM＿008355.3

IL-17：登录号NM＿010552.3

IL-18：登录号NM＿008360.1

TNF：登录号NM＿001278601.1

IL-1β启动子：登录号NC＿000068.7

IL-6启动子：登录号NC＿000071.6

IL-8启动子：登录号NC＿000071.6

IL-12启动子：登录号NC＿000069.6

IL-13启动子：登录号NC＿000077.6

IL-17启动子：登录号NC＿000067.6

IL-18启动子：登录号NC＿000075.6

TNF启动子：登录号NC＿000083.6

本说明书中，为了便于说明，以IL-1β为例进行说明。

制作在IL-1β基因的启动子下游连接有报道基因、在其下游添加有例如IL-1β部分序列和蛋白质分解信号序列的基因构建体。IL-1β部分序列中编码的肽连接子含有被胱天蛋白酶识别的序列(胱天蛋白酶识别序列)。并且，该IL-1β部分序列所编码的肽连接子为通过称为炎性体的蛋白复合物而被活化的胱天蛋白酶(胱天蛋白酶-1)作用的区域，该肽连接子通过胱天蛋白酶而被切断。

将具有这样的基因构建体的细胞中显示炎症报道系统的概要示于图3。图3是示出IL-1β作为炎症性细胞因子、示出荧光素酶(Luc)作为报道分子的例子。当然，炎症性细胞因子及报道分子并不限于图3所示的IL-1β及Luc。

图3中，无炎症刺激时，IL-1β基因启动子不工作，因此报道基因的表达未被活化。即使发生了表达遗漏(leak)，也仍然由于没有炎症刺激而炎性体不发挥作用，所表达的由报道分子-胱天蛋白酶识别序列-蛋白质分解信号序列构成的融合蛋白在其蛋白质分解信号序列的作用下被泛素-蛋白酶体系统积极地分解。

另一方面，在有炎症刺激时，在作为转录因子的NF-κB作用下，启动子工作，从而报道基因的表达被活化，通过由炎性体引起的胱天蛋白酶的活化，产生的报道分子被从蛋白质分解信号序列切下，报道分子本身单独时是稳定的，可以以报道蛋白的发光信号(报道信号)形式高水平地检测。该检测结果可以通过可视化并显示在监视器中的图像来确认。

本发明的一方式中，在来自小鼠的巨噬细胞样细胞RAW264株中一过性地导入了结构如下的基因载体：在IL-1β基因的启动子控制下，表达报道分子、胱天蛋白酶识别序列(构成IL-1β的氨基酸序列的一部分)和蛋白质分解信号序列的融合蛋白。在该细胞株的培养液中添加作为大肠杆菌细胞膜构成成分的LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)时，可以确认报道活性的显著上升(图4)。

此外，通过将该基因载体注射到C57BL/6系统的原核期(前核期)受精卵中，制作了转基因小鼠。通过在该转基因小鼠的腹腔内施予LPS而给予炎症刺激，通过生物体成像装置检测刚施予后、4小时后、24小时后的荧光素酶的发光信号的变化。可以在全身的组织中观察到炎症反应依赖性的发光(实施例、图5)。

作为报道蛋白(报道分子)，可以利用例如：荧光素酶、GFP(绿色荧光蛋白)、DsRed(红色荧光蛋白)、LacZ(β-半乳糖苷酶)等，此外，基因载体也可以采取质粒DNA、病毒载体等形态，本发明不受其限定。

编码这些报道蛋白的基因是公知的，可以由国内外的生物试剂厂商等获得。

“蛋白质分解信号序列”是指在E3连接酶作用下被积极地多泛素化、结果容易被蛋白酶体消化的序列，作为本发明中使用的蛋白质分解信号序列，可以列举：CL1序列、PEST序列等。这些编码蛋白质分解信号序列的基因是公知的，可以由国内外的生物试剂厂商等获得。

本发明的转化体可以通过将基因载体导入到宿主中而获得。

对导入基因载体的宿主也没有特别限定，可以是原核生物(大肠杆菌、乳酸菌等)、真核细胞(酵母)等单细胞生物，此外，也可以使用来自人的细胞(Hela，HEK293等)以及来自小鼠的细胞(NIH3T3等)的株化培养细胞、或其它动物细胞。在紧挨着启动子后边连接上述基因的方法是公知的(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4th Edition)、ColdSpring Harbor Laboratory Press(2012))。基因载体向宿主的导入可以通过电穿孔法(electroporation)、使用市售的脂质转染试剂的脂质转染法、利用病毒载体的方法等众所周知的方法来实施(参照上述Molecular Cloning等)。

导入有本报道基因载体的转基因非人动物可以用小鼠、大鼠、狗、猴、山羊等制作，但不限于这些非人动物。转基因非人动物可以通过用微量注射器在各动物的受精卵中注入基因载体DNA而制作，或者还可以通过同源重组法建立胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)后制作转基因动物。显微注射法等均为本领域技术人员可以容易地实施的公知方法(参照上述Molecular Cloning等)。

本发明中使用的转基因非人动物不限于个体，也可以使用来自该转基因非人动物的生物材料例如细胞、器官、组织、胚等。

2.筛选方法

本发明中，对成为抗炎症物质的候选的被检物质(候选物质)没有特别限定，可以列举例如：肽、蛋白质、DNA、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液等，这些化合物可以是新颖化合物也可以是公知化合物。这些被检物质可以形成盐，作为被检物质的盐，使用生理学上允许的与酸(例如无机酸等)、碱(例如有机酸等)等的盐，优选生理学上允许的酸加成盐。就被检物质而言，可以对单一物质独立地进行试验，也可以对混合物(包括文库等)进行试验。作为含有多种被检物质的文库，可以列举：合成化合物文库(组合文库等)、肽文库(组合文库等)等。

本发明中包括：对转基因非人动物施予炎症性物质(给予炎症性刺激)而引起炎症反应，使该动物接触被检物质，调查炎症反应的抑制效果的方式；以及，使转基因非人动物接触被检物质后，施予炎症性物质而引起炎症反应，调查该动物中的炎症反应的抑制效果的方式。任意方式中，均可以选择获得炎症反应的抑制效果的被检物质作为炎症性疾病(例如感染症、风湿、过敏)的治疗药或预防药即抗炎症剂。

作为成为被检物质施予对象的转基因非人动物(被检动物)及对照动物，没有特别限定，通常使用同种的非人动物。此外，被验动物及对照动物更优选使用同性别及同龄的动物。

本发明中，在使用转化体的情况下包括：使转化体接触被检物质后，使该转化体接触炎症性物质，调查炎症反应的抑制效果的方式；以及，使转化体接触炎症性物质而引起炎症反应，使该转化体接触被检物质，调查炎症反应的抑制效果的方式。

就是否抑制炎症反应而言，将以通过炎症性刺激报道蛋白是否以发光信号形式被检测为指标而获得的检测结果作为指标，来选择抗炎症物质。

“接触”包括：将被检物质施予非人动物的方式、对转化体或生物体材料添加被检物质的方式、在被检物质存在下进行培养的方式等。为了使转基因非人动物本身接触被检物质，可以通过注射等对这些动物接种被检物质。对转化体或生物体材料添加被检物质的方式可以列举：在细胞的培养物中添加被检物质，在组织、器官等中添加被检物质等。“培养物”是指细胞、培养液、细胞提取物中的任一种。“在被检物质存在下进行培养”是指在细胞与被检物质接触的条件下进行培养，被检物质与上述细胞等的接触可以如下实施：例如，在细胞培养基或各种缓冲液(例如HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水、Tris盐酸缓冲液等)中添加被检物质，将细胞孵育一定时间。

培养物中添加的被检物质的浓度根据化合物的种类(溶解度、毒性等)不同，可以在例如100ng/ml～10μg/ml的范围内适当选择。作为孵育时间，可以列举例如4～48小时。

3.试剂盒

本发明提供一种炎症反应检测用或抗炎症物质的筛选用试剂盒，其含有导入有载体的转化体或转基因非人动物，所述载体含有编码炎症性细胞因子的基因的启动子、编码报道蛋白的基因、编码前述炎症性细胞因子的基因、及编码蛋白质分解信号序列的基因。

在将本发明的转化体或转基因非人动物作为炎症性疾病、炎症反应的检测药使用时，除了上述转化体或转基因非人动物之外还可含有其它试剂例如蒸馏水、缓冲试剂、炎症引起物质、使用说明书等。

实施例

以下通过实施例具体且详细地说明本发明，但这些对本发明的范围没有限定。

基因载体的构建

以从来自小鼠的细胞提取的基因组DNA为材料，来克隆来自小鼠的IL-1β基因的上游约5kbp的区域。构建在克隆区域的正下方融合来自HSV的TK基因启动子、在该融合启动子的下游连接来自荧烛(Photinus pyralis)的改变型荧光素酶(GL4，约1.7kbp)、进而在其下游连接来自小鼠的编码IL-1β的部分序列(17-216aa)的碱基序列、进而在其下游连接CL1(来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))-PEST(来自小鼠的)序列、来自SV40的PolyA序列的载体(图7)(序列号1)。

IL-1β基因的克隆如下进行。

关于来自小鼠的IL-1B基因的上游约5kbp的区域

将整个区域分成4部分并分别用PCR法进行克隆。所有部分中，使用的PCR试剂盒均为Prime Star(Takara)，模板DNA均为来自小鼠ES细胞的基因组DNA，反应条件均为：98℃10秒、55℃5秒、72℃2分钟，循环35次。使用的引物根据部位的不同而不同，如下所述。

第1部分

5侧引物；aaaactagttcgtcttttgagaaagtcagggcag(序列号2)

3侧引物；gaataggcatcgataaacaagattc(序列号3)

第2部分

5侧引物；gaatcttgtttatcgatgcctattc(序列号4)

3侧引物；aaactcgaggcacatgcatgaagacgaatggcc(序列号5)

第3部分

5侧引物；aaactcgagatgcatgtgccttcctccaaatc(序列号6)

3侧引物；gtaggagctagcccgggtgagtag(序列号7)

第4部分

5侧引物；aaaactagttcgtcttttgagaaagtcagggcaggaac(序列号8)

3侧引物；aaaactagtcacaaggaagcttggctggagaggatc(序列号9)

需要说明的是，各部分的连接使用ClaI位点、EcoT22I位点、SmaI位点进行。

关于来自小鼠的IL-1β基因的部分(17-216aa)区域

用PCR法对全部区域的十分之一进行克隆。所使用的PCR试剂盒为Prime Star(Takara)，模板DNA为来自小鼠胎盘的逆转录产物，反应条件为：98℃10秒、55℃5秒、72℃1分钟，循环35次。

使用引物为5侧引物；aaaggtaccgatgagaatgacctgttctttg(序列号10)、3侧引物；aaactcgagaaaccgtttttccatcttcttc(序列号11)。

对培养细胞的一过性导入

将如上构建的基因载体一过性地导入到来自小鼠的巨噬细胞样细胞RAW264株中。

转染中使用Effectene(Qiagen)，回收转染后24小时的细胞供于实验。在一过性的表达细胞的培养液中按照2μg/mL的浓度添加LPS(Sigma#L2654)，用发光计对添加后48小时的荧光素酶发光量进行定量测定。作为对照，设置LP S无添加组。此外，作为现有型的仅检测IL-1β基因表达的报道系统，制作在IL-1β基因的启动子下游连接有GL4的载体，用以该载体进行了转染处理的细胞同样进行试验。

其结果是，获得图6所示的报道信号。导入有本发明的载体的、导入现有型的载体中的任一种的细胞中，均确认到通过LPS刺激而报道信号的显著上升。但是，就其灵敏度而言，本发明品比现有型提高了2倍以上。

转基因小鼠的制作

将切割、纯化后的基因载体注射到200个从C57BL/6系统的小鼠采集的原核期受精卵中，得到71只胎仔。使用由胎仔的体组织提取的基因组DNA，对基因型进行解析，得到18只基因组中插入有基因载体的建立者小鼠(founder mouse)。使4只建立者小鼠分别与野生型C57BL/6系统小鼠交配，制作F1代小鼠，研究腹腔内施予LPS(Sigma#L2654)时的报道分子的反应。

其结果，在系统编号No.M1的个体中，S/N比最优异，以炎症报道小鼠形式建立了该系统。(图8)。

使用转基因小鼠的炎症反应的可视化

在所建立的炎症报道小鼠的腹腔内，以3mg/kg体重的浓度施予LPS(Sigma#L2654)。在施予后0h、4h、24小时，用生物体成像装置(IVIS)观察荧光素酶发光。其结果是，可以从全身的组织捕捉到荧光素酶的发光信号(图5)。

序列表自由文本

序列号1～11：合成DNA

序列表

<110> 转基因股份有限公司(TransGenic Inc.)

国立大学法人熊本大学(National University Corporation KumamotoUniversity)

国立大学法人群马大学(National University Corporation GunmaUniversity)

<120> 炎症报道系统

<130> G1166WO

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8406

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 1

tcgtcttttg agaaagtcag ggcaggaaca caatcagggc agggacatgg aagcaggagc 60

tgatacaaag accatggaag attgctgctt actggcttgc ttcccttggc ttgctcagcc 120

tgttttctta tagaacccag aaccaccagc ccagggatgg taccatccac agtgagctgg 180

gccctctctt attaatcacc aattaataaa acgccctaca agtctaccta cagccagatc 240

ttacagaggc attttctcaa ttgagtctcc ctcctctctg atgactgtaa ctgtgtcatt 300

gacataaaac taatcagtac aactgacccc ttgccaactt gacacacaaa cacaccactt 360

tccttttttt aagatttatt tatttatata ttttatgtat atgggtgttt ttgtctgcat 420

gtactcctac acactagaag agtttattaa atcccatggg actactgtta cagatactgt 480

tagccaccat gtgggtgctg ggacttgaac tcaggacctc tggataagca gccagtgctc 540

taaattgctg agctcaaggc ccaacttatc actttttaat tagaaccttt cttttctcat 600

ttatccccaa gatgttatgt taatatttat atcacaatat aaaacattaa caacttaaag 660

gtcccacaat cctcacaaat tcaaatacat taaaagttct ctctctttaa aataatcaat 720

ctcttttaaa attcagtctc tcaactttgg acttctgtaa aatcaaaaat aaattatatt 780

tcaagagaga agaactaggt caaaatcgca atcaaagcaa agcaaaacca aactccaaaa 840

atgtaaatag tgcatgttcc aacgtcaaag atgcactcaa gatcttctgg gatcctctaa 900

ggggcttgag ttacttctgc agctcagccc tttgtagcac aaacagcttg tcttttagga 960

tttggctggc tccactccac tgctgctgct gttcttgatg gtcatcccat ggtacttgca 1020

tctccaaaat gctggggtct tctgctgcaa ctgggctgga cttataccag tactctcctg 1080

ggctctcttc atggtgacaa gcctcaactt ctctgtatga ccctttcaat cctgggcctt 1140

cagctgccac tgaggctgta ttgtcagtgc caagactcag ctgctcttcc atgaaccagt 1200

gtcacctggg tggctcttcc acaggaccaa atttggctgc cagtggagaa atacaacttt 1260

ggccatctct ggaaaacagc ttctgtgtgc tctcagaaaa cacttcccag aagatttcac 1320

ctcaataatg ctggactttt cttagtcact gctaatttct cagctccagc tcaccagcac 1380

tgagtatcta agcaaagcaa aggtttcatt tttagtggtt ctggaatctt gtttatcgat 1440

gcctattctt cagccccagc taatgagata ttatgttatc acggaatctt aattcaatat 1500

aacaaatggc cctgaagaag tctttaagct tccttctgaa gcttcacaag tcaggcctcc 1560

atctttgtgt tgccctcaac gtccctatct tccaagttcc taggaacagc tcaccaagaa 1620

ttgaccactc tatgggtttt cttgtacaaa gtccttccaa aacaatatgc tcaggtctgt 1680

cacagtcatg tcacagtaaa tcttggtgcc aattcatttt catttaggtt actattacta 1740

taatgaaact ccatgatcaa agcaacttgg ggaggaaagg atgtattctg cttacatttc 1800

cacatcacag tttatcatca aaggaagtca ggacaggaac tcaagcaagg caggaacctg 1860

gaaccaggag ctgatgcagc gatcatggag ggatgctgct cactggcttg ctcctcatgg 1920

cttgtcaacc tactttctta tagaacccag gaccaccagc ccagggatgg caccacccac 1980

aacaggctga tttctcccca agtaaatacc aattaataaa atttcctaca ggcttgccta 2040

cagacagatc ttttggatgt attttgtcag ttaaggctcc cttctctctg atgattctag 2100

cttgtgtcta gttgacataa aactaaccag gacagaaaag atgagaggga aagaacagac 2160

ccctaaggcc tgtgctaagt cgtcaactta aggaataaga caaggtctgg agaaagtaat 2220

gaggacagtc attgcttagc tctgttctga gcaagaggat aagtaaagaa gatgtagaac 2280

acatacatca actgggcctg ggagctcgtg cctgtaatct cagtccttgg gagacaaatg 2340

caggagaatt gtcatgtact tgaagccagt ctgggctgca cagtagtcat ggttatcaca 2400

gcaatagaaa gtaagtaaaa caggtagcaa ggcactttca gctttgaaga aatgcctgcc 2460

tccatcttgg aggaatgaga tgtcagaaca gagggaacct tacagcttaa aagtgctgag 2520

tgagtcaaga gctgaaaagt tccccaaaag ctagagtgcc cgtcaccatc ctggctttgc 2580

cgacttcctc ttttgctttg ttcatttcct ttgccaacat catcatcagt atcgtcatca 2640

ctatgccaca cccccagcat aacaatttct atagtgagtt atttcttcta ctcattgggg 2700

accaaaaagg aagtgtggtc tgagagacag ggtttgatat acatgttgtg caacttgcct 2760

gctctataac gacaagggga ggaaatttgg agcccaagtc acagggccag gatgaggttt 2820

gatagaacaa tagagtacca gaggcattgc ccagtagttc caaaatctcc ctctagaagc 2880

aaaagaatca tcaaccagat cattgcctcc tcccagacaa acctcctccc atctcttcat 2940

ctcttactca cgattaaatg gccattcgtc ttcatgcatg tgccttcctc caaatcctcc 3000

cagacaacca ctcctctcag gcatcagctc aagggtttag gagtgttata actagcagat 3060

ggtgaagaag attctgtaac tagactgagc tcaaggctcc tgaaaaatca tccagggaga 3120

agggacttgg agctgacact caggccccta gttacccttc tctgtcccct ggttttcacc 3180

atccctggtt caactcacat cagcagacca aaggagtctc caataatctc tgtcaggaca 3240

gcccataaaa tcatcagacc ttccagccct gcacacaggc tctgaggaag gtgttagtcc 3300

ctccaggcat agtttgaaat gtggaccctg tgaaggcaga acagaaaaat gaaccagatg 3360

gcccagacag gacctctgga ttgtctgcag aactagataa tacatcttat aagaccttag 3420

tgctgagaac tgaccattgc tcaccaaact caaaagcaac tgagaccctg aaccatcttc 3480

agatttcaaa tcaaacatat agctggtcaa aggcaggatt cttctgtttg ccttcctgaa 3540

atcgagatgc tgtgaaccaa attaggcaaa agaaggctgc ctagtaagta aaccttgttt 3600

catagtagag ccttgtctat tcctccttcc aattctgtct gtctatttcc cttcagtgct 3660

gcagaataag ctcagtaacc aaaacatact aggtacaaac tcatctgaat gaacacattg 3720

ccaaattcct actcacccgg gctagctcct actgcctgca tccatctgcc aggcactgtg 3780

gagacctggc tctaatggag tccacagact ctctgagggc tcagcaaagg agttaggttt 3840

ccactgagga ttctactata ctgtagatgt gcccaagaga ctgtatgcag cattcatatg 3900

gcctggttgc tcattccatc caagcaagaa gagctcccct gggtaggctc cctgggctct 3960

ctgagttagc agtctagtga tgcttgatat ggccaagaga cttggtctcc ccagatctta 4020

tagaaacaag aattttccaa aacaattttt taggcaaaga ctatctcttc actttttaag 4080

atggactgtg ctcatgaaca ggcagatgcc tcgttcacca cctttgcact gtgcaactta 4140

attcaggctc attctgctga tcacctagca ctgatatggt ttcaacatga gactggctat 4200

ggtattataa gtaccctggc agggcaggaa agcaggagtg ggtgggtgag tgggggagca 4260

tcctcataga ggcaggggag ggggagagga tagggggttt ccggagggga gacctggaaa 4320

agggataaca tttgaaatgt aaataaagaa aatatccaat aaaagaaaaa aataagcacc 4380

ctggcattat cagactgcat aggcttgctt ccagagttcc ctgaccctat gataagtcta 4440

cactgatacc tgcatactgt gtgtgccctg acccacacaa ggaagtgcgt gtctctccag 4500

aagcccctgc taacacagtt gatggagagc acagaagcac catccagtta ccaaactcca 4560

actgcaaagc tccctcagct taagcacaag gaggcgagag aggtgacaca cttctgggtg 4620

tgcatctacg tgcctacctt tgttccgcac atcctgactt aaaatgtaca gctaacccag 4680

gaaaacccaa tatttttaat attgacacca tctgcacaat tgtccagggg gaaataatgc 4740

ccatttccac cacgatgaca cacttgcgaa tgtgtcacta tctgccaccc cttgacttcc 4800

agggattaga aattatttca gggtagcaat agcctcttcc cctaagaatt cccatcaagc 4860

ttctcccccc tcccccaccc ttcagttttg ttgtgaaatc agttaaccca agggaaaatt 4920

tcacagctct tcacttctgc tttttaggac tataaaacaa gggagggaaa acaagttgga 4980

caacaaaccc tgcagtggtt cgaggcctaa taggctcatc tgggatcctc tccagccaag 5040

cttccttgtg actagaggcc ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga 5100

tgcagtcggg gcggcgcggt ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct 5160

cgaacaccga gcgaccctgc agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgaa gcttccacca 5220

tggaagatgc caaaaacatt aagaagggcc cagcgccatt ctacccactc gaagacggga 5280

ccgccggcga gcagctgcac aaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg 5340

cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg 5400

ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt 5460

gcagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg 5520

ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca 5580

gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa 5640

agaagctacc gatcatacaa aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct 5700

tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact 5760

tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac agtagtggca 5820

gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc 5880

atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctcagcgtgg 5940

tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca ccacgctggg ctacttgatc tgcggctttc 6000

gggtcgtgct catgtaccgc ttcgaggagg agctattctt gcgcagcttg caagactata 6060

agattcaatc tgccctgctg gtgcccacac tatttagctt cttcgctaag agcactctca 6120

tcgacaagta cgacctaagc aacttgcacg agatcgccag cggcggggcg ccgctcagca 6180

aggaggtagg tgaggccgtg gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc cagggctacg 6240

gcctgacaga aacaaccagc gccattctga tcacccccga aggggacgac aagcctggcg 6300

cagtaggcaa ggtggtgccc ttcttcgagg ctaaggtggt ggacttggac accggtaaga 6360

cactgggtgt gaaccagcgc ggcgagctgt gcgtccgtgg ccccatgatc atgagcggct 6420

acgttaacaa ccccgaggct acaaacgctc tcatcgacaa ggacggctgg ctgcacagcg 6480

gcgacatcgc ctactgggac gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg ctgaagagcc 6540

tgatcaaata caagggctac caggtagccc cagccgaact ggagagcatc ctgctgcaac 6600

accccaacat cttcgacgcc ggggtcgccg gcctgcccga cgacgatgcc ggcgagctgc 6660

ccgccgcagt cgtcgtgctg gaacacggta aaaccatgac cgagaaggag atcgtggact 6720

atgtggccag ccaggttaca accgccaaga agctgcgcgg tggtgttgtg ttcgtggacg 6780

aggtgcctaa aggactgacc ggcaagttgg acgcccgcaa gatccgcgag attctcatta 6840

aggccaagaa gggcggcaag atcgccgtgg gtaccaagct tgatgagaat gacctgttct 6900

ttgaagttga cggaccccaa aagatgaagg gctgcttcca aacctttgac ctgggctgtc 6960

ctgatgagag catccagctt caaatctcgc agcagcacat caacaagagc ttcaggcagg 7020

cagtatcact cattgtggct gtggagaagc tgtggcagct acctgtgtct ttcccgtgga 7080

ccttccagga tgaggacatg agcaccttct tttccttcat ctttgaagaa gagcccatcc 7140

tctgtgactc atgggatgat gatgataacc tgctggtgtg tgacgttccc attagacaac 7200

tgcactacag gctccgagat gaacaacaaa aaagcctcgt gctgtcggac ccatatgagc 7260

tgaaagctct ccacctcaat ggacagaata tcaaccaaca agtgatattc tccatgagct 7320

ttgtacaagg agaaccaagc aacgacaaaa tacctgtggc cttgggcctc aaaggaaaga 7380

atctatacct gtcctgtgta atgaaagacg gcacacccac cctgcagctg gagagtgtgg 7440

atcccaagca atacccaaag aagaagatgg aaaaacggtt tctcgaggac tacaaggatg 7500

acgatgacaa gaattctgct tgcaagaact ggttcagtag cttaagccac tttgtgatcc 7560

accttaacag ccacggcttc cctcccgagg tggaggagca ggccgccggc accctgccca 7620

tgagctgcgc ccaggagagc ggcatggata gacaccctgc tgcttgcgcc agcgccagga 7680

tcaacgtcta agctagctag gtagctagag gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg 7740

tgtgacataa ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt 7800

tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt agattccaac 7860

ctatggaact gatgaatggg agcagtggtg gaatgccttt aatgaggaaa acctgttttg 7920

ctcagaagaa atgccatcta gtgatgatga ggctactgct gactctcaac attctactcc 7980

tccaaaaaag aagagaaagg tagaagaccc caaggacttt ccttcagaat tgctaagttt 8040

tttgagtcat gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt acaccacaaa 8100

ggaaaaagct gcactgctat acaagaaaat tatggaaaaa tatttgatgt atagtgcctt 8160

gactagagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 8220

tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 8280

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 8340

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 8400

tctgga 8406

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 2

aaaactagtt cgtcttttga gaaagtcagg gcag 34

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 3

gaataggcat cgataaacaa gattc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 4

gaatcttgtt tatcgatgcc tattc 25

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 5

aaactcgagg cacatgcatg aagacgaatg gcc 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 6

aaactcgaga tgcatgtgcc ttcctccaaa tc 32

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 7

gtaggagcta gcccgggtga gtag 24

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 8

aaaactagtt cgtcttttga gaaagtcagg gcaggaac 38

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 9

aaaactagtc acaaggaagc ttggctggag aggatc 36

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 10

aaaggtaccg atgagaatga cctgttcttt g 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成 DNA

<400> 11

aaactcgaga aaccgttttt ccatcttctt c 31

Claims (8)

1.一种载体，其依次含有：控制编码炎症性细胞因子的基因的表达的启动子、编码报道蛋白的基因、编码前述炎症性细胞因子的基因、及编码蛋白质分解信号序列的基因，其中，

所述炎症性细胞因子为白介素1β，

所述报道蛋白为荧光素酶，

所述编码炎症性细胞因子的基因含有编码被胱天蛋白酶识别的肽的多核苷酸序列，

其中，所述编码炎症性细胞因子的基因的序列为来自小鼠的编码白介素1β第17-216位氨基酸的碱基序列；

所述胱天蛋白酶为胱天蛋白酶-1；

所述启动子为融合启动子，所述融合启动子为来自小鼠的IL-1β基因的上游启动子的正下游融合来自HSV的TK基因启动子所获得的融合启动子；

所述蛋白质分解信号序列为来自酿酒酵母的CL1-来自小鼠的PEST序列。

2.一种转化体，其含有权利要求1所述的载体。

3.根据权利要求2所述的转化体，其中，通过炎症性刺激，所述报道蛋白以发光信号形式被检测。

4.一种权利要求2所述的转化体或导入有权利要求1所述的载体的转基因非人动物在制备用于检测通过炎症性刺激而在该转化体或转基因非人动物中引起的炎症反应的试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，编码炎症性细胞因子的基因在由炎症反应引起的转录因子NF-κB作用下进行表达。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其中，通过炎症性刺激，以发光信号形式来检测所述报道蛋白。

7.一种抗炎症物质的筛选方法，其特征在于，使权利要求2所述转化体或导入有权利要求1所述载体的转基因非人动物在炎症性刺激下接触候选物质，以有无炎症反应为指标来选择抗炎症物质。

8.一种炎症反应检测用或抗炎症物质的筛选用试剂盒，其含有权利要求2所述转化体。

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