CN109182275A - Rga法检测热原生物学活性 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了RGA法检测热原生物学活性，所述RGA法是基于转染NF‑κB报告基因的RAW264.7单核细胞系所建立的热原生物活性检测方法，该方法可以快速方便的检测多种类热原。本发明同时公开了检测热原生物活性的单克隆细胞株及其构建方法。

Description

RGA法检测热原生物学活性
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及RGA法检测热原生物学活性。
背景技术
热原是一类可致人体产生发热反应的物质，其可分为外源性热原与内源性热原。外热原主要来源于机体外的细菌、病毒、真菌类微生物，目前对其结构研究较为清楚的主要包括革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)也称为细菌内毒素、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)、真菌的酵母多糖(zymosan)。内热原主要来源于机体内的激素(如类固醇、前列腺素)与细胞因子(如肿瘤坏死因子、干扰素、生长因子、白细胞介素)。作为污染药品的常见杂质，热原可严重危害药品的安全性。目前，常用的热原检测方法包括家兔热原检查法(rabbit pyrogen test，RPT)与细菌内毒素检查法(bacterialendotoxins test，BET)。RPT法存在的最大问题是兔与人对热原反应存在较大种属差异，不能真实反映人体对热原的发热反应机制。BET法存在的最大问题是其仅能特异性检测革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素，不能检测其他种类的热原物质。
发热反应是机体针对热原物质产生的系统性炎症反应，热原引起人体产生发热反应的机制主要包括2类通路：即前列腺素(prostaglandin，PEG)依赖性与PEG非依赖性通路。①PEG依赖性通路中，外热原先诱导机体产生促炎症因子，包括白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CC趋化因子5(CC chemokine ligand5，CCL5)、CXC趋化因子1(CXC chemokineligand 1，CXCL1)，这些因子均可促进PGE2的分泌进而诱导发热反应。②PEG非依赖性通路中，热原效应因子(preformed pyrogenic factor，PFPF)、CXCL8、CCL3为促炎症因子，这些因子分别通过PFPF→促皮质素释放因子(corticotropin releasing factor，CRF)→内皮素-1→内源性阿片肽，CXCL8→CRF，CCL3→CRF诱导发热反应。
不同种类的热原刺激人体的机制及诱导人体分泌的促炎症因子存在不同：如①LPS主要结合Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，活化的TLR4主要经MyD88依赖性(MyD88→NF-κB→促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6合成)与TRIF依赖性(TRIF→NF-κB)通路引起促炎症反应。②LTA主要结合TLR2进而活化NF-kB引起TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NO、趋化因子等促炎症介质的产生。③酵母多糖可结合TLR2活化NF-κB进而诱导促炎症因子TNF-α、IL-1β、趋化因子IL-8的表达。
本发明以炎症反应的中枢因子NF-κB为热原标志物，通过构建转染NF-κB报告基因的RAW264.7单核细胞系，研究该细胞模型中的NF-κB对不同种类热原(如LPS、LTA、zymosan)的反应活性，建立一种可全面反映人体对不同种类热原的发热反应机制，且快速简便、稳定准确的RGA热原检测法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种能够快速简便的检测热原生物学活性的单克隆细胞株的构建方法。
本发明的目的之二在于提供一种能够快速简便的检测多种热原生物学活性单克隆细胞株。
本发明的目的之三在于提供一种快速简便、稳定准确的热原生物学活性检测报告基因法。
本发明的目的之四在于提供一种筛选治疗发热候选药物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种测定热原生物活性的细胞株的构建方法，包括以下步骤：
a.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因启动子的重组质粒；
b.将重组质粒转入RAW264.7细胞中，加压筛选分离培养出阳性单克隆细胞株；
c.从阳性单克隆细胞株中筛选得到对热原具有较高反应活性的RAW264.7单克隆细胞株。
进一步，所述NF-κB反应元件为3个。
进一步，NF-κB反应元件的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述质粒包括本领域技术人员的常用的质粒载体。作为一种优选的实施方式，所述质粒为pCM1.1_luc_hygro。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的构建方法在制备RAW264.7单克隆细胞株中的应用。
本发明第三方面提供了一种RAW264.7细胞株，所述细胞株由本发明第一方面所述的方法构建而成，在本发明的具体实施方式中，所述细胞株为RAW264.7-NFκB 2D8。
本发明的第四方面提供了本发明第三方面所述的RAW264.7细胞株在制备检测热原生物活性的产品中的应用。
本发明的第五方面提供了一种新的热原生物活性的测定方法，所述方法通过使用本发明第三方面所述的RAW264.7细胞株进行检测，所述的RAW264.7细胞株转染NF-κB报告基因，当外源性热原刺激该细胞株时，NF-κB被活化，根据NF-κB的活化程度来判断热原的种类及浓度。
为了探索热原生物活性测定的最优方法，本发明对热原刺激的时间以及细胞密度进行了摸索。作为可选择的实施方式中，热原刺激的时间为4-24h；作为优选的实施方式，热原刺激的时间为10h。
作为可选择的实施方式，热原刺激的细胞密度为5000～150,000个/孔；作为优选的实施方式，细胞密度为100000个/孔。
本发明的第六方面提供了本发明第三方面所述的RAW264.7细胞株在筛选治疗发热的候选药物中的应用。
进一步，步骤包括：
加入待筛选物质和热原处理含有RAW264.7细胞株的体系；
检测所述体系中NF-κB的活性；
其中，若NF-κB的活性较低或者无变化，这说明该待筛选物质是治疗发热的候选药物。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次提供了一种可检测多种热原生物活性的方法，该方法成本低，操作简便，周期短，不需要进行动物实验，结果稳定可靠，准确度高，有利于促进药品的研究开发，质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。
本发明提供了一种单克隆细胞株及其构建方法，使用该单克隆细胞株，可检测多种热原生物活性，具有较高的敏感性和准确性。
附图说明
图1是不同热原活化NF-κB的时间-效应关系图，其中图A是细菌内毒素，图B是脂磷壁酸，图C是酵母多糖；
图2是不同细胞密度下细菌内毒素活化NF-κB的量效关系图；
图3是NF-κB对不同热原的检测限与剂量反应曲线图；其中，图A是细菌内毒素，图B是脂磷壁酸，图C是酵母多糖；
图4是内毒素样品溶液理论值与实测值的线性回归分析图。
具体的实施方式
本发明通过将三个串联的NF-κB反应元件构建报告基因质粒(Reporter gene，R-G)转染RAW264.7细胞，通过加压筛选分离培养出单克隆细胞株，再建立相应的检测方法定量检测热原生物学活性。其技术流程为：RAW264.7/R-G细胞株的建立(报告基因载体单克隆细胞株)→RGA测定方法的建立及方法学验证。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 RAW264.7单克隆细胞株的构建及筛选
1、材料
1)试剂
细菌内毒素国家标准品：中国食品药品检定研究院，150600-200707
酵母多糖：SIGMA，Z4250
脂磷壁酸：SIGMA，L3265
pCM1.1_luc_hygro载体：自主构建选择培养基：DMDM(GIBCO，11995-065)+10％胎牛血清(GEMINI，900-108)+1％双抗(GIBCO，15140-122)+1％Glutamin(GIBCO，25030-081)+150μg/ml潮霉素B(Amresco，V900372)
完全培养基：DMDM(GIBCO，11995-065)+10％胎牛血清(GEMINI，900-108)
荧光素酶底物：Promega，E2650
PBS：HYCLONE，SH30256.01
胰酶：GIBCO，25200-056
96孔板：CORNING，3917
RAW264.7细胞：ATCC
2)仪器：
电转仪：Bio-Rad，Gene Pulser Xcell
酶标仪：Biotek，synergyHT
二氧化碳培养箱：Thermo，BB150
生物安全柜：Thermo，1389A2
3)数据分析软件
Gen5CHS2.01软件
2、方法
1)NF-κB报告基因载体(pCM1.1_luc_NFκB_hygro)的构建
化学合成DNA反应元件，序列如下：
5’-TCCTCGGAAAGTCCCCTCTGAGATCCTCGGAAAGTCCCCTCTGAGATCTCAGAGGGGACTTTCCGAGGA-3’(SEQ ID NO.1)
正负链退火后连入pCM1.1_luc_hygro载体，测序鉴定。
2)载体的转染
a.细胞计数，收集5×106个活细胞，PBS润洗2次后用200μL Opti-MEM培养基重悬，转移至4mm电击杯；
b.取10μg质粒到200μL Opti-MEM培养基，静置5min后，加入4mm电击杯中与细胞悬液轻轻混匀，加入4mm电击杯中；
3)设置电击参数(电压300V，电容950μF)；
4)电击后转移至10cm细胞培养皿，加10mL完全培养基；
5)48h后检测荧光素酶的表达。
3)单克隆细胞株的加压筛选与分离培养
a.转染后48h，更换选择培养基(150μg/ml hygromycin)，筛选3周左右，每3-4天更换一次选择培养基；
b.待克隆长出后，消化计数，稀释至1个细胞/100μL，100μL/孔铺至96孔板；
c.用选择培养基培养8-12天，显微镜下观察，挑选单克隆的细胞孔，并转移至24孔板，长满后再传至6孔板扩大培养。
4)RAW264.7-NFκB 2D8单克隆细胞株的筛选
a.将分离到的单克隆细胞株使用选择培养基进行稀释，接种至96孔板中(20,000个/孔)，细胞贴壁24h后，弃去孔内选择培养基；
b.用完全培养基配制LPS系列溶液(初浓度为1000ng/ml，3倍系列稀释10个梯度)，加入96孔板(100μl/孔，n＝3)，二氧化碳培养箱内孵育10h(37℃，5％CO2)；
c.将萤光素酶底物溶液加入96孔板(100μl/孔)，检测NF-κB活化引起的荧光素酶活性。
最终筛选得到RAW264.7-NFκB 2D8单克隆细胞株对LPS的反应活性最强。
实施例2 RGA检测热原活性方法的建立
1、不同种类热原活化NF-κB的时间-效应关系
将3种不同种类的热原(包括LPS、LTA、zymosan)分别刺激筛选得到的RAW264.7-NFκB 2D8单克隆细胞株，检测随刺激时间延长(2、4、8、10、12、24h)，其活化NF-κB的时间-效应关系。
结果如图1所示，不同种类的热原，包括LPS(0.5、5、50EU/ml)、LTA(0.5、5、50μg/ml)、zymosan(1、10、100μg/ml)，均可活化NF-κB，且其活化效应具有一定的剂量依赖性随刺激时间延长，3种热原均可在作用后10h最大程度活化NF-κB(&：P＞0.05vs 0EU/ml；#：P＜0.05vs 0EU/ml；*：P＜0.01vs 0EU/ml)，说明本方法最佳孵育时间可为10h。
2、不同细胞密度下细菌内毒素活化NF-κB的量效关系
将系列浓度的LPS分别刺激不同密度的RAW264.7-NFkB 2D8单克隆细胞株(包括50,000，100,000，150,000个/孔)，刺激时间为10h，比较不同细胞密度下LPS活化NF-κB的量效关系。
结果如图2所示，不同细胞密度下，LPS浓度(0、0.125、0.5、2、8、32、128、512EU/ml)与NF-κB活性间均存在一定的量效关系；低密度细胞(50,000个/孔)的剂量反应曲线较平坦；高密度细胞(150,000个/孔)的剂量反应曲线较陡峭，LPS可维持NF-κB高活性平台期的浓度范围较窄(32～128EU/ml)；中密度细胞(100,000个/孔)的剂量反应曲线较陡峭，LPS可维持NF-κB高活性平台期的浓度范围较宽(32～512EU/ml)。因此，细胞密度为100,000个/孔时，LPS浓度与NF-κB活性间具有最佳的量效关系。
3、NF-κB对不同种类热原的检测限与剂量反应曲线
将3种不同种类的热原(包括LPS、LTA、zymosan)分别刺激RAW264.7-NFkB2D8单克隆细胞株，刺激时间为10h，细胞密度为100,000个/孔，检测NF-κB对不同种类热原的检测限与剂量反应曲线。
结果如图3所示，NF-κB对LPS、LTA、zymosan的检测限分别可达0.03EU/ml(P＝0.004)、0.001μg/ml(P＝0.021)、1μg/ml(P＝0.001)，(#：P＜0.05vs0EU/ml；*：P＜0.01vs0EU/ml)；LPS(0、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256EU/ml，n＝4)、LTA(0、0.01、0.1、1、10、100μg/ml，n＝4)、zymosan(0、1、10、100μg/ml，n＝4)分别与NF-κB活性间存在较好的剂量反应曲线，说明本方法具有较好的灵敏度与量效关系。
4、方法学验证
1)方法的精密度与重复性验证
用本方法建立LPS标准品溶液的量效曲线，用该曲线检测4个LPS样品溶液(理论值分别为样品1＝1.5EU/ml、样品2＝3EU/ml、样品3＝6EU/ml、样品4＝12EU/ml，n＝4)的生物活性，重复检测9次，分析方法的精密度与重复性。
结果如表1所示，本方法具有较好的精密度与重复性。
2)方法的准确性
对LPS样品溶液的理论值与实测值进行线性回归分析，分析方法的准确性。
结果如图4所示，说明本方法具有较好的准确性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> RGA法检测热原生物学活性
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctcggaaa gtcccctctg agatcctcgg aaagtcccct ctgagatctc agaggggact 60
ttccgagga 69

Claims (10)

1.一种测定热原生物活性的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因启动子的重组质粒；
b.将重组质粒转入RAW264.7细胞中，加压筛选分离培养出阳性单克隆细胞株；
c.从阳性单克隆细胞株中筛选得到对热原具有较高反应活性的RAW264.7单克隆细胞株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述NF-κB反应元件为3个。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，NF-κB反应元件的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为pCM1.1_luc_hygro。
5.权利要求1-4任一项所述的构建方法在制备RAW264.7单克隆细胞株中的应用。
6.一种RAW264.7细胞株，其特征在于，所述细胞株由权利要求1-4任一项所述的方法构建。
7.权利要求6所述的RAW264.7细胞株在制备检测热原生物活性的产品中的应用。
8.一种新的热原生物活性的测定方法，其特征在于，使用权利要求6所述的RAW264.7细胞株进行检测。
9.权利要求6所述的RAW264.7细胞株在筛选治疗发热的候选药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤包括：
加入待筛选物质和热原处理含有RAW264.7细胞株的体系；
检测所述体系中NF-κB的活性；
其中，若NF-κB的活性较低，这说明该待筛选物质是治疗发热的候选药物。
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