CN102741405A - 提高基因表达的系统和保持有该系统的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供使用启动子、增强子等来提高特别是外源基因的表达的方法；以及含有启动子、增强子等的可提高基因表达的表达用盒；本发明通过下述基因表达用盒达成上述目的：该表达用盒含有DNA构建体，并在该DNA构建体的下游含有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第1启动子下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。

Description

提高基因表达的系统和保持有该系统的载体
技术领域
本发明涉及使用启动子、增强子等来提高基因表达的方法；以及含有启动子、增强子等的提高基因表达的表达用盒。
背景技术
以往，为了提高基因表达效率，开发出了CMV启动子、CAG启动子等各种基因表达启动子(专利文献1～4)。但是，在生物技术领域中，即使使用这些现有技术，根据细胞种类或基因种类的不同，通常也会出现几乎不发生基因表达、或表达蛋白质量极少这样的问题。并且，该问题在将基因表达用于诊断或治疗的医疗的进步中成为较大的障碍。
专利文献1：日本专利公报第2814433号公报
专利文献2：日本专利公报第2814434号公报
专利文献3：美国专利第5168062号说明书
专利文献4：美国专利第5385839号说明书
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用启动子、增强子等来提高基因表达的方法；以及一种含有启动子、增强子等的可提高基因表达的表达用盒。
在利用了启动子的基因表达系统中，本发明人尝试开发出一种可以以更高的效率进行基因表达的新系统，对各种基于基因的启动子、增强子的组合所得到的启动子活性进行了比较、研究。结果发现，通过使用基因表达用盒(其在DNA构建体的下游连接有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第1启动子的下游含有所要表达的基因和polyA附加序列)，将所要表达的基因夹在2个启动子之间、或夹在启动子与增强子之间，可使基因高效表达。本发明人进一步发现，通过使上述表达用盒中含有polyA附加序列、RU5’、UAS、SV40-ori等元件，能够进一步高效地进行基因的表达。
通过本发明的“提高基因表达的系统和保持有该系统的载体”的开发，可针对大致全部的细胞、基因使蛋白质表达得到强力提高。
即，本发明如下。
[1]一种基因表达用盒，该表达用盒含有DNA构建体，并在该DNA构建体的下游含有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第1启动子下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。
[2]如[1]所述的表达用盒，其中，在所连接的增强子或第2启动子的下游不具有其它基因表达用机构，具有所要表达的基因被夹在一个第1启动子与一个增强子之间、或者被夹在一个第1启动子与一个第2启动子之间的结构。
[3]如[1]所述的表达用盒，其中，启动子为选自由CMV i启动子、SV40启动子、hTERT启动子、β肌动蛋白启动子和CAG启动子组成的组中的启动子。
[4]如[1]～[3]的任一项所述的表达用盒，其中，增强子为选自由CMV增强子、SV40增强子和hTERT增强子组成的组中的至少1种增强子。
[5]如[1]～[4]的任一项所述的表达用盒，其在DNA构建体的上游进一步连接有1～4个CMV增强子，所述DNA构建体在启动子的下游含有编码所要表达的蛋白质的DNA和polyA附加序列。
[6]如[1]～[5]的任一项所述的表达用盒，其进一步含有下述元件的至少任意之一：
(i)连接在紧靠编码外源蛋白质的DNA的上游的RU5’；
(ii)连接在紧靠增强子和/或启动子的上游的UAS；和
(iii)连接在表达用盒的最上游的SV40-ori。
[7]如[1]～[6]的任一项所述的表达用盒，其中，所要表达的基因为可用于疾病治疗的治疗用基因，或者为可用于药物、诊断试剂或试剂的蛋白质的基因。
[8]如[7]所述的表达用盒，其中，治疗用基因是可用于肿瘤的治疗的抑癌基因。
[9]如[8]所述的表达用盒，其中，抑癌基因为REIC/Dkk-3基因。
[10]如[9]所述的表达用盒，其中，所要表达的基因为REIC/Dkk-3基因的片段DNA。
[11]如[10]所述的表达用盒，其中，REIC/Dkk-3基因的片段DNA为编码序列编号18的氨基酸序列的第1～78氨基酸的DNA。
[12]如[1]所述的外源基因表达用盒，其具有构建体No.2(图8)、No.4(图10)、No.6(图12)、No.8(图14)、No.10(图16)、No.12(图18)和No.14(图20)所示的结构。
[13]如[1]所述的外源基因表达用盒，其具有构建体No.15(图16)、No.16(图37)、No.17(图49)、No.20(图57)和No.21(图58)所示的结构。
[14]一种载体，其含有[1]～[13]任一项所述的外源基因表达用盒。
[15]如[14]所述的载体，其为腺病毒载体或腺相关病毒载体。
[16]一种宿主细胞，其含有[14]或[15]所述的载体。
[17]一种疾病检测或治疗用制剂，其含有[14]或[15]所述的载体。
[18]一种使所要表达的基因进行表达的方法，其使用[1]～[13]的任一项所述的表达用盒、或者[14]或[15]所述的载体。
[19]一种使所要表达的基因进行表达的方法，在该方法中，将在DNA构建体的下游连接有增强子或第2启动子而成的物质导入至载体中，并使用该载体进行上述基因的表达；所述DNA构建体在第1启动子的下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。
[20]一种所要表达的基因所编码的蛋白质的制造方法，其包括如下步骤：将[1]～[13]的任一项所述的表达用盒、或者[14]或[15]所述的载体导入至细胞中，对该细胞进行培养。
本说明书中包括作为本申请优先权基础的日本专利申请2009-264299号的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1为示出了使用FuGENE(商标)-HD在HEK293细胞株中进行了36小时转染的各种外源基因的表达的图。
图2为示出了使用FuGENE(商标)-HD在各种细胞株中进行了36小时转染的KLF基因的表达的图。
图3为示出了使用各种转染试剂在HEK293细胞株中进行了36小时转染的KLF基因的表达的图。
图4为示出了使用FuGENE(商标)-HD使全长REIC基因和编码N78-REIC的基因在HEK293细胞株中进行了36小时转染的情况下的表达的图。
图5-1为示出了利用构建体No.14(其插入有编码N78-REIC的DNA)进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制与细胞死亡诱导的图(曲线图)。
图5-2为示出了利用构建体No.14(其插入有编码N78-REIC的DNA)进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制与细胞死亡诱导的图(照片)。
图6为示出了利用插入有全长REIC基因的构建体No.14进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制的图。
图7为示出了构建体No.1的结构的图。
图8为示出了构建体No.2的结构的图。
图9为示出了构建体No.3的结构的图。
图10为示出了构建体No.4的结构的图。
图11为示出了构建体No.5的结构的图。
图12为示出了构建体No.6的结构的图。
图13为示出了构建体No.7的结构的图。
图14为示出了构建体No.8的结构的图。
图15为示出了构建体No.9的结构的图。
图16为示出了构建体No.10的结构的图。
图17为示出了构建体No.11的结构的图。
图18为示出了构建体No.12的结构的图。
图19为示出了构建体No.13的结构的图。
图20为示出了构建体No.14的结构的图。
图21为示出了编码全长REIC/Dkk-3基因的腺病毒构建体的结构的图。
图22-1为示出了pDNR-1r供体载体的全碱基序列的图。
图22-2为示出了pDNR-1r供体载体的全碱基序列的图(续图22-1)。
图23为示出了pIDT-SMART载体的全碱基序列的图。
图24为示出了CMV i启动子(hCMV+内含子启动子)区域的碱基序列的图。
图25为示出了BGH polyA(3×stop+BGH polyA)区域的碱基序列的图。
图26为示出了CMV增强子区域的碱基序列的图。
图27为示出了人β肌动蛋白启动子区域的碱基序列的图。
图28为示出了RU5’正方向{HTLV类型1长末端重复的R段和U5序列的一部分(R-U5’)｝区域的碱基序列的图。
图29为示出了RU5’反方向{HTLV类型1长末端重复的R段和U5序列的一部分(R-U5’)}区域的碱基序列的图。
图30为示出了4×CMV增强子区域的碱基序列的图。
图31为示出了CAG启动子区域的碱基序列的图。
图32为示出了2IRES插入区域的碱基序列的图。
图33为示出了SV40ori-UAS-CMVi-RU5’区域的碱基序列的图。
图34为示出了3×stop-BGH-polyA-UAS-hTERT增强子+SV40增强子+CMV增强子区域的碱基序列的图。
图35-1为示出了构建体No.14载体的全碱基序列的图。
图35-2为示出了构建体No.14载体的全碱基序列的图(续图35-1)。
图36为示出了构建体No.15的结构的图。
图37为示出了构建体No.16的结构的图。
图38为示出了SV40ori-UAS-SV40enh-intron A-RU5’区域的碱基序列的图，其为示出了相对于构建体NO.15的插入基因(目的基因)为左侧(上游侧)的插入部分的碱基序列的图。
图39为示出了SV40ori-UAS-hTERT enh-intronA-RU5’区域的碱基序列的图，其为示出了相对于构建体NO.16的插入基因(目的基因)为左侧(上游侧)的插入部分的碱基序列的图。
图40为示出了质粒中的GFP区域的碱基序列的图。
图41-1为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.14的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图。
图41-2为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.14的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图(续图41-1)。
图42-1为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.15的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图。
图42-2为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.15的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图(续图42-1)。
图43-1为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.16的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图。
图43-2为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.16的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图(续图43-1)。
图44为示出了使用含有SV40启动子(构建体No.15)和hTERT启动子(构建体No.16)的质粒的情况下GFP基因表达的强度的图。
图45为示出了质粒中的人红细胞生成素区域的碱基序列的图。
图46为示出了使用构建体No.14的质粒进行人红细胞生成素的表达的情况下的结果的图。
图47A为示出了质粒中的人IgG轻链区域(图44A)的碱基序列的图。
图47B为示出了质粒中的人IgG重链区域(图44B)的碱基序列的图。
图48为示出了使用构建体No.14的质粒进行人IgG轻链(图48A)和人IgG重链(图48B)的表达的情况下的结果的图。
图49为示出了构建体No.17的结构的图。
图50为示出了将全长人REIC的DNA插入到构建体NO.17的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图。
图51为示出了使用构建体No.17的质粒进行全长人REIC的表达的结果的图。
图52为示出了c-myc基因的序列的图。
图53为示出了将存在于构建体No.14的表达质粒的表达基因下游的BGH polyA与3个增强子连接而成的碱基序列的图。
图54为示出了通过在市售质粒中重组下述碱基序列而进行c-myc基因的表达的情况下的结果的图，该碱基序列为将在构建体No.14表达质粒的表达基因下游存在的BGH polyA和3个增强子连接而成的碱基序列。
图55为示出了构建体No.18的结构的图。
图56为示出了构建体No.19的结构的图。
图57为示出了构建体No.20的结构的图。
图58为示出了构建体No.21的结构的图。
图59-1为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.21的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图。
图59-2为示出了将GFP基因的DNA插入到构建体No.21的插入基因(目的基因)区域而成的质粒的碱基序列的图(续图59-1)。
图60为示出了将目的基因插入到含有hTERT启动子的质粒中进行表达的情况下的结果的图。
图61为示出了对重组有不同外源基因的2个以上的表达载体同时进行转染的情况下的表达的图。
图62为示出了使用本发明的表达载体产生人红细胞生成素的图。
图63为示出了使用本发明的表达载体所产生的人红细胞生成素的纯度的图。
图64为示出了使用本发明的表达载体的人红细胞生成素的产生量的图，图64A表示25mL培养上清中的产生量，图64B表示1L培养上清中的换算产生量。
图65为示出了使用本发明的表达载体产生人REIC蛋白质的图。
图66为示出了使用本发明的表达载体所产生的人REIC蛋白质的离子交换柱色谱的图。
图67为示出了使用本发明的表达载体的人REIC蛋白质的产生量(520mL培养上清中的产生量和1L培养上清中的换算产生量)的图。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明中，所要表达的蛋白质的表达用盒指的是用于使所要表达的蛋白质的表达成为可能的DNA套件(set)。
该表达用盒具有下述结构：其含有至少在第1启动子下游含有所要表达的蛋白质的基因(所要表达的基因)和polyA附加序列的DNA构建体、并在该DNA构建体的下游连接含有增强子或第2启动子。另外，所要表达的基因可以使用任意基因，在本发明的表达用盒中，所要表达的基因的插入部位可以存在于多克隆位点。这种情况下，只要利用限制性内切酶所识别的序列将所要表达的基因插入到多克隆部位(插入部位)即可。如此，并不含有所要表达的基因DNA本身、但含有该DNA的插入部分作为多克隆部位的表达用盒也包含在本发明的表达用盒中。需要说明的是，有时也将所要表达的基因称为目标基因或目的基因、将所要表达的蛋白质称为目标蛋白质或目的蛋白质。并且，从表达盒构建的方面出发，由于这些基因被插入到表达盒的目标基因区域，因而也称为插入基因。并且有时也称为外源基因。
另外，在本发明表达用盒的最下游存在上述增强子或第2启动子，在其下游不具有其它基因表达用机构。即，本发明的表达用盒具有至少所要表达的基因被夹在一个第1启动子和至少一个增强子之间、或被夹在一个第1启动子和一个第2启动子之间的结构。此处，所谓其它基因表达用机构指的是用于表达上述的所要表达的基因以外的基因的结构，包括用于表达所要表达的基因以外的基因的启动子、增强子等。本发明的表达用盒中，在所要表达的基因的上游和下游可以存在启动子，这两个启动子用于增强该所要表达的基因的表达效率。
本发明的表达用盒通过重组到表达载体中进行利用。本发明也包括含有本发明的表达用盒的载体。如上所述，在本发明的表达用盒的最下游存在上述的增强子或第2启动子，在其下游不具有其它基因表达用机构。包含本发明的表达用盒的载体在表达用盒的下游不具有其它基因表达用机构。
本发明中，所要表达的基因包括人工插入的编码外源蛋白质的基因(DNA)，其包括与宿主细胞来源不同的基因、也包括来源相同的基因。这种情况下，在本发明中，也将外源基因称为插入基因。对所要表达的基因的种类并无限定，可以使用编码用于制造重组体的所有蛋白质的DNA、或为编码用于特定疾病的治疗而在生物体内所要表达的蛋白质的DNA。并且，作为可用于特定疾病的治疗的治疗用基因，可以举出REIC/Dkk-3基因(在序列编号17中示出了碱基序列)；p53、Rb等肿瘤抑制基因；编码下述物质的基因：白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15；α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、血管抑素、血小板反应蛋白(thrombospondin)、内皮抑素、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、肿瘤坏死因子、肝细胞成长因子、红细胞生成素、血小板生成素、胰岛素、生长激素、抗体(IgG轻链、IgG重链)、蛋白G、蛋白A等生理活性物质等可用作药物的蛋白质、用于疾病等的检测的诊断试剂、或作为用于研究室的实验、研究等的试剂有用的蛋白质。所表达的目的蛋白质优选为细胞外分泌蛋白质。并且，通过在生物本来具有的基因的下游人工连接增强子或启动子，也可使生物本来具有的基因的表达得到增强。即，本发明中的所要表达的基因也包括生物本来具有的基因。本发明也包括这样的在生物本来具有的基因的下游插入增强子或启动子来调节该基因的表达的内容。并且也包括包含生物本来具有的基因且在细胞中该基因的下游插入有增强子或启动子的细胞。进一步地，作为所要表达的基因，可以举出编码具有RNA干扰作用的siRNA、shRNA、miRNA等的DNA等。使用具有RNA干扰作用的RNA的情况下，通过使用转运RNA启动子来转录制造这些RNA，从而能够抑制特定基因的表达。
例如，这些基因之中，可将REIC/Dkk-3基因等用于肿瘤的治疗，不仅可使用其全长基因、也可使用其片段，例如可以举出编码下述多肽的DNA：由序列编号18所示的REIC/Dkk-3蛋白质的氨基酸序列中的从第1氨基酸开始到第39氨基酸～第78氨基酸中的任意氨基酸为止的氨基酸序列构成、或者由序列编号18所示的REIC/Dkk-3蛋白质的氨基酸序列中的从第1氨基酸开始到第39氨基酸～第78氨基酸中的任意氨基酸为止的氨基酸序列中有一个或者数个氨基酸发生取代、缺失或添加而得到的氨基酸序列构成；且具有凋亡活性的多肽。这些DNA中，优选使用编码由序列编号18所示REIC/Dkk-3蛋白质的氨基酸序列的第1～78氨基酸构成的肽的DNA(N78-REIC DNA)。
并且，也可以包括用于检测或疾病诊断的报告基因。
启动子是以DNA为模板起始转录的DNA上的特定碱基序列，通常具有共有序列。例如，在大肠杆菌等原核生物中，通常在转录起始部位的-10碱基对部位具有TATAATG序列、在-35碱基对部位具有TTGACA序列。并且，在真核生物中，通常在-20碱基对部位具有TATA框。本发明的表达用盒在所要表达的基因的上游一定具有第1启动子，并且在所要表达的基因的下游可以具有第2启动子。对用作这些第1启动子和第2启动子的启动子并无限制，第1启动子与第2启动子可以相同也可以不同。可以使用所有可在细胞或组织中促进外源基因表达的非特异性启动子，也可使用组织或者器官特异性启动子、肿瘤特异性启动子、发生或者分化特异性启动子等特异性或选择性启动子。例如，可以作为第1启动子使用特异性启动子，作为第2启动子使用非特异性启动子。作为本发明中所用的启动子，可以举出：作为癌-肿瘤特异性启动子的hTERT(人端粒酶逆转录酶)、PSA(前列腺特异抗原)、c-myc、GLUT启动子等；作为ES细胞-癌干细胞特异性启动子的OCT3/4、NANOG启动子等；作为神经干细胞特异性启动子的Nestin启动子等；作为细胞应激敏感性启动子的HSP70、HSP90、p53启动子等；作为肝细胞特异性启动子的白蛋白启动子等；作为放射线敏感性启动子的TNF-alpha启动子等；作为提高感染质粒的拷贝数的启动子的SV40启动子等；作为增殖性细胞特异性启动子的EF1-alpha启动子等。更具体地说，例如，作为第1启动子使用CMV-i启动子(hCMV+内含子启动子)(序列编号5)、β肌动蛋白启动子、CAG启动子(序列编号12)、CMV启动子等，作为第2启动子使用CMV启动子等。并不限定于β肌动蛋白启动子所来源的动物种，哺乳类β肌动蛋白启动子例如使用人β肌动蛋白启动子(序列编号8)或鸡肌动蛋白启动子。并且，也可以使用上述CMV-i启动子等人工杂合启动子。CMV-i启动子可以根据美国专利第5168062号说明书或美国专利第5385839号说明书的记载进行合成。启动子可以使用由具有启动子活性的最小序列构成的核心启动子部分。所谓核心启动子指的是具有准确引导转录起始的作用的启动子区域，有时会包含TATA框。上述的启动子之中，hTERT启动子等癌-肿瘤特异性启动子可适当地用于通过以癌为靶位的基因表达所进行的基因治疗、癌诊断用途中，含有hTERT启动子的构建体No.21可用于这样的用途中。
对polyA附加序列(多聚腺苷化序列、polyA)的来源并无限定，可以举出生长激素基因来源的polyA附加序列，例如牛生长激素基因来源的polyA附加序列(包含在序列编号6所示的碱基序列中(13碱基以后的序列))或人生长激素基因来源polyA附加序列、SV40病毒来源polyA附加序列、人或兔β珠蛋白来源的polyA附加序列等。通过在表达用盒中含有polyA附加序列，转录效率增大。
对于增强子，只要结果会使转录生成的信使RNA(mRNA)的量增加就没有限定。增强子为具有促进启动子作用的效果的碱基序列，通常多由100bp左右构成。增强子可促进转录而无论序列的方向如何。本发明中使用的增强子可以为一种，也可以将2个以上的相同增强子复数个使用、或者将2个以上不同的增强子组合使用。并且，使用2个以上不同的增强子的情况下，对其顺序并无限定。例如，可以使用CMV增强子(序列编号7)、SV40增强子、hTERT(端粒酶逆转录酶)增强子等。作为一例，可以举出依序连接有hTERT增强子、SV40增强子和CMV增强子而得到的增强子。
进一步地，在含有编码所要表达的蛋白质的DNA和polyA附加序列的DNA构建体的上游，可以连接2个以上的增强子、例如1～4个增强子。对在其上游所连接的增强子并无限定，但优选CMV增强子。例如可以举出将4个CMV增强子连接而成的4×CMV增强子(序列编号11)等。
若将增强子插入到紧靠由“启动子-所要表达的基因-poly A附加序列”构成的DNA构建体的下游，则与现有一般的基因表达系统相比，能够强力地表达所要表达的基因的蛋白质。
特别是，通过CMVi启动子与CMV增强子的组合，在几乎全部细胞(宿主细胞)中插入所有基因的情况下，即使在使用任一转染试剂的情况下，所要表达的基因也能够进行强力的蛋白质表达。
通过在启动子的上游插入1个以上的CMV增强子，在特定细胞(例如后述实施例的HEK293细胞株或MCF7细胞株)中，特定的基因、例如后述实施例的REIC/Dkk-3基因或CD133基因的表达进一步增强。并且，通过在启动子前插入4个CMV增强子，在特定的细胞(例如后述实施例的HepG2细胞株或HeLa细胞株)中表达进一步增强。
需要说明的是，若仅在上游插入CMV增强子，基因表达仅少量上升、或仅少量变化(图1和图2)。在本发明的表达用盒中，在紧靠polyA附加序列的下游插入连接CMV增强子是很重要的。
进一步地，可以将RU5’(序列编号9)连接在紧靠编码所要表达的蛋白质的DNA的上游。所谓“紧靠……的上游”指的是不隔着其它具有特定功能的元件而直接连接，但其间可含有作为连接子的短序列。RU5’为HTLV来源的LTR，其是通过插入而提高蛋白质表达的元件(Mol.Ce11.Biol.,Vol.8(1),p.466-472,1988)。若将RU5’与所报告相反地插入，则启动子的由增强子插入所致的表达增强效果可能会被消除。
进一步地，在紧靠增强子和/或启动子的上游可以连接UAS。UAS为GAL4基因的结合区域，通过在后面插入GAL4基因，使蛋白质表达提高。
进一步地，可以在表达用盒的最上游连接SV40-ori。SV40-ori为SV40基因的结合区域，通过在后面插入SV40基因，使蛋白质表达提高。
上述各元件需要进行功能性连接。此处，所谓功能性连接指的是，按照各元件发挥出其功能、使所要表达的基因的表达得以增强的方式进行连接。
在图7～21、36、37、49、55～58中示出了各种表达用盒的构建体的结构。在本发明中，也将构建体称为质粒的骨架。作为增强本发明所要表达的基因的表达的构建体，可以举出例如构建体No.2(图8)、No.4(图10)、No.6(图12)、No.8(图14)、No.10(图16)、No.12(图18)、No.14(图20)、No.15(图36)、No.16(图37)、No.17(图49)、No.20(图57)和No.21(图58)所示的构建体。并且也包括图21所示的构建体。
这些构建体之中，从提高基因表达的方面考虑，在目的基因下游连接有3个增强子的构建体No.14、构建体No.15和构建体No.16的构建体为最优。例如，通过在构建体No.14中使用作为目的基因的REIC全长基因，其蛋白质表达量可以匹敌100MOI下的腺病毒载体(编码全长REIC/Dkk-3基因)的情况下的表达量。并且，构建体No.14的质粒骨架在编码N78-REIC的DNA这样的基因片段中也显示出了提高基因表达的效果。
例如，通过将在构建体No.14的构建体中含有编码N78-REIC的DNA片段的制剂转染到人前列腺癌细胞PC3中，确认到显著的癌细胞增殖抑制效果和癌细胞死亡诱导效果。通过将在构建体No.14的构建体中编码有全长REIC基因的制剂转染到人前列腺癌细胞PC3中，确认到癌细胞增殖抑制效果。
并且，通过在构建体No.14中插入编码人红细胞生成素等蛋白质的DNA，制成表达载体，并使用该表达载体对细胞进行转染，能够使用该细胞大量制造上述蛋白质。
对于本发明中以上述序列编号的碱基序列所示的DNA，只要具有各DNA所具有的活性、或具有各DNA所编码的蛋白质或多肽所具有的活性即可，碱基序列可以存在变异。例如，下述DNA也可用于本发明DNA构建体的构建：跟具有与各序列编号所示碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的DNA；使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for BiologicalInformation(美国国立生物学信息中心的基本局部比对检索工具))等(使用例如默认即初期设定的参数)进行计算时，与各序列编号所示的碱基序列具有至少85%以上、优选为90%以上、进一步优选为95%以上、特别优选为97%以上的同源性的DNA；或者编码由相对于上述DNA所编码的蛋白质或者多肽的氨基酸序列具有一个或两个以上或者多个(1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1个或者2个)氨基酸发生了取代、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白质或多肽的DNA。此处，所谓“严格条件”例如为“1×SSC、0.1%SDS、37℃”程度的条件，作为更严格的条件为“0.5×SSC、0.1%SDS、42℃”程度的条件，作为进一步严格的条件为“0.2×SSC、0.1%SDS、65℃”程度的条件。杂交的条件越是如此地严格，越可期待与探针序列具有高同源性的DNA的分离。其中，上述SSC、SDS和温度的条件组合为示例，通过进行DNA的浓度、DNA的长度、杂交的反应时间等的适宜组合，可以实现所需要的严格性。
作为插入本发明的表达用盒的载体，可以举出质粒、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体等病毒载体；或生物降解性聚合物等非病毒载体。可以通过感染、电穿孔等公知的方法将导入了上述表达用盒的载体导入到细胞中。
并且，此时可以使用公知的转染试剂进行导入。
通过将插入了本发明的表达用盒的载体导入至细胞中并进行该细胞的转染，能够在该细胞中进行目的基因的表达、产生目的蛋白质。为了导入本发明的表达盒产生目的蛋白质，可以使用真核细胞或原核细胞系。作为真核细胞，可以举出例如所建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、真丝状菌细胞和酵母细胞等的细胞等；作为原核细胞，可以举出例如大肠杆菌、枯草杆菌、短芽胞杆菌属细菌等的细菌细胞。优选使用Hela细胞、HEK193细胞、CHO细胞、例如CHO、COS细胞、BHK细胞、Vero细胞等哺乳类细胞。可以对经转化的上述宿主细胞在体外或体内进行培养来产生目的蛋白质。宿主细胞的培养可以按公知的方法进行。例如，作为培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等公知的培养用培养基。作为所表达的蛋白质，在分泌蛋白质的情况下，可以从培养液中利用公知的方法进行精制，在非分泌蛋白质的情况下，可以从细胞提取物中利用公知的方法进行精制。在表达生产目的蛋白质的情况下，可以使细胞同时转染含有各目的基因的2个以上的载体进行生产。由此能够一次性产生2种以上的蛋白质。
进一步地，也可以对市售载体进行改变使其含有本发明的表达用盒。例如可以在pShuttle载体等市售载体的表达基因盒的下游区域重组增强子进行使用。本发明的载体也包含对市售盒进行改变而成的载体。
本发明进一步含有包含上述所要表达的基因表达用盒的腺病毒(Ad)载体和腺相关病毒(AAV)载体。该载体可用于癌等疾病的特异性诊断或治疗。该载体可以将上述所要表达的基因表达用盒插入到腺病毒或腺相关病毒来进行制作。
作为腺病毒载体的特征，可以举出：(1)可以在多种细胞中进行基因导入；(2)即使对增殖停止期的细胞也可效率良好地进行基因导入；(3)可通过离心进行浓缩，得到高滴度(10～11PFU/ml以上)的病毒；(4)适于在体内的组织细胞中直接进行基因导入；之类的特征。
作为基因治疗用的腺病毒，由E1/E3区域缺失的第1代腺病毒载体(Miyake,S.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996)开发出了除了E1/E3区域外还有E2或者E4区域也缺失的第2代腺病毒载体(Lieber,A.,et al.,J.Virol.,70,8944,1996；Mizuguchi,H.&Kay,M.A.,Hum.Gene Ther.,10,2013,1999)；腺病毒基因组大致完全缺失的(GUTLESS)第3代腺病毒载体(Steinwaerder,D.S.,et al.,J.Virol.,73,9303,1999)；在本发明基因的导入中，可以没有特别限定的使用任一腺病毒载体。
腺相关病毒为细小病毒属单链DNA病毒，其具有(1)基因长期表达、(2)低毒性、(3)可在分裂和非分裂细胞中进行基因导入这样的特性。串联体(concatamer；单链DNA连接而成的配合物)的形成被认为是基因长期表达的原因。
含有本发明的所要表达的基因表达用盒且可表达作为目标的所要表达的基因的腺病毒(Ad)载体和腺相关病毒(AAV)载体可用于疾病检测或疾病治疗。作为疾病，可以举出癌等，利用插入到腺病毒载体或腺相关病毒载体的外壳的、与在特定细胞中表达的蛋白质选择性结合的RGD等肽，指向该细胞，使该细胞感染，表达所要表达的基因。所要表达的基因为荧光素酶基因等报告基因的情况下，可以通过特定细胞的发光等进行检测。特定的细胞为癌细胞的情况下，通过对被测体给药，由此能够对被测体中的癌细胞进行检测，诊断出该被测体罹患癌的情况。本发明的腺病毒载体和腺相关病毒载体能够检测单个细胞，因而可用于例如微小癌的检测。
并且，所要表达的基因为治疗用基因的情况下，可在特定的细胞中进行作为目标的所要表达的基因的表达，从而发挥出治疗效果。例如，特定的细胞为癌细胞、使用REIC/Dkk-3基因等抑癌基因的情况下，通过给予至被测体，癌治疗用基因被运送至被测体的癌细胞中，在癌细胞中进行基因表达，发挥出治疗效果。本发明包括含有这样的腺病毒载体或腺相关病毒载体的诊断或治疗用病毒制剂。使用人REIC/Dkk-3基因等抑癌基因作为治疗用基因的情况下，对于作为治疗对象的癌，可以举出例如脑-神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴癌-白血病、结肠癌、胰腺癌、肛门-直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤-骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤等作为本发明的治疗对象的癌。本发明的腺病毒载体和腺相关病毒载体可用于原发性癌的治疗，也可用于转移性癌的治疗。
对于本发明的腺病毒载体和腺相关病毒载体在基因治疗领域中可使用的方法，例如可通过静脉内给药或动脉内给药等血管内给药、口服给药、腹腔内给药、气管内给药、支气管内给药、皮下给药、经皮给药等进行给药。特别是本发明的腺病毒载体和腺相关病毒载体对特定组织、细胞的指向性大，能够将目标基因有效地运送到特定组织、细胞中，因而即使通过血管内给药也能够有效地进行诊断、治疗。
腺病毒载体和腺相关病毒载体可以进行治疗上有效量的给药。对于治疗上的有效量，只要为基因治疗领域的本领域技术人员，就能够容易地确定。进一步地，给药量可以根据被测者病势的严重度、性別、年龄、体重、习惯等进行适宜变更。例如，腺病毒载体和腺相关病毒载体可以以0.5×1011～2.0×1012病毒基因组/kg体重、优选为1.0×1011～1.0×1012病毒基因组/kg体重、进一步优选为1.0×1011～5.0×1011病毒基因组/kg体重的量进行给药。病毒基因组表示腺病毒或腺相关病毒基因组的分子数(病毒颗粒数)，有时也称为颗粒(particle)。包括制剂领域通常使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液，使用含有生理食盐水、葡萄糖和其它辅助药的等渗液等，也可以与适当的助溶剂、例如醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等合用。作为油性液使用芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。
进一步地，也可以将包含含目的基因的本发明的表达盒的表达载体作为针对癌等的疫苗或DNA疫苗进行使用(Kaufman,H.L.et al.,J.Clin.Oncol.22,2122–2132(2004)；McNeel,D.G.et al.,J.Clin.Oncol.27,425–430(2009))。例如，可以将癌特异性抗原作为目标蛋白质，将含有重组了编码该蛋白质的基因的本发明的表达盒的表达载体通过皮下注入等施予至生物体内，使上述抗原在生物体内表达，从而诱导出相对于该抗原的宿主的细胞性免疫或抗体免疫的活化。通过如此地作为疫苗使用，能够将本发明的表达盒用于癌等疾病的预防和治疗。
利用以下实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1含有CMV启动子的表达用盒
制备本发明的表达用盒，进行转染，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。
(1)所用的表达用盒的构建体
构建体No.1(图7)
其是在所要表达的基因的上游载有CMVi启动子的基因表达质粒。并且，在上述基因的下游连接了BGH polyA(牛生长激素polyA附加序列)。即，认为与通常所使用的使用CMV i启动子的表达质粒具有同等的蛋白质表达能力。
构建体No.2(图8)
其是在构建体No.1的紧靠BGH poly A的下游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.3(图9)
其是将构建体No.1的CMVi启动子替换为人β肌动蛋白启动子的构建体。
构建体No.4(图10)
其是在构建体No.3的紧靠BGH poly A的下游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.5(图11)
其是在构建体No.3的紧靠人β肌动蛋白启动子的下游插入了RU5’区域的构建体。
构建体No.6(图12)
其是在构建体No.5的紧靠BGH poly A的下游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.7(图13)
其是在构建体No.5的紧靠人β肌动蛋白启动子的上游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.8(图14)
其是在构建体No.7的紧靠BGH poly A的下游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.9(图15)
其是使构建体No.7的RU5’区域成为相反的碱基序列的构建体。
构建体No.10(图16)
其是在构建体No.9的紧靠BGH poly A的下游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.11(图17)
其是在构建体No.5的紧靠人β肌动蛋白启动子的上游插入了4×CMV增强子(4个CMV增强子)的构建体。
构建体No.12(图18)
其是在构建体No.11的紧靠BGH poly A的下游插入了CMV增强子的构建体。
构建体No.13(图19)
其是载有CAG启动子的基因表达质粒。即，认为与通常所使用的使用了CAG启动子的表达质粒具有同等的蛋白质表达能力。
构建体No.14(图20)
根据对至此为止的上述各种构建体进行研究的结果判明，通过在紧靠BGH polyA的下游插入CMV增强子，能够显著增强基因表达，因而在构建体No.14中，进一步连接作为其它增强子的hTERT增强子与SV40增强子。作为其结果，认为该构建体优于构建体No.2。
编码全长REIC/Dkk-3基因的腺病毒的构建体(图21)
将REIC/Dkk-3(Ad-REIC)的全长cDNA重组入粘粒载体pAxCAwt中，接下来利用COS-TPC方法(TAKARA Bio)转移至腺病毒载体中。此时，将具有LacZ基因的腺病毒载体(Ad-LacZ)用作对照。所使用的腺病毒载体与日本专利3813872号公报中记载的相同。
图22～图35中示出了下述元件或构建体的碱基序列。
图22-1和图22-2(续图22-1)示出了pDNR-1r供体载体(无启动子的克隆用质粒载体(Clontech社、商品号PT3616-5))的全碱基序列。
图23示出了pIDT-SMART载体(无启动子的克隆用质粒载体(IDT社))的全碱基序列。
图24示出了CMV i启动子(hCMV+内含子启动子)区域的碱基序列。该区域是以CMV i启动子区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图25示出了BGH polyA(3×stop+BGH polyA)区域的碱基序列。
该碱基序列中的“TAATAAA”部分为BGH polyA序列中更为重要的序列。该序列是以BGHpolyA区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图26示出了CMV增强子区域的碱基序列。该序列是以CMV增强子区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图27示出了人β肌动蛋白启动子区域的碱基序列。该序列是通过获得InvivoGen社的pDRIVE-hβActin-RU5’质粒、对该部分的碱基序列进行PCR扩增而制作的。
图28示出了RU5’正方向{HTLV类型1长末端重复的R段和U5序列的一部分(R-U5’)｝区域的碱基序列。该序列是以{HTLV类型1长末端重复的R段和U5序列的一部分(R-U5’)｝区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图29示出了RU5’反方向{HTLV类型1长末端重复的R段和U5序列的一部分(R-U5’)}区域的碱基序列。该序列是以｛HTLV类型1长末端重复的R段和U5序列的一部分(R-U5’)}区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图30示出了4×CMV增强子区域的碱基序列。在图30的碱基序列中，带下划线的部分为被称为所谓“短CMV增强子”，由于其为4个，因而成为4×CMV增强子。需要说明的是，上述的CMV增强子包括“短CMV增强子”，但通常在说CMV增强子的情况下，指的是长的增强子。上述序列是以CMV增强子区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图31示出了CAG启动子区域的碱基序列。其是公知的CAG启动子区域的碱基序列。其是以Oriental Yeast社提供的作为载有CAG启动子的基因表达载体的pCAGGS质粒为基础，通过对该部分的碱基序列进行PCR扩增而制作的。
图32示出了2IRES插入区域的碱基序列。为后述的图5和图6的IRES对照基因的碱基序列。其是将BiP-IRES区域(图32的碱基序列中由(1)的框围起的小写字母部分)与Myc-IRES区域(图32的碱基序列中由(2)的框围起的小写字母部分)这两个正常人DNA的碱基序列依序连接而成的序列，是作为插入基因的对照基因使用的基因。上述序列是以BiP-IRES区域与Myc-IRES区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。
图33示出了SV40ori-UAS-CMVi-RU5’区域的碱基序列。其是构建体No.14(最佳构建体)的位于插入基因(外源基因)的左侧的插入部分的碱基序列。该序列是以该部分所含有的各区域的碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。图33的碱基序列中被(1)的框所围起的部分表示SV40ori区域，被(2)的框所围起的部分表示CMVi启动子区域，被(3)的框所围起的部分表示RU5’区域。
图34示出了3×stop-BGH-polyA-UAS-hTERT增强子+SV40增强子+CMV增强子区域的碱基序列。其是构建体No.14(最佳构建体)的位于插入基因(外源基因)的右侧(下游侧)的插入部分的碱基序列。该序列是以该部分所含有的各区域碱基序列的已知信息为基础通过人工合成而制作的。图34中的碱基序列中被(1)的框所围起的大写字母部分表示BGH polyA区域、被(2)的框所围起的小写字母部分表示hTERT增强子区域、被(3)的框所围起的大写字母部分表示SV40增强子区域、被(4)的框所围起的小写字母部分表示CMV增强子区域。
图35-1和35-2表示构建体No.14载体的全碱基序列。其表示图20所示构建体No.14(最佳构建体)的碱基序列，是包括pIDT-SMART载体部分(图35-1中直至碱基序列第10行的粗体字部分为止的区域和图35-2中碱基序列的倒数第24行的被框所围起的GCGCGC之后的区域)的全部的碱基序列。该序列是通过将前面2图所示的(构建体No.14的)插入基因(外源基因)左右的插入部分重组至上述的pIDT-SMART载体中而制作的。(1)表示SV-40ori区域、(2)表示CMV i启动子区域、(3)表示RU5’区域、(4)表示BiP IRES区域、(5)表示Myc IRES区域、(6)表示hTERT增强子区域、(7)表示SV40增强子区域。
(2)所用的外源基因(插入基因)
6His-S100A11-HA
以人正常成纤维细胞的该cDNA为模板，利用在其5’侧连接了6His连接子的引物以及在3’侧连接了HA连接子的引物，通过PCR进行制备。
GFP(绿色荧光蛋白)
将Clontech社制品的GFP表达载体pEGFP-N2作为模板进行引物设定，通过PCR进行制备。
REIC/Dkk-3(全长)
将人正常成纤维细胞的该cDNA作为模板进行引物设定，通过PCR进行制备。
N78‐REIC-6His
在上述得到的全长REIC/Dkk-3基因的3’侧连接6His来设定引物，通过PCR进行制备。
对照基因(IRES)
此处所说的该IRES对照基因是将BiP-IRES基因与Myc-IRES基因这2个正常人DNA的已知碱基序列依序连接而成的基因，通过人工合成来制备。通过将该基因插入到构建体No.14的插入基因(外源基因)的部分，在后述的图5和图6中作为REIC/Dkk-3(全长)基因和编码N78‐REIC-6His的DNA的对照基因。
CD133-6His
以人正常成纤维细胞的该cDNA为模板来设定引物，通过PCR进行制备。
LGR5-HA
以人正常成纤维细胞的该cDNA为模板来设定引物，通过PCR进行制备。
端粒酶-6His
以人正常成纤维细胞的该cDNA为模板来设定引物，通过PCR进行制备。
KLF16
以人正常成纤维细胞的该cDNA为模板来设定引物，通过PCR进行制备。
(3)转染法与Western印迹分析(WB法)
将各种基因向各种细胞(以6孔微板培养至70～80%汇合)导入时，使用各社的转染试剂：FuGENE(商标)-HD(Roche社)、Lipofectamine(注册商标)2000(Invitrogen社)、Trans-IT-Keratinocyte(TAKARA Bio社)来进行。其操作按照各制品手册中的记载进行。
所表达的外源基因(插入基因)Western印迹分析按以下方法进行。
将细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)清洗2次，用裂解缓冲液(50mM HEPES,pH 7.4,250mM NaCl,1mM EDTA,1%NP-40,1mM DTT,1mM PMSF,5μg/ml亮肽素,5μg/ml抑肽酶,2mMNa3VO4,1mMNaF,10mM β-GP)进行溶解，提取蛋白质。离心分离后，将各实验中所用的各上清的蛋白质量调整为同浓度，使用同量的2×SDS样品缓冲液进行稀释。接下来，在95℃进行5分钟热处理。将样品(10μg蛋白质)利用7.5%或梯度SDS-PAGE凝胶(Bio Rad社)进行分离，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。印迹物用含有10%脱脂奶粉、6%甘氨酸和0.1%Tween-20的TBS(Tris缓冲盐水)在室温下进行1小时封闭。接下来，利用以下的一次抗体(1:1000稀释)对蛋白质进行鉴定。
抗HA抗体(Cell Signaling Technology社)
抗GFP抗体(Clontech社)
抗REIC抗体(兔抗人REIC/Dkk-3多克隆抗体)
抗6His抗体(MBL社)
抗KLF16抗体(Abcam社)
用含有0.1%Tween-20的TBS(T-TBS)进行充分清洗，使印迹物与辣根过氧化物酶接合二次抗体进行反应。用T-TBS充分清洗后，利用增敏化学发光检测法(ECL试剂盒,Amersham Pharmacia Biotech社)进行检测。
细胞培养按以下方法进行。
HEK293(人正常肾脏来源)、MCF7(人乳腺癌来源)、PC3(人前列腺癌来源)、HeLa(人子宫癌来源)、HepG2(人肝癌来源)的各细胞株由ATCC(美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD))获得。所用的培养基如下。
HEK293:DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen社)
MCF7:DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen社)
PC3:F12培养基(Invitrogen社)
HeLa:DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen社)
HepG2:DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen社)
使上述细胞株在添加了10%(v/v)胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的上述培养基中生长，在5%CO2条件下进行培养。
结果如图1～图6所示。
图1示出了使用FuGENE(商标)-HD对HEK293细胞株进行了36小时转染的各种外源基因的表达。构建体No.1的蛋白质表达能力与通常使用(销售)的使用了CMVi启动子的表达质粒为同等。即，与这些表达质粒的蛋白质表达能力相比，可以说构建体No.2的蛋白质表达能力显著增强。并且，在以下的各种基因中也为同样的结果，可以说构建体No.2在全部种类的基因的表达中高于目前广泛使用的基因表达系统。
S100A11：被认为与癌增殖相关；细胞质-核转运蛋白质
GFP：荧光蛋白质；细胞质蛋白质
REIC/Dkk-3(全长)：抑癌蛋白质；分泌蛋白质
N78‐REIC：以上述基因片段为基础制作的片段蛋白质(由序列编号2所示REIC/Dkk-3蛋白质的氨基酸序列的第1～78氨基酸构成的片段肽)
CD133：癌干细胞的标记；也在细胞表面表达
LGR5：正常细胞和癌细胞的干细胞的标记；跨膜蛋白质
端粒酶：与细胞的老化、永生化相关；细胞质蛋白质
KLF16：与蛋白质的转录相关；核蛋白质
图2示出了使用FuGENE(商标)-HD对各种细胞株进行了36小时转染的KLF基因的表达。在图中所示的全部细胞(HEK293细胞、MCF7细胞、PC3细胞、HeLa细胞、HepG2细胞)中，与构建体No.1相比，可以说构建体No.2的蛋白质表达能力(KLF16的基因表达)显著增强。即，可以说构建体No.2在全部种类细胞中的基因表达高于目前广泛使用的基因表达系统。
图3示出了使用各种转染试剂对HEK293细胞株进行了36小时转染的KLF基因的表达。在各转染试剂中，在构建体No.2的情况下，利用WB法表达了最多的KLF16蛋白质。构建体No.1为通常可获得的含有通常良好使用的CMV i启动子的构建体，构建体No.13同样为含有通常良好使用的CAG启动子的构建体。即，通过使用本发明的构建体No.2可进行显著高于目前世界中作为基因表达用的质粒构建体而普及使用的构建体的量的蛋白质表达(提高整个基因表达过程的效率)。
图4示出了使用全长REIC基因和编码N78-REIC的基因FuGENE(商标)-HD对HEK293细胞株进行了36小时转染的情况下的表达。左侧图示显示，利用WB法，构建体No.14比构建体No.2情况更多地表达了REIC/Dkk-3蛋白质(全长)。即，根据图1的WB法的结果(构建体No.1～No.12中，No.2蛋白质表达最多)和图3的WB法的结果(构建体No.1、No.2、No.11、No.12、No.13中，No.2蛋白质表达最多)，所研究的质粒构建体中可表达最多蛋白质的(有用的)为构建体No.14。基于该构建体No.14的蛋白质表达能力为与100MOI下施予Ad-REIC(编码全长REIC/Dkk-3基因的腺病毒)时同等程度的强力能力。右侧图示中，在将作为片段基因的N78‐REIC-6His插入到构建体No.14中时，可以说也是与左侧图示是同样的。即，在所提出的质粒构建体中，可表达最多蛋白质的(有用的)为构建体No.14。
图5示出了利用插入有编码N78-REIC的DNA的构建体No.14对人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制与细胞死亡诱导。
细胞生存率分析
将PC3细胞株在6孔微板中以每1孔中50,000细胞的密度种在完全培养基中。24小时培养后，在完全培养基中使用FuGENE(商标)-HD试剂以规定的质粒转染细胞，培养规定天数。培养后，使用CellTiter 96(注册商标)Aqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(Promega社)对细胞生存率进行测定。
统计分析
在2组间进行曼-惠特尼U检验，p<0.05时判定为具有显著差异。
如图所示，在插入有编码N78-REIC的DNA的构建体No.14施予后第2日和第5日，与插入有对照基因(IRES)的构建体No.14施予组相比，PC3细胞株的增殖被显著抑制(PC3细胞数通过编码N78-REIC的DNA-构建体No.14的施予而减少，从而可以说显著诱导了大量细胞死亡)。
图6示出了利用插入有全长REIC基因的构建体No.14进行的人前列腺癌细胞PC3细胞株的增殖抑制。
细胞生存率分析
将PC3细胞株在6孔微板中以每1孔50,000细胞的密度种在完全培养基中。24小时的培养后，在Hank’s平衡盐溶液中使用FuGENE(商标)-HD试剂以规定的质粒转染细胞，培养规定天数。培养后，使用CellTiter 96(注册商标)Aqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(Promega社)测定细胞生存率。
统计分析
在2组间进行曼-惠特尼U检验，p<0.05时判定为具有显著差异。
如图所示，在插入有全长REIC基因的构建体No.14施予后第2日，与插入有对照基因(IRES)的构建体No.14施予组相比，显著抑制了PC3细胞的增殖。
实施例2含有SV40启动子或hTERT启动子的表达用盒
制备含有GFP(绿色荧光蛋白)作为目的基因(插入基因)的本发明的表达用盒，进行Hela细胞的转染，观察GFP表达，从而分析表达强度。转染使用Lipofectamine2000进行，48小时后在荧光显微镜下观察GFP表达。
所用表达用盒的构建体为实施例1中所用的构建体No.14(图20)以及构建体No.14的CMV i启动子被取代为SV40启动子的构建体No.15(图36)和构建体No.14的CMV i启动子被取代为hTERT启动子的构建体No.16(图37)。GFP基因为Clontech社制品的GFP表达载体，以pEGFP-N2为模板进行引物的设定，通过PCR进行制备，将其插入到各构建体的目的基因插入部进行使用。作为对照使用市售GFP表达质粒pEGFP-N1(Clontech社)。
构建体No.15表达载体的由SV40 ori+UAS+SV40 enh+intron A+RU5’区域构成的部分片段的碱基结构示于图38中，其碱基序列示于序列编号19中。并且，构建体No.16表达载体的由SV40 ori+UAS+hTERT enh+intron A+RU5’区域构成的部分片段的结构示于图39中，碱基序列示于序列编号20中。进一步地，图40中示出了连接有限制性内切酶部位的编码GFP的DNA的碱基序列(序列编号21)。图38的碱基序列中的(1)、(2)、(3)和(4)的框所围起的部分分别表示SV40ori、SV40启动子、intron A和RU5’，图39的碱基序列中的(1)、(2)、(3)和(4)的框所围起的部分分别表示SV40ori、hTERT启动子、intron A和RU5’。在构建体No.14的表达载体中插入了GFP基因的载体的全长碱基序列示于图41-1和图41-2(续图41-1)中(序列编号22)。并且，在构建体No.15的表达载体中插入了GFP基因的载体的全长碱基序列示于图42-1和图42-2(续图41-1)中(序列编号23)。进一步地，在构建体No.16的表达载体中插入了GFP基因的载体的全长碱基序列示于图43-1和图43-2(续图43-1)中(序列编号24)。图41-1和图41-2的碱基序列中的(1)、(2)、(3)和(4)的框所围起的部分分别表示CMVi启动子(P-CMViRU)、GFP基因、Myc IRES、3个增强子(pA-3enh)，图42的碱基序列中的(1)、(2)、(3)和(4)的框所围起的部分分别表示SV40启动子(P-SViRU)、GFP基因、MycIRES、3个增强子(pA-3enh)，图43的碱基序列中的(1)、(2)、(3)和(4)的框所围起的部分分别表示hTERT启动子(P-TiRU)、GFP基因、Myc IRES、3个增强子(pA-3enh)。
构建体No.15为在SV40蛋白质高表达环境下对于基因的强表达有利的质粒载体，构建体No.16为在癌细胞等中的hTERT蛋白质高表达的环境下对于基因的强表达有利的质粒载体。
结果示于图44中。图44A、B、C和D分别示出了市售GFP表达质粒(pEGFP-N1)、构建体No.14的GFP表达质粒、构建体No.15的GFP表达质粒以及构建体No.16的GFP表达质粒的结果。图中上段的图示表示明视野。如图中所示，与市售质粒相比，CMV启动子、SV40启动子和hTERT启动子均确认到了GFP基因的强表达。本实施例显示，该系统(构建体No.14的构建体骨架)中，即使这样地改变启动子，也能够用于进行基因增强。
实施例3人红细胞生成素的表达
制备含有人红细胞生成素作为外源基因(插入基因)的本发明的表达用盒，进行HEK293细胞的转染，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。转染使用FuGENE(商标)-HD进行，24小时后通过Western印迹检测细胞培养液中的人红细胞生成素。
所用表达用盒的构建体为实施例1中所用的构建体No.14(图20)，作为目的基因(插入基因)插入了编码人红细胞生成素的DNA。图45中示出了连接有限制性内切酶部位的编码人红细胞生成素的DNA的碱基序列(序列编号25)。作为对照，使用作为市售表达质粒的pTracer(注册商标)-EF/V5-His-A(Invitrogen社)和pEF6/Myc-His-A(Invitrogen社)，在各质粒的限制性内切酶位点EcoR1-Xba1的部位插入编码人红细胞生成素的DNA。
Western印迹中，使用抗6His抗体(MBL社)，将转染24小时后的培养液1mL中利用6His氨基酸捕获回收，使用回收的蛋白质总量。
结果示于图46中。泳道1表示使用pTracer(注册商标)-EF/V5-His-A进行表达的结果、泳道2表示使用pEF6/Myc-His-A进行表达的结果、泳道3表示使用构建体No.14的表达质粒进行表达的结果。如图所示，在使用构建体No.14的表达质粒的情况下确认到最强的表达。该结果显示，从基于基因增强的产量方面出发，本系统(构建体No.14的构建体骨架)在红细胞生成素等用作药品、诊断试剂或试剂的蛋白质生产中是有用的。
实施例4人IgG的表达
制备含有人IgG轻链和人IgG重链作为目的基因(插入基因)的本发明的表达用盒，进行HEK293细胞转染，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。转染使用FuGENE(商标)-HD进行，24小时后通过Western印迹对细胞提取液和细胞培养液中的人IgG轻链和人IgG重链进行检测。
所用表达用盒的构建体为实施例1中所用的构建体No.14(图20)，作为目的基因(插入基因)插入编码人IgG轻链或人IgG重链的DNA。在图47中示出了连接有限制性内切酶部位的编码人IgG轻链(图47A)和人IgG重链(图47B)的DNA的碱基序列(分别为序列编号26和序列编号27)。作为对照，使用作为市售表达质粒的pTracer(注册商标)-EF/V5-His-A(Invitrogen社)和pEF6/Myc-His-A(Invitrogen社)，在各质粒的限制性内切酶位点EcoR1-Xba1的部位插入编码人IgG轻链或人IgG重链的DNA。
Western印迹中，使用抗6His抗体(MBL社)，将转染24小时后的细胞提取液(总蛋白质量为10μg)与培养液1mL利用6His氨基酸捕获回收，使用回收的蛋白质总量。
结果示于图48中。图48A示出了人IgG轻链的结果、图48B示出了人IgG重链的结果。图48A、48B中，均在泳道1中示出了使用pTracer(注册商标)-EF/V5-His-A进行表达的结果、在泳道2中示出了使用pEF6/Myc-His-A进行表达的结果、在泳道3中示出了使用构建体No.14进行表达的结果。并且示出了使用细胞提取液的细胞内表达结果与使用培养液的结果。如图中所示，在使用构建体No.14的情况下确认到最强的表达。该结果显示，从基于基因增强的产量方面出发，本系统(构建体No.14的构建体骨架)在抗体等用作药品、诊断试剂或试剂的蛋白质生产中是有用的。
实施例5使用对市售质粒载体进行了改变的表达载体的REIC蛋白质的表达
制备含有人REIC基因作为外源基因(插入基因)的本发明的表达用盒，进行HEK293细胞的转染，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。转染使用FuGENE(商标)HD进行，24小时后通过Western印迹对细胞提取液中的REIC蛋白质进行检测。
所用表达用盒的构建体为构建体No.17，其是通过在市售pShuttle质粒载体(Clontech)的Xba1-Kpn1插入部插入了编码REIC的DNA，进一步在编码该REIC的DNA下游的Kpn1-EcoR1插入部位以BGHpolyA+3个增强子的形式插入了在实施例1中所用构建体No.14(图20)的表达质粒的表达基因的下游所存在的3个增强子(hTERT增强子、SV40增强子和CMV增强子)而构建出的(图49)。作为对照，使用在市售pShuttle质粒载体(Clontech)的Xba1-Kpn1插入部插入了编码REIC的DNA而构建出的载体。图50中示出插入了编码REIC的DNA的构建体No.17表达载体的全碱基序列(序列编号28)。图50的碱基序列中的(1)和(2)的框所围起的部分分别表示编码REIC的DNA和3个增强子(3×enh)。
Western印迹使用抗REIC抗体进行，使用转染24小时后的细胞提取液(总蛋白质量为10μg)。
结果示于图51中。泳道1示出了不表达外源蛋白质的细胞的细胞提取液的结果，泳道2示出了利用在市售pShuttle载体中编码REIC的载体进行转染的细胞的细胞提取液的结果，泳道3示出了利用在市售pShuttle载体中插入有编码REIC的DNA并在编码REIC的DNA的下游(BGH poly A的下游)插入有3个增强子的表达载体进行转染的细胞的细胞提取液的结果。如图中所示，在使用构建体No.17的情况下确认到了最强表达。该结果显示，通过在pShuttle载体等市售质粒的表达基因盒下游重组本系统(构建体No.14的构建体骨架)的3个增强子部分，能够使该基因的表达增强。即，显示出了能够将3个增强子区域插入到各种基因构建体中来增强目的基因的表达的效果。
实施例6使用对市售质粒载体进行了改变的表达载体的c-myc基因的表达
制备含有人c-mycC基因作为目的基因(插入基因)的本发明的表达用盒，进行HEK293细胞的转染，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。转染使用FuGENE(商标)-HD进行，24小时后通过Western印迹对细胞提取液中的REIC蛋白质进行检测。
所用表达用盒的构建体是通过在市售pShuttle质粒载体(Clontech)的Xba1-Kpn1插入部插入了编码REIC的DNA、进一步在编码该REIC的DNA下游的Kpn1-EcoR1的插入部位以BGH poly A+3个增强子的形式插入在实施例1中所用构建体No.14(图20)的表达质粒的表达基因的下游所存在的3个增强子(hTERT增强子、SV40增强子和CMV增强子)而构建出的构建体。作为对照，使用在市售pShuttle质粒载体(Clontech)的Xba1-Kpn1插入部插入了编码人c-myc的DNA而构建出的载体。图52中示出了所插入的c-myc基因的碱基序列(序列编号29)、图53中示出了包括构建体No.14所含有的BGH poly A与3个增强子的区域的碱基序列(序列编号30)。
Western印迹使用抗c-mycC抗体(Santa Cruz社、Cat No.:sc-70469)进行，使用转染24小时后的细胞提取液(总蛋白质量为10μg)。
结果示于图54中。泳道1示出了利用在市售pShuttle载体中编码有REIC的载体进行转染的细胞的细胞提取液的结果，泳道2示出了利用在市售pShuttle载体中插入有编码c-myc的DNA并在编码c-myc的DNA下游(BGH poly A的下游)插入有3个增强子的表达载体进行转染的细胞的细胞提取液的结果。如图中所示，在使用在市售pShuttle载体中插入有编码c-myc的DNA并在编码c-myc的DNA下游(BGH poly A的下游)插入有3个增强子的表达载体的情况下确认到了最强表达。该结果显示，通过在pShuttle载体等市售质粒的表达基因盒的下游重组本系统(构建体No.14的构建体骨架)的3个增强子部分，能够使该基因的表达增强。即，示出了在各种基因构建体中插入3个增强子区域可增强目的基因的表达。本实施例的结果显示，通过在用于iPS细胞的制作的c-myc基因表达用质粒的表达基因盒的下游重组本系统(构建体No.14的构建体骨架)的3个增强子部分，c-myc的基因表达增强。iPS细胞被认为在各种再生医疗中有用，即，以上结果显示，该增强子部分作为可使c-myc等所谓的重排基因进行更强的基因表达的手段、并且作为使表达蛋白质本身作为再生因子而在体内(in vivo)或者活体外(ex vivo)进行使用的手段，在再生医疗等中是有用的。
实施例7作为启动子使用hTERT的情况下的表达增强
制备含有GFP(绿色荧光蛋白)作为外源基因(插入基因)的本发明的表达用盒，进行HEK293细胞的转染，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。转染使用FuGENE(商标)-HD进行，24小时后通过Western印迹对细胞培养液中的GFP进行检测。
所用表达用盒的构建体为实施例1中所用的构建体No.2(图8)以及构建体No.18、19、20和21。构建体No.18、19、20和21的结构分别示于图55、56、57和58中。构建体No.18为含有hTERT启动子的通常的基因表达载体。hTERT在高表达环境下、即在癌细胞中的基因强表达方面是有利的，在期待癌细胞特异性基因表达的情况下进行使用。但是，该基因表达极其微弱，阻碍了在基因治疗中或在特异细胞中的蛋白质(药物)产生等中的临床应用。构建体No.19为在含有hTERT启动子的通常的基因表达载体(构建体No.18)的表达基因上游插入了RU5序列的质粒。构建体No.20为在含有hTERT启动子的通常的基因表达载体(构建体No.18)的BGH poly A序列的下游插入了hTERT增强子序列的质粒。构建体No.21为在含有hTERT启动子的通常的基因表达载体(构建体No.18)的表达基因的上游插入RU5’序列、进一步在BGH poly A序列的下游插入hTERT增强子序列的质粒。图59-1和图59-2(续图59-1)中示出了构建体No.21的表达载体的全碱基序列(序列编号31)。图59-1和图59-2的碱基序列中的(1)、(2)、(3)、(4)和(5)的框所围起的部分分别表示hTERT核心启动子、最小CMV启动子(minimal CMV promoter)、RU5’、GFP基因、BGH poly A、hTERT核心启动子。
表达的结果示于图60中。泳道1表示不表达外源蛋白质的细胞的细胞提取液的结果，泳道2～6分别表示使用构建体No.2、No.18、No.19、No.20和No.21进行表达的结果。如图中所示，以构建体No.18、No.19、No.20、No.21和No.2的顺序确认到强表达。本实施例的结果显示，本系统(将目的表达基因夹在启动子与增强子之间的该构建体的形态)在显著增强可进行癌特异性基因表达的hTERT启动子这样的基因表达能力极弱的启动子的基因表达方面是有用的。
实施例8同时转染重组了不同的外源基因的2个以上的表达载体的情况下的表达
对细胞同时转染在构建体No.2(图20)中重组了编码DsRed(红色荧光蛋白质)的DNA的质粒、在构建体No.21(图58)中重组了编码酵母GST(谷胱甘肽S转移酶)的DNA的质粒、在构建体No.21(图58)中重组了编码GFP的DNA的质粒，通过Western印迹对表达蛋白质进行分析。转染使用FuGENE(商标)-HD进行。细胞使用HEK293细胞、Hela细胞、PC3细胞、HepG2细胞、HCT116细胞、MCF7细胞的癌细胞株，进一步地，作为正常细胞株使用OUMS-24细胞(人来源的成纤维细胞)和NHK细胞(人来源的角化细胞)。转染的48小时后通过Western印迹对细胞提取液中的各蛋白质进行检测。对于编码DsRed的DNA和编码酵母GST的DNA，基于公知的cDNA序列通过人工合成来制作cDNA。
Western印迹使用抗GFP抗体、抗6His抗体(MBL社、在添加了6His的端粒酶的检测中使用)、抗微管蛋白抗体(Sigma社)、抗DsRed抗体(Clontech社)和抗酵母GST抗体进行，使用转染24小时后的细胞提取液(总蛋白质量为10μg)。
结果示于图61中。如图61所示，含有hTERT启动子的质粒构建体(构建体No.21)在各种癌细胞、正常细胞中对于仅针对癌细胞特异性的基因表达是有用的。即，该情况下，仅在癌细胞中有基因的强表达，且可抑制在正常细胞中的基因表达。关于这一点，例如，对于含有CMV启动子的质粒构建体(构建体No.2)，在人癌细胞-正常细胞中均观察到了基因表达，无法达成癌细胞中的特异性基因表达。而含有hTERT启动子的质粒在可以达成这样的癌细胞特异性基因表达这一点上是有用的。
实施例9基于利用含有本发明的基因表达盒的表达载体转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞)的人红细胞生成素(Human EPO)生产量的研究
为进行人红细胞生成素的分泌表达，将在C末端侧添加了His tag的EPO-His tag的DNA片段分别重组到含有构建体No.14的构建体的载体(称为SGE(基因超表达)载体)和作为对照的pTracer(注册商标)-EF载体(EF-1α启动子、Invitrogen社)中。
作为人红细胞生成素分泌表达的宿主细胞，将处于对数增殖期的人肾脏来源细胞：FreeStyle 293-F细胞(Invitrogen社)以5～6×105细胞/mL的浓度在125mL烧瓶中进行30mL接种，在37℃、8%CO2存在下使用Freestyle 293Expression 1Media(Invitrogen社)进行一晩振荡培养(125rpm)。翌日调整为1×106细胞/mL的浓度，对于在125mL烧瓶中接种了30mL的293-F细胞，将各30μg的SGE-EPO-His tag和pTracer(注册商标)-EF-EPO-His tag的质粒DNA与基因导入试剂：293Fectin(Invitrogen社)混合，进行基因导入。转染后在37℃、8%CO2存在下进行4天振荡培养，回收培养上清。使用SDS-PAGE对该培养上清中的18μL进行分离，利用CBB染色对分子量约为35kDa的糖基化型EPO蛋白质进行检测(图62)。
为估算EPO生产量，使用组氨酸亲和柱色谱法(TALON-Affinity Resin(Clontech社))对4天后回收的25mL培养上清中所分泌出的人红细胞生成素蛋白质进行精制，使用SDS-PAGE对溶出液进行分离，通过CBB染色确认EPO蛋白质的纯度(图63)。进一步地通过Bradford法对该精制EPO蛋白质的蛋白质量进行定量，由25mL培养时的精制蛋白质量计算出1L培养时所得到的蛋白质量(图64A和B)。根据该结果可知，对于人红细胞生成素，在使用SGE载体时，与pTracer(注册商标)-EF载体时的表达量比较，可生产出约8倍量的蛋白质，若换算成1L的培养液，则达成了约150mg的超高效率表达量。
实施例10基于利用含有本发明的基因表达盒的表达载体进行转染的HEK293细胞(人胚胎肾细胞)的人REIC(永生化细胞中表达下调，Reduced Expression inImmortalized Cells)蛋白质的生产量的研究
基于实施例1所记载的方法，将293-F细胞调整为1×106细胞/mL的浓度，在500mL烧瓶中接种180mL细胞，准备三个这样的烧瓶，在各烧瓶中使用基因导入试剂：293Fectin(Invitrogen社)进行REIC表达SGE载体(含有构建体No.14的构建体的载体)180μg进行暂时性转染。转染后，在37℃、8%CO2存在下进行4天振荡培养，回收培养上清。使用SDS-PAGE对该培养上清18μL进行分离，通过CBB染色对分子量约55kDa的糖基化REIC蛋白质进行检测(图65)。
通过超滤将回收的培养上清由520mL浓缩至35mL，使用Sephadex(商标)G25M柱色谱(GE Healthcare社)将溶剂置换为20mM Hepes缓冲液(pH7.2)，回收含有REIC蛋白质的级分。其后使用阴离子交换柱色谱(DEAE-Toyopearl(注册商标)650M,东曹)吸附蛋白质，之后在20mM Hepes缓冲液(pH7.2)中利用氯化钠的线性浓度梯度(0～0.7M)进行溶出，在氯化钠浓度为0.35M程度的条件下确认REIC蛋白质的峰级分。利用SDS-PAGE对各峰级分进行分析，回收仅由高纯度REIC蛋白质构成的级分(图66)。利用吸光度(280nm)计算出该精制REIC蛋白质的蛋白质量，进一步由520mL培养时的精制蛋白质量进行换算，从而计算出在培养1L时所得到的蛋白质量(图67)。结果，由转染了REIC表达SGE载体的培养上清得到了大约50mg的高纯度精制蛋白质。即，以上结果证明，若换算为1L培养液，则实际上能够回收大约100mg的大容量精制蛋白质。
工业实用性
本发明的基因表达用盒含有在第1启动子的下游含有所要表达的基因和polyA附加序列的DNA构建体，进一步在该DNA构建体的下游连接有增强子或第2启动子，该基因表达用盒不论细胞的种类、基因的种类、转染试剂的种类如何，通过基于基因表达所进行的所要表达的目的蛋白质的超高表达而实现大量生产，不仅可适用作生物技术领域中的试剂，还可适用作治疗用的蛋白质药物、可在临床上广泛应用于使用基因进行的治疗-检査-诊断中。例如，可应用于下述方面：(1)以往无法解析的未知基因在特定细胞或组织中的功能解析；(2)在基因治疗中通过不仅载入病毒载体还载入非病毒载体中所带来的治疗效果的提高；(3)作为抗体药物等近年来的生物药品的生产法，利用人细胞大量生产特定的人功能性蛋白质的超细胞的制作；(4)对于各种分析或临床诊断中所用的试剂或诊断试剂进行有效且低成本的制造的方法；等等，在生物技术领域中可带来革命性的进化。
本发明的表达用DNA盒不仅可适用作生物技术领域中的试剂，还可在临床上广泛应用于使用基因进行的治疗-检査-诊断中。
序列表单独文档
序列编号1～16、19～31合成
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Claims (16)

1.一种基因表达用盒，该表达用盒含有DNA构建体，并在该DNA构建体的下游含有增强子或第2启动子，所述DNA构建体在第1启动子下游含有所要表达的基因和polyA附加序列。
2.如权利要求1所述的表达用盒，其中，在所连接的增强子或第2启动子的下游不具有其它基因表达用结构，具有所要表达的基因被夹在一个第1启动子与一个增强子之间、或者被夹在一个第1启动子与一个第2启动子之间的结构。
3.如权利要求1所述的表达用盒，其中，启动子为选自由CMV i启动子、SV40启动子、hTERT启动子、β肌动蛋白启动子和CAG启动子组成的组中的启动子。
4.如权利要求1～3的任一项所述的表达用盒，其中，增强子为选自由CMV增强子、SV40增强子和hTERT增强子组成的组中的至少1种增强子。
5.如权利要求1～4的任一项所述的表达用盒，其在DNA构建体的上游进一步连接有1～4个CMV增强子，所述DNA构建体在启动子的下游含有编码所要表达的蛋白质的DNA和polyA附加序列。
6.如权利要求1～5的任一项所述的表达用盒，其进一步含有下述元件(i)～(iii)中的至少任意之一：
(i)连接在紧靠编码外源蛋白质的DNA的上游的RU5’；
(ii)连接在紧靠增强子和/或启动子的上游的UAS；和
(iii)连接在表达用盒的最上游的SV40-ori。
7.如权利要求1～6的任一项所述的表达用盒，其中，所要表达的基因为可用于疾病治疗的治疗用基因，或者为可用于药物、诊断试剂或试剂的蛋白质的基因。
8.如权利要求7所述的表达用盒，其中，治疗用基因是REIC/Dkk-3基因，该REIC/Dkk-3基因为可用于肿瘤的治疗的抑癌基因。
9.如权利要求1所述的外源基因表达用盒，其具有构建体No.2(图8)、No.4(图10)、No.6(图12)、No.8(图14)、No.10(图16)、No.12(图18)和No.14(图20)所示的结构。
10.如权利要求1所述的外源基因表达用盒，其具有构建体No.15(图16)、No.16(图37)、No.17(图49)、No.20(图57)和No.21(图58)所示的结构。
11.一种载体，其含有权利要求1～10的任一项所述的外源基因表达用盒。
12.如权利要求11所述的载体，其为腺病毒载体或腺相关病毒载体。
13.一种宿主细胞，其含有权利要求11或12所述的载体。
14.一种疾病检测或治疗用制剂，其含有权利要求11或12所述的载体。
15.一种使所要表达的基因进行表达的方法，其使用权利要求1～10的任一项所述的表达用盒、或者权利要求11或12所述的载体。
16.一种所要表达的基因所编码的蛋白质的制造方法，其包括如下步骤：将权利要求1～10的任一项所述的表达用盒、或者权利要求11或12所述的载体导入至细胞中，对该细胞进行培养。
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