WO2022025178A1 - ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３遺伝子を含むＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌の治療薬 - Google Patents

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嘉信 前田
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    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a combination therapy for treating EGFR gene mutation-positive lung cancer using the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor, and further EGFR gene mutation using an immune checkpoint inhibitor and a molecular target drug. Concerning combination therapies to treat positive lung cancer.
  • the REIC / Dkk-3 gene is known to be associated with cell immortalization. It has been reported that the expression of this gene is suppressed in cancer cells. Furthermore, it has been reported that the REIC / Dkk-3 gene is used for cancer treatment (see Patent Document 1). Immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 (Programmed cell death 1) antibody and anti-PD-L1 (Programmed cell-death ligand 1) antibody, which are PD-1 / PD-L1 immune checkpoint pathway inhibitors. inhibitor: ICI) is known to be useful for various malignant tumors.
  • EGFR tyrosine kinase inhibitor EGFR tyrosine kinase inhibitor: EGFR-TKI
  • ICIs immune checkpoint inhibitors
  • ICI may be effective for EGFR gene mutation-positive lung cancer when used in combination with cytotoxic anticancer agents and anti-VEGF antibodies, the current situation is EGFR gene mutation.
  • the role of ICI in positive lung cancer is unclear.
  • EGFR-TKI is effective for EGFR gene mutation-positive lung cancer, but it does not cure and eventually becomes resistant to treatment.
  • ICIs such as cytotoxic anticancer agents and anti-PD-1 antibodies can be used as treatment options after EGFR-TKI resistance.
  • ICI is a treatment that may lead to long-term survival if it responds, it is known that the effect of ICI is poor in EGFR gene mutation-positive lung cancer (see Non-Patent Document 1). It has been reported that EGFR gene mutation-positive lung cancer has a low tumor mutation burden (see Non-Patent Document 3), a small number of CD8 + tumor-infiltrating lymphocytes (see Non-Patent Document 4), and low immunogenicity. It is speculated that this may be the cause of the poor effect. Therefore, how to enhance immunogenicity and improve the effect of ICI is one of the important issues in the treatment of lung cancer.
  • lung cancer mouse model may not properly reproduce lung adenocarcinoma with EGFR gene mutation in actual human patients. Therefore, in order to carry out preclinical studies of tumor immunity in lung cancer with EGFR gene mutation, it can be said that an animal model that is closer to the findings obtained from human specimens is extremely important.
  • This Egfr gene mutation-positive lung cancer mouse expresses the Egfr gene mutation specifically in type 2 alveolar epithelium, and lung tumors dependent on the Egfr gene mutation develop. Similar to human lung cancer, it responds to EGFR-TKI but does not cure and becomes resistant. In addition, this mouse lung tumor does not express PD-L1 and the effects of anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody are poor, which is consistent with human EGFR gene mutation lung cancer and can be said to be a model that more reflects the pathological condition.
  • An object of the present invention is to provide a method for treating EGFR gene mutation-positive lung cancer by using an EGFR tyrosine kinase inhibitor, an immune checkpoint inhibitor, and a molecular target drug in combination with the REIC / Dkk-3 gene.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A drug for the treatment of EGFR gene mutation-positive lung cancer used in combination with an EGFR tyrosine kinase inhibitor containing the REIC / Dkk-3 gene as an active ingredient.
  • [2] A drug for the treatment of EGFR gene mutation-positive lung cancer, which comprises the REIC / Dkk-3 gene as an active ingredient and is used in combination with an immune checkpoint inhibitor and / or a molecular target drug.
  • REIC / Dkk-3 gene as an active ingredient for administration to patients with primary cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer after combined treatment with REIC / Dkk-3 gene and EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • REIC / Dkk-3 gene as an active ingredient for administration to patients with primary cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer after combined treatment with REIC / Dkk-3 gene and EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • a combination pharmaceutical kit for the treatment of EGFR gene mutation-positive lung cancer which comprises a combination of the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • a combination pharmaceutical kit for the treatment of EGFR gene mutation-positive lung cancer which comprises a combination of the REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor and / or a molecular target drug.
  • An EGFR gene mutation-positive lung cancer that is a combination drug kit containing a combination of the REIC / Dkk-3 gene, an immune checkpoint inhibitor, and a molecular-targeted drug that has recurred after treatment with an EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 / PD-L1 immune checkpoint pathway inhibitor.
  • the combination pharmaceutical kit according to any one of [12] to [21] which is in the form of a locally administered agent.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2020-130701, which is the basis of the priority of the present application.
  • EGFR-TKI is effective for EGFR gene mutation-positive lung cancer, but it does not cure and eventually becomes resistant to treatment.
  • Immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 antibody have little effect on EGFR mutation-positive lung cancer.
  • REIC / Dkk-3 has cancer cell-specific cell death-inducing and immunostimulatory effects. These actions are different from the effects of conventional cytotoxic anticancer drugs and molecular-targeted drugs.
  • the combined use of REIC / Dkk-3 and EGFR tyrosine kinase inhibitor, and the combined use of PD-1 / PD-L1 immune checkpoint pathway inhibitor and molecular target drug activates tumor immunity and enhances local antitumor effect. Is possible. This combination therapy makes it possible to activate not only local but also systemic tumor immunity and enhance antitumor effect.
  • FIG. 3A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 3B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • FIG. 4A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 4B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • FIG. 5A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 5B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • FIG. 5A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 5B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • FIG. 5A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 5B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • FIG. 5B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • the present invention will be described in detail.
  • the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor are used in combination, and a PD-1 / PD-L1 immune checkpoint pathway inhibitor and a molecular target drug are used in combination.
  • the base sequence of REIC / Dkk-3 DNA is represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the REIC / Dkk-3 protein encoded by the REIC / Dkk-3 DNA is represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (NCBI)) (for example, the default, that is, the initial stage).
  • NCBI National Center for Biological Information
  • the DNA contained in REIC / Dkk-3 DNA is contained.
  • REIC / Dkk-3 fragment nucleotides can also be used.
  • An example of a nucleotide containing a base sequence starting with the first base in the base sequence of REIC / Dkk-3 DNA represented by SEQ ID NO: 1 and ending with any of the 117th base to the 234th base is 1 It contains a polynucleotide in the range of the 117th base from the second base (SEQ ID NO: 3) and a polynucleotide in the range of the first base to the 234th base (SEQ ID NO: 4).
  • the REIC / Dkk-3 gene can be introduced into a subject by a conventional method.
  • Examples of the method for introducing a gene into a subject include a method using a viral vector and a method using a non-viral vector.
  • the REIC / Dkk-3 gene can be introduced into cells or tissues using a recombinant expression vector into which a gene expression vector such as a plasmid vector has been introduced, without using the above virus.
  • Typical viral vectors used for gene transfer include adenovirus, adeno-associated virus and retrovirus. Introduced target gene into DNA or RNA virus such as detoxified retrovirus, herpesvirus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindobis virus, Sendai virus (HVJ), SV40, immunodeficiency virus (HIV) However, it is possible to introduce the target gene into the cell by infecting the cell with such a recombinant virus. Preferably, an adenovirus vector is used.
  • the vector contains a construct containing the REIC / Dkk-3 gene.
  • the construct containing REIC / Dkk-3 DNA may optionally contain a promoter, an enhancer for gene transcription, a poly A signal, a marker gene for labeling and / or selection of cells into which the gene has been introduced, and the like. ..
  • a known promoter can be used.
  • the construct contains the REIC / Dkk-3 gene and a poly A addition sequence located downstream of at least one first promoter, and has a structure in which an enhancer or a second promoter is linked downstream of the DNA construct.
  • a promoter is a specific base sequence on DNA that initiates transcription using DNA as a template, and generally has a common sequence.
  • prokaryotes such as Escherichia coli usually have a TATAATG sequence at the -10 base pair site of the transcription initiation site and a TTGACA sequence at the -35 base pair site.
  • eukaryotes usually have a TATA box at the -20 base pair site.
  • the expression cassette of the present invention may always have a first promoter upstream of the gene to be expressed and a second promoter downstream of the gene to be expressed.
  • the promoters used as the first promoter and the second promoter are not limited, and the first promoter and the second promoter may be the same or different.
  • Non-specific promoters capable of promoting the expression of foreign genes in any cell or tissue can also be used, as well as specific or selective promoters such as tissue or organ-specific promoters, tumor-specific promoters, developmental or differentiation-specific promoters.
  • a specific promoter can be used as the first promoter and a non-specific promoter can be used as the second promoter.
  • promoters used in the present invention hTERT (human telomerase reverse transcriptase), PSA (prostate-specific antigen), c-myc, GLUT promoter, etc. as cancer or tumor-specific promoters are used as ES cell / cancer stem cell-specific promoters.
  • the animal species from which the ⁇ -actin promoter is derived is not limited, and mammalian ⁇ -actin promoters, for example, human ⁇ -actin promoters and niwatriactin promoters are used. Further, an artificial hybrid promoter such as the CMV-i promoter described above can also be used.
  • the CMV-i promoter can be synthesized, for example, based on the description of US Pat. No. 5,168,062 and US Pat. No. 5,385,839.
  • As the promoter a portion of the core promoter consisting of the smallest sequence having promoter activity may be used.
  • the core promoter is a promoter region that has a function of guiding accurate transcription initiation, and may include a TATA box.
  • cancer and / or tumor-specific promoters such as hTERT promoter can be suitably used for gene therapy by gene expression and cancer diagnosis targeting cancer.
  • the origin of the poly A addition sequence is not limited, and the poly A addition sequence derived from the growth hormone gene, for example, the poly A addition sequence derived from the bovine growth hormone gene or the poly A addition sequence derived from the human growth hormone gene, Examples thereof include a poly A addition sequence derived from the SV40 virus, a poly A addition sequence derived from the ⁇ -globin gene of humans and rabbits, and the like. Transcription efficiency is increased by including the poly A addition sequence in the expression cassette.
  • the base sequence of the BGA poly A addition sequence is shown in the sequence after the 13th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the enhancer is not limited as long as it results in an increase in the amount of messenger RNA (mRNA) produced by transcription.
  • An enhancer is a base sequence having an effect of promoting the action of a promoter, and generally consists of about 100 bp. Enhancers can promote transcription regardless of sequence orientation.
  • the enhancer used in the present invention may be one type, but two or more identical enhancers may be used, or a plurality of different enhancers may be used in combination. Further, when a plurality of different enhancers are used, the order thereof is not limited. For example, a CMV enhancer, an SV40 enhancer, an hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) enhancer, or the like can be used. As an example, hTERT enhancer, SV40 enhancer and CMV enhancer are connected in this order.
  • a plurality of enhancers may be linked upstream of the DNA construct containing the DNA encoding the protein to be expressed and the poly A addition sequence.
  • the enhancer connected to this upstream is not limited, but a CMV enhancer is preferable.
  • a 4 ⁇ CMV enhancer in which four CMV enhancers are connected can be mentioned.
  • the combination of the CMV-i promoter and CMV enhancer allows the gene to be expressed in almost all cells (host cells) when any gene is inserted and no transfection reagent is used. Protein expression is possible.
  • RU5' may be linked immediately upstream of the DNA encoding the protein to be expressed by RU5'. Immediate upstream means that they are directly linked without interposing other elements having a specific function, but a short sequence may be included as a linker.
  • RU5' is an LTR derived from HTLV and is an element that increases protein expression by insertion (Mol.Cell.Biol., Vol.8 (1), pp.466-472, 1988). Insertion of RU5'reversely reported may counteract the expression-enhancing effect of promoter enhancer insertion.
  • UAS may be linked immediately upstream of the enhancer and / or promoter.
  • UAS is a binding region of the GAL4 gene, and protein expression is increased by inserting the GAL4 gene later.
  • SV40-ori may be connected to the uppermost stream of the expression cassette.
  • SV40-ori is a binding region of the SV40 gene, and the insertion of the SV40 gene increases protein expression.
  • Each of the above elements must be functionally linked.
  • functionally linked means that each element exerts its function and is linked so that the expression of the gene to be expressed is enhanced.
  • the above DNA constructs include (i) CMV promoter, (ii) REIC / Dkk-3 DNA, (iii) polyA addition sequence, and (iv) hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) enhancer, SV40 enhancer and so on from the 5'end side. It is a construct that concatenates enhancers that concatenate CMV enhancers in this order.
  • the sequence of the portion of the DNA construct containing the REIC / Dkk-3 DNA of the present invention excluding the CMV promoter is shown in FIG. 7 and SEQ ID NO: 6.
  • the BGA polyA sequence is contained between the REIC / Dkk-3 DNA and 3 ⁇ enh.
  • the DNA construct containing REIC / Dkk-3 DNA of the present invention has a CMV promoter upstream (5'side) of the sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of the region containing BGHpolyA and three enhancers contained in the above construct.
  • the parts surrounded by the frames (1) and (2) in the base sequence of FIG. 7 indicate the DNA encoding the REIC / Dkk-3 protein and the three enhancers (3xenh), respectively.
  • functionally linked means that each element exerts its function and is linked so that the expression of the gene to be expressed is enhanced.
  • the above expression cassette contains, for example, a foreign gene insertion site downstream of a commercially available CMV promoter, and further downstream thereof, a REIC / Dkk-3 DNA is inserted into a pShuttle vector (Clontech) containing a BGA polyA sequence, and further. It can be obtained by concatenating an hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) enhancer, an SV40 enhancer and a CMV enhancer downstream of the BGA polyA sequence in this order.
  • hTERT Telomerase Reverse Transcriptase
  • REIC / Dkk-3 DNA [1] From the 5'end side (i) CMV promoter; (ii) The following REIC / Dkk-3 DNA: (a) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (b) DNA having at least 90%, 95%, 97% or 98% sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. (iii) polyA addition sequence; and (iv) hTERT (Telomerase Reverse Transcriptase) A DNA construct for expressing the REIC / Dkk-3 protein, in which enhancers, SV40 enhancers and CMV enhancers are linked in this order.
  • [2] The DNA construct of [1], wherein the polyA addition sequence is a polyA addition sequence (BGA polyA) derived from a bovine growth hormone gene.
  • BGA polyA polyA addition sequence
  • the DNA construct of [1] or [2] which comprises a base sequence concatenated with.
  • the DNA construct is prepared, for example, as described in WO2011 / 062298, US Patent Application Publication No. 2012/0309050, International Publication No. WO2012 / 161352 and US Patent Application Publication No. 2014/0147917. can do.
  • Ad-REIC Ad-REIC
  • Ad-REIC / Dkk-3 adenoviral vector containing REIC / Dkk-3 DNA
  • the vector system containing the DNA construct of the present invention is called an SGE (Super Gene Expression) system, and for example, an adenovirus vector containing a DNA construct containing REIC / Dkk-3 DNA is Ad5-SGE-REIC / Dkk-3 (Ad-). It is called SGE-REIC).
  • FIG. 6 illustrates the structure of Ad-REIC / Dkk-3
  • FIG. 7 illustrates the sequence of Ad-REIC / Dkk-3.
  • the adenovirus vector containing the above DNA construct can be obtained by introducing the above DNA construct into the adenovirus vector to prepare a recombinant adenovirus.
  • the introduction of the DNA construct into the adenovirus can be carried out, for example, by introducing the DNA construct in the pShuttle vector containing the above-mentioned DNA construct of the present invention into the adenovirus.
  • the characteristics of the adenovirus vector are (1) gene transfer into many types of cells, (2) efficient gene transfer into cells in the growth arrest phase, and (3) concentration by centrifugation. , High titer (10-11 pfu / mL or more) virus can be obtained, and (4) suitable for direct gene transfer into tissue cells in vivo.
  • Adenoviruses for gene therapy include first-generation adenovirus vectors lacking the E1 / E3 region (Miyake, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 1320, From 1996), a second-generation adenovirus vector lacking the E2 or E4 region in addition to the E1 / E3 region (Lieber, A., et al., J. Virol., 70, 8944, 1996; Mizuguchi, H.
  • Administering a recombinant adenoviral vector containing a DNA construct containing the REIC / Dkk-3 DNA of the present invention (hereinafter, may be simply referred to as “the adenoviral vector of the present invention”) to a human or other mammalian subject.
  • the gene for cancer treatment is delivered to the cancer cells of the subject, the gene is expressed in the cancer cells, the growth of the tumor cells is suppressed, and the cancer treatment effect is exhibited.
  • the adenoviral vector of the present invention can be used in the field of gene therapy, for example, intravascular administration such as intravenous administration or intraarterial administration, oral administration, intraperitoneal administration, intratracheal administration, intrabronchial administration, subcutaneous administration. , Can be administered by transdermal administration or the like.
  • the adenovirus vector of the present invention has a large orientation to a specific tissue or cell and can efficiently deliver the target gene to a specific tissue or cell, so that it can be efficiently diagnosed even by intravascular administration. , Can be treated.
  • the adenovirus vector of the present invention may be administered in a therapeutically effective amount.
  • a therapeutically effective amount can be easily determined by those skilled in the art of gene therapy. Further, the dose can be appropriately changed depending on the severity, sex, age, body weight, habit, etc. of the subject's condition.
  • the adenovirus vector of the present invention may be locally administered in an amount of 0.3 ⁇ 10 10 to 3 ⁇ 10 12 vp (number of virus particles) intratumorally.
  • the REIC / Dkk-3 gene or REIC / Dkk-3 DNA when used, it also includes the case where it is used as a REIC / Dkk-3 DNA adenovirus vector (Ad-REIC) containing REIC / Dkk-3 DNA.
  • Ad-REIC Ad-REIC
  • a molecular-targeted drug is a drug that attacks cancer cells by targeting proteins and genes existing on the surface of the cancer cells.
  • a molecular target drug compounds such as gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, and osimertinib having a tyrosine kinase inhibitory effect on EGFR (epidermal growth factor receptor), as well as antibodies and blood vessels against vascular endothelial factor receptor (VEGFR).
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • VEGFR vascular endothelial factor receptor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • antibodies against the vascular endothelial factor receptor (VEGFR) have a vascular injury effect as angiogenesis-suppressing therapy at high doses (clinical use), while they significantly work on normalization of blood vessels at low doses.
  • EGFR tyrosine kinase inhibitor a molecular target drug having a tyrosine kinase inhibitory effect on EGFR.
  • the anti-VEGFR antibody include ramucirumab (trade name: Cyramza), and examples of the anti-VEGF antibody include bevacizumab (trade name: Avastin).
  • EGFR gene mutation-positive lung cancer is targeted for treatment.
  • EGFR gene mutation-positive lung cancer is a cancer that is positive for the EGFR gene mutation, which is found in non-small cell lung cancer among lung cancers. It has been reported that cancer immunotherapy is not effective for EGFR gene mutation-positive lung cancer.
  • the EGFR gene mutation is a gene mutation that contributes to carcinogenesis by activating the EGFR gene mutation signal.
  • treatment was performed using an EGFR tyrosine kinase inhibitor, but there was a problem that lung cancer cells that had acquired resistance to the EGFR tyrosine kinase inhibitor became resistant to treatment.
  • the REIC / Dkk-3 gene, EGFR tyrosine kinase inhibitor, immune checkpoint inhibitor, and molecular target drug are appropriately combined for EGFR for the initial cancer and recurrent cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer.
  • the initial cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer means a cancer diagnosed as EGFR gene mutation-positive lung cancer for the first time
  • recurrent cancer means a cancer that reappears after treatment for the initial cancer.
  • the initial cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer refers to EGFR gene mutation-positive lung cancer that has not been treated with an EGFR tyrosine kinase inhibitor, and recurrent cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer is an EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • EGFR gene mutation-positive lung cancer that has acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors after treatment with.
  • the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor are used in combination to treat the initial cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer.
  • the tumor shrinks more than when treated with an EGFR tyrosine kinase inhibitor alone, and cancer antigen-specific cytotoxic CD8-positive T cells (CTL) can be induced.
  • CTL cancer antigen-specific cytotoxic CD8-positive T cells
  • the REIC / Dkk-3 gene and the EGFR tyrosine kinase inhibitor are not sufficiently therapeutically effective for the initial cancer of EGFR gene mutation-positive lung cancer, or if it recurs, the REIC / Dkk-3 gene And EGFR tyrosine kinase inhibitor combined treatment followed by REIC / Dkk-3 gene and immune checkpoint inhibitor, or REIC / Dkk-3 gene and immune checkpoint inhibitor Treatment may be performed in combination with three molecular target drugs. When the three agents are used in combination, a greater therapeutic effect can be obtained than when the two agents are used in combination.
  • REIC / Dkk-3 gene and immune checkpoint inhibitor should be used in combination
  • REIC / Dkk-3 gene and immune checkpoint inhibition should be used in combination.
  • Treatment may be performed by using three drugs, a drug and a molecular target drug, in combination. When the three agents are used in combination, a greater therapeutic effect can be obtained than when the two agents are used in combination.
  • cancer cells when using a chemotherapeutic drug, cancer cells may show resistance (resistance) to the chemotherapeutic drug.
  • resistance resistance to the chemotherapeutic drug.
  • Immune checkpoint inhibitors and molecular-targeted drugs can be administered by known methods, and may be administered according to the description in the package insert of each drug.
  • the dose will vary depending on symptoms, age, weight and other conditions. Doses of 0.001 mg to 2000 mg, preferably 1 mg to 1500 mg, more preferably 5 mg to 1000 mg can be administered once or divided into several doses at intervals of days, weeks or months.
  • the REIC / Dkk-3 gene can be administered separately or continuously at the same time as the administration of the EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • the REIC / Dkk-3 gene can also be administered before or after administration of the EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • the REIC / Dkk-3 gene is administered at the same time as the EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • they can be administered as separate formulations or as an anticancer composition containing both the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • the REIC / Dkk-3 gene When used in combination with an immune checkpoint inhibitor and / or a molecular target drug, the REIC / Dkk-3 gene can be administered separately or sequentially at the same time as the administration of the immune checkpoint inhibitor and / or the molecular target drug. ..
  • the REIC / Dkk-3 gene can also be administered before or after administration of immune checkpoint inhibitors and / or molecular targeted drugs.
  • the REIC / Dkk-3 gene is administered simultaneously with immune checkpoint inhibitors and / or molecular targeted drugs. When administered simultaneously, they can be administered as separate formulations or as an anticancer composition containing both the REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor and / or a molecular target drug.
  • the antibody against the vascular endothelial factor receptor is used as a low-dose angiogenesis-suppressing therapy as well as a low-dose angiogenesis-suppressing therapy with the REIC / Dkk-3 gene. Can be used as a combination therapy. In the latter case, it has been reported to promote the infiltration of effector T cells into the tumor tissue (Reference: Yuhui Huanga et al. PNAS
  • ramucirumab (trade name: Cyramza) can be administered at a dose lower
  • the administration form of the composition containing the three types is not limited, and the composition can be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection, or intravenous injection.
  • EGFR tyrosine kinase inhibitors are orally administered.
  • the REIC / Dkk-3 gene is a topical administration agent targeting a cancer site, and the immune checkpoint inhibitor or a molecular targeting agent to be used in combination is a systemic administration agent. Or it is a topical administration.
  • the composition containing three kinds contains a carrier, a diluent and an excipient generally used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets include monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, and fructose (including sugar alcohols such as erythritol, xylitol, sorbitol, and mannitol), lactose, maltose, sucrose, and trehalose.
  • oligosaccharides and polysaccharides including thickening polysaccharides, starch, powdered cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin, dextran, maltodextrin, isomaltodextrin, etc.
  • sugars including sugar alcohols such as lactitol and martitol
  • polysaccharides including thickening polysaccharides, starch, powdered cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin, dextran, maltodextrin, isomaltodextrin, etc.
  • calcium carbonate, kaolin, calcium secondary phosphate, calcium tertiary phosphate, calcium sulfate, magnesium stearate and the like are used.
  • an isotonic solution containing the above-mentioned saccharides such as physiological saline and glucose and other auxiliary agents is used, and appropriate solubilizing agents such as alcohol, polyalcohol such as propylene glycol, and nonionic liquids are used. It may be used in combination with a surfactant or the like.
  • solubilizing agents such as alcohol, polyalcohol such as propylene glycol, and nonionic liquids. It may be used in combination with a surfactant or the like.
  • the oily liquid sesame oil, soybean oil and the like are used, and as the solubilizing agent, benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination.
  • the carriers, diluents and excipients can be used alone or in combination of one or more thereof, respectively.
  • the REIC / Dkk-3 protein encoded by the REIC / Dkk-3 gene can treat or prevent cancer by upregulating the anticancer immune system. In addition, it also induces apoptosis of cancer cells. Specifically, the REIC / Dkk-3 protein induces CTLs (cytotoxic T lymphocytes), which attack cancer cells throughout the body.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • Cancer cells attacked by CTL express PD-L1 as a defense function, but PD-1 / PD-L1 immune checkpoint pathway inhibitors inhibit the defense function of cancer cells.
  • Molecular-targeted drugs directly attack cancer cells by targeting proteins and genes present on the surface of cancer cells.
  • the combination of the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor and the combination of the REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor are more effective in treating cancer than the drugs alone.
  • the present invention comprises two agents, a REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor, two agents, a REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor, or a REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor.
  • the invention also provides two agents, the REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor, two agents, the REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor, or REIC in the manufacture of pharmaceuticals for the treatment of cancer.
  • the present invention also has two agents, a REIC / Dkk-3 gene and an EGFR tyrosine kinase inhibitor, two agents, a REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor, or a REIC / Dkk-3 gene and an immune checkpoint inhibitor. And drugs including three molecular target drugs.
  • the present invention includes the REIC / Dkk-3 gene for use with EGFR tyrosine kinase, for use with immune checkpoint inhibitors, or for use with immune checkpoint inhibitors and molecular targeted drugs.
  • the present invention includes a method for treating EGFR gene mutation-positive lung cancer using the above-mentioned pharmaceuticals.
  • Ad-SGE-REIC (1.0x10 9 ifu / day, day1,8) is used only for one-sided tumor, or Ad-CAG-LacZ * (1.0x10 9 ifu / day, day1,8) is used as a control group. It was administered internally and the antitumor effect was evaluated (Fig. 1B). * Ad-CAG-LacZ: Adenovirus vector preparation that does not contain the REIC / Dkk-3 gene
  • Ad-SGE-REIC (1.0x10 9 ifu / day, day1,4,7) was intratumorally administered only to one-sided tumor, and anti-PD-1 antibody (clone; 29F.1A12) (Bio X cell, The antitumor effect of the combined use of Riverside, NH, USA) (10 mg / kg / day, day1,7, intraperitoneal administration) was evaluated (Fig. 1C).
  • Ad-SGE-REIC (1.0x10 9 ifu / day, day1,4,7) was intratumorally administered only to one-sided tumor, and anti-PD-1 antibody (clone; 29F.1A12) (10 mg / kg /) (day, day1,7, intraperitoneal administration) and anti-VEGFR antibody (clone; DC101) (Bio X cell, Riverside, NH, USA) (5 mg / kg / day *, day1,4,7, intraperitoneal administration) were added.
  • the antitumor effect of the combined use of the three drugs was evaluated (Fig. 1D). * Use a low dose (5 mg / kg / day) for angiogenesis normalization therapy instead of the high dose (40 mg / kg / day) used for angiogenesis suppression therapy.
  • FIG. 3A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 3B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • a significant antitumor effect was observed as compared with the control (Ad-CAG-LacZ) group (Fig. 3A).
  • No significant antitumor effect was observed in the contralateral tumor (Fig. 3B).
  • FIG. 4A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 4B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • No antitumor effect was observed with the anti-PD-1 antibody alone, but the combination of Ad-SGE-REIC and the anti-PD-1 antibody was more significant in the administration side tumor than with the Ad-SGE-REIC single agent group.
  • An antitumor effect was observed in (Fig. 4A). It is considered that the antitumor of Ad-SGE-REIC was enhanced by the combined use of anti-PD-1 antibody. No significant antitumor effect was observed in the contralateral tumor (Fig. 4B).
  • FIG. 5A shows the change in tumor volume on the administration side
  • FIG. 5B shows the change in tumor volume on the opposite side.
  • REIC / Dkk-3 gene and EGFR tyrosine kinase inhibitor are new cancer therapeutic agents for EGFR gene mutation-positive lung cancer. It makes it possible to provide and is extremely useful in industry.

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Abstract

EGFRチロシンキナーゼ阻害薬、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬、分子標的薬をREIC/Dkk-3遺伝子と併用することによりEGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療する方法の提供。　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬、分子標的薬と併用される、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。

Description

ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３遺伝子を含むＥＧＦＲ遺伝子変異陽性肺癌の治療薬
　本発明は、REIC/Dkk-3遺伝子およびEGFRチロシンキナーゼ阻害薬を用いた、EGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療するための併用療法に関し、さらに免疫チェックポイント阻害薬および分子標的薬を用いたEGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療するための併用療法に関する。
　REIC/Dkk-3遺伝子は細胞の不死化に関連していることが知られている。この遺伝子の発現はがん細胞で抑制されていることが報告されている。さらに、REIC/Dkk-3遺伝子ががん治療に用いられていることが報告されている（特許文献１を参照）。
　PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である抗PD-1（Programmed cell death 1)抗体、抗PD-L1（Programmed cell-death ligand 1)抗体等の免疫チェックポイント阻害薬（Immune Checkpoint inhibitor：ICI）は種々の悪性腫瘍に有用であることが知られている。
　EGFR（Epidermal growth factor receptor）遺伝子変異陽性肺癌は、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬（EGFR tyrosine kinase inhibitor: EGFR-TKI）が、薬物療法の第一選択となっているが、治癒することはなくいずれ耐性化する。そのため、新たな治療戦略の開発が必要である。近年、革新的効果をもたらす免疫チェックポイント阻害薬(ICI)が臨床応用され、進行期肺癌の治癒が期待されている。しかしながら、非常に不合理なことに、非喫煙者に多いEGFR遺伝子変異陽性肺癌にICIの効果は乏しく（非特許文献１及び２を参照）、EGFR-TKI耐性後は、細胞障害性抗がん剤が治療の主体となっている。前向き臨床試験のサブセット解析にて、細胞障害性抗がん剤、抗VEGF抗体と併用することでICIがEGFR遺伝子変異陽性肺癌に有効となる可能性が示唆されているものの、現状はEGFR遺伝子変異陽性肺癌対するICIの役割は明確ではない。
　EGFR遺伝子変異陽性肺癌は、EGFR-TKIが奏効するが、治癒することはなく最終的には治療耐性化する。EGFR-TKI耐性後の治療選択肢として、現在は、細胞障害性抗がん剤や、抗PD-1抗体等のICIが使用可能である。しかし、ICIは奏効すれば長期生存が得られる可能性もある治療ではあるが、EGFR遺伝子変異陽性肺癌においてICIの効果が乏しいことが知られている（非特許文献１を参照）。EGFR遺伝子変異陽性肺癌はtumor mutation burdenが低く（非特許文献３を参照）、CD8+腫瘍浸潤リンパ球が少ないとの報告があり（非特許文献４を参照）、免疫原性が低いことがICIの効果が乏しい原因ではないかと推測されている。そのため、免疫原性をいかに高め、ICIの効果を改善させることができるかが、肺癌治療における重要な課題の一つである。
　EGFR遺伝子変異陽性肺癌に対する腫瘍免疫療法の開発は喫緊の課題であるが、動的変化する腫瘍免疫系の評価のため、ヒトEGFR遺伝子変異陽性肺癌の病態を反映したマウスモデルが重要であるが、そのようなモデルがそもそも乏しく、EGFR遺伝子変異陽性肺癌に対する腫瘍免疫については十分に検討されていない現状がある。
　米国ハーバード大学およびメモリアルスロンケタリングのグループは、マウス肺クララ細胞を標的とするCCSPプロモーターによりEGFR遺伝子変異を導入した肺癌マウスモデルを作製している。彼らはマウス肺癌において、EGFRシグナルによりPD-L1発現が誘導されること、また抗PD-1抗体が奏効することを報告している(非特許文献５を参照)。しかしながら、実臨床、ヒト患者においては、EGFR遺伝子変異を有する肺癌にPD-L1の発現は低く、また抗PD-1抗体の効果は乏しいことが複数の臨床試験で示されている（非特許文献１及び２を参照）。
　これらを踏まえると、彼らの肺癌マウスモデルは、実際のヒト患者におけるEGFR遺伝子変異を有する肺腺癌を適切に再現していない可能性がある。そのため、EGFR遺伝子変異を有する肺癌における腫瘍免疫の前臨床研究を行うためには、よりヒトの検体で得られた知見に近似した動物モデルが非常に重要といえる。
　本発明者らは、EGFR遺伝子変異を有する肺癌の病態を理解するため、2型肺胞上皮特異的なSPCプロモーターを利用し免疫能が保持されたC57BL/6ベースのEgfr（マウスEGFR）遺伝子改変（Egfr遺伝子変異陽性）肺癌マウス（C57BL/6/EgfrdelE748-A752）を樹立し特許を取得している（非特許文献６及び特許文献２を参照)。このEgfr遺伝子変異陽性肺癌マウスから腫瘍を摘出し、他のC57BL/6Jマウスの皮下へ生着、繰り返し腫瘍が継代できることも確認している(非特許文献７を参照)。このEgfr遺伝子変異陽性肺癌マウスは、2型肺胞上皮特異的にEgfr遺伝子変異を発現させ、Egfr遺伝子変異に依存した肺腫瘍が発生する。ヒト肺癌と同様にEGFR-TKIに奏効するが治癒することはなく耐性化する。またこのマウス肺腫瘍は、PD-L1の発現がなく、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体の効果が乏しいこともヒトEGFR遺伝子変異肺癌と合致し、より病態を反映したモデルといえる。
　一方、血管内皮因子受容体（VEGFR)に対する抗体は、低用量で血管の正常化に有意に働くことで、エフェクターT細胞の浸潤が促進されることが報告されている（非特許文献８を参照）。
国際公開第WO01/038528号 特許第5255216号公報
Lee et al. J Thorac Oncol, February 01, 2017, vol. 12, no. 2, 403-407 Garon et al. N Engl J Med, May 21, 2015, vol. 372, no. 21, 2018-2028 Offin et al. Clin Cancer Res, February 01, 2019, vol. 25, no. 3, 1063-1069 Sugiyama et al. Sci Immunol, January 31, 2020, vol. 5, no. 43, eaav3937. Akbay et al. Cancer Discov, December, 2013, vol. 3, no. 12, 1355-1363 Ohashi et al. Cancer Sci, September, 2008, vol. 99, no. 9, 1747-1753 Higo et al. Lung Cancer, October 01, 2019, vol. 136, 86-93 Huanga et al. PNAS, October 23, 2012, vol. 109, no. 43, 17561-17566
　本発明は、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬、分子標的薬をREIC/Dkk-3遺伝子と併用することによりEGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療する方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、REIC/Dkk-3とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬（EGFR-TKI）の併用、さらにREIC/Dkk-3と免疫チェックポイント阻害薬の併用、さらにREIC/Dkk-3と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬との併用によるEGFR遺伝子変異陽性肺癌に対する効果について検討を行った。
　本発明者らは、REIC/Dkk-3とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の併用、さらに免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬との併用がEGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療し得ること、これらの医薬の併用によりPD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である抗PD-1抗体などの免疫チェックポイント阻害薬の効果が乏しいEGFR遺伝子変異陽性肺癌に対する新規の腫瘍免疫療法を提供することができることを見出した。このことはREIC/Dkk-3と他の医薬との併用がEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療に有用であることを示す。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
[２]　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
[３]　対象とするEGFR遺伝子変異陽性肺癌が初発癌である、[１]又は[２]の医薬。
[４]　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
[５]　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
[６]　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬と併用される医薬であって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
[７]　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬と併用される医薬であって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
[８]　分子標的薬が、抗VEGFR抗体である、[２]、[３]、[５]及び[７]のいずれかの医薬。
[９]　免疫チェックポイント阻害薬が、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である、[２]～[８]のいずれかの医薬。
[１０]　REIC/Dkk-3遺伝子が、アデノウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、[１]～[９]のいずれかの医薬。
[１１]　局所投与剤の形態にある、[１]～[１０]のいずれかの医薬。
[１２]　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との組合せを含む、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
[１３]　REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬との組合せを含む、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
[１４]　対象とするEGFR遺伝子変異陽性肺癌が初発癌である、[１２]又は[１３]の組合せ医薬キット。
[１５]　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子及び免疫チェックポイント阻害薬との組合せを含む、組合せ医薬キット。
[１６]　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬との組合せを含む、組合せ医薬キット。
[１７]　REIC/Dkk-3遺伝子及び免疫チェックポイント阻害薬との組合せを含む、組合せ医薬キットであって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
[１８]　REIC/Dkk-3遺伝子、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬との組合せを含む、組合せ医薬キットであって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
[１９]　分子標的薬が、抗VEGFR抗体である、[１３]、[１４]、[１６]及び[１８]のいずれかの組合せ医薬キット。
[２０]　免疫チェックポイント阻害薬が、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である、[１３]～[１９]のいずれかの組合せ医薬キット。
[２１]　REIC/Dkk-3遺伝子が、アデノウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、[１２]～[２０]のいずれかの組合せ医薬キット。
[２２]　局所投与剤の形態にある、[１２]～[２１]のいずれかの組合せ医薬キット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-130701号の開示内容を包含する。
　EGFR遺伝子変異陽性肺癌は、EGFR-TKIが奏効するが、治癒することはなく最終的には治療耐性化する。EGFR遺伝子変異陽性肺癌において抗PD-1抗体等の免疫チェックポイント阻害薬の効果は乏しい。REIC/Dkk-3は、がん細胞特異的な細胞死の誘導および免疫活性化作用を持つ。これらの作用は、従来の細胞障害性抗がん剤、分子標的薬による効果と異なる。REIC/Dkk-3とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の併用、さらにPD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬と分子標的薬との併用により、腫瘍免疫賦活させ、局所の抗腫瘍効果を増強させることが可能となる。この併用療法により、局所のみならず全身的な腫瘍免疫の活性化、抗腫瘍効果を増強させることが可能となる。
実施例で行った実験（実験１、実験２、実験３、実験４）における治療薬の投与法を示す図である。 実験１のマウス腫瘍モデルにゲフィチニブ（gefitinib）とREIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスを併用投与した場合の効果を示す図である。 実験２のマウス腫瘍モデルにREIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスを投与した場合の効果を示す図である。図３Ａに投与側腫瘍体積変化を示し、図３Ｂに反対側腫瘍体積変化を示す。 実験３のマウス腫瘍モデルにREIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスと抗PD-1抗体を組合せて投与した場合の効果を示す図である。図４Ａに投与側腫瘍体積変化を示し、図４Ｂに反対側腫瘍体積変化を示す。 実験４のマウス腫瘍モデルにREIC/Dkk-3遺伝子を含むアデノウイルスと抗PD-1抗体と抗VEGFR抗体を組合せて投与した場合の効果を示す図である。図５Ａに投与側腫瘍体積変化を示し、図５Ｂに反対側腫瘍体積変化を示す。 Ad-REIC/Dkk-3の構造の例を示す図である。 Ad-REIC/Dkk-3の配列を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の併用療法においては、REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬を併用し、さらにPD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬と分子標的薬を併用する。
　REIC/Dkk-3 DNAの塩基配列は、配列表の配列番号１に表される。また、REIC/Dkk-3 DNAがコードするREIC/Dkk-3タンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に表される。配列番号１に表される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（NCBI)（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは少なくとも90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、特に好ましくは少なくとも97％以上の配列同一性を有しているDNAはREIC/Dkk-3 DNAに含まれる。
　REIC/Dkk-3の断片ヌクレオチドも使用できる。配列番号１に表わされるREIC/Dkk-3 DNAの塩基配列中の第１番目の塩基に始まり第117番目の塩基～第234番目のいずれかの塩基に終わる塩基配列を含むヌクレオチドの例は、1番目の塩基から117番目の塩基の範囲のポリヌクレオチド（配列番号３）及び1番目の塩基から234番目の塩基の範囲のポリヌクレオチド（配列番号４）を含む。
　REIC/Dkk-3遺伝子は、従来法により被験体に導入することができる。被験体に遺伝子を導入する方法として、ウイルスベクターを用いた方法及び非ウイルスベクターを用いた方法が挙げられる。
　REIC/Dkk-3遺伝子は、上記ウイルスを用いなくとも、プラスミドベクター等遺伝子発現ベクターを導入したリコンビナント発現ベクターを用いて、細胞又は組織に導入することができる。
　遺伝子導入に用いる代表的なウイルスベクターとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びレトロウイルスが挙げられる。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス（HVJ）、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNA又はRNAウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞をそのようなリコンビナントウイルスにより感染させることによって、細胞内に標的遺伝子を導入することが可能である。好ましくは、アデノウイルスベクターを用いる。
　ベクターは、REIC/Dkk-3遺伝子を含むコンストラクトを含む。REIC/Dkk-3 DNAを含むコンストラクトは、適宜、プロモーター、遺伝子転写のためのエンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識及び／又は選別のためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
　該コンストラクトは、REIC/Dkk-3遺伝子と少なくとも１つの第１のプロモーターの下流に位置するポリA付加配列を含み、エンハンサー若しくは第２のプロモーターが該DNAコンストラクトの下流に連結した構造を有する。
　プロモーターはDNAを鋳型に転写を開始するDNA上の特定の塩基配列であり、一般的に、共通の配列を持つ。例えば、大腸菌などの原核生物では、通常、転写開始部位の-10塩基対部位にTATAATG配列を、-35塩基対部位にTTGACA配列を持つ。また、真核生物では、通常、-20塩基対部位にTATAボックスを持つ。本発明の発現用カセットは、発現させようとする遺伝子の上流に必ず第１のプロモーターを有し、また発現させようとする遺伝子の下流に第２のプロモーターを有してもよい。これら第１のプロモーター及び第２のプロモーターとして用いるプロモーターは限定されず、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じであっても異なっていてもよい。あらゆる細胞や組織で外来遺伝子の発現を促進させ得る非特異的プロモーターも組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等の特異的あるいは選択的プロモーターも用いることができる。例えば、第１のプロモーターとして特異的プロモーターを用いて、第２のプロモーターとして、非特異的なプロモーターを用いることができる。本発明において用いるプロモーターとして、癌又は腫瘍特異的プロモーターとしてはhTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、PSA（前立腺特異的抗原）、c-myc、GLUTプロモーターなどが、ES細胞・癌幹細胞特異的プロモーターとしてはOCT3/4、NANOGプロモーターなどが、神経幹細胞特異的プロモーターとしてはNestinプロモーターなどが、細胞ストレス感知プロモーターとしてはHSP70、HSP90、p53プロモーターなどが、肝細胞特異的プロモーターとしてはアルブミンプロモーターなどが、放射線感受性プロモーターとしてはTNF-alphaプロモーターなどが、感染プラスミドのコピー数を上げるプロモーターとしてはSV40プロモーターなどが、増殖性細胞特異的プロモーターとしてEF1-alphaプロモーターなどが挙げられる。さらに具体的には、例えば、第１のプロモーターとして、CMV-iプロモーター（hCMV + イントロンプロモーター）、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、第２のプロモーターとしてCMVプロモーター等が用いられる。βアクチンプロモーターの由来動物種は限定されず、哺乳類βアクチンプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーターやニワトリアクチンプロモーターが用いられる。また、上記のCMV-iプロモーター等の人工的なハイブリッドプロモーターを用いることもできる。CMV-iプロモーターは、例えば、米国特許第5,168,062号明細書や米国特許第5,385,839号明細書の記載に基づいて合成することができる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いてもよい。コアプロモーターとは、正確な転写開始を導く働きをもつプロモーター領域をいい、TATAボックスを含むことがある。上記のプロモーターのうち、hTERTプロモーター等の癌及び／又は腫瘍特異的プロモーターは、癌をターゲットとして遺伝子発現による遺伝子治療、癌診断用に好適に用いることができる。
　ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。BGAポリA付加配列の塩基配列は配列番号５に示す塩基配列の13番目の塩基以降の配列に示される。
　エンハンサーは、転写により生成するメッセンジャーRNA(mRNA)の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。エンハンサーはプロモーターの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には100bp前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。本発明で用いられるエンハンサーは１種類でもよいが、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。また、異なる複数のエンハンサーを用いる場合、その順番は限定されない。例えば、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー等を用いることができる。一例として、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。
　さらに発現させようとするタンパク質をコードするDNA及びポリA付加配列を含むDNAコンストラクトの上流に複数のエンハンサー、例えば１～４個のエンハンサーが連結されていてもよい。この上流に連結するエンハンサーは限定されないが、CMVエンハンサーが好ましい。例えば、CMVエンハンサーを４つ連結した４×CMVエンハンサー等があげられる。
　エンハンサーを「プロモーター－発現させようとする遺伝子－poly A付加配列」からなるDNAコンストラクトのすぐ下流に挿入すると、従来の一般の遺伝子発現システムと比べて、強力な発現させようとする遺伝子のタンパク質発現が可能となる。
　特に、CMV -iプロモーターとCMVエンハンサーの組合せにより、ほぼ全ての細胞（宿主細胞）において、あらゆる遺伝子を挿入した場合に、如何なるトランスフェクション試薬を用いた場合においても、発現させようとする遺伝子の強力なタンパク質発現が可能となる。
　さらに、RU5’が発現させようとするタンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。RU5'はHTLV由来のLTRで、挿入することにより、タンパク質発現を上昇させるエレメントである（Mol.Cell.Biol.,Vol.8(1),pp.466-472,1988）。RU5'を報告されているのと逆に挿入することにより、プロモーターのエンハンサー挿入による発現増強効果が打ち消されることがある。
　さらに、エンハンサー及び／又はプロモーターの直ぐ上流にUASが連結されていてもよい。UASとは、GAL4遺伝子の結合領域であり、後にGAL4遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇させられる。
　さらに、発現用カセットの最上流にSV40-oriが連結されていてもよい。SV40-oriはSV40遺伝子の結合領域であり、SV40遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇する。上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
　上記DNAコンストラクトは、REIC/Dkk-3 DNAの上流にCMV（cytomegalovirus）プロモーターが連結され、REIC/Dkk-3 DNAの下流に、ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）が連結される。さらに、該ポリA付加配列の下流にhTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMV（cytomegalovirus）エンハンサーをこの順で連結したもの（３×enh)が連結されている。すなわち、上記DNAコンストラクトは、5'末端側から(i) CMVプロモーター、(ii) REIC/Dkk-3 DNA、(iii) polyA付加配列、並びに(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結したコンストラクトである。
　本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトのCMVプロモーターを除く部分の配列を図７及び配列番号６に示す。図７中、REIC/Dkk-3 DNAと3×enhの間にBGA polyA配列が含まれる。本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトは配列番号６に示す配列の上流（5'側）にCMVプロモーターを有する。配列番号７に上記コンストラクトに含まれるBGH poly Aと３つのエンハンサーを含む領域の塩基配列を示す。図７の塩基配列中の（１）及び（２）の枠で囲んだ部分は、それぞれREIC/Dkk-3タンパク質をコードするDNA及び３つのエンハンサー（3xenh)を示す。
　上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
　上記の発現用カセットは、例えば、市販のCMVプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位を含み、さらにその下流にBGA polyA配列を含むpShuttleベクター（Clontech社）にREIC/Dkk-3 DNAを挿入し、さらにBGA polyA配列の下流にhTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結することにより得ることができる。
　REIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトは、
[1]　5'末端側から、
(i) CMVプロモーター;
(ii) 以下のREIC/Dkk-3 DNA:
(a)　配列番号１に表される塩基配列からなるDNA、若しくは
(b)　配列番号１に表される塩基配列と少なくとも90％、95％、97％又は98％の配列同一性を有するDNA、
(iii) polyA付加配列；並びに
(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した、REIC/Dkk-3タンパク質を発現させるためのDNAコンストラクト。
[２]　polyA付加配列がウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列（BGA polyA)である、[１]のDNAコンストラクト。
[３]　配列番号６に示す、(ii) REIC/Dkk-3 DNA、(iii) polyA付加配列、及び(iv) hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーを連結した塩基配列を含む、[１]又は[２]のDNAコンストラクト。
　DNAコンストラクトは、例えば、国際公開第WO2011/062298号、米国特許出願公開第2012/0309050号明細書、国際公開第WO2012/161352号及び米国特許出願公開第2014/0147917号明細書の記載に従って、調製することができる。
　本発明において、REIC/Dkk-3 DNAを含むアデノウイルスベクターを「Ad-REIC」又は「Ad-REIC/Dkk-3」と呼ぶ。
　本発明のDNAコンストラクトを含むベクターシステムをSGE(Super Gene Expression)システムと呼び、例えば、REIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトを含むアデノウイルスベクターをAd5-SGE-REIC/Dkk-3（Ad-SGE-REIC)と呼ぶ。図６は、Ad-REIC/Dkk-3の構造を例示し、図７はAd-REIC/Dkk-3の配列を例示する。
　上記のDNAコンストラクトを含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターに上記DNAコンストラクトを導入して組換えアデノウイルスを作製することにより得られる。アデノウイルスへのDNAコンストラクトの導入は、例えば上記の本発明のDNAコンストラクトを含むpShuttleベクター中のDNAコンストラクトをアデノウイルスに導入することにより行うことができる。
　アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（10～11 pfu/mL以上）のウイルスが得られる、（４）in vivoの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。
　遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、E1/E3領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Miyake,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996）から、E1/E3領域に加え、E2若しくはE4領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Lieber,A.,et al.,J.Virol.,70,8944,1996;Mizuguchi,H.&Kay,M.A.,Hum.Gene Ther.,10,2013,1999）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（GUTLESS）第３世代のアデノウイルスベクター（Steinwaerder,D.S.,et al.,J.Virol.,73,9303,1999）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウイルスベクターも使用可能である。
　本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むDNAコンストラクトを含む組換えアデノウイルスベクター（以下、単に「本発明のアデノウイルスベクター」という場合がある）をヒトやその他の哺乳動物である被験体に投与することにより、被験体のがん細胞にがん治療用遺伝子がデリバリーされ、がん細胞中で遺伝子が発現し、腫瘍細胞増殖を抑制しがん治療効果を発揮する。
　本発明のアデノウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
　本発明のアデノウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、本発明のアデノウイルスベクターを、0.3×1010～3×1012vp(ウイルス粒子数)の量を腫瘍内に局所投与すればよい。
　本発明において、REIC/Dkk-3遺伝子又はREIC/Dkk-3 DNAを用いるという場合、REIC/Dkk-3 DNAを含むREIC/Dkk-3 DNAアデノウイルスベクター（Ad-REIC)として用いる場合も含む。
　免疫チェックポイント阻害薬は抗PD-1(Programmed cell death 1)抗体、抗PD-L1(Programmed cell-death ligand 1)抗体等を含む。抗PD-1（Programmed cell death 1）抗体および抗PD-L1（Programmed cell-death ligand 1）抗体等のPD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である。PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路は、PD-1/PD-L1などの免疫チェックポイント分子を介して、T細胞の活性化を妨げることによって免疫系をダウンレギュレートする。また、これら免疫チェックポイント分子は、リンパ節における抗原特異的T細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進し、制御性T細胞（Treg）のアポトーシスを減少させることが知られている。
　分子標的薬とは、がん細胞表面に存在するタンパク質や遺伝子を標的としてがん細胞を攻撃する薬剤である。
　本発明においては、分子標的薬として、EGFR(epidermal growth factor receptor)に対するチロシンキナーゼ阻害作用を有するゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブなどの化合物、ならびに血管内皮因子受容体（VEGFR)に対する抗体や血管内皮増殖因子（VEGF）が選択される。特に、血管内皮因子受容体（VEGFR)に対する抗体は、高用量（臨床使用量）では血管新生抑制療法としての血管傷害作用が前面に出る一方，低用量では血管の正常化に有意に働くことで，腫瘍組織内へのエフェクターT細胞の浸潤が促進され、Ad-REICによる間接効果（全身効果）を相乗的に増強する効果が期待される（文献：Yuhui Huanga et al. PNAS | October 23, 2012 | vol. 109 | no. 43 | 17561-17566）本発明においては、EGFRに対するチロシンキナーゼ阻害作用を有する分子標的薬をEGFRチロシンキナーゼ阻害薬と呼ぶ。抗VEGFR抗体として、ラムシルマブ（商品名：サイラムザ）、抗VEGF抗体として、ベバシズマブ（商品名：アバスチン）が挙げられる。
　本発明においては、EGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療対象とする。EGFR遺伝子変異陽性肺癌は、肺がんの中でも非小細胞肺がんでみられるEGFR遺伝子変異が陽性であるがんである。EGFR遺伝子変異陽性肺癌はがん免疫療法が効きにくいことが報告されている。EGFR遺伝子変異は、EGFR遺伝子変異シグナルを活性化させることで発がんに寄与している遺伝子変異である。従来は、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬を用いて治療を行っていたが、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬に耐性を獲得した肺がん細胞が出現することにより治療に対して抵抗性になるという問題があった。
　本発明においては、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌、再発癌に対して、REIC/Dkk-3遺伝子、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬、分子標的薬を適宜組合せて用いて、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療を可能にする。ここでEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌とは、初めてEGFR遺伝子変異陽性肺癌と診断された癌をいい、再発癌とは初発癌に対して治療を行った後に再度出現した癌をいう。より具体的には、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌とは、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療歴のないEGFR遺伝子変異陽性肺癌をいい、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の再発癌とはEGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療後にEGFRチロシンキナーゼ阻害薬に対して耐性を獲得したEGFR遺伝子変異陽性肺癌をいう。
　本発明においては、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌に対してREIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬を併用して治療する。REIC/Dkk-3と併用することによりEGFRチロシンキナーゼ阻害薬単独で治療した場合に比べ、腫瘍がより縮小し、がん抗原特異的細胞傷害性CD8陽性T細胞(CTL)を誘導することができ、良好な治療効果としての再発抑制効果を得ることが期待できる。
　EGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌に対してREIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬を併用しても十分な治療効果が得られない場合や再発した場合には、REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療の後に、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬の２剤を併用して治療するか、あるいはREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の３剤を併用して治療すればよい。３剤を併用した場合、２剤の併用よりもより大きな治療効果を得ることができる。
　一方、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の再発癌に対しては、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬の２剤を併用して治療するか、あるいはREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の３剤を併用して治療すればよい。３剤を併用した場合、２剤の併用よりもより大きな治療効果を得ることができる。
　上記のように、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬、分子標的薬をREIC/Dkk-3遺伝子と併用した場合、がんの治療効果が顕著に向上するだけではなく、これらの薬の使用量を大幅に減量することが可能になり、その結果として、抗がん剤の副作用を軽減することができる。
　また、化学療法薬を用いる場合、がん細胞が化学療法薬に抵抗性（耐性）を示すことがある。REIC/Dkk-3遺伝子と併用した場合、がん細胞の化学療法剤に対する耐性化を効果的に抑制することが可能である。
　免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬は、公知の方法で投与することができ、それぞれの薬剤の添付文書の記載に従って投与すればよい。例えば、投与量は、症状、年齢、体重および他の状態により変化する。0.001mg～2000mg、好ましくは１mg～1500mg、さらに好ましくは５mg～1000mgの用量を一日１回又は数回に分けて、数日、数週間または数ヶ月の間隔で、投与することができる。
　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬を併用する場合、REIC/Dkk-3遺伝子はEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の投与と同時に、別々に又は連続して投与することができる。REIC/Dkk-3遺伝子は、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬の投与前又は投与後に投与することもできる。好ましくは、REIC/Dkk-3遺伝子は、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬と同時に投与される。同時に投与する場合、別々の製剤として投与することもできるし、REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の両方を含む抗がん組成物として投与することもできる。
　免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬を併用する場合、REIC/Dkk-3遺伝子は免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬の投与と同時に、別々に又は連続して投与することができる。REIC/Dkk-3遺伝子は、免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬の投与前又は投与後に投与することもできる。好ましくは、REIC/Dkk-3遺伝子は、免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬と同時に投与される。同時に投与する場合、別々の製剤として投与することもできるし、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬の両方を含む抗がん組成物として投与することもできる。なお、血管内皮因子受容体（VEGFR)に対する抗体は、高用量（臨床使用量）での血管新生抑制療法としての使用の他に、低用量での血管正常化療法としてREIC/Dkk-3遺伝子との併用療法として使用できる。後者の場合は、腫瘍組織内へのエフェクターT細胞の浸潤を促進することが報告されており（文献：Yuhui Huanga et al. PNAS | October 23, 2012 | vol. 109 | no. 43 | 17561-17566）、REIC/Dkk-3遺伝子で誘導されるエフェクターT細胞であるCTL（細胞傷害性Ｔリンパ球）の腫瘍内浸潤が促進されることによる間接効果（全身効果）を増強する効果が期待される（実験４）。つまり、抗VEGFR抗体として、ラムシルマブ（商品名：サイラムザ）については、臨床推奨用量よりも低い投与量で投与することができる。
　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬、REIC/Dkk-3遺伝子、免疫チェックポイント阻害薬若しくは分子標的薬、又はREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の２種又は３種を含む組成物の投与形態は限定されず、皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射により、投与することができる。EGFRチロシンキナーゼ阻害薬は経口投与する。全身投与剤でも局所投与剤でもよいが、好ましくは、REIC/Dkk-3遺伝子はがん部位を標的とした局所投与剤であり、併用する免疫チェックポイント阻害薬又は分子標的薬は、全身投与剤又は局所投与剤である。
　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬、REIC/Dkk-3遺伝子、免疫チェックポイント阻害薬若しくは分子標的薬、又はREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の２種又は３種を含む組成物は、製剤の分野で一般的に用いられる担体、希釈剤及び賦形剤を含有する。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ブドウ糖、ガラクトース、マンノース、フルクトースなどの単糖類（エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコールを含む）、ラクトース、マルトース、スクロース、トレハロースなどの二糖類（ラクチトール、マルチトールなどの糖アルコールを含む）の他、オリゴ糖、多糖類（増粘多糖類、澱粉、粉末セルロース、微結晶セルロース、デキストリン、デキストラン、マルトデキストリン、イソマルトデキストリンなどを含む）、更には、炭酸カルシウム、カオリン、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖などの前記糖類やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。前記担体、希釈剤及び賦形剤はそれぞれ、単独又はそれらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　REIC/Dkk-3遺伝子によってコードされるREIC/Dkk-3タンパク質は、抗がん免疫系をアップレギュレートすることによってがんを治療又は予防することができる。さらに、がん細胞のアポトーシスをも誘導する。具体的には、REIC/Dkk-3タンパク質はCTL（細胞傷害性Ｔリンパ球）を誘導し、CTLは全身のがん細胞を攻撃する。
　CTLによって攻撃されたがん細胞は防御機能としてPD-L1を発現するが、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬は、がん細胞の防御機能を阻害する。分子標的薬はがん細胞表面に存在するタンパク質や遺伝子を標的としてがん細胞を直接攻撃する。
　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の併用、さらに免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬との併用は、がんの治療において相乗的効果を発揮する。REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の併用、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬の併用は、それぞれ薬剤の単独よりもがんの治療に有効である。
　本発明は、REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の２剤、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬の２剤、あるいはREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の３剤を含む組合せ、組合せ製剤又は組合せ医薬キットを含む。
　本発明はまた、がんを治療するための医薬品の製造におけるREIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の２剤、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬の２剤、あるいはREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の３剤を組合せる方法を含む。
　本発明はまた、REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬の２剤、REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬の２剤、あるいはREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬の３剤を含む医薬を含む。
　さらに、本発明は、EGFRチロシンキナーゼと併用するための、免疫チェックポイント阻害薬と併用するための、又は免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬と併用するためのREIC/Dkk-3遺伝子を含む。
　さらに、本発明は、上記医薬を用いて、EGFR遺伝子変異陽性肺癌を治療する方法を包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
Egfr遺伝子変異陽性肺癌モデルマウスにおける治療実験
＜材料と方法＞
アデノウイルスベクターの構築と生産
　ヒトREIC/Dkk-3遺伝子の全長相補的DNAをコスミドベクターpAxCAwtに組み込み、そしてCOS-TPC法（Takara Bio、Shiga、Japan）に従ってアデノウイルスベクターに移した。次に、挿入されたREIC/Dkk-3遺伝子のポリA配列の後に、hTERT、SV40、及びCMVの3つのエンハンサーを追加し、REIC/Dkk-3遺伝子を導入したアデノウイルスベクター（Ad-REIC）を得た。一方、LacZ遺伝子を導入したアデノウイルスベクター（Ad-LacZ）を対照ベクターとして使用した。
皮下腫瘍モデルの作製
　Egfr遺伝子変異陽性肺癌マウス（C57BL/6/EgfrdelE748-A752）（Ohash K.,et al.,Cancer Sci., 99, 1747,2008）の肺癌細胞をC57BL/6Jの両背部皮下に移植した皮下腫瘍モデルを作製（Higo,H.,et al.,Lung Cancer.,136,86,2019）し、腫瘍体積が約100-150mm3に達した時点で、下記4つの実験を施行した（図１）。
＜実験１＞　ゲフィチニブ（gefitinib）(50mg/kg/day,連日14日、経口投与)し、片側腫瘍にのみAd-SGE-REIC*（1.0x109ifu/day，day1,4,7,15,18）を腫瘍内投与し抗腫瘍効果を評価した（図１Ａ）。
＊Ad-SGE-REIC：E1領域を欠き複製能力を持たないアデノウイルス5型ベクターに、REIC/Dkk-3遺伝子を組込んだ製剤。腫瘍内に投与することでREICをがん細胞に強制発現させる。
＜実験２＞片側腫瘍にのみAd-SGE-REIC（1.0x109ifu/day，day1,8）、もしくはcontrol群としてAd-CAG-LacZ*（1.0x109ifu/day，day1,8）を腫瘍内投与し抗腫瘍効果を評価した（図１Ｂ）。
＊Ad-CAG-LacZ：REIC/Dkk-3遺伝子を含まないアデノウイルスベクター製剤
＜実験３＞片側腫瘍にのみAd-SGE-REIC（1.0x109ifu/day，day1,4,7）を腫瘍内投与し、抗PD-1抗体（clone; 29F.1A12）( Bio X cell, Lebanon, NH, USA)（10mg/kg/day，day1,7，腹腔内投与）の併用による抗腫瘍効果を評価した（図１Ｃ）。
＜実験４＞片側腫瘍にのみAd-SGE-REIC（1.0x109ifu/day，day1,4,7）を腫瘍内投与し、抗PD-1抗体（clone; 29F.1A12）（10mg/kg/day，day1,7，腹腔内投与）および抗VEGFR抗体（clone;DC101）(Bio X cell, Lebanon, NH, USA)（5mg/kg/day*，day1,4,7，腹腔内投与）を加えた3剤併用による抗腫瘍効果を評価した（図１Ｄ）。
＊血管新生抑制療法として使用される高用量（40mg/kg/day）ではなく、血管正常化療法として低用量（5mg/kg/day）を使用。
結果
＜実験１＞
　ゲフィチニブ（gefitinib）投与により両側腫瘍の増殖は抑制されるが、投与終了とともに腫瘍の再増殖が認められた。Ad-SGE-REIC投与側腫瘍は明らかな縮小効果を示し、再増殖は有意に抑制された。Ad-SGE-REIC投与群の反対側腫瘍では併用による有意な抗腫瘍効果は認めなかった（図２）。
 ＜実験２＞図３Ａに投与側腫瘍体積変化を示し、図３Ｂに反対側腫瘍体積変化を示す。Ad-SGE-REIC投与側腫瘍において、control（Ad-CAG-LacZ）群と比較し有意に抗腫瘍効果を認めた（図３Ａ）。反対側腫瘍では有意な抗腫瘍効果は認めなかった（図３Ｂ）。
＜実験３＞図４Ａに投与側腫瘍体積変化を示し、図４Ｂに反対側腫瘍体積変化を示す。抗PD-1抗体単剤では抗腫瘍効果を認めなかったが、Ad-SGE-REICと抗PD-1抗体を併用することで、投与側腫瘍においてAd-SGE-REIC単剤投与群よりも有意に抗腫瘍効果を認めた（図４Ａ）。抗PD-1抗体を併用することでAd-SGE-REICの抗腫瘍が増強したと考えられる。反対側腫瘍では有意な抗腫瘍効果は認めなかった（図４Ｂ）。
＜実験４＞図５Ａに投与側腫瘍体積変化を示し、図５Ｂに反対側腫瘍体積変化を示す。Ad-SGE-REIC、抗PD-1抗体、抗VEGFR抗体3剤を併用することで，Ad-SGE-REIC投与側腫瘍のみならず（図５Ａ）、反対側腫瘍においても、抗腫瘍効果を認めるようになった（図５Ｂ）。
　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用、さらにREIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬と分子標的薬との併用はEGFR遺伝子変異陽性肺癌に対する新たながん治療薬の提供を可能にするものであり、産業上極めて有用である。
５～７　合成
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (22)

  1. 　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
  2. 　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
  3. 　対象とするEGFR遺伝子変異陽性肺癌が初発癌である、請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
  5. 　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬と併用されるEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
  6. 　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬と併用される医薬であって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
  7. 　REIC/Dkk-3遺伝子を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬と併用される医薬であって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための医薬。
  8. 　分子標的薬が、抗VEGFR抗体である、請求項２、３、５及び７のいずれか１項に記載の医薬。
  9. 　免疫チェックポイント阻害薬が、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である、請求項２～８のいずれか１項に記載の医薬。
  10. 　REIC/Dkk-3遺伝子が、アデノウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬。
  11. 　局所投与剤の形態にある、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬。
  12. 　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との組合せを含む、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
  13. 　REIC/Dkk-3遺伝子と免疫チェックポイント阻害薬及び／又は分子標的薬との組合せを含む、EGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
  14. 　対象とするEGFR遺伝子変異陽性肺癌が初発癌である、請求項１２又は１３記載の組合せ医薬キット。
  15. 　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子及び免疫チェックポイント阻害薬との組合せを含む、組合せ医薬キット。
  16. 　REIC/Dkk-3遺伝子とEGFRチロシンキナーゼ阻害薬との併用治療を行った後のEGFR遺伝子変異陽性肺癌の初発癌患者に投与するための、REIC/Dkk-3遺伝子、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬との組合せを含む、組合せ医薬キット。
  17. 　REIC/Dkk-3遺伝子及び免疫チェックポイント阻害薬との組合せを含む、組合せ医薬キットであって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
  18. 　REIC/Dkk-3遺伝子、免疫チェックポイント阻害薬及び分子標的薬との組合せを含む、組合せ医薬キットであって、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬による治療を受けた後に再発したEGFR遺伝子変異陽性肺癌の治療のための組合せ医薬キット。
  19. 　分子標的薬が、抗VEGFR抗体である、請求項１３、１４、１６及び１８のいずれか１項に記載の組合せ医薬キット。
  20. 　免疫チェックポイント阻害薬が、PD-1/PD-L1免疫チェックポイント経路阻害薬である、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の組合せ医薬キット。
  21. 　REIC/Dkk-3遺伝子が、アデノウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の組合せ医薬キット。
  22. 　局所投与剤の形態にある、請求項１２～２１のいずれか１項に記載の組合せ医薬キット。
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