KR20230004561A - 종양을 병용 치료하는 종양 용해성 바이러스와 면역 관문 억제제 - Google Patents

종양을 병용 치료하는 종양 용해성 바이러스와 면역 관문 억제제 Download PDF

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허 양
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Abstract

본 출원은 종양 치료 약물에 관한 것이다. 수포성 구내염 바이러스 야생형 바이러스 기질 단백질 M에 대한 부위 지정 돌연변이 통해, 새로운 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 제공하고, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기초 상에서, 약독화 균주에 외인성 유전자를 삽입하여 종양 용해성 바이러스 백신을 제공한다. 상기 종양 용해성 바이러스 백신과 면역 관문 억제제를 병용하여 다양한 종양을 효과적으로 치료할 수 있는 약물을 제공한다.

Description

종양을 병용 치료하는 종양 용해성 바이러스와 면역 관문 억제제
본 출원은 생물 의약분야에 관한 것으로, 구체적으로 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 면역 관문 억제제를 사용하여 제조된 항종양 또는 암 치료 약물 조합에 관한 것이다.
현재, 악성 종양(암)은 중국 인구의 건강을 심각하게 위협하는 주요 공중 보건 문제에서의 하나가 되었다. 기존의 암 치료 방법은, 주로 수술, 화학요법, 방사선요법 및 분자 표적 치료 등이 있지만 기존의 치료 수단은 종양의 재발과 전이에 효과가 유의하지 않다.
기존의 연구에 따르면, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)는 면역 응답을 촉진하는 새로운 종양백신담체로 사용되어 종양 치료에 적용될 수 있다. VSV는 뉴클레오캡시드 단백질(N), 인단백질(P), 기질 단백질(M), 당단백질(G) 및 대형 중합 효소 단백질(L)과 같은 5가지 단백질을 인코딩하는 게놈 크기가 11kb인 원형 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 현재 연구개발 중인 다른 종양 용해성 바이러스 플랫폼에 비해 VSV게놈이 작고, 조작이 용이하며; 복제 시간이 더 짧고; 독립적인 세포주기가 있으며; 광범위한 세포계에서 빠르게 성장하고, 역가가 높아, 대규모 생산이 가능하며; 숙주 세포의세포질 복제는 형질전환의 위험이 없다. 이러한 종양 용해성 바이러스는 DNA에 통합되지 않고, 약독화 되어야 생형 바이러스로 인한 신경계 염증을 방지할 수 있다. 따라서, VSV는종양 면역 치료에서 큰 잠재력을 갖는다.
그러나 VSV만을 사용하여 종양 면역 치료를 수행하면 치료 반응률이 만족스럽지 않다. 따라서, VSV와 다른 치료 방법의 병용에 관한 연구도 점점 증가하고 있다. 유두종 마우스 모델의 연구에 따르면, VSV와 종양 백신의 결합은 항종양 효과를 유의하게 향상시키는 것을 발견하였다. 미네소타대학교 의학원의 Manish R. Patel 등은 JAK/STAT억제제(Ruxolitinib)와 VSV-IFNβ를 결합하여 폐암 치료에 사용한 결과, Ruxolitinib과 VSV-IFNβ를 결합하여 우수한 종양 용해성 치료 효과를 획득하였음을 발표하였다. 다양한 사이토카인 무장 종양 용해성 바이러스는 CAR-T세포 요법과 병용되기도 하고; 이종이식 종양 모델에서, 이러한 결합 전략은 항종양 활성을 향상시켰다.
현재, 프로그램된 사멸 단백질-1(Programmed death 1, PD-1) 및 이의 리간드PD-L1(programmed death ligand 1)과 같은 면역 관문 억제제를 종양 치료에 적용하여 면역 치료가 혁신적인 진전을 이루었다. 불행히도, 대부분의 환자는 PD-1 또는 PD-L1의 항체 치료에 민감하지 않고, 대부분의 민감한 환자는 치료 후 완전히 완화되지 않았다.
PD-1 또는 PD-L1항체 치료는 종양 침윤 림프구(TILs) 수치가 높고, 돌연변이 부담이 높으며 PD-L1 발현이 증가된 종양에 적용될 경우, 항종양 작용이 가장 강하다. 이러한 응답성 종양은 면역학적으로 "열성종양"으로 지칭되고; 대조적으로 응답이 부족한 "저온성 종양"이다. 연구에 따르면, "저온성 종양"은 PD-1 또는 PD-L1항체에 의해 치료될 수 없고, 주로종양 관련 항원(TAAs) 발현 및/또는 제시의 부족, 낮은 밀도의 TILs, 면역 세포 하위 집합(예를 들어 호중구, 대식세포, 조절성 T세포, 골수 유래 억제 세포 및 자연 살해 세포)의 침윤 억제, 및 면역 억제 물질(예: IL-10, indoleamine-2,3-dioxygenase, CD73, PD-L1 및 prostaglandin E2)의 발현 부족에 기인한다. 이상의 연구를 가반으로, "저온성 종양" 을 "열성종양"으로 변환하는 것이 항PD-1 또는 PD-L1항체 치료를 개선하는 연구 핫이슈가 되었다. 여기서, 종양 용해성 바이러스는PD-1 또는 PD-L1항체 치료에 대한 환자 및 일부 종양 유형의 응답을 향상시키는 이상적인 치료 경로이다.
종합해보면, 기존의 연구는 VSV와 PD-1 또는 PD-L1항체를 병용하여 종양을 치료하는 것이 가능하도록 한다. 그러나 VSV와 PD-1 또는 PD-L1항체를 병용하여 종양 면역 치료를 수행할 경우, 여전히 다음과 같은 문제가 존재한다. (1)VSV야생형 균주 또는 약독화 균주를PD-1 또는 PD-L1항체와 병용하면, 치유율이 높지 않고, 한가지 요법을 단독으로 사용하는 경우에 비해 효과가 유의하게 향상되지 않으며; (2)야생형 VSV는 여전히 일정한 안전 위험이 존재하고, 현재 설치류 동물에 대하여 강한 신경 독성이 있는 것으로 알려졌으며, 임상 사용을 고려하여 질병의 위험을 보다 줄이기 위해 유전자 변형이 필요하고; (3)무작위 유전자 변형은, 종양 용해 효과가 좋지 않을 수 있거나, 성공적으로 포장되지 않을 수 있어 재조합 바이러스를 전혀 제조할 수 없다.
따라서, 안전성이 우수하고, 치유율이 높은 VSV재조합 바이러스를 제공하며, 이를PD-1 또는 PD-L1항체 또는 다른 면역 관문 억제제(예를 들어: CTLA-4, LAG-3, TIM-3의 항체 등)와 약물로서 병용하여 종양 면역 치료 분야에서 중요한 과학적 연구 가치와 응용 의미를 갖는다.
본 발명의 목적은 종양 치료 약물을 제공하고; 구체적으로, 종양 용해성 바이러스 백신과 면역 관문 억제제(예: PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, SIGLEC15의 항체 등)를 병용하여 종양을 치료하는 약물을 제공한다.
상기 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서 사용된 기술적 해결수단은, 항종양 또는 암 치료 약물로서, 상기 약물은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 면역 관문 억제제를 동시에 포함하고; 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 제조 방법은 다음과 같다. 종양 용해성 바이러스의 기질 단백질M을 변형시키고, 변형된 기질 단백질 M의 유전자 서열은 SEQ ID NO 3로 표시된다.
바람직하게, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주는 VSV MuddSummer 아형 균주를 기반으로 하고, 적어도 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이; 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이; 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이와 같은 위치 지정 유전자 돌연변이를 수행한 후 수득된다.
바람직하게, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 종양 용해성 바이러스 백신으로 제조한 후, 약물로 제조한다.
바람직하게, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조된다.
바람직하게, 상기 항원은 특이성 종양 항원이다.
바람직하게, 상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3, 글리피칸3에서의 임의의 하나이다.
바람직하게, 상기 면역 관문 억제제는 anti-PD-1항체, anti-PD-L1항체, anti-CTLA4항체, anti-LAG-3항체, anti-TIM-3항체, anti-SIGLEC15항체에서의 임의의 하나이다.
바람직하게, 상기 면역 관문 억제제는 상기 종양 용해성 바이러스 백신 이전에 체내에서 방출된다.
바람직하게, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종에서의 임의의 하나이다.
본 발명은 이하의 유리한 효과를 갖는다. 발명은 종양 용해성 바이러스 백신과 면역 관문 억제제 (예: PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, SIGLEC15의 항체 등)를 병용하여 종양을 치료하는 약물을 제공한다. 상기 약물은 다양한 종양을 효과적으로 치료할 수 있고; 마우스의 폐암 모델에서, 치유율은 놀라운 87.5%에 도달할 수 있으며, 큰 종양에도 보다 우수한 치료 효과가 있다.
한편으로, 본 출원은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약물 조합을 제공하는데, 여기서 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 VSV MuddSummer 아형 균주와 비교하여 기질 단백질M이 변형되고, 상기 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 아미노산 사이트의 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 아미노산 사이트의 226번째 세린이 아르기닌으로 돌연변이된 아미노산 돌연변이를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M의 변형은 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이; 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이이다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질 M은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에서의 임의의 하나를 갖는다.
다른 한편으로, 본 출원은 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약물 조합을 더 제공하는데, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 사용하여 제조된다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조된다.
일부 실시형태에서, 상기 항원은 특이성 종양 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3 및 글리피칸3에서의 임의의 하나로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 상기 약물 조합의 상기 면역 관문 억제제는 anti-PD-1항체, anti-PD-L1항체, anti-CTLA4항체, anti-LAG-3항체, anti-TIM-3항체 및 anti-SIGLEC15항체에서의 임의의 하나로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 면역 관문 억제제는 상기 종양 용해성 바이러스 백신 이전에 체내에서 방출된다.
일부 실시형태에서, 상기 약물 조합은 항종양 또는 암 치료가 가능하다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종 및 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나로부터 선택된다.
다른 한편으로, 본 출원은 항종양 또는 종양 치료 약물의 제조에서의 상기 약물 조합의 응용을 더 제공한다.
본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이하의 상세한 설명으로부터 본 출원의 다른 측면 및 이점을 용이하게 인식할 수 있다. 이하의 상세한 설명은 본 출원의 예시적인 실시형태만을 도시하고 설명한다. 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 출원의 내용은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 출원과 관련된 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 구체적인 실시형태를 변경할 수 있다는 것을 알 수 있다. 상응하게, 본 출원의 첨부 도면 및 명세서의 설명은 단지 예시적일뿐 제한적이지 않다.
본 출원에 관련된 발명의 구체적인 특징은 첨부된 특허청구범위에 의해 나타난다. 이하의 상세한 설명의 예시적인 실시형태 및 첨부 도면을 참조하여 본 출원과 관련된 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있다. 첨부 도면에 대해 다음과 같이 간략하게 설명한다.
도 1a-도 1b는 체외의 LLC세포 및 MEF세포에서 각 약독화 균주의 복제 능력 모식도이다.
도 2a-도 2b는 체외의 LLC세포 및 Hela세포에 대한 각 약독화 균주의 사멸 능력 모식도이다.
도 3은 체외의 MEF세포에 대한 각 약독화 균주의 사멸 능력 모식도이다.
도 4a-도 4b는 체외 LLC세포 및 MEF세포에서 IFN-β의 발현 수준에 대한 각 약독화 균주에 미치는 영향 모식도이다.
도 5는 종양 용해성 바이러스 백신의 구성 모식도이다.
도 6은 각 약독화 균주가 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 7은 각 백신이 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 8은 실험 종료 시, 각 약독화 균주 및 백신으로 처리된 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 9는 각 약독화 균주 및 백신이 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 10은 각 백신이 마우스 체내에서 마우스 체내에서 섬유육종(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 11은 실험 종료 시, 각 백신으로 처리된 마우스 체내에서 섬유육종(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 12는 각 백신이 마우스 체내에서 흑색종(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 13은 실험 종료 시, 각 백신으로 처리된 마우스 체내에서 흑색종(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 14는 상이한 투여량의 JBS004가 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 15는 실험 종료 시, 상이한 투여량의 JBS004로 처리된 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 16은 상이한 투여량의 JBS004가 마우스 체내에서 비-소세포성 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 17은 상이한 투여량의 JBS004가 폐암 마우스의 체중에 미치는 영향의 모식도이다.
도 18은 상이한 투여량의 JBS004가 폐암 마우스의 체온에 미치는 영향의 모식도이다.
도 19는 PCR 검출 방법의 정량적 표준 곡선이다.
도 20은 LLC이식 종양 모델에서, 상이한 시점에서 종양내 JBS004의 핵산 카피 수의 모식도이다.
도 21은 상이한 시점에서 상이한 투여량의 JBS004가 암컷 마우스의 체온에 미치는 영향의 모식도이다.
도 22는 상이한 시점에서 상이한 투여량의 JBS004가 수컷 마우스의 체온에 미치는 영향의 모식도이다.
도 23은 상이한 시점에서 상이한 투여량의 JBS004가 암컷 마우스의 체중에 미치는 영향의 모식도이다.
도 24는 상이한 시점에서 상이한 투여량의 JBS004가 수컷 마우스의 체중에 미치는 영향의 모식도이다.
도 25는 JBS004가 단독으로 치료하거나 PD-1항체와 병용 치료 시, 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 26a-도 26h는 실험 종료 시, 본 출원의 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신이 단독으로 치료하거나 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 27은 JBS004가 단독으로 치료하거나 PD-1항체와 병용 치료하여 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 28은 JBS004가 상이한 투여량의 PD-1항체와 병용 치료 시, 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 29는 실험 종료 시, JBS004가 상이한 투여량의 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 30은 JBS004가 상이한 투여량의 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 31은 상이한 투여 경로의 JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시, 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 32는 실험 종료 시, 상이한 투여 경로의 JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 33은 상이한 투여 경로의 JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 34는 상이한 투여 순서 하에, JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시, 폐암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 35는 실험 종료 시, 상이한 투여 순서 하에, JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 36은 상이한 투여 순서 하에, JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시 폐암 세포의 전이 상황에 미치는 영향의 모식도이다.
도 37은 JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시, 유방암(이식 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 38은 실험 종료 시, JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시 유방암(이식 종양) 부피 크기의 모식도이다.
도 39는 JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시, 결장암(이식 종양, 큰 종양) 부피 크기에 미치는 영향의 모식도이다.
도 40은 실험 종료 시, JBS004가 PD-1항체와 병용 치료 시 결장암(이식 종양, 큰 종양) 부피 크기의 모식도이다.
이하 특정된 구체적인 실시예로 본 출원 발명의 실시 형태를 설명하는데, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 명세서에 개시된 내용은 본 출원 발명의 다른 이점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
용어 정의
본 출원에서, 용어 "변형된"은 일반적으로 인공적인 수단에 의해 천연적으로 존재하는 생물체/분자의 구조 및/또는 성능을 변화를 의미한다. 변형의 방식은 예를 들어 상기 분자를 변형, 돌연변이, 합성하고 및/또는 외인성 분자 등을 삽입할 수 있다. "변형된"은 천연적으로 존재하는 것과 구별될 수 있다. 예를 들어, 만약 세포 또는 생물체가 유전자 정보가 변경되도록 조작되면(예를 들어 형질전환, 매칭, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입 또는 기타 메커니즘에 의해 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질을 도입하거나, 치환 또는 결실 돌연변이에 의해 이전에 존재하는 유전 물질을 제거하는 경우), 이는 "변형된"으로 간주된다. 예를 들어, 변형된 종양 용해성 바이러스는 종양 용해성 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시킬 수 있거나, 종양 용해성 바이러스의 유전자에 외인성 유전자를 삽입할 수 있거나, 종양 용해성 바이러스 단백질의 아미노산을 돌연변이시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 “약물 조합”은 일반적으로 적어도 두 가지 성분을 포함하는 조합을 지칭한다. 약물 조합의 각 성분은 조합되어 사용될 수 있다. 여기서 조합 사용은 동시 사용을 지칭할 수 있고, 별도 사용을 지칭할 수도 있다. 조합의 각 성분은 함께 혼합될 수 있고, 상이한 용기에 배치될 수도 있다. 예를 들어, 상기 약물 조합은 본 출원의 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 상기 면역 관문 억제제를 포함한다. 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주는 상기 면역 관문 억제제와 동시에 투여될 수 있고, 별도로 투여될 수도 있다. 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주는 상기 면역 관문 억제제와 함께 혼합될 수 있고, 상이한 용기에 별도로 배치될 수도 있다.
본 출원에서, 용어 “종양 용해성 바이러스”는 일반적으로 종양 세포에서 복제되고 종양 세포를 사멸할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 바이러스는 종양 세포에 대한 선택성을 향상시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 이의 면역 원성을 감소시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 수포성 구내염 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 MuddSummer 아형 균주이다. 일부 실시형태에서, 수포성 구내염 바이러스의 기질 단백질M 유전자에 대해 위치 지정 유전자 돌연변이를 수행할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "기질 단백질M"은 "M단백질"과 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 일반적으로 수포성 구내염 바이러스 기질 단백질을 지칭한다. 기질 단백질M은 VSV에 대한 중요한 독성 인자이고, 마우스의 선천적 면역 응답을 간섭하는 것으로 알려진 수포성 구내염 바이러스의 단백질이다. 용어 "기질 단백질M"은 상동체, 이종상동체, 변이체, 기능 활성 세그먼트 등을 포함한다. 예를 들어, 야생형 수포성 구내염 바이러스 MuddSummer 아형 인디애나 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 단백질 돌연변이 사이트의 표현은 일반적으로 "아미노산+아미노산 사이트+(돌연변이된 아미노산)"으로 표현된다. 본 출원에서, 상기 돌연변이는 아미노산의 증가, 치환, 결실 및/또는 삭제를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 용어 "M51R"은 일반적으로 51번째 메티오닌M이 아르기닌R로의 돌연변이를 지칭한다. 본 출원에서, 기호 “Δ”는 아미노산 결실을 나타낸다. 예를 들어, 용어 “ΔL111”는 일반적으로 111번째 류신의 결실을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 “항원”은 일반적으로 면역 원성을 갖는 단백질을 지칭한다. 상기 항원은 예를 들어 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 상기 항원은 종양 항원을 포함한다. 일부 경우에, 상기 항원은 흑색종을 포함한다. 일부 경우에, 예를 들어, 상기 항원은 NY-ESO-1일 수 있다.
본 출원에서, 용어 “NY-ESO-1”은 “뉴욕 식도 편평 세포암1”이라고도 지칭되고, 암-고환 항원(CTA)이다. 본 출원의 NY-ESO-1은 이의 변의체, 세그먼트 및/또는 절단체를 포함한다. 예를 들어, 상기 인간 NY-ESO-1의 서열은 GeneBank 등록번호: 1485에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 “PD-1”은 “PD1”과 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 예를 들어, “PD-1항체”는 “PD1항체”상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 “약물 제품”은 일반적으로 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적인 형태로 존재하는 것을 허용하는 제제를 지칭하고, 상기 제제가 투여되는 대상체에게 허용될 수 없는 독성의 다른 성분을 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이러한 제제는 약물의 활성 성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 약물 제품은 비경구, 경피, 관강내, 동맥내, 척추강내 및/또는 비강내 투여 또는 조직으로 직접 투여하는 약물 제품을 포함한다. 상기 약물 제품은 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 진피내 투여와 같은 상이한 방식으로 투여될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율을 갖는 보조제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 약학적으로 허용 가능한 보조제는 규제 기관(예를 들어 미국 식품의약국, 중국 식품의약국 또는 유럽 의약청)에 의해 승인되거나 일반적으로 인정되는 약전(예를 들어 미국 약전, 중국 약전 또는 유럽 약전)에 나열된 동물(보다 특히 인간)에 사용되는 보조제를 지칭할 수 있다. 본 출원에서, 약학적으로 허용 가능한 보조제는 알루미늄계 보조제, 무기염 보조제, 등장성 활성 보조제, 박테리아 유래 보조제, 유화 보조제, 리포솜 보조제, 사이토카인 보조제, 탄수화물 보조제 및 DNA 및 RNA 올리고머 보조제 등일 수 있다.
본 출원에서, 용어 “병용”은 “공동 투여”라고도 지칭되고, 일반적으로 다른 약물 성분의 이전에, 또는 이후에, 또는 동시에 투여되는 것을 지칭한다. 병용되는 두 개 또는 복수의 약물 성분은 동일한 투여 방식으로 투여될 수 있고, 상이한 투여 방식으로 투여될 수도 있으며, 동시에 투여될 수 있고, 선후로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 병용되는 하나의 치료제는 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신일 수 있고, 제2 치료제는 상기 면역 관문 억제제일 수 있다. 병용은 제3 또는 더 많은 치료제를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 “예방”은 일반적으로 사전에 일부 조치를 취함으로써 질환 또는 이의 한가지 또는 여러 가지 증상의 발생 및 발작, 재발, 및/또는 확산을 방지하는 것을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 “치료”는 일반적으로 질환, 또는 질환과 관련된 한가지 또는 여러 가지 증상을 을 제거 또는 개선하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 일반적으로 이러한 질환을 앓고 있는 환자에게 한가지 또는 여러 가지 약물을 투여하여 질환을 제거 또는 완화시키는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, “치료”는 특정 질환의 증상이 발작한 후, 다른 약물의 존재 또는 부재 하에서 상기 약물 조합 및/또는 약물 제품을 투여하는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 약물 조합 및/또는 약물 제품을 사용하여 종양의 발생, 발달, 재발 및/또는 전이를 방지한다.
본 출원에서, 용어 “포함”은 일반적으로 명시적으로 지정된 특징을 포함하지만, 다른 요소를 배제하지 않는 것을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 “상동성”은 일반적으로 비교되는 아미노산 서열 및 비교되는 핵산 서열과 일정한 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 “상동성”은 서열 “동일성”과 동일할 수 있다. 상동성 서열은 주제 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 99.1%, 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.3%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.5%, 적어도 약 99.6%, 적어도 약 99.7%, 적어도 약 99.8% 또는 적어도 약 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상동체는 주제 아미노산 서열과 동일한 활성 사이트 등을 포함한다. 상동성은 유사성(즉 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)에 근거하여 고려할 수 있고, 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현할 수도 있다.
발명의 상세한 설명
1．종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 이용하여 제조된 항종양 약물 또는 암 치료 약물에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주는 종양 용해성 바이러스의 기질 단백질M을 변형시키고, 변형된 기질 단백질M의 유전자 서열은 SEQ ID NO 3으로 표시되며; 상기 약물은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 면역 관문 억제제를 동시에 포함하는 것을 특징으로 한다.
2. 실시형태1에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주는 VSV MuddSummer 아형 균주를 기반으로 하고, 적어도 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이; 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이; 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이와 같은 위치 지정 유전자 돌연변이를 수행한 후 수득되는 것을 특징으로 한다.
3. 실시형태1 또는 실시형태2에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 종양 용해성 바이러스 백신으로 제조한 후, 약물로 제조하는 것을 특징으로 한다.
4. 실시형태3에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
5. 실시형태4에 있어서, 상기 항원은 특이성 종양 항원인 것을 특징으로 한다.
6. 실시형태5에 있어서, 상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3, 글리피칸3에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
7. 실시형태1 또는 실시형태2에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는anti-PD-1항체, anti-PD-L1항체, anti-CTLA4항체, anti-LAG-3항체, anti-TIM-3항체, anti-SIGLEC15항체에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
8. 실시형태1 또는 실시형태2에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 상기 종양 용해성 바이러스 백신 이전에 체내에서 방출되는 것을 특징으로 한다.
9. 실시형태1 또는 실시형태2에 있어서, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종, 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다양한 종양을 효과적으로 치료할 수 있는 약물을 제공한다. 상기 약물은 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 관문 억제제를 동시에 포함한다.
상기 종양 용해성 바이러스 백신의 제조 방법은 다음과 같다. 종양 용해성 바이러스 약독화 균주에 NY-ESO-1 유전자 또는 유전자 세그먼트를 삽입하여 수득된다. 구체적인 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
1. 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 제조. 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)를 선택하고, 구체적으로 수포성 구내염 바이러스 인디애나 균주, VSV MuddSummer 아형 균주를 선택하며; 이의 M단백질 유전자 서열은 SEQ ID NO 1로 표시되고, 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 2로 표시된다.
2. 상기 수포성 구내염 바이러스 기질 단백질M의 유전자에 대해 부위 지정 유전자 돌연변이를 수행한다. 돌연변이 사이트는, (1) 51번째 메티오닌(M)이 아르기닌(R)으로의 돌연변이; (2) 111번째 류신(L) 인코딩 염기 녹아웃; (3) 221번째 발린(V)이 페닐알라닌(F)으로의 돌연변이; (4) 226번째 세린(S)이 아르기닌(R)으로의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이된 수포성 구내염 바이러스를 JBS003으로 넘버링하고; XN2-M51R-△L111-V221F-S226R로 명명하며; 이의 M단백질의 유전자 서열은 SEQ ID NO 3로 표시되고, M단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 4로 표시된다.
야생형 VSV 및 기타 알려진 VSV 약독화 균주에 비해 상기 JBS003의 안전성은 더 높고, 항원, 사이토카인 등 물질의 담체(골격)로 사용할 수 있으며, 항원, 사이토카인 등과 결합한 후, 백신 또는 약물로 사용할 수 있다. 동시에, JBS003은 기타 물질과 결합하지 않고, 종양 면역 치료에서 종양 용해성 바이러스로 직접 사용할 수 있으며, 그 효과도 야생형 VSV 및 기타 VSV약독화 균주의 치료 효과보다 우수하다.
3. NY-ESO-1유전자 또는 유전자 세그먼트를 삽입한다. JBS003의 G단백질 및 L단백질 게놈 사이에 NY-ESO-1을 발현할 수 있는 유전자를 삽입하여 종양 용해성 바이러스 백신을 구축하고, JBS004로 넘버링한다.
NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)은 종양-고환 항원(Cancer-Testis Antigen, CTA) 패밀리에 속하고, 고환, 난소 및 다양한 종양 조직에서 발현되지만, 다른 정상 조직에서 발현되지 않으며, 현재까지 알려진, 면역 원성이 가장 강한 종양 특이성 항원이다. NY-ESO-1이 상이한 종양 조직에서 발현되는 풍도는 상이하고, 단백질 발현이 가장 높은 것은 점액성 원형 세포 지방육종(89%~100%), 신경모세포종(82%), 활막육종(90%), 흑색종(46%), 난소암(43%)이다. NY-ESO-1항원은 면역 원성 및 안전성을 갖고, 면역 치료에 사용되는 임상적으로 지배적인 항원이다.
현재, 재발, 전이성 두경부 편평 세포암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종 등은 여전히 효과적인 치료가 불가능하다. NY-ESO-1 도입 후 구축된 JBS004종양 용해성 바이러스 백신은 말초 림프계와 종양 조직에서 유기체의 특이성 항종양 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다. 시험에 따르면, 항종양 면역 치료, 특히 상술한 암 및 종양의 치료에서, 종양 용해성 바이러스 백신의 면역 원성, 유효성, 표적화, 안전성 및 내성은 유의한 이점이 있다.
상기 JBS003종양 용해성 바이러스 약독화 균주 또는 JBS004종양 용해성 바이러스 백신은 단독으로 종양 치료 약물로 사용할 수 있고, 사용 방법은, 상기 JBS003종양 용해성 바이러스 약독화 균주 또는 JBS004종양 용해성 바이러스 백신을 종양내 주사 또는 정맥내 주사하는 것이다. 종양내 주사는 종양을 가진 포유동물 체내의 대응되는 종양에 주사하는 것이다. 소량으로 여러 차례 투여하는 방법으로 주사한다.
4. JBS004종양 용해성 바이러스 백신과 면역 관문 억제제를 결합하여 공동으로 종양 치료 약물로 사용한다. 상기 면역 관문 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, SIGLEC15의 항체 등을 포함한다. 바람직하게는 PD-1의 항체 또는 PD-L1의 항체이다. 비교 전시 및 조작의 편의를 위해, 하기 각 실시예에서 모두 PD-1의 항체를 사용한다.
상기 약물의 사용 방법은, 소량으로 여러 차례 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 백신을(종양내 주사 또는 정맥내 주사) 제공하는 것이다. 바람직한 투여 순서는 먼저 면역 관문 억제제를 투여한 후, 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 백신을 투여한다. 상기 면역 관문 억제제의 주사 방식은 바람직하게 복강내 주사 또는 정맥내 주사이고; 상기 종양 용해성 바이러스 또는 종양 용해성 바이러스 백신의 투여 방식은 바람직하게 종양내 주사 또는 정맥내 주사이다.
한편으로, 본 출원은 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약물 조합을 제공하는데, 여기서 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 VSV MuddSummer 아형 균주와 비교하여 기질 단백질M이 변형되고, 상기 변형은 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기의 녹아웃을 포함한다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃된다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시된다.
일부 실시형태에서, 상기 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO:1로 표시되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M유전자의 돌연변이는 아미노산 사이트의 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M 유전자의 돌연변이는 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다.
본 출원에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M 유전자 돌연변이는 아미노산 사이트의 226번째 세린이 아르기닌으로 돌연변이된 아미노산 돌연변이를 더 포함한다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시된다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 아미노산 사이트의 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11로 표시된다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 VSV MuddSummer 아형 균주의 기질 단백질M과 비교하여 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이, 111번째 류신 인코딩 염기 녹아웃, 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이 아르기닌으로의 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시된다.
본 출원에서, 상기 면역 관문 억제제는 anti-PD-1항체, anti-PD-L1항체, anti-CTLA4항체, anti-LAG-3항체, anti-TIM-3항체 및 anti-SIGLEC15항체에서의 임의의 하나로부터 선택될 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은, 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약물 조성물을 제공하는데, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 본 출원의 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 이용하여 제조된다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조된다. 예를 들어, 상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아 단백, 암배아 항원, CA 125, Her2, 도파크롬 호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3 및 글리피칸3에서의 임의의 하나로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기질 단백질 M에서 ΔL111돌연변이를 갖는 VSV약독화 균주에 종양 관련 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 제조한다.
일부 실시형태에서, 기질 단백질 M에서 ΔL111 및 M51R돌연변이를 갖는 VSV약독화 균주에 종양 관련 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 제조한다.
일부 실시형태에서, 기질 단백질 M에서 ΔL111 및 V221F돌연변이를 갖는 VSV약독화 균주에 종양 관련 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 제조한다.
일부 실시형태에서, 기질 단백질 M에서 ΔL111 및 S226R돌연변이를 갖는 VSV약독화 균주에 종양 관련 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 제조한다.
일부 실시형태에서, 기질 단백질 M에서 ΔL111, V221F 및 S226R돌연변이를 갖는 VSV약독화 균주에 종양 관련 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 제조한다.
일부 실시형태에서, 기질 단백질 M에서 ΔL111, M51R, V221F 및 S226R돌연변이를 갖는 VSV약독화 균주에 종양 관련 항원을 삽입하여 상기 종양 용해성 바이러스 백신을 제조한다.
본 출원에서, 상기 약물 조성물의 면역 관문 억제제는 anti-PD-1항체, anti-PD-L1항체, anti-CTLA4항체, anti-LAG-3항체, anti-TIM-3항체 및 anti-SIGLEC15항체에서의 임의의 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 면역 관문 억제제는PD-1항체(anti-PD-1-항체)이다. 예를 들어, 상기 PD-1항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 PD-1항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 면역 관문 억제제는 상기 종양 용해성 바이러스 백신 이전에 체내에서 방출될 수 있다.
본 출원에서, 상기 약물 조합은 항종양 또는 암 치료가 가능하다. 본 출원에서, 상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직 육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종 및 원형세포 지방육종에서의 임의의 하나로부터 선택될 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은 약물 제품을 더 제공하는데, 상기 약물 조합, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 출원에서, 바이러스 구조 과정을 통해 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 수득할 수 있다. 구체적인 과정은 RNA 중합효소를 발현하는 폭스 바이러스로 BHK-21세포를 감염 접종하고, 각각 클로닝된 VSV N, VSV P, VSV L유전자 발현 플라스미드 및 VSV M유전자 발현 플라스미드 또는 VSV M유전자 발현 돌연변이 플라스미드를 사용하여 플라스미드 형질감염 프리믹스 용액을 제조하여lipofectamine형질감염시켜, 돌연변이 균주를 수득한다.
본 출원에서, 상기 약물 조합 및/또는 상기 약물 제품의 각 성분은 동일한 용기에 배치될 수 있고, 상이한 용기에 배치될 수도 있다.
본 출원에서, 상기 약물 조합 및/또는 상기 약물 제품의 각 성분은 함께 혼합될 수 있고, 별도로 배치될 수도 있다.
본 출원에서, 약물 제조에 공동으로 사용되는 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신 및 상기 면역 관문 억제제의 용도를 더 제공한다.
본 출원에서, 약물 제조에 공동으로 사용되는 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신의 발현 벡터 및 상기 면역 관문 억제제의 용도를 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신 및 상기 면역 관문 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 동시 투여는 각 성분을 함께 혼합하여 투여할 수 있고, 별도로 투여할 수도 있다. 동일한 정맥 또는 다른 혈관에 투여하는 것과 같이 동일한 방식으로 투여할 수 있고, 정맥내 투여 및 종양내 투여가 동시에 수행되는 것과 같이 상이한 방식으로 투여할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신 및 상기 면역 관문 억제제는 선후로 투여될 수 있다. 투여 순서는 먼저 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신을 투여한 후, 상기 면역 관문 억제제를 투여할 수 있고; 먼저 상기 면역 관문 억제제를 투여한 후, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신을 투여할 수도 있다. 동일한 방식으로 투여될 수 있고, 상이한 방식으로 투여될 수도 있다. 각 성분은 한번에 투여될 수 있고, 여러 차례 투여될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 순차적인 투여는 분, 시간, 일, 주, 월 또는 년을 포함하는 임의의 시간 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 순차적인 투여는 적어도 2분, 5분, 10분, 30분, 1시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월에서의 하나의 시간 간격으로 분리되어 투여되는 것을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 투여량은 임의의 투여량일 수 있다.
일부 실시형태에서, 투여량은 치료 유효량일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주/종양 용해성 바이러스 백신은 종양내 투여를 위해 조제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주는 정맥내 투여를 위해 조제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 면역 관문 억제제는 전신 투여를 위해 조제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 면역 관문 억제제는 국소 투여를 위해 조제될 수 있다.
어떠한 이론에 제한되는 것을 의도하지 않고, 하기 실시예는 단지 본 출원의 발명의 다양한 기술적 해결수단을 설명하기 위해 사용된 것일 뿐, 본 출원의 발명의 범위를 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.
실시예
실시예1 부위 지정 돌연변이의 약독화 균주의 구축 및 효과 전시
1, 표 1의 방식에 따라, 상기 수포성 구내염 바이러스인 디애나 균주에 부위 지정 돌연변이를 수행하여 7개의 그룹의 돌연변이된 약독화 균주를 수득한다. 유전자 돌연변이를 수행하지 않은 그룹번호는 JBS000이고, 대조군으로 사용된다.
표 1 각 그룹의 돌연변이 상황 전시표
Figure pct00001
약독화 균주의 구체적인 구축 방법은 본 분야의 통상적인 기술이고, 다음과 같이 간략하게 설명한다.
(1)플라스미드의 구축. pVSV-XN2 플라스미드를 주형으로 사용하고, PCR 방법을 사용하여 표 1에 기재된 상이한 돌연변이 사이트를 도입한다. 플라스미드를 각 돌연변이 사이트의 프라이머에 대해 공동으로 PCR을 수행하고, PCR산물을 1%의 아가로스겔로 전기 영동한 후, 겔 회수 키트로 겔 절단 및 회수하여M기질 단백질의 상이한 돌연변이의 플라스미드를 수득한다.
(2)바이러스 구조. MOI=5에 따라, T7 RNA 중합 효소를 발현하는 폭스 바이러스vTF7-3로 BHK-21세포를 감염 접종하고, 1h 동안 감염시킨 후, DPBS완충액을 사용하여 BHK-21세포를 1회 세척한다. 다음 구체적으로 pBS-N, pBS-P, pBS-L, 단계(1)에서 제조된 돌연변이 플라스미드를 포함하는 플라스미드 형질감염 프리믹스 용액을 제조한다. 여기서 pBS-N, pBS-P, pBS-L은 각각 VSV N, VSV P, VSV L 단백질 유전자가 클로닝된 발현 플라스미드를 지칭하고, 바이러스 구조에 필요한 N, P, 및 L단백질을 각각 발현한다. lipofectamine 2000 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 플라스미드 형질감염을 수행하고, 4h 후 10%의 소태아혈청을 함유하는 신선한 DMEM완전 배지를 교체하며, 48h 후 상청액을 흡인하고, 0.22μm의 여과막으로 폭스 바이러스를 제거한다. 여과액을 신선한 BHK-21세포에 첨가하고; 매일 세포 병변 상태를 관찰하며, 세포에 병리학적 변화가 나타날 경우 상청액을 취하고, RTPCR 감정하여 성공적인 것을 확인한 후, 바이러스 플라크 분석으로 바이러스를 정제한다. 즉 약독화 균주를 수득한다.
(3)M단백질 유전자 시퀀싱. Trizol키트를 이용하여 바이러스 게놈RNA를 추출하고, 무작위 프라이머로 역전사 반응을 수행하며, M단백질 유전자 서열에 맞게 설계된 프라이머로 역전사된 cDNA에 대해 PCR을 수행한다. 프라이머 서열은 5'-AAAAAAGTAACAGATATCAC-3'(SEQ ID NO: 5); 5'-ACATTTTTCCAGTTTCCTTTTTGG-3'(SEQ ID NO: 6)이다. 산물은 1%의 아가로스겔로 전기 영동한 후 회수하고, 시퀀싱 회사로 보내 시퀀싱을 수행한다.
2. 세포에 대한 상이한 약독화 균주의 체외 감염 능력 전시. MEF세포(인간 섬유아세포) 배양액, LLC세포(마우스 유래 비-소세포성 폐암 세포) 배양액에, JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS008, JBS009, JBS010, JBS014를 각각 200pfu 첨가하고, 각 그룹의 약독화 균주에 의해 생성된 절반의 조직 배양 감염 투여량(Tissue culture infective dose,TCID50)을 검출한다. 구체적인 테스트 방법은 다음과 같다.
(1)6웰의 배양 플레이트의 각 웰에 3mL의 세포 현탁액을 넣어, 세포량이 4×105개/웰, 총 6개의 웰이 되도록 하여37℃, 5％의 CO2조건 하에서 16h 동안 배양한다.
(2)각 웰에 각각 바이러스JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS008, JBS009, JBS010, JBS014를 200pfu씩 첨가하고, 2개의 웰을 정상 세포 대조군으로 설정한다. 24h에, 100μL의 세포 상청액을 취한다.
(3)96웰의 배양 플레이트에, 각 웰에 100μL의 Vero세포 현탁액을 첨가하여 세포량이 1×104개/mL가 되도록 하여37℃, 5％의 CO2조건 하에서 16h 동안 배양한다.
(4)1.5mL EP튜브에 단계(2)에서 수득한 상청액을 10-1~10-11, 총 11개의 역가로 연속 10배 희석한다.
(5)희석된 상청액을 단계(3)의 96웰의 배양 플레이트에 접종하고, 각 희석액에 대해 컬럼 1개(총 8개 웰), 각 웰에 100μL를 접종한다. 정상 세포 열을 대조군으로 설정한다.
(6)48h 후 각 웰의 세포의 형광 상황을 관찰하고, 형광 마커가 있으면 이 웰이 감염된 것이다.
(7)Karber법에 따라 TCID50을 계산한다.
결과는 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같다. 체외 폐암 세포(LLC)에서의 구축된 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 복제 및 증폭 능력은 정상 섬유아세포(MEF)의 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 복제 및 증폭 능력보다 강하고, 여기서 체외 폐암 세포(LLC)에서의 JBS003의 복제 및 증폭 능력은 강하며, 24h 감염 후 생성된 바이러스 입자 수는 야생형 바이러스에 가깝다. 그러나 정상 섬유아세포(MEF)에서 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주의 복제 및 감염 능력은 모두 감소된다. 따라서, JBS003담체는 종양 세포에 대해 강한 특이성 감염 능력을 갖는다.
3. 세포에 대한 상이한 약독화 균주의 체외 사멸 능력 전시. 동일한 양의 각 약독화 균주를 사용하여 상이한 세포를 각각 체외 감염시키고, 24h 후 MTT법으로 세포 활력을 검출한다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
(1)96웰의 배양 플레이트의 각 웰에 100μL의 세포 현탁액을 첨가하여 세포량이 1Х104개/웰이 되도록 하여37℃, 5％의 CO2조건 하에서 16h 동안 배양한다. 테스트한 세포 종류는 LLC, MEF, Hela(인간 종양 세포)이다.
(2)JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS008, JBS009, JBS010, JBS014를 각각 MOI(multiplicity of infection, 감염 다중도)에 희석하고 각각 0.001, 0.01, 0.1, 1.0이며, 각각의 희석 구배를 4개의 웰에 접종하고, 각 웰에 100μL를 접종하여37℃, 5％의 CO2조건 하에서 40h 동안 배양한다.
(3)96웰의 배양 플레이트의 상청액을 제거하고, 신선한 DMED배지를 첨가하며, 5mg/mL의 MTT 용액을 첨가하고, 20μL/웰을 사용한다. 37℃, 5％의 CO2조건 하에서 4h 동안 배양한다.
(4)96웰 플레이트를 원심분리하고, 회전속도를 2500g/min으로 설정하며, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 다음 1mL의 1회성 무균 주사기를 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인한다.
(5)각 웰에 DMSO를 첨가하고, 100μL/웰을 사용하여 37℃에서 10분 동안 방치한다.
(6)다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 2분 동안 진탕하고, 570nm의 파장에서, 각 웰의 OD값을 측정한다.
결과는 도 2a, 도 2b, 및 도 3에 도시된 바와 같다. 결과는 MEF세포에 대해 유의한 사멸 능력이 없는 JBS000을 제외하고 각 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주가 모두 우수한 종양 세포 사멸 능력을 나타내는 것을 입증한다. 즉, 체외 상태에서, JBS000 외에, 각 약독화 균주는 모두 종양 세포에 대해 특이성 사멸을 갖고, 정상 세포에는 유의한 영향이 없다.
4. 세포 내에서의 상이한 약독화 균주의 제거 난이도 테스트. IFN-β 지표로 테스트를 수행한다. 상기 단계3의 단계(1), (2)에 따라 세포를 배양하고 약독화 균주를 첨가한다. 다음 각 그룹의 세포를 파괴하고, TRIzol(Invitrogen)로 각 세포로부터 총 RNA를 추출하며, PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser(Takara) 역전사 키트를 사용하여 cDNA로 역전사하고, LightCycler 480SYBR Green I Master(Roche) 염료로 염색하며, LightCycler 480 정량적 PCR 기기에서 각 유전자의 Ct값을 검출한다. △△Ct법으로 목적 유전자IFN-β, VSV-G의 상대 발현량을 계산한다. 결과는 도 4에 도시된 바와 같다. LLC세포계에서, JBS000을 제외하고, 모든 약독화 균주는 모두 IFN-β 발현 수준을 향상시킬 수 있으며, 여기서 JBS003담체의 조절 능력이 가장 낮고; MEF세포에서, 모든 바이러스는 모두 IFN-β의 발현 수준을 상향 조절할 수 있으며, 여기서 JBS003의 수준이 가장 높고, 야생형 바이러스 담체(JBS000)의 3배이다. 즉, JBS003은 종양 세포에서 제거되기 어렵지만, 정상 세포에서는 제거하기 용이하다.
실시예2 종양 용해성 바이러스 백신의 구축 및 효과 전시
1. 실시예1에서 제조한 각 약독화 균주 및 야생형 바이러스의 기초 상에서, NY-ESO-1유전자를 삽입하여 종양 용해성 바이러스 백신을 구축하고, 구축 모식도는 도 5에 도시된 바와 같다. 각 그룹의 삽입 세그먼트 상황은 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2 각 그룹의 삽입 세그먼트 상황 전시표
Figure pct00002
상기 JBS004-JBS007, JBS011-JBS013, JBS015의 구체적인 제조 방법은 본 분야의 통상적인 기술이고, 다음과 같이 간략하게 설명한다. 하기 기재는 JBS004-JBS007, JBS011-JBS013, JBS015를 다음과 같은 방법으로만 수행되어야 함을 제한하는 것이 아니고, 예시적으로 제공한다는 점에 유의해야 한다.
(1)약독화 균주 플라스미드 구축. 제한 효소 절단 사이트 Xho I 및 Mlu I가 있는 연결 서열을 인공적으로 합성하고, 생물학적 기술과 유전자 재조합 기술을 이용하여 실시예1에서 제조한 각 약독화 균주의 G단백질과 L단백질 사이의 비코딩 영역에 삽입하여 각 약독화 균주의 플라스미드를 수득한다.
(2)외인성 유전자의 삽입. 각 약독화 균주 플라스미드를 Xho I 및 Mlu I로 이중 소화한 후, NY-ESO-1외인성 유전자를 삽입하여NY-ESO-1을 포함하는 약독화 균주 재조합 플라스미드를 수득한다.
(3)백신 구조. 실시예1의 "바이러스 구조"의 방법을 참조하여 각 약독화 균주 재조합 플라스미드에 대응되는 백신을 구조함으로써 각 종양 용해성 바이러스 백신을 구축한다.
2. LLC-NY-ESO-1비-소세포성 폐암(이식 종양) 치료 효과 전시.
유의미한 차이가 없는 136마리의 C57BL/6마우스를 선택하고, 각각 2×105개의 LLC세포(마우스 폐암 세포)를 피하 접종하며, 동일하고, 적합한 조건 하에서 9일 동안 배양한다. 접종 9일차에, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 모든 마우스를 17개의 그룹(n=8)으로 나눈다. 대조군(PBS군)에 50μL의 PBS를 종양내 주사하고, 나머지 16개의 그룹은 치료군이며, JBS000, JBS001, JBS002, JBS003, JBS004, JBS005, JBS006, JBS007, JBS008, JBS009, JBS010, JBS011, JBS012, JBS013, JBS014, JBS015를 각각 종양 내에 주사하고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여하고, 단일 접종량은 모두 107 pfu/마리이다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록하고, 부피(mm3)=(장경×단경2)/2이다. 암세포의 전이율을 검출하고, 검출 방법은 LLC세포에는 적색 형광 단백질이 포함되며, 녹색 형광 현미경 하에서 황생 형광을 나타내고; 암세포가 폐조직으로 전이된 후, 폐조직을 현미경으로 관찰하여 형광 이미지를 촬영하며, Image J로 이미지 회색값을 분석함으로써 폐암 세포의 비율을 분석하고, 즉 암세포의 전이율을 얻는다.
종양 부피 변화 상황은 도 6~도 8에 나타낸 바와 같다. 결과는, 각 치료군이 모두 이식 종양에 일정한 억제 작용이 있음을 나타낸다. 여기서 JBS003군은 1마리가 완전히 치료된다. 이식 종양에 대한 JBS004의 치유율은 37.5%에 도달한다. 암세포 전이 상황은 도 9에 도시된 바와 같다. 도 6~ 도 9로부터 알 수 있다 시피, 이식 종양 부피 크기와 폐 전이량 사이에는 일정한 상관성이 존재한다. JBS003은 폐 전이 치료에서 JBS000, JBS001군보다 우수하고; JBS004는 폐암 세포 전이를 억제하거나 방지하는 능력은 다른 그룹보다 우수하다.
3. MCA-205-NY-ESO-1섬유육종(이식 종양)의 치료 효과 전시.
"LLC-NY-ESO-1 비-소세포성 폐암 이식 종양"을 치료하는 방법으로 마우스를 처리하고, 106개의 MCA-205-NY-ESO-1섬유육종 세포를 피하 접종하며, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 처리한다. 마찬가지로 50μL의 PBS를 대조군으로 종양내 주사하고, 치료군에서, 각각 JBS004, JBS005, JBS006, JBS007, JBS011, JBS012, JBS013, JBS015를 종양내 접종하며, 각 그룹당 6마리 동물이고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여하고, 단일 접종량은 모두 108 pfu/마리이다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록한다. 결과는 도 10, 도 11에 도시된 바와 같다.
결과에 따르면, 각 치료군은 모두 종양 부피를 어느 정도 감소시킬 수 있다. JBS004 치료 후, 2마리의 마우스의 이식 종양이 완전히 제거되고(33.33% 차지), 나머지 마우스의 종양 부피도 잘 제어되어 나머지 그룹과 유의하게 상이하다. JBS004가 섬유육종을 치료하는 전체 반응률은 100%이다.
4. B16-F10-NY-ESO-1흑색종(이식 종양)의 치료 효과 전시.
상술한 이식 종양 시험의 처리 방법에 따라 마우스를 처리하고, 2Х106개의 B16-F10-NY-ESO-1흑색종 세포를 피하 접종하며, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 처리한다. 마찬가지로 50μL의 PBS를 대조군으로 종양내 주사하고, 치료군에서, 각각 JBS004, JBS005, JBS006, JBS007, JBS011, JBS012, JBS013, JBS015를 종양내 접종하며, 각 그룹당 6마리 동물이고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여하고, 단일 접종량은 모두 108 pfu/마리이다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록한다. 결과는 도 12, 도 13에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 각 처리군이 흑색종에 대해 모두 일정한 치료 작용이 있고, JBS004군의 효과가 우수한 것을 나타낸다.
5. 상이한 투여량의 JBS004의 효과 전시.
6~8주령, 약 18g의 체중의 C57BL/6마우스를 선택하고, 각각 2Х105개의 LLC세포(마우스 폐암 세포)를 피하 접종한다. 접종 9일차에, 이식 종양 부피가 약 100mm3로 증가하면 모든 마우스를 5개의 그룹으로 나누고, 각 그룹은 6마리의 동물이다. 대조군(PBS군)은 50μL의 PBS를 종양내 주사하고, 나머지 4개의 그룹은 치료군이며, 각각 106 pfu/마리, 107 pfu/마리, 108 pfu/마리, 109 pfu/마리의 JBS004를 종양내 접종하고, 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여한다. 투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록하고, 결과는 도 14, 도 15에 도시된 바와 같다. 실험 종료 시, 안락사시킨 마우스를 부검하고, 마우스의 폐조직을 취하며, 암세포의 전이율을 검출하고, 결과는 도 16에 도시된 바와 같다.
결과에 따르면, 상이한 투여량의 JBS004는 모두 폐암 마우스에 일정한 치료 효과가 있고, 여기서 108 pfu/마리의 투여량 수준에서, 치유율은 33.33%에 도달하며, 유효 제어율은 33.33%에 도달하고, 폐암 세포가 없는 전이율은 66.67%이며, 다른 투여군에 비해 유의하게 우수하다.
이 밖에, 도 17, 도 18에 도시된 바와 같이, 전체 실험 과정에서, 마우스의 체온, 체중은 모두 정상 범위 내로 유지되고, 체온, 체중에 이상은 없으며, 상이한 투여량의 JBS004가 폐암 마우스의 체온, 체중에 유의한 영향을 미치지 않는다. 체중에 있어서, PBS군 마우스의 체중은 안정적으로 증가하고, 나머지 치료군의 마우스는 느린 성장을 나타내며, 그 원인은 이식 종양의 감소와 관련이 있고, 실험 종료 시, 각 그룹의 마우스의 체중은 유의한 차이가 없다. JBS004의 안전성이 우수함을 입증한다.
실시예3 JBS004의 약동학 및 급성 독성 실험 결과 전시
1. 약동학 실험. C57BL/6마우스를 선택하여 2Х105개의 LLC세포를 피하 접종하고, 접종 약 9일 후, 이식 종양 부피가 100mm3로 증가하며, LLC이식 종양 모델을 구축한다. 108 pfu/마리의 JBS004를 1회 종양내 주사하고, 각각 0 min(+15min), 6h, 12h, 48h, 96h, 120h 및 14일에 종양 조직 샘플링을 수행하며(3회 반복), 자동 그라인더로 조직을 파쇄하고, Trizol로 종양 조직의 전체 RNA를 추출하며, 최종적으로 정량적 PCR(형광 프로브 방법)로 바이러스 핵산 카피 수를 분석한다. 결과는 도 19, 도 20에 도시된 바와 같다.
결과에 따르면, 종양내 바이러스의 양은 감염 6h에 피크값에 도달하고, 초기 투여량과 비교하여 약 500배 복제되며; 감염 48h 후, 바이러스의 양은 초기 주사량보다 감소되기 시작하고; 14일 후, 바이러스 핵산 카피 수는 검출되지 않는다.
따라서, JBS004는 종양 내에서 신속하고 효과적으로 복제될 수 있으며; 14일 후, JBS004는 검출되지 않음을 입증하고, 장기간 체내에 축적되지 않아, 잠재적인 후속 손상을 유발할 수 있으며, 안전성이 우수하다.
2. 급성 독성 실험. 40마리의 C57BL/6마우스를 선택하고, 절반은 수컷, 절반은 암컷이다. 3개의 투여군으로 나누고, JBS004 용액을 1회 근육 주사로 투여하며, 각 그룹의 투여량은 각각 103pfu/마리, 106pfu/마리, 109pfu/마리이다. 블랭크 대조군에는 용매 대조(PBS를 1회 근육내 주사)를 1회 투여하고, 투여 부피는 모두 100μL이다. 동물 투여일을 이 동물군의 첫 관찰일로 설정한다. 동물은 약물 투여 후 14일 동안 관찰하고, 투여 후 15일째에 해부한다.
실험 과정에서, 2일마다 마우스의 체온 및 체중을 기록한다. 결과는 도 21~도 24에 도시된 바와 같다. 투여 전 및 투여 후의 30min, 1h, 2h, 4h 및 10h에 마우스에 대해 상세한 케이지측 관찰을 수행하고, 후속 실험에서 매일 적어도 1회의 케이지측 관찰을 수행한다. 실험 종료 시, 마우스의 말초 혈액을 취하여 혈액학 및 혈액 생화학적 검출(혈당, 크레아티닌, 요소질소, 혈액요소질소/레아티닌, 인이온, 칼슘이온, 총단백질, 알부민, 글로불린 등)에 사용하고, 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 뇌, 고환/난소를 포함하는 주요 장기를 조직 칭량을 위해 부검하여 수집하고, 장기 계수를 계산한다.
편복의 제한으로 인해, 혈액학, 혈액 생화학적 검출의 모든 지표 데이터는 여기에 나열되지 않는다. 테스트 결과에 따르면, 마우스의 비정상적인 사망은 없고, JBS004와 관련된 임상 증상이 나타타지 않는다. 상이한 투여량의 JBS004를 주사하여 마우스 장기의 중량에 유의한 영향을 미치지 않고; 마우스의 혈액학 및 혈액 생화학적 지표에 유의한 영향을 미치지 않는다. 본 실험 조건 하에서, 최대 허용 투여량(MTD)은 적어도 109pfu/마리이다. 따라서 상기 최적 투여량(108pfu/마리)는 안전한 투여량 이내이다.
실시예4 비-소세포성 폐암 치료에서 종양 용해성 바이러스 백신과 PD-1항체(PD1항체) 병용의 효과 전시
6~8주령, 약 18g의 체중의 C57BL/6마우스를 선택하고, 2Х105개의 비-소세포성 폐암 LLC-NY-ESO-1세포를 각각 피하 접종하며, 이식 종양 부피가 약 100mm3가 되면 처리를 시작한다. 각 그룹의 처리 조건은 표 3에 도시된 바와 같고, 대조군(PBS 주사), PD-1항체군, JBS004군, JBS004와 PD-1항체 병용군, JBS005군, JBS005와 PD-1항체 병용군, JBS006군, JBS006과 PD-1항체 병용군, JBS007군, JBS007과 PD-1항체 병용군, JBS011군, JBS011과 PD-1항체 병용군, JBS012군, JBS012와 PD-1항체 병용군, JBS013군, JBS013과 PD-1항체 병용군, JBS014군, JBS014와 PD-1항체 병용군으로 나누고, 각 그룹은 8마리의 마우스이다. PD-1항체의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 12로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO: 13으로 표시된다. JBS004를 2일마다 1회 투여하고, 총 3회 투여하며, 단일 접종량은 모두 108 pfu/마리이고; PD-1항체를 2일마다 1회 복강내 주사하며, 총 3회 투여하고, 단일 투여량은 5mg/kg이며, 투여 시간과 JBS004 주사 시간은 동일하다.
표 3 각 그룹별 처리 상황 전시표
Figure pct00003
투여 시작부터 실험 종료까지, 2일마다 이식 종양 부피를 기록하고, 실험 종료 시, 마우스를 부검하며, 폐를 취하여 형광현미경에 넣어 폐 형광 이미지를 수집한다. 각 그룹의 이식 종양 부피 변화 상황 결과는 도 25, 도 26에 도시된 바와 같다. 각 그룹의 폐암 세포 전이 상황 결과는 도 27에 도시된 바와 같다.
도 25, 26으로부터 알 수 있다 시피, PBS군의 종양 성장 추세는 폐암 이식 종양 모델이 성공적으로 구축되었다. 각 그룹의 종양 용해성 바이러스 백신과 PD-1항체의 병용의 종양 억제 효과는 모두 단독 투여의 효과보다 우수하다. PD-1항체를 단독으로 복강내 주사하는 것은 이식 종양의 성장에 영향을 미치지만, 마우스에서 이식 종양이 완전히 치유되지 않고, JBS004군 및 JBS004+PD1항체 병용 치료군의 마우스에서, 이식 종양 부피는 모두 어느 정도 제어된다. 여기서, JBS004군의 2마리의 마우스가 완전히 치유되고, 25%를 차지하며; JBS004+PD1항체군에서 5마리의 마우스가 완전히 치유되고, 62.5%를 차지한다. 도 27로부터 알 수 있다시피, JBS004군 및 JBS004+PD1항체군은 모두 폐암 이식 종양의 암세포 전이를 어느 정도 억제할 수 있고, JBS004와 PD1항체를 병용 투여 후, 암세포 전이를 억제하는 효과는 다른 그룹에 비해 유의하게 우수하다.
실시예5 종양 용해성 바이러스 백신과 PD-1항체를 병용 투여 시, 상이한 투여량의 PD-1항체를 제공하는 효과 전시
실시예4의 방법에 따라 폐암 이식 종양 모델(LLC-NY-ESO-1, 마우스)을 구축하고, 이식 종양 부피가 약 100mm3가 되면 처리를 시작한다. 대조군(PBS 주사), JBS004군(JBS004만 종양내 주사), JBS004+PD-1항체 투여량군을 설정하고; JBS004+PD-1항체 투여량군에서, PD-1항체는 모두 복강내 주사 방식으로 투여되고, 투여량 수준은 각각 1mg/kg, 5mg/kg 및 10mg/kg이며, 각 그룹은 8마리의 마우스이다. 상기 그룹에서, JBS004는 모두 종양내 주사하고, 단일 용량은 모두 108 pfu/마리이며; 2일마다 1회 투여하고, 총 3회 투여하며, JBS004 및 PD-1항체의 투여 시간은 동일하다.
각 그룹의 종양 부피 변화 상황은 도 28, 도 29에 도시된 바와 같고; 암세포 전이 상황은 도 30에 도시된 바와 같다. 도면으로부터 알 수 있다 시피, 1mg/kg의 JBS004+PD-1항체 투여량군을 제외하고, 나머지 병용 투여군의 치료 효율은 모두 어느 정도 향상되었다. JBS004의 치유율은 25%이고; PD-1항체가 5mg/kg일 경우, 치유율은 62.5%로서, 암세포 전이에 대한 억제 작용도 가장 유의하며; PD-1항체가 10mg/kg일 경우, 치유율은 37.5%로서, 암세포 전이에 대한 억제 작용은 JBS004를 단독으로 사용한 그룹 및 PD-1항체 투여량이 1mg/kg인 그룹보다 약하였다.
종합해보면, JBS004와 병용 시, PD-1항체의 최적 용량은 5mg/kg이다.
실시예6 종양 용해성 바이러스 백신과 PD-1항체를 병용 투여 시, JBS004상이한 투여 경로의 효과 전시
JBS004의 투여 경로는 비강내 적가, 종양내 주사, 정맥내 주사 및 복강내 주사를 포함하고; 임상적 투여의 편의성의 관점에서, 본 실시예는 종양내 주사 및 정맥내 주사만을 전시한다. 실시예4의 방법에 따라 폐암 이식 종양 모델(LLC-NY-ESO-1, 마우스)을 구축하고, 이식 종양 부피가 약 100mm3가 되면 처리를 시작한다. 대조군(PBS 주사)), JBS004 단독 종양내 주사군(IT), JBS004 단독 정맥내 주사군(IV), JBS004 종양내 주사(IT) 및 PD-1항체 결합군, JBS004 정맥내 주사(IV) 및 PD-1항체 결합군으로 설정하고, 각 그룹은 8마리의 마우스이다. 여기서, JBS004의 정맥내 투여량은 모두 109 pfu/마리이고, 종양내 투여량은 모두 108 pfu/마리이며; PD-1항체는 모두 복강내 주사 방식으로 투여되고, 1회 투여량은 모두 5mg/kg이다. 2일마다 1회 투여하고, 총 3회 투여하며, JBS004 및 PD-1항체의 투여 시간은 동일하다. 정맥내 투여량은 종양내 투여량보다 큰 것은, 정맥내 주사 후, 종양에 도달하기 전에, 약물이 유기체 내에서 어느 정도 손실되는 것을 고려하여; 종양에 도달하는 약물의 양이 종양내 주사군의 약물의 양과 동일하도록 하기 위하여 정맥내 약물의 양을 증가하였다.
각 그룹의 종양 부피 변화 상황은 도 31, 도 32에 도시된 바와 같고; 암세포 전이 상황은 도 33에 도시된 바와 같다. 각 도면으로부터 알 수 있다 시피, 종양내 주사 방식은 정맥내 주사보다 유의하게 우수하다. JBS004 종양내 주사와 PD-1항체로 병용 치료 후, 치유율은 62.5%이고; 동일한 경우에, JBS004 정맥내 주사의 치유율은 12.5%에 불과하였다.
실시예7 종양 용해성 바이러스 백신과 PD-1항체를 병용 투여 시, 상이한 1차 투여 순서의 효과 전시
이론적으로, JBS004가 종양 용해 작용을 발휘할 경우, 주로 T세포의 모집 및 종양으로의 국소 침윤을 통해 종양을 사멸한다. 그러나 T세포가 국소 종양에 도달한 후, 종양 미세 환경의 사이토카인과 투쟁하여야 함으로써 종양 용해 사멸 능력을 어느 정도 약화시킨다. 만약 PD-1항체를 사전 주입할 수 있다면 종양의 국소 면역 체크를 효과적으로 차단할 수 있어JBS004의 종양 용해 효과를 향상시킬 수 있다. 예비 시험 및 이론적 분석을 통해, 1차 투여 시 순서는 치료 효과에 큰 영향을 미치고, 후속 투여 순서는 치료 효과와 높은 상관관계가 없으므로, 본 실시예는 1차 투여 순서와 효과 사이의 관계만 전시한다. 1차 투여와 치료 효과 사이의 높은 상관관계에 대한 가능한 이유는 다음과 같다. (1)1차 투여 시, 종양 부피가 상대적으로 작고, 종양내 미세 환경이 더 쉽게 파괴되며; (2)후속 투여 시, 유기체 내에는 이미 일정량의 PD-1항체가 존재한다.
실시예4의 방법에 따라 폐암 이식 종양 모델(LLC-NY-ESO-1, 마우스)을 구축하고, 이식 종양 부피가 약 100mm3가 되면 처리를 시작한다. 각 그룹에 모두 8마리의 마우스를 설정하고, JBS004는 모두 종양내 주사하며, 단일 용량은 모두 108 pfu/마리이고; PD-1항체는 모두 복강내 주사로 투여하며, 1회 투여량은 모두 5mg/kg이고; 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여한다. PBS군을 설정하고, 200μL의 PBS를 복강내 주사하는 동시에, 50μL의PBS를 종양내 주사하며; 그룹1은 PD-1항체를 복강내 주사하는 동시에, JBS004를 종양내 주사하고; 그룹2는 먼저 PD-1항체를 복강내 주사하며, 6h 후 JBS004를 종양내 주사하고; 그룹3은 먼저 JBS004를 종양내 주사하며, 6h 후 PD-1항체를 복강내 주사한다.
각 그룹의 종양 부피 변화 상황은 도 34, 도 35에 도시된 바와 같고; 암세포 전이 상황은 도 36에 도시된 바와 같다. 동시 투여 시, 치유율은 62.5%이고; JBS004를 먼저 주사한 그룹의 치유율은 37.5%로 저하되며; PD-1항체를 먼저 투여한 그룹의 치유율은 87.5%에 도달하여 치료 효율이 유의하게 향상되었다.
종합해보면, 먼저 PD-1항체를 제공한 후, JBS004를 제공하여 병용 치료를 수행하면 치료 효과가 우수하다. 즉, JBS004와 PD-1항체를 병용할 경우, PD-1항체는 JBS004 이전에 체내에서 방출(작용 발휘)하여 치료 효과 향상에 보다 유리하다. 실제 적용 시, PD-1항체가 먼저 방출되거나 종양에 먼저 도달하여 작용을 발휘하도록 하기 위하여 선후 투여 방식을 사용할 수 있고, 약학적 수단을 사용할 수도 있다. 선후 투여 방식을 사용할 경우, 정맥내 주사, 종양내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등 방식으로 투여할 수 있다. 약학적 수단을 사용할 경우, JBS004 및 PD-1을 일체형 약물로 제조할 수 있고, 제조 과정에서 코팅, 도포 등 수단으로 JBS004 및 PD-1방출의 선후 순서 및 방출 시간을 제어한다.
실시예8 JBS004와 PD-1항체로 다른 종양(암)을 병용 치료하는 효과 전시
본 실시예에서, 각 그룹에 모두 8마리의 마우스를 설정하고, JBS004는 모두 종양내 주사하며, 단일 용량은 모두 108 pfu/마리이고; PD-1항체는 모두 복강내 주사 투여하며, 단일 투여량은 모두 5mg/kg이고; 2일마다 1회 투여하며, 총 3회 투여한다. 투여 순서는 먼저 PD-1항체를 제공하고, 6h 후 JBS004를 제공한다.
1. JBS004와 PD-1항체로 유방암(이식 종양)을 병용 치료하는 효과 전시.
BALB/c마우스에 5×105개의 4T1-NY-ESO-1세포(유방암 세포)를 동소 접종하고, 이식 종양 부피가 약 100mm3에 도달할 경우, 처리를 시작한다. PBS군, JBS004 단독 주사군, PD-1항체 단독 주사군, JBS004와 PD-1항체 병용 치료군을 설정한다.
각 그룹의 종양 부피 변화 상황은 도 37, 도38에 도시된 바와 같다. JBS004와 PD-1항체 병용 치료군의 치유율은 62.5%이고, 유효율은 100%이며, 효과는 다른 그룹에 비해 유의하게 우수하다.
2. JBS004와 PD-1항체로 결장암(이식 종양, 큰 종양)을 병용 치료하는 효과 전시. 기존의 임상 시험에 따르면, 알려진 암 치료 약물은 모두 일정한 부피를 초과한 큰 종양에 효과가 없다.
C57BL/6마우스에 MC38-NY-ESO-1세포(결장암 세포)를 피하 접종하고, 종양 부피가 200mm3~300mm3 사이에 도달할 경우, 처리를 시작한다. PBS군, JBS004 단독 주사군, PD-1항체 단독 주사군, JBS004와 PD-1항체 병용 치료군을 설정한다.
각 그룹의 종양 부피 변화 상황은 도 39, 도 40에 도시된 바와 같다. JBS004를 단독으로 제공할 경우, 결장암의 큰 종양을 어느 정도 치유할 수도 있음을 알 수 있다. 동시에, 발명자는 상기 모델 조건 하에서, PD-1항체가 큰 종양에도 어느 정도 예상 효과가 있는 것을 놀랍게도 발견하였다. 병용 치료군의 치유율은 75%로서, 양자의 단독 사용보다 유의하게 우수하였다.
전술한 상세한 설명은 해석 및 열거 방식으로 제공되고, 첨부된 특허청구범위를 제한하려는 것이 아니다. 현재 본 출원에 열거된 실시형태의 다양한 변화는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 것이고, 첨부된 특허청구범위 및 그 균등한 방식의 범위 내에 보류된다.
SEQUENCE LISTING <110> JOINT BIOSCIENCES (SH) LTD. <120> ONCOLYTIC VIRUS IN COMBINATION WITH IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR FOR TREATING TUMORS <130> 0190-PA-009 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Indiana strain of vesicular stomatitis virus(VSV MuddSummer) <400> 1 atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60 gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120 attgacaaat cctattttgg agttgacgag atggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180 tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240 tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300 aaacgtccct tctacaaaat cttggctttt ttgggttctt ctaatctaaa ggccactcca 360 gcggtattgg cagatcaagg tcaaccagag tatcacgctc actgcgaagg cagggcttat 420 ttgccacata ggatggggaa gacccctccc atgctcaatg taccagagca cttcagaaga 480 ccattcaata taggtcttta caagggaacg attgagctca caatgaccat ctacgatgat 540 gagtcactgg aagcagctcc tatgatctgg gatcatttca attcttccaa attttctgat 600 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Ile Glu Leu Thr Met Thr 165 170 175 Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His 180 185 190 Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe 195 200 205 Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser 210 215 220 Ile Ser His Phe Lys 225 <210> 3 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（M51R，ΔL111，V221F，S226R） <400> 3 atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60 gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120 attgacaaat cctattttgg agttgacgag agggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180 tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240 tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300 aaacgtccct tctacaaaat cttggctttt ggttcttcta atctaaaggc cactccagcg 360 gtattggcag atcaaggtca accagagtat cacgctcact gcgaaggcag ggcttatttg 420 ccacatagga tggggaagac ccctcccatg ctcaatgtac cagagcactt cagaagacca 480 ttcaatatag gtctttacaa gggaacgatt gagctcacaa tgaccatcta cgatgatgag 540 tcactggaag cagctcctat gatctgggat catttcaatt cttccaaatt ttctgatttc 600 agagagaagg ccttaatgtt tggcctgatt gtcgagaaaa aggcatctgg agcgtggttc 660 ctggactcta tccggcactt caaatga 687 <210> 4 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix Protein M（M51R，ΔL111，V221F，S226R）（PRT） <400> 4 Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Leu Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser 20 25 30 Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val 35 40 45 Asp Glu Arg Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe 50 55 60 Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile 85 90 95 Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Phe Gly Ser 100 105 110 Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln Pro 115 120 125 Glu Tyr His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met 130 135 140 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Claims (20)

  1. 종양 용해성 바이러스의 약독화 균주 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약물 조합으로서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 VSV MuddSummer 아형 균주와 비교하여 기질 단백질M이 변형되고, 상기 변형은 아미노산사이트의 111번째류 신인 코딩 염기의 녹아웃을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째류 신인 코딩 염기의 녹아웃인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 51번째 메티오닌이아르기닌으로의 돌연변이를 더 포함하는것을 특징으로 하는 약물 조합.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째류 신인 코딩 염기의 녹아웃 및 51번째 메티오닌이 아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 221번째 발린이페닐알라닌으로의 돌연변이를 더 포함하는것을 특징으로 하는 약물 조합.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 111번째류 신인 코딩 염기 녹아웃및 221번째 발린이페닐알라닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 226번째 세린이아르기닌으로 돌연변이된 아미노산 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째류 신인 코딩 염기의 녹아웃 및 226번째 세린이아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 아미노산 사이트의 111번째류 신인 코딩 염기의 녹아웃, 221번째 발린이페닐알라닌으로의 돌연변이및 226번째 세린이아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M의 변형은 51번째 메티오닌이아르기닌으로의 돌연변이; 111번째류 신인 코딩 염기 녹아웃; 221번째 발린이 페닐알라닌으로의 돌연변이 및 226번째 세린이아르기닌으로의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주의 기질 단백질M은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열에서의 임의의 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  12. 종양 용해성 바이러스 백신 및 면역 관문 억제제를 포함하는 약물 조합으로서,
    상기 종양 용해성 바이러스 백신은 제1항 내지 제11항 중 어느한 항에 따른 종양 용해성 바이러스 약독화 균주를 사용하여 제조되는 것을 특징으로하는 약물 조합.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 종양 용해성 바이러스 백신은 상기 종양 용해성 바이러스 약독화 균주에 항원을 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항원은 특이성 종양 항원인 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  15. 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 NY-ESO-1, gp33, gp100, TX103, Mucin-1, WT-1, MART-1, MAGE A1, MAGE A3, MAGE A4, MAGE B2, PRAME, SURVIVIN, MART-1, col6A3, tyrosinase, T antigen, SLC45A2, VCX/Y, HPV, 알파태아단백, 암배아항원, CA 125, Her2, 도파크롬호변이성화효소, BAGE 단백질, GAGE 단백질, 서바이빈, 티로시나아제, SSX2, 사이클린-A1, KIF20A, MUC5AC, Meloe, Lengsin, 칼리크레인4, IGF2B3 및 글리피칸3에서의 임의의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 관문 억제제는 anti-PD-1항체, anti-PD-L1항체, anti-CTLA4항체, anti-LAG-3항체, anti-TIM-3항체및 anti-SIGLEC15 항체에서의 임의의 하나로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 관문 억제제는 상기 종양 용해성 바이러스 백신 이전에 체내에서 방출되는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    항 종양 또는 암 치료가 가능한 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 종양 또는 암은 두경부암, 흑색종, 연조직육종, 유방암, 식도암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 자궁경부암, 신경모세포종, 활막육종 및 원형 세포 지방 육종에서의 임의의 하나로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 조합.
  20. 항 종양 또는 종양 치료 약물의 제조에서의 제1항 내지 제19항 중 어느한 항에 따른 약물 조합의 응용.
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