JP2022531976A - 弱毒化黄熱ウイルス及びがんの処置のためのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、弱毒化黄熱ウイルスを用いた、様々な形態の悪性腫瘍の処置のための設計された組換え型ウイルスの使用である。本発明の方法は、様々な臓器、例えば、乳房、皮膚、結腸、気管支、胃腸の上皮内層、上気道、尿生殖器、肝臓、前立腺、及び脳における悪性腫瘍の処置に特に有用である。乳癌及び黒色腫の処置に関しては、実験動物における驚異的な寛解が実証されている。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８４８，４４３号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の主張を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。

発明の分野
本発明は、悪性腫瘍に対する腫瘍溶解効果を誘導し、悪性腫瘍を処置するために黄熱ウイルスワクチン株、黄熱ウイルスワクチン株の改変バージョン、及び黄熱ウイルスの改変バージョンを使用する方法に関する。

背景
本明細書における全ての刊行物は、各々の刊行物または特許出願が、参照により援用されているように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度において、参照により援用される。以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれについても、今回請求する本発明に対する先行技術であることもしくはそれに関連することを認めるものではなく、または具体的もしくは暗黙的に言及された出版物が先行技術であることを認めるものでもない。

合成ウイルス学
ＤＮＡ合成技術の急速な向上により、ウイルス学で用いられる従来的な方法に変革がもたらされることが期待される。ウイルスゲノムの異なる領域の機能を排除するために従来より用いられているアプローチの１つでは、ウイルス株のゲノムにおける小さな配列バリエーションの影響を探索するのに、部位特異的変異誘発の使用が広範で労力を要するものとなる。しかし、ウイルスゲノム、特にＲＮＡウイルスのゲノムは比較的短く、多くの場合１０，０００塩基長未満であり、このようなゲノムは現状利用できる技術を用いた全ゲノム合成に適用可能である。最近開発されたマイクロ流体チップ系技術は、仕様通りに設計された新たなゲノムの新規合成を１件当たりわずか数百ドルで実施することができる。これにより、完全に新規のコード配列の生成や既存配列の調整が、従来のクローニング法では実質的に不可能な程度まで可能になる。このような設計の自由により、ＤＮＡ／ＲＮＡコード配列の大規模な再設計を実施する上で多大な力がもたらされ、（１）コドンバイアス、コドン対バイアス、及びＲＮＡ二次構造などのパラメーターの変化がウイルスの翻訳及び複製効率に及ぼす影響の研究、（２）ウイルス増殖を成功させるのに必要な未知の調節エレメント及びその他のシグナルのための効率的な完全ゲノムスキャンの実施、（３）ウイルス系統の遺伝子操作及び抗ウイルスワクチン設計のための新たなバイオテクノロジーの開発、（４）腫瘍溶解療法で使用するための改変ウイルスの合成、を行うことができる。

ウイルスゲノムの新規合成
ウイルスゲノムを新規に設計し合成するためにコンピューターベースのアルゴリズムが使用される。これらの合成されたゲノムは、本明細書に記載の黄熱ウイルス１７Ｄの合成によって例示されるように、がんの処置に使用することができる。

悪性腫瘍は、臓器内の細胞の制御不能な成長に起因することが知られている。腫瘍は、腫瘍浸潤、機能的組織の置換え、本質的リソースの競合、及びしばしば生じる２次的部位への転移的拡散により、正常な臓器機能が致命的に損なわれ得る程度まで成長する。悪性がんは、米国における死亡原因の第２位である。

悪性腫瘍を処置するための先行技術としては、外科的切除、放射線、及び／または化学療法が挙げられる。しかし、多くの悪性腫瘍は、従来から利用可能な全ての処置選択肢に対する応答が不十分であり、既知の実践されている方法には重大な副作用が存在する。副作用の重症度の低減に大きな進歩が見られ、一方で一般的に実践されている処置レジメンの効率が向上している。しかし、多くの問題が残されており、代替的な処置モダリティーを探索する必要がある。

近年、がんの処置のために、（１）遺伝子送達ビヒクルとして、（２）病原性特色を喪失するように遺伝子改変されたウイルスを使用することにより、直接的な腫瘍溶解媒介物として、または（３）この目的のために遺伝子操作されたウイルスを用いての、悪性細胞を選択的に損傷するための媒介物として、ウイルスを使用することが提案されている。

悪性神経膠腫に対するウイルスの使用例としては、以下のものが挙げられる。単純ヘルペスウイルスｄｌｓｐｔｋ（ＨＳＶｄｌｓｐｔｋ）は、ＨＳＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）陰性変異体である。このウイルスは、正常なウイルス複製に必要な産物をもたらすＴＫ遺伝子の３６０塩基対が欠失していることにより、神経毒性が弱毒化されている。ＨＳＶｄｌｓｐｔｋは、細胞の溶解及び死を引き起こす悪性細胞を迅速に分割する増殖の潜在能力を保持することが分かっている。残念ながら、神経病原性が弱毒化された全ての欠陥ヘルペスウイルスは、実験動物における脳炎の重篤な症状との関連が見られている。例えば、脳内にＨＳＶｄｌｓｐｔｋを感染させたマウスにおいて、ＬＤ_５０ ^Ｉｃ（頭蓋内投与）は１０^６ｐｆｕとかなり低用量である。これが、この変異体ＨＳＶの使用を制限する。他のＨＳＶ変異体が提案され、試験されている。それにもかかわらず、ウイルス性脳炎による死亡が依然として問題となっている。

別の提案は、ＨＳＶ ｔｋ遺伝子を含むように操作されたレトロウイルスを使用して、ガンシクロビルやアシクロビルのようなヌクレオシドアナログのｉｎ ｖｉｖｏリン酸化を引き起こすチミジンキナーゼを発現させ、ＤＮＡ複製を遮断し、分裂細胞を選択的に殺滅することであった。Ｉｚｑｕｅｒｄｏ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２：６６－６９（１９９５）（非特許文献1）は、ＨＳＶ ｔｋ遺伝子及びそのプロモーターの挿入により操作されたモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の使用について報告した。治療用レトロウイルスの新生物内接種で処置した神経膠芽腫患者をＭＲＩにより経過観察したところ、明らかな短期的副作用を伴わない腫瘍の減少が明らかになった。しかし、この実験的療法は、罹患患者の短期生存率にも長期生存率にも影響を及ぼさなかった。レトロウイルス療法は、典型的には、重篤な長期的副作用（例えば、挿入変異誘発）の危険性を伴う。

同様のシステムが、上気道の悪性腫瘍、アデノウイルス感染に対し天然に感受性の組織内で生じ、アクセスが容易な腫瘍を標的とするように開発されている。しかし、多形神経膠芽腫は、広範に異種の細胞型から構成された（多形という名称はこのためである）高度に悪性の腫瘍であるが、極めて可変性の遺伝子型によって特徴づけられ、一様な遺伝子異常を伴った均質の腫瘍を対象とする腫瘍溶解ウイルスシステムに応答する可能性は低い。

Ｉｚｑｕｅｒｄｏ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２：６６－６９（１９９５）

本発明者らのウイルス改変の効果は、当業者に知られている方法で確認することができる。非限定的な例としては、プラークアッセイ、増殖測定、ＲＮＡウイルスの逆遺伝学、及び試験動物における致死率低下が挙げられる。本出願は、改変ウイルスが、宿主における防御免疫応答を誘導可能であることと、宿主における抗腫瘍応答を誘導可能であることとを実証する。

発明の概要
以下の実施形態及びその態様は、範囲を限定しないように意図されている代表的かつ例示的な組成物及び方法と共に、記載及び例示される。

本発明の目的は、本明細書でさらに記載されるように、様々なタイプのがんの処置のための弱毒化黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を開発することである。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは黄熱ウイルス株１７Ｄワクチン（ＹＦＶ １７Ｄ）である。様々な実施形態において、ＹＦＶ １７Ｄは合成ＹＦＶ １７Ｄである。

本発明のさらなる目的は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療薬またはその他の免疫オンコロジー療法と組み合わせて使用することができる、様々なタイプのがんの処置のための弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させてがん細胞の溶解及び死を引き起こすことにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて抗腫瘍免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ１、ＴＩＭ３、ｌａｇ－３などの抗腫瘍免疫タンパク質の発現を増加または減少させることによって抗腫瘍免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて腫瘍における自然免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて、腫瘍における自然シグナリング受容体ＲＩＧ－Ｉ、ＳＴＮＧ、ならびに自然免疫転写因子ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、またはＮＦｋＢの活性化を介して腫瘍細胞における自然免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて、腫瘍における炎症促進性免疫応答を誘発することにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて、腫瘍に炎症促進性白血球を動員することにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、がん細胞に弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を感染させて、腫瘍から調節性白血球を減少させることにより、がん細胞を処置することである。

本発明のさらなる目的は、レシピエントを弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）で前処置して免疫応答を誘発した後に、当該ウイルスを投与してがんを処置することである。

本発明のさらなる目的は、腺癌、特に子宮頚癌の処置に適していると考えられる弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、（例えば、免疫ペルオキシダーゼ染色によって）ケラチンに対し陽性のがん細胞の処置に適していると考えられる弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、ｐ５３遺伝子発現が低いまたはないと報告されているがん細胞の処置に適していると考えられるさらなる弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、細胞が低二倍体である腫瘍の処置に適していると考えられるさらなる弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、肺癌腫、特に肺癌の処置に適している弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、低三倍体（例えば、細胞の約４０％で染色体数６４、６５、または６６）であるがんの処置に適している弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、細胞当たり単一コピーの染色体Ｎ２及びＮ６を有したがんの処置に適している弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、酵素グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の酵素のアイソエンザイムＧ６ＰＤ－Ｂを発現するがんの処置に適切である弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、黒色腫の処置に適している弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、メラニン細胞に由来する悪性細胞の処置に適している弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、少なくとも３倍のＭＹＣＮ腫瘍遺伝子増幅を有するがんの処置に適している弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、乳癌の処置に適した弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することであり、様々な実施形態では、これは、トリプルネガティブ乳癌の処置のためのものである。

本発明のさらなる目的は、膀胱癌の処置に適した弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、大腸癌の処置に適した弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、前立腺癌の処置に適した弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

本発明のさらなる目的は、末梢神経鞘腫瘍の処置に適した弱毒化黄熱ウイルス（例えば、合成ＹＦＶ １７Ｄ）を開発することである。

また、本発明の実施形態は、対象において処置するための治療用組成物であって、黄熱ウイルス１７Ｄと、医薬的に許容される担体とを含む、治療用組成物も提供する。また、本発明は、対象における免疫応答を誘発するための治療用組成物であって、黄熱ウイルス１７Ｄと、医薬的に許容される担体とを含む、治療用組成物も提供する。本発明はさらに、野生型宿主細胞内では生存不能な黄熱ウイルス１７Ｄに許容的であるように特別に操作された、改変宿主細胞株を提供する。

本発明によれば、合成黄熱ウイルス１７Ｄは、合成ウイルスゲノムを宿主細胞に形質移入してウイルス粒子を産生することにより、作製される。本発明はさらに、がんの処置に適した合成黄熱ウイルス１７Ｄを含む医薬組成物を提供する。

これらの目的を促進するため、本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍を処置する、または腫瘍サイズを縮小する方法であって、弱毒化黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。本発明の様々な実施形態は、悪性腫瘍を処置する方法であって、弱毒化ＹＦＶのプライム用量を、それを必要とする対象に投与する工程と、弱毒化ＹＦＶの１回以上のブースト用量を、それを必要とする対象に投与する工程とを含む、方法を提供する。本発明の様々な実施形態は、腫瘍サイズを縮小する方法であって、弱毒化ＹＦＶのプライム用量を、それを必要とする対象に投与する工程と、弱毒化ＹＦＶの１回以上のブースト用量を、それを必要とする対象に投与する工程とを含む、方法を提供する。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶはＹＦＶ株１７Ｄワクチン（ＹＦＶ １７Ｄ）であり得る。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは合成ＹＦＶ株１７Ｄ（ＹＦＶ １７Ｄ）であり得る。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、ＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶであり得る。

様々な実施形態において、プライム用量は、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与され得る。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、腫瘍内または静脈内に投与され得る。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量の１回目は、１回のプライム用量から約２週間後に、またはプライム用量が２回以上の場合は最後のプライム用量から約２週間後に投与することができる。

様々な実施形態において、対象はがんを有する可能性がある。

様々な実施形態において、プライム用量は、対象ががんを有しないときに投与され得る。様々な実施形態において、対象はがんを発症するリスクが高い可能性がある。

様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、対象ががんを有しないときに、プライム用量後１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与され得る。様々な実施形態において、対象はその後がんと診断され、対象ががんと診断された後に、１回以上のブースト用量が投与され得る。

様々な実施形態において、方法はさらに、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を投与する工程を含み得る。様々な実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は抗ＰＤ１抗体であり得る。様々な実施形態において、抗ＰＤ１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、スパルタリズマブ、セミプリマブ、ＡＫ１０５、ＢＣＤ－１００、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ００１、ＬＺＭ００９、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ－０４２、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、チスレリズマブ、及びこれらの組合せからなる群より選択され得る。様々な実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＦ－０６８０１５９１、抗ＰＤ１抗体を発現する多能性キラーＴリンパ球（ＰＩＫ－ＰＤ－１）、自家抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４ＳＣＡＲ－ＩｇＴ細胞、及びこれらの組合せからなる群より選択され得る。様々な実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得る。様々な実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＣＫ－３０１、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ－１３１６、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＣＫ－３０１、及びこれらの組合せからなる群より選択され得る。様々な実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１阻害剤はＭ７８２４であり得る。

様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することは、悪性腫瘍の再発の可能性を低下させ得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することは、前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを有する可能性を低下させ得る。様々な実施形態において、対象が前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせ得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象が前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせ得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することは、腫瘍における炎症性免疫応答を刺激し得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することは、炎症促進性細胞を腫瘍に動員させ得る。様々な実施形態において、悪性腫瘍を処置することは、抗腫瘍免疫応答を刺激し得る。

様々な実施形態において、悪性腫瘍は固形腫瘍を減少させ得る。様々な実施形態において、神経膠腫、神経芽腫、多形性膠芽腫、腺癌、髄芽腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、気管支癌、類表皮癌、及び黒色腫からなる群より選択される悪性腫瘍が減少し得る。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、腫瘍内、静脈内、脳内、筋肉内、脊髄内、または髄腔内に投与され得る。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶを投与することは、腫瘍細胞における細胞溶解を引き起こし得る。

本発明の他の特徴及び利点は、本発明の実施形態の様々な特徴を例として示す添付の図面と合わせて、以下の詳細な説明から明らかになる。

参照される図面には代表的な実施形態が例示されている。本明細書で開示される実施形態及び図面は、限定ではなく例示とみなされるように意図されている。

図１は、例示的な処置プロトコルを示している。 図２Ａ～２Ｃは、マウスにおける合成ＹＦＶ １７Ｄの免疫原性を示している。図２Ａは、０日目及び２１日目に５×１０^６ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄをワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した血清の中和抗体価を示している。０、２１、及び３５日目に血清を採取し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）試験を用いて中和抗体を調べた。初回のワクチン接種後、全てのマウスが血清転換した（ＰＲＮＴ５０≧３２）。ＰＲＮＴ５０力価の平均は、２１日目（２４３．２）から３５日目（２４０．０）まで有意に増加しなかった。このことから、ブースト用量後にＹＦＶ １７Ｄの複製を防止する殺菌免疫が誘導されたことが示される。図２Ｂは、０日目及び２１日目に５×１０^６ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄをワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した血清中の中和抗体価を示している。０、２１、及び３５日目に血清を採取し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）試験を用いて中和抗体を調べた。初回のワクチン接種後、全てのマウスが血清転換した（ＰＲＮＴ５０≧３２）。ブーストから２週間後、ＰＲＮＴ５０の平均は４４．８から１９５．２に増加し、有意な増加となった（ｐ＝０．０１；対応のあるｔ検定）。図２Ｃは、０日目及び２１日目に５×１０^６ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄをワクチン接種したＤＢＡ／２マウスから採取した血清中の中和抗体価を示している。０、２１、及び３５日目に血清を採取し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）試験を用いて中和抗体を調べた。初回のワクチン接種後、全てのマウスが血清転換した（ＰＲＮＴ５０≧３２）。ＰＲＮＴ５０力価の平均は、２１日目（１９２）から３５日目（１６０．０）まで有意に増加しなかった。このことから、ブースト用量後にＹＦＶ １７Ｄの複製を防止する殺菌免疫が誘導されたことが示される。 図３Ａ～３Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの移植同系Ｂ１６黒色腫細胞の処置における合成ＹＦＶ １７Ｄの有効性を示している。マウスに０日目及び２１日目にワクチン接種し、３８日目に移植し、次いで４９、５１、５３、５６、６９、７１、７６、及び７８日目に１０^７ＰＦＵを送達して８回処置した。図３Ａは、ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスの経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ^３）を示している。マウスの右脇腹に１００μｌの体積中１０^５のＢ１６細胞を皮下送達して移植し、０．２％のＢＳＡ ＭＥＭで模擬処置（ｎ＝１０）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝１０）した。図３Ｂは生存率を示しており、ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて１，０００ｍｍ^３以上の腫瘍体積という人道的初期エンドポイントを用いて算出した。マウスの右脇腹に１００μｌの体積中１０^５のＢ１６細胞を皮下送達して移植し、模擬処置（ｎ＝１０）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝１０）した。 図４Ａ～４Ｂは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの移植同系ＥＭＴ－６トリプルネガティブ乳癌細胞の処置における合成ＹＦＶ １７Ｄの有効性を示している。マウスに０日目及び２１日目にワクチン接種し、３７日目に移植し、次いで４０、４２、４４、４６、４９、５１、５８、６５、及び６７日目に１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄを送達して９回処置した。図４Ａは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ^３）を示している。１００μｌの体積中１０^４のＥＭＴ－６細胞を腹部脂肪パッドに皮下送達して移植し、模擬処置（ｎ＝１０）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝１０）した。図４Ｂは生存率を示しており、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて５００ｍｍ^３以上の腫瘍体積という人道的初期エンドポイントを用いて算出した。マウスの腹部脂肪パッドに１００μｌの体積中１０^４のＥＭＴ－６細胞を皮下送達して移植し、模擬処置（ｎ＝１０）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝１０）した。 図５Ａ～５Ｂは、ＤＢＡ／２マウスの移植同系ＣＣＬ５３．１黒色腫細胞の処置における合成ＹＦＶ １７Ｄの有効性を示している。マウスに０日目及び２１日目にワクチン接種し、４５日目に移植し、次いで５１、５３、５６、５８、６０、６３、６５、７２、及び７９日目に１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄを送達して９回処置した。図５Ａは、ＤＢＡ／２マウスの経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ^３）を示している。マウスの右脇腹に１００μｌの体積中１０^５のＤＢＡ／２細胞を皮下送達して移植し、０．２％のＢＳＡ ＭＥＭで模擬処置（ｎ＝８）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝８）した。図５Ｂは生存率を示しており、ＤＢＡ／２マウスにおいて１，０００ｍｍ^３以上の腫瘍体積という人道的初期エンドポイントを用いて算出した。マウスの右脇腹に１００μｌの体積中１０^５のＣＣＬ５３．１細胞を皮下送達して移植し、模擬処置（ｎ＝８）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝８）した。 図６は、ＤＢＡ／２マウスへのＹＦＶ １７Ｄ接種からの中和抗体価（ＰＲＮＴ５０）を示している。ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝８）に、０日目及び２１日目に５×１０^６ＰＦＵのＹＦＶ １７Ｄを接種し、０、２１、及び３５日目に滴定用の血清を採取した。 図７Ａ～７Ｃは、ＤＢＡ／２マウスのＣＣＬ－５３．１黒色腫処置におけるＹＦＶ １７Ｄの有効性を示している。１０^５のＣＣＬ－５３．１細胞を移植し、１０^７ＰＦＵのＹＦＶ １７Ｄを９回腫瘍内に注入したＤＢＡ／２マウスにおける処置の有効性を移植後（ＤＰＩ）６０日間追跡した。Ａ）ＹＦＶ １７Ｄをワクチン接種及び処置したマウスでは、腫瘍サイズ中央値（ｍｍ^３）が模擬処置対照群に比べて縮小した。Ｂ）腫瘍サイズ中央値（開始時腫瘍サイズと比較しての％）も処置動物では縮小した。Ｃ）模擬処置対照に比べて、処置マウスで生存率（＜１，０００ｍｍ^３）が増加した。 図８Ａ～８Ｂは、後続の攻撃に対し持続的な免疫をもたらす合成ＹＦＶ１７Ｄ処置の有効性を示している。ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０日目及び２１日目にワクチン接種し、３７日目に移植し、次いで４０、４２、４４、４６、４９、５１、５８、６５、及び６７日目に１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄを送達して９回処置した。半数のマウスは、脂肪パッドに移植したＥＭＴ－６腫瘍が治癒し、８８日目には明らかな腫瘍は認められなかった。治癒したマウスに、８８日目に１００μｌの体積中１０^４のＥＭＴ－６を右脇腹に皮下送達して攻撃し、腫瘍の成長を毎日追跡した。Ａは、攻撃ＢＡＬＢ／Ｃマウスの経時的な平均腫瘍体積（ｍｍ^３）を示している。Ｂは、合成ＹＦＶ １７Ｄ処置によって以前に治癒したマウス（ｎ＝３）またはナイーブ対照マウス（ｎ＝８）における、１０^４のＥＭＴ－６細胞による攻撃後に検出可能な腫瘍を有するパーセンテージを示している。

発明の説明
本明細書で引用されている全ての参考文献は、その全体が、完全に記載されているかのように参照により本明細書に援用される。別途記載のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３^ｒｄ ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００６）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４^ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２０１２）は、本出願で使用されている用語の多くに対する全般的指針を当業者に提供する。

本発明の実施において使用することができる本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法及び材料を、当業者は認識するであろう。実際に、本発明は、記載されている方法及び材料に決して限定されるものではない。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、参照される数値表示に関連して使用される際、本明細書で別段の明記がない限り、参照される数値表示のプラスマイナス５％以内を意味する。例えば、「約５０％」という表現は４５％～５５％の範囲を網羅する。様々な実施形態において、「約」という用語は、参照される数値表示に関連して使用される際、特許請求の範囲で具体的に示される場合、参照される数値表示のプラスマイナス４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％以内を意味し得る。

「対象」とは、任意の動物または人為的に改変された動物を意味する。動物としては、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、及びモルモット）、ならびに鳥類が挙げられる。人為的に改変された動物としては、限定されるものではないが、ヒト免疫システムを有するＳＣＩＤマウス、実験用マウスの非近交または近交系統、無胸腺ヌードマウスが挙げられる。好ましい実施形態において、対象はヒトである。鳥類の好ましい実施形態は家禽種であり、これには、限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、及びガチョウが含まれる。

腫瘍溶解性ウイルス組成物及び医薬組成物
本発明の諸実施形態は、弱毒化黄熱ウイルスを提供する。本発明の様々な実施形態は、弱毒化された黄熱ウイルスと、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。様々な実施形態において、医薬品として許容される担体または賦形剤はソルビトールまたはゼラチンであり、これらは安定剤として使用され得る。様々な実施形態において、弱毒化黄熱ウイルスを含む組成物（例えば、ワクチン調製物）は、凍結乾燥し、コールドチェーン条件下で保存することができる。

様々な実施形態において、医薬的に許容される担体または賦形剤は、がん処置のための弱毒化黄熱ウイルスの送達に特に適しており、例えば、腫瘍部位への送達の強化に適している。このような担体の例としては、限定されるものではないが、カーボンナノチューブ、層状複水酸化物（ＬＤＨ）、酸化鉄ナノ粒子、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）、ポリマーナノ粒子、リポソーム、ミセル、タンパク質ナノ粒子、及びデンドリマーが挙げられる。

弱毒化黄熱ウイルスとは、哺乳類、特にヒトにおいて黄熱を引き起こさない、または引き起こす可能性が０．０１％未満のウイルスである。

様々な実施形態において、弱毒化黄熱ウイルスは、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）１７Ｄワクチン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３３１４（ＰＯＬＧ＿ＹＥＦＶ１））である。

弱毒化生ＹＦＶ １７Ｄワクチン株は、１９２７年にガーナで単離された野生型ＹＦウイルス（Ａｓｉｂｉ株）に由来し、ニワトリ胚組織培養での連続継代によって弱毒化されている。現在、孵化鶏卵でのワクチン生産には１７Ｄワクチンウイルスの２つの亜系、すなわち１７Ｄ－２０４及び１７ＤＤが使用されている。いくつかのワクチンは、１７Ｄ－２０４（１７Ｄ－２１３）の異なる亜系からも調製される。したがって、様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶ １７Ｄは、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３である。

様々な実施形態において、黄熱ウイルス１７Ｄワクチン（及びその亜系）は合成ＹＦＶ １７Ｄである。合成ＹＦＶ １７Ｄ及び合成ＹＦＶ １７Ｄ亜系は、それぞれ弱毒化ＹＦＶ １７Ｄ及び弱毒化ＹＦＶ １７Ｄ亜系と同じウイルスゲノムを有する。

本発明の様々な実施形態は、弱毒化ＹＦＶウイルスであって、ゲノム内の１つ以上の位置で操作されたヌクレオチド置換を含む改変ウイルスゲノムを含み、置換が、複数の同義コドン（例えば、コドン対脱最適化）をゲノム内に導入する、及び／または同じアミノ酸における既存コドンの順序の変化（コドン対利用の変化（例えば、コドン対脱最適化））を導入する、弱毒化ＹＦＶウイルスを提供する。いずれの場合も、元のワクチン株のアミノ酸配列は保持される。

したがって、本発明の様々な実施形態は、コドン脱最適化黄熱ウイルスを提供する。

様々な実施形態において、コドン脱最適化黄熱ウイルスは、タンパク質コード配列内に少なくとも１０の脱最適化コドンを含み、少なくとも１０の脱最適化コドンは、各々が黄熱ウイルスにおいて使用頻度が比較的低い同義コドンである。様々な実施形態において、コドン脱最適化黄熱ウイルスは、タンパク質コード配列内に少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の脱最適化コドンを含み、このとき、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の脱最適化コドンは、各々が黄熱ウイルスにおいて使用頻度が比較的低い同義コドンである。黄熱ウイルスにおいて使用頻度が比較的低い同義コドンは、同じアミノ酸をコードするコドンであり、ただしこのコドンは、アミノ酸に関して黄熱ウイルスが選好しないコドンである。

（表１）黄熱ウイルス（１７Ｄ株）コドン使用頻度

黄熱ウイルス１７Ｄ株、１０，２３３ヌクレオチドの長いオープンリーディングフレーム（終止コドンを除く３４１１コドン）のコドン使用頻度。Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）からのデータ

様々な実施形態において、コドン脱最適化黄熱ウイルスは、タンパク質コード配列内に少なくとも１０の脱最適化コドンを含み、少なくとも１０の脱最適化コドンは、各々がウイルス宿主（例えば、ヒト）において使用頻度が比較的低い同義コドンである。様々な実施形態において、コドン脱最適化黄熱ウイルスは、タンパク質コード配列内に少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の脱最適化コドンを含み、このとき、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の脱最適化コドンは、各々がウイルス宿主（例えば、ヒト）において使用頻度が比較的低い同義コドンである。ウイルス宿主において使用頻度が比較的低い同義コドンは、同じアミノ酸をコードするコドンであり、ただしこのコドンは、アミノ酸に関してウイルス宿主が選好しないコドンである。ヒトにおいて使用頻度が比較的低い同義コドンは、同じアミノ酸をコードするコドンであり、ただしこのコドンは、アミノ酸に関してヒトが選好しないコドンである。

様々な実施形態において、コドン脱最適化黄熱ウイルスは、ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３と同じアミノ酸配列を有する。様々な実施形態において、コドン脱最適化黄熱ウイルスは、ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３のアミノ酸配列に比べて最大１、２、３、４、または５のアミノ酸変化を有する。アミノ酸変化は、異なるアミノ酸、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の付加であり得る。

コドン脱最適化の方法は、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６２４１号に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

本発明の様々な実施形態は、コドン対脱最適化（ＣＰＤ）黄熱ウイルスを提供する。

様々な実施形態において、コドン対脱最適化黄熱ウイルスは、黄熱ウイルスをコドン対脱最適化する前の黄熱ウイルスに比べてコドン対バイアス（ＣＰＢ）の低下を含む。したがって、コドン対脱最適化黄熱ウイルスは、タンパク質コード配列内の既存のコドンを再構成することを含む。タンパク質コード配列内の既存のコドンを再構成することは、コドン対を、より低いコドン対スコアを有するコドン対で置換することを含む。

そのため、このウイルスは、再コードされたタンパク質コード配列であって、各配列が、親タンパク質コード配列からの既存の同義コドンを再構成された順序で有し、かつこの配列が由来する親タンパク質コード配列のＣＰＢよりも小さいＣＰＢを有する、再コードされたタンパク質コード配列を含む。

いくつかの実施形態において、コドン対のサブセットは、同義コドンのサブセットを再構成することによって置換される。他の実施形態において、コドン対は、再構成された同義コドンの数を最大化することによって置換される。留意されたいのは、コドンの再構成によって、ウイルスコード配列全体ではコドン対バイアスが低下し（よりマイナスになり）、この再構成によって多くの位置でコドン対スコア（ＣＰＳ）が低下するが、他の位置ではＣＰＳの増加を伴う場合もあることである。しかし、平均すれば、コドン対スコア、ひいては改変配列のＣＰＢは低下する。

様々な実施形態において、ＣＰＢは、少なくとも０．０１、少なくとも０．０２、少なくとも０．０３、少なくとも０．０４、少なくとも０．０５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１５、少なくとも０．２０、少なくとも０．２５、少なくとも０．３０、少なくとも０．３５、少なくとも０．４０、少なくとも０．４５、または少なくとも０．５０低下する。

様々な実施形態において、コドン対バイアスは、黄熱ウイルスにおけるコドン対の使用頻度に基づいている。様々な実施形態において、コドン対バイアスは、ヒトにおけるコドン対の使用頻度に基づいている。

様々な実施形態において、コドン対脱最適化黄熱ウイルスは、ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３と同じアミノ酸配列を有する。様々な実施形態において、コドン対脱最適化黄熱ウイルスは、ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３のアミノ酸配列に比べて最大１、２、３、４、または５のアミノ酸変化を有する。アミノ酸変化は、異なるアミノ酸、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の付加であり得る。

コドン対脱最適化の方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８９５２号に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

本発明の様々な実施形態は、ＣＧ及び／またはＴＡ（またはＵＡ）ジヌクレオチド含有量の頻度が変更された脱最適化黄熱ウイルスを提供する。様々な実施形態において、脱最適化ＹＦＶにおけるＣｐＧジヌクレオチドの含有量が増加する。様々な実施形態において、脱最適化ＹＦＶにおけるＵｐＡジヌクレオチドの含有量が増加する。

様々な実施形態において、脱最適化黄熱ウイルスは、ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３と同じアミノ酸配列を有する。様々な実施形態において、脱最適化黄熱ウイルスは、ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３のアミノ酸配列に比べて最大１、２、３、４、または５のアミノ酸変化を有する。アミノ酸変化は、異なるアミノ酸、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の付加であり得る。

ＣＧ及び／またはＴＡ（またはＵＡ）ジヌクレオチドの含有量を変更する方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８９５２号に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

本発明の弱毒化ＹＦＶ、特に合成ＹＦＶ １７Ｄは、様々な臓器、例えば、乳房、結腸、気道、胃腸の上皮内層、上気道、尿生殖器、肝臓、前立腺、脳、または任意の他のヒト組織の腫瘍サイズを縮小し、悪性腫瘍を処置するための予防用及び治療用組成物に有用である。様々な実施形態において、本発明の改変ＹＦＶは、固形腫瘍のサイズを縮小し、固形腫瘍を処置するのに有用である。特定の実施形態において、処置されるまたはサイズが縮小される腫瘍は、神経膠腫、膠芽腫、腺癌、黒色腫、または神経芽腫である。様々な実施形態において、腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である。

本発明の医薬組成物はさらに、悪性腫瘍の予防向けの他の治療薬を含んでもよい。例えば、本発明の改変ＹＦＶは、手術、放射線療法、及び／または化学療法と組み合わせて使用してもよい。さらに、１つ以上の改変ＹＦＶは、上記の治療手順のうちの２つ以上と組み合わせて使用してもよい。このような併用療法は、より低い投薬量の投与治療剤を有利に利用することで、様々な単剤療法に関連するあり得る毒性または有害作用を回避し得る。

本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明に従う１つ以上の改変ＹＦＶと、医薬的に許容される担体とを含む。「治療有効量」とは、がん細胞を溶解させて腫瘍壊死を引き起こすことが可能な量を意味する。「医薬的に許容される担体」とは、投与される患者にアレルギー反応またはその他の不利な効果を引き起こさない担体を意味する。

好適な医薬的に許容される担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、及びこれらの組合せを含む。医薬的に許容される担体はさらに、少量の補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、保存料、または緩衝液を含んでもよく、これらは改変されたウイルスキメラの貯蔵寿命または有効性を増強する。

本発明の組成物は、様々な形態をとることができる。このような形態としては、例えば、液体剤形、例えば、液体の溶液、分散液、または懸濁液、注射及び点滴溶液が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式及び予防用途かまたは治療用途かに依存する。好ましい組成物は、注射または点滴溶液の形態をとる。

組換え型の改変ＹＦＶは、周知されている組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。ＤＮＡ技術の標準的マニュアルは、本発明の改変ウイルスキメラを産生するための詳細なプロトコルを提供する。

本発明はさらに、本明細書に記載の任意のウイルスを合成する方法であって、（ａ）合成する標的ウイルスを同定することと、（ｂ）標的ウイルスを完全にシークエンシングするか、または公的または私的に利用可能なデータベース上で配列を検索することと、（ｃ）ゲノムのコード領域及び非コード領域を含むＤＮＡを、「感染性クローン」として知られる完全なプラスミドとして、または重複ＰＣＲを用いて連結され得る合成ＤＮＡの個々の断片として新規合成することとを含む、方法を提供する。さらなる実施形態において、全ゲノムが合成ＤＮＡで置換される。またさらなる実施形態において、ゲノムの一部が合成ＤＮＡで置換される。なお他の実施形態において、このゲノムの一部はカプシドコード領域である。

がんの予防処置及び治療処置
本発明は、様々な腫瘍タイプを処置するための腫瘍溶解療法として使用され得る黄熱ウイルス及びこのような黄熱ウイルスを含む組成物の生産、ならびに弱毒化ＹＦＶウイルス、例えば、弱毒化（脱最適化による弱毒化を含む）ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、特に本明細書に記載の合成ＹＦＶ １７Ｄを投与することにより、腫瘍及びがんを処置する方法に関する。

既存のがんの処置
本発明の様々な実施形態は、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法を提供する。様々な実施形態において、このタイプの処置は、対象ががんと診断されたときに行われ得る。方法は、弱毒化ＹＦＶを、それを必要とする対象に投与する工程を含む。弱毒化ＹＦＶは、本明細書で提供されるような医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物で提供し、投与することができる。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、本発明の出願日時点でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３３１４（ＰＯＬＧ＿ＹＥＦＶ１）として提供される配列を有するＹＦＶ １７Ｄワクチンである。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３である。

様々な実施形態において、黄熱ウイルス１７Ｄワクチン（及びその亜系）は合成ＹＦＶ １７Ｄである。合成ＹＦＶ １７Ｄ及び合成ＹＦＶ １７Ｄ亜系は、それぞれ弱毒化生ＹＦＶ １７Ｄ及び弱毒化生ＹＦＶ １７Ｄ亜系と同じウイルスゲノムを有する。

様々な実施形態において、弱毒化黄熱ウイルスは、コドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶである。

様々な実施形態において、悪性腫瘍に腫瘍溶解効果を誘導することは、結果的に悪性腫瘍を処置する。

様々な実施形態において、処置方法はさらに、ＰＤ－１阻害剤を投与する工程を含む。他の実施形態において、処置方法はさらに、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を投与する工程を含む。また他の実施形態において、処置方法はさらに、ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の両方を投与する工程を含む。

様々な実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は抗ＰＤ１抗体である。様々な実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。使用されるＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の例は、本明細書に示されている。

様々な実施形態において、悪性腫瘍の処置は、悪性腫瘍の再発の可能性を低下させる。これは、前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを有する可能性も低下させ得る。対象が前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせる。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象は前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症し、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせる。

プライム－ブースト処置
本発明の様々な実施形態は、プライム－ブースト型処置レジメンを用いて、免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法を提供する。様々な実施形態において、免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導することは、結果的に悪性腫瘍を処置する。

弱毒化ＹＦＶ、詳細には本発明の合成ＹＦＶ １７Ｄのプライム用量を投与して、初期の免疫応答を誘発する。その後、弱毒化ＹＦＶ、詳細には本発明の合成ＹＦＶ １７Ｄのブースト用量は、腫瘍に対する腫瘍溶解効果を誘導するように、及び／または腫瘍に対する腫瘍溶解効果を含む免疫応答を誘発するように投与される。

様々な実施形態において、方法は、弱毒化ＹＦＶ、特に合成ＹＦＶ １７Ｄのプライム用量を、それを必要とする対象に投与する工程と、弱毒化ＹＦＶ、特に合成ＹＦＶ １７Ｄの１回以上のブースト用量を、それを必要とする対象に投与する工程とを含む。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３である。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、コドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶである。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、コドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３である。

様々な実施形態において、プライム用量は、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される。

様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、腫瘍内、静脈内、髄腔内、または新生物内（腫瘍内に直接）に投与される。好ましい投与様式は、腫瘍部位に直接行う様式である。

プライム及びブースト投薬間のタイミングは、例えば、がんのタイプ、がんのステージ、及び患者の健康状態に応じて異なり得る。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量の１回目は、プライム用量の約２週間後に投与される。すなわち、プライム用量が投与され、その約２週間後にブースト用量が投与される。

様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、プライム用量の約１週間後に投与される。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、プライム用量の約２週間後に投与される。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、プライム用量の約３週間後に投与される。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、プライム用量の約４週間後に投与される。様々な実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５回のブースト用量が投与される。様々な実施形態において、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または４５～５０のブースト用量が投与される。様々な実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間とすることができる。さらなる実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヵ月とすることができる。非限定的な例として、プライム用量が投与され、その約２週間後に１回目のブースト用量が投与され、１回目のブースト用量の約１ヵ月後に２回目のブースト用量が投与され、２回目のブースト用量の約６ヵ月後に３回目のブースト用量が投与され得る。別の非限定的な例として、プライム用量が投与され得、その約２週間後に１０回のブースト用量が１週間に１回の割合で投与される。別の非限定的な例として、プライム用量が投与され、その約２週間後に１回目のブースト用量が投与され、１回目のブースト用量の約６ヵ月後に２回目のブースト用量が投与され、２回目のブースト用量の約１２ヵ月後に３回目のブースト用量が投与され得る。さらなる実施形態において、追加のブースト投薬は、定期的に、例えば、１年毎、２年毎、５年毎、１０年毎などで投与され得る。

様々な実施形態において、投薬量は、プライム及びブースト投薬間で異なり得る。非限定的な例として、プライム用量は、ブースト用量よりも少ないコピー数のウイルスを含むことができる。

他の実施形態において、投与経路は、プライム用量とブースト用量との間で異なってもよい。非限定的な例において、プライム用量は皮下に投与することができ、ブースト用量は腫瘍内への注入により投与することができ、アクセス不能またはアクセスが困難な腫瘍の場合には、ブースト用量は静脈内に投与することができる。

様々な実施形態において、処置はさらに、ＰＤ－１阻害剤を投与することを含む。他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を投与することを含む。また他の実施形態において、当該処置はさらに、ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の両方を投与することを含む。特定の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはこの両方は、処置（ブースト）段階の間に投与され、プライム段階の間は投与されない。

様々な実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は抗ＰＤ１抗体である。様々な実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の例は、本明細書に示されている。

がんを有する前のプライム－ブースト処置
本発明の様々な実施形態は、がんを有しない対象における免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞が対象に発生した場合に腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導する方法を提供する。方法は、プライム－ブースト型の処置レジメンを使用する。様々な実施形態において、免疫応答を誘発し、腫瘍またはがん細胞に対する腫瘍溶解効果を誘導することは、対象ががんを発症した場合に、結果的に悪性腫瘍を処置する。

弱毒化ＹＦＶ、詳細には本発明の合成ＹＦＶ １７Ｄのプライム用量は、対象ががんを有しないときまたは対象ががんを有しないと考えられるときに、初期免疫応答を誘発するように投与される。後者は、検出不能または検出されないがんに起因する場合がある。

その後、いくつかの実施形態において、弱毒化ＹＦＶ、特に本発明の合成ＹＦＶ １７Ｄのブースト用量は、免疫応答の誘発を継続するために定期的に投与される。例えば、ブースト用量は、１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与され得る。特定の実施形態において、ブースト用量は約５年毎に投与され得る。

代替的に、他の実施形態において、弱毒化ＹＦＶ、特に本発明の合成ＹＦＶ １７Ｄのブースト用量は、対象ががんと診断された後に投与される。例えば、対象ががんと診断されたら、その後すぐにブースト用量の投与を伴う処置レジメンを開始して、腫瘍に及ぼす腫瘍溶解効果を誘導する、及び／または腫瘍に対する腫瘍溶解効果を含む免疫応答を誘発することができる。さらなる実施形態において、がんの処置を継続するために追加のブースト用量が投与され得る。

様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３である。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、コドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶである。様々な実施形態において、弱毒化ＹＦＶは、コドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３である。

いかなる特定の理論にも設定レジメンにも束縛されることは望まないが、プライム用量及びブースト用量は、対象の免疫システムにウイルス感染細胞を認識するように「教示する」と考えられている。したがって、対象ががんを発症しブースト用量が投与されるとき、対象の免疫システムはウイルス感染細胞を認識する。このとき、ウイルス感染細胞はがん細胞である。ウイルス感染がん細胞に対する免疫応答中、免疫システムはがん抗原によってもプライミングされ、このようにして免疫システムは、がん抗原を発現する細胞も標的としながら抗がん免疫を増強する。

そのため、様々な実施形態において、悪性腫瘍の処置は、悪性腫瘍の再発の可能性を低下させる。これは、前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを有する可能性も低下させ得る。対象が前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせる。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象は前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症し、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせる。

プライム及びブースト用量は、がんが発生したときに、処置を行う腫瘍細胞を標的とするように免疫システムを準備する抗がんワクチンと考えてもよい。

様々な実施形態において、プライム用量は、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される。

様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、がんを有しない、またはがんを有する疑いがない対象に投与される場合、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される。

様々な実施形態において、１回以上のブースト用量は、がんと診断された対象に投与されるときに、腫瘍内、静脈内、髄腔内、または新生物内（腫瘍内に直接）に投与される。好ましい投与様式は、腫瘍部位に直接行う様式である。

プライム及びブースト投薬間のタイミングは、例えば、がんのタイプ、がんのステージ、及び患者の健康状態に応じて異なり得る。様々な実施形態において、１回以上のブースト用量の１回目は、対象ががんを有しない、またはがんを有する疑いがない場合、プライム用量後１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与される。特定の実施形態において、ブースト用量は約５年毎に投与される。

様々な実施形態において、例えば、対象ががんと診断されたときに、１回以上のブースト用量は、がんの診断の後に投与される。様々な実施形態において、２、３、４、または５回のブースト用量が投与される。様々な実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回のブースト用量が投与される。様々な実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間とすることができる。さらなる実施形態において、ブースト用量間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヵ月とすることができる。非限定的な例として、プライム用量が投与され、その約５年後に１回目のブースト用量が投与され、１回目のブースト用量の約１年後、対象ががんと診断され、２回目のブースト用量が投与され、２回目のブースト用量の約２週間後に３回目がブースト用量を投与され、３回目のブースト用量の約２週間後に４回目のブースト用量が投与され、４回目のブースト用量の約１ヵ月後に５回目のブースト用量が投与され得る。がんが寛解期にあると判定されたら、追加の定期的なブースト用量が、例えば、６ヵ月毎、１年毎、２年毎、３年毎、４年毎、または５年毎に投与され得る。

様々な実施形態において、投薬量は、プライム及びブースト投薬量間で異なり得る。非限定的な例として、プライム用量は、ブースト用量よりも少ないコピー数のウイルスを含むことができる。

他の実施形態において、投与経路は、プライム用量とブースト用量との間で異なってもよい。非限定的な例において、プライム用量は皮下に投与され得、ブースト用量は（患者ががんを有するとき）腫瘍内への注射によって投与され得、アクセス不能またはアクセスが困難な腫瘍の場合には、ブースト用量は静脈内に投与され得る。

様々な実施形態において、このような処置（例えば、がんを有する前のプライム用量、またはがんを有する前のプライム及びブースト用量、ならびにその後のがんを有した後のブースト用量）を受ける対象は、がんを発症するリスクが高い対象であり得る。このような対象の例としては、限定されるものではないが、遺伝子的素因（例えば、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異、ＴＰ５３変異、ＰＴＥＮ変異、ＫＲＡＳ変異、ｃ－Ｍｙｃ変異、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによりがん素因となる変異とみなされている任意の変異など）、がんの家族歴、高齢（例えば、４０、４５、５５、６５歳またはそれ以上）、通常よりも高い放射線曝露、長期の日光曝露、タバコ（例えば、喫煙、咀嚼）の使用歴、アルコール乱用歴、薬物乱用歴、体型指数＞２５、慢性炎症疾患（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、喘息、関節リウマチ、など）の病歴、免疫抑制歴、がんリスクの増加と相関を有することが知られている慢性感染症（例えば、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ－１、ＭＣｐｙＶ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉなど）の病歴を伴う対象を含む。

様々な実施形態において、このような処置（例えば、がんを有する前のプライム用量、またはがんを有する前のプライム及びブースト用量、ならびにその後のがんを有した後のブースト用量）を受ける対象は、ハイリスクカテゴリーには入らないが、臨床医により、将来のがんリスクのための予防措置としてプライム及びブースト用量を処方されている対象であり得る。

様々な実施形態において、処置はさらに、ＰＤ－１阻害剤を投与することを含む。他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を投与することを含む。また他の実施形態において、処置はさらに、ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の両方を投与することを含む。特定の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはこの両方は、処置（ブースト）段階の間に投与され、プライム段階の間は投与されない。

様々な実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は抗ＰＤ１抗体である。様々な実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤の例は、本明細書に示されている。

炎症応答
様々な実施形態において、本発明の黄熱ウイルス１７Ｄの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、対象における内因性１型インターフェロンの産生を刺激することを目的とする。

様々な実施形態において、本発明の改変ウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、対象における１型インターフェロンの治療有効量の産生を維持することを目的とする。

また他の実施形態において、本発明の改変ウイルスの投与は、対象におけるＩ型インターフェロンを活性化して、対象におけるイオン化放射線及び化学療法の感作を維持することを目的とする。

様々な実施形態において、本発明の改変ウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、ＣＤ４５＋白血球、好中球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋免疫細胞を含めた炎症促進性免疫細胞をがんの部位に動員することを目的とする。

様々な実施形態において、本発明の改変ウイルスの投与は、部分的には治療有効性をもたらす、がんの部位からのＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞またはＭ２マクロファージのような抗炎症性免疫細胞を減少させることを目的とする。

様々な実施形態において、悪性腫瘍の処置は、悪性腫瘍の再発の可能性を低下させる。これは、前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを有する可能性も低下させ得る。対象が前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせる。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍の寛解後、対象は前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症し、悪性腫瘍の処置は、結果的に第２のがんの成長を遅らせる。

ＰＤ－１阻害剤及びＰＤ－Ｌ１阻害剤
本明細書で論じられているように使用することができる抗ＰＤ１抗体の例としては、限定されるものではないが、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、スパルタリズマブ、セミプリマブ、ＡＫ１０５、ＢＣＤ－１００、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ００１、ＬＺＭ００９、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ－０４２、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、及びチスレリズマブが挙げられる。

ＰＤ－１阻害剤のさらなる例としては、限定されるものではないが、ＰＦ－０６８０１５９１、抗ＰＤ１抗体を発現する多能性キラーＴリンパ球（ＰＩＫ－ＰＤ－１）、及び自家抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４ＳＣＡＲ－ＩｇＴ細胞が挙げられる。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、限定されるものではないが、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＣＫ－３０１、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ－１３１６、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、及びＣＫ－３０１が挙げられる。抗ＰＤ－Ｌ１阻害剤のさらなる例は、Ｍ７８２４である。

投与経路
上記で論じられたものに加えて、治療用腫瘍溶解ＹＦＶ １７Ｄウイルス（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、またはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ、またはコドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３）は、腫瘍内、静脈内、髄腔内、または新生物内（腫瘍内に直接）に送達され得る。好ましい投与様式は、腫瘍部位に直接行う様式である。治療目的で適用されるウイルスの接種物は、１～１０μｌの範囲の極めて小さい体積で投与され得る。

本発明のＹＦＶ １７Ｄウイルス（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ、またはコドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３）の治療有効量が、投与スケジュール、投与されるＹＦＶ １７Ｄウイルス（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ）の単位用量、ＹＦＶ １７Ｄウイルス（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ、またはコドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３）が他の治療剤と組み合わせて投与されるか、患者の状態及び健康に依存し得ることは、当業者には明らかであろう。様々な実施形態において、４．７４ｌｏｇ１０＋／－２ｌｏｇ１０の本発明のＹＦＶ １７Ｄウイルスの治療有効量が投与される。

腫瘍溶解性組換え型ウイルスの治療有効量は、経験的に決定され、また、安全に投与することができる組換え型ウイルスの最大量及び効率的な腫瘍溶解をもたらす組換え型ウイルスの最小量に依存し得る。

腫瘍溶解性弱毒化ＹＦＶ（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチドの含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ、またはコドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３）、特に合成ＹＦＶ １７Ｄの治療用接種は、初期処置レジメンの効果に応じて繰り返し行うことができる。腫瘍溶解性弱毒化ＹＦＶ（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ、またはコドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧまたはＴＡ（またはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３）、特に、初期に投与された合成ＹＦＶ １７Ｄに対する宿主の免疫応答がその有効性を制限する場合、異なる改変ウイルスの血清型を有する腫瘍溶解性改変ウイルスの追加注射を行うことができる。弱毒化ＹＦＶ（またはＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、またはコドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ、またはコドン脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン対脱最適化ＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３、または本明細書に記載のようにＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶ １７Ｄ、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、もしくはＹＦＶ １７Ｄ－２１３）、特に合成ＹＦＶ １７Ｄに対する宿主の免疫応答は、血清学的に容易に決定することができる。ただし、投与スケジュールに従って上に示されたものよりも低いまたは高い投薬量が選択されることが認識されよう。

以下の実施例は、特許請求対象の発明をより十分に例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。特定の材料が言及される限りにおいて、それは単なる例示目的のものであり、本発明を限定することは意図されていない。当業者は、発明能力を行使することなく、及び発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。

実施例１
免疫コンピテントマウスにおける免疫原性
０日目及び２１日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^６ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄを接種した（図２Ａ）。０、２１、及び３５日目に血清を採取し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）試験を用いて中和抗体を調べた。マウスは当初、ＹＦＶ １７ｄの血清反応が陰性であった（ＰＲＮＴ５０＜１６）。初回のワクチン接種後、全てのマウスが血清転換した（ＰＲＮＴ５０≧３２）。ＰＲＮＴ５０力価の平均は、２１日目（２４３．２）から３５日目（２４０．０）まで有意に増加しなかった。このことから、ブースト用量後にＹＦＶ １７Ｄの複製を防止する殺菌免疫が誘導されたことが示される。０日目及び２１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０^６ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄをワクチン接種した（図２Ｂ）。０、２１、及び３５日目に血清を採取し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）試験を用いて中和抗体を調べた。マウスは当初、ＹＦＶ １７Ｄの血清反応が陰性であった（ＰＲＮＴ５０＜１６）。初回のワクチン接種後、全てのマウスが血清転換した（ＰＲＮＴ５０≧３２）。ブーストから２週間後、ＰＲＮＴ５０力価の平均は４４．８（２１日目）から１９５．２（３５日目）に増加し、有意な増加となった（ｐ＝０．０１；対応のあるｔ検定）。０日目及び２１日目に、ＤＢＡ／２マウスに５×１０^６ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄを接種した（図２Ｃ）。０、２１、及び３５日目に血清を採取し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）試験を用いて中和抗体を調べた。マウスは当初、ＹＦＶ １７Ｄの血清反応が陰性であった（ＰＲＮＴ５０＜１６）。初回のワクチン接種後、全てのマウスが血清転換した（ＰＲＮＴ５０≧３２）。ＰＲＮＴ５０力価の平均は、２１日目（１９２）から３５日目（１６０．０）まで有意に増加しなかった。このことから、ブースト用量後にＹＦＶ １７Ｄの複製を防止する殺菌免疫が誘導されたことが示される。中和抗体の誘導によって実証されるように、合成ＹＦＶ １７Ｄのワクチン接種によってＹＦＶ １７Ｄに対する免疫が首尾よく誘導された。

実施例２
免疫コンピテントマウスにおけるＢ１６黒色腫に対する腫瘍溶解有効性
合成ＹＦＶ １７Ｄを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの移植同系Ｂ１６黒色腫細胞を処置した。マウスに、０日目及び２１日目にワクチン接種し、３８日目に移植し、次いで４９、５１、５３、５６、６９、７１、７６、及び７８日目に１０^７ＰＦＵを送達して８回処置した（図３Ａ～Ｂ）。ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に１００μｌの体積中１０^５のＢ１６細胞を皮下送達して移植し、０．２％のＢＳＡ ＭＥＭで模擬処置（ｎ＝１０）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝１０）した。移植腫瘍を、５０μｌの合成ＹＦＶ １７Ｄを直接注入することによって処置した。腫瘍の高さ、幅、及び奥行をカリパスを用いて毎日測定し、下記の式を用いて腫瘍体積（ｍｍ^３）を計算した。

各群の平均腫瘍サイズを比較するスチューデントのｔ検定による判定において、処置マウスは５２、５３、５４、５５、５７、及び５８日目に、模擬対照マウスに比べて腫瘍サイズが有意に縮小した（図３Ａ）。５８日目以降、模擬対照群のほとんどが人道的早期エンドポイント（腫瘍体積１，０００ｍｍ^３）に達し、サイズを比較することができなくなった。生存率（１，０００ｍｍ^３の腫瘍体積を人道的早期エンドポイントとして使用）に関しては、ＹＦＶ １７Ｄを投与したマウスのアウトカムは大きく改善し、生存率の中央値が移植後２０日（模擬対照群）から３１日に増加した。カプラン・マイヤー曲線を用いた生存率解析（図３Ｂ）で示されるように、ＹＦＶ １７Ｄで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率は、ログランク（マンテル・コックス）検定によって模擬対照群に比べて有意に改善された（ｐ＝０．０１４１）。サンプルサイズは、以前の実験で観察された腫瘍サイズの標準偏差に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｔａｔｍａｔｅ ２を用いて十分な統計検出力（０．８０）を達成するように選択した。

実施例４
免疫コンピテントマウスにおけるＥＭＴ－６トリプルネガティブ乳癌に対する腫瘍溶解有効性
合成ＹＦＶ １７Ｄを使用して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの移植同系ＥＭＴ－６トリプルネガティブ乳癌細胞を処置した。マウスに、０日目及び２１日目にワクチン接種し、３７日目に移植し、次いで４０、４２、４４、４６、４９、５１、５８、６５、及び６７日目に１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄを送達して９回処置した。ワクチン接種ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹部脂肪パッドに１００μｌの体積中１０^４のＥＭＴ－６細胞を皮下送達して移植し、模擬処置（ｎ＝１０）または１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで処置（ｎ＝１０）した。移植腫瘍を、５０μｌの合成ＹＦＶ １７Ｄを直接注入することによって処置した。腫瘍の高さ、幅、及び奥行をカリパスを用いて毎日測定し、下記の式を用いて腫瘍体積（ｍｍ^３）を計算した。

各時点での平均値を比較するスチューデントのｔ検定による判定において、ＹＦＶ １７Ｄ処置マウスは４１～５６日目に、模擬対照に比べて腫瘍サイズが有意に縮小した（図４Ａ）。２３日目以降は、模擬処置群のマウスの数が少なすぎたため、群間で統計的に比較することができなかった。５００ｍｍ^３以上の腫瘍潰瘍化というヒト初期エンドポイントによって判定された生存率も、ＹＦＶ １７Ｄ投与群では模擬対照群に比べて改善した。生存期間中央値は、処置マウス（３６日）の方が模擬対照（１９日）に比べてはるかに高く、カプラン・マイヤー曲線では、処置マウスの方が生存率が高いことがログランク（マンテル・コックス）解析によって示された（ｐ＝＜０．０００１）。サンプルサイズは、以前の実験で観察された腫瘍サイズの標準偏差に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｔａｔｍａｔｅ ２を用いて十分な統計検出力（０．８０）を達成するように選択した。

実施例５
免疫コンピテントマウスにおけるＣＣＬ－５３．１黒色腫に対する腫瘍溶解有効性
本試験の目的のため、ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝８）に対し、最初に０日目及び２１日目に合成ＹＦＶ １７Ｄをワクチン接種し、次いで４５日目に１０^５のＣｌｏｎｅ Ｍ３（Ｃｌｏｕｄｍａｎ Ｓ－９１黒色腫腫瘍細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－５３．１）を移植し、５１、５３、５６、５８、６０、６３、６５、７２、及び７９日目に１０^７ＰＦＵの合成ＹＦＶ １７Ｄで９回処置した（図５Ａ～Ｂ）。移植腫瘍を、５０μｌの合成ＹＦＶ １７Ｄを直接注入することによって処置した。腫瘍の高さ、幅、及び奥行をカリパスを用いて毎日測定し、下記の式を用いて腫瘍体積（ｍｍ^３）を計算した。

死亡率については、２０％以上の体重減少、腫瘍潰瘍化、または腫瘍成長＞１，０００ｍｍ^３の人道的早期エンドポイントを使用した。サンプルサイズは、以前の実験で観察された腫瘍サイズの標準偏差に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｔａｔｍａｔｅ ２を用いて十分な統計検出力（０．８０）を達成するように選択した。移植ＣＣＬ－５３．１細胞は、ＹＦＶ １７Ｄを用いた腫瘍溶解処置に十分に応答した。処置群と模擬処置群との間のスチューデントのｔ検定比較によれば、５３、５６、６０、６１、及び６３～６７日目に処置群で平均腫瘍サイズが有意に縮小した。さらに、生存期間中央値は、処置群（＞４７日）において模擬対照群（２７．５日）に比べて大きく増加した。カプラン・マイヤー生存曲線の比較（図５Ｂ）においても、ログランク（マンテル・コックス）検定により、処置ＤＢＡ／２マウスは模擬対照に比べて生存率が有意に向上した（ｐ＝０．０００４）。

黒色腫は、ＣＣＬ５３．１細胞移植を用いてＤＢＡ／２マウスで十分にモデル化することができるが、本試験では合成ＹＦＶ １７Ｄによる処置に感受性であることが示された。

実施例６
ＤＢＡ／２マウスの移植同系ＣＣＬ－５３．１黒色腫細胞の低継代及び高継代合成ＹＦＶ １７Ｄによる処置
４～１０週齢の雌ＤＢＡ／２マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、－３日目に予備抗体価のために出血させた。０日目に、第３群及び第５群のマウスに模擬ワクチン接種した（表２を参照）。８頭のマウスは、以前の実験からの既知の腫瘍サイズの標準偏差を考慮した最小試料サイズの計算に基づいている（ＧｒａｐｈＰａｄ ＳｔａｔＭａｔｅ）。２１日目及び３５日目に、ワクチン接種したマウスから採血し、プラーク減少中和５０％（ＰＲＮＴ５０）アッセイを用いてＹＦＶ １７Ｄに対する中和抗体について試験した。２１日目に、ワクチン接種したマウスを、０日目と同じ用量の同じウイルスでブーストした。マウスに、皮下注射によって１００μｌのＤＭＥＭの体積中１×１０^５のＣＣＬ－５３．１細胞を移植した。全てのマウスに対し、５１、５３、５６、５８、６０、６３、６５、７２、及び７９日目に、５０μｌの体積を用いて表２のように処置した。第１、２、４、及び５群のマウスは、８８日目及び９３日目にさらに２回処置した。

（表２）

ＹＦＶ １７Ｄの免疫原性：ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝８）に０日目と２１日目にワクチン接種し、０、２１、及び３５日目に血清を採取し、ＰＲＮＴ５０アッセイによる中和抗体の滴定を行った。当初、全てのマウスがＹＦＶ １７Ｄに対し血清陰性（ＧＭＴ：＜８）であったが、５×１０６ ＰＦＵを単回接種した後、２１日目に全てのマウスが血清転換した（ＧＭＴ：１７２．３）。対応のあるｔ検定により、２１～３５日目のＰＲＮＴ５０力価（ＧＭＴ：１４３．７）における有意差は認められなかった（ｐ＝０．３６３２）（図６を参照）。

初期腫瘍サイズ：各群（ｎ＝８）の初期腫瘍サイズ（５１日目）について、ＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．３９８３）及びダネットの多重比較により、各群を模擬ワクチン接種対照群と比較した。ＹＦＶ １７Ｄワクチン接種した移植腫瘍の初期平均値（３７．１８ｍｍ^３）は、模擬処置（９４．５９ｍｍ^３）に比べて小さく、この差はスチューデントのｔ検定では有意であった（ｐ＝０．０２０２１５）ものの、通常の一元配置ＡＮＯＶＡまたはダネットの多重比較試験では有意ではなかった。

ＹＦＶ １７Ｄの有効性：腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を多重ｔ検定によって比較したところ、ＹＦＶ １７Ｄ処置マウスにおいて５１、５３、５６、６３、６５、６９、７１、７３、７６、及び７８日目に有意に小さいことが分かった。腫瘍成長を初期の腫瘍サイズと比較した変化パーセントの関数として調べると、いずれの日においても、ＹＦＶ １７Ｄ処置腫瘍及び模擬処置腫瘍に有意差は認められなかった。ただし、生存率（腫瘍サイズ＜１，０００ｍｍ^３による判定）はＹＦＶ １７Ｄ処置腫瘍で改善し、ＭＴＤは６０を超え、これに対し模擬処置腫瘍では２７．５であった（図７Ａ－７Ｃ）。

各腫瘍溶解処置でベネフィットが観察され、ＹＦＶ １７Ｄ処置では生存率の改善及び腫瘍サイズの縮小が認められた。各処置群からの生存マウスは、移植後６０日を過ぎても腫瘍サイズが比較的小さいまま保たれた。

結論として、低継代及び高継代のＹＦＶ １７Ｄは、ＤＢＡ／２マウスの同系ＣＣＬ－５３．１移植モデルを用いた黒色腫に対し有効である。

実施例７
ＹＦＶ １７Ｄを用いた腫瘍溶解療法の成功は、攻撃後のＥＭＴ－６腫瘍のさらなる成長を防止する
ＹＦＶ １７Ｄで処置し腫瘍が消滅したＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝３）を、１０^４のＥＭＴ６ ＴＮＢＣ細胞の２回目移植によって攻撃した。マウスに対し、一次接種部位の腹部脂肪パッドから離れた二次部位の右脇腹に皮下注射することによって攻撃した。対照のナイーブマウス（ｎ＝８）にも同時に１０^４のＥＭＴ６ ＴＮＢＣ細胞を移植した。移植後、両群の腫瘍を毎日測定した。腫瘍サイズ（ｍｍ^３）は、対照マウスで移植後４～１４日目に有意に大きいものとなった。ＹＦＶ １７Ｄ群では、５日目に１頭のマウスに小さな腫瘍が出現したものの、９日目に消失した。対照群では、３日目に半数のマウスに腫瘍が出現し、５～１４日目には全てのマウスに腫瘍が出現した。

本発明の様々な実施形態が、上記の発明を実施するための形態で説明されている。これらの説明は、上記の実施形態を直接的に説明するが、当業者は、本明細書に示され、説明される特定の実施形態に対する修正及び／または変形を着想し得ることが理解される。この説明の範囲内に収まる任意のこのような変更形態または変形形態は、その中に含まれるように意図されている。具体的に記されていない限り、本発明者の意図では、明細書及び請求項における語句は、適用可能な技術分野の当業者にとって一般的かつ慣れ親しんだ意味が与えられている。

出願時に出願人に知られている本発明の様々な実施形態について上記の説明を提示したが、これは例示及び説明の目的で意図されている。本明細書は、網羅的であるようにも、また開示されている詳細な形式に発明を限定するようにも意図されておらず、上記の教示に照らして多くの変更形態及び変形形態が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理及びその実際的適用を説明し、他の当業者が様々な実施形態において、また企図されている特定の使用に適合するように様々な変更形態を用いて、本発明を利用することを可能にするように機能する。そのため、本発明は、本発明を実施するために開示されている特定の実施形態に限定されないように意図されている。

本発明の特定の実施形態が示され説明されたが、当業者には、本明細書の教示に基づいて、本発明及びそのより広範な態様から逸脱することなく変更及び修正がなされ得ることが明白であろう。そのため、添付の請求項は、本発明の真の趣旨及び範囲内にあるものとして、その範囲内に全てのこのような変更及び修正を包含するものとする。概して、当業者には、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語として意図されていることが理解されよう（例えば、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであり、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも～を有する」と解釈されるべきであり、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであることなどである）。

本明細書で使用される場合、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、ある実施形態に有用である組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素に関して使用され、さらに不特定の構成要素を含むことに対しても、有用か否かにかかわらず開かれている。概して、当業者には、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語として意図されていることが理解されよう（例えば、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであり、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも～を有する」と解釈されるべきであり、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであることなど）。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という制限のない用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、または有する（ｈａｖｉｎｇ）のような用語の同義語として、本明細書では本発明の説明及び特許請求のために使用されているが、本発明またはその実施形態は、「～からなる」または「本質的に～からなる」のような代替的用語を用いて、代替的に説明されることもある。

Claims (32)

1. 悪性腫瘍を処置する、または腫瘍サイズを縮小する方法であって、
   弱毒化黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を、それを必要とする対象に投与する工程
   を含む、前記方法。
2. 悪性腫瘍を処置する方法であって、
   弱毒化ＹＦＶのプライム用量を、それを必要とする対象に投与する工程と、
   弱毒化ＹＦＶの１回以上のブースト用量を、それを必要とする前記対象に投与する工程と
   を含む、前記方法。
3. 腫瘍サイズを縮小する方法であって、
   弱毒化ＹＦＶのプライム用量を、それを必要とする対象に投与する工程と、
   弱毒化ＹＦＶの１回以上のブースト用量を、それを必要とする前記対象に投与する工程と
   を含む、前記方法。
4. 前記弱毒化ＹＦＶがＹＦＶ株１７Ｄワクチン（ＹＦＶ １７Ｄ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記弱毒化ＹＦＶが合成ＹＦＶ株１７Ｄ（ＹＦＶ １７Ｄ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記弱毒化ＹＦＶが、ＹＦＶ １７Ｄ－２０４、ＹＦＶ １７ＤＤ、ＹＦＶ １７Ｄ－２１３、コドン脱最適化ＹＦＶ、コドン対脱最適化ＹＦＶ、またはＣＧもしくはＴＡ（もしくはＵＡ）ジヌクレオチド含有量を増加させることによって脱最適化されたＹＦＶである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記プライム用量が、皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、または静脈内に投与される、請求項２または３に記載の方法。
8. 前記１回以上のブースト用量が、腫瘍内または静脈内に投与される、請求項２または３に記載の方法。
9. 前記１回以上のブースト用量の１回目が、１回のプライム用量から約２週間後に投与されるか、またはプライム用量が２回以上の場合に最後のプライム用量から約２週間後に投与される、請求項２または３に記載の方法。
10. 前記対象ががんを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記プライム用量が、前記対象ががんを有しないときに投与される、請求項３に記載の方法。
12. 前記対象が、より高いがん発症リスクを有する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記１回以上のブースト用量が、前記対象ががんを有しないときに、前記プライム用量後１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０年毎に投与される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記対象が後にがんと診断され、前記対象ががんと診断された後に前記１回以上のブースト用量が投与される、請求項１１に記載の方法。
15. ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ＰＤ－１阻害剤が抗ＰＤ１抗体である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記抗ＰＤ１抗体が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、スパルタリズマブ、セミプリマブ、ＡＫ１０５、ＢＣＤ－１００、ＢＩ ７５４０９１、ＪＳ００１、ＬＺＭ００９、ＭＧＡ０１２、Ｓｙｍ０２１、ＴＳＲ－０４２、ＭＧＤ０１３、ＡＫ１０４、ＸｍＡｂ２０７１７、チスレリズマブ、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＰＤ－１阻害剤が、ＰＦ－０６８０１５９１、抗ＰＤ１抗体を発現する多能性キラーＴリンパ球（ＰＩＫ－ＰＤ－１）、自家抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ４ＳＣＡＲ－ＩｇＴ細胞、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
19. 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１５に記載の方法。
20. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、ＢＧＢ－Ａ３３３、ＣＫ－３０１、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、ＭＳＢ２３１１、ＳＨＲ－１３１６、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＣＫ－３０１、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤がＭ７８２４である、請求項１５に記載の方法。
22. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記悪性腫瘍の再発の可能性が低下する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを有する可能性が低下する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記対象が、前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合に、前記悪性腫瘍の前記処置が、結果的に前記第２のがんの成長を遅らせる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記悪性腫瘍の寛解後、前記対象が前記悪性腫瘍とは異なる第２のがんを発症した場合に、前記悪性腫瘍の前記処置が、結果的に前記第２のがんの成長を遅らせる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記腫瘍における炎症性免疫応答が刺激される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記悪性腫瘍を処置することによって、前記腫瘍に炎症促進性細胞が動員される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記悪性腫瘍を処置することによって、抗腫瘍免疫応答が刺激される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記悪性腫瘍が固形腫瘍である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記悪性腫瘍が、神経膠腫、神経芽腫、多形性膠芽腫、腺癌、髄芽腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、気管支癌、類表皮癌、及び黒色腫からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記弱毒化ＹＦＶが、腫瘍内、静脈内、脳内、筋肉内、脊髄内、または髄腔内に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記弱毒化ＹＦＶの投与が、前記腫瘍細胞における細胞溶解を引き起こす、請求項３１に記載の方法。

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