CN113874032A - 减毒的黄热病病毒及其用于癌症治疗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是设计的重组病毒在使用减毒的黄热病病毒治疗各种形式的恶性肿瘤中的用途。本发明的方法对于治疗各种器官(例如：乳腺、皮肤、结肠、支气管通道、胃肠的上皮衬里、上呼吸道和泌尿生殖道、肝、前列腺和脑)的恶性肿瘤特别有用。关于乳腺癌和黑色素瘤的治疗处理，在实验动物中证实了惊人的缓解。

Description

减毒的黄热病病毒及其用于癌症治疗的用途
对相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请包括2019年5月15日提交的美国临时专利申请No.62/848,443的优先权的权益，以引用的方式将其全部并入本文。
技术领域
本发明涉及使用黄热病病毒疫苗毒株、黄热病病毒疫苗毒株的修饰版本和黄热病病毒的修饰版本来诱导对恶性肿瘤的溶瘤作用和治疗恶性肿瘤的方法。
背景技术
将本文的所有出版物均以引用方式并入，其程度就如同将每个单独的出版物或专利申请具体地且单独地指示为以引用方式并入一样。下面的描述包括可能有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息都是现有技术或与目前要求保护的发明相关，也不是承认任何明确或隐含地引用的出版物都是现有技术。
合成病毒学
DNA合成技术的快速改进有望彻底改变病毒学中采用的传统方法。传统上用于消除病毒基因组不同区域的功能的办法之一大量但费力地使用定点诱变来探索病毒株基因组中小的序列变异的影响。然而，病毒基因组(尤其是RNA病毒的基因组)相对短，通常长度不到10,000个碱基，这使得它们适合于使用目前可用的技术来全基因组合成。最近开发的基于微流控芯片的技术可以进行按照规范设计的新基因组的从头合成，每个基因组只需几百美元。这允许产生全新的编码序列或将现有序列调整到传统克隆方法几乎不可能的程度。这种设计自由为进行大规模重新设计DNA/RNA编码序列提供了巨大的力量，以用于：(1)研究参数(如密码子偏倚、密码子对偏倚和RNA二级结构)变化对病毒翻译和复制效率的影响；(2)对未知的调控元件和病毒成功复制所必需的其它信号进行高效的全基因组扫描；(3)开发用于病毒株基因工程和抗病毒疫苗设计的新生物技术；(4)合成用于溶瘤疗法的修饰的病毒。
病毒基因组的从头合成
将基于计算机的算法用于从头设计和合成病毒基因组。这些合成的基因组(以本文所述的黄热病病毒17D的合成为例)可用于治疗癌症。
众所周知，恶性肿瘤是由器官中细胞不受控制的生长引起的。肿瘤生长到正常器官功能可能会因肿瘤侵袭、功能组织的替换、对基本资源的竞争以及频繁转移扩散到继发部位而严重受损的程度。恶性肿瘤是美国第二大死亡原因。
用于治疗恶性肿瘤的现有技术方法包括手术切除、放射和/或化学疗法。然而，许多恶性瘤(malignancies)对所有传统可用的治疗选择反应不佳，并且已知和实践的方法存在严重的不良副作用。在降低副作用的严重程度的同时提高常用治疗方案的效率方面已经取得了很大进展。然而，仍然存在许多问题，需要寻找替代的治疗方式。
近年来，已提出使用病毒来治疗癌症：(1)作为基因递送载体；(2)通过使用经遗传修饰而失去其致病特性的病毒作为直接的溶瘤剂；或(3)作为选择性破坏恶性细胞的试剂，其中使用为此目的而经遗传修饰的病毒。
使用病毒对抗恶性胶质瘤的实例包括如下。单纯疱疹病毒dlsptk(HSVdlsptk)为HSV的胸苷激酶(TK)阴性突变体。由于TK基因中360个碱基对的删除，该病毒的神经毒力减弱，TK基因的产物是正常病毒复制所必需的。已发现HSVdlsptk在快速分裂的恶性细胞中保留了繁殖潜力，导致细胞裂解和死亡。不幸的是，所有具有减弱的神经致病性的缺陷型疱疹病毒都与实验动物中脑炎的严重症状有联系。例如，在脑内感染有HSVdlsptk的小鼠中，LD50 Ic(颅内给予)为106pfu，这是一个相当低的剂量。这限制了这种突变型HSV的使用。已经提出并测试了其它HSV突变体。不过，病毒性脑炎导致的死亡仍然是一个问题。
另一种提议是使用经工程化含有HSV tk基因以表达胸苷激酶的逆转录病毒，其导致核苷类似物(如更昔洛韦或阿昔洛韦)的体内磷酸化，阻断DNA的复制并选择性地杀伤分裂的细胞。Izquierdo,M.等Gene Therapy,2:66-69(1995)报道了使用以HSV tk基因及其自身启动子的插入进行工程化而来的莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。通过MRI对用治疗性逆转录病毒的肿瘤内接种治疗的胶质母细胞瘤患者进行的随访揭示出肿瘤缩小，并且没有明显的短期副作用。然而，试验性疗法对受影响的患者的短期或长期存活没有影响。逆转录病毒疗法通常与严重的长期副作用(例如插入诱变)相关联。
已经开发了类似的系统来靶向上呼吸道的恶性瘤(起源于天然易受腺病毒感染的组织内并且易于到达的肿瘤)。然而，多形性胶质母细胞瘤(由广泛异质的细胞类型组成的高度恶性的肿瘤，因此命名为多形性)其特征在于基因型极其易变，并且不太可能对针对具有一致遗传异常的同质肿瘤的溶瘤病毒系统作出反应。
可以以本领域普通技术人员已知的方式确认我们的病毒修饰的效果。非限制性实例包括空斑测定、生长测量、RNA病毒的反向遗传学和测试动物中致死率降低。本申请证明，经修饰的病毒能够在宿主中诱导保护性免疫应答以及在宿主中诱导抗肿瘤反应。
发明内容
结合组合物和方法对以下实施方式及其方面进行描述和说明，其意在为示例性和说明性的，而不是限制范围。
本发明的目的是开发减毒的黄热病病毒(YFV)，以用于治疗如本文进一步描述的各种类型的癌症。在各种实施方式中，减毒YFV为黄热病病毒17D毒株疫苗(YFV 17D)。在各种实施方式中，YFV 17D为合成的YFV 17D。
本发明的另一个目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，以用于治疗各种类型的癌症，其可与抗PD-L1抗体疗法或其它免疫-肿瘤学疗法联合使用。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞以引起癌细胞裂解和死亡。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此引发抗肿瘤免疫应答。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此通过增加或降低抗肿瘤免疫蛋白(如PD-1、CTLA-4、IDO1、TIM3、lag-3)的表达来引发抗肿瘤免疫应答。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此在肿瘤中引发固有免疫应答。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此经由肿瘤中的固有信号传导受体RIG-I、STNG，以及固有免疫转录因子IRF3、IRF7或NFkB的激活在肿瘤细胞中引发固有免疫应答。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此在肿瘤中引发促炎性免疫应答。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此将促炎性白血细胞募集至肿瘤。
本发明的另一目的是通过如下方式来治疗癌细胞：用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)感染癌细胞，并由此降低来自肿瘤的调节性白血细胞。
本发明的另一目的是在给予病毒治疗癌症之前，用减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)对接受者进行预处理以引发免疫应答。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒将适用于治疗腺癌，特别是宫颈癌。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒将适用于治疗角蛋白阳性(例如，通过免疫过氧化物酶染色)的癌细胞。
本发明的另一目的是进一步开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒将适用于治疗据报道p53基因表达低或不存在的癌细胞。
本发明的另一目的是进一步开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒将适用于治疗其中的细胞为亚二倍体的肿瘤。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒适用于治疗肺癌性瘤(carcinomas)，特别是肺癌。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒适用于治疗亚三倍体(例如，在约40％的细胞中染色体计数为64、65或66)的癌症。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒适用于治疗每细胞具有单拷贝的染色体N2和N6的癌症。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒适用于治疗表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)这一酶的同工酶G6PD-B的癌症。
本发明的另一个目的是开发适用于治疗黑色素瘤的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)。
本发明的另一目的是开发适用于治疗源自黑素细胞的恶性细胞的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)。
本发明的另一目的是开发减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)，所述减毒的黄热病病毒适用于治疗具有至少3倍的MYCN癌基因(oncogene)扩增的癌症。
本发明的另一目的是开发适用于治疗乳腺癌的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)；在各种实施方式中，其用于治疗三阴性乳腺癌。
本发明的另一目的是开发适用于治疗膀胱癌的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)。
本发明的另一目的是开发适用于治疗结肠癌的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)。
本发明的另一目的是开发适用于治疗前列腺癌的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)。
本发明的另一目的是开发适用于治疗周围神经鞘瘤的减毒的黄热病病毒(例如，合成的YFV 17D)。
本发明的实施方式还提供了用于在受试者中进行治疗的治疗性组合物，所述治疗性组合物包含黄热病病毒17D和药学上可接受的载体。本发明还提供了用于在患有癌症的受试者中引发免疫应答的治疗性组合物，所述治疗性组合物包含黄热病病毒17D和药学上可接受的载体。本发明进一步提供了修饰的宿主细胞系，所述修饰的宿主细胞系经特别工程化以容许在野生型宿主细胞中不能存活的黄热病病毒17D存活。
根据本发明，所述合成的黄热病病毒17D通过将合成的病毒基因组转染到宿主细胞中由此产生病毒颗粒来制备。本发明进一步提供了包含适用于治疗癌症的合成的黄热病病毒17D的药物组合物。
为了进一步实现这些目标，本发明的各种实施方式提供了治疗恶性肿瘤或减小肿瘤大小的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予减毒的黄热病病毒(YFV)。本发明的各种实施方式提供了治疗恶性肿瘤的方法，所述包括：向有需要的受试者给予初始剂量的减毒YFV；以及，向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的减毒YFV。本发明的各种实施方式提供了减小肿瘤大小的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予初始剂量的减毒YFV；以及向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的减毒YFV。
在各种实施方式中，所述减毒YFV可为YFV 17D毒株疫苗(YFV 17D)。在各种实施方式中，所述减毒YFV可为合成的YFV 17D毒株(YFV 17D)。在各种实施方式中，所述减毒YFV可为YFV 17D-204、YFV 17DD、YFV 17D-213、密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV、或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV。
在各种实施方式中，所述初始剂量可以皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予。在各种实施方式中，所述一个或多个加强剂量可以瘤内或静脉内给予。在各种实施方式中，所述一个或多个加强剂量中的第一个可以在一个初始剂量后约2周给予，或者如果多于一个初始剂量，则在最后一个初始剂量后约2周给予。
在各种实施方式中，所述受试者可患有癌症。
在各种实施方式中，当受试者未患有癌症时可以给予初始剂量。在各种实施方式中，受试者可能处于发展为癌症的较高风险中。
在各种实施方式中，当受试者未患癌症时，可以在初始剂量后约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年给予一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，受试者随后可被诊断患有癌症并且可在受试者被诊断患有癌症后给予一个或多个加强剂量。
在各种实施方式中，所述方法可进一步包括给予PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。在各种实施方式中，PD-1抑制剂可为抗PD1抗体。在各种实施方式中，抗PD1抗体可选自于由如下抗体所组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、AK105、BCD-100、BI 754091、JS001、LZM009、MGA012、Sym021、TSR-042、MGD013、AK104、XmAb20717、替雷利珠单抗(tislelizumab)及其组合。在各种实施方式中，PD-1抑制剂可选自于由如下所组成的组：PF-06801591、表达抗PD1抗体的多能杀伤性T淋巴细胞(PIK-PD-1)、自体抗EGFRvIII 4SCAR-IgT细胞及其组合。在各种实施方式中，PD-L1抑制剂可为抗PD-L1抗体。在各种实施方式中，抗PD-L1抗体选自于由如下抗体所组成的组：BGB-A333、CK-301、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、BMS-936559、CK-301及其组合。在各种实施方式中，所述抗PD-L1抑制剂可为M7824。
在各种实施方式中，治疗恶性肿瘤可以降低恶性肿瘤复发的可能性。在各种实施方式中，治疗恶性肿瘤可降低患有不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症的可能性。在各种实施方式中，如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，则所述恶性肿瘤的治疗可使得第二种癌症的生长减缓。在各种实施方式中，在恶性肿瘤缓解后，如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，则所述恶性肿瘤的治疗可使得第二种癌症的生长减缓。在各种实施方式中，治疗恶性肿瘤可刺激肿瘤中的炎性免疫应答。在各种实施方式中，治疗恶性肿瘤可将促炎性细胞募集至肿瘤。在各种实施方式中，治疗恶性肿瘤可刺激抗肿瘤免疫应答。
在各种实施方式中，所述恶性肿瘤可为实体瘤。在各种实施方式中，所述恶性肿瘤可选自于由如下恶性肿瘤所组成的组：胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、腺癌、髓母细胞瘤、乳腺癌性瘤、前列腺癌性瘤、结直肠癌性瘤、肝细胞癌性瘤、膀胱癌、前列腺癌、肺癌性瘤、支气管癌性瘤、表皮样癌性瘤和黑色素瘤。
在各种实施方式中，所述减毒YFV可瘤内、静脉内、脑内、肌内、椎管内或鞘内给予。
在各种实施方式中，给予减毒YFV可引起肿瘤细胞中的细胞裂解。
本发明的其它特征和优点将由以下结合附图的详细描述而变得显而易见，所述附图通过示例的方式说明本发明的实施方式的多种特征。
附图说明
在参考附图中示出了示例性实施方式。本文公开的实施方式和附图旨在被认为是说明性的而不是限制性的。
图1示出了示例性治疗方案。
图2A-图2C描绘了合成的YFV 17D在小鼠中的免疫原性。图2A描绘了血清中的中和抗体滴度，所述血清收集自在第0天和第21天用5×106PFU的合成YFV 17D免疫接种的C57BL/6小鼠。在第0、21和35天收集血清并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测试来测试中和抗体。在初始免疫接种后，所有小鼠均血清转化(PRNT50≥32)。从第21天(243.2)到第35天(240.0)，平均PRNT50滴度没有显著增加，表明在加强剂量后诱导了阻止YFV 17D复制的消除性免疫(sterilizing immunity)。图2B描绘了血清中的中和抗体滴度，所述血清收集自在第0天和第21天用5×106PFU的合成YFV 17D免疫接种的BALB/c小鼠。在第0、21和35天收集血清并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测试来测试中和抗体。在初始免疫接种后，所有小鼠均血清转化(PRNT50≥32)。在加强后2周，平均PRNT50滴度从44.8增加到195.2，显著增加(p＝0.01；配对t检验)。图2C描绘了血清中的中和抗体滴度，所述血清收集自在第0天和第21天用5×106PFU的合成YFV 17D免疫接种的DBA/2小鼠。在第0、21和35天收集血清并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测试来测试中和抗体。在初始免疫接种后，所有小鼠均血清转化(PRNT50≥32)。从第21天(192)到第35天(160.0)，平均PRNT50滴度没有显著增加，表明在加强剂量后诱导了阻止YFV 17D复制的消除性免疫。
图3A-图3B描绘了合成的YFV 17D在治疗C57BL/6小鼠中植入的同基因B16黑色素瘤细胞中的功效，所述小鼠在第0天和第21天进行了免疫接种，在第38天进行了植入，然后用在第49、51、53、56、69、71、76和78天递送的107PFU处理8次。图3A描绘了免疫接种的C57BL/6小鼠中随时间的平均肿瘤体积(以mm3计)，所述小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至右胁腹的105个B16细胞，并用0.2％BSA MEM进行模拟处理(n＝10)或用107PFU的合成YFV 17D处理(n＝10)。图3B描绘了存活率，并在免疫接种的C57BL/6小鼠中使用≥1,000mm3肿瘤体积的人道早期终点进行计算，所述小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至右胁腹中的105个B16细胞，并进行模拟处理(n＝10)或用107PFU的合成YFV 17D处理(n＝10)。
图4A-图4B描绘了合成的YFV 17D在治疗BALB/C小鼠中植入的同基因EMT-6三阴性乳腺癌细胞中的功效，所述小鼠在第0天和第21天进行了免疫接种，在第37天进行了植入，然后用在第40、42、44、46、49、51、58、65和67天递送的107PFU的合成YFV 17D处理9次。图4A描绘了BALB/C小鼠随时间的平均肿瘤体积(以mm3计)，所述小鼠植有以100μL的体积皮下递送至腹部脂肪垫中的104个EMT-6细胞，并进行模拟处理(n＝10)或用107PFU的合成YFV 17D处理(n＝10)。图4B描绘了存活率，并在BALB/C小鼠中使用≥500mm3肿瘤体积的人道早期终点进行计算，所述小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至腹部脂肪垫中的104个EMT-6细胞，并进行模拟处理(n＝10)或用107PFU的合成YFV 17D处理(n＝10)。
图5A-图5B描绘了合成的YFV 17D在治疗DBA/2小鼠中植入的同基因CCL53.1黑色素瘤细胞中的功效，所述小鼠在第0天和第21天进行了免疫接种，在第45天进行了植入，然后用在第51、53、56、58、60、63、65、72和79天递送的107PFU的合成YFV 17D处理9次。图5A描绘了DBA/2小鼠中随时间的平均肿瘤体积(以mm3计)，所述小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至右胁腹中的105个DBA/2细胞，并用0.2％BSA MEM进行模拟处理(n＝8)或用107PFU的合成YFV 17D处理(n＝8)。图5B描绘了存活率，并在DBA/2小鼠中使用≥1,000mm3肿瘤体积的人道早期终点计算，所述小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至右胁腹中的105个CCL53.1细胞，并进行模拟处理(n＝8)或用107PFU的合成YFV 17D处理(n＝8)。
图6描绘了来自用YFV 17D免疫接种DBA/2小鼠的中和抗体滴度(PRNT50)。DBA/2小鼠(n＝8)在第0天和第21天免疫接种5×106PFU的YFV 17D，并在第0、21和35天收集血清用于滴定。
图7A-图7C描绘了YFV 17D在治疗DBA/2小鼠中的CCL-53.1黑色素瘤中的功效。在植入有105个CCL-53.1细胞并用107PFU的YFV 17D瘤内注射9次的DBA/2小鼠中，在植入后(DPI)60天内跟踪治疗功效。A)与模拟处理的对照相比，在免疫接种并用YFV 17D处理的小鼠中中位肿瘤大小(mm3)减小。B)在经处理的动物中中位肿瘤大小(％，与起始肿瘤大小相比)也减小了。C)与模拟处理的对照相比，经处理的小鼠的存活率(<1,000mm3)增加。
图8A-图8B描绘了合成的YFV 17D治疗在提供针对随后的激发的持久免疫力方面的功效。BALB/C小鼠在第0天和第21天进行了免疫接种，在第37天进行了植入，然后用在第40、42、44、46、49、51、58、65和67天递送的107PFU的合成YFV 17D处理9次。一半的小鼠从植入它们脂肪垫中的EMT-6肿瘤治愈，第88天没有明显肿瘤。在第88天用104个EMT-6(以100μL的体积皮下递送到右胁腹中)对治愈的小鼠进行激发，并每天跟踪肿瘤生长。图8A描绘了在所激发的BALB/C小鼠中随时间的平均肿瘤体积(以mm3计)。图8B描绘了先前用合成YFV 17D治疗治愈的小鼠(n＝3)或未接受过处理
Figure BDA0003354580530000111
的对照小鼠(n＝8)在用104个EMT-6细胞激发后具有可检测的肿瘤的的百分比。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献均通过引用的方式以其整体被并入，如同完全阐述一样。除非另有定义，本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，第3版，修订版，J.Wiley&Sons(NY 2006)；以及Sambrook和Russel，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor，NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。
本领域技术人员将认识到可用于本发明的实践的与本文所述的那些方法和材料相似或等效的许多方法和材料。事实上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
除非本文另有具体规定，当与提及的数字表示结合使用时，如本文所用的术语“约”意指所提及的数字表示加上或减去多至所提及的数字表示的5％。例如，语言“约50％”涵盖了45％到55％的范围。在各种实施方式中，即使在权利要求中特别规定，当与提及的数字表示结合使用时，术语“约”可以表示所提及的数字表示加上或减去多至所提及的数字表示的4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％。
“受试者”是指任何动物或人工改造的动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟类。人工改造的动物包括但不限于具有人免疫系统的SCID小鼠、实验室小鼠的远交或近交品系以及无胸腺裸鼠。在优选的实施方式中，受试者为人。鸟类的优选实施方式为驯养的家禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。
溶瘤性病毒组合物和药物组合物
本发明的实施方式提供了减毒的黄热病病毒。本发明的各种实施方式提供了包含减毒的黄热病病毒和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在各种实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂为山梨糖醇或明胶，其可以用作稳定剂。在各种实施方式中，可以将包含减毒的黄热病病毒的组合物(例如，疫苗制剂)冻干并保存在冷链条件下。
在各种实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂特别适用于递送减毒的黄热病病毒以用于癌症治疗；例如，增强向肿瘤部位的递送。这些载体的实例包括但不限于碳纳米管、层状双氢氧化物(LDH)、铁氧化物纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)、聚合物纳米颗粒、脂质体、胶束、蛋白纳米颗粒和树枝状大分子(dendrimer)。
所述减毒的黄热病病毒是不会在哺乳动物受试者中、特别是在人受试者中引起黄热病或引起黄热病的几率低于0.01％的黄热病病毒。
在各种实施方式中，所述减毒的黄热病病毒是黄热病病毒(YFV)17D疫苗(例如，UniProtKB-P03314(POLG_YEFV1))。
减毒活YFV 17D疫苗毒株源自于1927年在加纳分离的野生型YF病毒(Asibi毒株)，并通过在鸡胚胎组织培养物中连续传代而减毒。目前两种17D疫苗病毒亚株用于在含胚鸡蛋中生产疫苗，即17D-204和17DD。一些疫苗也由17D-204的独特亚株(17D-213)制备。因此，在各种实施方式中，减毒的YFV 17D为YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213。
在各种实施方式中，黄热病病毒17D疫苗(及其亚株)是合成的YFV 17D。合成的YFV17D和合成的YFV 17D亚株分别与减毒活YFV 17D和减毒活YFV 17D亚株具有相同的病毒基因组。
本发明的各种实施方式提供减毒的YFV病毒，所述减毒的YFV病毒包含修饰的病毒基因组，所述修饰的病毒基因组包含在基因组中的一个或多个位置中经工程化的核苷酸置换，其中，所述置换将多个同义密码子引入基因组中(例如，密码子去优化)和/或引入相同氨基酸的现有密码子顺序的改变(密码子对利用的改变(例如，密码子对去优化))。在这两种情况下，都保留了原始的疫苗株氨基酸序列。
因此，本发明的各种实施方式提供了密码子去优化的黄热病病毒。
在各种实施方式中，密码子去优化的黄热病病毒在蛋白编码序列中包含至少10个去优化的密码子，其中，所述至少10个去优化的密码子各自为黄热病病毒中使用频率较低的同义密码子。在各种实施方式中，密码子去优化的黄热病病毒在蛋白编码序列中包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个去优化的密码子，其中，所述至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个去优化的密码子各自为黄热病病毒中使用频率较低的同义密码子。黄热病病毒中使用频率较低的同义密码子是编码相同氨基酸的密码子，但该密码子是黄热病病毒对该氨基酸的非优选密码子。
表1.黄热病病毒(17D毒株)密码子使用
Figure BDA0003354580530000131
黄热病病毒的密码子使用，17D毒株，10,233个核苷酸的长开放阅读框(3411个密码子，不包括终止密码子)。来自Rice等的数据(1985)
在各种实施方式中，密码子去优化的黄热病病毒在蛋白编码序列中包含至少10个去优化的密码子，其中，所述至少10个去优化的密码子各自为在病毒宿主中(例如在人中)使用频率较低的同义密码子。在各种实施方式中，密码子去优化的黄热病病毒在蛋白编码序列中包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个去优化的密码子，其中，所述至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个去优化的密码子各自为在病毒宿主(例如人)中使用频率较低的同义密码子。在病毒宿主中使用频率较低的同义密码子是编码相同氨基酸的密码子，但该密码子是该病毒宿主对该氨基酸的非优选密码子。在人中使用频率较低的同义密码子是编码相同氨基酸的密码子，但该密码子是人对该氨基酸的非优选密码子。
在各种实施方式中，所述密码子去优化的黄热病病毒具有与YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213相同的氨基酸序列。在各种实施方式中，与YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213的氨基酸序列相比，密码子去优化的黄热病病毒具有多至1、2、3、4或5个氨基酸变化。氨基酸变化可以是不同的氨基酸、氨基酸的删除或氨基酸的添加。
在国际申请No.PCT/US2005/036241中描述了密码子去优化的方法，以引用的方式将其内容并入本文。
本发明的各种实施方式提供了密码子对去优化(CPD)的黄热病病毒。
在各种实施方式中，与黄热病病毒的密码子对去优化之前的黄热病病毒相比，密码子对去优化的黄热病病毒包括密码子对偏倚(CPB)的降低。因此，密码子对去优化的黄热病病毒包括重新排列蛋白编码序列中的现有密码子。重新排列蛋白编码序列中的现有密码子包括将密码子置换为具有较低密码子对分数的密码子对。
因此，它包含重新编码的蛋白编码序列，其中，每个序列具有按重新排列的顺序的来自其亲本蛋白编码序列的现有同义密码子，并且具有比其来源的亲本蛋白编码序列的CPB低的CPB。
在一些实施方式中，密码子对的子集通过重新排列同义密码子的子集而被置换。在其它实施方式中，密码子对通过使重新排列的同义密码子的数量最大化而被置换。需要注意的是，虽然密码子的重新排列导致对于病毒编码序列整体而言减小的密码子对偏倚(使其更负)，并且重新排列导致许多位置处的密码子对分数(CPS)降低，但可能伴随着其它位置处的CPS增加，但平均而言，密码子对分数以及由此而来的修饰序列的CPB减小。
在各种实施方式中，CPB减小了至少0.01、至少0.02、至少0.03、至少0.04、至少0.05、至少0.10、至少0.15、至少0.20、至少0.25、至少0.30、至少0.35、至少0.40、至少0.45或至少0.50。
在各种实施方式中，密码子对偏倚基于黄热病病毒中的密码子对使用。在各种实施方式中，密码子对偏倚基于人中的密码子对使用。
在各种实施方式中，所述密码子对去优化的黄热病病毒具有与YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213相同的氨基酸序列。在各种实施方式中，与YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213的氨基酸序列相比，密码子对去优化的黄热病病毒具有多至1、2、3、4或5个氨基酸变化。氨基酸变化可以是不同的氨基酸、氨基酸的删除或氨基酸的添加。
在国际专利申请No.PCT/US2008/058952中描述了密码子对去优化的方法，以引用的方式将其内容并入本文。
本发明的各种实施方式提供了去优化的黄热病病毒，其中，CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量的频率改变。在各种实施方式中，去优化的YFV中的CpG二核苷酸含量增加。在各种实施方式中，去优化的YFV中的UpA二核苷酸含量增加。
在各种实施方式中，所述去优化的黄热病病毒具有与YFV 17D、YFV 17D-204、YFV17DD或YFV 17D-213相同的氨基酸序列。在各种实施方式中，与YFV 17D、YFV 17D-204、YFV17DD或YFV 17D-213的氨基酸序列相比，去优化的黄热病病毒具有多至1、2、3、4或5个氨基酸变化。氨基酸变化可以是不同的氨基酸、氨基酸的删除或氨基酸的添加。
在国际专利申请No.PCT/US2008/058952中描述了改变CG和/或TA(或UA)二核苷酸含量的方法，以引用的方式将其内容并入本文。
本发明的减毒YFV(特别是合成的YFV 17D)可在用于减小肿瘤大小和治疗各种器官(例如：乳腺、结肠、支气管通道、胃肠的上皮衬里、上呼吸道和泌尿生殖道、肝、前列腺、脑或任何其它人体组织)中的恶性肿瘤的预防性和治疗性组合物中有用。在各种实施方式中，本发明的修饰的YFV可对于减小实体瘤的大小和治疗实体瘤有用。在具体的实施方式中，被治疗或减小大小的肿瘤为胶质瘤、胶质母细胞瘤、腺癌、黑色素瘤或神经母细胞瘤。在各种实施方式中，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。
本发明的药物组合物还可包含用于预防恶性肿瘤的其它治疗剂。例如，本发明的修饰的YFV可以与手术、放射疗法和/或化学疗法联合使用。此外，一种或多种的修饰的YFV可与前述治疗程序中的一种或两种联合使用。这种联合疗法可以有利地使用较低剂量的所给予的治疗试剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或不良作用。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的根据本发明的一种或多种修饰的YFV，和药学上可接受的载体。“治疗有效量”是指能够引起癌细胞裂解从而引起肿瘤坏死的量。“药学上可接受的载体”是指不会在所给予的患者中引起变态反应或其它不利影响的载体。
例如，合适的药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。药学上可接受的载体可进一步包括少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质提高经修饰的病毒嵌合体的保质期或有效性。
本发明的组合物可为多种形式。例如，这些形式包括液体剂型(如液体溶液、分散剂或悬浮剂、可注射溶液和可输注溶液)。优选的形式取决于预期的给予方式和预防性或治疗性应用。优选的组合物为可注射溶液或可输注溶液的形式。
可以通过众所周知的重组DNA技术来合成重组修饰的YFV。任何关于DNA技术的标准手册都提供了生产本发明的修饰的病毒嵌合体的详细方案。
本发明进一步提供了合成本文所述的任一种病毒的方法，所述方法包括：(a)对待合成的目标病毒进行鉴别；(b)对目标病毒进行完全测序，或对公共或私人可用的数据库上的序列进行定位；(c)对包含基因组的编码区和非编码区的DNA进行从头合成，所述DNA作为称为“感染性克隆”的完整质粒或可使用重叠PCR连接的合成DNA的个体片段。在进一步的实施方式中，用合成的DNA置换整个基因组。在更进一步的实施方式中，用合成的DNA置换基因组的一部分。在其它实施方式中，所述基因组的一部分为衣壳编码区。
预防性和治疗性癌症治疗
本发明涉及可用作溶瘤疗法以治疗不同的肿瘤类型的黄热病病毒和包含这些黄热病病毒的组合物的生产，以及通过给予减毒的YFV病毒(例如，本文所述的减毒的(包括通过去优化进行的减毒)YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，特别是合成YFV17D)来治疗肿瘤和癌症的方法。
现有癌症的治疗
本发明的各种实施方式提供了诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用的方法。在各种实施方式中，当受试者被诊断患有癌症时可以进行这种类型的治疗。所述方法包括向有需要的受试者给予减毒YFV。所述减毒YFV可以以如本文提供的包含药学上可接受的载体或赋形剂的组合物来提供和给予。
在各种实施方式中，所述减毒YFV为具有截至本申请日以UniProtKB-P03314(POLG_YEFV1)提供的序列的YFV 17D疫苗。
在各种实施方式中，所述减毒YFV为YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213。
在各种实施方式中，黄热病病毒17D疫苗(及其亚株)为合成的YFV 17D。合成的YFV17D和合成的YFV 17D亚株分别与减毒活YFV 17D和减毒活YFV 17D亚株具有相同的病毒基因组。
在各种实施方式中，所述减毒的黄热病病毒为如本文所述的密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV、或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV。
在各种实施方式中，诱导对恶性肿瘤的溶瘤作用导致对所述恶性肿瘤的治疗。
在各种实施方式中，所述治疗方法进一步包括给予PD-1抑制剂。在其它实施方式中，所述治疗方法进一步包括给予PD-L1抑制剂。在其它实施方式中，所述治疗方法进一步包括给予PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂二者。
在各种实施方式中，PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在各种实施方式中，PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。本文提供了使用的PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的实例。
在各种实施方式中，恶性肿瘤的治疗降低了所述恶性肿瘤复发的可能性。它还可以降低患上不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症的可能性。如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，并且对所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。在一些实施方式中，在恶性肿瘤缓解后，受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，并且对所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。
初免-加强治疗(Prime-boost treatments)
本发明的各种实施方式提供了使用初免-加强型治疗方案引发免疫应答并诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用的方法。在各种实施方式中，引发免疫应答并诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用使得对恶性肿瘤进行治疗。
给予初始剂量的减毒YFV，特别是本发明的合成的YFV 17D以引发初始免疫应答。此后，给予加强剂量的减毒YFV，特别是本发明的合成的YFV 17D以诱导对肿瘤的溶瘤作用和/或引发包括针对肿瘤的溶瘤作用在内的免疫应答。
在各种实施方式中，所述方法包括向有需要的受试者给予初始剂量的减毒YFV，特别是合成的YFV 17D；以及向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的减毒YFV，特别是合成的YFV 17D。
在各种实施方式中，所述减毒YFV为YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213。在各种实施方式中，所述减毒YFV为如本文所述的密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV、或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV。在各种实施方式中，所述减毒YFV为：如本文所述的，密码子去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或者通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213。
在各种实施方式中，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予所述初始剂量。
在各种实施方式中，瘤内、静脉内、鞘内或肿瘤内(直接进入肿瘤)给予所述一个或多个加强剂量。优选的给予方式为直接给予至肿瘤部位。
例如，初始剂量和加强剂量之间的时间可以根据癌症的类型、癌症的阶段和患者的身体状况而变化。在各种实施方式中，在所述初始剂量后约2周，给予所述一个或多个加强剂量中的第一个。即，给予所述初始剂量并在其后约两周给予加强剂量。
在各种实施方式中，在初始剂量后约1周，给予所述一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，在初始剂量后约2周，给予所述一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，在初始剂量后约3周，给予所述一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，在初始剂量后约4周，给予所述一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，给予2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个加强剂量。在各种实施方式中，给予1-5个、5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-35个、35-40个、40-45个或45-50个加强剂量。在各种实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。在另外的实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。作为非限制性实例，可以给予初始剂量，在其后约两周可以给予第一个加强剂量，在第一个加强剂量后约一个月，可以给予第二个加强剂量，在第二个加强剂量后约6个月，可以给予第三个加强剂量。作为另一非限制性实例，可以给予初始剂量，在其后约两周以每周一剂给予10个加强剂量。作为另一非限制性实例，可以给予初始剂量，在其后约两周可以给予第一个加强剂量，在第一个加强剂量后约六个月，可以给予第二个加强剂量，在第二个加强剂量后约12个月，可以给予第三个加强剂量。在进一步的实施方式中，可以定期给予额外的加强剂量，例如，每年、每隔一年、每5年、每10年等。
在各种实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间剂量可以变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初始剂量可以包含较少的病毒拷贝。
在其它实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间给予途径可以变化。在非限制性实例中，初始剂量可以皮下给予，加强剂量可以通过注射到肿瘤中进行给予；对于不可接近的肿瘤或难以接近的肿瘤，可以静脉内给予加强剂量。
在各种实施方式中，所述治疗进一步包括给予PD-1抑制剂。在其它实施方式中，所述治疗进一步包括给予PD-L1抑制剂。在其它实施方式中，所述治疗进一步包括给予PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂二者。在具体的实施方式中，在治疗(加强)阶段而不是在引发阶段期间给予PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或两者。
在各种实施方式中，所述PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在各种实施方式中，所述PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。本文提供了PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的实例。
患癌前的初免-加强治疗
本发明的各种实施方式提供了在未患癌症的受试者中引发免疫应答并在如果肿瘤或癌细胞在所述受试者中发展时诱导对所述肿瘤或癌细胞的溶瘤作用的方法。所述方法使用初免-加强型治疗方案。在各种实施方式中，如果所述受试者发展为癌症时，引发免疫应答并诱导对肿瘤或癌细胞的溶瘤作用使得对恶性肿瘤进行治疗。
当受试者未患癌症时或当受试者被认为未患癌症时，给予初始剂量的减毒YFV(特别是本发明的合成的YFV 17D)，以引发初始免疫应答。后者可能是由于无法检测或未检测到的癌症。
此后，在一些实施方式中，定期给予加强剂量的减毒YFV(特别是本发明的合成的YFV 17D)以继续引发免疫应答。例如，加强剂量可以约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年给予。在具体的实施方式中，可以约每5年给予所述加强剂量。
或者，在其它实施方式中，在受试者被诊断患有癌症之后，给予加强剂量的减毒YFV，特别是本发明的合成的YFV 17D。例如，一旦受试者被诊断患有癌症，就可以在此后不久开始进行涉及给予加强剂量的治疗方案，以诱导对肿瘤的溶瘤作用和/或以引发包括针对肿瘤的溶瘤作用在内的免疫应答。在进一步的实施方式中，可以给予额外的加强剂量以继续治疗癌症。
在各种实施方式中，所述减毒YFV为YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213。在各种实施方式中，所述减毒YFV为如本文所述的密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV、或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV。在各种实施方式中，所述减毒YFV为：如本文所述的，密码子去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或者通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213。
尽管不希望受任何特定理论或设定方案的束缚，据信初始剂量和加强剂量“教导”受试者的免疫系统来识别病毒感染的细胞。因此，当受试者患上癌症并给予加强剂量时，所述受试者的免疫系统识别病毒感染的细胞；这一次，病毒感染的细胞为癌细胞。在针对病毒感染的癌细胞的免疫应答过程中，免疫系统也被癌抗原启动，从而增强抗癌免疫力，因为免疫系统也会靶向表达所述癌抗原的细胞。
因此，在各种实施方式中，恶性肿瘤的治疗降低了所述恶性肿瘤复发的可能性。它还可以降低患上不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症的可能性。如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，并且所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。在一些实施方式中，在恶性肿瘤缓解后，受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，并且所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。
人们可以将初始剂量和加强剂量视为抗癌疫苗，在癌症发展时使免疫系统准备好以靶向所治疗的肿瘤细胞。
在各种实施方式中，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予初始剂量。
在各种实施方式中，当将一个或多个加强剂量给予未患癌症或未被怀疑患有癌症的受试者时，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予所述一个或多个加强剂量。
在各种实施方式中，当将一个或多个加强剂量给予已被诊断患有癌症的受试者时，瘤内、静脉内、鞘内或肿瘤内(直接进入肿瘤)给予所述一个或多个加强剂量。优选的给予方式为直接给予至肿瘤部位。
初始剂量和加强剂量之间的时间可以根据，例如，癌症的类型、癌症的阶段和患者的身体状况而变化。在各种实施方式中，如果受试者未患癌症或未被怀疑患有癌症，则在初始剂量后约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年给予所述一个或多个加强剂量中的第一个。在具体的实施方式中，约每5年给予所述加强剂量。
在各种实施方式中，例如，当受试者被诊断患有癌症时，在癌症诊断之后给予所述一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，给予2、3、4或5个加强剂量。在各种实施方式中，给予2、3、4、5、6、7、8、9或10个加强剂量。在各种实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。在另外的实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。作为非限制性实例，可以给予初始剂量，在其后约五年，可以给予第一个加强剂量，在第一个加强剂量后约一年，受试者被诊断患有癌症，可以给予第二个加强剂量，在第二个加强剂量后约2周，可以给予第三个加强剂量，在第三个加强剂量后约2周，可以给予第四个加强剂量，并在第四个加强剂量后约1个月，可以给予第五个加强剂量。一旦确定癌症处于缓解中，可以给予额外的定期加强剂量，例如，每6个月、每年、每2年、每3年、每4年或每5年。
在各种实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间剂量可以变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初始剂量可以包含较少的病毒拷贝。
在其它实施方式中，在初始剂量和加强剂量之间给予途径可以变化。在非限制性实例中，初始剂量可以皮下给予，加强剂量可以通过注射到肿瘤中进行给予(当受试者患有癌症时)；对于不可接近的肿瘤或难以接近的肿瘤，可以静脉内给予加强剂量。
在各种实施方式中，接受这些治疗(例如，在患癌症之前接受初始剂量，或在患癌症之前接受初始剂量和加强剂量，然后在患癌症之后接着接受加强剂量)的受试者可以是处于发展为癌症的较高风险中的受试者。此类受试者的实例包括但不限于具有如下的受试者：具有遗传倾向(例如，BRCA1或BRCA2突变、TP53突变、PTEN突变、KRAS突变、c-Myc突变、被美国国家癌症研究所视为癌症易感突变的任何突变等)，癌症家族史，高龄(例如，40、45、55、65岁或以上)，高于正常的放射暴露，长时间的阳光照射，烟草使用史(例如，吸烟、咀嚼)，酗酒史，药物滥用史，体重指数>25，慢性炎性疾病史(例如，炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、哮喘、类风湿性关节炎等)，免疫抑制史，已知与癌症风险增加相关的慢性感染史(例如，丙型肝炎、乙型肝炎、EBV、CMV、HPV、HIV、HTLV-1、MCPyV、幽门螺杆菌(H.Pylori)等)。
在各种实施方式中，接受这些治疗(例如，在患癌症之前接受初始剂量和加强剂量，或者在患癌症之前接受初始剂量和加强剂量然后在患癌症之后接着接受加强剂量)的受试者可为未处于较高风险类别的受试者，但由其临床医师开出初始剂量和加强剂量，作为未来癌症风险的预防措施。
在各种实施方式中，所述治疗进一步包括给予PD-1抑制剂。在其它实施方式中，所述治疗进一步包括给予PD-L1抑制剂。在其它实施方式中，所述治疗进一步包括给予PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂二者。在具体的实施方式中，在治疗(加强)阶段而不是在引发阶段期间给予PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或两者。
在各种实施方式中，PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在各种实施方式中，PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。本文提供了PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的实例。
炎性反应
在各种实施方式中，给予本发明的黄热病病毒17D以刺激受试者中内源性1型干扰素的产生，这部分地提供了治疗功效。
在各种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以在受试者中维持治疗有效量的1型干扰素产量，这部分地提供了治疗功效。
在其它实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以激活受试者中的I型干扰素以维持所述受试者中的电离辐射和化学疗法致敏。
在各种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以将包括CD45+白细胞、中性粒细胞、B-细胞、CD4+T细胞和CD8+免疫细胞在内的促炎性免疫细胞募集至癌症部位，这部分地提供了治疗功效。
在各种实施方式中，给予本发明的修饰的病毒以降低来自癌症部位的抗炎性免疫细胞(例如FoxP3+T调节细胞或M2巨噬细胞)，这部分地提供了治疗功效。
在各种实施方式中，恶性肿瘤的治疗降低了所述恶性肿瘤复发的可能性。它还可以降低患上不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症的可能性。如果受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。在一些实施方式中，在恶性肿瘤缓解后，受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。
PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂
如本文所讨论可使用的抗PD1抗体的实例包括但不限于派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、斯巴达珠单抗、西米普利单抗、AK105、BCD-100、BI 754091、JS001、LZM009、MGA012、Sym021、TSR-042、MGD013、AK104、XmAb20717、和替雷利珠单抗。
PD-1抑制剂的其它实例包括但不限于PF-06801591、表达抗PD1抗体的多能杀伤性T淋巴细胞(PIK-PD-1)和自体抗EGFRvIII 4SCAR-IgT细胞。
抗PD-L1抗体的实例包括但不限于BGB-A333、CK-301、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559、和CK-301。抗PD-L1抑制剂的另一实例为M7824。
给予途径
除了以上讨论的那些之外，可以瘤内、静脉内、鞘内或肿瘤内(直接进入肿瘤)递送治疗性溶瘤性YFV 17D病毒(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或者密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV；或者如本文所述的，密码子去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213)。优选的给予方式是直接至肿瘤部位。可以以范围在1-10μL之间的极小体积来给予用于治疗目的的病毒接种物。
对于本领域技术人员将显而易见的是，治疗有效量的本发明的YFV 17D病毒(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV；或密码子去优化的YFV17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV17DD或YFV 17D-213，或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213)可取决于：给予计划；所给予的YFV 17D病毒(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，或密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV)的单位剂量；YFV 17D病毒(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV；或密码子去优化的YFV17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV17DD或YFV 17D-213，或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213)是否与其它治疗试剂联合给予；患者的状况和身体状况。在各种实施方式中，给予治疗有效量(4.74log10+/-2log10)的本发明的YFV 17D病毒。
溶瘤性重组病毒的治疗有效量可以根据经验确定，并且取决于可以安全给予的重组病毒的最大量、以及产生有效溶瘤的重组病毒的最小量。
溶瘤性减毒YFV(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV；或密码子去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213)，特别是合成的YFV 17D的治疗性接种可以重复给予，这取决于初始治疗方案的效果。如果宿主对最初给予的溶瘤性减毒YFV(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV；或密码子去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，密码子对去优化的YFV 17D、YFV17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213)，特别是合成的YFV 17D的免疫应答限制了其有效性，可以进行具有不同修饰病毒血清型的溶瘤性修饰病毒的额外注射。可以很容易地通过血清学确定宿主对减毒YFV(或如本文所述的YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213；或密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV；或密码子去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，密码子对去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213，或通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV 17D、YFV 17D-204、YFV 17DD或YFV 17D-213)，特别是合成的YFV17D的免疫应答。然而根据所选择的给予计划，将认识到比上述所指示的剂量低或高的剂量。
实施例
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明并且不应被解释为限制本发明的范围。在提及具体材料的范围内，其仅为举例说明之目的，并不旨在限制本发明。本领域技术人员可以在不行使创造性能力且不脱离本发明的范围的情况下开发出等效的手段或反应物。
实施例1
在免疫功能正常(Immune-Competent)小鼠中的免疫原性
在第0天和第21天用5×106PFU的合成YFV 17D免疫接种C57BL/6小鼠(图2A)。在第0、21和35天收集血清并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测试来测试中和抗体。小鼠最初对YFV 17d呈血清阴性(PRNT50<16)。在初始免疫接种后，所有小鼠均血清转化(PRNT50≥32)。从第21天(243.2)到第35天(240.0)，平均PRNT50滴度没有显著增加，表明在加强剂量后诱导了阻止YFV 17D复制的消除性免疫。在第0天和第21天用5×106PFU的合成YFV 17D免疫接种BALB/c小鼠(图2B)。在第0、21和35天收集血清并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测试来测试中和抗体。小鼠最初对YFV 17D呈血清阴性(PRNT50<16)。在初始免疫接种后，所有小鼠均血清转化(PRNT50≥32)。在加强后2周，平均PRNT50滴度从44.8(第21天)增加到195.2(第35天)，显著增加(p＝0.01；配对t检验)。在第0天和第21天用5×106PFU的合成YFV 17D免疫接种DBA/2(图2C)。在第0、21和35天收集血清并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测试来测试中和抗体。小鼠最初对YFV 17D呈血清阴性(PRNT50<16)。在初始免疫接种后，所有小鼠均血清转化(PRNT50≥32)。从第21天(192)到第35天(160.0)，平均PRNT50滴度没有显著增加，表明在加强剂量后诱导了阻止YFV 17D复制的消除性免疫。正如中和抗体的诱导所证明的，通过免疫接种合成的YFV 17D成功地诱导了对YFV 17D的免疫力。
实施例2
在免疫功能正常小鼠中针对B16黑色素瘤的溶瘤功效
合成的YFV 17D用于治疗C57BL/6小鼠中植入的同基因B16黑色素瘤细胞，在第0天和第21天免疫接种，在第38天植入，然后用在第49、51、53、56、69、71、76和78天递送的107PFU处理8次(图3A-图3B)。免疫接种的C57BL/6小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至右胁腹中的105个B16细胞，并用0.2％BSA MEM进行模拟处理(n＝10)或者用107PFU的合成YFV17D处理(n＝10)。所植入的肿瘤通过直接注射50μL的合成YFV 17D进行处理。每天使用卡尺测量肿瘤的高度、宽度和深度，并使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)：
Figure BDA0003354580530000281
与模拟对照小鼠相比，经处理小鼠的肿瘤大小在第52、53、54、55、57和58天显著减小(图3A)，通过学生t检验比较每组的平均肿瘤大小进行确定。第58天后，大多数的模拟对照组已达到我们的人道早期终点(1,000mm3肿瘤体积)，无法再比较大小。在存活率方面(使用1,000mm3肿瘤体积作为人道早期终点)，YFV 17D处理小鼠的结果大大改善，中位存活从植入后20天(模拟对照组)增加到31天。如使用Kaplan-Meier曲线的生存分析所示(图3B)，通过对数秩(Mantel-Cox)检验，YFV 17D处理的C57BL/6小鼠的生存率与模拟对照组相比显著提高(p＝0.0141)。样本大小基于先前实验中观测到的肿瘤大小的标准偏差，并使用GraphPad Statmate 2选择以获得足够的统计功效(0.80)。
实施例4
在免疫功能正常小鼠中针对EMT-6三阴性乳腺癌的溶瘤功效
合成的YFV 17D用于治疗BALB/C小鼠中植入的同基因EMT-6三阴性乳腺癌细胞，在第0天和第21天免疫接种，在第37天植入，然后用在第40、42、44、46、49、51、58、65和67天递送的107PFU的合成YFV 17D处理9次。免疫接种的BALB/C小鼠植入有以100μL的体积皮下递送至腹部脂肪垫中的104个EMT-6细胞，并进行模拟处理(n＝10)或者用107PFU的合成YFV17D处理(n＝10)。植入的肿瘤通过直接注射50μL的合成YFV 17D进行处理。每天使用卡尺测量肿瘤的高度、宽度和深度，并使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)：
Figure BDA0003354580530000282
与模拟对照组相比，在第41-56天YFV 17D处理的小鼠的肿瘤大小显著减小(图4A)，通过学生t检验比较每个时间点的平均值来确定。第23天后，模拟对照组中剩余的小鼠太少，无法在组之间进行统计比较。与模拟对照相比，YFV 17D处理组的生存率(由大小≥500mm3的肿瘤溃疡的人道早期终点来确定)也得到改善。与模拟对照(19天)相比，处理组(36天)的中位存活要高得多，并且Kaplain-Meier曲线通过对数秩(Mantel-Cox)分析显示处理组小鼠的存活率提高(p＝<0.0001)。样本大小基于先前实验中观测到的肿瘤大小的标准偏差，并使用GraphPad Statmate 2选择以获得足够的统计功效(0.80)。
实施例5
在免疫功能正常小鼠中针对CCL-53.1黑色素瘤的溶瘤功效
出于本研究的目的，在第0天和第21天用合成的YFV 17D初始免疫接种DBA/2小鼠(n＝8)，然后在第45天植入105个Clone M3,Cloudman S-91黑色素瘤肿瘤细胞(ATCC CCL-53.1)，然后用在第51、53、56、58、60、63、65、72和79天递送的107PFU的合成YFV 17D处理9次(图5A-图5B)。植入的肿瘤通过直接注射50μL的合成YFV 17D进行处理。每天使用卡尺测量肿瘤的高度、宽度和深度，并使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)：
Figure BDA0003354580530000291
对于死亡率，使用≥20％体重减轻、肿瘤溃疡或肿瘤生长>1,000mm3的早期人道终点。样本大小基于先前实验中观测到的肿瘤大小的标准偏差，并使用GraphPad Statmate 2选择以获得足够的统计功效(0.80)。植入的CCL-53.1细胞对YFV 17D的溶瘤处理反应良好。根据处理组和模拟处理组之间的学生t检验比较，在第53、56、60、61和63-67天处理组的平均肿瘤大小显著减小。此外，与模拟处理对照(27.5天)相比，处理组(>47天)的中位存活时间大大增加。Kaplan-Meier存活曲线的比较(图5B)还显示，通过对数秩(Mantel-Cox)检验，与模拟对照(p＝0.0004)相比，经处理的DBA/2小鼠的存活率显著提高。
使用CCL53.1细胞植入可在DBA/2小鼠中很好地对黑色素瘤进行建模，并且在本研究中显示对合成的YFV 17D的处理敏感。
实施例6
用低传代和高传代合成YFV 17D处理DBA/2小鼠中植入的同基因CCL-53.1黑色素瘤细胞
从Taconic Biosciences获得4-10周龄的雌性DBA/2小鼠，并在第-3天取血以用于初步抗体滴度。在第0天，第3组和第5组的小鼠进行了模拟免疫接种(见表2)。根据先前实验(GraphPad StatMate)给出的已知肿瘤大小标准偏差，基于最小样本大小计算出8只小鼠。在第21天和第35天，对免疫接种的小鼠进行取血，并使用空斑减少中和50％(PRNT50)测定来测试针对YFV 17D的中和抗体。在第21天，用与第0天相同剂量的相同病毒对免疫接种的小鼠进行加强。通过皮下注射以100μL体积的DMEM将1×105个CCL-53.1细胞植入小鼠。在第51、53、56、58、60、63、65、72和79天，使用50μL的体积对所有小鼠进行如表2中的处理。第1、2、4和5组的小鼠在第88天和第93天接受了额外的两次处理。
组 免疫接种 剂量 处理 剂量(PFU) 样本大小
3 YFV 17D 5x10<sup>6</sup> YFV 17D 1x10<sup>7</sup> 8
5 模拟 模拟 8
YFV 17D的免疫原性：DBA/2小鼠(n＝8)在第0天和第21天免疫接种，在第0天、第21天和第35天收集血清用于通过PRNT50测定进行的中和抗体滴定。所有小鼠最初针对YFV17D均呈血清阴性(GMT：<8)，在用5×106PFU单次免疫接种后，所有小鼠在第21天血清转化(GMT：172.3)。通过配对t检验，从第21天到第35天(GMT：143.7)，PRNT50滴度没有显著差异(p＝0.3632)。(参见图6)
初始肿瘤大小：通过ANOVA(p＝0.3983)和Dunnett多重比较来比较每组(n＝8)的初始肿瘤大小(第51天)，将每组与模拟免疫接种的对照进行比较。与模拟处理(94.59mm3)相比，免疫接种YFV 17D的植入肿瘤的初始平均值更小(37.18mm3)，这种差异通过学生t检验是显著的(p＝0.020215)，但通过普通单因素ANOVA或Dunnett多重比较检验是不显著。
YFV 17D的功效：通过多次t检验比较肿瘤大小(mm3)，发现在第51、53、56、63、65、69、71、73、76和78天，YFV 17D处理的小鼠中的肿瘤大小显著更小。如果将肿瘤生长作为与初始肿瘤大小相比的百分比变化的函数进行检查，则在任何一天，YFV 17D处理的肿瘤与模拟处理的肿瘤都没有显著差异。然而，与模拟处理的肿瘤中的27.5相比，YFV 17D处理的肿瘤(MTD>60)的生存(由肿瘤大小<1,000mm3来确定)得到改善。(图7A-图7C)
对于YFV 17D处理而言，观测到每种溶瘤处理都有改善的存活和减小的肿瘤大小的益处。每个处理组的存活者在植入后60天后仍保持相对较小的肿瘤大小。
总之，使用DBA/2小鼠中的同基因CCL-53.1植入模型，低传代和高传代YFV 17D对黑色素瘤均有效。
实施例7
YFV 17D成功的溶瘤疗法进一步防止激发后EMT-6肿瘤生长
用YFV 17D处理且根除肿瘤的BALB/C小鼠(n＝3)通过第二次植入104个EMT6 TNBC细胞进行激发。通过皮下注射到右胁腹(远离腹部脂肪垫(初次接种部位)的第二部位)中对小鼠进行激发。对照的未接受过处理的小鼠(n＝8)也同时植入104个EMT6 TNBC细胞。植入后每天测量两组中的肿瘤。在对照小鼠中植入后第4-14天的肿瘤大小(mm3)明显更大。虽然YFV 17D组的单只小鼠在第5天出现小肿瘤，但在第9天消失。在对照组中，第3天一半小鼠中出现肿瘤，第5-14天所有小鼠中出现肿瘤。
本发明的各种实施方式在上面的详细描述中进行了描述。虽然这些描述直接描述了上述实施方式，但是应当理解，本领域技术人员可以想到对本文示出和描述的特定实施方式的修改和/或变化。落入本描述范围内的任何此类修改或变化也旨在包括在其中。除非特别指出，发明人的意图是将说明书和权利要求中的词语和短语赋予对于适用领域的普通技术人员而言普通和习惯的含义。
申请人在提交申请时已知的本发明的各种实施方式的前述描述已经被呈现并且旨在用于说明和描述的目的。本描述并不旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式，并且根据上述教导，许多修改和变化是可能的。所描述的实施方式用于解释本发明的原理及其实际应用，并使本领域的其他技术人员能够在各种实施方式中利用本发明并进行各种修改，以适合预期的特定用途。因此，目的在于本发明不限于为实施本发明而公开的特定实施方式。
虽然已经示出和描述了本发明的特定实施方式，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，基于本文的教导，可以在不脱离本发明及其更广泛的方面的情况下做出改变和修改，因此，所附权利要求书将包括在本发明的真正精神和范围内的所有此类改变和修改于其范围内。本领域技术人员将理解，一般而言，本文中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。
如本文所用，术语“包括”或“包含”用于指对实施方式有用的组合物、方法及其各自的组分，但对包括未指定的元素开放，无论是否有用。本领域技术人员将理解，一般而言，本文中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。尽管开放式术语“包括”，作为诸如包括、包含或具有等术语的同义词在本文中用于描述和要求保护本发明，但本发明或其实施方式也可替代地使用替代术语来描述，例如“由……组成”或“基本上由……组成”。

Claims (32)

1.一种对恶性肿瘤进行治疗或减小肿瘤大小的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予减毒的黄热病病毒(YFV)。
2.一种对恶性肿瘤进行治疗的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予初始剂量的减毒YFV；以及
向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的减毒YFV。
3.一种减小肿瘤大小的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给予初始剂量的减毒YFV；以及
向所述有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的减毒YFV。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述减毒YFV为YFV 17D毒株疫苗(YFV17D)。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述减毒YFV为合成的YFV 17D毒株(YFV17D)。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述减毒YFV为YFV 17D-204、YFV 17DD、YFV 17D-213、密码子去优化的YFV、密码子对去优化的YFV或者通过增加CG或TA(或UA)二核苷酸含量而去优化的YFV。
7.如权利要求2或3所述的方法，其中，皮下、肌内、皮内、鼻内或静脉内给予所述初始剂量。
8.如权利要求2或3所述的方法，其中，瘤内或静脉内给予所述一个或多个加强剂量。
9.如权利要求2或3所述的方法，其中，在一个初始剂量后约2周给予所述一个或多个加强剂量中的第一个；或者如果多于一个初始剂量，则在最后一个初始剂量后约2周给予所述一个或多个加强剂量中的第一个。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有癌症。
11.如权利要求3所述的方法，其中，在所述受试者未患癌症时，给予所述初始剂量。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述受试者处于发展为癌症的较高风险中。
13.如权利要求11所述的方法，其中，在所述受试者未患癌症时，在所述初始剂量后约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年给予所述一个或多个加强剂量。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述受试者随后被诊断患有癌症，在所述受试者被诊断患有癌症之后给予所述一个或多个加强剂量。
15.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括给予PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂为抗PD1抗体。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述抗PD1抗体选自于由如下抗体所组成的组：派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、斯巴达珠单抗、西米普利单抗、AK105、BCD-100、BI 754091、JS001、LZM009、MGA012、Sym021、TSR-042、MGD013、AK104、XmAb20717、替雷利珠单抗及其组合。
18.如权利要求15所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂选自于由如下所组成的组：PF-06801591、表达抗PD1抗体的多能杀伤性T淋巴细胞(PIK-PD-1)、自体抗EGFRvIII 4SCAR-IgT细胞及其组合。
19.如权利要求15所述的方法，其中，所述PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述抗PD-L1抗体选自于由如下抗体所组成的组：BGB-A333、CK-301、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559、CK-301及其组合。
21.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗PD-L1抑制剂为M7824。
22.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，对所述恶性肿瘤进行治疗降低所述恶性肿瘤复发的可能性。
23.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，对所述恶性肿瘤进行治疗降低患上不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症的可能性。
24.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，如果所述受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。
25.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在所述恶性肿瘤缓解后，如果所述受试者发展出不同于所述恶性肿瘤的第二种癌症，所述恶性肿瘤的治疗使得所述第二种癌症的生长减缓。
26.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，对所述恶性肿瘤进行治疗刺激所述肿瘤中的炎性免疫应答。
27.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，对所述恶性肿瘤进行治疗将促炎性细胞募集至所述肿瘤。
28.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，对所述恶性肿瘤进行治疗刺激抗肿瘤免疫应答。
29.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述恶性肿瘤为实体瘤。
30.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述恶性肿瘤选自于由如下恶性肿瘤所组成的组：胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、腺癌、髓母细胞瘤、乳腺癌性瘤、前列腺癌性瘤、结直肠癌性瘤、肝细胞癌性瘤、膀胱癌、前列腺癌、肺癌性瘤、支气管癌性瘤、表皮样癌性瘤和黑色素瘤。
31.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，瘤内、静脉内、脑内、肌内、椎管内或鞘内给予所述减毒YFV。
32.如权利要求31所述的方法，其中，给予所述减毒YFV引起肿瘤细胞中的细胞裂解。
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