CN1398297A - 重组黄病毒及其用途 - Google Patents

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R·安迪诺-帕夫卢诺夫斯基
A·麦考利斯特-莫雷诺
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Abstract

本发明提供重组黄病毒，尤其是活的减毒重组黄病毒，其中包括可编码外源氨基酸序列的外源核苷酸序列。这些重组黄病毒包括外源核酸。用重组黄病毒感染宿主细胞，可提供在宿主细胞中表达外源核酸，并产生由外源核酸编码的抗原性多肽。这种重组黄病毒可用于引发对外源多肽的免疫应答。

Description

重组黄病毒及其用途
与相关申请的相互参照
本申请要求享有于2000年1月21日归档的美国临时专利申请号60/177,449的利益，本文将其全部纳入作为参考。
政府权利
按美国公共卫生事业AI44343号资助，美国政府在本申请中可拥有一定权利。
发明领域
本发明主要涉及重组病毒领域，并涉及对特定免疫力的诱发，尤其是对肿瘤-特异性免疫力的诱发作用。
发明背景
肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以在一些试验系统和癌症患者中预防或消除肿瘤(1-3)。临床试验表明，35％用特异性肿瘤-反应性淋巴细胞治疗的黑色素瘤患者的肿瘤可以部分或完全退化(4)。在有些情况下已鉴定了由T细胞识别的抗原(5，6)。虽然癌细胞可能表达肿瘤-相关性抗原(TAA)，但生长的肿瘤不能有效地引发指导抗TAA的CTL，故免疫系统不能控制肿瘤的生长。因此，看来肿瘤细胞既缺乏免疫原性，还可能缺乏激活CTL所需的适当的共同刺激作用。
与肿瘤细胞相反，病毒是细胞免疫应答的一种强诱导因子。因此，通过用表达肿瘤相关性抗原的重组病毒施行免疫接种来激活肿瘤-指导的CTL的应答，是预防和治疗恶性肿瘤有前途的方法。已在实验性癌症模型中成功地使用的病毒疫苗载体包括痘病毒、腺病毒、细小核糖核酸病毒和流感病毒(7-10)。然而，由于各疫苗载体自身可能存在的有益特性和不良副作用，对新载体的探索依旧是研究的热门领域。例如，当前正在研究的一些载体的临床用途，还受着它们在安全性、有效性、潜在的致瘤性或引发免疫抑制作用等方面的记录的限制。另外，原有的对抗这类载体的免疫作用也会阻碍治疗的效力(8，11)，因此需要另选其它病毒载体。
本领域需要一种可用于诱导针对广泛范围的抗原(包括肿瘤中存在的那些抗原)的免疫力的病毒载体。本发明实现了这一需求，并可提供一些相关的益处。
发明概述
本发明提供了一种重组黄病毒，其中包括可编码外源多肽的外源核酸序列。一般而言，本发明的重组黄病毒具有复制能力，即它们是活的减毒病毒。在一些实施例中，黄病毒是黄热病病毒。因此，在一些实施例中，本发明提供了重组黄热病病毒(YFV)，尤其是活的减毒重组YFV，其中包括可编码外源(即非-YFV)多肽的外源(即非-YFV)的核苷酸序列。这些重组黄病毒包括外源核酸。用重组黄病毒感染宿主细胞，可使宿主细胞内表达外源核酸，并产生由该外源核酸编码的抗原多肽。这种重组黄病毒可用于引发对外源多肽的免疫应答。
重组活减毒核蛋白可表达外源核酸序列，该序列可编码掺入黄病毒多蛋白的外源多肽，如(但不限制于)从黄病毒以外的病原体得到的多肽、肿瘤抗原等。当引入到哺乳动物对象时，这些重组黄病毒可用于引发针对该对象内的外源性多肽的免疫应答。因此，本发明的重组黄病毒可作为免疫作用的载体。
可将多种抗原性氨基酸序列掺入黄病毒多蛋白，包括微生物病原体(如细菌、寄生虫、(除黄病毒以外的)病毒、真菌等)的那些多蛋白和各种肿瘤相关性抗原。通常，在用本发明的重组病毒感染宿主细胞后，该外源性多肽可从病毒多蛋白前体经蛋白酶解作用切割分离而进入其结合部分。然后该外源多肽可能被输送到宿主细胞表面，也可能以具有主要组织相容性抗原的肽存在于细胞表面，也可能从细胞分泌出，或存在于细胞的胞浆中。在肿瘤的免疫治疗中，宿主体的外源多肽表达可引发对该肿瘤的免疫应答，从而减少肿瘤细胞的质量和/或肿瘤细胞数，并可防止或延迟肿瘤的发展，和/或降低肿瘤发生的机会。
本发明提供了包括本发明的重组黄病毒的药物组合物。这种组合物可通过补充宿主的免疫系统，而用于诸如缓解疾病的严重程度、减少临床发病的风险、防止疾病发作和/或改善疾病进程。
本发明还提供了在哺乳动物对象中引发对抗原的免疫应答的方法。这类方法包括：对哺乳动物对象施用本发明的重组黄病毒，从而引发对外源性多肽的免疫应答。这种抗原可以是宿主抗原，或是非黄病毒病原体的抗原。
本发明还提供了可减低或抑制肿瘤细胞生长的方法，和减少肿瘤细胞质量和/或肿瘤细胞数量的方法。这些方法包括对患肿瘤的宿主施用本发明的重组黄病毒，其中包括可编码肿瘤相关性抗原(TAA)/表位的外源序列，从而使该重组黄病毒进入宿主细胞，并且使外源性TAA多肽或在宿主细胞表面表达，或存在于MHC分子中，或从宿主细胞分泌。在其表面带有针对肿瘤可引发免疫应答抗原的，该抗原包括外源性TAA多肽或类似外源性多肽足以引发针对肿瘤细胞的免疫应答。对表面上携带肿瘤相关性抗原的肿瘤的免疫应答，足以减少、抑制或消除该肿瘤。
本发明还提供了可防止肿瘤细胞生长的方法和降低肿瘤形成机会的方法，这些方法包括对未患肿瘤的宿主施用本发明的重组黄病毒，其包括肿瘤相关性抗原/可编码表位的核酸，从而使该重组黄病毒进入宿主细胞，在宿主细胞的表面表达肿瘤相关性抗原和/或在主要组织相容性(MHC)分子(如MHC I类)中存在肿瘤相关性抗原，并引发对肿瘤相关性抗原的免疫应答。这种对肿瘤相关性抗原的免疫应答足以防止或降低宿主发生肿瘤的机会。
本发明的主要目的是提供一种重组黄病毒，提供该病毒用于产生外源性多肽，当用重组黄病毒感染宿主后，这种多肽适用于引发针对该多肽的免疫应答。这种外源性多肽包括(但不限于)由宿主产生的抗原(如肿瘤抗原)或非黄病毒病原体的抗原(如逆转录病毒抗原)。
本发明的优点是本发明的重组黄病毒是减毒活病毒，它会持续繁殖直到宿主免疫系统的干预。
本发明的另一个优点是这种重组黄病毒在该体内表现为低毒性。
本发明的再一个优点是这种重组黄病毒在宿主细胞内可表达多肽，因此可以引发免疫应答，尤其是包括如抗原-特异性细胞毒性T淋巴细胞系列(CTLs)的细胞免疫应答。
本发明的还有一个优点是用本发明的重组黄病毒引发的免疫原性并不限于针对感染的细胞，该免疫系统也会识别携带由重组黄病毒表达的抗原的细胞。例如，由重组黄病毒产生肿瘤抗原可以“破坏对肿瘤抗原的免疫耐受性”，并引发针对肿瘤足以例如抑制肿瘤生长的免疫应答，。
本领域技术人员可以从以下更详细的描述中理解本发明的这些以及其他一些目的、优点和特征等具体内容。
附图简述
图1显示了黄热病病毒载体YF-pOva的模式图和表达鸡卵清蛋白的策略。上排表示YF载体基因组RNA。下排框符表示成熟的病毒蛋白质。白色箭头指NS2B/NS3切割位点，黑色三角指细胞信号肽酶切割位点。在N-末端或C-prM与NS2B-NS3之间的连接处(以黑箭头标示)插入可编码卵清蛋白Kb表位SIINFEKL的核苷酸序列和侧接于病毒蛋白酶切割位点的核苷酸序列。
图2显示了亲代黄热病病毒17D毒株(YF-17D)和三种YF病毒载体的单步生长曲线：YF-pOva-1(空心三角)，YF-pOva-2(空心圆圈)和YF-pOva-8(实心方块)。用YF-17D、YF-pOva-1、YF-pOva-2或YF-pOva-8感染SW13细胞单层(MOI＝5)。用空斑试验确定各时间点的病毒产量(pfu/ml)。
图3A-3C显示了在活体内活化CD8+T细胞至Ova肽。四合体SIINFEKL/小鼠MHC I类分子H-2 Kb复合物结合于CD8+脾细胞。流式细胞计法的统计图表明与清白小鼠或用亲代YF-17D或重组YF-pOva-8感染的小鼠的受控的(gated)CD8+T淋巴细胞相结合的四合体。用表达SIINFEKL的EL4细胞(EL4-SL8)共同培养5天，以激发脾细胞。数值表明与四合体相结合的CD8+T淋巴细胞的百分比。
图4A-D和5A-D表明用YF载体免疫接种的结果，引发了针对表达Ova的黑色素瘤B16的保护性和抗原-特异性免疫力。通过静脉内(i.v.，图4A和5A)、腹腔内(i.p.，图4B和5B)、皮下(s.c.，图4C和5C)或肌内(i.m.，图4D和5D)用YF-pOva-8(3×105pfu/小鼠)(实心方块)，每2周2次免疫接种C57BL/6小鼠。将接种亲代YF-17D(空心方块)或盐水(空白)(实心圆圈)的小鼠作为对照。在第一次免疫接种(第0天)30天后，用5×104B16-Ova攻击动物。图4A-D：局部肿瘤生长。每5天测定肿瘤的大小，并以平均肿瘤大小±标准偏差(cm2)与攻击后的时间(天)相比绘制曲线图。图5A-D：以存活动物的百分比与时间相比绘制存活曲线图。所有试验包括每组10只小鼠，并重复3次。
图6A-F显示用YF-pOva-8接种已形成B16的小鼠的结果。在第0天(移植肿瘤)用黑色素瘤B16-Ova(5×103细胞/小鼠(图6A-6C)或5×104(图6D-6F)皮下注射C57BL/6小鼠。动物每3天接受3次皮下接种PBS(空白)(实心圆圈)、或亲代17D(YF-17D)(空心方块)或YF-pOva-8(4×105pfu/小鼠)(实心方块)。在移值肿瘤的当天(第0天，图6A和6D)、第5天(第5天，图6B和6E)或第10天(第10天，图6C和6F)，施用疫苗接种。每周2次触摸检查小鼠以确证肿瘤生长。
图7显示了接种肿瘤后30天，用编码的盲试方式评估接受治疗后的小鼠肺部转移情况。显示了每个小鼠的肺转移瘤的数量。
图8显示了接种肿瘤后30天，用YF-pOva-8或YF-17D治疗后的肺部照片。
图9A和9B显示了在移植5×104细胞(图9A)或1×106细胞(图9B)后，以存活动物百分比与时间相比所绘制的存活图。空白：实心圆圈；YF-17D，空心方块；YF-pOva-8，实心方块所有各项实验都是每组10只小鼠。
优选实施例详述
在描述本发明之前，应该明确本发明不受所述的具体实施例的限制，而是可以变化的。还须理解本文所用的术语仅是为了说明所述的具体实施例，而不是对其进行限制，因为本发明的范围仅受所附的权利要求书的限制。
除非特别指出，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所涉及的领域普通技术人员通常所知的含义相同。虽然在本发明的实践和测试中可以使用任何与本发明所述的相类似或相当的方法和材料，但在此描述的则是优选的方法和材料。本文将所述的所有出版物都全部纳入作为参考，以公开和描述与所引用的这些出版物相关的方法和/或材料。
必需注意到，除非特别指出，本文及所附权利要求中的单数形式“一”、“和”和“该”也包括复数的论述对象。所以，例如“一种重组黄病毒”也包括许多这种表达，而“病毒”包括一个或多个表位以及与本领域技术人员所知相当的概念等。
本文中所论述的出版物都是在本申请书归档日期之前它们单独提供所公开的内容。在此并不能意味着发明者无权在发明之前超前使用这类出版物。另外，所提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，这就需要单独予以确定。
定义
本文交替使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指聚合形式的任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，该术语包括(但不限制于)单-、双-、或多股DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或聚合体(包括嘌呤和嘧啶的碱基或其它天然的、化学或生物化学修饰的非天然的或衍生的核苷酸碱基)。
本文交替使用的术语“肽”、“寡肽”、“多肽”“多蛋白”和“蛋白质”，它们指聚合体形式的任何长度的氨基酸，包括编码的和不编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸、和具有修饰的肽主干的多肽。
本文所用的术语“重组体”指经过克隆、限制和/或连接等步骤的各种组合过程而产生的特定的DNA序列，可形成具有与天然系统中所发现的同源序列不同的结构编码序列的构建物。通常，可编码结构编码序列的DNA序列可以由cDNA片段和短的寡核苷酸接头装配而成，或由一系列寡核苷酸装配而成，以提供能在重组体转录单元中表达的合成的基因。这种序列能够以未受内部未翻译序列干扰的开放读数框形式或内含子(通常存在于真核基因中)形式提供。也可以使用包括相关序列的基因组DNA。在开放读数框的5’或3’可能存在未翻译的DNA的序列，在那里这种序列并不干扰编码区域的操作或表达。因此，例如术语“重组体”多核苷酸或核酸指不是天然形成的或由人工结合两个按其他方式分离的序列片段得到的多核苷酸或核酸。人工结合通常由化学合成方法，或以人工操作核酸的分离片段，如通过基因工程方法完成。这通常是用可编码相同或保留的氨基酸的多余的密码子来替代一个密码子，一般要引入或除去一个序列识别位点。另外，也可将具有所需功能的核酸片段连接在一起，产生所需的若干功能的组合。
“构建物”指重组核酸(通常为重组DNA)，其目的是表达特定的核苷酸序列(类)或用于构建其它重组核苷酸序列。
类似地，“重组多肽”或“重组多蛋白”指非天然形成的或由人工组合氨基酸序列的两个按不同方式分离的片段所产生的多肽或多蛋白。这种人工组合物可由重组DNA工艺的标准方法完成，如上所述，即可能由重组多核苷酸编码重组多肽或重组多蛋白。因此，重组多肽或重组多蛋白是由全部或部分重组多核苷酸编码的氨基酸序列。
本文所用的术语“外源多肽”指通常不与天然亲代黄病毒结合的多肽。
术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原性氨基酸序列”、“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引发哺乳动物免疫应答的氨基酸序列，无论是单独或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。
本文所用的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作；和/或抑制、减少或防止肿瘤细胞的增生；和/或降低肿瘤细胞的数量或肿瘤的质量；和/或降低肿瘤性形成的可能性。
术语“肿瘤相关性抗原”是本领域所熟知的，指相对于同种细胞类型的非癌症细胞的肿瘤细胞差级表达的表面分子。本文所用的术语“肿瘤相关性抗原”不仅仅包括完整的肿瘤相关性抗原，还包括其含部分(片段)的表位。肿瘤相关性抗原(TAA)抗原可以是天然发现的，也可以是天然发现的TAA的合成形式或天然存在的TAA的变体(如免疫原特性增强的变体)。
术语“抗原”和“表位”是本领域熟知的，指可由免疫系统的一种成分(如抗体或T细胞抗原受体)特异性识别的大分子的一部分。表位可由溶液中的抗体识别，如与其它分子相对游离。当表位与I或II类主要组织相容性复合物分子结合时，就可由T-细胞抗原受体识别表位。“CTL表位”就是当表位存在于与MHC I类分子结合的细胞表面上时，由细胞毒性T淋巴细胞(通常为CD8+细胞)识别的表位。
本文所用的术语“分离的”指描述处于与一种化合物的天然形成环境所不同的条件下的有关化合物(如重组病毒、肽等)。“分离的”包括在样本中一种有关化合物基本处于富集状态和/或在其中一种有关化合物有部分或基本上达到纯化的各种化合物。
本文所用的术语“基本纯的”指从其天然环境取出的化合物，且是至少60％(较佳地为75％，更佳地为90％)无与之天然结合的其它成分。
本文交替使用的术语“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受黄病毒(如黄热病病毒)感染的对象，如可以支持黄病毒复制的对象。
“生物样品”包括从生物体得到，且可用于诊断或监测分析的各种样品类型。该术语包括血样和其它生物性液体样品、固态组织样品(如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞及它的子代)。该术语包括在购置后以任何方法操作的样品，如用试剂处理、溶液化或富集其某些成分。该术语包括临床样品，还包括细胞培养物、细胞上清液、细胞溶解产物、血清、血浆、生物液体和组织样品。
本文交替使用的术语“处理”、“治疗”等通常指获得理想的药理或生理效果。这种效果可以是完全或部分防止疾病或其症状的预防性效果，和/或部分或完全治愈疾病或其症状和/或对疾病造成不利作用的治疗性效果。本文所用的术语“治疗”包括对哺乳动物(如人)的疾病的任何治疗措施，且包括：(a)防止具有患病倾向但至今还未诊断出患病的对象患该病，如降低个体患该病的风险性，降低疾病症状的严重程度；(b)抑制疾病，即制止其发展；和(c)减轻疾病，即使疾病消退。在有些实施例中，本发明人着眼于处置癌症口才。在这些实施例中，“治疗”可治疗包括降低或抑制肿瘤细胞的生长，消除肿瘤、减少转移、减少或抑制肿瘤细胞的增生，减少肿瘤细胞实体的大小，减少肿瘤细胞的数量和降低肿瘤形成的可能性。
术语“癌症”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌瘤”在本文中交替使用，它们指表现相对自主生长的细胞，因此它们表现出细胞增生明显失控特征的异常生长表型。癌性细胞可以是良性或恶性。
重组黄病毒
本发明提供重组黄病毒，尤其是活的减毒重组黄病毒，包括可编码外源氨基酸序列(即亲代黄病毒以外的氨基酸序列)的外源核苷酸序列(即亲代黄病毒以外的核苷酸序列)。这种重组黄病毒可用于引发对外源肽的免疫应答。为了简化，在所有这些序列的示例中都可使用术语“外源性”，但并无对其限制的意图。
黄热病病毒(YFV)是黄病毒的一种非限制性的示例。以下对YFV的描述通常也可用于其它黄病毒。黄热病病毒是有包膜的正分股的RNA病毒，是黄病毒属的成员。其基因组长度约为11kb，可编码单个多肽(16)。在翻译期间和之后，可经蛋白酶解作用加工此多肽前体，而产生病毒复制所需的功能性蛋白质。该加工过程受细胞性和病毒性蛋白酶的介导，这些蛋白酶可识别与病毒蛋白质相连接处存在的特异性短氨基酸序列。病毒蛋白酶NS2B/NS3可介导被感染的细胞的细胞溶质中大部分的非结构蛋白质切割(17-19)。
本发明的重组黄病毒包括可编码外源多肽的核酸。在正常病毒蛋白质的翻译过程中表达的所编码的外源多肽，优选作为重组或融合前体多肽的成分。重组多蛋白通常包括外源多肽和病毒多肽，且较佳地还含有人工蛋白水解识别的若干位点。这种蛋白水解识别位点可以位于重组前体多肽中，从而可用病毒性或细胞性蛋白酶类来对前体多蛋白进行蛋白水解加工，从病毒蛋白质释放出游离的外源蛋白质。
将随后修饰成含有外源序列的启动黄病毒称为“亲代”黄病毒，它可以是本源性黄病毒(可以是病原性的，最好是非病原性的)、减毒的黄病毒、疫苗黄病毒毒株或重组黄病毒。各种黄病毒毒株都可用于生成本发明所述的重组黄病毒。
适用于生成本发明的重组黄病毒的黄病毒类包括(但不限制于)：黄热病病毒(YFV)；登革热病毒，包括1-4型登革热病毒；日本脑炎病毒；墨累溪谷脑炎病毒；圣路易斯脑炎病毒；西尼罗河热(West Nile)病毒；蜱媒脑炎病毒；丙型肝炎病毒；孔吉氏病毒；中欧脑炎病毒；俄罗斯春-夏脑炎病毒；庞沃桑病毒；凯萨纳森林病病毒；和欧姆斯克出血热病毒。在许多实施例中，用作启动黄病毒以产生重组黄病毒的黄病毒是YFV。
可从公用数据库(包括，如GenBank)获得若干YFV毒株的核苷酸序列。示范毒株是“YFV 17D”。可在GenBank登记号X03700获得YFV基因组的核苷酸序列以及可编码病毒多蛋白的氨基酸序列，Rice等人((1985)Science229：726-733)也对其有描述，本文将它们都全部纳入用于参考其中所公开的核苷酸和蛋白质序列。黄热病病毒子(病毒颗粒)的生产是本领域所熟知的。
在多数实施例中，重组黄病毒的黄病毒核苷酸序列都是野生型的，即它们是在天然条件下发现的序列。在其它一些实施例中，与野生型黄病毒相比，黄病毒核苷酸序列含有一个或多个突变体。在还有一些实施例中，重组黄病毒的黄病毒部分是从两种或多种不同的黄病毒衍生的，即用于构建重组黄病毒的黄病毒是嵌合型黄病毒。
通常，插入到黄病毒基因组的外源核酸包括可编码外源多肽的核苷酸序列和至少一个可编码蛋白水解切割位点的核苷酸序列。可编码外源多肽的核苷酸序列可能侧接于可编码蛋白水解切割位点的核苷酸序列。另外，可编码外源多肽的核苷酸序列可能仅连接于可编码蛋白水解切割位点的核苷酸序列的一侧。在后一种实例中，插入位点的选择是根据在插入后可编码外源多肽的核苷酸序列的两侧都有可编码蛋白水解切割位点的核苷酸序列侧接，其中一个核苷酸序列存在于紧邻插入位点的亲代黄病毒基因组中。
可编码外源多肽的外源核酸序列和可编码蛋白水解切割位点的核酸序列都可以位于黄病毒基因组的不同位点。作为非限制性实施例，可将外源核酸序列插入以下的一个或多个位置：(1)病毒多肽的N-末端；(2)病毒蛋白质C和prM之间；(3)病毒蛋白质NS2A和NS2B之间；(4)病毒蛋白质NS2B和NS3之间；(5)病毒蛋白质NS3和NS4A之间；和(5)NS4A和NS4B之间。外源核酸可插入黄病毒基因组的其它位点。最好是，外源核酸的插入不致破坏黄病毒蛋白质的功能、和/或病毒多肽的蛋白水解加工、和/或病毒的复制。病毒的复制是否会受到不良的影响，可用早已建立的各种方法来检测，包括(但不限制于)蚀斑测定和单步生长曲线测定(如实施例1所述)。
与仅可产生一轮抗原病毒表达的其它载体和/或会停止表达而不干扰宿主免疫系统的其它载体不同，本发明的活性重组病毒会持续繁殖直到免疫系统被充分活化到制止感染。与用常规表达载体(如病毒复制子)所引发的免疫应答相比，这样就会产生更强的(针对黄病毒产生的外源抗原性肽)的免疫应答。
重组黄病毒在感染宿主后也表现出低毒性。例如，YF-17D是非常安全和有效的活病毒疫苗，是用世界卫生组织(WHO)开发的标准方法从受感染的鸡胚制备的。免疫接种后，有95％以上的疫苗可在10天内引发免疫力(12)，且可检测抗病毒的中和抗体的期限超过35年(13)。疫苗的安全性记录是优异的：严重的对YF-17D的副作用是特别罕有的，且实际上不存在回复成野生型的情况(14，15)。
可将其它特征结合入有复制活性的重组黄病毒的设计中，如多接头序列(如EcoR1、Not1、BssH2和Xhol)以协助所需的外源序列使之容易插入到重组载体中。同样，各种突变体(如多甘氨酸序列)可与插入的序列相邻地插入，从而增进该区域的结构灵活性并大大提高蛋白水解加工的效率。
在重组的复制-活性黄病毒中可包括可编码要产生的外源蛋白或多肽的一个以上的核酸序列，结果这种病毒可产生相应数量的外源蛋白质或多肽。两个或多个核酸序列可以分别编码不同的产物也能编码同一种产物(如，如果希望提高蛋白质或多肽的产量)。
可用分子生物学的标准方法进行外源核酸的插入，如在多种标准规程都有论述，包括如“分子生物学通用规程”(F.M.Ausubel等人编辑，1987)及修订本。实施例1提供了如何完成具体插入的进一步指导。用这些指南材料，可将任何品种的外源核酸插入到黄病毒基因组中。
外源核酸的长度可以为约12-18，15-24，21-30，30-60，60-90，90-120，120-150，150-180，180-240，240-300，300-600，600-1200，1200-1500，1500-2100，2100-2400，10-1000，20-500或2400-3000个核苷酸。
可将本文所述的重组黄病毒用于在个体中引发对抗原的免疫应答，和如提供保护作用以对抗可产生抗原的外源病原体(细菌、病毒、真菌、寄生虫)的攻击或感染。因此，它们可用作提供抗这些病原体的免疫保护作用的疫苗。
任何可编码多肽或蛋白质的DNA序列，都可视为用于本发明目的的外源核酸，当表达这种多肽或蛋白质时，就可产生针对如病原微生物或与抗原存在相关或由抗原产生的疾病或紊乱的保护性免疫力。本发明的疫苗中可包括可编码一种或多种相关的外源多肽(如抗原或表位)的核酸序列。如果外源核酸序列编码多个相关的外源抗原或表位，它们可以是单个病原体的抗原或表位或多个(不同)病原体的抗原或表位。在一个优选实施例中，这种生物是一种病原性微生物。例如，这种外源表位可以从作为疾病或紊乱的致病因子的细菌、寄生虫、病毒或真菌中发现。另外，可以使用变应原、精液和癌细胞等的表位。因此，在有些实施例中，当外源核酸序列编码一个以上的外源肽时，这种外源肽可以是在单个TAA上发现的不同表位。
本发明的疫苗制剂中的各种外源蛋白质，还可包括外源生物的表位。当在脊椎动物宿主中表达外源多肽时，可以引发免疫应答，以防护由表达或宿主中的存在含该表位的抗原而引起的或与之相关的疾病或紊乱。例如，在本发明的实施例中，可以使用包含蛇毒、蜂毒、激素、精液(用于避孕)，变应原引发的抗原或免疫应答所需其它抗原外源蛋白质等的表位或蛋白质的。在另一实施例中，肿瘤-特异性抗原可以重组外源蛋白质的形式表达，以引发对癌症的保护性或治疗性免疫应答。
本发明的由重组病毒表达的可编码外源蛋白质的基因序列，可用本领域已知的方法获得，包括(但不限制于)化学或酶促合成法、从微生物的基因组DNA纯化法，从可编码TAA的cDNA纯化或分离法，从微生物的RNA进行cDNA合成法，或重组DNA法(Maniatis等人，“分子克隆：实验室手册”，1982，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组黄病毒施用于个体。通常采用与常规(目前可得的)疫苗相同的施用途径和/或模拟相关的病原体发生感染的路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式给予其中除有复制流行性重组病毒以外，还可包括生理学方面可接受的载体。这种组合物还可包括免疫发因子或佐剂、矫味剂或稳定剂。
给药的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、肿瘤内、皮下、皮内、经阴道、肺内、静脉内、经直肠、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组黄病毒疫苗，即重组黄病毒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效地促使保护宿主抵抗病原性生物感染或与病原性生物感染相关的症状。在有些实施例中，“有效量”的重组黄病毒疫苗是指重组黄病毒的量在给药的路径中能足以引发免疫应答，以有效地降低或抑制肿瘤细胞的生长、减少肿瘤细胞的质量或肿瘤细胞的数量，或降低肿瘤形成的可能性。
在各疫苗剂份中所选用的重组黄病毒的量，是按可引发免疫保护性或其它免疫治疗性应答而无明显的通常与常用的疫苗相关的副作用的量而定。该用量的变动是根据：所用的特定免疫原；疫苗制剂中是否包括佐剂；和各种宿主一依赖性因素。通常期望的是在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1-1000μg蛋白质，通常为1-200μg，一般为10-100μg。以重组黄病毒核酸为基础的疫苗的有效剂量，通常包括给予约1-1000μg核酸。另外，重组黄病毒疫苗的有效剂量的一般范围为约102-107，103-106或104-105空斑形成单位(PFU)。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
本发明的重组黄病毒还可用在宿主细胞(如哺乳动物，尤其是人)或其它类型细胞中形成可产生外源多肽的系统。然后可来用各种标准方法分离该外源蛋白质。
在两种用途(即免疫接种或组织培养生产)中，引入到黄病毒中的外源核酸序列可以从其天然形成的来源获得，或是用基因工程方法生产，或是用化学法或酶促法进行合成。引入到病毒中的外源核酸序列可以编码免疫应答所需的完整抗原或抗原性表位或其部分，如约4-1000、10-500、15-250、20-100、25-50个氨基酸的免疫原性片段。期望插入的序列存在于宿主的免疫系统(抗原性结构由主序列和结构形态两者来确定)中。
包含本发明的重组黄病毒的各种组合物
本发明还提供了包含本发明的重组黄病毒的各种组合物(包括药用组合物)。
包含本发明的重组黄病毒的各种组合物可以包含按重组黄病毒的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington：药学和药学实践”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可将药用组合物制备成各种剂型，如粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂、和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，本发明的重组黄病毒可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体配制本发明的疫苗。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是药学上可接受的载体，也是本领域技术人员所熟知的)。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂(Nickals(1992)Res.Immunol.143：489-493)；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；MontanideISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)；和硝化纤维(Nilsson和Larsson(1992)Res.Immunol.143：553-557)。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分，包括(但不限制于)：各种细胞因子如白细胞介素；各种集落-刺激因子(如GM-CSF，CSF等)；和肿瘤坏死因子。
本发明的重组黄病毒的使用方法
本发明提供了可引发对抗原的免疫应答的各种方法，该方法包括对哺乳动物对象施用本发明的重组黄病毒，其中黄病毒进入细胞，由蛋白水解切割释放外源多肽，并对此外源多肽引发免疫应答。
在一些实施例中，如本文所述将在特定肿瘤细胞(如肿瘤相关性抗原，“TAA”)上表达的多肽抗原插入到本发明的重组黄病毒中。这种重组黄病毒就适用于患有或怀疑患有肿瘤的个体。有时，可将这种重组黄病毒给予未患肿瘤但希望获得保护性免疫力个体。免疫系统往往不会提高有效抑制或压制肿瘤生长或完全消除肿瘤的免疫应答。肿瘤相关性抗原的免疫原性通常很弱，也许是由于有活动性和进行中的免疫抑制过程在起作用。另外，癌症患者都具有被免疫抑制的倾向，且仅对某些T-依赖性抗原有应答。在这种情况下，在宿主中引入本发明的重组黄病毒(可表达与肿瘤细胞表面上表达的抗原相应的外源肽)，可以在宿主中引发对肿瘤的免疫抑制作用。如一些实施例所示，在小鼠中引入含有可编码序列SIINFEKL(“Ova”)(SEQ ID NO：1)的插入片段的重组YFV，当与I类MHC分子一起在细胞表面上存在时，可特异性地由CD8+细胞毒性T细胞(CTL)识别。随后当用在其表面上表达Ova的肿瘤攻击小鼠时，就可产生对肿瘤的强CTL应答。
可将任何已知的肿瘤相关性抗原(TAA)插入到本发明的黄病毒中。可以(但并非必须)插入完整的TAA。也可插入一部分TAA(如用其表位)，尤其是可由CTL识别的表位。可插入到黄病毒的肿瘤相关性抗原(或其含有表位的片段)包括：(但不限制于)MAGE-2、MAGE-3、MUC-1、MUC-2、HER-2、大分子量的黑色素瘤-相关性抗原MAA、GD2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢相关性抗原OV-TL3和MOV18、TUAN、甲胎蛋白(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、肾肿瘤相关性抗原G250、EGP-40(也称为EpCAM)、S100(恶性黑色素瘤相关性抗原)、p53、前列腺肿瘤相关性抗原(如PSA和PSMA)和p21ras。
如上所述，可将包含TAA的重组黄病毒给予个体。是否针对特定的肿瘤引发的免疫应答可由本领域的各种标准方法来确定，这些方法包括(但不限制于)：测定从个体取得的生物样品中TAA-特异性抗体情况存在和/或其含量，如通过酶联免疫吸附试验法(ELISA)、放射免疫试验法(RIA)等；测定CTL特异性在TAA是否存在和/或其含量；等。关于测定是否存在CTL特异性TAA和/或其含量的实施例可见本文以下的实施例部分。可以使用可从各种课本中检索的标准免疫学方案，其中包括如“免疫学现代记录”(J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编辑，1991)。
在其它一些实施例中，外源多肽是微生物病原体的抗原性多肽。然后可将这种重组黄病毒施予宿主，以预防或治疗由该病原体引起的感染，或者预防或治疗由这种病原性感染引起的症状。特别值得关注的是，预防或治疗在感染过程中由细胞内存在的微生物病原体(例如，病毒(如HIV)、细菌(如志贺氏菌、利斯特氏菌等)、寄生虫(如疟原虫(如恶性疟疾(Falciparum)、锥虫等)等导致的感染或疾病的预防和治疗。这些微生物病原体的抗原性多肽是本领域已熟知的，且易于由普通技术人员选择用于本发明的重组黄病毒疫苗。
另外，本发明的重组黄病毒可用作发送载体，将任何抗原送递给个体，以引发对该抗原的免疫应答。在一些实施例中，本发明的重组黄病毒可用作双价或多价疫苗，来治疗由感染性病原体(尤其是病毒、细菌和寄生虫)引起的人或动物的疾病。在本发明的一种多价黄病毒疫苗中可向宿主送递的表位的例子包括：B类链球菌的各种血清型的多种表位；流感病毒的多种表位；轮状病毒的多种表位，和已知天然以多形式或血清型存在的其它病原性微生物；两种或多种不同病原性微生物的表位等。
用已知的各种方法可以(定量地，如通过测定参数；或定性地，如通过评估症状的严重程度，或通过检测定特定参数的存在与否)确定是否引发了对病原性微生物的免疫应答。测定免疫应答的方法是本领域熟知的，包括：酶联免疫吸附试验法(ELISA)，检测和/或测定特定病原性生物的特异性抗体；在活体外测定细胞免疫应答(如，用细胞表面上表达表位的标记的、失活的细胞与I类MHC分子进行的CTL)试验。本领域技术人员可使用各种标准测定方法，如测定宿主中病原性生物的数量(如测定病毒量等)、测定宿主中存在的病原性生物所引起的症状(如体温、CD4+T细胞计数等)，轻易地确定免疫应答是否能有效地促进保护宿主抵抗由病原性生物引起的感染或与感染相关的症状。
免疫应答是否能有效减少个体中肿瘤细胞的数量，可由各种标准测定法来确定，包括(但不限制于)测定个体中肿瘤细胞的质量、测定个体中肿瘤细胞的数量，和测定肿瘤细胞的转移。在以下的实施例部分描述了这些测定法。
用本文在主题发明方面所述的各种方法和组合物，可在易受微生物病原体感染的任何对象，人或其他动物中引发对微生物感染的免疫防护性应答。当重组黄病毒含有可编码TAA的外源核酸序列时，对象可以是已知患有癌症的、怀疑患有癌症的，或未患癌症但可引发对癌症免疫的对象。
实施例
现列述以下一些实施例为本领域普通技术人员提供完全公开描述如何制备和使用本发明，但并不限制发明人对其发明所认定的范围，他们也并无意于认为以下的试验是所有或仅有的已完成的试验。已尽量确保所用数据(如数量、温度等)的精确性，但也考虑到了一些试验错误和偏差。除非特别指出，部份是以重量表示，分子量是指平均分子质量，温度为摄氏度，压力为或接近大气压。
实施例1：制备重组黄热病病毒
材料和方法
质粒和PCR片段：由Dr.Charles Rice提供可编码完整YFV-17D序列的质粒pYF5’3’和pYFM5.2。用在活体外连接的方法用这些质粒产生全长的病毒RNA(20)。简单地说，我们插入一个PCR产生的DNA片段，可编码侧接BssHII和BstEII或ClaI和NdeI限制酶位点的小鸡卵清蛋白的13氨基酸肽，然后再侧接病毒性肽酶(NS2B-NS3复合物)识别位点。我们将该片段插入如下的病毒的各cDNA位点：病毒多肽的N末端，或蛋白质C-prM、NS2A-NS2B、NS2B-NS3、NS3-NS4A和NS4A-NS4B之间。为了在基因组的结构区域插入各外源序列，将包含各该外源序列的PCR片段在不同位置克隆入质粒p5’3’。为了在基因组的非结构部分产生各重组体，产生了相应于pyFM5.2的各YFV序列且含有相关的各插入序列的各种8kb PCR片段。用这些PCR片段作为以下所述的在活体外连接反应中的质粒pYFM5.2的各替代物。
从质粒产生病毒：用与Rice及其合作者最初发表的方法相类似的方法，生产YFV-17D分子克隆体(20)。简单地说，用限制酶Aat II和Apa I消化各5μg质粒(或用PCR产生的相应的各种序列)。消化处理后，用低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化含有病毒基因组的5’和3’端的质粒和相应于中间区域的YFM5.2的片段，并在16℃用分级的等摩尔浓度处理4小时进行连接。在60℃培养20分钟使连接酶失活。用Xho I消化处理连接的DNA，在m7GpppAmp(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)存在时，用作SP 6 RNA聚合酶(Promega，Madison，WI)的活体外转录的模板。无需进一步纯化处理，就可通过电穿孔(BTX电动细胞操作器600，San Diego，CA)将合成的RNA转染入BHK-21细胞。
病毒原液：在转染后观察细胞病变效应(CPE)3-5天。从BHK-21细胞产生的各空斑分别克隆出病毒。病毒原液的制备，将克隆的病毒在SW13细胞中繁殖；澄清受感染细胞的上清液，等分样品、滴定并存储于-70℃。
单步生长曲线：用PBS冲洗接近融合状态的SW13细胞单层1次，以5pfu/细胞的感染量重复感染。在37℃培养2小时后，用PBS冲洗细胞2次，然后用补充有10％FCS的L-15培养基覆盖。在37℃培养这些感染的细胞培养物若干天，每6小时回收100μl份，共6天或直到充分发生CPE。用空斑试验法确定滴定度。
用RT-PCR法分析病毒RNA：在SW13细胞上数次传代繁殖重组病毒后，按(21)的方法从感染的细胞获得全部胞质RNA。使用随机的各种六聚物和特异性引物(ATCGCGGACCGAGTGGTTTTGTGTTTGTCATCCAAAGGTCTGCT TATTCTTGAGC(SEQ IDNO：2))并按照制造商的推荐流程，用Superscript(Dibco-BRL)进行逆向转录。在42℃培养1小时后，将2μl各反应产物用作PCR反应的模板，其中使用RtTH(Perkin-Elmer)和侧接于待研究的序列(CAATGAGGCACTCGCAGCAGCTGG(SEQID NO：3)和TGCCCTAGCTCTGT GCGCTGCCCYF-pOva-8(SEQ ID NO：4))的特异性引物。用限制酶消化处理和/或DNA测序来分析扩增的PCR产物。
结果
表达小鸡卵清蛋白T-细胞表位的YFV17D重组体的制备：将各外源序列(侧接蛋白酶识别位点)插入到YF多蛋白前体中不同位置上的结构内。病毒蛋白酶就可据以识别和切割侧接的各蛋白水解位点，从剩余的YF多蛋白游离出各外源抗原性序列，以正确地产生所有YF蛋白质，使病毒复制正常进行(图1)。在病毒基因组的一些位点上，我们引入了可编码小鸡卵清蛋白CTL表位的各序列，随后引入了病毒蛋白酶NS2B/NS3的8个氨基酸切割位点(图1)。插入的片段可编码限制小鼠I类MHC分子H-2Kb的氨基酸序列SIINFEKL(SEQ ID NO：1)表位(25)。
用在活体外合成的RNA转染BHK细胞而回收重组活黄热病病毒。在基因组的3个位点插入各外源序列可得到活的重组病毒：其氨基末端C-prM和NS2B-NS3相衔接(将得到的病毒分别命名为YF-pOva-1、YF-pOva-2和YF-pOva-8)。从各空斑分离出病毒，并在SW13细胞中连续传代繁殖2次以制备病毒原液。
在另一系列试验中，用如上所述各种方法，引入若干不同的抗原。用于制备重组黄病毒的那些序列都是从流感病毒衍生的序列(如流感病毒核蛋白的片段，如来自毒株N1H1的NP147-155)；呼吸道合胞体病毒(RSV，A毒株)的G蛋白质(144-159)；以及人和小鼠的黑色素瘤的肿瘤相关性抗原(如TRP)。
各项空斑试验和单步生长曲线显示重组体YF-pOva-1、YF-pOva-2和YF-pOva-8以及所有携带其它外源抗原(如流感、RSV或黑色素瘤抗原)的病毒重组体，以与亲代17D毒株十分类似的速度复制(图2)。重组体YF-pOva-8和所有经测试的在基因组位点带有插入序列的其他重组体都以与17D相同的动力学复制，并达到相同的滴定度。重组体YF-pOva-1和YF-pOva-2的复制比亲代17D慢，显示出复制过程滞后，且在感染后3天滴定度仅为17D的10-20％(图2)。从YF-pOva-8较好的复制特性来看，此重组体可用于所有以后的研究，以对黄热病载体的免疫原性进一步鉴定。
已报道了一些正链病毒载体的遗传稳定性问题(26，27)。因此，用我们诊断限制酶消化的RT-PCR法和扩增片段的编序法验证了存在的插入片段。在BHK-21细胞传代6次后依旧保留着YF-pOva-8的原初遗传结构。因此，可以在黄热病病毒基因组的NS2B和NS3编码序列中引入各种外源肽，而不会过于危及病毒的复制。
实施例2：用YF-pOva-8感染的细胞以I类MHC限制的形式表现Ova-肽SIINFEKL
材料和方法
细胞系：除已描述过的BHK-21和SW13细胞以外，将以下各细胞系用于抗原表现试验或肿瘤排斥攻击处理：B3Z(T-细胞杂交瘤)、EL-4(胸腺瘤)和EL4-SL8细胞。承Nilabh Shastri，University of California，Berkeley惠予提供B3Z细胞和EL4-SL8。EL4-SL8细胞可稳定表达并呈现Ova CTL表位(SIINFEKL(SEQ ID NO：1))。B3Z是对Kb+SIINFEKL(SEQ ID NO：1)特异性的小鼠T细胞杂交瘤，是在IL-2增强子元件的转录控制下已有LacZ报道基因转染。因此，易由β-半乳糖苷酶的表达检测B3Z细胞的活化(22)。C57BL/6衍生的黑色素瘤B16FO和B16-OVA是由Kenneth Rock，University of Massachusetts的惠赠。B16-Ova(Mo5.20.10)是稳定表达由质粒pAc-neo-Ova转染B16FO而构建的卵清蛋白的细胞系。
抗原传递试验：以10pfu/细胞，在MOI用YF-17D和重组病毒模拟感染或感染EL4细胞。在37℃培养48小时后，将感染的细胞或相同数量的B16-Ova对照细胞与5×104个B3Z细胞在37℃共培养16小时。为了确定β-半乳糖苷酶的表达，用PBS冲洗培养物，然后用1％甲醛/0.2％戊二醛在4℃固定5分钟。再次冲洗这些细胞，用由1mg/ml X-Gal、5mM亚铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾和2mM MgCl2构成的PBS溶液培养。然后在37℃培养过夜，在显微镜下检测β-半乳糖苷酶活性的存在(蓝色细胞)。
结果
用YF-pOva-8感染的细胞以I类MHC限制方式表现Ova-肽SIINFEKL：为了确定用重组黄热病病毒感染的细胞是否能以I类MHC限制方式表达和传递表现各种抗原，我们用YF-pOva-8感染EL4细胞，并将感染的细胞与(识别在I类KbMHC分子中存在的SIINFEKL的T细胞一起共培养。抗原最初在受感染细胞的胞质中表达，但它会通过I类MHC途径转运到细胞表面并在其上表现。我们使用携带受白细胞介素-2增强剂元件NF-AT转录控制的lacZ报道基因的T-细胞杂交瘤B3Z(22)。因此，通过β-半乳糖苷酶活性的产生就可测定B3Z细胞的TCR-特异性激发作用。
在共培养12-16小时后，被YF-pOva-8感染的EL4细胞就可活化10％杂交瘤T细胞。相反，与未感染的EL4细胞共培养的杂交瘤B3Z或单独培养的杂交瘤B3Z则没有产生β-半乳糖苷酶活性。与稳定表达卵清蛋白的细胞系共培养可强烈引发β-半乳糖苷酶的产生。这些结果表明，以I类MHC限制方式加工并表现的黄热病病毒重组体可表达各种多肽。另外，用抗病毒蛋白质的Western印迹法表明，所有黄热病病毒蛋白质在YF-pOva-8感染的细胞中都可正确产生和加工的情况，提示从病毒多蛋白上已适当地切除了外源抗原。
实施例3：用重组YF-pOva-8诱导Ova-特异性CD8+T细胞
材料和方法
CD8+T细胞应答：免疫处理。以107pfu/小鼠的剂量，用YFV 17D或重组病毒YF-pOva-8模拟感染或免疫接种(静脉内)若干3只一组的C57BL/6小鼠。在感染后第21天，用相同的剂量腹腔内给所有组加接种。7天后，处死所有小鼠，取出它们的脾，并制成单细胞悬浮液。
激发作用和四聚体结合试验：将3×106个脾细胞与经6000拉得(rads)处理的105个表达SIINFEKL的FL4细胞共培养4天，进行再次激发。I类SIINFEKL-MHC四聚体承蒙John Altman博士(Emory University，Atlanta，GA)惠赠。在第4天，按Atman等人(23)提供的方法染色，并进行流式细胞仪分析。
免疫接种和肿瘤攻击：从Jackson实验室购得C57BL/6小鼠(H-2b)，并在6-8周龄使用。用3×105pfu/小鼠剂量的YF 17D或YF-pOva-8(表达Ova的17D重组病毒)腹腔内(i.p.)、皮下(s.c.)、肌内(i.m.)或静脉内(i.v.)免疫接种小鼠，每组5-10只小鼠。2周后用相同的剂量给所有各组加强接种。将未免疫接种的小鼠作为空白对照。在无Ca++、Mg++的PBS中培养5分钟，回收黑色素瘤细胞，通过台盼蓝排除法计数活细胞，并在感染30天后，s.c.注射5×104B16-OVA或B16F0黑色素瘤细胞攻击所有小鼠。每周2次测定肿瘤的尺寸，并以相应于最大垂直直径的肿瘤面积表示(cm2)。将肿瘤发育大于2.0cm2的动物处死。
实体瘤的免疫治疗：用5×104B16-OVA细胞s.c.注射小鼠。在肿瘤移植后第0、5或10天开始治疗，包括3次s.c.注射4×105pfu YF-pOVA-8或17D(间隔为5天)。而对照组不进行治疗。每3天观察小鼠肿瘤的发展，将大于0.3cm2的肿瘤计为阳性。
试验性肺部转移的免疫治疗：用5×104或1×105B16-OVA细胞i.v.注射小鼠。如对实体瘤所述进行免疫治疗。在第30天，处死各组10只小鼠，然后取出肺，置于3％H2O2的H2O中5分钟，然后在Bouin溶液(Sigmadiagnostics，St.Louis，MO，USA)中固定。H2O2处理通过膨胀肺和漂白溢血而有利于在解剖显微镜下对癌转移的分析，否则会错误判断成癌转移。
结果
为了确定重组黄热病病毒是否能引发特异性CD8+T-淋巴细胞，用YF-pOva-8、亲代YF-17D或PBS(空白)接种小鼠。用从免疫接种的小鼠取出的脾细胞监测结合MHC I类SIINFEKL四聚物体的CD8+T-淋巴细胞群(图3A-3C)。空白组小鼠或用YF-17D免疫接种的小鼠的脾细胞都不能产生SIINFEKL特异性T细胞。经用YF-pOva-8免疫的小鼠的新鲜分离的脾细胞和在活体外激发的脾细胞制定四聚物结合情况。新鲜分离的淋巴细胞显示在一次接种(0.5％CD8+T细胞)后四聚物结合最少。然而，经在活体外激发后，从YF-pOva-8免疫接种的小鼠得到CD8+T细胞有明显的百分比(8.75％)对SIINFEKL具有特异性。
活体内的保护性免疫：为了评估载体是否引发保护性CTL免疫力，我们使用了已确立的肿瘤模型，在其中CTL对于保护宿主免受致命剂量的恶性黑色素瘤细胞的攻击起着关键性作用(1)。用YF-pOva-8或YF-17D免疫接种小鼠2次，30天后用黑色素瘤衍生的C57BL/6中的一种进行攻击：亲代B16-F0肿瘤细胞系或稳定表达小鸡卵清蛋白的B16-Ova。用B16-Ova细胞或亲代B16-F0黑色素瘤细胞皮下接种的空白组小鼠以类似的动力学生长了肿瘤，并在数周内杀死空白组动物(图4A-4D和5A-5D，仅显示了B16-Ova的数据)。用YF-pOva-8免疫接种，保护动物抵抗B16-Ova的攻击(其剂量为LD50的10倍)。免疫接种保护的小鼠不会局部生长肿瘤(图4A-4D)也不会死亡(图5A-D)。
我们用四种不同的路径-皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、腹腔内(i.p.)和静脉内(i.v.)施用重组YF-pOva-8，以比较它们的保护性免疫应答的效力。皮下和静脉内接种可引发强力的应答。所有用YF-pOva-8免疫接种的动物都受到了保护，而对照小鼠则100％死亡。腹腔内和肌内接种的效力略低，在这些组中10-20％小鼠生长了肿瘤而死亡。疫苗的效力对SIINFEKL是特异性的，因为用YF-pOva-8免疫接种的小鼠对于亲代其不表达Ova的B16黑色素瘤细胞的攻击未能保护。然而，我们观察到当腹腔内、皮下或肌内施用病毒时，用YF-17D免疫接种的小鼠的肿瘤生长有略微的滞后，虽然不很明显。这种效力可能是由于由黄热病病毒复制引发的细胞因子产生的增加或其它免疫应答所造成的。这与文献并非不一致，因为过去曾显示，IFN-γ和IFN-α在B16黑色素瘤细胞上有抗肿瘤和抗细胞活性(28-30)。
对已形成的肿瘤的有效免疫治疗：其次，我们确定了用YF重组体免疫接种是否能引发使已形成的肿瘤消退。用5×103或5×104B16-Ova肿瘤细胞皮下接种小鼠，然后在移植肿瘤的当天(第0天)、移植肿瘤后的第5天(第5天)或移植肿瘤后第10天(第10天)，用YF-pOva-8感染。接种数量较少的B16-Ova肿瘤细胞(5×103)的小鼠，即使肿瘤是在移植肿瘤后第10天开始治疗，瘤约为未接受疫苗的小鼠约有60％生成的肿而经免疫接种后则完全受到保护(图6A-6F)。用较高剂量肿瘤细胞(5×104)接种的动物，在第0天用YF-pOva-8免疫接种的动物有80％在移植肿瘤后的45天依旧未生肿瘤，而注射亲代YF-17D或盐水的动物则长出肿瘤并在3-4周内死亡(图6A-6F)。与盐水相比，用YF-17D免疫接种略可延缓肿瘤的生长，但其效果极小，且90％动物在移植肿瘤后30天长出肿瘤。在移植肿瘤后5天用重组YF-pOva-8免疫接种，起到部分保护作用(60％小鼠保持未患肿瘤)。在第10天免疫接种对肿瘤的生长仅有极小或没有作用。这些结果表明，用黄热病病毒重组体施行免疫接种，可以实现对已形成的肿瘤的治疗。
肺部转移的有效免疫治疗：当注射入同系小鼠的尾静脉时，B16黑色素瘤细胞可再生地转移到肺(31)。这就提供了一种模型来评估黄热病病毒重组体是否能引发有效的抗癌转移的应答。用5×104或1×105B16-Ova细胞静脉内接种小鼠，在动物移植肿瘤后第0、5或10天，皮下免疫接种YF-pOva-8或对照病毒。用载体治疗可防止死亡(图9A-9B)，且基本减少肺部转移的大小和数量(图7和8)。在用5×104细胞移植肿瘤后10周，在第0天免疫接种的动物100％健康(图9A-9B)。而当免疫接种是在第5天进行时，保护率下降至80％，若在第10天免疫接种则对动物的保护效果进一步降至20％。用YF-17D接种则毫无保护效果，且转移以与用盐水接种动物相同的动力学而发展(图7和8)。当用1×105肿瘤细胞接种小鼠时，在第0天接受治疗的小鼠仅有40％受到保护。这些结果更强调了，在低肿瘤负荷量时开始免疫治疗的重要性。尽管如此，这些结果还是显示，表达单种抗原性表位的重组黄热病病毒能在小鼠中引发治疗性抗肿瘤应答。
虽然本发明已参考上述各具体实例进行了描述，但本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的实质精神和范围时，还存在着各种改变和相当的问题。另外，根据具体的情况、材料、组合物、加工、加工步骤、本发明的精神和范围等还要作出有许多改进。所有这类改进都应当受限于本文附带的权利要求书。
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                       序列表<110>R.安迪诺-帕夫卢诺夫斯基(Andino-Pavlovsky，Raul)
 A.麦考利斯特-莫雷诺(Mcallister-Moreno，Andres)<120>重组黄病毒及其使用方法<130>UCSF-185WO<140>09/653,754<141>2000-09-01<150>60/177,449<151>2000-01-21<160>4<170>FastSEQ Windows版4.0<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>外源肽<400>1Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu1               5<210>2<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>2atcgcggacc gagtggtttt gtgtttgtca tccaaaggte tgcttattct tgagc<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>3caatgaggca ctcgcagcag ctgg                                             24<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>4tgccctagct ctgtgcgctg ccc                                              23

Claims (28)

1.一种包含插入到亲代黄病毒中的外源核酸的具有复制能力的重组黄病毒，所述的外源核酸含有编码外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的重组黄病毒编码重组多蛋白前体，该重组多蛋白前体包括所述的外源多肽，且通过蛋白酶解加工从该重组多蛋白前体释放出该外源多肽。
2.如权利要求1所述的重组黄病毒，其特征在于，所述的外源多肽是与肿瘤相关性抗原。
3.如权利要求1所述的重组黄病毒，其特征在于，所述的外源多肽是由细胞毒性T淋巴细胞识别的表位。
4.如权利要求1所述的重组黄病毒，其特征在于，所述的外源多肽是细菌性、病毒性、真菌性或寄生虫性抗原。
5.如权利要求1所述的重组黄病毒，其特征在于，所述的亲代黄病毒是黄热病病毒。
6.一种含有插入到亲代黄病毒的外源核酸的重组黄病毒，且所述的外源核酸含有编码外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的外源核酸与编码蛋白酶解切割位点的核苷酸序列侧接。
7.一种在哺乳动物宿主中引发针对抗原的免疫应答的方法，其特征在于，所述的方法包括给予宿主含有插入到亲代黄病毒的外源核酸的重组黄病毒，所述的外源核酸包含编码外源多肽的核苷酸序列，所述的重组黄病毒编码重组多蛋白前体，所述的重组多蛋白前体包含所述的外源多肽，且通过蛋白酶解加工从所述的重组多蛋白前体释放出该外源多肽。
8.一种在哺乳动物宿主中引发针对抗原的免疫应答的方法，其特征在于，所述的方法包括给予宿主含有插入到亲代黄病毒的外源核酸的重组黄病毒，所述的外源核酸包含编码外源多肽的核苷酸序列，所述的外源核酸与编码蛋白酶解切割位点的核苷酸序列侧接。
9.一种减少宿主中肿瘤细胞数量的方法，其特征在于，所述的方法包括给予宿主含有插入到亲代黄病毒的外源核酸的重组黄病毒，所述的外源核酸包含编码肿瘤相关性抗原的核苷酸序列，所述的重组黄病毒编码重组多蛋白前体，所述的重组多蛋白前体包含所述的肿瘤相关性抗原，且通过蛋白酶解加工从所述的重组多蛋白前体释放出该肿瘤相关性抗原。
10.一种减少宿主中肿瘤细胞数量的方法，其特征在于，所述的方法包括给予宿主含有插入到亲代黄病毒的外源核酸的重组黄病毒，所述的外源核酸包含编码肿瘤相关性抗原的核苷酸序列，所述的外源核酸与编码蛋白酶解切割位点的核苷酸序列侧接。
11.含有权利要求1或6所述的重组黄病毒的组合物。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上的赋形剂。
13.一种含有插入到亲代黄热病病毒(YFV)中的外源核酸的具有复制能力的重组黄热病病毒，所述的外源核酸包含编码外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的重组YFV编码重组多蛋白前体，所述的重组多蛋白前体包含所述的外源多肽且耐蛋白酶解加工从该重组多蛋白前体释放出该外源多肽。
14.一种含有插入到亲代黄热病病毒(YFV)中的外源核酸的具有复制能力的重组黄热病病毒，所述的外源核酸包含编码外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的重组YFV编码重组多蛋白前体，所述的重组多蛋白前体包含所述的外源多肽，且通过蛋白酶解加工从该重组多蛋白前体释放出该外源多肽，当用所述的重组YFV感染宿主时，宿主细胞表达该外源多肽并在宿主体内引发对该外源多肽的免疫应答。
15.一种含有插入到亲代黄热病病毒(YFV)中的外源核酸的具有复制能力的重组黄热病病毒，所述的外源核酸包含编码外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的外源核酸侧接于编码蛋白酶解位点的核苷酸序列，从而在蛋白酶解加工后释放出该外源多肽，所述的重组YFV编码重组多蛋白前体，所述的重组多蛋白前体包含所述的外源多肽，且通过蛋白酶解加工从该重组多蛋白前体释放出该外源多肽。
16.如权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒，其特征在于，所述的外源多肽是肿瘤相关性抗原。
17.如权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒，其特征在于，所述的外源多肽是除黄热病病毒以外的病毒的多肽。
18.如权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒，其特征在于，所述的外源多肽是除黄热病病毒以外的微生物病原体的多肽。
19.如权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒，其特征在于，所述的病毒是活的减毒病毒。
20.如权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒，其特征在于，感染后在宿主细胞的表面上表达所述的外源多肽。
21.如权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒，其特征在于，在感染后从宿主细胞分泌出所述的外源多肽。
22.分离的用权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒感染的宿主细胞。
23.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求13-15任一所述的重热组黄病毒和缓冲液。
24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还含有药学上的赋形剂。
25.一种引发哺乳动物宿主对抗原性多肽产生免疫应答的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
将权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒给予哺乳动物宿主，其中所述的外源多肽是抗原性多肽，所述的给予使宿主细胞被感染和抗原性多肽被表达；
所述的外源多肽的表达在宿主中引发了对抗原性多肽的免疫应答。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述的抗原性多肽是肿瘤相关性抗原的多肽。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述的抗原性多肽是微生物病原体的多肽。
28.一种减少宿主中肿瘤细胞数量的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
将权利要求13-15任一所述的重组黄热病病毒给予患肿瘤的宿主，其中所述的外源多肽是在宿主的肿瘤细胞上发现的肿瘤相关性抗原的多肽；
所述的肿瘤相关性抗原的表达在宿主引发有效减少宿主中肿瘤细胞数量的针对肿瘤细胞的免疫应答。
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