CN1610748A

CN1610748A - 能够表达结构hcv抗原的重组mva

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Publication number: CN1610748A
Application number: CNA028222156A
Authority: CN
Inventors: 格尔德·祖特尔; 福尔克尔·艾尔弗勒; 卡罗琳·施泰布; 王圆; 李光弟; 朱立新
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2022-09-05
Also published as: US20130089569A1; WO2003023042A1; JP4056472B2; RU2004106592A; DE10143490C2; WO2003023042A9; EP1423525B1; DE10143490A1; US20090238843A1; RU2270860C2; DE50212580D1; CN100375786C; JP2005502362A; EP1423525A1; US20050019347A1; ATE403007T1; HK1074643A1; US20110293656A1; DK1423525T3

Abstract

本发明涉及重组MVA，它能够表达结构HCV抗原、所述结构抗原的功能性部分或所述结构抗原的表位。此外，本发明尤其描述了一种以疫苗形式存在的药物组合物，和本发明的重组MVA，包含本发明重组MVA的真核细胞，以及该重组MVA的不同应用，如，用于制备重组结构蛋白、用于制备药物组合物，该药物组合物特别适用于治疗和预防HIV感染以及由HIV引起的疾病。本发明进一步涉及制备重组MVA的方法，以及制备由所述的重组MVA和重组MVA的DNA或RNA编码的重组结构HCV多肽的方法。

Description

能够表达结构HCV抗原的重组MVA

技术领域

本发明涉及重组MVA，它能够表达结构HCV抗原、所述结构抗原的功能性部分或所述结构抗原的表位。此外，本发明尤其描述了一种以疫苗形式存在的药物组合物，和本发明的重组MVA，包含本发明重组MVA的真核细胞，以及该重组MVA的不同应用，如，用于制备重组结构蛋白、用于制备药物组合物，该药物组合物特别适用于治疗和预防HIV感染以及由HIV引起的疾病；以及制备本发明的重组MVA、由所述的重组MVA和重组MVA的DNA或RNA编码的重组结构HCV多肽的方法。

技术背景

丙型肝炎病毒(HCV)其是一种属于Flaviviridaae家族的正链RNA病毒。它是人群中由于输血引发的非A-、非B-型肝炎的主要介质(8，35)。超过70％的感染病人可能发展为慢性肝炎，并进一步发展为肝硬化和肝细胞肿瘤(30，53)。目前的治疗方法很有限(39，40，31，24，13)。已经在疫苗的研发上进行了很多努力，并且取得了一些令人鼓舞的成绩(9，41，22，25)，但迄今为止还没得到有效的和/或治疗的疫苗。

结构HCV蛋白，例如病毒包衣蛋白核(viral capside protein nucleus)、以及外壳糖蛋白(envelope glycoprotein)E1和E2是有希望的疫苗靶位：在不同的HCV基因型和亚型中核心抗原高度保守(6)。在诸如Rabies病毒、乙型肝炎病毒和流感病毒等不同的模型中，核壳体(nucleocapsid)等内部抗原(internal antigen)都与保护免疫反应相关联。采用下述的不同方法可诱导并检测HCV核特异性的抗体和CTL反应(22，23)。相比之下，核心蛋白似乎具有许多调节功能，这些功能与宿主细胞的凋亡、转录、转化和免疫呈递等的调节相关(43，4)。采用重组E1和E2蛋白免疫黑猩猩能诱导对同源蛋白的免疫保护，推测这是通过诱导中和抗体来起作用的(9)。根据多篇报道，存在于E2的N-末端的高度可变区(HVR)可以是重要的中和位点(20，34，67，68)。

由于缺少合适的动物模型，从而使得针对HCV的宿主免疫反应以及对疫苗保护的评价等研究变得很复杂。由于缺少有效的体外细胞培养系统来进行HCV扩增，并且在感染的肝组织或血液中HCV颗粒的数量很少，因此阻碍了对传统的诸如减毒或灭活病毒疫苗的形成及评价。基于活载体病毒表达抗原编码序列的原理，在HCV疫苗的开发中采用载体疫苗是一种新的替代途径。

本发明的目的在于提供一种适于人和动物预防及治疗HCV感染的新的制剂，该制剂能够避免上述的缺点。

根据本发明，该目的是通过重组MVA来完成的，所述MVA通过修饰能够表达结构HCV抗原、结构HCV抗原的功能性部分和/或所述HCV结构抗原的表位，优选表面表位。

本发明的优选实施例可参考下述说明书以及所述的权利要求。

根据本发明，具有编码结构HCV抗原、结构HCV抗原功能性部分或所述结构HCV抗原表位的DNA序列的重组MVA非常适用于制备疫苗。尤其令人惊奇的是，HCV核心抗原的制备或共同制备(co-production)并不影响疫苗的免疫原性。准确地，出版物(19)显示，在受感染的或接种疫苗的宿主中，免疫反应通过一种特别的方式受到抑制，即，通过牛痘病毒的复制来抑制。因此，可以设想，当使用MVA作为制备结构HCV抗原的载体时，也会发生这种抑制。然而文中显示，令人预料不到的是，当使用MVA载体时，所述免疫抑制再次得到补偿。所报道的这一令人惊奇的实验结果为开发新疫苗提供了良好的基础，尤其是在将HCV抗原作为疫苗抗原提供了基础。

本发明所用的病毒载体是基于改良的安卡拉牛痘病毒(vaccinia virusAnkara，MVA)，该病毒是一种高度减毒(attenuated)的牛痘病毒株，已证实该病毒在临床应用是很安全的，这很可能是由于它的复制缺陷(42，45，60，50)。重组MVA(rMVA)用作疫苗已经证实能刺激T-细胞和针对不同异种抗原的抗体反应，并且在人类的多种感染性疾病(包括流感、AIDS、麻疹、以及疟疾)的动物模型实验中都具有保护作用(61，3，27，52，15，59，1)。

尽管实质上已经知道重组MVA在制备疫苗中的应用，但是疫苗与结构HCV抗原，也即HCV的核心抗原以及E1和E2的组合应用现今还少有应用。

实际上HCV的结构抗原是已知的。其包括外壳蛋白核心、包膜糖蛋白E1和包膜糖蛋白E2。

已知为制备疫苗不必完全表达HCV的结构抗原。实验人员也能够根据特定的实验步骤以及所需的结果而仅表达结构抗原的一部分，尤其是HCV结构抗原的功能性部分或者表位。例如，功能性部分包括结构HCV抗原的免疫原性部分。其实例包括C-末端核心蛋白区域(HCV多蛋白质的127-190位氨基酸)、HCV多蛋白质的220-371位氨基酸的E1蛋白区域、以及包含糖蛋白E2的N-末端的高度可变区的27个氨基酸(Rehermann &Chisari 2000，Curr Top.Microbiol.Immunol 242：299-325，Penin et al.2001，J Virol 75：5703-5710)。结构抗原的功能性部分包括例如HCV核心蛋白的124个N-末端氨基酸(Kunkel et al.J.Virol 75：2119-2129，2001)，它足以用于病毒样的核衣壳颗粒的装配；以及跨膜结构域TMD-E1的350-370位氨基酸或者TMD-E2的717-740位氨基酸，它对包膜蛋白E1和E2的异质二聚化(heterodimerisation)是非常必要的(Op de Beeck et al.2000，J.Biol.Chem.275：31428-31437)；或者糖蛋白的可分泌型，它能够穿过内质网。优选地，这是通过缺失或其它突变来改变E1或E2的跨膜结构域来完成的，从而使得蛋白质不再保留在膜上(Michalak et al.1997，J Gen Virol 78：2299-2306)。

结构HCV抗原的表位是已知的。这些表位包括诸如MHC-I限制性T-细胞核心氨基酸2-10，核心氨基酸35-44，核心氨基酸41-49，核心氨基酸85-98，核心氨基酸132-140，核心氨基酸167-176，核心氨基酸178-187，核心氨基酸181-190，E1氨基酸220-227，E1氨基酸233-242，E1氨基酸363-371，E2氨基酸401-411，E2氨基酸489-496，E2氨基酸521-628或者E2氨基酸725-733(Rehermann & Chisari 2000，Curr Top Microbiol Immunol242：299-325)。进一步的例子包括E1表位氨基酸312-326。结构HCV抗原的表位还可以利用已知的技术来确定，例如在Koziel et al 1995，J.ClinInvest 96：2311-2321中所述。

在本发明的一个优选实施方案中，重组MVA包括编码E1和E2的DNA序列。特别有利的是可以采用E1抗原与E2抗原的截短形式(truncated form)的组合，从而使得两种抗原能够共同制备。“截短”表示E2糖蛋白的亲脂性部分缺失。本实施方案已经表明，与表达E1抗原和全部E2蛋白的重组MVA疫苗接种相比，在接种重组MVA疫苗后的本发明实施例中，针对E1抗原的细胞免疫反应，即E1-特异性的细胞毒性T-细胞的诱导显著增加。可以理解，可能利用不止一个MVA载体而是至少两个载体来装配不同的HCV结构抗原、尤其是E1和E2。

根据本发明，突变意味着缺失碱基取代或碱基添加。也可能是化学修饰。

对结构HCV抗原在重组MVA中的排列使得编码序列与调解元件之间形成功能性连接，例如，形成启动子和增强子。可以采用本领域公知的合适的DNA克隆技术。本处引用了诸如：Sambrook，J.et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY；或者Ausubel，F.M.et al.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY.上述出版物在此引用作为示例。特别地，编码DNA序列进行排列和选择，从而使得在MVA-HCV载体病毒感染的细胞中可进行正确的多肽处理步骤。

外源DNA序列整合入MVA基因组时，优选是在对MVA的复制和感染能力不必要的区域进行。例如，作为整合位点，在MVA基因组中可能具有天然缺失。这些实质上不影响病毒生命周期的缺失包括缺失I、II、III、IV、V、和VI，优选缺失II和III(Meyer，H.，Sutter，G.und Mayr，A.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038)。由此制备的重组MVA是有感染性的，也就是它能够感染外源细胞从而表达整合进的外源DNA序列HCV。这种重组病毒适于用作及其安全的活疫苗，从而对HCV引起的疾病进行诊断或治疗。

本发明的重组MVA可通过下面的概括性阐述来进行制备。可在实施例中找出详细的描述。在诸如异源重组的过程中将HCV结构抗原插入至MVA的DNA中，其中在两端所引入的序列是与靠近天然发生的缺失序列进行重组的序列，所述的缺失为MVA基因组中的缺失II或III(Antoine etal.1998，Virology 244：365-396)。

将包含结构HCV抗原或其功能性部分或表位的DNA构建体引入到被MVA感染的细胞中，从而得到异源重组，其中的构建体是在缺失位点、即MVA基因组的缺失II或III附近的MVA-DNA序列作为两侧端(flank)。插入的DNA构建体可以是线性的或环状的。优选地，插入的是环状DNA分子，特别是质粒。

为了表达编码HCV结构抗原的DNA序列，需要有调节序列使DNA序列能够转录。这样的调节序列，例如启动子和增强子，是已知的。例如，其包括牛痘11 kDa基因(参见EP 0 198 328)和7.5 kDa基因(参见EP0 110 385)的启动子，或者合成牛痘病毒特异性启动子(参见Sutter et al.，Vaccine 1994，12：1032)。

可利用已知的方法将DNA构建体插入至MVA感染细胞中，例如可采用下述方法进行转染：磷酸钙沉淀法(Graham et al.，Virol.52，456-467，1973；Wigler et al.，Cell 777-785，1979)、电穿孔法(Neumann et al.，EMBO J.1，841-845，1982)、微注射法(Graessmann et al.，Meth.Enzymology 101，482-492，1983)、脂质体技术(Straubinger et al.，Methods in Enzymology 101，512-527，1983)、sphaeroblast技术(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77，2163-2167，1980)、或已知的其它方法。优选使用磷酸钙沉淀技术。

将DNA构建体插入至真核细胞后，将HCV-DNA和病毒DNA进行重组，然后利用公知的技术将重组MVA分离，优选利用标志基因的方法(参见Nakano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1593-1596，1982；Frankeet al.，Mol.Cell.Biol.1918-1924，1985，Chakrabarti et al.，Mol.Cell.Biol.3403-3409，1985，Fathi et al.，Virology 97-105，1986)。

按照本发明制备的MVA也可以带有标志基因。该标志基因使得利用已知技术分离重组病毒易于进行。所述标志基因是已知的，它们包括编码诸如下述蛋白的基因：β-牛乳糖(β-galactosidase)、新霉素(neomycine)、乙醇脱氢酶、荧光素酶、嘌呤霉素(puromycine)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、匀霉素(hygromycin)、分泌性碱性磷酸酶、或绿荧光蛋白和蓝荧光蛋白。

可以理解，也可以采用其它方法来制备本发明的重组病毒，例如下面实施例中详细描述的克隆方法。

病毒的生长和纯化

MVA病毒的生长

MVA病毒是Ankara牛痘病毒菌株(CVA)在原代鸡胚纤维原细胞(CEF)培养上进行长期传代得到的一种高度减毒的牛痘病毒株。为了对该制备进行概括，可参见Mayr et al.在Infection 3，6-14[1975]中对MVA菌株的特性和用途进行的介绍。由于在CEF中被减毒，MVA病毒在这种禽类宿主细胞中进行高滴度复制。然而，在哺乳动物细胞中，MVA病毒的生长被强烈抑制，未检测到典型的菌斑的生成。因此MVA病毒在CEF细胞上生长。为制备CEF细胞，从孵育的鸡蛋中分离11天大的胚胎，除去四肢，将胚胎匀浆，在0.25％胰蛋白酶的溶液中、置于37℃ 20分钟进行分离。过滤所得的细胞悬液，然后在Sorvall RC-3B离心机中于2000rpm室温下离心5分钟沉降细胞，用10倍体积的培养基A(MEM Eagle，从例如LifeTechnologies GmbH Eggenstein，德国购得)将细胞重悬后，再在SorvallRC-3B离心机中于2000rpm室温下离心沉降细胞，将细胞在包含10％胎牛血清(FCS)、青霉素(100units/ml)、链霉素(100units/ml)和2mM谷氨酸的培养基A中再次重悬，以形成包含500 000细胞/ml的细胞悬液。将如此得到的CEF细胞接种于细胞培养皿中，在C0₂温箱中、培养基A环境下于37℃培养1-2天，使得细胞能够根据所需的细胞密度来生长，将所得细胞直接应用或经过进一步的传代培养感染。原代细胞培养的制备详细描述参见R.I.Freshney，″Culture of animal cell″，Alan R.Liss Verlag，NewYork[1983]第11章，S.99 ff中所述。

如下述将MVA病毒用于感染：将CEF细胞在175cm²的细胞培养瓶中进行培养。当细胞长至90～100％汇合(confluence)时，移去培养基，将细胞在培养基A中与MVA病毒悬液(每细胞0.01感染单位(IU)，0.02ml/cm²)共培育1小时。然后加入更多的培养基A(0.2ml/cm²)，将培养瓶在37℃培养2-3天(直到约90％的细胞表现出细胞病变效果)。原始病毒菌株(raw virus strain)是通过下述方法制备的：将细胞单层刮入培养基中，在Sorvall RC-3B离心机中于3000rpm在4℃离心5分钟。在进一步的处理步骤(例如，病毒纯化)前，将原始病毒制备物储存于-20℃。

病毒纯化

进行纯化步骤以获得尽可能纯的病毒制备物，该病毒制备物不包含宿主细胞特异性的物质，如Joklik(Virology 18，9-18[1962])所述。将储存于-20℃的原始病毒菌株制备物解冻并用PBS重悬一次(10至20X沉降物体积)，然后将细胞悬液按照上述方法离心。所得的新的沉降物用10X的Tris缓冲液1(10mM Tris-HCl，pH 9.0)重悬，将所得悬液用超声短时处理(Labsonic，L.B.Braun Biotech International，Melsungen，德国；60 Watt 2×10秒，室温)以进一步裂解细胞碎片，从而使病毒颗粒从细胞物质中释放出来。将核和大的碎片利用下述的悬液离心除去(Sorvall GSA转头，购自DuPont Co.，D-6353 Bad Nauheim，德国，3000rpm、10℃离心3分钟)。然后，将沉降物再用Tris缓冲液1重悬一次，所得悬液按照上述用超声处理并离心。将收集到的不含病毒颗粒的上清液合并，在盛有10ml 36％蔗糖溶液(溶于pH9.0的10mM Tris HCl)的pad中进行分层，然后用Beckman SW 27/28-转头在4℃在13500rpm离心80分钟。弃去上清，将含有病毒颗粒的沉淀物置于10ml的1mM Tris HCl(pH 9.0)中，利用短时超声处理来匀浆(采用上述设备在室温下，2X 10秒)然后置于20～40％的蔗糖梯度(溶于pH9.0的10mMTris HCl)进一步纯化，用Beckman SW41转头将梯度液在4℃、13000rpm条件下离心50分钟。离心后，通过吸出包含病毒颗粒的条带来收集包含病毒颗粒的条带。将所得的蔗糖溶液用三倍体积的PBS稀释，再次通过离心(Beckman SW 27/28，4℃、13500rpm离心60分钟)来沉降病毒颗粒。现在将主要包含纯病毒颗粒的沉淀用PBS重悬，平衡至平均1～5×10⁹ IU/ml的病毒浓度。将纯化的病毒储存液储存于-80℃，直接应用或在下述实验中用PBS稀释。

修饰的Ankara牛痘病毒(MVA)是一种宿主范围受限的高度减毒的牛痘病毒菌株，它不能在所研究的人类和多数其它哺乳动物细胞中繁殖。然而，由于病毒基因的表达在上述不被许可的细胞中不受影响，因此重组MVA可用作非常安全和有效的表达载体和重组疫苗。

因此，在本发明的一个实施方案中，所构建的MVA病毒能够在牛痘病毒早期/晚期启动子P7.5的控制下表达结构HCV抗原。

表达结构HCV抗原的重组MVA病毒可以用于诸如肿瘤病人的免疫治疗。

此外，表达结构HCV抗原的重组MVA病毒也可以与诸如树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞等抗原呈递细胞组合应用，用于在免疫治疗中对人进行免疫。

另外，重组MVA病毒可与诸如树突状细胞等抗原呈递细胞在体外(exvivo)组合应用，以形成可用于人的免疫治疗的免疫效应因子。

重组MVA病毒还可进一步用于制备重组结构HCV蛋白。

可以转化本发明的MVA牛痘病毒来制备药学可接受形式的疫苗治疗剂。在此，人们能够从防治天花的MVA疫苗的制备中得到经验(如Stickl，H.，et al.[1974] Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392中所述)。通常将在100ml磷酸缓冲盐水(PBS)中的约10⁶～10⁸的重组MVA颗粒在2％蛋白胨和1％人白蛋白在安瓿中冷冻干燥，优选在玻璃安瓿中。冻干物可包含适用于肠胃外给药的扩展剂(extending agent，如甘露醇、右旋糖苷、糖、氨基乙酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其它辅剂(例如抗氧化剂、稳定剂等)。然后将玻璃安瓿封口，在优选低于-20℃的温度下储存几个月。

当用作接种疫苗或者治疗用时，将该冻干粉溶解于0.1～0.5ml的水溶液、优选生理盐水溶液中，然后通过下述方式给药：肠胃外给药，例如肌肉内接种；或者局部给药，如皮内接种，或肿瘤内/肿瘤所在位置内接种。本发明由于治疗的疫苗优选通过肌肉内的方式注射(Mayr，A.et al.[1978]Zbl.Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.B 167，375-390)。给药途径、剂量和给药次数可由本领域技术人员通过已知的方式进行优选。该疫苗适于长时间给药以获得针对外源抗原的适宜的免疫反应。

本发明还包含被重组MVA病毒感染的真核细胞，其包括诸如鸡胚纤维原细胞、幼仓鼠肾细胞，优选BHK-21细胞、或者诸如树突状细胞、巨噬细胞以及B淋巴细胞等抗原呈递细胞。

如上所述的重组MVA病毒被用于疫苗的制备，尤其被用于HCV感染或由此引起的疾病，尤其是慢性肝病和肝肿瘤的诊断和治疗。自然，利用重组病毒也可以制备重组HCV结构蛋白，并随后可分离并纯化为纯品形式。根据本发明，重组HCV蛋白意味着结构HCV抗原，其还包括结构HCV抗原的功能性部分或表位，尤其是结构HCV抗原的表面表位。

本发明还包括重组MVA的DNA或者RNA。

下面将结合实施例对本发明进行详细描述。然而，本发明并不限于所述的特定实施例，可结合说明书的范围并结合权利要求对本发明进行修饰。

下述附图也是为了进一步理解本发明、尤其是下述实施例。附图如下：

图1

包含HCV结构蛋白基因序列的重组MVA的构建及其基因组结构

(A)：MVA基因组的限制性核酸内切酶HindIII的示意图。在牛痘病毒的早期/晚期启动子P7.5的转录控制下，通过异源重组将HCV编码序列插入到MVA基因组的缺失位点III。和MVA DNA序列相关的侧端(flank)1和侧端2在缺失位点III的附近，用于指导MVA基因组内的重组。Rec2表示的是与侧端1的右端对应的283bp的重复MVA DNA序列位置，使得能够从异源重组构建的重组病毒的基因组中除去K1L可检测标志。下面显示了重组的MVA-HCV-151-661，MVA-HCV-1-661和MVA-HCV-1-742基因组结构图解。

(B)：用来控制在缺失位点III插入的基因序列的病毒DNA的PCR分析。野生型MVA的基因组DNA以及重组的MVA-HCV-151-661，MVA-HCV-1-661和MVA-HCV-1-742被用作特征DNA片段扩增的矩阵DNA(matrix DNA)，该DNA片段是通过琼脂糖凝胶电泳分离的。采用1kB ladder(Gibco)作为碱基对(bp)的分子量标记(M)。

图2

通过重组MVA合成HCV核心和E2蛋白

用10 IU/细胞的MVA或者MVA-HCV来感染BHK-21细胞，24小时后(A，B)或者在所示时间点(C，D)收集细胞。用SDS 10％PAGE分离细胞裂解液的蛋白，利用单克隆鼠抗HCV核心(A，B)或者E2特异性多克隆兔抗体(C，D)进行Western印迹法分析。用箭头标示出HCV特异性蛋白带。泳道MW所示为蛋白标准的位置和分子量(kDa)。

图3

通过重组MVA制备的细胞结合型和分泌型E2蛋白的糖基化

MVA感染的BHK-21细胞中的总细胞蛋白(A)或者上清(B)的蛋白沉淀在SDS/β巯基乙醇中进行变性，在内糖苷酶PNGase F的存在(+)或者不存在(-)下进行培养，用SDS-10％PAGE进行分离并用多克隆兔抗E2血清进行Western印迹法来分析。用箭头标示出HCV-E2特异性蛋白带。泳道MW所示为蛋白标准的位置和分子量(kDa)。

图4

通过重组MVA制备的细胞结合型和分泌型E2蛋白对EndoH的敏感性进行分析

在MOI为10的情况下，用重组的MVA/151-661或者MVA-HCV/1-661或者非重组MVA感染BHK-21细胞24小时。对感染的培养物中的总细胞蛋白(A)或者上清中的蛋白沉淀(B)进行变性，在PNGase F或EndoH的存在(+)或者不存在(-)下进行培养，用SDS-10％PAGE进行分离并用多克隆兔抗E2血清进行Western印迹法来分析。用箭头标示出HCV特异性蛋白带。泳道MW所示为蛋白标准的位置和分子量(kDa)。

图5

用MVA-HCV接种的BALB/c小鼠的CTL对E1肽刺激的靶细胞进行特异性裂解

从用重组的MVA-HCV/151-661(A)、MVA-HCV/1-661(B)、或者MVA-HCV/1-742(C)接种的小鼠中取脾细胞，然后在体外用E1肽aa312-326进行再刺激。在给出的针对P815靶细胞的4小时⁵¹Cr释放实验的E：T关系中检测效应子的细胞毒性，其中所述的靶细胞已经被E1肽aa312-326(■)或者Flu肽(□)刺激。非重组的MVA接种的小鼠脾细胞被用作对照，检测用E1肽aa312-326(◆)或者Flu肽(×)共培育的P815靶细胞。

图6

在用重组MVA接种的BALB/c小鼠中的E2特异性抗体的反应

将采用10⁸IU的重组或野生型MVA免疫三次的BALB/c小鼠的血清进行二倍系列稀释，用ELISA检测E2特异性抗体。显示了所有的血清转化动物的正常平均抗E2滴度的log(2)数值。利用bars表达标准偏差。在峰值的数量显示了血清转化动物和所有分析动物之间的关系。

材料和方法

细胞系和病毒

原代鸡胚纤维原细胞(CEF)、幼仓鼠肾BHK-21(ATCC CCL-10)细胞、兔肾-RK-13(ATCC CTL-37)和小鼠P815(H-2d，ATCC TIB64)细胞在添加了10％胎牛血清(FCS)的MEM或者RPMI 1640培养基中生长。细胞生长在潮湿的5％CO₂的气氛和37℃环境下。

牛痘病毒MVA(克隆分离F6、45、60)采用常规方法进行繁殖，在CEF中通过牛痘病毒特异性的免疫染色来确定感染单位(IU)/ml。本实验采用第582次CEF循环得到的病毒。在菌斑还原实验中使用编码E.colilacZ报告基因(60)的重组病毒MVA-LZ来确定牛痘病毒MVA特异性的中和抗体。

质粒构建

为构建包含结构HCV基因的MVA载体质粒，制备来源于克隆HCV-DNA的DNA片段，它最初是由Y.Wang获得的(University of Beijing，GeneBank Accession number D10934，63，38)。通过EcoR1和HindIII酶切pUC18/CE1E2得到包含HCV氨基酸(aa)1至742的编码序列的DNA片断，用Klenow聚合酶处理，形成平端，并将其克隆到pIII dHR-P7.5的单Pmel位点，从而得到pIII dHR-P7.5-HCV(1-742)。

为获得MVA载体质粒pIII dHR-P7.5-HCV(1-661)和pIIIdHR-P7.5-HCV(151-661)，采用聚合酶链式反应(PCR)从相同的HCV-cDNA矩阵中扩增编码HCV-aa 1-661或者aa 151-651的DNA片段，其中使用下述的寡核苷酸：HCV-5′-1 5′-CAT GG G AAT TCC CAT GAG-3′，HCV-5′-151 5′-GGC GCT GC G AAT TCC ATG GCG CAT GGC GTC CGG-3′和HCV-3′-661 5′-GGG GGG GAA TTC TCA CTC TGA TCT ATC CCT GTC-3′(下划线为Eco RI-位点)。对PCR产物用EcoRI进行酶切，用Klenow形成平端，然后将其克隆进pIIIdHR-P7.5的PMEI位点。

重组病毒的形成

根据操作说明书，取在6孔组织培养板(Corning，Corning，NY，USA)上近乎汇合的BHK-21单层细胞，采用FuGENE 6-转染试剂(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，德国)以1.5ug质粒DNA/孔来感染细胞，然后以0.01感染单元/细胞的多样性用MVA进行感染，转染90分钟。感染后24小时收集细胞，如所述通过选择宿主细胞谱的短暂扩展来分离rMVA(58)。在RK-13单层细胞中形成典型的感染灶后观察到了重组病毒。RK-13细胞不支持肠胃外MVA的繁殖性生长。3个繁殖周期后RK-13中菌斑纯化，通过BHK-21细胞运送rMVA来除去可选择的标志基因K1L。在BHK-21细胞中制备病毒起始物质，通过在蔗糖pad中的两步超声沉淀进行纯化，采用牛痘病毒特异性免疫染色在CEF细胞上确定滴度。将其分成等分试样并于-80℃储存。

重组蛋白的分析

每细胞用10个感染rMVA单位来感染BHK-21单层细胞。感染24小时后收集细胞，离心收集并在SDS凝胶上样缓冲液((50mM Tris-Cl，pH6.8，2％SDS，0.04％溴苯酚兰(bromophenolblue)，84mM β-巯基乙醇，20％甘油)中进行细胞裂解。总细胞蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电转移至硝酸纤维素膜上。将膜用磷酸缓冲盐水缓冲液(PBS)加2％牛血清白蛋白(BSA，W/V)和0.05％(V/V)的Tween 20进行封闭，然后与多克隆兔抗-HCV-E2抗体(血清RE2116，1∶5000)、多克隆兔抗-HCV-抗体(Antigenix，Amerika Inc./Bio-Trade，Vienna，Austria，1∶10000)、或者单克隆鼠抗-HCV-核心抗体C1(1∶5000，由斯坦福大学医学院(Stanford，CA，USA)的Ramsey C.Cheung惠赠)一起温育4小时，然后用相同的PBS缓冲液稀释。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤后，将蛋白斑与偶联了辣根过氧化物酶抗兔或者抗鼠的IgG-抗体(Dianova，Hamburg，德国)温育1小时，然后用封闭缓冲液稀释10000倍，温育，再洗涤，用Lumi-LightWestern印迹的底物(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德国)进行显色。为了控制分泌的重组HCV蛋白，在感染后24小时从MVA感染的培养物中收集不含细胞的上清液，该培养物是在不含血清的optiMEM(Gibco BRL)中生长的。将上清中的蛋白用等体积的冰乙醇沉淀，在10000Xg/4℃离心1小时得到蛋白，然后用PBS重悬，用于Western印迹分析。

用内糖苷酶EndoH和PNGaseF(New England Biolabs，Frankfurt amMain，德国)使重组蛋白脱糖基化。从感染细胞或培养上清液沉淀出的总蛋白在100℃ 10分钟、在0.5％的SDS和1％的β-巯基乙醇中2小时(37℃)进行变性，如操作手册所述，用EndoH或者PNGase F进行酶切，用Western印迹进行分析。

动物免疫及血清样品的获得

每组取5只BALB/c小鼠(6至8周龄，购自Charles River，Sulzfeld，德国)，用1×10⁸感染的MVA或者rMVA单位(溶于0.5ml无菌PBS中)在第0、38和81天对每只动物进行腹腔免疫。在第-7、21、48、103和158天从腹膜后血管丛抽取小鼠血液，将所得血液用微量离心管收集，在室温下放置4小时，在2700Xg/4℃离心10分钟。将所得血清储存于-20℃。

ELISA方法测定抗体

用酶联免疫吸附方法(ELISA)来确定血清探针中是否存在针对HCV核以及E2-抗原的抗体。用1ug/ml浓度的HCV核蛋白(aa 2-192，Bio Trade，Vienna，Austria)或者E.coli生产的HCV E2(aa 450-565)的抗原包被96孔平底培养板(MaxiSorp Surface，Nunc，Wiesbaden，德国)。将抗原用含有0.02％叠氮化钠的PBS悬起，每孔加入50ul，在4℃孵育过夜。然后移去每孔的物质，用加入了0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤3次。每孔加入200ul的封闭缓冲液(1％BSA溶于PBS-T中)，将板在37℃孵育1小时。用PBS-T洗涤板后，每孔加入用封闭缓冲液2倍系列稀释的稀释液100ul，在37℃孵育3小时。用PBS-T洗板三次后，加入偶联了碱性磷酸酶的羊抗小鼠免疫球蛋白G(Dianova，Hamburg，德国，在封闭缓冲液中1000X稀释)，在37℃孵育1小时。用PBS-T洗板8次后，用对-磷酸硝基苯底物(Sigma，Deisenhofen，德国)进行显色。在室温下孵育30分钟后，加入0.5M的NaOH停止反应，用微板读取仪器(Model 550，Bio RadLaboratories，Munich，德国)在450nm测定消光值。利用两倍稀释的溶液与所得的光密度值(OD)来计算抗体的滴度，其为临界值(cutoff)的两倍。临界值是对照组血清的平均OD值，其中对照组用非重组的MVA进行免疫。

MVA特异性抗体应答的分析

利用重组MVA-LZ通过菌斑还原实验来分析牛痘病毒MVA特异性抗体。将免疫小鼠血清的二倍系列稀释液与溶于200ul PBS的200个感染性MVA-LZ单位进行反应，在37℃孵育3小时。然后，将汇合的BHK-21单层细胞进行双份孵育，接种48小时后如(16)中所述用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-氨基半乳糖底物(X-Gal，Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德国)对病毒感染细胞灶进行显色。对显蓝色的病毒灶进行计数，每一血清中得到的数量与免疫前的血清对照或者无小鼠血清对照相比较。计算两倍稀释的抗体，结果显示病毒灶数量降低50％。

脾细胞培养以及细胞毒检测

基本按照(5)中所述方法进行试验。取末次病毒接种12周以后的小鼠脾细胞用作体外应答细胞(responder cell)。取5×10⁶细胞在含有5ug/ml E1肽(HCV aa 312-326)的RPMI 1640培养基中进行培养，该培养基还添加了10％FCS、25uM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酸盐。第二天向培养物中加入10％的TCGF。7天以后收集效应细胞(effector cell)，利用⁵¹Cr释放实验检测特异性细胞毒性。将1×10⁶的P815或者T2靶细胞与75uCi的Na⁵¹CrO₄(溶于200ul RPMI/10％FCS中)在37℃温育1小时。用RPMI/10％FCS洗涤细胞三次，用5ug/ml的E1肽(HCV aa312-326)或者1ug/ml的A/PR/8/34-流感病毒基质蛋白M1肽在37℃温育30分钟，共温育3次。在96孔培养板中以不同的比例将反应细胞和靶细胞在37℃共同培养5小时。收集30ul的上清液以确定释放的⁵¹Cr的量。所有样品在Topcount NXT(Packard，Downers Grove IL)中计数，特异性释放的百分率按照下述计算：[(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)]×100。释放以每分钟数量进行计算。实验以平行双份进行。对再刺激，将取自未免疫的BALB/c小鼠的5×10⁶受辐照(3000rad)的细胞与10ug/ml的E1肽(HCV aa312-326)温育2小时后，加到1×106的效应细胞中，在RPMI培养基(添加了10％FCS、25uM 2-巯基乙醇、1mM的丙酮酸钠、2mM的L-谷氨酸盐、以及10％的TCGF)中生长7天。

结果

用于表达HCV-C-E1-E2基因的rMVA的设计和分离

以前的研究表明载体质粒的方法适于形成并分离rMVA，其中该载体质粒能够基于牛痘病毒K1L基因的瞬时表达(transient expression)来选择宿主范围(58)。为使用所说的新技术，将HCV靶基因序列克隆进MVA载体质粒pIIIdHR-P7.5中。所得的质粒pIIIdHR-HCV/1-742、pIIIdHR-HCV/1-661和pIIIdHR-HCV/151-661包含HCV-cDNA编码多蛋白的氨基酸1-742、1-661或者151-651。rMVA在已被MVA感染的BHK-21细胞中形成，该BHK-21细胞已被pIIIdHR-HCV/1-742、pIIIdHR-HCV/1-661或者pIIIdHR-HCV/151-661转染。将感染细胞裂解液的系列稀释置于RK-13细胞中，该细胞使得重组病毒在可选择的标志基因K1L的瞬时表达中能够选择性生长。经过3次克隆传代后在RK-13细胞上只有rMVA可检测出，这可通过病毒DNA的PCR分析来证实(数据未显示)，然后将病毒分离物在BHK 21细胞上进一步进行菌斑纯化。在所述细胞中的rMVA的生长与K1L基因的表达无关，从而通过在复制性DNA序列之间的异源重组而使标志基因丢失，其中该DNA序列的两侧为病毒基因组内的K1L基因(图1A)。通过BHK-21细胞几次传代后，病毒DNA的PCR分析显示，病毒基因组包含稳定整合的HCV靶基因序列，但不再包含K1L基因(图1B)。通过对所得的病毒MVA-HCV/1-742、MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661进行扩增和纯化得到高滴度病毒制备物，留待进一步的分析。

rMVA感染后HCV蛋白的合成

由于需要检测所形成的rMVA作为载体疫苗候选物的HCV抗原的传递(delivery)和免疫特性，因此需要详细确定组织培养感染中HCV蛋白的生成。所有包含E1和E2等不同核心蛋白的编码序列的rMVA控制结构HCV蛋白的合成，如感染后24小时收集的BHK 21细胞裂解液的SDSPAGE分析和免疫印迹分析所示(图2A、B)。在MVA-HCV/1-742或者MVA-HCV/1-661感染细胞中，针对HCV核心蛋白生成的单克隆抗体具有与21kDa的核心蛋白相等的量，但是MVA-HCV/151-661或者未重组的MVA感染后却未检测到这种蛋白带(图2A)。在晚些时间随着核心蛋白量的增加，可检测到第二个23kDa的蛋白带。HCV外壳蛋白的合成受E2特异性多克隆兔抗血清的控制。根据图2B，所有三个重组病毒形成的E2多肽，对MVA-HCV/1-742，该多肽显现为分子量约为60kDa的蛋白；对于MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661，该多肽显现为分子量约为50kDa的蛋白。后者的病毒都包含HCV多蛋白的表达框，该多蛋白具有C-末端被截短的E2序列。利用多克隆血清还显示出几个其它的小蛋白带，由于从野生型MVA感染的细胞的对照裂解液中也检测出这些条带，因此其可能代表非HCV编码的蛋白。

此外，应该控制rMVA感染中HCV蛋白合成的动力学。在感染后两天的时间里，我们同时多次用10个感染单位/细胞的MVA-HCV/1-742感染BHK-21单层细胞，并制备细胞裂解液用于Western印迹分析(图2C，D)。在感染后4小时可检测到HCV核心蛋白的合成(图2C)，但是第一重组E2蛋白(图2D)在感染后8小时清楚出现。在感染后34小时的时间段里，两种重组蛋白的量都明显增加。野生型MVA感染的细胞的裂解液用作阴性对照。

由MVA制备的与细胞相联接的分泌型E2抗原的分析

传递抗原(delivered antigen)的翻译后修饰实质上影响免疫原性和保护能力。HCV外壳蛋白E1和E2被高度糖基化修饰，它可能是带有羧基末端疏水性锚定结构域的I型跨膜糖蛋白。除去E2跨膜锚定导致E2外部结构域的分泌(c.f.17所述)。感染哺乳动物细胞后，真核MVA表达系统能导致重组蛋白的可信的翻译后修饰。为了控制所述的步骤，将用rMVA感染中生成的E2蛋白进行生化定性。BHK-21细胞用MVA-HCV/1-742、MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661感染。将感染细胞的总的细胞裂解液(图3A)或者上清液的沉淀(图3B)用PNGase F处理，利用多克隆抗-E2抗血清通过Western印迹法进行分析。细胞裂解液中表达的～60kDa(MVA-HCV/1-742)或者～50kDa(MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661)的E2蛋白分别缩小至约33kDa(全长E2)或者31kDa(截短的E2)，对应于未糖基化的E2肽骨架(图3A)。分泌型E2仅在用重组病毒MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661感染后能够检测到，其在跨膜结构域生成截短的E2。分泌型E2比细胞结合型E2的修饰更加显著，其分子量为～75kDa。当用PNGase F处理后，所述蛋白也将缩小到约31kDa，对应于截短的E2肽骨架。在接下来的步骤里，进一步对所述分泌型E2蛋白中的糖基化类型进行表征。细胞用MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661进行感染，感染细胞的细胞裂解液或者上清液用内糖苷酶H进行处理(图4)。然而，细胞内的E2对EndoH敏感，如所检测到的MW从～50kD减小到～32kD(图4A)，但是分泌型E2却不受影响(图4B)。由于酶切后Endo H酶在Asn侧链上脱离GlcNAc残基，因此PNGase F酶切的E2条带的分子量比被Endo H酶切的相应条带的分子量低。这一结果与通过高尔基体(golgi apparatus)进行传代中的C-末端截短E2的更加复杂的糖基化相对应。

用rMVA接种小鼠引起HCV和牛痘病毒特异性免疫应答

由于已知在小鼠中由牛痘病毒重组物生成的HCV核心蛋白介导免疫抑制(36)，因此下面在小鼠中检测不同的rMVA疫苗的免疫原性。此外，需要确定本文的2个rMVA疫苗生成的全长HCV核心蛋白介导的免疫反应的可能调节。因此，分析了直接针对HCV-E1和E2抗原的HCV特异性的体液或细胞免疫。当用重组或野生型MVA HCV-E1对BALB/c小鼠腹腔免疫三次后，研究对E1(312-326)-BALB/c-表位的特异性CTL反应。取用MVA/HCV/151-661或者MVA-HCV/1-661免疫的动物脾细胞，采用E1肽进行刺激，表现出75％的E1特异性裂解，其E∶T的比率为9∶1，而用MVA-HCV/1-742进行免疫时，动物的脾细胞表现出47％的特异性裂解(图5)。当用表达C-末端截短的E2蛋白的rMVA进行免疫时，在脾细胞培养物中表现更高的E1特异性裂解。

取同样的BALB/c小鼠的血清样品用ELISA的方法来进一步研究针对HCV E2蛋白的抗体反应(图6)。检测了平均滴度分别为1∶2512(MVA-HCV/151-661)、1∶933(MVAHCV/1-661)和1∶176(MVA-HCV/1-742)的E2特异性抗体。发现用MVA-HCV/151-661免疫的动物中具有更高量的抗-E2抗体，尽管组之间的差别没有统计学显著性。

HCV核心蛋白可如前所述表现出免疫调节功能。现在已经研究了MVA-HCV/151-661注射小鼠的高水平抗E2抗体反应是否能归因于所述病毒中该核心蛋白的大量截短。可以预计，HCV核也能调节诱导牛痘病毒MVA特异性免疫反应。因此，检测了用于ELISA的相同小鼠血清中MVA中和抗体的量。根据表1，检测出在用表达全长或者截短的核心蛋白的重组或野生型MVA免疫的组之间抗MVA抗体反应没有差别。

实验概括

从前的实验在一系列动物模型系统中建立了呈递病毒抗原的重组MVA疫苗的免疫原性以及保护作用的数据(61，29，27，64，65，44，59)。然而，仍迫切需要针对HCV感染的疫苗，并鉴别具有适宜的免疫原性和可能的保护能力的疫苗候选物。为了研究MVA在生成HCV抗原中的适宜性，构建了一系列具有HCV基因序列的插入表达框的rMVA，其编码结构蛋白C-E1-E2。我们想确定重组MVA的特征，该MVA被设计为生成HCV-E1-E2外壳蛋白或者具有或不具有全长HCV包衣/核心蛋白的分泌型E2抗原。rMVA的生成和分离依靠瞬时宿主范围的基因选择(58)，当准备出几种MVA载体病毒用于对比实验时，该项技术尤其适合。在牛痘病毒的早期晚期启动子P7.5的控制下，可以很容易地获得表达不同HCV编码序列的重组MVA，并且早期的实验显示，采用相应的方法时，所有的构建体产生相似量的结构HCV蛋白。

HCV核心序列是病毒基因组中最高度保守的区域之一，其延伸到不同HCV基因型的病毒中，这使得核心蛋白成为了令人感兴趣的免疫抗原(6，57，7)。然而，将核心包含入疫苗候选物中受到高度怀疑，这是因为其多功能的特性可能参与宿主细胞的凋亡、转录、转化以及免疫呈递等的调节(43，4)。重组MVA编码多蛋白aal-742和1-661的HCV序列的表达首先导致21-kDa-核心蛋白的合成(图2A)。只有在感染的晚期，随着重组蛋白生成的量的增加才看到23kDa大小的第二条核心特异性蛋白带。该23kDa的蛋白可能是最初的多蛋白酶切产生的具有191氨基酸的未成熟核心蛋白，而21-kDa的蛋白可能是病毒颗粒上存在的成熟的核心蛋白(28，26，51，55，66)。所述数据表明在MVA-HCV载体感染的细胞中核心多肽的有效的早期合成以及处理。

当用MVA-HCV/1-742感染后，检验约60kDa的E2蛋白的生成，其仍为严格的细胞结合型(图2B)。在细胞培养物上清中，75kDa的C-末端截短的E2蛋白的扩增揭示了在HCV感染细胞中分泌路径的功能性。利用SDS-PAGE对MVA-HCV/1-661和MVA-HCV/151-661生成的细胞结合型和分泌型截短的E2进行比较(图3AB)，显示分泌型迁移的更慢。这是由于糖基化的不同造成的。相应地，当用PGNase F脱糖基化后，两种E2蛋白以同样的水平迁移。此外，分泌型E2对内糖苷酶H的处理不敏感，这清楚显示了在高尔基体的运输过程中摄取了复杂的糖。然而并未正式分析HCV-E1蛋白的表达，但E2蛋白形成了HCV多蛋白的下游部分，E2合成的验证提示了E1蛋白序列的生成。

这一想法的正确性通过下述方法进行检测：当用重组MVA-HCV病毒接种后检测E1特异性的T细胞反应。

为进行疫苗免疫原性的对比实验，对BALB/c小鼠进行接种，研究其免疫反应的诱导，该免疫反应直接针对所有的载体病毒制备的HCV外壳蛋白。对于外壳抗原，E1和E2特异性CTL存在于HCV感染的人和黑猩猩的肝脏和外周血中(Walker 1996，Sem.Virol.)。最近的许多研究数据表明，在HCV感染的黑猩猩的免疫反应中，CD8+CTL伴随着感染的迅速停止(12)。长期持续CTL的精确特异性分析揭示，HCV蛋白E1，E2，P7，NS2，NS3，NS5a存在9个不同的肽表位，其中在E1/E2序列中具有4个所述的表位。E1表位312-326被成功用于对接种的BALB/c小鼠的脾细胞进行体外再刺激，所有3个rMVA疫苗诱导的表位特异性CTL都可被检测到。令人感兴趣的是，在最后一次免疫的12周以后，还能检测到E1特异性的CTL。这揭示长期的免疫能够诱导长期持续(记忆相)的E1特异性T细胞反应。

HCV核心蛋白的共合成并不影响对E1特异性CTL反应的诱导，然而，制备C-末端截短的分泌型E2蛋白的载体病毒的免疫反应似乎引起更高水平的E1特异性细胞毒活性。糖蛋白E1和E2形成复合物，由于疏水性跨膜序列的相互反应，该复合物在内质网(ER)中被保留在蛋白的C-端(10)。E2跨膜区域的去除或突变抑制天然E1-E2复合物的生成，并阻止E1糖蛋白的正确折叠(11，48)。对于MHC-1-分子的呈递来说，E1抗原似乎来源于内质网，但是需要一个胞质内加工(54)，并且可能依靠第二条输出途径来将跨膜的糖蛋白运输进胞液中，如流感核蛋白或者细胞糖蛋白酪氨酸酶所暗示的一样(2，47)。由于用制备分泌型E2的载体病毒免疫后将有更高水平的CTL活性，基于这一发现，人们推测，将截短的E2的分泌路径进行固定将在上述处理途径中优先获得E1，从而可以增强E1抗原的MHC-I的限制性呈递。

在黑猩猩模型中用重组HCV-外壳抗原进行预防性免疫所得到的保护作用与E2特异性抗体相关(9)。相应地，对于将E2蛋白作为疫苗抗原候选物来诱导HCV中和抗体，人们投入了巨大的关注(68，56)。在检测E2特异性体液免疫反应的实验中，发现所有3种rMVA疫苗免疫后形成特异性的抗体。在利用可合成具有截短的跨膜结构域的分泌型E2蛋白的载体进行接种的动物血清中，获得了更高的抗体滴度。自然地，E2的分泌能够引起更好的抗体反应，然而为形成细胞内保留复合物所进行的全长E1和-E2蛋白相互反应能够遮盖重要的表位，并且阻止了最佳的免疫呈递。由可复制的牛痘病毒制备的HCV核心蛋白似乎抑制宿主免疫反应，尤其抑制牛痘病毒特异性免疫反应的生成(Large et al 1999，J Immunol 162：931-938)。在本文所示的接种实验中，与这些数据相应的最好的E2特异性抗体反应似乎是由MVA-HCV/151-661疫苗诱导的，在核心抗原不存在的情况下，该疫苗生成了截短的E2。然而牛痘病毒特异性中核抗体反应的相应分析表明，所有的rMVA-HCV疫苗几乎引起等量的牛痘病毒特异性免疫。然而，对所有免疫实验结果进行评价得出下述结论：采用带有复制缺陷的牛痘病毒MVA的HCV核心抗原(至少在本实验中)作为表达载体未产生可检测的效果。

概括来说，本研究证实rMVA可用来有效生产成熟的核心蛋白和外壳蛋白。此外，用rMVA疫苗接种BALB/c能诱导相当数量的E2特异性抗体以及长效的E1特异型细胞毒T细胞反应，并且表明可将所述的病毒载体进一步用作针对HCV感染的有潜力的疫苗。

因此根据本发明，rMVA可用作针对HCV感染的潜在的疫苗候选物。首先，构建MVA载体疫苗，它能表达编码主要HCV病毒成分的所有序列，表征MVA感染后重组HCV蛋白的合成，并评价它作为疫苗的免疫原性。

在本研究中，检测到全长HCV结构蛋白的大量合成以及有效的翻译后成熟，该蛋白是通过用rMVA的体外感染来制备的。还显示：在BALB/c小鼠中用rMVA免疫能够诱导HCV-E1和E2-抗原特异性体液或者细胞免疫反应。所有的疫苗引起平衡量的牛痘病毒特异性循环抗体。本发明数据显示，rMVA表达的HCV结构抗原，包括完全HCV核心抗原的高度免疫原性。

表1：MVA疫苗诱导的牛痘病毒中和抗体

	滴度^b(log2的平均倒数)^c
	滴度^b(log2的平均倒数)^c				疫苗^a	d0	d28	d55	d110
MVA	＜5.3	10.3	12.3	12.3	疫苗^a	d0	d28	d55	d110
MVA	＜5.3	10.3	12.3	12.3	MVA-HCV/151-661	＜5.3	9.5	12.3	12.3
MVA-HCV/1-661	＜5.3	10.1	11.9	12.1	MVA-HCV/151-661	＜5.3	9.5	12.3	12.3
MVA-HCV/1-661	＜5.3	10.1	11.9	12.1	MVA-HCV/1-742	＜5.3	9.9	12.3	12.3

a)10⁸IU MVA疫苗，在第0、38、81天通过腹腔途径给予；

b)血清抗体滴度通过50％的牛痘病毒菌斑还原实验确定；

c)n＝5，是最大标准差

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Claims

1.一种重组MVA，其特征在于，它包含编码HCV结构抗原或者编码HCV结构抗原的功能性部分或表位的DNA序列。

2.权利要求1的重组MVA，其特征在于它包含下述结构抗原的基因DNA序列：包衣蛋白核心和/或外壳糖蛋白E1和/或外壳糖蛋白E2。

3.权利要求1或2的重组MVA，其特征在于它包含编码E1和E2序列的DNA序列。

4.权利要求3的重组MVA，其特征在于编码E2的DNA序列编码E2的一种突变形式。

5.权利要求4的重组MVA，其特征在于E2的突变形式是可分泌形式，其中删除了E2亲脂结构部分中的至少一部分。

6.前述权利要求中的任意一项或多项中所述的重组MVA，其特征在于将DNA序列整合进MVA基因组的非必要区域中。

7.前述权利要求中的任意一项或多项中所述的重组MVA，其特征在于将DNA序列整合进MVA基因组中天然发生缺失的部分。

8.权利要求7所述的重组MVA，其特征在于天然发生缺失的位点为MVA基因组的非必要区域中的缺失位点III或者其它缺失。

9.前述权利要求中的任意一项或多项中所述的重组MVA，其特征在于DNA序列受到牛痘病毒特异性启动子的转录控制、和/或受到并非来源于牛痘病毒的启动子的控制，该DNA序列优选与进一步的控制序列相连，如增强子元件。

10.权利要求9所述的重组MVA，其特征在于DNA序列受到牛痘病毒特异性早期/晚期启动子P7.5的转录控制。

11.前述权利要求中的任意一项或多项中所述的重组MVA，其特征在于E1和E2不能形成异源二聚体。

12.一种药物组合物，其特征在于它包含前述权利要求1-11中任意一项或多项所述的至少一种重组MVA以及药学上可接受的载体和辅剂。

13.权利要求12的药物组合物，其特征在于它以疫苗的形式存在。

14.一种真核细胞，其特征在于，用权利要求1-11中的任意一项或多项所述的重组MVA对该细胞进行感染。

15.一种真核细胞，其特征在于，该细胞是鸡胚纤维原细胞或者幼仓鼠肾细胞，优选是BHK-21细胞，或者是一种抗原呈递细胞，优选是树突状细胞。

16.权利要求1-11中的任意一项或多项所述的重组MVA在治疗和预防HCV感染以及由此引起的疾病、尤其是慢性肝疾病和肝肿瘤中的应用。

17.权利要求1-11中的任意一项或多项所述的重组MVA在制备疫苗中的应用，用来生产重组HCV结构蛋白或者用于制备生产重组蛋白的真核细胞。

18.权利要求12或13所述的药物组合物，它用来对动物或者人进行免疫。

19.一种制备重组HCV结构多肽或者其功能性部分的方法，其包含下述步骤：

(a)在适宜的条件下按照权利要求9或10培养细胞；以及

(b)对重组HCV结构多肽、其功能性部分或者其表位进行表达、分离、以及纯化。

20.一种制备重组MVA的方法，其包含下述步骤：

(a)将权利要求1所述的DNA序列、或者其功能性部分、或其表位引入MVA载体的非必要区域中，用来制备重组MVA载体；

(b)将重组MVA载体引入真核细胞中，并在所述细胞中扩增该载体；

(c)分离病毒颗粒或其DNA或RNA。

21.前述权利要求1-11中的任意一项或多项所述的重组MVA的DNA或者RNA，优选为分离型。