KR20110092316A - 재조합 불활성화 바이러스 벡터 백신 - Google Patents

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KR20110092316A
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베르나르도 로자노-두베르나르드
다비드 사르파티-미즈라히
예수스 알레한드로 수아레즈-마르티네즈
마뉴엘 호아킨 가이-구티에레즈
에르네스토 소토-프리안테
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래보래토리오 아비-멕스, 에스.에이. 데 씨.브이.
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Abstract

본 발명은 해당 질병을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 불활성화된 바이러스 벡터와, 약학적으로 허용 가능한 비히클, 보조제 또는 부형제를 포함하는 백신에 관한 것이다. 이 백신은 동일한 바이러스 벡터에 기초한 활성 바이러스 백신에 대하여 요구되는 것과 유사한 바이러스 벡터 역가를 사용하여 해당 질병에 대한 보호를 제공한다. 주로, 파라믹소바이러스 또는 아데노바이러스의 바이러스 벡터가 서술된다.

Description

재조합 불활성화 바이러스 벡터 백신 {RECOMBINANT INACTIVATED VIRAL VECTOR VACCINE}
본 발명은 좋기로는 조류의 질병의 예방 및 치료에 사용되는 기술에 관한 것이고, 더욱 좋기로는, 질병에 대한 항원 활성 (disease antigenic activity)을 가지는 단백질을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 불활성화된 바이러스 벡터와 약학적으로 허용 가능한 비히클, 보조제 또는 부형제를 포함하는 재조합 백신에 관한 것이다.
잘 알려져 있는 바와 같이, 바이러스 병원체에 대한 백신은 백신 제조에 사용되도록 분리된 해당 바이러스로부터 제형되어, 다양한 제형 형태로 동물 또는 인간에게 투여된다.
반면에, 활성 전바이러스 (whole and active virus)를 사용하는 백신 제형물이 있는데, 이는 야생에서 낮은 병원성을 나타내거나, 또는 실험실에서 감소된 병원성을 가지지만, 이를 투여한 경우에는 더 높은 병원성을 가지는 동일한 종의 바이러스 균주에 대한 보호를 제공하기에 충분한 항원 반응을 유발시킨다.
예를 들어, 뉴캐슬병 (Newcastle Disease, 알파벳 첫자를 따서 ND)은 바이러스에서 기원하는 것이고 매우 전염성이 강한데, 치사에 이를 수도 있다. 상기 질병은 가축 및 야생 조류를 감염시켜, 높은 이병율 (morbidity) 및 폐사율 (mortality)을 유발한다. ND는 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae) 과(科), 아불라바이러스 (Avulavirus) 속에 속하는 바이러스에 의하여 유발된다. 이의 병원성 및 바이러스성 정도에 따라, 이 균주는 렌토제닉 (lentogenic), 메소제닉 (mesogenic) 및 벨로제닉 (velogenic)으로 분류되는데, 즉, 각각 저병원성, 중병원성, 고병원성을 나타낸다 (Office International des Epizooties (2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p.576-589).
ND 바이러스 (NDV)에 대해서는 다양한 전파 경로가 있다. 예컨대, 직접적으로는 살아 있는 조류 또는 죽은 조류 및 이들의 산물 또는 부산물, 또는 간접적으로는 감염된 곤충 또는 기타 동물 등의 사람을 비롯한 매개체가 있다. 고폐사율을 유발하는 벨로제닉 타입의 NVD (알파벳 첫자를 따서 VNDV)에 대한 인큐베이션 기간은 약 21일인데, 이 동안에 두근거림, 재채기, 협동 운동장애, 뻣뻣한 날개, 다리 끌기, 두경부 꼬임, 안면 경련, 원으로 돌기, 우울증, 친화력 없어짐 및 완전 마비 등의 호흡기 및/또는 신경계 징후를 나타낸다. 뿐만 아니라, 달걀 생산율이 부분적으로 또는 완전히 감소되거나, 변형된 알 또는 수성 알부민을 함유하는 얇고 거친 껍질의 알을 낳기도 한다.
ND를 통제 및 예방하기 위한 전략 중 하나는 활성 바이러스 백신, 좋기로는 렌토제닉 균주에서 생성된 활성 바이러스 백신을 사용하는 것이다. ND에 대한 생백신은 호흡기 점막 수준에서 보호를 유발하며, 50년 이상 산업계에서 사용되어 왔다. 이들 활성 바이러스 백신은 주로 Hitchner B1 및 LaSota 균주로부터의 렌토제닉 바이러스를 사용하여 만들어지는데, 후자, 즉 LaSota 균주가 가장 많이 사용되는 백신이다 (Op.Cit., Office International des Epizooties (2008) Newcastle).
그러나, 활성 바이러스는 에멀젼 성분에 의하여 불활성화될 수 있고, 에멀젼화된 활성 백신의 안정성은 제한된다. 그러므로, 다른 종류의 제형물을 사용하는 것이 일반적이고, 또는 그렇지 않으면 대규모 애비컬쳐 (aviculture)로 사용하기 어려운 인 시츄 (in situ) 혼합물에 의하여 전달된다.
활성 바이러스와 관련된 주요 문제점은, 높은 유전적 변이 능력, 다른 활성 바이러스와의 재조합, 또는 병원성 변화 경향 (가령, 인플루엔자 바이러스) 등으로 인하여, 백신으로서 늘 사용될 수는 없다는 점이다. 인플루엔자는 포유류 및 조류 모두에 영향을 미치는 호흡기 질환이다. 이러한 집단에서 인플루엔자 바이러스 균주의 출현은 가축 조류 및 인간 또는 다른 포유류 모두에 있어서 각 개별 대상자에 대해 심각한 결과를 초래할 수 있다. 바이러스가 가축 암탉 및 포유류를 감염시킨 경우에, 이는 스스로 돌연변이를 일으켜 새로운 집단이 되고, 이러한 돌연변이가 발생되는 기간 중에는, 그 바이러스 중의 중요한 생물학적 변화를 일으킬 수 있고, 이로 인하여 호스트 및 동물 또는 인간 집단에 대하여 치사에 이르게 할 수 있다.
특히, 조류 인플루엔자 (알파벳 첫자를 따서, AI)는 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae)과로부터의 타입 A 바이러스에 의하여 유발되는 고전염성 바이러스으로 인한 전염병이다. 대부분의 AI 바이러스 (알파벳 첫자를 따서, AIV)는 야생 조류, 특히 VI 바이러스에 대하여 낮은 병원성 (low pathogenicity AI virus; 알파벳 첫자를 따서, LPAIV) 보균자로서 작용하는 수생 조류로부터 분리된다. 이들 바이러스가 가금류, 주로 갈리나시애 (gallinaceae)(즉, 특히 그중에서도 암탉, 칠면조 및 메추라기 등) 등의 자연 속에 있는 것이 아닌 바이러스 호스트를 감염시키는 경우, 바이러스는 적응 과정을 통하여 매우 고병원성인 형태 (highly pathogenic form; 알파벳 첫자를 따서 HPAIV)로 돌연변이 된다.
AIV는 2개의 바이러스 외피 단백질에 따라 분류될 수 있다. 그 중 하나는 헤마글루티닌인데, 감염되거나 백신 처리된 조류에서 중화 항체 반응을 담당하기 때문에 가장 중요하며, 16개의 서브타입 (subtypes) 또는 세로타입(serotypes)이 보고되어 있다. 두번째 단백질은 뉴라미니다제인데, 9개의 상이한 서브타입이 보고되어 있다. 특히, 조류에게 있어 가장 중요한 바이러스는 헤마글루티닌 세로타입 H5 및 H7을 가지는 것들인데, 이들은 고병원성으로 돌연변이되었을 때 100% 폐사율에 이르게 할 수 있다.
마찬가지로, 조류에서의 AI는 두 가지 임상형을 나타낸다. 제1 임상형은 저병원성 조류 인플루엔자 (low pathogenicity avian influenza; LPAI)로서 약한 질병을 일으키고, 종종 깃털 상태 악화, 달걀 생산량 감소로서 나타난다. 그러나 AI는 고도로 돌연변이를 일으킬 수 있는 바이러스의 능력 때문에 조류에게 있어 중요한데, 이는 폐사율 100%에 이르게 할 수 있는 고병원성 조류 인플루엔자 (high pathogenicity avian influenza; HPAI) 형태인 제2 임상형을 초래하기 때문이다.
특히, AI의 임상적 징후는 다양하고, 관여한 바이러스 서브타입, 이의 병원성, 면역 상태 및 감염된 조류의 종에 따라 영향을 받는다. HPAIV에 대한 인큐베이션 기간은 21일간이고, 임상적 징후는 결막염, 뻣뻣한 깃털이 특징인 체온 증가, 기운 없음, 탈진 및 사망에 이르기까지 다양하다. 흔하게 설명되는 외상으로는 폐 울혈, 출혈 및 부종이 있다.
일단 AIV가 가금류 농장에 도입된 경우, 이는 대변 및 호흡액을 통하여 환경으로 방출된다. 바이러스의 전염 및 다른 조류에게로의 바이러스 확산은 감염된 조류의 분비물과 직접 접촉하는 것을 통하여, 특히 오염된 대변, 사료, 물, 장치, 및 의복류를 통하여 이루어진다. 감염에 대한 취약성 및 질병의 임상학적 징후가 나타나는 정도는 매우 다양하다.
통제가 어렵고, 활성 바이러스 백신이 동물과 심지어 인간의 건강에 대한 위험을 수반할 수 있는 이러한 종류의 질병에 있어서, 투여 과정 중에 상기 통제가 손실되는 경우에는 불활성화된 바이러스 백신, 보통은 에멀젼화된 바이러스 백신을 사용하는 것이 좋다.
전술한 AI 등의 다양한 바이러스성 질환을 예방하기 위하여 선행 기술에서는 여러 가지 백신이 개발되어 있다. 이러한 AI 등의 질병에 관하여, AI 전바이러스를 포함하는 에멀젼화된 백신은 이미 존재하고, 이는 닭의 배에서 생산된다. 이 바이러스는 불활성화되고, 물-오일 중에 에멀젼화되어, 시판용 조류에 피하 또는 근육내 투여된다. (Office International des Epizooties (2008). Avian Influenza. OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, Office International des Epizooties France, p. 465-481).
더욱 구체적으로는, 백신은 불활성화된 AI 바이러스로 만들어지고, 전신 수준에서 강한 면역 반응을 자극하며, 이들은 두 가지 AI 형태를 통제하는 데 있어 모두 긍정적인 결과를 나타내어 왔다. 백신처리 (백신 접종)은 질병의 임상적 징후를 예방하기 위하여, 또한 가능하면 감염된 새끼로부터의 바이러스 배출물이 환경으로 방출되는 것을 감소시키기 위하여 사용된다. 바이러스 배출물 감소는 백신처리되었지만 곧 감염될 수 있는 조류로부터, 감염되지 않은 취약한 조류로 바이러스가 이동할 기회를 줄이게 된다. (Swayne, D, y Kapczynski, D (2008), Vaccines, Vaccination and Immunology for avian influenza viruses in poultry. In Avian Influenza. Ed by David Swayne. Blackwell Publishing, USA, p.407-451.)
뿐만 아니라, 에멀젼화된 불활성화된 바이러스 백신은 안정성이 증가됨으로써, 더욱 나은 백신 관리를 가능하게 해 주고, 더욱 긴 백신 저장 수명을 가능하게 한다. 그러므로, ND 백신은 에멀젼화된 불활성화된 바이러스로서 제형되어 왔다.
활성 바이러스 백신 및 불활성화된 바이러스 백신 간의 주요 차이점 중 하나는 투여되었을 때 항원 반응을 수행하는 데 필요한 바이러스의 양이라는 것을 주목할 필요가 있다.
활성 바이러스는 세포 내에서 스스로 복제할 수 있는 완전한 능력을 가지기 때문에, 백신에 요구되는 해당 바이러스의 양은 항원 반응을 유발시킬 투여량보다는 적은데, 이는 바이러스가 자연적으로 복제할 것을 감안하여 백신을 투여한 개체가 병이 나는 것을 예방하기 위해서이다. 그리고 일단 개체로 도입되면, 바이러스의 양은 희망하는 항원 반응을 달성할 수 있는 양에 충분히 도달된다.
반면에, 불활성화된 바이러스 백신은 활성 바이러스보다 더 높은 농도의 바이러스를 요구하게 되는데, 일반적으로는 동일한 항원 활성을 달성하기 위하여 10배 정도 더 높은 농도를 필요로 한다. 이는 왜냐하면, 백신이 투여되는 시점에 면역 반응을 일으키는 데 요구되는 전체 항원의 양이 존재하게 되도록 바이러스의 복제능이 제거되도록 바이러스가 조작되었기 때문이며, 이에 따라 유기체가 보통은 바이러스를 복제하지 않고, 결론적으로 그 양은 증가되지 않기 때문이다.
한편, 생명공학 분야에서 중요한 진일보중 하나는 재조합 백신을 사용하는 것이다. 유기체의 DNA 특정 단편을 유전자 크기로 분리 및 스플라이스 (또는 재조합)하여, 이들을, 보호 항체 형성을 유발할 수 있는 항원 생성을 촉진하도록 벡터 또는 DNA 플라스미드를 사용하여 다른 개체로 전달할 수 있는 능력은, 새로운 백신이 도입되게 하였다. 이 재조합 기술은, 높은 돌연변이능 때문에 활성 전바이러스 사용 가능성이 없고, 불활성화된 전바이러스의 사용은 불활성화 과정이 적절히 수행되지 않은 경우의 위험을 항상 안고 있는 것 등의 통상의 백신의 단점과는 대조적으로, 전술한 AI 등의 질병과 관련하여 매우 중요한 장점을 제공한다. 활성 형태의 재조합 백신은 해당 질병에 대항하여 항원을 발현시키도록 하는 필요한 뉴클레오타이드를 삽입한 것으로서, 이는 낮은 병원성 질병의 활성 바이러스 벡터로, 호흡기 점막 수준으로 국소적인 면역을 일으키도록 안전하게 투여될 수 있는데, 이러한 점은 수반되는 위험 때문에 비재조합 생바이러스를 사용하여서는 불가능한 것이다.
재조합 백신의 다른 장점은 사용되는 바이러스 벡터가 보통은 그들이 보호하는 질병에 대응하지 않는 점인데, 이로 인하여, DIVA로서 알려져 있기도 한, 감염된 동물로부터 백신 처리된 동물을 구분시키는 타입의 척추 동물 진단 및 예방 기술 분야에서 사용하는 것이 용이하게 된다 (Capua, I et al., "Development of a DIVA (differentiating infected from vaccinated animals) strategy using a vaccine containing a heterologous neuraminidase for the control of avian influenza" Avian Pathology 32(1) pp. 47-55).
현재까지는 백신은 AI (오일 중에 에멀젼화된 형태로서, 불활성화된 전바이러스) 및 기타의 유사 질병을 통제하기 위하여, HPAIV에 의하여 유발되는 폐사를 예방하기 위하여 사용되어 왔지만, 조류에서 AIV의 감염 및 복제를 피하기 위하여 사용되어 온 것은 아니므로, 바이러스 배출 및 확산 감소는 부분적으로 달성되어 왔을 뿐이었다.
그러므로, 조류 인플루엔자 등의 통제가 어려운 질병의 항원성 자리를 코딩하는 삽입된 유전자를 가지는 바이러스 벡터는 뉴캐슬병 등 낮은 병원성 질병으로부터 선행 기술에서 개발되어 왔다. 이러한 것들은 문헌 [Ge, Deng, Tian et al. "Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice", J. Vir. Vol. 81, No. 1, p. 150-158]에 기재되어 있고, 여기에서는 활성 형태의 재조합 백신을 기재하고 있다. 특히, 상기 문헌은 조류 인플루엔자 서브타입 H5N1 유전자를 가지는 LaSota 균주를 사용한 임상 시험의 결과를 나타내고 있다.
동일한 분야의 문헌으로서, 다음 문헌 [Park, Man Seong et al. "Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian Influenza and Newcastle disease", PNAS Vol. 103, No. 21, May 12, 2006 p. 8203-8208]이 있다. 상기 문헌은 '앵커링 (anchoring)'이라고 부르는 조류의 인플루엔자 유전자 발현 증가 기술에 관한 것이다.
일부 재조합 백신은 전술한 장점 때문에 활성 바이러스 백신을 대체하고 있지만, 재조합 백신은 아직까지 불활성화된 전바이러스 백신의 장점에 이르지는 못하였고, 전술한 바와 같이, 재조합 백신은 삽입된 외생성 유전자에 관하여 적절한 면역성을 제공할 수 없다. 그 이유는, 주로 전술한 인플루엔자와 뉴캐슬 등의 재조합 백신은 두 가지 질병 모두에 대하여 항원 활성을 유발시키지만, 벡터에 삽입된 외생성 항원 자리의 더 높은 노출을 요구한다는 사실 때문이다. 결과적으로, 전술한 인플루엔자 경우에서와 같이, 바이러스 벡터 중의 항원 발현을 더욱 증가시키는 앵커링 등의, 유전자 변형을 이용한 기술 개발을 고안하여 왔다. 그러나, 이러한 기술은 완전히 성공적이지는 못하였다.
그러므로, 활성 바이러스로부터의 재조합 백신은, 해당 미생물의 항원 자리의 적당한 노출을 달성시킬 목적으로, 사용되는 바이러스 벡터에 해당하는 활성 바이러스로부터의 비재조합 백신에 대하여 사용되는 것보다 약 10배 더 높은 바이러스 농도로 제형된다.
마찬가지로, 재조합 백신은 불활성화된 형태로 사용되지 않았는데, 왜냐하면 불활성화된 형태는 보통의 바이러스에 요구되는 것보다 100배 더 높은 바이러스 벡터 농도 (재조합 활성 바이러스보다 10배 더 높은 농도)를 달성하는 것을 의미하기 때문이며, 이는 산업 규모로는 매우 복잡해질 수 있기 때문이다. 결과적으로, 일반적으로 이들 재조합 활성 바이러스 백신은 안정성의 제한 때문에, 그리고 에멀젼은 활성 바이러스 벡터의 활발한 특징 때문에 유리하지 않다는 사실 때문에 에멀젼으로서도 사용되지 않았다.
요컨대, 전술한 내용으로부터, 적절한 통제 및 효능을 가능하게 하면서, 생성된 백신에서 더 높은 안정성이 달성될 수 있도록 하는 안전하고 효율적인 방식으로, 재조합 기술에 의한 다양한 질병에 대항하는 백신이 절실히 필요함을 알 수 있을 것이다.
본 발명을 발명하는 데 있어서, 해당 질병의 항원 자리를 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 재조합 불활성화된 바이러스 벡터와, 약학적으로 허용 가능한 에멀젼화된 비히클, 보조제 또는 부형제를 포함하는 백신은, 동일한 바이러스 벡터에 근거한 재조합 활성 바이러스 백신에 대해 요구되는 것과 유사한 바이러스 벡터 역가를 사용함으로써 해당 질병에 대한 보호를 제공할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
본 발명의 실시 상태에 있어서, 외생성 뉴클레오타이드 서열은 인플루엔자, 감염성 후두기관염, 감염성 기관지염, 파브리시우스 낭 감염 (Gumboro), 간염, 바이러스성 비기관염, 감염성 비염, 미코플라즈마 히오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumonieae), 파스투렐라병, 돼지 호흡기 생식기 증후군 (PRRS), 써코바이러스 (circovirus), 보데텔라 폐렴 (bordetellosis), 파라인플루엔자, 또는 해당 바이러스 벡터로 삽입을 허용하는 크기의 다른 항원에 대한 항원 자리 서열로부터 선택된다. 좋기로는, 조류 인플루엔자, 후두기관염, 감염성 기관지염, 파브리시우스 낭 감염 (Gumboro), 간염, PRRS, 및 써코바이러스로부터 선택된 항원이 사용된다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA)를 코딩하는 유전자로 이루어지는 외생성 뉴클레오타이드는, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 16 서브타입 또는 면역원성 변이체로부터 선택되고, 이는 더욱 좋기로는 상기 단백질의 서브타입 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 중 적어도 하나를 코딩한다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 단백질 H5 유전자는 멕시코 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N2로부터 얻거나, 또는 아시아 유래 서브타입 H5N1으로부터 얻는데, HPAIV 서브타입 H5N2에 의하여 유도되는 폐사율에 대하여 상기 모든 서브타입의 양호한 보호가 관찰되었다.
본 발명의 바이러스 벡터에 관하여, 뉴캐슬병 바이러스 (rNDV)는, 삽입된 외생성 뉴클레오타이드 서열을 가지는 바이러스 벡터에 해당하는 것인 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 좋기로는 백신 (vaccinal) 균주, 가령, LaSota, Ulster, QV4, B1, CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30, 또는 VGGA로부터 선택되거나, 또는 뉴캐슬병 유전자 군 I 내지 V로부터의 균주로부터 선택된다. 좋기로는, 재조합 바이러스는 LaSota 균주 (rNDV/LS)이다.
마찬가지로, 바이러스 벡터가 아데노바이러스인 특정 실시 상태에 있어서, 아데노바이러스는 조류 아데노바이러스 및 돼지 아데노바이러스로부터 선택되고, 더욱 좋기로는, 조류 아데노바이러스 타입 9 (rFAdV/9) 및 돼지 아데노바이러스 타입 5 (rSAdV/5)로부터 선택된다.
아래에 서술된 결과에 따르면, 본 발명을 통하여, 에멀젼 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 보조제 중의 재조합 불활성화된 바이러스 백신을 제조하기 위하여, 바이러스 벡터 중에서, 해당 질병의 구체적인 항원 결정부를 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열을 사용하는 것이 가능하다는 결론을 내릴 수 있다.
본 발명의 백신 (rNDV/LS-H5)으로 달성 가능한 결과는 예상 밖의 것이었는데, 왜냐하면 기존에는 바이러스 벡터 형태의 재조합 백신의 경우에, 적당한 면역 반응을 자극하기 위하여 재조합 단백질 발현을 충분히 수행하기 위하여 호스트 세포에서 바이러스 벡터 복제가 요구되는 것으로 여겨져 왔지만, 본 발명의 경우에는, 얻어진 결과가, 해당 질병의 항원 단백질이 벡터 바이러스 표면에서 적절하고 충분히 발현되어, 불활성화 형태의 벡터 바이러스의 존재만으로도 상기 해당 질병에 대한 적당한 항원 및 보호 반응을 가능하게 한다는 것을 증명하였기 때문이다.
특히, 조류 인플루엔자 등의 통제하기 어려운 고병원성 질병의 경우, 본 발명의 재조합 백신의 장점은 전바이러스를 사용하지 않아서, 백신 바이러스의 부적절한 불활성화로부터 아웃브레이크 (outbreak)될 위험을 감소시킨다는 점이다. 더욱이, 본 발명의 백신은 백신 (vaccinal) 또는 야생형 (field-type)인 전바이러스와 접촉한 조류에 의하여 유도되는 면역 반응으로부터, 특정 실험실 시험을 통하여 구분될 수 있는 조류의 호흡기 점막 수준에서 국소적인 면역 반응 뿐만 아니라 전신 수준에서 면역 반응을 달성하는데, 이는 전염병 분야에서 중요한 장점을 나타낸다.
백신은 피하 투여되도록 제형된다. 그러나, 근육내 투여 또는 피부내 투여 등의 다른 전신 경로도 성공적으로 사용될 수 있다. 백신에 대한 액체 비히클이 사용되어도 좋은데, 더욱 좋기로는, 유중수 에멀젼이 사용되지만, 다른 종류의 면역 반응 보조제 또는 변형제를 사용하는 것도 성공적이다.
본 발명의 재조합 백신을 사용하면, 야생형 바이러스가 환경으로 배출되는 것이 감소됨으로써, 바이러스 전염을 현저히 감소시키는 데 기여하게 된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 특허청구범위에 기재하기로 한다. 그러나, 본 발명의 백신 및 이의 목적 및 장점은 첨부된 도면을 참조로 하여, 이하 발명의 상세한 설명 및 특정 실시 상태로부터 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 벨로제닉 NDV (VNDV)로 챌린지 (challenge)함으로써 생성된 실시예 6A로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 2는 고병원성 AI 바이러스 (HPAIV) 서브타입 H5N2로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6A로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 3은 VNDV로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6B로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 4는 HPAIV 서브타입 H5N2로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6B로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 5는 VNDV로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6C로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 6은 HPAIV 서브타입 H5N2로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6C로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 7은 VNDV로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6D로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
도 8은 HPAIV 서브타입 H5N2로 챌린지함으로써 생성된 실시예 6D로부터의 폐사율 (M) 및 이병율 (MI)을 도시한 그래프이다.
본 발명에서는, 해당 질병에 대하여 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 불활성화된 바이러스 벡터와, 약학적으로 허용 가능한 비히클, 보조제 또는 부형제를 포함하는 백신은, 동일한 바이러스 벡터를 기반으로 한 활성 바이러스 백신에 요구되는 것과 유사한 바이러스 벡터 역가를 사용함으로써 해당 질병에 대한 보호를 제공하게 된다는 것을 예상 밖으로 증명하였다.
본 발명에 있어서는, 바이러스 벡터가 불활성화되는 것이 필수적인데, 여기서 불활성화된다는 것은 바이러스 벡터로서 작용하면서도, 해당 질병의 항원 자리에 대하여 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 것인 재조합 바이러스가 이의 복제능을 손실한 것을 말한다. 불활성화는 이 기술 분야에 잘 알려져 있는 물리적 또는 화학적 절차에 의하여 달성되는데, 좋기로는 포름알데히드 또는 베타-프로피오락톤을 사용한 화학적 불활성화법이 사용된다 (Office International des Epizooties (2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p. 576-589). 반대로, 살아있는 (또는 활성인) 바이러스란, 이의 복제능을 유지하고 있는 것을 말한다.
좋기로는 아데노바이러스 또는 파라믹소바이러스로부터 선택되는 바이러스 벡터를 불활성화하고, 해당 질병의 항원 자리 1개 이상에 대하여 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열을 삽입하는데, 좋기로는 인플루엔자, 감염성 후두기관염, 감염성 기관지염, 파브리시우스 낭 감염 (Gumboro), 간염, 바이러스성 비기관염, 감염성 비염, 미코플라즈마 히오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumonieae), 파스투렐라병, 돼지 호흡기 생식기 증후군 (PRRS), 써코바이러스, 보데텔라 폐렴, 파라인플루엔자, 또는 해당 바이러스 벡터로 삽입을 허용하는 크기의 다른 항원에 대한 항원 자리 서열로부터 선택되는 1개 이상의 질병의 항원 자리에 대하여 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열을 삽입한다. 더욱 좋기로는, 조류 인플루엔자, 후두기관염, 감염성 기관지염, 파브리시우스 낭 감염 (Gumboro), 간염, PRRS, 및 써코바이러스로부터 선택되는 항원이 사용된다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 외생성 뉴클레오타이드 서열은 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA)을 코딩하는 유전자로 이루어지는데, 상기 유전자는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 16 서브타입 또는 면역원성 변이체로부터 선택되며, 더욱 좋기로는 상기 단백질의 서브타입 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 중 하나 이상을 코딩한다.
본 발명의 바이러스 벡터에 관하여, 뉴캐슬병 바이러스 (rNDV)가 바이러스 벡터에 해당하고, 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 좋기로는 백신 균주, 가령, LaSota, Ulster, QV4, B1, CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30, VGGA 균주로부터 선택되거나 또는 뉴캐슬병 유전자군 I 내지 V으로부터의 균주로부터 선택된다. 좋기로는, 재조합 바이러스는 LaSota 균주 (rNDV/LS)이다.
마찬가지로, 바이러스 벡터가 아데노바이러스인 실시 상태에 있어서, 상기 아데노바이러스는 조류 아데노바이러스 및 돼지 아데노바이러스로부터 선택되고, 더욱 좋기로는, 조류 아데노바이러스 타입 9 (rFAdV/9) 및 돼지 아데노바이러스 타입 5 (rSAdV/5)로부터 선택된다.
항원 자리에 관해서는, 인플루엔자가 해당 질병인 경우, 조류 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 단백질에 해당하는 항원 자리가 바람직하고, 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유전자를 얻는 것으로서, 존재하는 16가지 서브타입 중 어느 하나, 좋기로는 H5, H7 및 H9를 코딩하는 것, 좋기로는 서브타입 H5를 코딩하는 것이 좋은데, H5는 좋기로는 아래에 서술하는 Bive, 435 및 Viet (VT) 균주로부터 얻은 것이 좋다. 이와 관련하여, HA 서브타입 H5를 코딩하는 유전자 급원 균주는 본 발명에 있어 중요하지 않다는 것을 추론 가능한데, 왜냐하면 실험 결과는, 어떠한 균주라도 본 발명의 목표를 달성하기 위하여 유용한 유전자 물질을 제공할 수 있다는 것을 증명하였기 때문이다.
양호한 유전자 급원에 관해서는, Bive 균주로부터의 H5-유전자는 1994년에 멕시코에서 영계 (broiler) 생물학적 샘플로부터 분리되었고, 멕시코 정부로부터 (A/chicken/Mexico/232/CPA)로 확인된 LPAIV-H5N2에 해당하는 것임을 말할 필요가 있다. 상기 바이러스 균주는 "Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion (SAGARPA, by its Spanish acronym)"로부터, 에멀젼화된 불활성화 백신의 제조에서의 사용에 관하여 승인받았고, 따라서, 해당 유전자와 이 바이러스의 재조합은 본 발명의 재조합 백신의 생물학적 안정성을 보장한다.
H5-435-유전자인 양호한 제2 유전 물질 급원에 관하여, 이는 LPAIV-H5N2의 분리체로부터 얻어진 것으로서, 2005년에 멕시코에서 영계 생물학적 샘플로부터 분리된 것이다.
본 발명의 백신의 바이러스 벡터는, 해당 뉴클레오타이드 서열의 PCR 증폭과, 아데노바이러스 또는 파라믹소바이러스로부터 좋기로는 선택된 오리진 병원체의 분리체로부터 바이러스 벡터로 삽입되어 증폭될 분리된 항원 자리를 동정하는 것에 의하여 제조될 수 있다. 삽입은 제한 효소 및 DNA 리가아제 등의 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 이루어진다. 이렇게 하여 제조된 감염성 클론은 바이러스 벡터에 따른 재조합 바이러스의 제조를 위하여 세포주에 도입된다.
바이러스 벡터의 성질에 따라서, 임의의 적당한 생장 시스템, 가령 SFP 닭의 배아 또는 시판 세포주, 또는 바이러스 생장을 위하여 구체적으로 디자인된 것 중에서 바이러스는 복제하게 된다.
항원 반응을 수행하기 위하여 요구되는 바이러스 농도에 도달하면, 좋기로는 사용되는 바이러스 벡터에 따라 102 내지 1010 DI50%/ml에서, 바이러스 불활성화가 진행된다. 좋기로는, 이러한 불활성화는 이 기술 분야에 잘 알려져 있는 물리적 또는 화학적 절차에 의하여 수행되는데, 좋기로는 포름알데히드 또는 베타-프로피오락톤으로의 화학적 불활성화에 의하여 수행된다.
본 발명의 백신을 위한 약학적으로 허용 가능한 비히클은 좋기로는 수용액 또는 에멀젼이다. 더욱 좋기로는, 유중수 에멀젼 비히클을 사용하는 것이 좋다. 백신에 특이적인 제형은 사용되는 바이러스 벡터에 따라 달라질 뿐만 아니라, 삽입되는 외생성 뉴클레오티드 서열에 따라서도 달라진다. 그러나, 바이러스 벡터가 뉴캐슬병 바이러스인 양호한 실시 상태에 있어서, 양호한 양은 104 내지 1010 DIEP50%/ml이다. 아데노바이러스가 바이러스 벡터인 실시 상태에 있어서, 양호한 양은 102 내지 108 DIEP50%/ml이다.
백신 투여에 관해서는, 이는 좋기로는 조류의 뒷목덜미 중간에 피하 주사하는 것이 좋다. 본 발명의 백신은 영계, 알낳는 닭, 생식용 조류, 칠면조, 투계, 뿔닭 (Guinea fowls), 자고새 (partridges), 메추라기, 오리, 거위, 백조 또는 타조 등의 가금류에게 투여된다. 좋기로는 백신은 어떤 연령의 조류이든 피하 투여되지만, 특정한 경우에는 근육내 투여될 수 있다.
백신이 에멀젼화된 뉴캐슬 벡터 형태로 닭에게 투여되는 경우, 백신은 좋기로는 닭 한마리당 108 내지 109 DIEP50%/0.5ml를 함유하고, 더욱 좋기로는 백신은 닭 한마리당 108.5 DIEP50%/0.5ml를 함유한다. 닭 백신처리는 10일령 닭에게 손쉽게 할 수 있다.
본 발명은 매우 중요한 경쟁적인 이점을 제공한다. 본 발명의 재조합 불활성화 백신은 바이러스 벡터에, 통제하기 어려운 병원체로부터 분리된 유전자가 삽입된 것인 재조합 백신을 독점적으로 사용하는 백신 접종 프로그램을 설계하는 것을 가능하게 하였으며, 그 결과, 질병 통제 및 박멸에 유용한 단 하나의 백신을 수여 받은 동물로부터 감염된 동물을 확인하는 방법 (DIVA)을 가능하게 한다. 한편, 그 방법은
a) 병원체에 의하여 유발되는 질병의 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 불활성화된 바이러스 벡터의 재조합 백신을 투여받은 1마리 이상의 동물의 1개 이상의 샘플을, 상기 샘플 중에 상기 항원에 대응하는 항체가 존재하는지를 검출하기 위하여, 제1 항체 검출 방법에 도입하는 것과,
b) 제1 항체 검출 방법에 도입되었던 샘플과 동일한 1종 이상의 동물 샘플을, 상기 샘플 중에 질병을 일으키는 병원체에 대응하는 항체가 존재하는지를 검출하기 위하여, 제2 항체 검출 방법에 도입하는 것과,
c) 제1 항체 검출 방법 및 제2 항체 검출 방법의 결과로부터 동물이 감염되었는지 또는 백신 처리되었는지를 측정하는 것을 포함한다.
예컨대, 병원체가 통제하기 어려운 경우, 가령 AIV의 경우, 주로 H5 및 H7은 가금류에서 높은 폐사율을 유발하는데, 본 발명의 재조합 불활성화 백신을 사용하면, 탁월한 전신 수준의 보호가 달성되며, 이는 곧 적절히 불활성화되지 않은 경우에 심각한 위험을 안고 있는 AI 전바이러스의 사용에 비하여 높은 수준의 생물학적 안정성을 제공하는 것이다. 상기 위험은 바이러스가 생바이러스인 (활성인) 제조 과정에서 증가된다. 본 발명은 또한 전바이러스에 노출된 다른 조류로부터 백신 처리된 조류를 전염병학적으로 구분해 내는 것을 가능하게 하는데 (DIVA 시스템), 왜냐하면 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 유전자만이 삽입된 경우, 조류 인플루엔자에 대한 백신 유도된 항체를 검출하는 데 사용된 실험실 시험은 헤마글루티네이션 억제 (hemagglutination inhibition; HI)이기 때문이다. 현재의 면역학적 시험법, 가령, ELISA와, 아가 겔 확산법 등의 다른 시험법은 본 발명의 재조합 백신에 의하여 유도된 조류 인플루엔자에 대한 항체 검출에 반응을 보이지 않는데 (negative), 왜냐하면 이들은 전바이러스에 함유된 다른 종류의 항원에 의하여 유도된 항체를 검출하도록 디자인되어 있기 때문이다. 본 발명의 재조합 백신으로 백신 처리한 조류가 야생형 바이러스로 감염된 경우에, 이들 시험은 조류 인플루엔자에 대한 항체 검출에 반응을 보임으로써, 감염된 조류를 구분할 수 있게 된다.
또한, 본 발명은 불활성 및 활성 형태 재조합 백신을 독점적으로 사용하는 조인트 (joint) 프로그램을 개발하게 하여 주는데, 첫번째로, 전술한 전신 면역을 제공하고, 재조합 활성 백신은 점막 수준에서 면역화를 수행하여, 야생 수준에서 100%에 가까운 보호를 제공하게 될 것이다. 이러한 프로그램에서는, 전술한 DIVA 시스템이 사용된다.
에멀젼화된 불활성화 백신의 재조합 벡터가 VNDV 및 HPAIV 양자로 챌린지된 뉴캐슬과 삽입된 인플루엔자 유전자의 조합인 본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 이는 동일한 벡터와 항원을 함유하는 활성 백신을, 눈 경로를 통하거나 분무함으로써, 호흡기 점막으로 직접, 또는 물을 마시게 함으로써 동시에 투여할 수 있고, 이로써 국소적인 수준의 반응이 매우 자극되어 (호흡기 및 소화관 점막), 분비 면역글로불린 타입 A (IgA)을 생성시키고, 이로 인해 야생형 바이러스 복제가 현저히 감소되고, 이에 따라 바이러스 방출 및 전파가 상당히 감소된다.
반면, 본 발명의 백신은 감염된 조류와 백신 처리된 조류를 구분해 냄으로써 통제 프로그램 및 박멸을 가능하게 하는데, 왜냐하면 이는 본 발명의 재조합 불활성화된 백신을 투여하였을 때, 재조합 백신은 항원으로서 AIV 헤마글루티닌만을 함유하고, ELISA 등의 진단 방법을 사용하면, 헤마글루티닌에 의하여 유도된 것뿐만 아니라 다른 바이러스 항원에 의하여 유도된 항체도 검출하는 것이 가능해 지기 때문에, 야생형 바이러스로 감염된 조류와 백신 처리된 조류를 구분해낼 수 있기 때문이다 (DIVA 시스템).
본 발명의 인플루엔자에 대한 재조합 백신은 다음의 상세한 설명에 의하여 더 명백히 설명할 것이지만, 이는 본 발명을 설명하고자 하는 목적이지 한정하고자 함은 아니다.
실시예
실시예 1
뉴캐슬- LaSota 벡터의 제조
뉴캐슬-바이러스 LaSota-균주 게놈을 클로닝함으로써 바이러스 벡터를 제조하기 위하여, 먼저 "pNDV/LS"라 불리는 중간 벡터를 제조하였다. 전바이러스 RNA 추출은 뉴캐슬-LaSota 균주에 대하여 트리아졸법으로 수행하였다. cDNA (상보적 DNA) 합성은 템플레이트로서 미리 정제해 둔 전체 RNA를 사용하여, 바이러스 게놈의 정제된 RNA로부터 수행하였다. 뉴캐슬 게놈 (15, 183 베이스 페어 (bp))으로부터 전체 유전자를 클로닝할 목적으로, "오버래핑 (overlapping)" 말단 및 점착성 (cohesive) 제한 자리를 가지는 7개의 단편을 PCR로 증폭시켰다. 단편 1 (F1)은 뉴클레오타이드 (nt) 1-1755을, F2는 nt 1-3321을, F3은 nt 1755-6580을, F4는 6,151-10,210을, F5는 nt 7,381-11,351을, F6은 11,351-14,995를, F7은 nt 14,701-15,186을 포함한다. 상기 7개 단편의 조합을 표준 연결 기술을 사용하여 pGEM-T라고 불리는 클로닝 벡터에서 수행함으로써, 뉴캐슬-LaSota 게놈을 재구성하였다. 클로닝 결과 P 및 M 유전자 사이의 단일 제한 자리 SacII가 있는데, 이는 이 벡터 바이러스 영역 중에서 해당 유전자를 클로닝시키기 위한 것으로 작용한다.
실시예 2
AIV 서브타입 H5N2 435 균주 435로부터의 HA -유전자 클로닝
AIV 435 균주의 HA-유전자를 클로닝하기 위하여 바이러스의 전체 RNA 추출은 트리아졸법으로 수행하였다. 이 정제된 전체 RNA를 cDNA (상보적 DNA)를 합성하는 데 사용하였으며, AI 바이러스로부터 HA 유전자를 특정 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR 기술로 증폭시켰다. 435로부터의 HA 유전자를 표준 클로닝 기술을 사용하여 pGEM-T 벡터로 삽입하여, 플라스미드 p-GEMT-435를 제조하였다.
실시예 3
pNDV / LS 벡터의 SacII 자리내에 AI 435의 HA 유전자를 클로닝하여 , 플라스미드 pNDV / LS -435를 제조함
A. pSacIIGE / GS 중간체 벡터 제조:
pSacIIGE/GS라고 불리는 새로운 중간체 벡터를 제조하여, HA 435 유전자의 5' 말단에 GE/GS라고 불리는 뉴캐슬로부터의 전사 인자를 도입하였다. 이때에 서열 GE/GS의 PCR 초기 증폭을 사용하였고, 템플레이트로서 뉴캐슬 게놈을 사용하였으며, 나중에 이들 서열을 pGEM-T 내에 삽입하였다.
B. pSacIIGE / GS 벡터에 HA 유전자를 서브클로닝
플라스미드 pGEMT-435를 Hpal-Ndel로 분해 (digestion)하고, pSacIIGE/GS로 더 클로닝하여, 플라스미드 pSacIIGE/GS-HA435를 제조하였다.
C. GE / GS - HA435 를 pNDV - LS 벡터로 서브클로닝
두 개의 플라스미드,즉 pSacIIGE/GS-HA435 및 pNDV/LS를 SacII로 분해하고, 분해 산물을 정제하고, GE/GS-HA435 영역을 정제한 다음에, pNDV/LS의 SacII 자리에 삽입함으로써, pNDV/LS-435라고 불리는 감염성 클론을 제조하였다.
실시예 4
세포 배양액 중 재조합 바이러스 rNDV / LS - HA435 의 제조
Hep-2 및 A-549 세포를 감염 지수 (infection multiplicity; MOI) 1에서 MAV-7 바이러스로 초기 감염시켰다. 37℃에서, 5% CO2 분위기 중에서, 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 클론 pNDVLS-435의 1 마이크로그램 (㎍) DNA와, 두 가지 세포 타입을 재조합하기 위하여 필요한 바이러스 단백질 P, NP 및 L을 코딩하는 것인 발현 플라스미드인 pNP, pP 및 pL로부터의 0.2 ㎍ DNA와 함께 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 12시간 후, 양쪽 세포 타입에서 생성된 재조합 바이러스를 수확하고, 이를 10일령 SPF 닭의 배 (embryo)에 주사하여 생성된 바이러스를 증폭시켰다. 48시간 후 수확된 알란토이드 (allantoid) 액체를 베로 셀 (Vero Cell)에서 플레이트 어세이 (plate assay)함으로써 적정하였고, 이로써 백신 제조에 사용될 최종 재조합 바이러스가 생성되었다.
Bive 및 Viet 균주로부터 얻은 유전자를 가지는 재조합 바이러스도 역시 전술한 바와 같이 제조하였다.
실시예 5
조류 인플루엔자 바이러스로부터의 H5 삽입체를 가지는 뉴캐슬- LaSota 재조합 바이러스인 rNDV / LS - H5 를 사용하여 에멀젼화된 불활성화된 백신을 제조하는 방법
항원 제조
제조용 씨드 (seed)로부터 출발하여, 특정한 병원체가 없는 (free from specific pathogens; SPF)) 부화된 계란에 소정의 감염량을 주사하였다. 배를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 날마다 폐사율을 확인하였다. 이 기간 후에, 살아 있는 배를 하루 내지 이틀, 좋기로는 24시간 냉장고에 보관하고, 아미노알란토이드액 (스페인어로는 FAA)을 흡입하여 수확하였다. FAA를 원심분리하여 정제하고, 포름알데히드를 사용하여 불활성화시켰는데, 이때 이러한 종류의 백신의 제조에 일반적으로 사용되는 다른 불활성화제도 사용될 수 있다. 불활성화, 순도, 멸균 및 DIEP 및 HA 모두에 대한 역가를 확인하기 위하여 FAA를 시험하였다.
에멀젼 제조
백신을 유중수 타입 에멀젼으로 제조하였다. 미네랄 오일 및 계면활성제 타입 Span 80 및 Tween 80을 오일상으로 사용하였다. 수성상을 제조하기 위하여, FAA를 보존액 (티메로살)과 혼합하였다. 에멀젼을 제조하기 위하여, 꾸준히 저으면서 수성상을 오일상에 서서히 가했다. 호모게나이저 및 콜로이달 밀 (colloidal mill)을 사용하여 특정 입자 크기에 도달하도록 하였다.
항원 함량
백신을 조류 1마리당 0.5 ml의 용량이 사용될 수 있도록, 최소 108.5 DIEP50%/0.5ml을 생성하도록 제형하였다.
전술한 절차를 바탕으로, 6개의 재조합 백신을 제조하였다. 그 중 세개는 AI 바이러스에 대한 HA 앵커링과 함께, 뉴캐슬-LaSota 균주 벡터 (rNDV/LS)를 가지는 것으로서 (Rd)라고 명명하였고, 나머지 세 개는 같은 벡터이지만 앵커링이 없는 것으로서 (Re)라고 명명하였다. Rd 및 Re 게놈 각각을 아래에 서술되는 세 개의 상이한 HA-유전자로 클로닝하여, 6개의 백신을 얻었다.
1. H5-Bive 유전자: LPAIV 서브타입 H5N2 균주 (A/chicken/Mexico/232/CPA)로부터 얻은 것이고, 1994년에 멕시코에서 영계 생물학적 샘플로부터 분리된 것으로서, 에멀젼화된 불활성화 백신을 제조하기 위하여 SAGARPA에 의하여 승인받은 바이러스 균주에 해당
2. H5-435 유전자: HPAIV 서브타입 H5N2의 분리체로부터 얻은 것이고, 2005년도에 멕시코에서 영계 생물학적 샘플로부터 분리된 것. 435 균주는 Bive 균주로 헤마글루티닌 억제 (HI) 시험한 것에서 상이한 항원 특징을 나타내었으며, 뉴클레오타이드 서열에서 중요한 변화를 나타내었다.
3. H5-Vt 유전자: 이 유전자는 베트남에서 분리된 것이고, AI 바이러스 서브타입 H5N1의 H5 유전자에 해당하는 것이다.
실시예 5A
에멀젼화되고, 불활성화되었으며, 재조합이고, 앵커링된 (Rd) 것으로서, (rNDV/LS) 벡터 중의 H5-Bive 유전자인 실험용 백신을 실시예 5에 기술된 방법에 따라, 물/오일 약학 제형으로서 제조하였으며, 이를 Emi Rd-Bive라고 명명하였다.
실시예 5B
에멀젼화되고, 불활성화되었으며, 재조합이고, 앵커링된 (Rd) 것으로서, (rNDV/LS) 벡터 중의 H5-435 유전자인 실험용 백신을 실시예 5에 기술된 방법에 따라, 물/오일 약학 제형으로 제조하였으며, 이를 Emi Rd-435라고 명명하였다.
실시예 5C
에멀젼화되고, 불활성화되었으며, 재조합이고, 앵커링된 것으로서, (rNDV/LS) 벡터 중의 H5-Vt 유전자인 실험용 백신을 실시예 5에 기술된 방법에 따라, 물/오일 약학 제형으로 제조하였으며, 이를 Emi Rd-Vt라고 명명하였다.
실시예 5D
에멀젼화되고, 불활성화되었으며, 재조합이고, 앵커링되지 않은 것으로서, (rNDV/LS) 벡터 중의 H5-Bive 유전자인 실험용 백신을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 물/오일 약학 제형으로 제조하였으며, 이를 Emi Re-Bive라고 명명하였다.
실시예 5E
에멀젼화되고, 불활성화되었으며, 재조합이고, 앵커링되지 않은 것으로서, (rNDV/LS) 벡터 중의 H5-435 유전자인 실험용 백신을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 물/오일 약학 제형으로 제조하였으며, 이를 Emi Re-435라고 명명하였다.
실시예 5F
에멀젼화되고, 불활성화되었으며, 재조합이고, 앵커링되지 않은 것으로서, (rNDV/LS) 벡터 중의 H5-Vt 유전자인 실험용 백신을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 물/오일 약학 제형으로 제조하였으며, 이를 Emi Re-Vt라고 명명하였다.
실시예 6
AI 바이러스 HA 유전자를 앵커링 하거나, 또는 앵커링하지 않은 ND - LaSota 벡터를 사용한 재조합 백신에 대한 인 비보 ( in vivo ) 효능 측정
본 발명의 에멀젼화된 재조합 불활성화 백신의 효능을 측정하기 위하여, 상이한 항원 서브타입 및 AI 바이러스의 변이체로부터의 여러 가지 클로닝된 헤마글루티닌 유전자를 사용하여 제조된 것임을 입증하고, SPF 조류에서, 또한 한편으로는 AIV 및 NDV에 대한 선천성 (parental) 면역을 가지는 시판용 영계에서의 HPAI 바이러스 서브타입 H5N2 및 VNDV에 의하여 유발되는 폐사율을 예방하는 것에 대한 이들의 효능을 시험하였다.
백신 효능을 측정하기 위한 상이한 챌린징 시험에 사용되는 균주는 다음과 같다.
1. 조류 인플루엔자 (HPAIV-H5N2): 고병원성 바이러스 서브타입 H5N2, A/chicken/Queretaro/14588-19/95 균주, 역가 108.0 DIEP50%/ml, 100 DLP50%/0.3ml/chicken에 상응
2. VNDV 바이러스: 106.5 DIEP50%/0.03ml/chicken에 상응하는 108.0 DIEP50%/ml를 함유하는 칠말후아칸 (Chimalhuacan) 균주
생물안전성 (biosafety) 레벨 3인 아크릴 분리 캐비넷에서, INIFAP-CENID-Microbiology의 분리 장치에서 챌린지를 35일령 닭 (백신 처리후 (day post vaccination; DPV) 21일째)에 수행하였다. 챌린지를 위하여, 각 실험군을 2개의 하위군으로 나누었고, 각 하위군을 소정의 생물안전성 절차에 따라 해당 분리 장치에 할당하였다.
HPAIV-H5N2를 pH 7.2에서 PBS로 1:10 비율로 희석시키고, 0.06 ml (2 방울)를 각 닭의 양쪽 눈에 투여하였고, 0.09 ml (3방울)을 각 콧구멍에 투여하였는데, 이 양은 0.3 ml 또는 100 DLP50%에 상응하는 양이다.
106.5 DLP50%/조류 1마리에 상응하는 양인 108.5 DIEP50%/ml를 함유하는 바이러스 현탁액 0.03 ml를 닭의 각 눈에 투여함으로써, VNDV 바이러스 챌린지를 수행하였다.
챌린지 후 (post-challenge; PC) 측정에 있어서, 모든 군을 날마다 임상적 징후 심각도를 비롯한 폐사율 및 이병율에 대하여 확인하여 기록하였다. 각 군에서 챌린지 후 (PC day, DPC) 매일 개별적으로 조류를 모니터링하고, 이를 표 1에 나타낸 항목에 따라 수치 값을 할당하였다.
[표 1]
Figure pct00001
OIE에 의하여 제안되는 지침에 따라, VNDV에 대한 PC 측정을 14일간 수행하고, HPAIV-H5N2에 대한 PC 측정을 10일간 수행하였다.
각 군에 대한 이병율 (Morbidity index; MI)은 관찰 기간 PD 동안에 더욱 심각한 임상 징후를 나타내는 날에 해당하는 데이터로부터 얻은 방정식에 의하여 계산된다.
MI = (A)(100)/B
(상기 식 중, A는 관찰일에 심각한 외상에 대한 모든 개체의 수치의 합을 나타내고, B는 1일 동안 가능한 중증 임상 상태의 최대값을 나타낸다).
실험은 아래에 서술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 6A
백신 처리후 21일째에, SPF 조류군에서 VNDV 및 HPAIV-H5N2로 챌린지를 수행하였는데, 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 5A (Emi Rd-Bive), 5B (Emi Rd-435) 및 5C (Emi Rd-Vt)에 따라 얻은 본 발명의 불활성화된 백신을 사용하여 면역화하였다. 비교 목적으로, 2개의 다른 군을 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병에 대한 에멀젼화된 시판 백신 2개로 면역화하였다. 상기 시판 백신은 에멀젼화된 불활성화 전바이러스로부터 제조된 것으로서, 각각 E. ND/AI-435 및 E. ND/AI-Bive로 명명되는 것이었다.
[표 2]
앵커링이 있는 (Rd) 재조합 바이러스 rNDV/LS-H5로 제조된 불활성화된 백신으로 면역화한 SPF 조류에서의 효능
Figure pct00002
VNDV 및 HPAIV-H5N2에 대한 효능 결과는 각각 도 1 및 2에 그래프로 나타낸다.
결과는, 본 발명의 앵커링을 함유하는 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5는 VNDV 챌린지 바이러스에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 SPF 닭의 100% 보호를 제공할 수 있음을 나타낸다. 마찬가지로, 클로닝된 H5 유전자와는 관계없이, 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신은 HPAIV-H5N2에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 100%의 보호를 제공하는데 (도 2), 이는 ND 및 AI의 대조군에서 사용되는 전세계적으로 현재 승인받아 있는 전바이러스를 사용하여 제조된 통상의 불활성화 백신에 상응하는 값이다. 상기 통상의 불활성화 백신은 역가 108.6 DIEP50%/ml인 뉴캐슬병 LaSota 균주의 바이러스와, 역가 108.0 DIEP50%/ml인 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스를 제형 내에 포함하고, 포름알데히드 및 오일-에멀젼화 방법으로 화학적 불활성화된 것으로부터 제조된다. 보호 결과는 대조군 ND 및 AI에 사용하기 위한 멕시코 및 국제 표준을 만족하는 앵커링을 가지는 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5는, 즉 본 발명의 앵커링을 가지는 재조합 버젼은 성공적이었음을 나타내는 것이다.
실시예 6B
앵커링 효과를 측정하기 위하여 고안된 두 번째 시험에 있어서, SPF 조류의 각 군에 백신 처리 후 21일째에 VNDV 및 HPAIV-H5N2를 사용하여 챌린지하였는데, 이들은 표 3에 나타낸 바와 같이, 에멀젼화된 불활성화 전바이러스로부터 제조한 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병에 대한 2가지 시판 에멀젼화된 백신(E. ND / AI -435 및 E. ND / AI - Bive)과, 실시예 5D (Emi - Re - Bive), 5E (Emi - Re -435) 및 5F (Emi-Re-Vt)로부터 얻은 앵커링이 없는 본 발명의 3개의 에멀젼화된 불활성화 백신을 사용하여 면역화하였다.
[표 3]
앵커링이 없는 (Re) 재조합 바이러스 rNDV/LS-H5로 제조된 불활성화된 백신으로 면역화한 SPF 조류에서의 효능
Figure pct00003
VNDV 및 HPAIV-H5N2에 대한 효능 결과는 각각 도 3 및 4에 그래프로 나타낸다.
예상 외로, 결과는, 본 발명의 앵커링을 함유하지 않는 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5도 역시, VNDV 챌린지 바이러스에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 SPF 닭의 100% 보호를 제공할 수 있음을 나타낸다. 마찬가지로, 클로닝된 H5 유전자와는 관계없이, 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신은 HPAIV-H5N2에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 100%의 보호를 제공하는데, 이는 불활성화된 전바이러스 ND/AI-Bive 및 ND/AI-435를 사용하여 제조된 통상의 에멀젼화된 백신 및 앵커링이 있는 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5에 상응하는 것이다.
실시예 6A 및 6B의 결과는, HI 시험에서 상이한 오리진 및 항원 특성을 갖는 AIV H5 유전자 (H5N2 또는 H5N1)를 가지는 것으로서, 앵커링이 있거나 없는 벡터로제조된 재조합 불활성화된 백신은 HPAIV-H5N2로 챌린지한 것에 대하여 동일한 보호를 제공할 수 있는 것임을 나타낸다. 이 결과는 임의의 AIV H5 유전자를 사용하여 제조된 재조합 불활성화된 백신은 헤마글루티닌 H5를 가지는 인플루엔자 바이러스 서브타입중 어느 하나로 HPAIV를 챌린지한 것에 대하여 보호를 제공할 수 있고, 뉴라미니다제의 종류는 상관없음을 제시하는 것이다.
그러므로, 본 발명은 상이한 타입의 뉴라미니다제를 포함해도 효과적이며, 이는 기존의 불활성화된 전바이러스 백신에 대해서도 밝혀진 바와 일치하는 것임을 나타낸다. (Soto et al., Inactivated mexican H5N2 avian influenza vaccine protects chickens from the asiatic highly pathogenic H5N1 avian influenza virus. Proceedings of the 56th Western Poultry Disease Conference (WPDC). USA, p. 79. (2007) and Swayne, D. and Kapczynski, D. (2008). Vaccines , Vaccination and Immunology for avian influenza viruses in poultry . In Avian Influenza. Ed. By David Swayne. Blackwell Publishing, USA, p. 407-451).
실시예 6C
세 번째 실험은 야생 조건에서 자극하기 위하여 시판용 조류에서 본 발명의 백신을 시험하기 위하여 수행하였는데, 여기서 챌린지는 ND 및 AI에 대한 선천성 면역을 가지는 시판용 영계에서 백신 처리 후 21일째에 VNDV 및 HPAIV-H5N2를 사용하여 수행하였다. 상기 VNDV 및 HPAIV-H5N2는 표 4에 제시된 바와 같이 면역화하였는데, 즉, 에멀젼화된 불활성화 전바이러스로부터 제조된 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병에 대한 2개의 시판용 에멀젼화된 백신 (E. ND / AI -435, 및 E. ND / AI - Bive )과, 본 발명의 실시예 5A (Emi - Rd - Bive), 5B (Emi - Rd -435) 및 5C (Emi - Rd - Vt)에 따라 얻은 본 발명의 불활성화된 백신을 사용하였다.
[표 4]
앵커링 (Rd)이 있는 재조합 바이러스 rNDV/LS-H5로 제조된 불활성화된 백신으로 면역화한, ND 및 AI에 대한 선천성 면역이 있는 시판용 영계에서의 효능
Figure pct00004
VNDV 및 HPAIV-H5N2에 대한 효능 결과는 각각 도 5 및 6에 그래프로 나타낸다.
결과는, 본 발명의 앵커링이 있는 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5는, VNDV 챌린지 바이러스에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 ND 및 AI 바이러스에 대하여, 선천성 면역이 있는 시판용 영계에서 90% 이상에 상당하는 보호를 제공할 수 있음을 나타낸다 (도 5). 뿐만 아니라, 클로닝된 H5 유전자와는 관계없이, 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신은 HPAIV-H5N2에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 80% 이상에 상당하는 보호를 제공하는데, 이는 ND 및 AI를 통제하기 위하여 사용되는 불활성화된 전바이러스를 사용하여 제조된 기존의 에멀젼화된 백신에 상응하는 것이다.
보호 결과는, 본 발명의 앵커링이 있는 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5는, AI의 불활성화된 전바이러스로 제조된 기존의 백신에 의하여 제조된 것과 유사한 보호를 제공하면서, AI 및 ND 바이러스에 대한 선천성 면역이 있는 시판용 영계에서 HPAI를 통제하는 데 있어 성공적으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 다만, 추가의 장점은 재조합 활성 및 불활성화 백신을 단독으로 사용하면서, 생물학적 안정성을 완수하고, 백신 처리 프로그램 및 AI 확산의 방지를 동시에 허용하면서 DIVA 시스템을 구축할 수 있다는 점이다.
실시예 6D
완전한 야생 조건에서 앵커링 효과를 측정하기 위하여, ND 및 AI에 대하여 선천성 면역이 있는 시판용 영계 군에, 백신 처리 후 21일 째에 VNDV 및 HPAIV-H5N2를 사용하여 챌린지를 수행하였다. 이는 표 5에 나타내어 있는 바와 같이, 에멀젼화된 불활성화된 전바이러스로 제조된 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병에 대한 2개의 에멀젼화된 시판용 백신 (E. ND / AI -435, 및 E. ND / AI - Bive)과, 본 발명의 실시예 5D (Emi - Re - Bive), 5E (Emi - Re -435) 및 5F (Emi - Re - Vt)에 따라 얻은 것으로서 앵커링이 없는 본 발명의 에멀젼화된 불활성화 백신으로 면역화한 것이다.
[표 5]
앵커링이 없는 (Re) 재조합 바이러스 rNDV/LS-H5로 제조된 불활성화된 백신으로 면역화한, ND 및 AI에 대한 선천성 면역이 있는 시판용 영계에서의 효능
Figure pct00005
VNDV 및 HPAIV-H5N2에 대한 효능 결과는 각각 도 7 및 8에 그래프로 나타낸다.
예상 외로, 결과는, 본 발명의 앵커링이 없는 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5도 역시, VNDV 챌린지 바이러스에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 선천성 면역이 있는 시판용 영계에서 90% 이상에 상당하는 보호를 제공할 수 있음을 나타낸다 (도 7). 마찬가지로, 클로닝된 H5 유전자와는 관계없이, 모든 3개의 재조합 불활성화된 백신은 HPAIV-H5N2에 의하여 유도된 폐사율 (M)에 대하여 80% 이상에 상당하는 보호를 제공하는데, 이는 불활성화된 전바이러스 ND/AI-Bive 및 ND/AI-435를 사용하여 제조된 통상의 에멀젼화된 백신 및 앵커링이 있는 재조합 불활성화된 백신 rNDV/LS-H5과 유사한 것이다.
이러한 연구 결과는, 본 발명의 성공을 확인해 주는 것인데, 왜냐하면 병에 걸릴 수 있는 조류에게 이들을 사용하기 위하여 에멀젼 또는 약학적으로 허용 가능한 비히클, 보조제 또는 부형제를 사용하는 불활성화된 형태의 AI에 대한 재조합 백신은 SPF 닭에서 HPAIV로 챌린지한 것에 대하여 100%의 보호를 제공할 수 있는 탁월한 면역 반응을 보였고, ND 및 AI 바이러스에 대한 선천성 면역을 가진 영계에서 80% 이상의 면역 반응을 보였기 때문이다. 이러한 결과는 조류에서 적절한 면역 반응을 생성시키기 위해서 해당 단백질이 충분한 양으로 발현되기 위해서는, 면역화된 조류에서 재조합 바이러스 복제가 필수적인 것이라고 지금껏 생각해 왔던 것과는 반대의 결과로서, 예상 밖의 것이었다.
불활성화된 백신의 사용은 HPAIV 및 VNDV에 의하여 유발되는 폐사율을 예방하기 위하여 야생 수준에서 적당한 보호를 달성하기 위하여 필수적인데, 왜냐하면 산업적으로 가금류가 이용되고 있는 야생 조건 하에, ND에 대한 기존의 활성 백신의 사용, 또는 AI에 대한 기존의 재조합 활성 백신의 사용만으로는 충분하지 않을 수 있기 때문이다.
이상, 본 발명의 구체적인 실시 상태를 설명하고 묘사하였지만, 사용되는 AI 바이러스 또는 아데노바이러스, 사용되는 에멀젼 타입 또는 비히클 등에 있어서, 몇 가지 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명은 선행 기술 및 첨부되는 청구 범위를 제외하고는 제한적인 것으로 해석되어서는 아니된다.

Claims (25)

  1. 불활성화된 형태이고, 해당 질병의 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 것이 특징인 바이러스 벡터와,
    약학적으로 허용 가능한 비히클, 보조제 또는 부형제
    를 포함하는 재조합 백신.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외생성 뉴클레오타이드 서열은 인플루엔자, 감염성 후두기관염, 감염성 기관지염, 파브리시우스 낭 감염 (Gumboro), 간염, 바이러스성 비기관염, 감염성 비염, 미코플라즈마 히오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumonieae), 파스투렐라병, 돼지 호흡기 생식기 증후군 (PRRS), 써코바이러스 (circovirus), 보데텔라 폐렴 (bordetellosis), 파라인플루엔자로부터 선택되는 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  3. 제2항에 있어서, 상기 외생성 뉴클레오타이드 서열은 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA)을 코딩하는 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  4. 제3항에 있어서, 상기 헤마글루티닌 (HA)을 코딩하는 유전자는 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA) 서브타입 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  5. 제4항에 있어서, 상기 헤마글루티닌 (HA)을 코딩하는 유전자는 서브타입 H5인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 파라믹소바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  7. 제6항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 파라믹소바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  8. 제7항에 있어서, 상기 파라믹소바이러스는 뉴캐슬병 바이러스인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  9. 제8항에 있어서, 상기 뉴캐슬병 바이러스는 LaSota, Ulster, QV4, B1, CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30, 또는 VGGA 균주, 또는 뉴캐슬병 유전자군 I 내지 V로부터의 균주로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  10. 제6항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  11. 제10항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 조류 아데노바이러스 또는 돼지 아데노바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  12. 제11항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 조류 아데노바이러스 타입 9인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  13. 제11항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 돼지 아데노바이러스 타입 5인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  14. 제1항에 있어서, 상기 백신용 약학적으로 허용 가능한 비히클은 좋기로는 수용액 또는 에멀젼인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비히클로서 물-오일 에멀젼이 사용되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  16. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 벡터에 요구되는 역가는 재조합 활성 바이러스 백신에 요구되는 것과 유사한 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  17. 제16항에 있어서, 항원 반응을 수행하기 위하여 요구되는 바이러스 농도는 102 내지 1010 DI50%/ml인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  18. 제7항에 있어서, 상기 항원 반응을 수행하는 데 요구되는 바이러스 농도는 104 내지 1010 DIEP50%/ml인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  19. 제18항에 있어서, 백신이 닭에게 투여할 용으로 제조된 경우, 바이러스 농도는 닭 1마리당 108 내지 109 DIEP50%/0.5 ml인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  20. 제19항에 있어서, 백신은 닭 1마리당 108.5 DIEP50%/0.5 ml의 농도인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  21. 제10항에 있어서, 항원 반응을 수행하기 위하여 필요한 바이러스 농도는 102 내지 108 DIEP50%/ml인 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  22. 제1항에 있어서, 항원 반응을 수행하기 위하여 필요한 바이러스 농도는 백신은 피하 투여 또는 근육내 투여되는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 백신.
  23. 동물 질병의 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 비활성화된 바이러스 벡터를 포함하는 재조합 백신을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물 질병에 대하여 백신 처리하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 불활성화된 바이러스 벡터와 동일한 활성 바이러스 벡터를 포함하고, 상기 동물 질병의 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 재조합 백신을 동물에게 추가로 투여하는 것을 더 특징으로 하는 동물의 질병에 대하여 백신 처리하는 방법.
  25. a) 병원체에 의하여 유발되는 질병의 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 불활성화된 바이러스 벡터의 재조합 백신을 투여받은 1마리 이상의 동물의 1개 이상의 샘플을, 상기 샘플 중에 상기 항원에 대응하는 항체가 존재하는지를 검출하기 위하여, 제1 항체 검출 방법에 도입하고,
    b) 상기 제1 항체 검출 방법에 도입되었던 샘플과 동일한 동물로부터의 1종 이상의 샘플을, 상기 샘플 중에 상기 질병을 일으키는 병원체에 대응하는 항체가 존재하는지를 검출하기 위하여, 제2 항체 검출 방법에 도입하며,
    c) 제1 항체 검출 방법 및 제2 항체 검출 방법의 결과로부터 동물이 감염되었는지 또는 백신 처리되었는지를 측정하는 것
    을 포함하는, 질병의 통제 및 확산에 유용한 감염된 동물 및 백신 처리된 동물 간의 확인 방법.
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