CN113396217A - 刺激抗肿瘤免疫应答的嵌合溶瘤疱疹病毒 - Google Patents

Abstract

描述的是嵌合溶瘤病毒，其包含：具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包括降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；以及编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。还描述的是使用嵌合溶瘤病毒来治疗患有癌症的受试者、或给处于发展癌症的风险中的受试者接种疫苗的方法。

Description

刺激抗肿瘤免疫应答的嵌合溶瘤疱疹病毒

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月31日提交的美国临时申请号62/725,809、以及于2018年9月14日提交的美国临时申请号62/731,365的权益，所述两个美国临时申请均引入本文作为参考。

政府资助

本发明在通过美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的授权号CA071933下由政府支持完成。美国政府享有本发明的某些权利。

序列表

本申请含有序列表，其已以ASCII格式电子提交，并且在此整体引入作为参考。所述ASCII副本于2018年8月24日创建，命名为NCH-027861US PRO SEQUENCE LISTING_ST25，且大小为8,621字节。

背景技术

癌症免疫疗法是新的治疗选项，其涉及启动免疫系统用于肿瘤细胞根除。免疫疗法已用于克服经典治疗选项（如手术、放射疗法、化学疗法或抗体疗法）对于晚期实体瘤患者的有限功效。虽然一些肿瘤已用免疫治疗方法成功地进行治疗，但其它肿瘤是更抗性的。实体瘤和具有较低突变负荷的肿瘤（例如儿科癌症）更难以靶向。然而，这些较低的突变负荷经常表达膜相关的胎儿抗原（例如EphA2、GD2、IL13Ra2、EGFR VIII），其促成它们的转化并提供潜在的免疫治疗靶。Gros等人，Nature medicine，22:433-8（2016）。

免疫疗法中的两个有希望的领域涉及使用用以针对肿瘤进行疫苗接种的抗原肽混合物（Phuphanich等人，Cancer immunology，immunotherapy: CII，62:125-35（2013））和溶瘤病毒（OV）对树突细胞进行脉冲。Markert等人，Mol Ther.，17:199-207（2009）。尽管它们是不同的方法，但两种策略均很可能通过诱导抗肿瘤免疫来达到功效。Brown MC，Gromeier M.，Curr Opin Virol.，13:81-5（2015）。病毒免疫疗法基于生物抗癌剂，其优先靶向肿瘤细胞，同时保留正常细胞。溶瘤HSV已安全地用于广泛范围的癌症类型包括脑肿瘤的临床试验中。随着对病毒复制和宿主免疫介导的应答如何促成抗肿瘤应答的机制了解的改善，已改造了更新的下一基因来改善其功效和/或安全性概况。Ghonime MG，CassadyKA.，Cancer immunology research 2018；6:1499-510

神经胶质瘤是最频繁发生的原发性恶性脑肿瘤，其中多形性成胶质细胞瘤（GBM）是最致命且治疗难治性癌症之一。由于这些患者的中值进展时间和中值存活在过去五十年内最低限度地改变，因此需要新的多模式治疗策略。遗传修饰的HSV作为具有复制能力的溶瘤载体是有吸引力的，并且其基因组促进用于多模式治疗方法的高水平的转基因表达。尽管其安全性已在临床试验中得到证实，但第一代oHSV受肿瘤中的弱复制限制。Markert等人，Rev Med Virol，10（1）: 第17-30页（2000）。弱复制起于指导γ₁34.5基因的去除的安全防范措施，其预防神经毒力，但也取消对触发翻译停滞的宿主干扰素（IFN）信号传导途径的病毒抗性。Wakimoto等人，Gene Ther，10（11）: 第983-90页（2003）。

有效复制所需的许多oHSV基因也主动抑制宿主基因表达和抗原加工途径。HSV-1编码的ICP47、US3激酶和gB蛋白抑制I类和II类MHC分子上的肽负载或表面表达。Fruh等人，Nature，375（6530）: 第415-8页（1995）；Imai等人，PLoS One，8（8）: 第e72050页（2013）。类似地，oHSV中的病毒体宿主关闭（VHS）蛋白通过降解受感染细胞中的宿主细胞转录物，降低了宿主基因表达，包括潜在的肿瘤抗原。Taddeo等人，J Virol，87（8）: 第4516-22页（2013）。这些病毒蛋白的协同作用允许选择性的病毒基因表达、以及隐匿受感染细胞免于免疫监督机制。因此，oHSV用于引发有效的抗GBM应答的用途很可能需要这样的病毒，其有效地逆转GBM中的免疫抑制状态，并且特异性地增强对TAA的获得性应答。

oHSV感染本身被认为瞬时地逆转免疫抑制性肿瘤微环境，并且刺激适应性应答。Iizuka等人，Int J Cancer，118（4）: 第942-9页（2006）。宿主细胞抗病毒应答诱导IFN和细胞因子信号传导，其最终导致先天性免疫细胞（嗜中性粒细胞、NK细胞、树突细胞（DC）和巨噬细胞）的募集和活化，以及适应性（CD4+、CD8+）应答的后续刺激。Miller等人，CancerRes，60（20）: 第5714-22页（2000）。尽管这促成病毒清除，但它也被认为间接地刺激抗肿瘤应答。Parker等人，Cancer Gene Ther，12（4）: 第359-68页（2005）。许多研究支持这一假设。首先，改造为表达促炎基因（IL-12、IL-18、IL-4、TNF-α）的oHSV具有增强的抗肿瘤效应。例如，用表达IL-12和CCL2的oHSV的治疗增加活化巨噬细胞和T细胞的募集，并且改善存活而不减少病毒复制。其次，预先存在的HSV免疫改善了oHSV功效和存活，并且这种存活优点在免疫抑制的小鼠中丧失。Miller等人，Mol Ther，7（6）: 第741-7页（2003）。最后，来自Δγ₁34.5 oHSV（G207）的Ib期临床试验的转录阵列分析提示了，抗病毒免疫应答促成抗GBM活性，因为与无响应者（存活时间< 3ms）相比，长期存活者（>6ms）显示出更大的炎性和干扰素刺激的基因表达。

病毒疗法是成熟的实验疗法，并且在一些情况下，已获得FDA的批准。Talimogenelaherparepvec（T-VEC）是一种掺入有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）转基因的减毒单纯疱疹病毒，是同类第一的FDA批准的溶瘤HSV，用于通过病灶内注射治疗晚期、不可切除的3和4期黑色素瘤。Pol等人，Oncoimmunology，5:e1115641（2016）。作为免疫治疗剂，病毒的重复给药以及将病毒与其它免疫调节剂组合，改善了患有疗法抗性黑色素瘤的患者中的临床应答。C134是另一种下一代oHSV，在具有缺陷PAMP感知和IFN信号传导的细胞中，具有超过第一代oHSV的改善的蛋白质翻译和复制。在非恶性细胞中，C134诱导IRF3介导的IFN和细胞因子信号传导，因此限制了肿瘤细胞中的有效病毒复制。Cassady等人，Journal ofVirology，86:610-4 C134（2012），比第一代病毒更好地维持晚期病毒蛋白合成和复制，并且这导致增加的致细胞病变效应（CPE）和抗原负载，但仍然与亲本Δγ134.5HSV（18-20）一样安全。溶瘤HSV不仅具有通过受感染细胞中的病毒复制和裂解引起的直接抗肿瘤活性，而且它还引发了促成总体抗肿瘤活性的免疫应答。引入OV的确引起细胞损伤，并且导致肿瘤抗原从受病毒感染的细胞中的释放、促炎病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP），在病毒感染过程中产生的细胞因子和趋化因子刺激免疫应答，并且逆转与肿瘤相关的免疫抑制。Russell SJ，Barber GN.，Cancer cell，33:599-605（2018）。

由于其固有的抗原性，肿瘤已进化以逃避免疫监督，并且通过下调抗原加工机制，例如主要组织相容性复合物（MHC）I途径、蛋白体亚基潜伏膜蛋白（LMP）2和LMP7、tapasin以及与抗原加工（TAP）蛋白相关的转运蛋白，具有缓慢的病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）应答以及缺陷性抗原呈递。Johnsen等人，J. of immunology，163:4224-31（1999）。因此，肿瘤抗原的表达被下调，并且细胞毒性T淋巴细胞识别明显的肿瘤细胞并促进耐受的能力受到阻碍。Maeurer等人，J Clin Invest.，98（7）:1633-41（1996）。溶瘤病毒的复制导致细胞死亡，最终诱导促炎DAMP和PAMP应答，并且促进死亡或损伤的受病毒感染的肿瘤细胞的吞噬作用。病毒感染在打破免疫耐受性和诱导对自身抗原的自身免疫方面得到充分描述。Steed AL，Stappenbeck TS.，Curr Opin Immunol.，31:102-7（2014）。HSV也不例外，并且可以诱导全身性自身免疫反应（多形红斑）（Lucchese A.，AutoimmunRev，17:576-81（2018））、T细胞介导的角膜炎（Buela KA，Hendricks RL，J Immunol，194:379-87（2015））、以及持续性自身免疫性脑炎（Nosadini等人，Dev Med Child Neurol 59:796-805（2017））。该病毒在溶菌感染期间诱导稳健的炎性和免疫介导的应答。像所有病毒一样，它已进化以经得住抗病毒应答并且在其裂解阶段限制免疫应答的峰值。Cassady等人，Viruses，4；8 pii E43（2016）。随着时间过去，这种炎性和免疫介导的应答限制病毒的裂解性感染：引发先天性和适应性免疫应答，其导致由T细胞介导的长期免疫应答。Melzer等人，Biomedicines，5（1）. pii: E8（2017）。尽管oHSV感染募集了免疫效应物，但它也降低了受感染细胞中的宿主基因表达，使选择性病毒基因表达成为可能并且抑制了立即的宿主免疫检测。C134在刺激IFN应答的同时维持受感染细胞中的蛋白质翻译的能力，使得它特别适合作为多峰治疗平台。

发明内容

神经胶质瘤是最频繁发生的原发性恶性脑肿瘤，其中多形性成胶质细胞瘤（GBM）是最致命且治疗难治性癌症之一。基于与当前方案相关的死亡率和发病率，显然需要新的治疗选项。溶瘤疱疹病毒（oHSV）代表了用于治疗难治性癌症的新的治疗剂，并且已在早期临床试验中证实了功效。oHSV通过肿瘤细胞中的裂解性复制来介导直接的抗肿瘤效应，但最近的数据提示了，oHSV的间接免疫刺激效应可能对其功效具有更大的影响。在这方面，oHSV感染触发宿主细胞抗病毒信号传导途径，其引发抗病毒和抗肿瘤免疫应答两者。本发明人已制备了新的oHSV（C134），其合成蛋白质并且在肿瘤中更好地复制（直接溶瘤特性），并且具有增强的免疫刺激潜力（间接特性）。他们还已显示了，肿瘤蛋白（肿瘤相关抗原：TAA）的表达将刺激针对肿瘤的免疫应答，并且通过改造TAA，使得它们被分泌并与特化的抗原呈递免疫细胞结合，将“接种疫苗”并诱导长期的抗肿瘤免疫应答，即使在病毒消失之后。本发明人还已证实了，通过将C134改造为表达从受感染的细胞分泌并靶向专业抗原呈递细胞的肿瘤抗原，它们可以增强肿瘤特异性免疫应答，而不是针对病毒抗原的免疫应答。

序列简述

SEQ ID NO: 1：是源自单纯疱疹病毒1的γ₁34.5基因：

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SEQ ID NO: 2是衍生自人巨细胞病毒的IRS-1序列：

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SEQ ID NO: 3是衍生自人巨细胞病毒的TRS-1序列：

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SEQ ID NO: 4是衍生自人巨细胞病毒的IRS1和TRS1序列的共享的130氨基酸区域：

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SEQ ID NO: 5是“C170”，来自HSV-C134——表达EphA2 Full-ML的完整病毒基因组v1嵌合HSV（C134+pCK1201），参见图19D。

SEQ ID NO: 6是>C171，来自HSV-C134——表达EphA2-Full-MLM的完整病毒基因组v1嵌合HSV（C154+pCK1200），参见图19E。

SEQ ID NO: 7是>C172，来自HSV-C134——表达EphA2-Ecto-ML的完整病毒基因组v1嵌合HSV（C154+ pCK1205），参见图19F。

SEQ ID NO: 8是>C173，来自HSV-C134——表达EphA2-Ecto-MLM的完整病毒基因组v1嵌合HSV（C154+pCK1207），参见图19G。

SEQ ID NO: 9是>C174，来自HSV-C134——表达EphA2-Endo-ML的完整病毒基因组v1嵌合HSV（C154+pCK1210），参见图19H。

SEQ ID NO: 10是>C175，来自HSV-C134——表达EphA2 Endo-MLM的完整病毒基因组v1嵌合HSV（C154+pCK1212），参见图19I。

SEQ ID NO: 11是衍生自人序列的hEphA2 ML提取序列：

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SEQ ID NO: 12是衍生自人序列的hEphA2 MLM提取序列：

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SEQ ID NO: 13是衍生自人序列的hEphA2 GPNMB靶：

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附图说明

图1提供了显示从C134表达的EphA2衍生物的图示。（A）C134 oHSV的构型，包括来自UL3/UL4基因间区的IRS1表达和γ₁34.5的缺失。pCK1136穿梭载体用于将Egr1驱动的GFP表达盒插入C134内，指名为C154（B）。（C-F）将鼠EphA2衍生物克隆到pCK1136内，用于C154中的GFP重组和替换。野生型分泌前导序列得到维持，并且利用C末端Myc标签来区分内源性蛋白与C134表达的蛋白质。（C）全长EphA2。（D-F）使用天然的前导序列和跨膜结构域的缺失来生成EphA2的分泌性截短变体，其包括细胞外（Ecto，D，E）或细胞内（Endo，F）EphA2结构域。（E，F）具有C末端DC-靶向结构域的分泌性EphA2变体。

图2A和2B提供的曲线图显示了在A）U87 IC肿瘤模型和Neuro2A模型B）中的oHSV回收和存活研究的复合结果，在所述U87 IC肿瘤模型中，C134复制是Δγ₁34.5病毒（C101）的1000x，在所述Neuro2A模型中，它没有复制优势（插图：以48 hpi的病毒回收）。

图3A和3B提供了显示C134诱导的体液和细胞介导的免疫的图像。（A）针对DBT和Neuro2A细胞裂解产物的体液反应性的基于血清的检测。从首次用于实验的Balb/c小鼠，或用DBT肿瘤攻击并用盐水、R3616或C134处理的Balb/c小鼠中收集血清。将血清1:2048稀释，并且用作蛋白质分析的主要试剂。将从相同动物中分离的过量脾细胞加入DBT细胞的汇合单层（10:1）中。在三天后，将细胞扩增与在不存在DBT刺激的情况下铺平板的细胞进行比较，并且通过剩余DBT细胞的迈格林华（May-Grünwald）染色，来显现细胞介导的细胞毒性（B）。

图4A-4C提供了显示GPNMB特异性噬菌体和融合蛋白结合的曲线图。（A）在针对GPNMB-Fc的4轮噬菌体淘选后，鉴定了GPNMB特异性共有序列。噬菌体克隆（B）的GPNMB结合特异性，或将用分泌前导区改造并遗传融合到GPNMB结合共有序列的FcE（C），加入293T和293T-GPNMB细胞的混合物中。通过流式细胞术评价GPNMB表达和噬菌体/分泌性蛋白结合。

图5A和5B提供的曲线图显示了可以基于oHSV复制，将恶性神经胶质瘤肿瘤系分成敏感和抗性细胞系。DBT肿瘤是高度抗性MG肿瘤细胞。分析肿瘤细胞对HSV感染的敏感性（%HSV阳性）和剩余细胞的绝对数目（%相对细胞计数）。基于MG对病毒细胞溶解的敏感性，可以将它们分层为oHSV敏感和抗性肿瘤，并且显示了DBT肿瘤细胞是高度oHSV抗性的。B）来自DBT CNS肿瘤的病毒回收研究显示了，C134和R3616在这些CNS肿瘤中等价地复制。对oHSV处理的小鼠CNS肿瘤执行HSV DNA的限制性噬菌斑稀释和qPCR，并且在R3616（第一代oHSV）和C134（第二代oHSV）复制中没有显示差异。

图6A和图6B提供了显示体内DBT肿瘤研究的曲线图，所述研究显示了，除直接病毒介导的细胞溶解外的机制促成oHSV抗肿瘤活性。我们先前的研究显示了，C134对oHSV敏感性肿瘤具有改善的直接溶瘤活性。然而，一些肿瘤（例如DBT、CT2A、GL261）对HSV复制和病毒的细胞溶解活性是抗性的。将原位DBT荷瘤小鼠用oHSV（1x10⁷ pfu）或盐水进行处理。C134显著改善了存活（p=0.003）。ICP34.5（-）病毒R3616并未改善存活超过生理盐水处理；然而，R3616或C134小鼠的一部分（~1/3）是长期存活者。（> 37天）。存活者在另一个位置（胁腹）中用DBT肿瘤再次攻击。存活者具有比首次用于实验的（未经历肿瘤的）对照小鼠显著更慢的肿瘤生长，其提示了抗肿瘤免疫应答促成这些存活者中的长期存活。

图7提供了显示重复的C134处理延长存活的曲线图。为了鉴定C134的重复给药是否可以延长存活，执行了Winn型测定。简言之，对Balb/C小鼠植入受oHSV感染的肿瘤细胞（MOI 1），然后在8天后再次处理（1 x 10⁷ pfu）。结果显示了，与过去的研究相似，DBT肿瘤对用盐水处理的小鼠是迅速致命的（中值存活为14天）。相比之下，C134的重复给药延长了具有DBT脑肿瘤的小鼠的存活（与单一剂量研究中的33天相比，中值存活为55天）。还用C134外源抗原表达病毒（EGFP）处理组，以鉴定来自该病毒的外源抗原表达是否改善了抗肿瘤免疫应答。对照组用丝裂霉素C处理的肿瘤细胞进行接种。Mito-C处理的肿瘤细胞并不复制，但保持活的，将小鼠暴露于肿瘤抗原（不依赖于oHSV处理），用于图9中所示的后续研究。

图8A和8B提供了示意图和曲线图，其显示了促炎细胞因子表达改善了存活。A）C002（基于C134的表达mIL-12的oHSV）的示意图。用1x10⁷ pfu的C134或C002（C134+mIL-12）处理荷有原位DBT肿瘤的Balb/C小鼠，显著改善存活超过盐水疗法。来自C134的T细胞活化促炎细胞因子（IL-12）的表达，进一步扩展了DBT同系肿瘤模型中的C134抗肿瘤活性。

图9提供的曲线图显示了oHSV治疗刺激抗肿瘤免疫应答，其优于在首次用于实验的小鼠，或具有先前的肿瘤抗原暴露（Mito-C），并且在再次攻击的小鼠中具有显著降低的肿瘤生长的小鼠中可见的抗肿瘤免疫应答。

图10A-C提供了显示HSV免疫及其对oHSV抗肿瘤功效的作用的曲线图。我们假设与促炎细胞因子表达相似，具有预先存在的HSV免疫的小鼠将显示出增强的T细胞活性，其将转化为改善的抗肿瘤效应。为了测试这一假设，我们用HSV（在肿瘤植入之前第21天和第7天，optiprep R3616 3.33x10⁶ pfu IM）来免疫Bal b/C组。然后，我们植入DBT肿瘤（1x10⁵个细胞），并且在肿瘤植入（与我们先前的研究一致）后一周，用1x10⁷ pfu的oHSV（C134（图10B）或C002（图10C））或盐水1（图10A），处理HSV免疫和HSV首次用于实验的组。结果显示了，先前的HSV免疫对盐水或C134存活没有作用。

图11A-11C提供了基于表达肿瘤抗原的oHSV的C134的复合图像和示意图。A）共聚焦显微镜检查显示了所表达的EphA2在细胞中的细胞分布（加上Myc标签的-EphA2、反面高尔基体网络、DAPI-核）。全长EphA2是膜相关的，而细胞内和细胞外结构域在细胞内分布。B）C134 EphA2肿瘤抗原表达构建体C170-C175的示意图，所述构建体包括在3'端处的表位结构域，其致使我们能够鉴定病毒表达的抗原并将其引导至抗原表达细胞。C）免疫染色研究显示了，表达全长和细胞内EphA2结构域的oHSV保持与细胞相关（C170、C171、C174和C175），而表达EphA2细胞外结构域的oHSV被分泌到培养基内（C172、C173）。

图12A-12D提供了显示EphA2表达病毒构建和验证的图示和图像。（A）抗原表达病毒的示意性概述 – 使用基于C134的病毒，通过同源重组来构建C170和C172。这将由强MND启动子驱动的编码全长C57bl6 EphA2基因（C170）或细胞外结构域（C172）的序列引入g134.5基因结构域内。（B）DNA杂交研究确认了预料的DNA片段大小不同于亲本病毒。（C）.免疫荧光显示了明显的细胞分布特征（C170膜相关染色，C172 IC染色）：绿色EphA2，反式高尔基体网络的红色染色，由DAPI的蓝色核染色（D）。受感染的小鼠神经胶质瘤细胞和上清液的蛋白质印迹显示了，C170表达预料的125kd细胞相关蛋白，而C172产生60kd细胞相关和分泌的蛋白质。

图13A-D提供的曲线图显示了B6鼠神经胶质瘤（CT2A）（图13 A和C）和MPNST（图13B和D）（67C4）细胞中的病毒复制（图13A和13B）和细胞毒性（图13C和13D）。（A）. 病毒回收研究显示了，C170和C172在目的鼠肿瘤细胞系中类似于母体病毒（C134）复制。（B）使用感染复数（PFU/细胞）为1的incucyte和感染的病毒细胞毒性测定显示了，C134和C170诱导相似的细胞毒性，并且肿瘤细胞系显示出在直接细胞毒性方面的差异。

图14A和14B提供了显示C170在两种不同的同系肿瘤模型中的体内测试的曲线图。（A）. C170是测试的唯一病毒，其显著改善了CT2A原位模型中的存活。上图显示了实验设计和病毒处理的示意图。下图显示了卡普兰迈耶（Kaplan Meier）曲线，其显示了在C170处理之后改善的中值存活和总体存活（B）。在高度抗性鼠67C4鼠MPNST肿瘤模型中，C170还显著降低了肿瘤生长（未配对样品的曼怀二氏分析，*p值<0.05，** p值<0.005，双侧分析）。

图15A-15H提供了显示CT2A脑肿瘤TIL免疫表型分型的曲线图和图像：在盐水灌注后的CT2A肿瘤浸润白细胞（TIL）的分析 -（A）从在注射后第6天时盐水（41,948）、C134（275,594）和C170（273.174）处理的小鼠中分离的总体TIL的比例饼图概括，以及相对淋巴细胞（粉红色）和髓样（黑色、橙色和蓝色）组成。饼图下方的数目表示白细胞/脑样品的绝对数目。（B）C170显著增加了总体T细胞浸润。（C）两种oHSV（C134和C170）均增加了CD4群体，（D）.C170显著增加了CD8 T细胞毒性细胞和（E）活化的（CD25+）CD8 T细胞毒性细胞。（F）. 用于CD8效应物样（CD44+、CD62L-）和中央记忆样（CD44+、CD62L+）群体分析的进一步CD8表型分析的门控和代表性流程图的实例。（G）. C134和C170均增加了CD8 T效应物样群体（CD44+、CD62L-），但仅C170在处理后第6天时增加了（H）CD8中央记忆样群体。

图16A-16I提供的曲线图和图像显示了盐水和oHSV处理的67C4胁腹肿瘤的免疫表型分析，其显示了（A）C170显著减少了肿瘤中的CD11b髓样群体的相对比例，并且（B）当与盐水或C134处理的样品相比时，显著减少了免疫抑制性MDSC样（CD11b+、GR1+）群体。与我们的脑肿瘤模型结果相似，C170处理显著增加了肿瘤内的（CD8+,CD44+、CD62L+）中央记忆样群体。除TIL改变之外，C170处理还对外周群体具有作用。（D）初始T细胞（CD90+）和髓样（CD11b+）群体门控的代表性实例。C170处理降低了外周中的（E）CD11b（+）细胞和（F）CD11b+,GR1+MDSC样群体。C170并不显著增加（G）T细胞或（H）CD4（+）T细胞比例，但它的确增加（I）外周中的CD8 T细胞群体。

图17A和17B提供了示意图和曲线图，其显示了伴随远隔效应（abscopal effect）和针对肿瘤的免疫记忆。在CT2A胁腹肿瘤再次攻击时，与首次用于实验的（从未暴露于肿瘤的小鼠）或C134处理的存活者相比，C170处理的脑肿瘤存活者更好地抑制CT2A肿瘤的再生长。（A）显示的实验设计示意图。（B）肿瘤生长曲线显示了，在首次用于实验的或oHSV处理的长期存活者的胁腹中，在CT2A植入后，肿瘤生长的显著减少。

图18A-18F提供了来自盐水和oHSV处理的小鼠的T细胞功能研究的概括，其显示了C170处理在长期存活者的外周中诱导抗原特异性T细胞应答。分析了来自盐水（蓝色柱）或oHSV处理的小鼠（红色柱C134、绿色柱C170）的脾细胞。在开始时，使用肽脉冲的群体中不存在差异；然而，在用10um EphA2或10uM OVA肽（阴性对照）脉冲后，C170处理的小鼠显著增加了其活化的（B）CD25（+）、（C）GZMB（+）、以及（D）CD25+、GZMB+双重染色CD8+群体，指示EphA2特异性群体应答。（E）显示的是CD8（+）GZMB（+）群体和门控以及（F）GZMB CD25双阳性门控群体的代表性流程图。

图19A-19I提供了本文所述的示例性嵌合溶瘤病毒（图19A-19C），以及C170（图19D）、C171（图19E）、C172（图19F）、C173（图19G）、C174（图19H）和C175（图19I）的整个病毒基因组序列的图示。

具体实施方式

本发明提供了嵌合溶瘤病毒，其包含：具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包括降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ134.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；以及编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。还描述的是使用嵌合溶瘤病毒来治疗患有癌症的受试者、或给处于发展癌症的风险中的受试者接种疫苗的方法。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本文的本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案，而不预期限制本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都整体引入作为参考。

在提供值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确指示，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一、以及在该指定范围内的任何其它指定值或中间值包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本发明内，服从于指定范围中任何具体排除的限制。当指定范围包括一个或两个限制时，排除这些包括限制中的任一或两者的范围也包括在本发明中。

如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“样品”也包括多个此类样品，并且提及“剪接调节蛋白”包括提及一个或多个蛋白质分子，依此类推。

如本文使用的，术语“约”指与基础值的+/-10%偏差。

如本文使用的，术语“核酸”或“寡核苷酸”指连接至磷酸基和可交换有机碱基的多个核苷酸（即包含糖（例如核糖或脱氧核糖）的分子），所述有机碱基是取代的嘧啶（例如胞嘧啶（C）、胸苷（T）或尿嘧啶（U））或取代的嘌呤（例如腺嘌呤（A）或鸟嘌呤（G））。该术语还应该包括多核苷（即减去磷酸的多核苷酸）和任何其它含有机碱基的聚合物。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤以及其它天然和非天然存在的核碱基、取代和未取代的芳族部分。天然核酸具有脱氧核糖或核糖磷酸主链。人工或合成的多核苷酸是在体外或无细胞系中聚合的任何多核苷酸，并且含有相同或相似的碱基，但可以含有除天然核糖-磷酸主链外的类型的主链。这些主链包括：PNA（肽核酸）、硫代磷酸酯、二氨基磷酸酯、吗啉代和天然核酸的磷酸主链的其它变体。其它此类修饰对于本领域技术人员是众所周知的。因此，术语核酸还包含例如在碱基和/或糖中具有取代或修饰的核酸。

术语“碱基”包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物。碱基包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成衍生物包括但不限于放置新的反应性基团的修饰，所述基团例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸和烷基卤。

“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且指由通过肽键连接的氨基酸残基链组成的化合物。多肽的“活性部分”意指这样的肽，其小于全长多肽，但保留了可测量的生物学活性并保留了生物检测。

如本文使用的，术语“肿瘤”指无论是良性还是恶性（癌性）的任何赘生物生长、增殖或细胞团块，无论是原发部位病灶或转移灶。

如本文使用的，“治疗有效量”指减轻（至某种程度，如通过熟练的医学从业者判断的）哺乳动物中的疾病或状况的一种或多种症状的组合物的量。另外，组合物的“治疗有效量”意指与疾病或状况相关或其原因的生理或生物化学参数部分或完全恢复正常的量。本领域熟练的临床医生可以确定组合物的治疗有效量，以便当它例如静脉内、皮下、腹膜内、经口或通过吸入施用时，治疗或预防特定的疾病状况或病症。治疗有效所需的组合物的精确量取决于众多因素，例如活性剂的比活性、所采用的递送装置、试剂的物理特征、施用目的，加上许多患者特异性考虑。但是，在了解本文所述的公开内容后，治疗有效量的确定在普通技术人员的技术内。

如本文使用的，“治疗（Treat）”、“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”等，指对处于疾病的风险中或患有疾病的患者提供益处的任何动作，包括通过减轻或抑制至少一种症状、疾病进展的延迟、疾病发作的预防或延迟等，改善状况。治疗还包括不希望有的增殖细胞的部分或完全破坏，伴随对正常细胞的最低限度破坏作用。处于风险中的受试者是已确定为具有受试者发展癌症的高于平均水平风险的受试者，其可以例如通过家族史或引起发展癌症的易感性的基因检测来确定。

如本文使用的，术语“受试者”指哺乳动物的物种，包括但不限于灵长类动物，包括猿猴和人、马科动物（例如马）、犬科动物（例如犬）、猫科动物、各种驯养的牲畜（例如有蹄类动物，如母猪、猪、山羊、绵羊等等）、以及驯养宠物和动物园中维持的动物。

“溶瘤病毒”指优先感染并杀死癌细胞的病毒。受感染的癌细胞通过溶瘤作用被破坏，导致新的传染性病毒颗粒的释放，其继续感染其它癌细胞。

“嵌合病毒”指包含来自不同病毒的核酸序列的病毒。例如，嵌合病毒可以是包括来自疱疹病毒和巨细胞病毒的核酸材料的病毒。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

嵌合溶瘤病毒

在一个方面，本发明提供了嵌合溶瘤病毒，其包含：具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包含降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；以及编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。

这些HSV重组体在肿瘤中的选择性复制可以通过缺失病毒神经毒力基因γ₁34.5来实现。HSV-1神经毒力基因的缺失允许这些溶瘤病毒的安全施用。虽然Δγ₁34.5病毒能够进入非分裂的正常细胞内，但这些病毒不能有效地复制，除了在活跃分裂的细胞如肿瘤细胞中之外。Chou等人，Science 250（4985）: 1262-6（1990）。因此，此类病毒是肿瘤选择性病毒。Δγ₁34.5病毒已在临床前动物模型中显示对于脑恶性肿瘤治疗的显著功效，并且已在美国（Markert等人，Gene Ther. 7（10）: 867-74（2000））和英国（Rampling等人，GeneTher. 7（10）: 859-66（2000））两国中的I和II期试验中证实为安全的。然而，减毒的HSV-1（Δγ₁34.5）重组体不能有效地合成病毒蛋白，并且这限制了病毒复制。Shah等人，J.Neurooncol. 65（3）: 203-26（2003）。然而，包括了抑制PKR介导的蛋白关闭而无神经毒力的PKR逃避基因。

嵌合溶瘤病毒包括降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰。可以对γ₁34.5基因进行的修饰包括一个或多个突变、缺失、插入和取代。因此，对疱疹病毒核酸序列的修饰可以包含从HSV-1中完全或部分缺失γ₁34.5基因（SEQ ID NO: 1）。修饰可以包含插入的外源终止密码子或者其它一个或多个核苷酸。修饰可以包含启动子的突变或缺失，或者改变γ₁34.5基因表达的外源启动子的插入。该修饰可以包含一个或多个插入的核苷酸，其导致密码子移码。此外，嵌合体的第二病毒核酸序列可以取代γ₁34.5基因。对γ₁34.5基因的修饰也可以是与γ₁34.5基因具有至少约70-99%同源性，包括70%、75%、80%、85%、90%或95%同源性的核酸的修饰。在一些实施方案中，疱疹病毒γ₁34.5基因的修饰包含γ₁34.5基因的缺失或突变。用于制备本文所述修饰的方法是本领域技术人员众所周知的。

本发明的嵌合溶瘤病毒基于疱疹病毒。遗传修饰的疱疹病毒出于许多原因作为溶瘤载体是有吸引力的：1）用于构建重组疱疹病毒的程序是充分建立的；2）多个基因可以被缺失和/或用治疗性外源基因替换，而不影响病毒的复制能力；3）文献中存在关于疱疹病毒的生物学，以及其在人和非人灵长类动物中的行为的丰富经验；和4）修饰的疱疹病毒可以进行改造，以保持对标准抗病毒药物疗法的敏感性，作为“内置”安全特点。此外，单纯疱疹病毒的基因组大小为152 kb，允许转移大小为30 kb或更大的基因。

存在多于120种动物疱疹病毒。所有疱疹病毒分成三个子集：alpha（α）、beta（β）和gamma（γ）疱疹病毒。存在在三个子集之间拆分的8种人疱疹病毒。α疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1（HSV-1）、HSV-2和水痘带状疱疹病毒（VZV）。β疱疹病毒包括人巨细胞病毒（HCMV）、人疱疹病毒6（HHV-6）和人疱疹病毒7（HHV-7）。γ疱疹病毒包括EB病毒（EBV）和γ卡波西氏肉瘤疱疹病毒。相应地，在一些实施方案中，嵌合溶瘤病毒中包括的疱疹病毒是α疱疹病毒，而在进一步的实施方案中，嵌合溶瘤病毒中包括的疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒。

嵌合溶瘤病毒包含降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰，以及编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列。与在修饰不存在下的逃避基因表达相比，疱疹病毒核酸修饰导致蛋白激酶R（PKR）逃避基因的表达降低。第二病毒序列编码蛋白质，其包含PKR逃避基因的蛋白质合成功能，而无该基因的神经毒力功能。因此，与野生型疱疹病毒相比，嵌合病毒具有降低的神经毒力。同样如本文所公开的，与现有的减毒疱疹病毒，例如Δγ₁34.5 HSV相比，所提供的嵌合病毒具有增强的蛋白质合成和/或复制。与在第二病毒核酸序列不存在下的嵌合病毒的蛋白质合成或复制相比，所提供的嵌合病毒的第二核酸序列增强了蛋白质合成或复制。所提供的嵌合病毒的第二核酸序列可以通过抑制PKR的活化、抑制eIF-2α的磷酸化、或增强eIF-2α的去磷酸化，来增强蛋白质合成和复制。

嵌合溶瘤病毒的第二病毒核酸序列包含PKR逃避基因的一个表型，在受感染的肿瘤细胞中的蛋白质合成和复制，但不包含PKR逃避基因的另一表型，PKR介导的毒力例如神经毒力。换言之，第二病毒核酸序列抑制了PKR介导的蛋白关闭，而无神经毒力。因此，第二病毒核酸序列可以是并不引起毒力的任何PKR逃避基因或可比较基因。第二病毒核酸序列可以衍生自同源病毒。因此，所提供的嵌合病毒的第二病毒核酸序列可以是α疱疹病毒核酸序列、P疱疹病毒核酸序列或γ疱疹病毒核酸序列。因此，所提供的嵌合病毒的病毒核酸序列可以是巨细胞病毒（CMV）核酸序列。

可以用于所提供的嵌合病毒中的合适核酸序列的实例，包括但不限于IRS-1（SEQID NO: 2）和TRS-1（SEQ ID NO: 3）或其同源基因。所提供的嵌合病毒可以包含IRS-1基因。所提供的嵌合病毒还可以包含与IRS-1基因具有至少约70-99%同源性，包括约70%、75%、80%、85%、90%、95%同源性的核酸。所提供的嵌合病毒可以包含TRS-1基因或其同源基因。所提供的嵌合病毒还可以包含与TRS-1基因具有至少约70-99%同源性，包括约70%、75%、80%、85%、90%、95%同源性的核酸。

人巨细胞病毒（HCMV）IRS1和TRS1蛋白具有共享的130氨基酸（aa）区域，其独立地与两个真核基因Nedd4和TSG101相互作用，所述真核基因涉及细胞中的囊泡转运和溶酶体分选。如下文实施例中所述，包含TRS1或IRS1的嵌合病毒具有相似的蛋白质合成表型。因此，所提供的嵌合病毒可以包含对应于IRS1和TRS1的共享的130 aa区域的核酸序列（SEQID NO: 4）。所提供的嵌合病毒还可以包含与SEQ ID NO: 4具有至少约70-99%同源性，包括约70%、75%、80%、85%、90%、95%同源性的核酸。

应理解，如本文讨论的，术语同源性和同一性的使用意指与相似性相同的事物。因此，例如，如果词语同源性的使用在两个非天然序列之间使用，应理解这不一定指示这两个序列之间的进化关系，而是察看其核酸序列之间的相似性或相关性。用于确定两个进化相关分子之间的同源性的许多方法常规地应用于任何两种或更多种核酸或蛋白质，用于测量序列相似性的目的，而不管它们是否是进化相关的。

一般而言，应理解，定义本文公开的基因和蛋白质的任何已知的变体和衍生物、或者可能出现的变体和衍生物的一种方式，是通过根据与特异性已知序列的同源性来定义变体和衍生物。本文公开的特定序列的这种同一性也在本文其它地方进行讨论。一般而言，本文公开的基因和蛋白质的变体通常与所述序列或天然序列具有至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99百分比的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质或核酸，例如基因的同源性。例如，可以在这样比对两个序列，使得同源性处于其最高水平之后，来计算同源性。

计算同源性的另一种方法可以通过公开的算法来执行。用于比较的最佳序列比对可以通过以下来进行：Smith和Waterman，Adv. Appl. Math. 2: 482（1981）的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，J. Mol. Biol. 48: 443（1970）的同源性比对算法，Pearson和Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444（1988）的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现（Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA）或者检查。

可以通过例如以下中公开的算法，对于核酸获得相同类型的同源性：Zuker，M.Science 244:48-52，1989，Jaeger等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710，1989，Jaeger等人Methods Enzymol. 183:281-306，1989，所述参考文献关于至少与核酸比对有关的材料引入本文作为参考。应理解，通常可以使用任何方法，并且在某些情况下，这些各种方法的结果可能不同，但技术人员应理解，如果用这些方法中的至少一种找到同一性，则该序列可以被说成将具有所述同一性，并且在本文中公开。

例如，如本文使用的，叙述为与另一种序列具有特定百分比同源性的序列，指具有如通过上述任何一种或多种方法计算的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法，第一序列计算为与第二序列具有80百分比的同源性，则即使如通过任何其它计算方法计算的，第一序列与第二序列不具有80百分比的同源性，第一序列与第二序列也具有如本文定义的80百分比的同源性。作为另一个实例，如果使用Zuker计算方法以及Pearson和Lipman计算方法两者，第一序列计算为与第二序列具有80百分比的同源性，则即使如通过Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任何其它计算方法计算的，第一序列与第二序列不具有80百分比的同源性，第一序列与第二序列也具有如本文定义的80百分比的同源性。作为另外一个实例，如果使用每种计算方法，第一序列计算为与第二序列具有80百分比的同源性，则第一序列与第二序列具有如本文定义的80百分比的同源性，尽管在实践中，不同计算方法经常导致不同的计算的同源性百分比。

所公开的核酸可以含有例如核苷酸类似物或核苷酸取代物。这些和其它分子的非限制性实例在本文中进行讨论。应理解，例如，当载体在细胞中表达时，所表达的mRNA通常由A、C、G和U构成。

核苷酸类似物是含有碱基、糖或磷酸部分的某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域众所周知知的，并且包括例如5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤。

本文还提供的是包含本文公开的嵌合溶瘤病毒的病毒载体，其中所述嵌合溶瘤病毒进一步包含肿瘤相关抗原。因此，提供了将肿瘤相关抗原递送至细胞的方法，其包括使靶细胞与本文提供的病毒载体接触。递送可以是体内或离体的。病毒载体的嵌合溶瘤病毒可以包括编码病毒进入所需的修饰的HSV糖蛋白的基因。已构建了重组HSV，其专一地通过肿瘤特异性受体进入肿瘤细胞。Zhou和Roizman，J. Virol. 79（9）: 5272-7（2005）。

递送至细胞的核酸，例如本文所述的核酸，通常含有表达控制系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。启动子一般是在关于转录起始位点处于相对固定位置时起作用的一个或多个DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以含有上游元件和应答元件。

控制来自哺乳动物宿主细胞中的载体转录的优选启动子可以得自各种来源，例如病毒例如多瘤病毒、猿猴病毒40（SV40）、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒且最优选巨细胞病毒的基因组，或来自异源哺乳动物启动子，例如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子方便地作为SV40限制性片段获得，所述SV40限制性片段也含有SV40病毒的复制起点（Fiers等人，Nature，273: 113（1978））。人巨细胞病毒的立即早期启动子方便地作为HindIII E限制性片段获得（Greenway，P. J.等人，Gene 18: 355-360（1982））。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子在本文中也是有用的。

增强子一般指这样的DNA序列，其在距转录起始位点不固定的距离处起作用，并且可以对于转录单元为5'或3'。此外，增强子可以在内含子内以及在编码序列本身内。它们的长度通常为10至300个碱基对（bp），并且它们以顺式起作用。增强子作用于增加来自附近启动子的转录。增强子经常还含有介导转录调控的应答元件。启动子也可以含有介导转录调控的应答元件。增强子经常决定基因表达的调控。虽然许多增强子序列目前已知来自哺乳动物基因（珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素），但通常使用来自真核细胞病毒的增强子用于一般表达。优选的实例包括但不限于SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子。

启动子和/或增强子可以通过光或触发其功能的特异性化学事件被特异性活化。系统可以通过试剂例如四环素和地塞米松进行调控。还存在通过暴露于照射如γ射线照射或烷基化药物，来增强病毒载体基因表达的方法。

启动子区可以充当组成型启动子，以使待转录的转录单位区域的表达达到最大。在某些构建体中，启动子区即使在特定时间仅在特定类型的细胞中表达，它也可以在所有真核细胞类型中是活性的。这种类型的优选启动子是CMV启动子（650个碱基）。其它优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒（全长启动子）和逆转录病毒载体LTR。已显示，所有特异性调控元件可以进行克隆并用于构建表达载体，所述表达载体在特异性细胞类型例如黑色素瘤细胞中选择性表达。例如，神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）启动子，已用于在神经胶质起源的细胞中选择性地表达基因。此类肿瘤特异性启动子也可以掺入嵌合病毒以及本文所述的病毒载体内。

用于真核宿主细胞中的表达载体还可以含有对于转录终止所必需的序列，其可能影响mRNA表达。这些区域转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多聚腺苷酸化区段。3'非翻译区还包括转录终止位点。优选转录单元还含有多聚腺苷酸化区域。该区域的一个益处在于，它增加了转录单位如mRNA一样进行加工且转运的可能性。在表达构建体中的多腺苷酸化信号的鉴定和使用是充分建立的。优选在转基因构建体中使用同源的多聚腺苷酸化信号。在某些转录单位中，多聚腺苷酸化区域衍生自SV40早期多聚腺苷酸化信号，且由约400个碱基组成。还优选转录单元单独或与上述序列组合含有其它标准序列，以改善来自构建体的表达或构建体的稳定性。

病毒载体可以包括编码标记物产物的核酸序列。这种标记物产物用于确定基因是否已递送至细胞，并且一旦递送就被表达。标记物基因包括例如编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌（E. Coli）lacZ基因和绿色荧光蛋白（GFP）。标记物也可以用于成像技术中。因此，编码标记物的嵌合载体可以用于显现癌细胞或肿瘤。例如，标记物区域的大小或标记物的强度可以用于评估癌症的进展、消退或治愈。

如本文使用的，“标记物”意指可以直接（例如，整合到多肽或核酸内的荧光分子）、或间接（例如，通过活化或结合至表达的遗传报告物，包括可活化底物、肽、受体融合蛋白、一抗或具有整合标签的二抗）附着至目的分子的任何可检测标签。“标记物”是可以用成像方法显现的任何标签。可检测标签可以是不透射线的物质、放射性标签、荧光标签、发光蛋白、磁性标签或微气泡（保留在循环系统中，并且可通过超声检查检测的均匀大小的空气填充气泡，如整体引入本文的Ellega等人Circulation，108:336-341，2003中所述）。可检测标签可以选自适合于局限化的γ发射器、β发射器和α发射器，正电子发射器，X射线发射器，超声反射器（微气泡）和荧光发射器。合适的荧光化合物包括荧光素钠、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、德克萨斯红磺酰氯（de Belder & Wik，Carbohydr. Res.44（2）:251-57（1975）），以及在近红外区中发荧光的化合物，例如Cy5.5、Cy7及其它。还包括的是在放射性示踪剂施用之后可检测的遗传报告物，所述放射性示踪剂例如hSSTr2、胸苷激酶（来自疱疹病毒、人线粒体或其它）和NIS（钠/碘化物同向转运体）。发光蛋白包括各种类型的萤光素酶。用不超过常规实验，本领域技术人员将知道或能够确定适合于标记分子的其它荧光化合物。

可以使用例如以下来进行体内监测：生物发光成像、平面γ相机成像、SPECT成像、基于光的成像、磁共振成像和光谱学、荧光成像（尤其是在近红外区中）、扩散光层析成像、超声检查（包括非靶向微气泡造影和靶向微气泡造影）、PET成像、荧光相关光谱、体内双光子显微镜检查、光学相干断层扫描、斑点显微镜检查、小分子报告物、纳米晶体标记和二次谐波成像。使用上述成像技术，在特异性诱导之后，检测在各种炎症特异性启动子的控制下的报告基因。

这些技术可以与其它成像技术组合应用。例如，可以使用对于CMV-萤光素酶呈阳性的肿瘤细胞来完成肿瘤团块监测。另外，两种萤光素酶可以同时进行成像，例如，使用CMV-萤光素酶（来自萤火虫）和cox2L-萤光素酶（来自海肾）。其它报告分子和启动子可以与这些实例结合使用，其一些实例在上文得到公开。

肿瘤相关抗原

嵌合溶瘤病毒包括编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。如本文使用的，“肿瘤相关抗原”包含由肿瘤细胞产生的任何抗原。“肿瘤相关抗原”可以是仅存在于肿瘤细胞中而不存在于任何其它细胞上的抗原，或者它可以是存在于一些肿瘤细胞以及一些正常细胞中的抗原。肿瘤相关抗原可以包括例如突变的癌基因和肿瘤抑制基因的产物、过表达或异常表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的肿瘤抗原、癌胚抗原、改变的细胞表面糖脂和糖蛋白或细胞类型特异性分化抗原。

在一些实施方案中，嵌合溶瘤病毒能够表达多种不同的肿瘤相关抗原。例如，在一些实施方案中，疱疹病毒包括第四核酸序列，其编码与由第三核酸序列编码的不同的肿瘤相关抗原。

各种抗原（例如，肿瘤相关抗原、微生物抗原）或其抗原部分可以从本领域已知的那些抗原中选择用于用作目的抗原，或者如上所述通过免疫测定确定为能够与抗体或MHC分子结合（抗原性）、或生成免疫应答（免疫原性）。另外，有用的抗原或其衍生物也可以通过各种标准来鉴定，所述标准例如抗原在癌症中的牵涉（Norrby（1985）Vaccines 85，Lerner等人（编辑），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，第388-389页）、类型或组特异性、通过患者的抗血清或免疫细胞的识别、和/或对于抗原特异性的抗血清或免疫细胞的保护效应的证实。

尽管任何目的抗原都可以用于本文提供的方法和组合物中，但非限制性实例包括与癌症相关、衍生自癌症或预测为与癌症相关的肿瘤相关抗原或其抗原部分。在这种情况下，目的肿瘤相关抗原可以来自任何类型的癌症，包括但不限于腺癌、肝母细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、骨髓瘤、膀胱癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、头颈癌、睾丸癌、结肠直肠癌、前列腺癌和胰腺癌、或其任何抗原部分。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是成胶质细胞瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是在待治疗的癌症上发现的抗原。

许多类型的肿瘤细胞表达在正常细胞中未发现的抗原。称为肿瘤相关抗原的这些抗原，已作为治疗性抗癌疫苗的靶进行深入研究。示例性的肿瘤相关抗原是淋巴细胞抗原6复合物、基因座K（LY6K）、细胞分裂周期相关1（CDCA1）、胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3（IMP-3）、驱动蛋白家族成员20A（KIF20A）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、叉头盒M1（FOXM1）、钙粘蛋白3（CDH3）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、细胞分裂周期45配体（CDC45L）、含DEP结构域1（DEPDC1）、M期磷蛋白1（MPHOSPH1）、前列腺特异性抗原（PSA）、前列腺特异性膜抗原（PSMA）、人表皮生长因子受体2/成神经细胞瘤（HER2/neu）、癌胚抗原（CEA）、突变表皮生长因子受体（EGFR）、黑色素瘤抗原（MAGE）、粘蛋白1（MUC-1）和New York食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）、BAGE、GAGE、MAGE、NY-ESO-1、SSX、gp100、Melan-A/Mart-1、酪氨酸酶、乳腺珠蛋白-A、p53、livin、存活素、β-肌动蛋白/4/m、肌球蛋白/m、HSP70-2/m、HLA-A2-R17OJ、GM2、GD2、GD3、MUC-1、sTn、globo-H、WT1、PR1、E75、ras、AFP、URLC10、VEGFR1和2、突变型p53、NY-ESO-1、HPV16 E7、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、α-肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、神经节苷脂、WT1、EphA2、EphA3、CD20、端粒酶、MART-1或其抗原部分。参见Hirayama等人2016，Int. Immunol. Advance Access May 28，第1-26页。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是EphA2。

此外，还包含的是上述肿瘤相关抗原的变体。此类变体具有与特异性肿瘤相关抗原至少相同的基本抗原活性。此外，应理解，如根据本发明提及的变体应该具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍然优选与特异性肿瘤相关抗原的氨基序列至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%等同。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以通过本领域众所周知的算法来确定。

可以使用本领域技术人员已知和本文描述的方法，将第三核酸序列插入表达嵌合溶瘤病毒的核苷酸序列内。例如，pCK1166载体（Cassady等人，J. Virol 86（a），第610-4页（2012））可以用于基于重组的转基因表达盒的插入，包括用于表达肿瘤相关抗原的序列。在一些实施方案中，第三核酸序列在γ₁34.5基因座处插入嵌合溶瘤病毒内。

在一些实施方案中，将肿瘤相关抗原修饰为包括结合蛋白或增加其通过由嵌合溶瘤病毒感染的细胞的分泌。例如，在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包括树突细胞结合肽。在其它实施方案中，肿瘤相关抗原是分泌性蛋白。合适的树突细胞结合肽包括与树突细胞相关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖-整联蛋白配体结合的肽。

制备方法

除非另外特别指出，否则可以使用本领域技术人员已知用于该特定试剂或化合物的任何方法，来制备本文公开的嵌合溶瘤病毒和执行公开的方法所必需的组合物。例如，核酸可以使用标准化学合成方法来制备，或者可以使用酶促方法或任何其它已知方法来产生。此类方法的范围可以从标准的酶促消化随后为核苷酸片段分离（参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版（Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989），第5、6章），到纯合成方法例如通过使用Milligen或Beckman System 1Plus DNA合成仪（例如，Milligen-Biosearch，Burlington，Mass.的型号8700自动合成仪或ABI型号380B）的氰乙基亚磷酰胺方法。可用于制备寡核苷酸的合成方法还通过Ikuta等人，Ann. Rev. Biochem. 53:323-356（1984）（磷酸三酯和亚磷酸三酯方法），以及Narang等人，Methods Enzymol.，65:610-620（1980）（磷酸三酯方法）进行描述。蛋白质核酸分子可以使用已知方法，例如通过Nielsen等人，Bioconjug. Chem. 5:3-7（1994）描述的方法进行制备。

嵌合溶瘤病毒和病毒载体可以如实施例中所述进行重组制备，或通过如许多标准实验室手册中所述的制备重组病毒的其它方法进行制备，所述标准实验室手册例如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology（1986），以及Sambrook等人，MolecularCloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.（1989）。在制备本文所述的病毒载体的方法中，相似的方法用于引入目的基因。例如，可以在DNA共转染后，使用同源重组来构建重组病毒。在该实例中，可以将细胞与含有目的基因的至少两种不同病毒共转染，并且可以基于标记物表达的丧失来纯化子代病毒噬菌斑。候选病毒的正确遗传组构的最终验证，可以通过使用针对如本文所述的核酸的探针的DNA杂交研究来验证。

本文描述的核酸序列可以使用标准的克隆和筛选技术，从天然来源例如基因组DNA文库获得，或者可以使用众所周知和商购可得的技术来合成。

当核酸序列重组使用时，核酸序列可以包括单独的成熟多肽的编码序列，或与其它编码序列在读码框中的成熟多肽的编码序列，所述其它编码序列例如编码前导区或分泌序列、前蛋白或蛋白原或前蛋白原序列、或其它融合肽部分的编码序列。核酸序列还可以含有非编码的5'和3'序列，例如转录的、非翻译的序列，剪接和多聚腺苷酸化信号，核糖体结合位点和稳定mRNA的序列。

核酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针、或者用作核酸扩增（PCR）反应的引物，以分离编码多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及分离cDNA和具有高度序列相似性的其它基因（包括编码来自不同物种的同源物和直向同源物的基因）的基因组克隆。

本文所述的核酸，包括来自物种的同源物和直向同源物，可以通过包括以下步骤的方法获得：在严格的杂交条件下，用标记的探针或其片段筛选适当的文库（如通过本领域普通技术人员理解的）；并且分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术是技术人员众所周知的。

癌症治疗

在一个方面，本发明提供了通过使受试者的癌细胞与嵌合溶瘤病毒接触来治疗受试者中的癌症的方法，所述嵌合溶瘤病毒包含：具有修饰的核酸序列的疱疹病毒。修饰的核酸序列包括降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；以及编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。嵌合溶瘤病毒可以是本文所述的任何变体和实施方案。例如，在一些实施方案中，疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒，而在进一步的实施方案中，第二病毒核酸序列是巨细胞病毒（CMV）核酸。

本发明提供了使用本文所述的嵌合溶瘤疱疹病毒治疗有此需要的受试者的癌症的方法。术语“癌症”指由细胞增殖引起或特征在于细胞增殖的增殖性病症，所述细胞已丧失对正常生长控制的敏感性。相同组织类型的癌症通常源于相同的组织，并且可以基于其生物学特征分为不同的亚型。癌症的四个一般范畴是癌（上皮细胞衍生的）、肉瘤（结缔组织或中胚层衍生的）、白血病（血液形成组织衍生的）和淋巴瘤（淋巴组织衍生的）。

描述了通过使受试者的癌细胞与嵌合溶瘤病毒接触来治疗受试者的癌症的方法。接触步骤可以在体内或离体执行。靶细胞可以是实体瘤细胞。所公开的嵌合病毒还可以用于治疗癌前状况，例如宫颈和肛门发育不良、其它发育不良、重度发育不良、增生、非典型增生或瘤形成。因此，靶细胞可以是腺癌、肝母细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、骨髓瘤、膀胱癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、头颈癌、睾丸癌、结肠直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。靶细胞可以是外胚层衍生的癌细胞。靶细胞可以是脑癌细胞。因此，靶细胞可以是成神经细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞或成胶质细胞瘤细胞。靶细胞可以是乳腺癌细胞。靶细胞可以是肝母细胞瘤细胞或肝癌细胞。杀死靶细胞的方法可以进一步包括本领域已知用于促进细胞死亡的另外步骤。

本文还提供的是治疗受试者的癌症的方法，其包括使癌细胞与本文提供的嵌合溶瘤病毒接触。癌症可以选自腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、骨髓瘤、肝母细胞瘤、膀胱癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、头颈癌、睾丸癌、结肠直肠癌、前列腺癌和胰腺癌。因此，癌症可以是神经胶质瘤。在进一步的实施方案中，癌症可以是成胶质细胞瘤。癌症可以是成神经细胞瘤。癌症可以是乳腺癌。癌症也可以是胰腺癌或肝母细胞瘤。

成胶质细胞瘤（GBM）抑制浸润和外周免疫细胞功能。肿瘤分泌TGF-β、IL-10和前列腺素E2，其下调T淋巴细胞免疫识别和细胞因子产生。肿瘤内的调节性T细胞（T_Reg）和肿瘤相关的巨噬细胞促成升高的IL-10产生，其在功能上损害浸润的T效应细胞。已鉴定了在GBM中特异性表达或上调的几种肿瘤抗原，但肿瘤微环境中的免疫抑制和恶性细胞中的功能失调的抗原加工途径减弱了获得性免疫应答。Mohme等人，Cancer Treat Rev，40（2）:248-58（2014）

如本文所述，用于癌症治疗的嵌合溶瘤病毒包括编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。肿瘤相关抗原可以是仅存在于肿瘤细胞中而不存在于任何其它细胞上的抗原，或者它可以是存在于一些肿瘤细胞以及一些正常细胞中的抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是在待治疗的癌症上发现的抗原。例如，EphA2是通常由成胶质细胞瘤表达的肿瘤相关抗原。相应地，当治疗成胶质细胞瘤时，嵌合溶瘤病毒可以被修饰为表达肿瘤相关抗原EphA2。

抗病毒免疫应答促成嵌合溶瘤病毒的效应。嵌合溶瘤病毒诱导干扰素信号传导，其募集先天性（例如嗜中性粒细胞、NK细胞和巨噬细胞）和适应性（CD4+、CD8+）免疫应答，以及改善的抗原识别。嵌合溶瘤病毒还逆转免疫抑制性肿瘤环境，并且刺激抗肿瘤免疫识别。在嵌合溶瘤病毒中包括肿瘤相关抗原增强了疫苗方法，导致嵌合溶瘤病毒基于疫苗接种效应而提供持续的抗肿瘤效应。

根据本发明的方法包括单独嵌合溶瘤病毒的施用或组合疗法，其中动物还经历选自手术、化学疗法、放射疗法、热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的一种或多种癌症疗法。

一般而言，任何组合疗法将包括以下中的一种或多种：化学治疗剂，靶向试剂如抗体；激酶抑制剂；激素试剂等等。组合疗法也可以包括常规疗法，包括但不限于抗体施用，疫苗施用，细胞毒素剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答修饰剂的施用。两种或更多种组合的化合物可以一起或序贯使用。例如，本领域众所周知并且可以与本文所述的组合物组合用作治疗的抗癌试剂包括但不限于。如本文使用的，一线“化学治疗试剂”或一线化学疗法是这样的药剂，其可以用于治疗癌症，并且一般具有直接杀死癌细胞的能力。

化学治疗试剂的实例包括烷化剂、抗代谢物、天然产物、激素和拮抗剂、以及混杂试剂。烷化剂的实例包括氮芥，例如甲氧乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑（L-溶肉瘤素）和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，例如六甲基三聚氰胺和噻替哌；烷基磺酸盐，例如白消安；亚硝基脲，例如卡莫司汀（BCNU）、司莫司汀（甲基-CCNU）、洛莫司汀（CCNU）和链脲菌素（链脲霉素）；DNA合成拮抗剂，例如磷酸雌莫司汀；以及三嗪，例如达卡巴嗪（DTIC、二甲基-三氮烯咪唑甲酰胺）和替莫唑胺。抗代谢物的实例包括叶酸类似物，例如氨甲蝶呤（甲氨蝶呤）；嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶、5-FU、5FU）、氟尿苷（氟脱氧尿苷、FUdR）、阿糖胞苷（胞嘧啶阿糖核苷）和吉西他滨；嘌呤类似物，例如巯基嘌呤（6-巯基嘌呤、6-MP）、硫鸟嘌呤（6-硫鸟嘌呤、TG）和喷司他丁（2'-脱氧助间型霉素、脱氧助间型霉素）、克拉屈滨和氟达拉滨；以及拓扑异构酶抑制剂，例如安吖啶。天然产物的实例包括长春花生物碱，例如长春碱（VLB）和长春新碱；紫杉烷类，例如紫杉醇（Abraxane）和多西他赛（泰索帝）；表鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；喜树碱，例如托泊替康和伊立替康；抗生素，例如放线菌素（放线菌素D）、柔红霉素（道诺霉素、正定霉素）、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素（丝裂霉素C）、伊达比星、表柔比星；酶，例如L-天冬酰胺酶；以及生物应答调节剂，例如干扰素α和白细胞介素2。激素和拮抗剂的实例包括黄体生成素释放激素激动剂，例如布舍瑞林；肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松和有关制剂；孕激素，例如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和炔雌醇和有关制剂；雌激素拮抗剂，例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素，例如丙酸睾酮和氟甲睾酮和有关制剂；雄激素拮抗剂，例如氟他胺和比卡鲁胺；以及促性腺激素释放激素类似物，例如亮丙瑞林。混杂试剂的实例包括沙利度胺；铂配位络合物，例如顺铂（czs-DDP）、奥沙利铂和卡铂；蒽二酮类，例如米托蒽醌；取代的脲，例如羟基脲；甲基肼衍生物，例如丙卡巴肼（N-甲基肼、MIH）；肾上腺皮质激素遏抑剂，例如米托坦（o,p'-DDD）和氨鲁米特；RXR激动剂，例如贝沙罗汀；以及酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼。

如本文使用的，术语“放射治疗方案”或“放射疗法”指施用辐射以杀死癌细胞。辐射与细胞内的各种分子相互作用，但导致细胞死亡的主要靶是脱氧核糖核酸（DNA）。然而，放射疗法还经常导致对细胞膜和核膜以及其它细胞器的损伤。DNA损伤通常涉及糖-磷酸主链中的单链和双链断裂。此外，可能存在DNA和蛋白质的交联，其可以破坏细胞功能。取决于辐射类型，DNA损伤的机制可能变化，如相对生物学有效性一样。例如，重颗粒（即质子、中子）直接损伤DNA，并且具有更大的相对生物学有效性。然而，电磁辐射导致通过短命的羟基自由基起作用的间接电离，所述羟基自由基主要通过细胞水的电离产生。辐射的临床应用由外部束辐射（来自外部源）和近距离放射疗法（使用植入或插入患者内的辐射源）组成。外部束辐射由X射线和/或γ射线组成，而近距离放射疗法采用衰变且发射α粒子或β粒子连同γ射线的放射性核。

针对癌症的免疫

本发明的另一个方面提供了针对癌症来免疫受试者的方法。该方法包括向受试者施用嵌合溶瘤病毒，其包含：具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包含：降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；以及编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列，其中所述嵌合溶瘤病毒在针对癌症有效免疫受试者的条件下施用。在一些实施方案中，嵌合溶瘤病毒连同药学上可接受的载体一起施用。

嵌合溶瘤病毒可以是本文所述的任何变体和实施方案。例如，在一些实施方案中，疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒，而在进一步的实施方案中，疱疹病毒γ₁34.5基因的修饰包括γ₁34.5基因的缺失或突变。

嵌合溶瘤病毒可以用于针对本文所述的任何类型的癌症来免疫受试者。例如，在一些实施方案中，癌症选自腺癌、肝母细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、骨髓瘤、膀胱癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、头颈癌、睾丸癌、结肠直肠癌、前列腺癌和胰腺癌。在一个进一步实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤。

免疫可以用于减少癌症在受试者中发展的可能性。在一些实施方案中，将嵌合溶瘤病毒施用于已鉴定为处于发展癌症（例如，成胶质细胞瘤）的风险中的受试者。由于发展癌症的家族史、与癌症风险增加相关的基因的鉴定、或者暴露于辐射或其它致癌材料，受试者可能处于发展癌症的风险中。

制剂和施用方法

本文所述的嵌合溶瘤病毒和病毒载体可以在药学上可接受的载体中，在体外或体内进行施用。“药学上可接受的”意指并非生物学上或其它方面不期望的材料，即，该材料可以连同核酸或载体一起施用于受试者，而不引起任何不期望的生物效应、或以有害方式与它包含在其中的药物组合物中的任何其它组分相互作用。如本领域技术人员众所周知的，载体天然地选择为使活性成分的任何降解降到最低，并且使受试者中的任何不利副作用降到最低。

材料可以处于溶液、悬浮液中（例如，掺入微粒、脂质体或细胞内）。这些可以经由抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。媒介物如“隐形(stealth)”和其它抗体缀合的脂质体（包括脂质介导的靶向结肠癌的药物），受体介导的通过细胞特异性配体的DNA靶向，淋巴细胞指导的肿瘤靶向，以及在体内对鼠神经胶质瘤细胞的高度特异性的治疗性逆转录病毒靶向。一般而言，受体涉及组成性或配体诱导的内吞途径。这些受体聚簇在网格蛋白包被的小窝中，经由网格蛋白包被的囊泡进入细胞，经过受体在其中进行分选的酸化内体，然后再循环到细胞表面，变得细胞内贮存，或在溶酶体中降解。内在化途径发挥各种功能，例如营养素摄取、活化蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调控。许多受体遵循多于一种细胞内途径，取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体效价和配体浓度。

除选择的分子（在这种情况下为病毒或病毒载体）之外，药物组合物还可以包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性试剂等等。药物载体是本领域技术人员已知的。这些最通常为用于向人施用药物的标准载体，包括溶液如无菌水、盐水以及在生理pH下的缓冲溶液。合适的载体及其制剂在Remington: The Science and Practice ofPharmacy（第19版）编辑A. R. Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，Pa. 1995中进行描述。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐，以致使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，并且更优选为约7至约7.5。进一步的载体可以包括缓释制剂，例如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，取决于例如施用途径和待施用组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳状液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、以及可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂（例如基于林格氏右旋糖的补充剂）等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如；例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。

一些组合物可能潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐进行施用，所述盐通过与以下反应而形成：无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸，或者无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，以及有机碱例如单、二、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺。

病毒和载体可以以许多方式进行施用，取决于是需要局部治疗还是需要全身治疗、以及待治疗的区域。施用可以是局部、经口、通过吸入或肠胃外，例如通过静脉内滴注，皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的病毒和载体可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或经皮施用。因此，所提供的病毒和载体对脑的施用可以是颅内、硬膜下、硬膜外或脑池内的。例如，所提供的病毒和载体可以通过立体定向递送直接施用到肿瘤内。还应理解，如果病毒或载体与允许穿越血脑屏障并在血液中存活的部分组合，则对CNS的肿瘤的递送可以是通过血管内递送。因此，可以组合增加血脑屏障的通透性的试剂。试剂包括例如弹性蛋白酶和脂多糖。所提供的病毒和载体经由颈动脉施用。在另一个方面，所提供的病毒和载体在脂质体中施用，所述脂质体例如本领域已知或本文所述的脂质体。所提供的病毒和载体可以血管内或通过直接注射到肿瘤内施用于不在脑中的癌症。

组合物的肠胃外施用（如果使用的话）一般以注射为特征。注射剂可以按常规形式制备为液体溶液或悬浮液，适合于在注射前在溶液中溶解或悬浮的固体形式，或者乳状液。用于肠胃外施用的最新修订方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统，使得恒定剂量得到维持。参见例如，美国专利号3,610,795，其关于其中教导的方法引入本文作为参考。

还能够将分子（缀合物）与病毒或病毒载体连接，以增强例如细胞摄取。缀合物可以与病毒或病毒载体化学连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分。（Letsinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989，86:6553-6556）。

本文所述的病毒和病毒载体可以例如通过对流增强的递送来施用，所述对流增强的递送已与腺病毒和AAV一起使用，以通过肿瘤间质中的总体流动来增加病毒的分布。Chen等人，J. Neurosurg. 103（2）:311-319（2005）遗传修饰也已用于增强病毒传播。例如，致融合糖蛋白基因的插入产生了具有增强的抗神经胶质瘤效应的溶瘤病毒。Fu等人，Mol.Ther. 7（6）: 748-54（2003）。因此，本文描述的病毒载体可以包含此类基因。

剂量

所需组合物的确切量将因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄、重量和一般状况，待治疗疾病的严重程度，所使用的特定病毒或载体，其施用模式等等。因此，不可能对于每一种组合物指定确切量。然而，鉴于本文的教导，适当的量可以通过本领域普通技术人员，仅使用常规实验来确定。

可以凭经验确定用于施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行此类确定在本领域的技术内。例如，存在几种脑肿瘤模型，其提供了用于快速筛选和评估实验疗法的潜在毒性和功效的机制。存在用于关键研究的六种分开的人神经胶质瘤异种移植模型。Pandita等人，Genes Chromosomes Cancer 39（1）: 29-36（2004）。自发地衍生的同系神经胶质瘤模型也是可获得的，所述模型并不表达通常与化学或病毒诱导的实验性肿瘤相关的外源抗原。Hellums等人，Neuro-oncol. 7（3）: 213-24（2005）。用于各种癌症的其它动物模型可以例如得自The Jackson Laboratory，600 Main Street Bar Harbor，Me. 04609 USA，其提供了数百种癌症小鼠模型。肿瘤体积的直接（组织学）和功能测量（存活）均可以用于监测对溶瘤疗法的应答。这些方法涉及处死代表性动物以评估群体，增加了实验所需的动物数目。肿瘤中萤光素酶活性的测量提供了替代方法来评估肿瘤体积，而无需动物处死，并且允许纵向的基于群体的治疗分析。

关于组合物施用的剂量范围是足够大以产生所需效应的剂量范围，在所述效应中疾病的症状受到影响。剂量不应太大而引起不利的副作用，例如不需要的交叉反应、过敏反应等等。在任何禁忌症的情况下，剂量可以通过个体医生进行调整。剂量可以变化，并且可以每天在一个或多个剂量施用中进行施用，共一天或几天。

病毒回收和免疫组织化学已成功地用于监测在体内的病毒复制和传播。通过病毒的生物发光和荧光蛋白表达，也可以用于间接地监测肿瘤中的病毒复制和传播。重组病毒中通常使用编码荧光报告蛋白（d2EGFP和dsRED单体）、或生物发光标记物（萤火虫萤光素酶）的基因。这些不仅促进了体外重组病毒的筛选和选择。报告基因还允许在体内研究中的病毒活性的间接监测。

与现有的减毒疱疹病毒相比，所提供的嵌合病毒需要较低的剂量。与常规的减毒疱疹病毒例如Δγ₁34.5 HSV相比，所提供的嵌合病毒显著改善了存活，并且在较低剂量下是有效的。例如，所公开的嵌合溶瘤病毒在10³ pfu，包括10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹ pfu，或两者之间的任何量下是有效的。因此，嵌合病毒的剂量可以为5×10³至5×10⁶ pfu，更优选为5×10⁴至5×10⁵。

下述实施例为了说明的目的而包括，并不预期限制本发明的范围。

实施例

实施例1：oHSV构建和树突细胞靶向

GBM是最致命和治疗难治性癌症之一，导致实验疗法中的兴趣。两种类型的实验疗法（树突细胞免疫疗法和oHSV疗法）已在用于成人GBM的近期早期临床试验中证实了功效。Phuphanich等人，Cancer Immunol Immunother，62（1）: 第125-35页（2013）。尽管它们是不同的方法，但两种策略均很可能通过诱导抗肿瘤免疫来达到功效。溶瘤HSV的功效先前归于直接基于复制的肿瘤细胞裂解；然而，宿主细胞抗病毒应答的病毒活化越来越多地被识别为另一种重要效应，因为这些应答募集了有力的抗肿瘤效应物，并且刺激了获得性免疫应答。许多oHSV的肿瘤细胞选择性基于γ₁34.5神经毒力基因的缺失（Δγ₁34.5 oHSV），这致使其能够安全地直接接种到CNS内，但也削弱其在肿瘤中的复制。为了克服这一点，制备了嵌合的Δγ₁34.5 oHSV（C134），其表达来自远缘相关的疱疹病毒，人巨细胞病毒（HCMV）的IRS1基因。Shah等人，Gene Ther，14（13）: 第1045-54页（2007）。与第一代oHSV不同，C134维持蛋白质翻译，并且这导致肿瘤细胞中改善的病毒复制，而不使得病毒更具毒力。C134引发稳健的IFN应答，最终导致先天和获得性效应细胞群体的改善募集和活化。Cassady等人，JVirol,，86（1）: 第610-4页（2012）。

本发明人已利用了C134的蛋白质翻译和免疫刺激特性，以通过直接从病毒基因组过表达神经胶质瘤抗原，来增加对肿瘤抗原的交叉致敏作用。他们先前证实了基于病毒的转基因表达是有效的，并且在感染后可能绕过抑制宿主细胞基因表达的HSV途径，包括潜在的肿瘤相关抗原（TAA）。Shu等人，Proc Natl Acad Sci U S A，110（18）: 第E1669-75页（2013）。另外，他们已改造了C134表达的TAA，以从受感染的细胞中分泌，用于靶向结合树突细胞（DC）。受GBM和HSV感染的细胞中的抗原加工途径被减弱，而HSV感染增强邻近细胞中的MHC表达，并且将活化的DC募集到周围组织内。因此，分泌的TAA在APC中具有更好的摄取和交叉呈递的机会，而DC靶向元素与TAA的融合应增强这种活性。

与Δγ₁34.5 oHSV相比，在C134治疗之后改善的动物存活似乎部分通过抗肿瘤免疫的刺激来介导。先前的研究已证实了，在胁腹GBM模型中的重复oHSV施用可以诱导获得性抗GBM免疫。Iizuka等人，Int J Cancer，118（4）: 第942-9页（2006）。本发明人比较了在C134和Δγ134.5 oHSV施用之后诱导的免疫应答的水平和特异性。还评价了每种病毒诱导抗肿瘤应答超过针对病毒抗原的抗肿瘤应答的程度。本发明人认为，C134增强了获得性抗肿瘤免疫应答，并且这些应答是其功效的主要机制。

EphA2穿梭载体的构建：pCK1136载体用于基于重组的转基因表达盒插入C134的γ₁34.5基因座内（图1A、B）。Cassady等人，J Virol，86（1）: 第610-4页（2012）。这种载体利用鼠Egr-1启动子来驱动转基因表达。本发明人先前使用这种策略来制备C134的表达GFP的衍生物（C154）。如图1C-F中描绘的，将四种分开的EphA2衍生物插入pCK1134内：第一种编码具有C末端Myc标签的全长EphA2读码框（图1C）。对于分泌性变体，EphA2编码序列被截短为包含细胞外结构域（图1D-E）或胞质结构域。EphA2的前28个N末端残基与胞质结构域（aa575-977）的融合恢复了EphA2前导序列的切割潜力，其应重新制定细胞内结构域用于分泌的路线（图1F）。所有构建体都含有C末端Myc标签，以区分C134表达的EphA2与受感染的肿瘤细胞的EphA2。本发明人已鉴定了靶向DC细胞的许多肽（图4）。对于DC靶向，可以将鼠DC结合肽编码序列改造到分泌的EphA2变体的C末端内（图1E-F）。

oHSV构建和验证：每种pCK1136-EphA2变体通过共转染到兔皮肤细胞内，用于与C154重组。将各个GFP阴性噬菌斑连续传代并纯化，用于进一步表征。对病毒克隆内的EphA2表达盒进行测序。为了验证基于病毒的EphA2表达导致升高的EphA2水平，GL261细胞被C134和C134-EphA2衍生物感染。通过受感染的细胞裂解产物的蛋白质分析，来测量EphA2水平（总体和加上Myc标签的）。通过ELISA评估分泌的变体的表达，并且通过与树突细胞的结合的流式细胞术检测来评价DC靶向。病毒回收测定用于确保所有oHSV具有等价的复制率。

本发明人评估了基于C134的抗原表达是否增强了鼠原位GBM模型中的GBM特异性CTL应答和存活。原位GL261肿瘤将在同系C57BL/6小鼠中建立。第一组研究比较了用细胞i.c.植入的小鼠中的存活，所述细胞用C134或表达全长EphA2变体的C134进行离体感染。小鼠在移植后的第5天和第15天时进行再处理，并且评估了EphA2特异性应答。

本发明人还确定了分泌和靶向是否改善EphA2特异性应答。进行了动物研究，以评价DC靶向的EphA2变体的分泌（图1E、F）是否改善存活。本发明人还评估了非靶向的EphA2变体（图1D），以查明分泌和/或伴随靶向的分泌是否负责改善的结果。实验显示了，表达EphA2的C134衍生物，特别是分泌并靶向DC的变体，将改善具有GL261肿瘤的小鼠的存活。

C134在鼠脑肿瘤模型中介导复制依赖性和不依赖性的存活益处。在人U87 GBM细胞系中的初步研究证实了，与Δγ₁34.5病毒相比，C134具有高达1000倍的复制速率，其转化为具有U87肿瘤的免疫缺陷动物中的改善存活（图2A）。然而，C134在荷有同源Neuro2A肿瘤的免疫活性小鼠中也是保护性的，在所述小鼠中不存在复制优势（图2B）。这些数据提示了，C134也可能具有增强的免疫刺激潜力。为了在同系GBM模型中测试这个现象，小鼠用i.c. DBT细胞进行植入，并且用盐水、Δγ₁34.5（R3616）或C134 oHSV进行处理。每个组中的存活动物随后用DBT胁腹肿瘤进行再次攻击。然后评价从存活动物获得的血清和脾细胞的免疫反应性。如图3A中所示，从首次用于实验和所有处理组中收集的血清检测到在DBT和Neuro2A（N2A）细胞裂解产物两者中的共同条带。然而，即使在4000倍稀释后，C134处理的小鼠血清仍在两种细胞系的提取物中识别独特的~60 KDa条带（箭头）。类似地，用10倍过量的从C134处理的小鼠中收集的混合脾细胞，达到DBT细胞的细胞毒性（图3B）。这些研究证实了基于C134的抗肿瘤免疫刺激，并且提示这些效应可以通过将免疫引导至特异性TAA得到增强。

除用于诱导抗肿瘤免疫的基于C134的EphA2变体表达之外，本发明人评估了掺入DC靶向结构域以增强这些应答。他们使用噬菌体展示先前鉴定了与髓样衍生的DC结合的肽，并且当作为N末端和C末端蛋白融合物掺入时，该肽维持结合功能。Alberti等人，GeneTher，20（7）: 第733-41页（2013）。他们最近还鉴定了与树突细胞相关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖-整联蛋白配体（DCHIL/GPNMB）结合的12聚体肽（图4A）。树突细胞上的GPNMB表达通过与多配体蛋白聚糖-4的共抑制剂相互作用，来阻止记忆和效应T细胞活化。这些肽可以允许抗原靶向表达GPPNB的APC，以及抑制GPPNB介导的T细胞抑制。

实施例2：用于建模oHSV抗肿瘤应答的DBT恶性神经胶质瘤细胞系的评估

越来越多地，免疫应答被识别为促成抗肿瘤疗法（生物制品、放射治疗、化学疗法）的长期抗肿瘤效应的重要组分。过去，研究人员已质疑免疫应答的重要性及其在oHSV介导的抗肿瘤活性中的作用。这些研究已允许我们开发主要依赖于免疫介导的抗肿瘤应答的体内模型。如图5A中所示，与其它神经胶质瘤细胞系形成对比，DBT恶性神经胶质瘤细胞系对oHSV感染和致细胞病变效应是高度抗性的。

使用这种模型，本发明人能够鉴定在我们的第一代和第二代重组病毒之间的溶瘤活性差异，以及细胞因子表达、给药时间表和先前免疫如何影响间接抗肿瘤应答。与过去的CNS肿瘤模型形成对比，病毒产量在体内在第一代和第二代oHSV之间是等价的，并且直接的病毒细胞溶解并未显著促成这种同系神经胶质瘤中的抗肿瘤活性（图5）；因此允许我们分开地评价免疫介导的抗肿瘤效应。

在DBT模型中，尽管在CNS肿瘤中等价的病毒复制（图5B），C134再次优于第一代Δγ₁34.5 oHSV（图6A）。这提示了在病毒的致细胞病变活性方面存在差异（不依赖于复制），或者免疫介导的应答不同。在过去的基于成神经细胞瘤的研究中，本发明人鉴定了免疫应答促成这种差异。在无胸腺裸鼠的CNS中植入N2A肿瘤消除了oHSV抗肿瘤疗法的任何存活优势。为了测试免疫应答是否促成这种抗肿瘤应答，将DBT肿瘤细胞植入存活者和首次用于实验的小鼠的胁腹中。先前的oHSV处理的存活小鼠抑制了在再次攻击过程中的肿瘤生长，提示了在这些存活者中已发展了循环的抗肿瘤免疫。相比之下，在oHSV和未经历肿瘤的首次用于实验的小鼠中，植入的肿瘤不受控制地生长。这些研究加强了抗肿瘤免疫应答促成oHSV疗法，并且这并非单一动物或肿瘤类型所独有的。

执行winn型测定以确定抗肿瘤免疫应答是否可以被引发。这些研究鉴定了，对于我们的第一代和第二代C134 oHSV两者，测试的所有病毒的重复给药改善了oHSV的抗肿瘤活性（图7）。这些研究还提示了，来自oHSV的外源抗原表达可以延长存活（图7：C154: C134+EGFP）。研究还验证了，通过来自C134的促炎mIL-12细胞因子表达引发免疫应答，也延长神经胶质瘤模型中的存活（图8，C002相对于C134）。先前的研究显示了，在成神经细胞瘤CNS模型中的类似益处；这些研究同样对于神经胶质瘤确认了这一点。

研究还鉴定了来自oHSV疗法的长期抗肿瘤益处。相对于单独暴露于肿瘤抗原的小鼠，oHSV处理改善了持久的抗肿瘤免疫（图9）。oHSV介导的抗肿瘤免疫似乎是循环免疫应答，并且不需要驻留的记忆细胞，因为存活的小鼠能够排斥在远处部位植入的肿瘤。

本发明人已假设先前的免疫可以改善免疫应答，并且增加对肿瘤的旁观者损伤；然而，他们的发现提示了，预先存在的HSV免疫并不改善oHSV抗肿瘤效应，也不改善存活（图10A和B）。对于“非武装的（unarmed）” oHSV（R3616和C134），先前的免疫没有益处，但它也是无害的。

出乎意料的是，发现先前的免疫对基于C134的表达mIL-12细胞因子的病毒C002是有害的（图10C）。如先前讨论的，IL-12表达（其增强T细胞活化）显著改善了C134的抗肿瘤活性（图8）。本发明人已预料到，C002将改善这些引发的T细胞的抗肿瘤活性。然而，发现HSV免疫不利地影响了这种重组体，并且消除了由IL-12表达所提供的任何优势，致使其在HSV免疫的小鼠中仅与C134一样有效。本发明人已确定，在具有先前免疫的小鼠中，在接种后的最初几天过程中，C002不能很好地复制。定量PCR研究也检查了病毒IL-12转基因表达。IL-12表达的丧失可以解释为何C002（C134+mIL12）在本研究中表现类似于C134 oHSV。

该发现是不曾预料的，并且提示存在首次用于HSV实验和经历HSV的个体中的oHSV活性的不同贡献者，并且提出了几个新问题。这种oHSV活性的丧失是“武装的”转基因表达病毒特异性的，还是表达Il-12的病毒在其增强抗HSV免疫应答的能力方面独特的

先前的免疫是否限制我们所有oHSV（第一代Δγ134.5和C134）的复制，转变免疫动物中的直接和间接抗肿瘤贡献

我们过去的研究已使用存活作为总体oHSV抗肿瘤活性的量度。这种读出组合了直接和间接的抗肿瘤效应。尽管过去的研究未显示“净抗肿瘤效应”的变化，但先前的免疫可能转变直接（病毒细胞溶解）和间接免疫介导的抗肿瘤效应的相对贡献。对于依赖稳健病毒基因表达的新一代武装oHSV（如C002或M002），这是尤为重要的问题。

本发明人制备并验证了6种不同的基于C134的表达肿瘤抗原的病毒（概括于图11中）。收集了关于6种病毒各自的两个分离株（12种病毒），命名为（C170-181），并且通过DNA杂交、转基因表达、细胞内抗原定位和在感染过程中的细胞分泌进行验证（图5）。剩下的有待完成：在体外和体内显示MBP标签功能（与抗原呈递细胞[APC]结合）的证据。

总之，本发明人能够验证肿瘤模型明确地显示了免疫应答促成oHSV疗法，并且可以调节这种应答以改善持久的抗肿瘤效应。他们还发现它不足以产生针对该病毒的免疫应答。实际上，尽管集中于抗病毒免疫应答并未阻碍第一代或第二代oHSV，但它确实影响了用武装的细胞因子表达病毒处理的小鼠的存活。表达肿瘤抗原的oHSV（C170-C181）的开发，允许进一步剖析抗肿瘤和抗病毒免疫应答的作用。

实施例3：表达抗原的溶瘤病毒—靶向共享抗原的多模式抗肿瘤疫苗

为了确定基于病毒的肿瘤相关胎儿抗原（TAFA）表达是否改善对OV免疫疗法抗性的肿瘤中的抗肿瘤免疫，本发明人制备了基于C134的病毒（C170），其编码鼠（B6）TAFAEphrin A2。他们使用体外和体内B6同系模型两者，调查了病毒TAFA表达如何影响OV抗肿瘤活性和针对EphA2的免疫应答。结果显示了，当与C134处理的组相比时，基于C134的EphA2表达改善抗肿瘤效应，改变肿瘤相关的免疫浸润，并且改善抗肿瘤记忆应答、伴随远隔效应，并且引发特异性抗EphA2 T细胞应答。这些令人兴奋的发现确认了，OV可以进行修饰以增强“自身” TAFA的免疫识别，并且该策略可以用作将病毒用于体内抗肿瘤疫苗接种的方法。

材料和方法

细胞系和病毒

CT2A细胞由Dr. Seyfried Boston College友情提供，并且在补充有10%胎牛血清（FBS）的达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中繁殖。67C-4由Dr. Tim Cripe友情提供，并且由他的合作者Dr. Nancy Ratner开发并提供给他，并且维持在补充有10% FBS的DMEM中。使用ATCC通用支原体检测试剂盒，肿瘤系对于支原体污染检测呈阴性。在研究中使用具有相对低传代数（< 12次传代）的肿瘤细胞，然后返回“低”传代形式的细胞系，以使我们研究中的遗传漂移降到最低。病毒先前已得到描述（Ghonime等人，Translational oncology，11:86-93（2017）），但简言之，HSV-1（F）毒株和R3616，Δγ₁134.5重组体，由Dr. BernardRoizman（University of Chicago，Chicago，IL）友情提供。Chou等人，Science，250:1262-6（1990）。C134先前已得到描述。Shah等人，Gene Ther，14:1045-54（2007）。简言之，C134是Δγ₁134.5病毒，其含有处于UL3/UL4基因间区域中的CMV IE启动子的控制下的HCMV IRS1基因。Cassady KA.，J Virol，79:8707-15（2005）。C154是C134的EGFP表达版本。

病毒传播测定（在体外）

将B76、B96、67C-4和5NPCIS细胞铺平板到透明的、48孔平底聚苯乙烯组织培养处理的微板（Corning，NY，USA）内，并且允许在37℃下粘附过夜。第二天，在指示的感染复数（MOI）下，用表达EGFP的第二代oHSV-1（C154）感染细胞，并且使用IncuCyte ZOOM平台监测平板，所述平台容纳在37℃与5% CO₂下的细胞培养箱内，直至测定结束。使用10X物镜每3小时获取来自三个重复的9张图像/孔，共3天，然后使用IncuCyte™ Basic Software进行分析。除相位差之外，绿色通道的采集时间为400 ms。

动物研究

动物研究已获得美国全国儿童医院机构动物护理和使用委员会（NationwideChildren’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee）（IACUC；方案编号AR16-00088）批准，并且根据通过NIH实验动物护理和使用指南（NIH Guide for theCare and Use of Laboratory Animals）建立的准则执行。在这些研究中使用两个同系的C57/B16肿瘤模型：大脑内CT2A神经胶质瘤模型和胁腹67C4恶性外周神经鞘瘤（MPNST）模型。

对于胁腹肿瘤模型，将2×10⁶个67C-4 MPNST细胞皮下注射到6至8周龄的C57BL/6小鼠（Envigo，Frederick，MD）的胁腹内。在植入后每两周通过卡尺测量肿瘤大小，并且通过长度×宽度×深度来计算肿瘤体积。当肿瘤大小达到25-150 mm³时，将动物合并，并且随机分到下文讨论的具有可比较的平均肿瘤大小的指定组内。在第4天（最后一个RUX剂量后1天）时，小鼠用媒介物、C134或C170（在100 μL 10%甘油的PBS溶液中3.5 x 10⁷）进行瘤内（IT）处理，并且在一周后再次进行处理。研究3次重复，以确保生物学有效性。

对于存活研究，在初始治疗后每周三次监测动物的肿瘤体积，直到总肿瘤体积/小鼠超过2000 mm³或个别肿瘤>1500 mm³。一旦总体肿瘤大小超过这些标准，就基于IACUC要求处死小鼠。对于细胞募集分析和体内基因表达，如下所述，在初始C134或C170注射后6天，收获肿瘤。将肿瘤在PBS中进行洗涤，并且精细地切碎成小片。然后将组织在37℃下在振荡平台上，在含有胶原酶D（2 mg/mL；Roche）和DNA酶I（0.01 mg/mL；Roche）的RPMI 1640中消化30分钟。在胶原酶消化后，将含有单核细胞的培养基过滤，并且在4℃下以400 x g离心10分钟，将所得到的细胞重悬浮于补充有1% FBS和青霉素/链霉素的RPMI 1640中，然后用于流式细胞术分析和RNA提取。对于CD8耗竭研究，小鼠类似于上文所述用RUX进行处理，但在RUX疗法开始后，将小鼠随机分配到抗CD8耗竭或同种型处理组内。在实验自始至终，小鼠用100µg抗CD8（克隆2.43，Bio X Cell，West Lebanon，NH）或同种型对照（克隆LTF-2，大鼠IgG2a.Bio X Cell，West Lebanon，NH）进行腹膜内（IP）处理，每周两次。小鼠然后如上所述用ITC134进行处理。为了定量CD8耗竭，小鼠经历了尾静脉出血（在开始CD8耗竭后1周），并且使用FITC缀合的抗CD8b（克隆：H35-17.2，eBioscience）分析了CD8+ T细胞群体。

IC肿瘤植入和处理

从（Envigo，Frederick，MD）获得6至8周龄的C57BL/6小鼠。对于存活研究，将5%甲基纤维素中的1×10⁵ CT2A大脑内注射到同系C57BL/6小鼠内，并且如先前描述的，在5天后用媒介物或病毒（1×10⁷ PFU/10 μl）进行处理。Russell SJ，Barber GN.，Cancer cell，33:599-605（2018）每天评价小鼠，并且处死垂死的小鼠并记录日期。使用卡普兰迈耶分析确定存活曲线，并且计算中值存活和95%置信区间。时序检验用于比较各组之间的存活。研究重复两次，以确保生物学有效性。

病毒复制（在体内）

如上所述，在6至8周龄的雌性C57BL/6中建立了67C-4肿瘤。当肿瘤大小达到25-150 mm³时，将小鼠随机分配，并且用C134或C170（在100 μL 10%甘油和PBS中的3.5 × 10⁷pfu）进行瘤内处理。在病毒处理后的第1、3和5天时，收获肿瘤样品并匀浆化。按照制造商的说明书，通过DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Germantown，MD）提取DNA。通过Taqman定量PCR来测量病毒回收率。Ghonime等人，Translational oncology，11:86-93（2017）。简言之，将提取的DNA样品与下述HSV特异性引物和HSV聚合酶的探针一起温育。使用StepOne Plus实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA），从一式三份的样品中测量扩增产物的HSV基因组当量，并且针对阳性对照DNA序列的对数稀释度（10⁶ – 10¹个拷贝）进行比较。使用Prism 78.0统计软件（GraphPad），使用描述性统计分析（平均值和SD）来比较样品之间的DNA拷贝数的差异。

RNA分离

根据制造商的说明书，使用Direct-zol RNA Miniprep Plus试剂盒（ZymoResearch，Irvine，CA），从肿瘤样品中分离总RNA。使用NanoDrop 2000 Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific，Charlotte，NC），来确定RNA数量和纯度。根据制造商的说明书，使用SuperScript III Reverse Transcriptase（Life Technologies，Carlsbad，CA），将2 μg总RNA用于合成cDNA。

流式细胞术

如先前所述获得了来自肿瘤的单细胞悬浮液。Leddon等人，Molecular therapyoncolytics，1:14010（2015）。简言之，将肿瘤在PBS中进行洗涤，并且精细地切碎成小片。然后将组织在37℃下在振荡平台上，在含有胶原酶D（2 mg/mL；Roche）和DNA酶I（0.01 mg/mL；Roche）的RPMI 1640中消化30分钟。在胶原酶消化后，将含有单核细胞的培养基过滤，并且在4℃下以400 x g离心10分钟，将所得到的细胞重悬浮于补充有1% FBS的PBS中，然后用于流式细胞术分析。来自肿瘤的单细胞悬浮液用RBC裂解缓冲液（Sigma）进行裂解，并且用FACS缓冲液（PBS中的1% FBS和1 mM EDTA）中的5%小鼠Fc封闭剂（2.4G2，BD Biosciences，San Jose，CA）进行封闭。用下述抗体染色实验对象组标记细胞，用于分析适应性免疫细胞：（1）来自BioLegend（San Diego，CA，USA）的CD11b-Violet 421（M1/70）、CD4-BV785（GK1.5）、CD25-PE（7D4）、CD8a-BV510（53-6.7）、CD3ε-BV 711（145-2C11）、CD44-APC、CD45-BV605、NKp46–PE-Cy7和B220-AF488（RA3-6B2）。通过用Live/Dead Near/IR染色（APC-Cy7）（ThermoFisher Scientific，Charlotte，NC）染色，来排除死细胞。用上述染色实验对象组，将单个样品在冰上染色30分钟，并且用FACS缓冲液洗涤一次。在标记后，将细胞在1%多聚甲醛中固定，并且在BD FACS LSR II（BD Biosciences）上进行分析。使用FlowJo软件，版本10.0.3（Tree Star Inc.，Ashland，OR）进行分析。

IncuCyte ZOOM病毒传播测定

将细胞铺平板到96孔平坦的透明底部的聚苯乙烯组织培养处理的微板（Corning，NY，USA）内，并且允许在37℃下粘附过夜。C134或C170以指示MOI添加，并且将板转移到IncuCyte ZOOM平台内，所述平台容纳在37℃与5% CO₂下的细胞培养箱内，直至测定结束。使用10X物镜每3小时获取来自三个技术重复的4张图像/孔，共3天，然后使用IncuCyteTMBasic Software进行分析。除相位差之外，绿色通道的采集时间为400 ms。

蛋白质印迹

在具有完整的微型蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Indianapolis，IN）的破裂缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.0、1 mM EDTA、1% Triton X100、0.1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS、140 mMNaCl、20% β-巯基乙醇、0.04%溴酚蓝）中，在冰上收集来自肿瘤样品的细胞裂解产物。使用Pierce™ BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific,Rockford，IL），来测定蛋白质浓度。将样品在98℃下变性5分钟，在冰上冷却，通过PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜（ThermoScientific，Rockford IL）上，并且在室温下用5%奶粉（S.T. Jerrell Co.）或牛血清白蛋白（Fisher Scientific，Rockford，IL）封闭1小时。使膜与在具有0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）中稀释的一抗一起在4℃下温育过夜。针对RIG-I（克隆D14G6）、MDA-5（克隆D74E4）和p-STAT-1（克隆58D6）的一抗购自Cell Signaling Technology，并且针对肌动蛋白（克隆C4）的一抗购自Chemicon。膜用TBST反复洗涤，对于RIG-I、MDA-5和p-STAT-1与HR缀合的山羊抗兔（Pierce），或者对于在TBST中稀释的肌动蛋白（1:20,000稀释度），与山羊抗小鼠（Pierce）一起在室温下温育1小时，然后用TBST洗涤。膜使用SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate（Thermo Scientific，Rockford，IL）进行显色，然后暴露于x射线胶片（Research Products International）。

脾细胞用EphA2的I类（Kb）限制性肽表位的肽脉冲

将来自处理的荷瘤小鼠的脾细胞（5 × 10⁵）在圆底96孔板中铺平板，并且用或不用10 µM EphA2肽（671-FSHHNIIRL-679）刺激6小时。在流式细胞术染色之前，使样品与含有1 µl/mL布雷菲德菌素A的蛋白质转运抑制剂（Golgi-plug™，BD Biosciences，San Jose，CA）一起温育6小时，然后通过流式细胞术分析CD8 T淋巴细胞的颗粒酶B细胞内染色和活化（CD25）。

统计分析

使用Prism 8（GraphPad Software）执行统计分析。具有多重比较校正的单因素ANOVA（如指定的Holk-Sidham或Kruskal Wallace）用于涉及多个细胞系或另外指定的分析。为了比较两个处理组之间随着时间过去的肿瘤生长，使用具有Sidak多重比较检验的双因素ANOVA。使用时序测定来评价存活，并且使用卡普兰迈耶曲线显示数据。对于所有分析，统计显著性的截断设定为P<0.05。使用下述表示法：（ns）P > 0.05,（*）P ≤ 0.05,（**）P≤ 0.01,（***）P ≤ 0.001。

结果

表达EphA2的oHSV的构建和表征

免疫系统区分正常细胞和癌细胞的能力对于癌症免疫疗法是必需的，并且基于保持通过恶性细胞的足够抗原性。Coulie等人，Nature reviews Cancer，14:135-46（2014）。然而，肿瘤细胞可能丧失其抗原性，以逃避免疫介导的清除。抗原性的丧失可以通过几种机制而发生，所述机制例如缺乏或突变免疫原性肿瘤抗原的癌细胞的免疫选择、抗原加工机制的失调、或肿瘤抗原呈递的妨碍（例如，主要组织相容性表达的下调或丧失）。Schreiber等人，Science，331:1565-70（2011）。本发明人寻求这样的方法，其增强治疗抗性的免疫识别和抗原性。他们假设通过改造表达共享胎儿抗原（在许多肿瘤中表达的）的溶瘤病毒，我们可以利用病毒破坏免疫耐受的天然趋势，来改善针对这些胎儿抗原的免疫治疗应答。Ehl等人，J Exp Med.，187:763-74（1998）。

为了测试这一假设，制备了表达肿瘤相关的“共享的”胎儿抗原（EphrinA2）的溶瘤HSV，所述胎儿抗原在恶性神经胶质瘤、肉瘤和许多癌（乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和结肠直肠癌）中广泛表达。Tandon等人，Expert Opin Ther Targets. 15:31-51（2011）。因为研究集中于使用病毒作为灵活的平台，来呈现这些“自身的”肿瘤相关胚胎抗原，所以构建了oHSV重组体（C170和C172），其表达C57BL/6 Ephrin A型受体2（EphA2）的全长和分泌的细胞外结构域，如图12A中概述的。含有EphA2基因的HSV重组体通过DNA杂交研究进行遗传验证，并且EphA2蛋白表达通过关于正确蛋白质大小的蛋白质印迹（图12B）、关于定位的免疫荧光（图12C）、以及基于细胞培养的研究中的流式细胞术（图12D）进行验证。结果显示了C170表达预测的MW 97kd（图12B），并且在受感染的细胞中具有膜分布的细胞相关EphA2（图12C）。流式细胞术研究还显示了，C170感染使EphA2表面表达增加高于CT2A（基于C57BL/6的MG）和67C-4（基于C57BL/6的MPNST）肿瘤系中的天然存在的表达。如上文指示的，这种新病毒的目标是为了改善对OV治疗的肿瘤的免疫治疗应答。因此，本发明人首先评估了EphA2插入和表达如何影响病毒的复制、传播和直接溶瘤活性。为了测试这一点，在人和鼠肿瘤系中比较C170和C134（亲本病毒）复制和致细胞病变活性。如预料的，两种病毒在CT2A（鼠MG系）、U87（人MG系）、8814（人MPNST）和67C-4（鼠MPNST系）中具有可比较的病毒复制。这提示了新的转基因插入片段并未改变肿瘤系中的病毒复制。使用Incuyte zoom实时评估细胞增殖显示了，C134和C170均等价地降低CT2A肿瘤细胞生长，并且在高度抗性的67C-4模型中，即使在高感染复数下，病毒（C134和C170）无一直接显著抑制细胞生长（图13A-D）。相比之下，两种病毒均在MOI 1和10下抑制在体外生长的CT2A肿瘤细胞。结果显示了，C170和C134在体外vero细胞以及人和鼠肿瘤系中类似地复制、传播并具有致细胞病变活性，并且突出显示了在体外在两种不同的C57BL/6肿瘤系中oHSV溶瘤活性的差异。

C170在两种不同的高度抗性的同系模型中降低肿瘤生长并改善存活

本发明人接下来寻求在治疗抗性CT2A同系脑肿瘤模型中，评估新的表达EphA2的oHSV-1（C170和C172）的抗肿瘤活性。CT-2A肿瘤是通过Siefried等人使用化学诱导建立的基于C57BL/6的间变性星形细胞瘤。Seyfried等人，Molecular and chemicalneuropathology，17:147-67（1992）。CT2A肿瘤模型重现了人GBM的使得其难以治疗的许多特征。如同人肿瘤，CT-2A肿瘤是放射和化学抗性的，具有高瘤内细胞异质性的浸润，并且与神经干细胞共享相似性（当在无血清培养基中培养时，形成神经球，并且表达干细胞标记物，例如CD133、Oct和巢蛋白。Oh等人，J Transl Med.，12:107（2014）。荷有原位CT2A肿瘤的小鼠进行oHSV-（1×10⁷ PFU）或盐水处理，并且监测存活。与体外研究一致，C134和C170在体内在这种肿瘤模型中同等地复制。尽管具有等价的复制能力，但仅C170能够改善总体动物存活，与分别关于模拟、C172和C134处理的小鼠的29和30天相比，C170小鼠的中值存活为43天（图14A）。此外，一些C170处理的小鼠和有限数目的C134处理的小鼠清除了其肿瘤，提示了免疫应答可能促成oHSV的抗肿瘤活性。初始研究还显示了，虽然C170（表达包括EC和IC结构域两者的全长EphA2的基于C134的病毒）改善存活，但表达EphA2的分泌性EC结构域的C172病毒是无效的，且与盐水处理并无不同。这提示了通过该病毒表达的某些EphA2结构域在OV抗肿瘤效应中起作用。

为了确定oHSV抗肿瘤活性的这种差异是否局限于CT2A肿瘤模型，在共享相同肿瘤抗原EphA2的抗性同系肿瘤模型（67C4 MPNST）中，检查了表达全长EphA2的oHSV和C134。Ghonime等人，Cancer immunology research，6:1499-510（2018）另外，由于C172在CT2A模型中并未显示任何存活益处，因此它从这些研究中排除。本发明人确认了EphA2在67C-4肿瘤细胞上的表达，并且发现在C170感染后的EphA2表达上调，如图14B中所示。他们发现，与C134和模拟处理的组相比，C170的单次处理显著减弱了肿瘤生长，提示了C170具有更好的抗肿瘤活性，并且可能在共享EphA2抗原的任何肿瘤模型中都是有效的。

C170处理改变脑肿瘤中的白细胞浸润

如上文指示的，C134和C170两者均在肿瘤模型中等价地复制，并且因此，基于通过本发明人的其它研究，预料为具有等价的直接抗肿瘤活性。接下来，他们集中于与OV处理有关的免疫应答。为了评估这一点，检查了来自处理动物的免疫细胞浸润，以鉴定C170、C134和盐水处理的小鼠之间的差异，将处理动物处死，用盐水灌注，并且从模拟、C134和C170处理的荷瘤小鼠中收获脑，并且比较免疫细胞浸润。结果显示了，亲本溶瘤HSV-1（C134）和表达EphA2的病毒（C170）两者均增加了白细胞向肿瘤的迁移，如图15中所示。值得注意的是，如饼图所示，C170显示出T细胞与髓样平衡中的轻微增加，其中T细胞在C170处理的组中占优势。C134还诱导了相当大的T细胞浸润，但与此同时也增强了髓样募集到脑。接下来，检查了T细胞群体的组成，并且鉴定了C134和C170两者均诱导T细胞迁移，但仅C170诱导TME中的T细胞绝对数目的统计学显著增加（图15）。两种病毒均引起CD4T数目的显著增加，但仅C170引起CD8T细胞数目的显著增加，其可能提示了这些细胞在观察到的抗肿瘤效应中的关键作用。为了阐明观察到的抗肿瘤效应的潜在机制，检查了CD8T细胞的不同亚群。发现两种病毒均诱导了如图中通过CD25活化标记物所示的CD8T活化，并且增加了TME中的效应CD8 T（CD8TEFF）细胞的数目，伴随在C170处理的小鼠中更高数目的趋势。然而，仅C170显著增加了中央记忆CD8T细胞（CD8 TCM）群体数目，如图15中所示。Hu G，Wang S.，Scientific reports，7:10376（2017）。

本发明人还检查了oHSV处理的67C-4 MPNST肿瘤和外周的免疫细胞概况。C170处理的肿瘤再次证实了与来自脑肿瘤模型的结果一致的，髓样群体和髓样衍生的抑制细胞（MDSC）的降低，以及TCM群体的显著增加（图16）。此外，来自盐水和oHSV处理的动物的脾细胞显示了，在C170处理的67C-4荷瘤小鼠中，髓样群体和髓样衍生的抑制细胞（MDSC）的显著减少、以及CD8T细胞的显著增加（图16）。先前的研究已显示了，髓样和MDSC群体的这种转变（图16）和CD8 T细胞群体的增加，与来自脑肿瘤模型的结果一致。Katoh H，Watanabe M.，Mediators of inflammation 2015，159269（2015）。

表达肿瘤抗原的溶瘤病毒发展系统记忆和持久的抗肿瘤抗原应答

基于显示C170处理的小鼠在肿瘤中诱导中央记忆群体的结果，本发明人接下来检查了响应oHSV疗法的处理小鼠是否发展针对病毒表达的肿瘤抗原的系统记忆。

C170和C134在CT2A模型中产生了长期存活者，提供了使用功能研究来测试这一假设的独特机会。因此，来自C134和C170处理的组的CT2A的长期存活者、以及年龄匹配的首次用于实验的小鼠再次受到攻击，以检查持久抗肿瘤应答的发展。如图17A-17B中所示，当长期存活者和首次用于实验的小鼠用CT2A胁腹肿瘤进行攻击时，仅C170长期存活者降低肿瘤生长。与较早的表型数据一致，这提示了C170独特地诱导了持久的记忆群体，其可以循环并鉴定CT2A肿瘤，导致伴随远隔效应（即，在局限性处理范围之外的肿瘤缩小）。

为了进一步调查这种记忆应答，然后检查了67C4肿瘤模型样品。与脑肿瘤模型形成对比，在67-C4肿瘤研究中处理的小鼠都在同一时间（当首次用于实验的小鼠肿瘤>1500mm³时）、以及在另一项研究中的处理后第6天时处死。这允许检查不同处理组之间的T细胞功能应答差异，以及在外周中针对溶瘤病毒表达的肿瘤抗原EphA2的系统记忆的发展。用EphA2的MHC-1限制性免疫显性肽（H-2Db；671-CFSHHNIIRL-679）的肽脉冲功能测定共6小时。虽然在刺激6小时后，在CD8T的百分比方面不存在变化，但发现仅来自用C170处理的小鼠的CD8T显示出稳健活化（CD25表达）和效应细胞因子（GzmB）的表达，如图18中所示，提示了这些小鼠具有在再次暴露后可能响应肿瘤抗原的循环抗原特异性CD8T细胞。

图19A-19C是本文所述病毒的图示。在这些病毒中，小鼠EpHA2基因用于一些细胞系和实例中。当然，病毒可以被修饰为编码人EphA2基因。本公开内容还包含示例性序列的变体或同种型。图19D-I公开了本文所述的几种嵌合病毒的完整基因组病毒序列。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物，以及可电子获得的材料的完整公开内容引入作为参考。前述详述和实施例仅为了清楚理解的目的而给出。由此应理解没有不必要的限制。本发明并不限于所显示且描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求限定的本发明内。

Claims (32)

1.一种嵌合溶瘤病毒，其包含：

具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包含：

降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；

编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；和

编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。

2.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述疱疹病毒是α疱疹病毒。

3.权利要求2的嵌合溶瘤病毒，其中所述疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒。

4.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述疱疹病毒γ₁34.5基因的修饰包含γ₁34.5基因的缺失或突变。

5.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述第二病毒核酸序列是巨细胞病毒（CMV）核酸。

6.权利要求5的嵌合溶瘤病毒，其中所述CMV核酸包含IRS-1基因或与IRS-1基因具有至少70%同源性的核酸。

7.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述肿瘤相关抗原包括树突细胞结合肽。

8.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述肿瘤相关抗原是分泌性蛋白。

9.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述肿瘤相关抗原是成胶质细胞瘤相关抗原。

10.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述肿瘤相关抗原是EphA2。

11.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述第三核酸序列在γ₁34.5基因座处插入所述嵌合溶瘤病毒内。

12.权利要求1的嵌合溶瘤病毒，其中所述疱疹病毒包含第四核酸序列，其编码与由所述第三核酸序列编码的不同的肿瘤相关抗原。

13.一种通过使受试者的癌细胞与嵌合溶瘤病毒接触来治疗受试者的癌症的方法，所述嵌合溶瘤病毒包含：

具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包含：

降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；

编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；和

编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列。

14.权利要求13的方法，其中所述疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒。

15.权利要求13的方法，其中所述疱疹病毒γ₁34.5基因的修饰包含γ₁34.5基因的缺失或突变。

16.权利要求13的方法，其中所述癌症选自腺癌、肝母细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、骨髓瘤、膀胱癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、头颈癌、睾丸癌、结肠直肠癌、前列腺癌和胰腺癌细胞。

17.权利要求13的方法，其中所述癌症是成胶质细胞瘤。

18.权利要求13的方法，其中所述癌细胞离体进行接触。

19.权利要求13的方法，其中所述癌细胞在体内进行接触。

20.权利要求19的方法，其中所述嵌合溶瘤病毒在药学上可接受的载体中进行施用。

21.权利要求16的方法，其进一步包括向所述受试者施用化学疗法或放射疗法。

22.权利要求16的方法，其中所述肿瘤相关抗原是在待治疗的癌症上发现的抗原。

23.权利要求16的方法，其中所述肿瘤相关抗原是EphA2。

24.权利要求16的方法，其中所述疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒。

25.权利要求16的方法，其中所述第二病毒核酸序列是巨细胞病毒（CMV）核酸。

26.权利要求16的方法，其中所述疱疹病毒包括第四核酸序列，其编码与由所述第三核酸序列编码的不同的肿瘤相关抗原。

27.权利要求16的方法，其中所述嵌合溶瘤病毒提供持续的抗肿瘤效应。

28.一种针对癌症来免疫受试者的方法，其包括向所述受试者施用嵌合溶瘤病毒，所述嵌合溶瘤病毒包含：

具有修饰的核酸序列的疱疹病毒，所述修饰的核酸序列包含：

降低其表达的疱疹病毒γ（1）34.5基因（γ₁34.5），或与γ₁34.5基因具有至少约70%同源性的核酸的修饰；

编码不引起毒力的PKR逃避蛋白的第二病毒核酸序列；和

编码肿瘤相关抗原的第三核酸序列，

其中所述嵌合溶瘤病毒在针对癌症有效免疫受试者的条件下施用。

29.权利要求28的方法，其中所述疱疹病毒是HSV-1疱疹病毒。

30.权利要求28的方法，其中所述疱疹病毒γ₁34.5基因的修饰包含γ₁34.5基因的缺失或突变。

31.权利要求28的方法，其中所述癌症选自腺癌、肝母细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、骨髓瘤、膀胱癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、头颈癌、睾丸癌、结肠直肠癌、前列腺癌和胰腺癌细胞。

32.权利要求28的方法，其中所述癌症是成胶质细胞瘤。

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