CN114196604B - 一种双重修饰的工程化细菌及其应用 - Google Patents

一种双重修饰的工程化细菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114196604B
CN114196604B CN202111175321.1A CN202111175321A CN114196604B CN 114196604 B CN114196604 B CN 114196604B CN 202111175321 A CN202111175321 A CN 202111175321A CN 114196604 B CN114196604 B CN 114196604B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
bacterium
bac
bacteria
immune checkpoint
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111175321.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114196604A (zh
Inventor
刘尽尧
王露
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN202111175321.1A priority Critical patent/CN114196604B/zh
Publication of CN114196604A publication Critical patent/CN114196604A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114196604B publication Critical patent/CN114196604B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种双重修饰的工程化细菌及其应用，具体地，该工程化细是外部偶联免疫检查点抑制剂、内部编码酪氨酸酶基因的工程化细菌，包含该双重修饰的工程化细菌的的药物组合物及其应用。其中，该工程化细菌优选大肠杆菌。利用该工程化细菌，获得在空间和时间上可控的黑色素表达、分布，而且黑色素与抑制剂分布相似，两者结合增强双免疫激活作用，协同重编程肿瘤免疫微环境。该工程化细菌，单独地或组合常规肿瘤治疗方式或药物，能够显著抑制肿瘤生长和延长生存期。包含该细菌的药物组合物的药物组合物或其应用不仅克服了棘手的肿瘤内屏障，且渗透性好，能够均匀和持久地将抗肿瘤药物分散到整个肿瘤。

Description

一种双重修饰的工程化细菌及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种编码酪氨酸酶基因的工程化细菌，具体地，涉及一种双重修饰的工程化细菌及其应用，该细菌是外部偶联免疫检查点抑制剂、内部编码酪氨酸酶基因的工程化细菌，包含该细菌的药物组合物及其应用。
背景技术
在肿瘤治疗方面，能够在整个肿瘤中均匀和持久地分布抗肿瘤药物的方法对于最大化其治疗效果具有重要意义，但已被证明是极具挑战性的。目前，抗肿瘤药物在肿瘤组织内积累有限，渗透能力差，往往影响其疗效。各种温和的负载型纳米颗粒已经被开发出来，其用于通过高渗透长滞留EPR效应在肿瘤部位浓缩药物。尽管提高了药物浓度，但总体的富集程度还不能尽如人意。更糟糕的是，由于多种生物屏障的存在，大多数聚集的纳米颗粒被滞留在肿瘤血管周围，导致对远端肿瘤细胞仅暴露极低的药物浓度。另一方面，局部给药，例如肿瘤内注射包埋药物的水凝胶，已被开发用于药物的缓释。这尽管能够增加局部暴露，但是释放的药物同样受到肿瘤内屏障(包括致密的细胞外基质和肿瘤间质压力)的限制扩散，导致仅在注射点周围高浓度。此外，由于存在不可避免且棘手的生物屏障，其他形式的药物，如抗体-药物偶联物、聚合物前药物和配体-药物偶联物，在实体肿瘤内的渗透性也很差。因此，为了最大限度地提高其治疗效果，能够均匀和持久地将抗肿瘤药物分散到整个肿瘤的方法一直是研究人员期望实现的，但已被证明是困难的。
考虑到上述缺陷或不足，本发明申请的发明人及其团队研究并在此公开一种经双重修饰的工程化细菌及其在实体肿瘤治疗中的应用，其中该工程化细菌，通过基因工程和高分子化学手段，在细菌内外同时修饰细菌，使其靶向肿瘤部位，且在时空上可控地分布有效组分黑色素和免疫检查点抑制剂，以重新编程免疫抑制微环境，从而优化抗肿瘤治疗方式及效果。
发明内容
第一方面，本发明申请提供一种双重修饰的工程化细菌，该工程化细菌在外部偶联免疫检查点抑制剂，在内部编码酪氨酸酶基因。
进一步地，该工程化细菌包括编码酪氨酸酶基因，具体地，将包括编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种工程化细菌，然后，将在碱性溶液中将免疫检查点抑制剂锚定到细菌表面。
进一步地，该细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌，优选地，Nissle1917和VNP20009，更有选地，BL21(DE3)。
进一步地，该免疫检查点抑制剂包括选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和TIGIT抑制剂中的一种或多种。该免疫检查点抑制剂包括选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗TIGIT抗体中的一种或多种。优选地，抗PD-1抗体。
第二方面，本发明提供了一种制备上述任一双重修饰的工程化细菌的方法，包括：
步骤1：将编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种能够表达黑色素的菌株；和
步骤2：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式将免疫检查点抑制剂共沉积到表达黑色素的菌株的表面。
进一步地，在步骤2中，在碱性环境下，适当浓度多巴胺的碱性溶液中，在室温、搅拌的条件下，通过多巴胺的氧化和原位聚合作用，将免疫检查点抑制剂共沉积在该表达黑色素的菌株的表面。具体地，该碱性环境为PH8.0-9.0，优选地，PH8.5-9.0，更优选地，PH8.6-8.8，搅拌速率100-600rpm，优选地200-500rpm，更优选地，200-300rpm。
第三方面，本发明提供了一种可时空定位的用于治疗或缓解肿瘤进程的体系，其至少包括一种工程化细菌，该工程化细菌在外部表面偶联免疫检查点抑制剂，在内部包括编码酪氨酸酶基因，以获得重新编程免疫抑制微环境，从而达到治疗或缓解肿瘤进程。
进一步地，该工程化细菌是通过以下方法获得：步骤1：将编码酪氨酸酶基因的质粒 DNA转化到细菌中，获得一种能够表达黑色素的菌株；步骤2：在碱性环境下，适当浓度多巴胺的碱性溶液中，在室温、搅拌的条件下，通过多巴胺的氧化和原位聚合作用，将免疫检查点抑制剂共沉积在该表达黑色素的菌株的表面，由此获得一种工程化细菌。具体地，该碱性环境为PH8.0-9.0，优选地，PH8.5-9.0，更优选地，PH8.6-8.8，搅拌速率100-600rpm，优选地200-500rpm，更优选地，200-300rpm。
进一步地，该体系还包括光热疗法。
进一步地，将该工程化细菌输送至肿瘤部位，使其定植在肿瘤组织中。
第四方面，本发明提供了该双重修饰的工程化细菌在制备用于治疗或减缓肿瘤进程的药物方面的用途。
第五方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述任一双重修饰的工程化细菌及其药学上可接受的载体。
利用该工程化细菌，获得在空间和时间上可控的黑色素表达、分布，在广阔的治疗窗口中激光照射肿瘤时反复产生的温和而均匀的加热，能够诱导强大的光热触发的抗肿瘤免疫。进一步地，黑色素与αPD-1分布相似，两者结合增强双免疫激活作用，协同重编程肿瘤免疫微环境。该工程化细菌，单独地或组合常规肿瘤治疗方式或药物，能够显著抑制肿瘤生长和延长生存期。包含该细菌的药物组合物及其应用不仅克服了棘手的肿瘤内屏障，且在实体肿瘤内的渗透性好，能够均匀和持久地将抗肿瘤有效成分分散到整个肿瘤。
进一步地，在该药物组合物中，该工程化细菌的含量为1-99.9重量％。优选地，10-90 重量％。其中每个活的细菌细胞的平均免疫检查点抑制剂的量为0.56-0.75ng。
有益效果
本发明公开了该工程化细菌介导的联合治疗策略，该工程化细菌在实体肿瘤中的时空可控分布，以重新编程免疫微环境，从而优化抗肿瘤疗效。在本发明中，结合合成生物学和界面化学，使细菌内外同时修饰，不仅表达光热黑色素，还在其表面附着免疫检查点抑制剂。由于细菌在肿瘤缺氧环境中定植的特性，这两种药物在人体内和小鼠体内实验中均可均匀持久地分布于肿瘤中。具体地，黑色素与免疫检查点抑制剂分布相似，两者结合增强双免疫激活作用，协同重编程肿瘤免疫微环境。该工程化细菌，单独地或组合常规肿瘤治疗方式或药物，能够显著抑制肿瘤生长和延长生存期。包含该细菌的药物组合物的药物组合物或其应用不仅克服了棘手的肿瘤内屏障，且在实体肿瘤内的渗透性很好，能够均匀和持久地将抗肿瘤药物分散到整个肿瘤。
在广阔的治疗窗口期中，黑色素的时空可控定位可在光照下反复对肿瘤产生温和而均匀的加热。与类似的局部抑制剂组合使用，引发光热刺激和检查点阻断介导的免疫激活效应，协同重编程免疫抑制肿瘤的微环境。在皮下和原位小鼠模型中，均能显著抑制肿瘤生长和延长小鼠存活率，由此证明其具有很好的临床治疗价值。经双重修饰的细菌在肿瘤部位的定植为该药物在实体肿瘤的时空可控分布铺平了道路，有望在逆转癌症免疫耐受性并刺激有效的抗肿瘤免疫应答起重大作用，同时不增加毒副作用。
基于实验研究，该工程化细菌能够稳定表达酪氨酸，在光热刺激下生成黑色素，且被负载的免疫检查点抑制剂能够在肿瘤微环境中有效激活抗肿瘤的免疫应答。该工程化细菌的制备方法简单、成本低、安全性高，这具有重要的研究意义和临床应用价值。
附图说明
图1A为根据本发明双重修饰的工程化细菌的设计、制备和表征。
其中：a.在实体肿瘤中联合处理中黑色素和免疫检查点抑制剂的时空可控分布的示意图。
b.编码酪氨酸酶的质粒DNA转化大肠杆菌菌株的流程图。
c.BacWT和BacMel在Luria Bertani(LB)琼脂平板上培养。d.BacWT和BacMel的代表性TEM图像。比例尺:1μm。
e,f.采用DLS测量BacWT和BacMel的zeta电位ζ-电位(e)和尺寸分布(f)。
g.在37℃下LB培养基中BacWT和BacMel的生长曲线。
h,i.近红外激光(808nm,1.0W/cm2,300s)照射下PBS、BacWT(2.5×106CFU/ml)和BacMel(1.25×105～5×106CFU/ml)的温度提升和温度变化结果。
j.采用紫外可见分光光度计测定500～900nm范围内的BacWT(2.5×106CFU/ml)和BacMel(1.25×105～5×106CFU/ml)。
k.照射(808nm,1.0W/cm2)300s后，平板计数分析BacMel活力。误差棒代表标准差(n＝3)。
图1B示出了BacWT和BacMel悬浮在LB液体介质中的照片。
图2A示出了B-αPD-1的制备流程图及其表征。
a.在中等碱性缓冲液(pH 8.8)中，通过原位多巴胺氧化和自聚合将αPD-1附着到BacMel 表面的示意图。
b.分别为BacMel和b-αPD-1的代表性TEM图像。比例尺：1μm。
c.BacMel、BacMel@PDA和B-αPD-1的典型CLSM图像。红色和绿色分别表示表达mCherry和FITC标记的αPD-1的细菌。比例尺：5μm。
d.BacMel、BacMel@PDA、B-αPD-1(FITC标记的αPD-1)的代表性流式细胞仪直方图。用DLS测定BacMel、BacMel@PDA和B-αPD-1的尺寸分布(e)和zeta电位(f)。
g.αPD-1修饰后，平板计数法测定BacMel活力。h近红外激光(808nm,1.0W/cm2,300s) 照射下BacWT、BacMel(5×106CFU/ml)和B-αPD-1(5×106CFU/ml)的温度变化，误差柱代表标准偏差(n＝3)。
图2B示出了BacMel和BacMel@PDA的典型CLSM图像。红色和绿色荧光信号分别表示表达mCherry和FITC标记PDA的细菌。比例尺：5μm。
图3A示出了黑色素在肿瘤中的时空分布及光热效应。
a-d.在给药(a)2小时、(b)2天、(c)5天和(d)12天之后，BacMel的生物分布。将4T1荷瘤小鼠瘤内注射BacMel(每只小鼠1×105CFU)，在预定时间点安乐死。取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑组织，称重，均质，进行细菌平板计数(n＝4～6)。
e.免疫组化染色BacMel分布于典型的完整肿瘤组织内。放大后的图像来自左边列的红色圆点正方形。PR和IR分别表示外围区和内部区。
f,g.采用NIR光谱仪近红外光照射(808nm,1.0W/cm2)300s后，向小鼠注射PBS、BacWT(1×106CFU/只鼠)、BacMel(1×105或1×106CFU/只鼠)、或金纳米棒(10μg/只鼠)的温度上升的结果(f)和热成像(g)结果(n＝3)。
h.示出了将肿瘤的加热区域划分为三个部分。
i.用分区统计方法量化各区域温度变化(n＝3)。
j.BacMel在4T1皮下肿瘤中经光热诱导产生的免疫激活效果评价实验的设计。在预定的时间点收集经处理小鼠的DLN，以检测免疫应答。
k-m.CD80+CD86+DCs(k)、细胞内Ki67+(l)、IFN-γ+(m)在总T细胞中的百分比(n＝3)。误差棒代表标准差。采用单因素方差分析(ANOVA)和图基(Tukey)检验进行统计分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图3B示出了不同进料浓度下B-αPD-1中αPD-1的加载效率，数据为平均值±SEM(n＝ 3)。
图4A示出了1在肿瘤中αPD-的时空分布。其中：
a.在37℃下B-αPD-1(PE标记的αPD-1)的平均荧光强度(MFI)与增殖的关系。
b.B-αPD-1生长后各对应时间点的CLSM图像。红色表示PE标记的αPD-1。比例尺： 1μm。
c.PE标记的αPD-1附着BacMel的百分比与培养时间的关系。其中采用流式细胞仪分析细菌。
d,e.向每只小鼠注射50μg游离αPD-1或注射等同于结合的αPD-1(1×105CFU B-αPD-1) 5h、1天和5天之后，用数字图像扫描技术捕捉4T1肿瘤组织的典型荧光图像。绿色和蓝色分别代表FITC标记的αPD-1和4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)标记的核。放大的图像来自红色的圆点正方形。比例尺：2mm(d)，50μm(e)。
f,g.注射5天后小鼠肿瘤的IVIS图像和平均辐射效率(n＝3)。
h.活化的T细胞分别与Bac@PDA,B-iso或B-αPD-1(FITC标记的αPD-1)沉淀的重悬或上清孵育后的平均荧光强度MFI(n＝3)。
j.向肿瘤注射1×105CFU B-αPD-1第5天后，4T1肿瘤组织的荧光图像。绿色和蓝色分别为αPD-1和细胞核。比例尺：20μm。误差棒代表标准差。采用Student检验进行统计学分析。*p<0.05，**p<0.01。
图4B示出了向肿瘤注射后细菌计数的变化。数据显示为平均值±标准误差(n＝4～6)。
图5A示出了B-αPD-1光热和检查点阻断双重介导的免疫激活效应。
a.评价B-αPD-1重新编程免疫抑制TME能力的实验设计。在体积达到50～100mm3大小的皮下4T1肿瘤，皮下注射1×105CFU BacWT、BacMel、和B-αPD-1或含50μgαPD-1的PBS 50μl。在指定的时间点用NIP光谱仪(808nm,1.0W/cm2)照射肿瘤300s。
b-m.在示出的时间点从被处理的小鼠取样DLN、肿瘤、血清的免疫反应。量化共刺激的标记分子MHC-II(b,f)和DC上的CD86(c,g)的MFI。通过细胞内IFN-γ和(e,k)Ki67染色测定总T细胞应答(d,j)、CD45+(h)和CD25+CD4+(i)。ELISA法检测血清中IFN-γ(l)和 TNF-α(m)水平。
n.肿瘤切片CD3(绿色)、CD8(红色)和DAPI(蓝色)或TUNEL(绿色)和DAPI(蓝色)共染色。比例尺：50μm。误差棒代表标准差。采用单因素方差分析与Tukey检验进行测统计分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图5B示出了向注射PBS或BacMel后典型的苏木精和伊红(H&E)染色后心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和脑组织的图像。比例尺：200μm。
图6A示出了B-αPD-1在皮下和原位4T1肿瘤模型中的治疗价值。第0天的肿瘤细胞，向腹腔注射1×105CFU BacMel和B-αPD-1或含50μgαPD-1的50μl PBS，使皮下和原位4T1 肿瘤体积达到50～100mm3，分别于第10天、第12天和第13天用INR光谱仪(808nm,1.0 W/cm2,300s)照射肿瘤。a,e：不同方式处理后的肿瘤生长。b,f：每组中单个肿瘤生长情况。 c,g：不同处理后小鼠生存曲线。d、h处理后小鼠的体重变化情况。误差棒代表标准偏差(n ＝8)。采用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。
图6B示出了BacMel注射后第12天，INR光谱仪(808nm,1.0W/cm2,300s)照射肿瘤的代表性热图像。
图7A示出了B-αPD-1在人肿瘤组织中的时空分布。每个样品注射10μg游离αPD-1或等量的αPD-1(B-αPD-1，0.2×105CFU)，立即或注射后24小时进行切片、染色并成像。蓝色、红色、绿色分别为DAPI染色的细胞核，Cyanine3标记的抗大肠杆菌染色的细菌， FITC标记的αPD-1。比例尺：0.5mm。
图7B示出了BacMel重新编程TME的光热效应。在期望的时间点收集经处理小鼠的DLN，用于检测免疫反应。典型的流式细胞术散点图示出了总T细胞中CD80+CD86+DC(a)以及细胞内Ki67+和(c)IFN-γ+(b)。
图8示出了具有代表性的流式细胞术散点图(a)和在体外暴露于不同处理方式后体内 4T1细胞凋亡百分比(b)。数据以平均值±SEM表示(n＝3)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)与Tukey检验进行统计分析。
图9示出了具有代表性的流式细胞术散点图(a)和在体外暴露于不同处理方式后体内 4T1细胞凋亡百分比(b)。数据以平均值±SEM表示(n＝3)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)与Tukey检验进行统计分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图10示出了荷瘤小鼠DLN中CD4+T细胞的百分比。数据以平均值±SEM表示(n＝3)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)与Tukey检验进行统计分析。*p<0.05。
图11示出了CD8+T细胞百分比(a)、CD25+Foxp3+T细胞百分比(b)、CD8+与Treg的比值(c)。数据为平均值±SEM。统计分析采用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。****p<0.0001。
图12示出了CD8+T细胞(a)百分比、及CD8+与Treg的比值(b)，肿瘤细胞表面PD-L1的平均荧光强度(MFI)(c)。数据为平均值±SEM(n＝4～6)。采用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*p<0.05。。
图13示出ELISA检测血清IL-6水平。数据为平均值±标准误差(n＝4～6)。采用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*p<0.05。
图14评估在皮下(a)和原位(b)4T1肿瘤模型中B-αPD-1抑制肿瘤生长治疗价值的实验设计。
图15示出了，当皮下4T1肿瘤体积达到50～100mm3时，分别将包含1×105CFU的BacWT-αPD-1、BacMel+αPD-1或B-αPD-1的50μl PBS经皮下注射到小鼠体内。用NIP光谱仪(808nm,1.0W/cm2)照射肿瘤300s。a.不同治疗后肿瘤生长情况。b.治疗后体重变化。 c,d.DC上共刺激标记物的MFI定量：MHC-II(c)和CD86(d)。e,f.通过细胞内IFN-γ(e)和 Ki67(f)染色测定总T细胞应答。误差棒代表标准差。采用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，但是并不以此限制本发明。在不背离本发明的技术构思及技术方案的前提下，对本发明所属领域的普通技术人员来说，能够实现的任何修改、调整或修饰、或者等同替换方法都将落入本发明的要求保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
第一方面，本发明申请提供一种工程化细菌，该工程化细菌在外部偶联免疫检查点抑制剂，在内部编码酪氨酸酶基因。
进一步地，该工程化细菌包括编码酪氨酸酶基因，具体地，将包括编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种工程化细菌，然后，将在碱性溶液中将免疫检查点抑制剂锚定到细菌表面。
进一步地，该细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌，优选地，Nissle1917和VNP20009，更有选地，BL21(DE3)。
进一步地，该免疫检查点抑制剂包括选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和TIGIT抑制剂中的一种或多种。该免疫检查点抑制剂包括选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗TIGIT抗体中的一种或多种。优选地，抗PD-1抗体。
第二方面，本发明提供了一种制备上述任一工程化细菌的方法，包括：
步骤1：将编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种能够表达黑色素的菌株；和
步骤2：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式生成聚多巴胺颗粒，然后，将免疫检查点抑制剂共沉积到多巴胺颗粒表面，再附着到该能够表达黑色素的菌株的表面。
进一步地，在步骤2中，在碱性环境下，适当浓度的多巴胺的碱性溶液在室温、被搅拌条件下，通过多巴胺的氧化和原位聚合作用，将免疫检查点抑制剂共沉积在所述表达黑色素细菌的表面。
第三方面，本发明提供了一种可时空定位的用于治疗或缓解肿瘤进程的体系，其至少包括一种工程化细菌，该工程化细菌在外部表面偶联免疫检查点抑制剂，在内部包括编码酪氨酸酶基因，以获得重新编程免疫抑制微环境，从而达到治疗或缓解肿瘤进程。
进一步地，该工程化细菌是通过以下方法获得：步骤1：将编码酪氨酸酶基因的质粒 DNA转化到细菌中，获得一种能够表达黑色素的菌株；步骤2：：在碱性环境下，适当浓度多巴胺的碱性溶液中，在室温、搅拌的条件下，通过多巴胺的氧化和原位聚合作用，将免疫检查点抑制剂共沉积在该表达黑色素的菌株的表面，由此获得一种工程化细菌。
进一步地，该碱性环境为PH8.0-9.0，优选地，PH8.5-9.0，更优选地，PH8.6-8.8，搅拌速率100-600rpm，优选地200-500rpm，更优选地，200-300rpm。进一步地，该体系还包括光热疗法。
进一步地，将该工程化细菌输送至肿瘤部位，使其定植在肿瘤组织中。
第四方面，本发明提供了该工程化细菌在制备用于治疗或减缓肿瘤进程的药物方面的用途。
第五方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述任一工程化细菌及其药学上可接受的载体。
利用该工程化细菌，获得在空间和时间上可控的黑色素表达、分布，在广阔的治疗窗口中激光照射肿瘤时反复产生的温和而均匀的加热，能够诱导强大的光热触发的抗肿瘤免疫。进一步地，黑色素与αPD-1分布相似，两者结合增强双免疫激活作用，协同重编程肿瘤免疫微环境。该工程化细菌，单独地或组合常规肿瘤治疗方式或药物，能够显著抑制肿瘤生长和延长生存期。包含该细菌的药物组合物及其应用不仅克服了棘手的肿瘤内屏障，且在实体肿瘤内的渗透性好，能够均匀和持久地将抗肿瘤有效成分分散到整个肿瘤。
进一步地，在该药物组合物中，该工程化细菌的含量为1-99.9重量％。优选地，10-90 重量％。其中每个活的细菌细胞的平均免疫检查点抑制剂数量为0.56-0.75ng。
I.材料和方法
细胞
4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞系)从美国菌种保藏中心(ATCC)中获得，并使用含10％胎牛血清(Gibco，美国)、100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的RPMI 1640培养基(Gibco，美国)，在37℃，5％CO2下培养。
质粒构建及细菌培养
质粒pET-28a或pET-28a-melA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，以获得BacWT或BacMel。为了产生黑色素，在添加1g L-酪氨酸和94.5mg CuSO4的Luria-Bertani(LB)培养基中，在 30℃条件下培养。然后，收集细菌，用1×PBS重悬，以进行后续实验。
实验例
BacMel的表征
用透射电子显微镜(TEM,H7700s,HITACH,Japan)观察BacWT和BacMel的形态。利用纳米Zetasizer(Malvern Instrument,UK)动态光散射(DLS)测量BacWT和BacMel的Zeta电位和平均尺寸。为了检测细菌的生长，将BacWT和BacMel在LB培养基中稀释到600nm(OD 600)～0.2的初始光密度，并且在37℃轻轻震荡培养。每半小时用Synergy H1(BioTek，美国)记录OD 600值。
BacMel在体外的光热效应
采用NIR光谱仪(808nm,1W/cm2,中国好良科技)照射BacMel，每ml剂量范围为 1.25×105～5×106菌落形成单位(Colony Forming Units,CFU)，照射300s，并用红外热像仪记录升温过程。
采用紫外可见分光光度计(Cary 100,Agilent,USA)检测BacMel在1.25×105～5×106CFU/ml内不同剂量下的吸收光谱。为了证明温度对细菌活力的影响，发明人采用NIP光谱仪照射BacMel获得从35到70℃的不同温度。将样品适当稀释，37℃下LB平板孵育过夜，计数菌落。
B-αPD-1的制备与表征
抗PD-1抗体(αPD-1)购自Bio X Cell(RMP1-14)。RMP1-14抗体在体内被广泛用于阻断小鼠PD-L1/PD-L2与PD-1的结合。根据发明人在《Polymerization-MediatedMultifunctionalization of Living Cells for Enhanced Cell-Based Therapy》(C.Pan,J.Li,W.Hou,S.Lin,L.Wang,Y.Pang,Y.Wang,J.Liu,Adv.Mater.2021,33,e2007379)中描述的方法制备 B-αPD-1。
简单地说，向37℃孵育过夜的BacMel(1×105CFU)中加入0.5ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)，其中该Tris-HCl缓冲液包含1mg多巴胺和0.2mgαPD-1。在室温下振动45min后，采用1×PBS冲洗被BacMel捕获的αPD-1(B-αPD-1)或聚多巴胺(Bac@PDA)，以除去自由的αPD-1，然后4000×rpm离心5min收集。
通过使用Nano Zetasizer的DLS测量BacMel Bac@PDA和B-αPD-1的Zeta电势和平均大小，采用FITC偶联αPD-1(297.1A12,BioLegend)，通过CLSM TCS SP8(Leica，德国) 和流式细胞仪CytoFLEX(Beckman Coulter，美国)证明αPD-1的加入。采用双茚二酮酸(BCA) 蛋白检测试剂盒，通过计算反应液中加入的总量与上清液中残留量的差值来测定αPD-1的负载效率。
B-αPD-1的体外结合
为了验证在细菌表面的修饰αPD-1是否有效，将Bac@PDA、B-iso(FITC偶联的同型对照)或B-αPD-1(FITC偶联的αPD-1)在RPMI 1640培养基中37℃下摇瓶培养1小时。所有样品4000×rpm离心10min，分别收集沉淀和上清，用于后续染色。用PMA(20ng/ml, Beyotime，中国)和离子霉素(1μg/ml,Beyotime，中国)刺激小鼠脾细胞6小时，然后收集 APC标记的抗CD3(17A2)和上述各种配方。
皮下乳腺癌模型和原位小鼠乳腺癌模型
6～8周龄雌性BALB/c野生型小鼠购自洁丝洁(中国上海)。所有动物方案均得到上海交通大学医学院动物护理和使用委员会指南的批准。将100μl(1×106)4T1细胞皮下注射到正常BALB/c小鼠体内，制备皮下乳腺癌模型。将50μl(1×105)4T1细胞植入小鼠左侧乳腺脂肪垫，以构建原位乳腺癌模型。
BacMel在肿瘤中的定植和分布
在皮下乳腺癌模型中，向肿瘤内注射BacMel，剂量为1×105CFU/只。随后，在注射后5小时、第2天、第5天和第12天时，分别收集肿瘤、心、肝、脾、肺、肾和脑组织，称重，均质。将样品逐步稀释(1:10～1:105)，涂于LB板，在37℃孵育过夜。计数菌落，计算每克组织的CFU。此外，固定完整的肿瘤组织进行大肠杆菌免疫组化染色。
BacMel在体内的光热效应
瘤内注射BacMel(1×105或1×106CFU每只小鼠)或金纳米棒(10μg每只小鼠)后第2天用 NIR光谱仪(808nm,1W/cm2)照射肿瘤，照射时间为300s。采用红外热像仪记录肿瘤表面温度。
B-αPD-1在肿瘤中的分布
向皮下乳腺癌小鼠的瘤内注射B-αPD-1(FITC偶联的αPD-1)或无FITC偶联的αPD-1，剂量为1×105CFU/只。分别于注射后5h、第1天和第5天采集完整的肿瘤组织，固定后切片，进行FITC荧光检测。细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。
B-αPD-1在离体的人肿瘤组织中的分布
人结肠癌组织由上海交通大学医学院附属仁济医院提供。本方案经上海交通大学医学院附属仁济医院人类伦理委员会批准。将组织切成0.5cm立方块，随后注射10μg FITC偶联的αPD-1或等效偶联的αPD-1(0.2×105CFU B-αPD-1)。在预设定的时间间隔内37℃孵育，采用Cyanine3和DAPI标记的抗大肠杆菌对固定的冰冻肿瘤组织切片进行染色。采用数字图像扫描技术检测荧光信号。
细胞凋亡检测
采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测4T1细胞(Multi Sciences,China)经BacMel或 B-αPD-1诱导的凋亡进行评估。简言之，将5×105细胞和不同形式的细菌(5×106CFU)的混合物在近红外辐射或无近红外辐射下刺激5min。在冰上采用FITC标记的Annexin V和PI 对细胞染色10min，无需洗涤，立即使用流式细胞仪分析。
体内评估免疫反应
为了分析免疫反应，在指定的时间点采集被处理小鼠的肿瘤、引流淋巴结(Draining Lymph Nodes,DLN)和血清样本。将DLN完全磨碎，制备单细胞悬液。为了隔离肿瘤组织中的髓细胞和淋巴细胞，利用手术器械将肿瘤切成小块，随后与10ml消化缓冲液在在37℃下轻摇30min，其中消化缓冲液包含100单位/毫升IV型胶原酶和100μg/ml DNase。然后，细胞悬液通过70μm的细胞滤器，经40/70％Percoll梯度，2000rpm，在室温下离心20min，收集位于界面处的细胞，用1×PBS洗涤，进行后续染色。
为了分析DC的激活和成熟，首先，用纯化的anti-CD16/32在4℃封闭15min，然后用PerCP/Cyanine5.5-conjugated anti-CD11b(M1/70)、FITC-conjugated anti-CD11c(N418)、 PE/Cyanine7-conjugated I-A/I-E(MHC-II,M5/114.15.2)、APC-conjugatedanti-CD86(24F)和PE-conjugated anti-CD80(16-10A1)在冰上处理30min。
为了分析T细胞反应，首先，用纯化的anti-CD16/32在冰上封闭细胞15min，然后，用PE/Cyanine7-conjugated CD45(30-F11)、PerCP/Cyanine5.5-conjugated anti-CD3(145-2C11)、 APC-conjugated anti-CD3(17A2)、PE-conjugated anti-CD8(53-6.7)、FITC-conjugated anti-CD4(GK1.5)、PerCP/5-conjugated anti-CD4(GK1.5)或APC-conjugated anti-CD25(3C7)在冰上孵育30min后，用Foxp3/转录因子固定/渗透试剂盒(eBioscience,USA)对细胞进行洗涤、固定和渗透，以用于细胞内染色。通过PE/Cyanine7-conjugated anti-IFN-γ(XMG1.2)、 PE-conjugated anti-Foxp3(MF-14)或FITC-conjugated anti-Ki67(SolA15)染色检测胞内细胞因子或核蛋白。所有抗体均购自BioLegend和eBioscience。采用FACSVerse流式细胞仪(BD Biosciences,USA)采集数据，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。用ELISA试剂盒(Multi Sciences,中国)稀释血清样品，分析IFN-γ、TNF-α和IL-6，然后在Synergy H1上测量。
皮下4T1肿瘤模型和原位4T1肿瘤模型的抗肿瘤作用
为了评价其对肿瘤生长的抑制作用，我们建立了皮下4T1肿瘤模型和原位4T1肿瘤模型。当肿瘤体积达到约50-100mm3时，向肿瘤内注射50μl BacWT(1×105CFU/只)、BacMel(1×105CFU/只)、B-αPD-1(1×105CFU/只，相当于50μgαPD-1)或游离的αPD-1(50μg/只)。另外，在注射后的第2天和第3天，用NIR光谱仪808nm照射2次，照射功率适当，保持肿瘤表面温度在45℃左右。记录经处理小鼠的体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：0.5×长×(宽)2。在生存评估中，当肿瘤体积达到2000mm3时，小鼠被认定为死亡。
统计分析
分析采用GraphPad Prism 8.0进行所有统计。数据以平均值±平均值标准误差(SEM)表示。两组比较采用未配对t检验，多组比较采用单因素方差分析。显著性被定义为p<0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
II.结果
合理的设计
通过结合基因操作和界面聚合，大肠杆菌被双重修饰，同时携带光热黑色素和免疫检查点抑制剂αPD-1。在其生存特性的帮助下，改良大肠杆菌有望推动黑色素和αPD-1在实体肿瘤中的分布和保留(图1A，a)。
双修饰菌的制备与表征
为了构建表达黑色素的细菌(BacMel)，我们将编码酪氨酸酶的质粒DNA转化到大肠杆菌的菌株中，如图1b所示。与空质粒转化细菌(BacWT)的黄色菌落相比，生长在固体培养基表面的BacMel呈暗黑色(图1A，c和图1B)。透射电镜(TEM)图像显示，BacMel与BacWT外的细胞质具有高对比度(图1A，d)，表明成功构建了产生黑色素的BacMel。我们发现，酪氨酸酶的表达对细菌粒径、ζ电位和活力的影响可以忽略不计(图1A，e-g)。然后，我们检测BacMel是否能在NIR光谱仪照射下启动光热效应。如图1A,h所示，在808nm辐射下，与BacWT或PBS空白相比较，BacMel极大地提高加热，并且，通过调整每毫升菌落形成单位浓度从 1.25×106～5×106(cfu)，可以在40-55℃范围内灵活地控制温度上升的程度。此外，BacMel的光热转换效率很高，激光照射90s后，温度变化可迅速提高10℃至20℃(图1A，i)。BacMel的光吸收与细菌浓度成比例，在808nm处的吸收系数为0.43-0.91cm-1(图1A，j)。考虑到组织在808nm处的吸收系数约为0.04cm-1，远低于BacMel的吸收系数，这说明细菌介导的光热效应可以局限于其定殖位置。为了确保细菌在肿瘤内分布治疗药物的驱动力，我们检测了加热对其活力的影响。具有指导意义的是，即使温度升高至50℃(图1A，k)，BacMel的活性也几乎不受影响，这为PTT提供了一个广阔的加热窗口。正如其他微生物所观察到的那样，BacMel耐高温的能力可以解释为细胞壁完整性的增加。
为了制备表面有αPD-1附着的BacMel(B-αPD-1)，我们使用了一种细胞相容的共沉积方法，并根据发明人之前的报道《Polymerization-Mediated Multifunctionalizationof Living Cells for Enhanced Cell-Based Therapy》(C.Pan,J.Li,W.Hou,S.Lin,L.Wang,Y.Pang,Y.Wang,J.Liu,Adv.Mater.2021,33,e2007379)进行了微小的调整。简单地说，αPD-1通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式共沉积到BacMel的表面(图2A，a)。典型的TEM和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示，细菌表面可见PDA纳米颗粒(图2A,b和图2B)。为了确认αPD-1被结合到细菌表面，我们使用FITC标记的αPD-1进行共沉积。CLSM图像显示B-αPD-1有一个清晰的荧光外壳，这在BacMel和Bac@PDA中都没有观察到(图2A,c)。流式细胞分析术的直方图显示，FITC标记的B-αPD-1明显向更高的荧光强度转移，进一步验证了αPD-1的成功修饰(图2A,d)。动态光散射(DLS)分析表明，与BacMel相比，B-αPD-1 的平均粒径从1.08μm增加到1.17μm，zeta电位分别从-17.3mV增加到-14.8mV(图2A,e 和f)。PDA表面附着αPD-1和共沉积过程对细菌生存能力的副作用有限，因为B-αPD-1的增殖与未修饰的细菌相似(图2A，g)。Bicinchoninic acid(BCA)检测结果表明，对于1×105CFU细菌，随着在反应溶液中加入αPD-1浓度从200μg/ml增加到400μg/ml，αPD-1的负载率((mass of loadedαPD-1/total mass of addedαPD-1)×100％)从28wt％下降到16wt％，每个活的细菌细胞的平均免疫检查点抑制剂的量为0.56-0.75ng(图3B)。值得注意的是，未受影响的细菌活力对B-αPD-1在肿瘤组织[39]中的运动能力至关重要。此外，B-αPD-1在近红外照射下表现出与BacMel相当的光热效应，说明温度升高是由黑色素的表达引起的(图2A， h)。
黑色素的时空分布
我们首先评估了经修饰的细菌在皮下4T1荷瘤乳腺癌小鼠体内的生物分布。单次向瘤内注射BacMel(剂量为1×105CFU)后，分别于给药后2小时、第2天、第5天和第12天后对小鼠实施安乐死。收集肿瘤等主要组织进行细菌培养，并进行苏木精伊红(H&E)染色。平板计数显示在肿瘤组织内有特异性定植，因为直到注射12天后，BacMel在其他主要器官中几乎不存在(图3A,a-d)。
此外，给药后在肿瘤组织中定植的细菌数量呈指数级增加，与注射2小时相比，注射后第2天达到4000倍(图4B)，验证了BacMel在肿瘤缺氧环境中充分定植的能力。给药后第12天进行H&E染色组织学检查。经处理小鼠的主要器官未发现损伤(图5B)，表明BacMel具有良好的安全性。为确定BacMel在肿瘤内的分布，对经注射小鼠的肿瘤组织进行免疫组化染色。如图3A,e所示，BacMel能够在整个肿瘤中充分分布。内外区放大图像均显示BacMel 在肿瘤内均匀定植，这可能是由于肿瘤内缺氧、营养和免疫抑制的微环境适合细菌生长所致。
接下来，我们研究了BacMel在整个肿瘤的足够分散是否能产生足够的加热。采用红外热成像技术研了BacMel的光热转换过程。向肿瘤内注射PBS、BacWT或BacMel第2天后，用808nm激光照射小鼠5min后成像。我们发现，BacMel在1×105CFU剂量下注射小鼠，肿瘤表面温度迅速升高到45℃，而PBS或BacWT处理小鼠的相应温度保持在35℃左右(图3A, f)。如预期的那样，随着BacMel剂量增加到1×106CFU，温度进一步升高到50℃。与体外光热转换的结果一致，BacMel表现出依赖于细菌数量的加热性能。
为了证明BacMel的优越性，我们与金纳米棒进行比较。金纳米棒是一种典型的光热剂，具有良好的近红外吸收性能和光热转换效率。如图3A,g所示，BacMel引起均匀的加热区域，这归因于细菌介导的黑色素在肿瘤中扩散。相反，金纳米棒只在注射点附近产生明显的加热。通过纬向统计方法进行的定量分析进一步显示，与Au纳米棒相比，加热区域从中心到外围的温度下降很大程度上有所延迟(图3A,h和i)，这验证了BacMel具有肿瘤加热更加均匀的能力。此外，由于在肿瘤内长期居住长达12天，BacMel可用于单次给药后的反复加热(图6B)。
采用免疫原性差、免疫应答低的4T1乳腺癌肿瘤模型检测BacMel光热触发的免疫激活作用。给荷瘤小鼠的肿瘤内注射50μl BacMel第10天、第12天和第13天分别用808nm 激光(1W/cm2)照射相关肿瘤5min(图3A,j)。考虑到45℃左右的温和加热，可通过调节TME 显著提高抗肿瘤免疫效果，给予小鼠1×105CFU，可使肿瘤温度在45℃左右。所有经处理的小鼠在第15天被安乐死，收集其引流淋巴结(DLN)以检测免疫反应。
有趣的是，与PBS或激光照射小鼠相比，经BacMel处理的小鼠显示CD80+CD86+成熟树突状细胞(DCs)的百分比增加(图3A,k和图7B,a)。树突状细胞的激活可能归因于细菌诱导的肿瘤细胞免疫原性细胞死亡。值得注意的是，近红外激光刺激可使该比例进一步提高1.2倍，这归因于肿瘤细胞凋亡的增加(图8和图9)。我们发现，在施用BacMel后，T细胞中干扰素-γ(IFN-γ)的产生和Ki67的表达没有变化(图3A,l和m，图7B,b和c)，这意味着单独用BacMel处理不能诱导T细胞启动。不同的是，在近红外辐射刺激下，与没有激光照射的BacMel相比，T细胞中IFN-γ的产生水平和Ki67的表达水平分别提高了2.2倍和5倍。而且，BacMel联合近红外辐射处理主要促进CD4+T细胞增殖(图10)。结果表明，与低剂量 1×105CFU相比，1×106CFU BacMel可将肿瘤温度提高到50℃，导致DC成熟减弱，T细胞活化减弱。这些结果很好地证明了，BacMel的时空可控分布所带来的光热效应能够激活有效的t细胞免疫应答。
αPD-1的时空定位
在BacMel在肿瘤中的时空可控定位的鼓励下，我们进一步研究B-αPD-1是否可以驱动肿瘤内αPD-1的分布和保留。
首先，在细菌结合FITC标记的αPD-1孵育细菌后，在预定的时间间隔内，通过流式细胞仪检测αPD-1在细菌表面的保留与增殖情况。典型的曲线图显示随培养时间的延长B-αPD-1的荧光强度降低，这说明在细菌表面结合αPD-1的稀释(图4A,a)。从共聚焦成像也可以观察到，含有FITC标记的αPD-1的B-αPD-1的荧光强度逐渐降低(图4A,b)。尽管分裂导致B-αPD-1的持续稀释，但B-αPD-1的百分率仍能保持一致(图4A,c)，这说明αPD-1 在B-αPD-1上长期保留。
分别于注射FITC标记的αPD-1或B-αPD-1 5h、第1天和第5天后，处死4T1荷瘤小鼠，以检测αPD-1在瘤内分散度。收集肿瘤，切片，采用数字图像扫描技术检测全组织FITC 荧光信号。从图4A,d中可以看出，B-αPD-1注射5小时后，αPD-1在肿瘤中的分布在视觉上比未注射的αPD-1均匀。与游离αPD-1相比，注射B-αPD-1的小鼠在整个肿瘤中出现的αPD-1更加均匀，注射后时间延长至1天。值得注意的是，即使施用后时间延长至 5天，B-αPD-1处理小鼠的αPD-1仍然均匀分布在整个肿瘤内(图4A,d和e)。
为了量化αPD-1在肿瘤内的保留，我们收集肿瘤，并通过体内成像系统(IVIS)成像观察。与游离αPD-1相比，B-αPD-1注射第5天后，典型IVIS图像显示肿瘤信号明显增加(图4A,f)，进一步证实定量分析(图4A,g)。αPD-1在整个肿瘤中均匀持久的分布可以用B-α PD-1在肿瘤中充分驻留的性质来解释。考虑到PD-1在活化后可诱导表达在T细胞上，将B-αPD-1和分离的αPD-1在预先设定的时间间隔后离心分离，然后，与活化的T细胞孵育，以探讨其与细胞膜上表达的PD-1的相互作用。Bac@PDA和B-iso(包含FITC标记的同型) 作为对照。
流式细胞分析显示，释放到上清液中的αPD-1可以与活化的T细胞结合(图4A,h)，与对照组相比，其荧光信号显著增强，证明分离的αPD-1的完整性。更吸引人的是，我们观察到，在重悬沉淀培养后，受刺激的T细胞呈现出类似的荧光强度增加。这表明，同时在肿瘤组织中观察到，附着在细菌表面的αPD-1也能够与T细胞上表达的PD-1结合(图4A,i)，这揭示αPD-1以游离和共轭形式与PD-1相互作用。αPD-1在肿瘤中的时空可控定位提出了B-αPD-1逆转免疫抑制TME的潜力，考虑到αPD-1多剂量给药以获得免疫激活效果
TME重组
综合评价B-αPD-1在光热和检查点阻断剂双重激活作用下的免疫应答是否能够协同重组TME。建立皮下4T1肿瘤模型，向肿瘤内分别注射PBS、BacWT、BacMel、αPD-1或 B-αPD-1。详细的实验设计如图5A,a所示。在第15天处死小鼠，收集DLN、肿瘤组织和血清，分析免疫激活作用。通过流式细胞分析得到的直方图表明，B-αPD-1+NIR处理小鼠的DLNs中DCs上MHC-II和CD86的表达显著高于其他各组(图5A,b和c)。CD25+Foxp3+Treg细胞百分比降低(图11,b)，CD8+T细胞/Treg细胞比例升高(图11,c)，这些数据表明， B-αPD-1+NIR处理小鼠的激活免疫应答。T细胞中IFN-γ产生水平和Ki67表达水平的增加进一步证明，B-αPD-1+NIR可诱导强烈的T细胞反应(图5A,d和e)。同时，还通过流式细胞术分析了肿瘤中的免疫反应。B-αPD-1+NIR组DC上MHC-II表达高于其他各组(图 5A,f)。与其他组相比较，类似于BacMel+近红外光谱，B-αPD-1+近红外光谱表明CD86 DC 表达增加(图5A,g)，CD45+细胞渗透性增强(图5A,h)、Treg细胞百分比减少(图5A,i)、 Ki67+CD8+T细胞百分比增加(图5A,j)、和干扰素γ+CD8+T细胞百分比提高(图5A,k)。此外，与其他组比较，在近红外光照射下，B-αPD-1组中CD8+T细胞明显浸润(图5A,n 和图12,a)，CD8+T细胞与Treg细胞的比例略有增加(图12,b)，这解释了重编程的TME。
在这些处理中，从B-αPD-1+NIR小鼠的肿瘤组织中，CLSM图像的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记(TUNEL)染色显示最大的凋亡和坏死区域(图5A,n)。据报道，肿瘤细胞的凋亡或坏死可产生大量的细胞碎片，刺激免疫系统，产生免疫应答。B-αPD-1+NIR可显著下调肿瘤细胞上PD-L1的表达(图12,c)，表明PD-L1/PD-1相互作用减弱，可进一步增强TME中T细胞的杀伤能力。如图5A,l和m所示，在所有这些组中，B-αPD-1和NIR 处理的血清中IFN-γ和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量最高，这证明了一种强大的系统抗肿瘤免疫应答的启动。此外，与游离αPD-1相比，B-αPD-1+NIR降低了血清中IL-6 的产生(图13)，这是有意义的，因为系统IL-6水平的升高与αPD-1 nivolumab处理的不良临床反应有关。
综上所述，这些结果支持了B-αPD-1时空可控分布结合光热和检查点阻断协同激活免疫抑制TME的潜力。
在皮下肿瘤模型和原位肿瘤模型中的治疗价值
为了评价本发明方法对实体瘤的治疗价值，我们记录了B-αPD-1+近红外照射后4T1 荷瘤小鼠的肿瘤大小、生存率和体质量。
采用PBS、BacMel、BacMel+近红外辐照和αPD-1作为对照例。处理的实验设计如图14所示。尽管BacMel介导的PTT对肿瘤具有有效的抑制作用，但B-αPD-1+近红外照射处理的肿瘤体积的增长速度比其他所有组都慢，这归因于联合抗肿瘤效果(图6A,a和b)。与所有对照组相比，联合治疗后肿瘤进展率的降低显著延长了治疗小鼠的生存时间(图6A,c)。此外，各组间的体重变化波动可忽略不计(图6A,d)，证明B-αPD-1的副作用有限。
此外，我们还建立了小鼠乳腺脂肪垫注射4T1细胞的原位乳腺肿瘤模型，以测试B-α PD-1的治疗效果。与从皮下肿瘤中获得的结果不同，BACmel介导的PTT治疗对原位肿瘤的生长抑制可以忽略(图6A,e和f)。显著的是，B-αPD-1加近红外照射比其他所有组的肿瘤生长明显迟缓。特别地，B-αPD-1+NIR照射组的两个原发肿瘤在治疗后第14天被消除(图 6A,f)。令人鼓舞的是，联合治疗组的小鼠，在40天内使75％的动物存活；而其他组的小鼠，在35天内死亡(图6A,g)。同样，所有实验组小鼠的体重均无明显差异(图6A,h)。
我们还注意到，与BacMel+αPD-1+NIR和BacWT-αPD-1+NIR相比，B-αPD-1+NIR照射在抑制肿瘤生长和激活免疫抑制TME方面的效果增强(图15)。B-αPD-1治疗效果显著增强，表明联合治疗方式在皮下和原位肿瘤模型中均具有时空可控分布的优势。
综上，本发明还提供了一种在时空可控的方式下在实体肿瘤中分配治疗药物的策略。将PPT与免疫检查点阻断疗法相结合，展示联合疗法如何在肿瘤内部实现时空可控分布，从而使其治疗效果最大化。细菌由于其功能化的多功能性以及在肿瘤内环境中的定植性，已被开发为药物载体。我们结合合成生物学和界面化学的优势来修饰细菌，考虑到这种策略的稳健性，可同时携带多种抗肿瘤药物。
大肠杆菌是一种可以在各种肿瘤上定植的菌株，它已经被内外双重修饰以表达天然黑色素，并在其表面结合免疫检查点抑制剂。被修饰的细菌在肿瘤内的充分驻留促使联合疗法在人体内和小鼠体内肿瘤组织中均匀和持久的分布。光热黑色素的时空可控分布能够在宽照射窗内激光照射肿瘤后反复产生温和而均匀的加热。除了黑色素引起的光热增强免疫反应外，与其分布相似的免疫检查点抑制剂结合，促进协同免疫激活效应，成功逆转免疫抑制的TME。在皮下和原位肿瘤模型中，免疫微环境的重编程显示出有前景的治疗价值，包括显著抑制肿瘤生长和大大延长生存时间。鉴于这种细菌修饰策略的方便性和可行性，我们的研究为治疗药物在实体肿瘤内的时空可控分布提供了一个通用平台，并为优化抗肿瘤疗效打开了一个新的窗口。
以上仅是本发明的具体实施例以及用于证实本发明申请发明构思的实验例，但并不以此限制本发明。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种双重修饰的工程化细菌，其特征在于，所述双重修饰的工程化细菌在外部偶联免疫检查点抑制剂，在内部编码酪氨酸酶基因；
其中，所述细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌；
所述工程化细菌是将包括编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，然后在碱性溶液中将免疫检查点抑制剂锚定到细菌表面获得的一种工程化细菌；
通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式将免疫检查点抑制剂共沉积到表达黑色素的细菌的表面，由此获得的一种工程化细菌。
2.根据权利要求1所述的工程化细菌，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-抑制剂、PD-L抑制剂和TIGIT抑制剂中的一种或多种。
3.一种制备上述权利要求1-2中任一项所述双重修饰的工程化细菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：将编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种能够表达黑色素的细菌；和
步骤2：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式将免疫检查点抑制剂共沉积到表达黑色素的细菌的表面，由此获得的一种工程化细菌；
其中所述细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤2中，在碱性环境下，将多巴胺的碱性溶液，在室温，搅拌条件下，通过多巴胺的氧化和原位聚合作用，将免疫检查点抑制剂共沉积在所述表达黑色素的细菌的表面。
5.一种可时空定位的用于治疗或缓解肿瘤进程的产品，其特征在于，所述产品至少包括一种工程化细菌，所述工程化细菌在外部表面偶联免疫检查点抑制剂，在内部包括编码酪氨酸酶基因，以获得重新编程免疫抑制微环境，从而达到治疗或缓解肿瘤进程；
其中所述细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌；
所述肿瘤为实体瘤；
所述工程化细菌是将包括编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，然后将在碱性溶液中将免疫检查点抑制剂锚定到细菌表面获得的一种工程化细菌；
通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式将免疫检查点抑制剂共沉积到表达黑色素的细菌的表面，由此获得的一种工程化细菌。
6.一种双重修饰的工程化细菌在制备用于治疗或减缓肿瘤进程的药物方面的用途，其特征在于，所述工程化细菌在外部偶联免疫检查点抑制剂，在内部编码酪氨酸酶基因；
其中，所述细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌；
所述肿瘤为实体瘤；
所述工程化细菌是将包括编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，然后将在碱性溶液中将免疫检查点抑制剂锚定到细菌表面获得的一种工程化细菌；
通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式将免疫检查点抑制剂共沉积到表达黑色素的细菌的表面，由此获得的一种工程化细菌。
7.药物组合物，其包括上述权利要求1-2中任一项所述双重修饰的工程化细菌及其药学上可接受的载体。
CN202111175321.1A 2021-10-09 2021-10-09 一种双重修饰的工程化细菌及其应用 Active CN114196604B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111175321.1A CN114196604B (zh) 2021-10-09 2021-10-09 一种双重修饰的工程化细菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111175321.1A CN114196604B (zh) 2021-10-09 2021-10-09 一种双重修饰的工程化细菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114196604A CN114196604A (zh) 2022-03-18
CN114196604B true CN114196604B (zh) 2024-01-23

Family

ID=80646155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111175321.1A Active CN114196604B (zh) 2021-10-09 2021-10-09 一种双重修饰的工程化细菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114196604B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114149941B (zh) * 2021-10-29 2023-09-19 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种表面结合靶向配体的细菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016106198A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for generating antigens, antibodies, and immunotherapeutic compositions and methods
WO2017152132A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of identifying and treating immune checkpoint inhibitor-responsive neoplasms
CN110951663A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 深圳市前海金卓生物技术有限公司 表达pd-1抗体的重组细菌及其构建方法和应用
CN111467489A (zh) * 2020-05-12 2020-07-31 上海荣瑞医药科技有限公司 一种治疗肿瘤的药物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10166255B2 (en) * 2015-07-31 2019-01-01 Regents Of The University Of Minnesota Intracellular genomic transplant and methods of therapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016106198A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for generating antigens, antibodies, and immunotherapeutic compositions and methods
WO2017152132A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of identifying and treating immune checkpoint inhibitor-responsive neoplasms
CN110951663A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 深圳市前海金卓生物技术有限公司 表达pd-1抗体的重组细菌及其构建方法和应用
CN111467489A (zh) * 2020-05-12 2020-07-31 上海荣瑞医药科技有限公司 一种治疗肿瘤的药物

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bacteria-Driven Hypoxia Targeting for Combined Biotherapy and Photothermal Therapy;Chen W;ACS Nano;全文 *
In-situ synthesis of melanin in tumor with engineered probiotics for hyperbaric oxygen-synergized photothermal immunotherapy;Yi Xiao;nanotoday;全文 *
Polydopamine-based nanoplatform for photothermal ablation with long-term immune activation against melanoma and its recurrence;Li Mengmeng;Acta Biomater;全文 *
Spatiotemporally Controllable Distribution of Combination Therapeutics in Solid Tumors by Dually Modified Bacteria;Wang Lu;Adv Mater;全文 *
Surface Modification of Bacteria to Optimize Immunomodulation for Advanced Immunotherapy;Xue Keke;ChemMedChem;全文 *
细胞膜包裹槲皮素-聚多巴胺（PDA）的制备及抗菌和抗肿瘤的活性研究;程豪;中国优秀硕士学位论文全文数据库;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114196604A (zh) 2022-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Spatiotemporally controllable distribution of combination therapeutics in solid tumors by dually modified bacteria
Ou et al. Heterojunction engineered bioactive chlorella for cascade promoted cancer therapy
Zhou et al. Rational design of a minimalist nanoplatform to maximize immunotherapeutic efficacy: Four birds with one stone
Chen et al. Combination of bacterial‐photothermal therapy with an anti‐PD‐1 peptide depot for enhanced immunity against advanced cancer
Alphandéry Applications of magnetotactic bacteria and magnetosome for cancer treatment: a review emphasizing on practical and mechanistic aspects
Chen et al. Dual drugs decorated bacteria irradiate deep hypoxic tumor and arouse strong immune responses
Pan et al. A heterogenic membrane-based biomimetic hybrid nanoplatform for combining radiotherapy and immunotherapy against breast cancer
Liu et al. Multimodal oncolytic bacteria by coating with tumor cell derived nanoshells
Lin et al. Dual-functional PLGA nanoparticles co-loaded with indocyanine green and resiquimod for prostate cancer treatment
Zhao et al. A hybrid bacterium with tumor-associated macrophage polarization for enhanced photothermal-immunotherapy
Zhao et al. Calcium phosphate nanoneedle based gene delivery system for cancer genetic immunotherapy
Chen et al. Wrapping Porphyromonas gingivalis for tumor microenvironment immunomodulation and photothermal immunotherapy
WO2013059528A2 (en) Encapsulated diagnostics and therapeutics in nanoparticles-conjugated to tropic cells and methods for their use
Zhu et al. Tumor‐targeted nano‐adjuvants to synergize photomediated immunotherapy enhanced antitumor immunity
Chen et al. Simultaneous T Cell Activation and Macrophage Polarization to Promote Potent Tumor Suppression by Iron Oxide‐Embedded Large‐Pore Mesoporous Organosilica Core–Shell Nanospheres
Chen et al. Photodynamic therapy initiated immunotherapy of self-delivery re-educator by inducing immunogenic cell death and macrophage polarization
Li et al. Tri-component programmable nanoregulator with Three-pronged penetration boosts immunotherapy of Triple-Negative breast cancer
Zhou et al. Bacteria-based immunotherapy for cancer: a systematic review of preclinical studies
CN114196604B (zh) 一种双重修饰的工程化细菌及其应用
Tian et al. Bio-Responsive nanoparticle for tumor targeting and enhanced photo-immunotherapy
Jiao et al. Anti-tumor immune potentiation targets-engineered nanobiotechnologies: design principles and applications
Guo et al. Converting bacteria into autologous tumor vaccine via surface biomineralization of calcium carbonate for enhanced immunotherapy
Chen et al. Macrophage-derived biomimetic nanoparticles enhanced SDT combined with immunotherapy inhibited tumor growth and metastasis
Zhang et al. Immunostimulant In Situ Fibrin Gel for Post-operative Glioblastoma Treatment by Macrophage Reprogramming and Photo–Chemo-Immunotherapy
Mathew et al. 5-FU mediated depletion of myeloid suppressor cells enhances T-cell infiltration and anti-tumor response in immunotherapy–resistant lung tumor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant