CN101603045B - 利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶，公开了一种乳腺特异性表达的融合基因，该融合基因从5’至3’依次包含以下元件：牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列，人溶菌酶基因，和牛生长激素基因3’侧翼序列。本发明还公开了一种制备转基因动物的方法。本发明还公开了一种高效安全的去除标记基因的转基因家畜制备方法。

Description

利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体的，本发明涉及一种乳腺特异性表达融合基因，以及一种制备乳汁中可高效表达溶菌酶的转基因家畜的方法，以及一种高效的去除标记基因的转基因家畜制备方法。

背景技术

天然的溶菌酶是一种在动物界和植物界中广泛存在的多肽类糖苷酶。1922年AlexanderFlemin发现多种粘液组织和分泌物以及鸡蛋清中存在能够溶解多种革兰氏阳性细菌的物质。他把这种溶解因子称为溶菌酶。Flemin发现溶菌酶在软骨组织和胃的匀浆液、泪液、唾液、痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、血清和淋巴细胞中都有存在，但在健康的尿液、脑脊髓液或汗液中没有溶菌酶。1963年Jolles和Canfield各自独立阐明了鸡蛋清来源的溶菌酶的一级结构。1965年Phillips基于X-射线结晶学描绘了溶菌酶的三维结构。

溶菌酶可分为三种类型：源于鸡蛋卵清的c型、源于鹅蛋卵清的g型和源于噬菌体的溶菌酶。三者有相似的三维结构，但氨基酸序列不同。目前已知溶菌酶发挥生物学活性主要通过两种方式：一种是直接作用，即通过降解细菌细胞壁肽聚糖(polypeptidoglycan)中N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)间的β(1→4)糖苷键的连接，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。由于革兰氏阳性细菌(G+细菌)的细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而革兰氏阴性细菌(G-细菌)只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶可高效破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌的作用不大。间接作用就是通过降解细菌细胞膜中的粘多糖片段引发一些尚未明确的免疫激活，刺激巨噬细胞的噬菌活性。这种间接作用已在大鼠中得到证明，完整的细菌不引发巨噬细胞的噬菌作用，相反经溶菌酶处理过的细菌能够被迅速吞噬。另外溶菌酶分子本身的阳离子和疏水的特性也有助于其杀菌活性的发挥。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，因此溶菌酶对人体细胞无毒性作用。

目前已知的溶菌酶的主要作用有：1)抗菌消炎作用。溶菌酶的溶菌活性使其在预防和治疗多种细菌性疾病中具有重要作用，如由链球菌家族微生物引起的耳炎、窦炎、腺炎、尿道炎、阴道炎等。它还可结合并失活各种诱发炎症的酸性物质，能增强抗生素和其它药物的疗效等。2)抗病毒作用。溶菌酶的正离子特性使其可结合带负电荷的病毒蛋白使其失活。3)增强免疫力。溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，可以改善和增强巨噬细胞的吞噬和消化能力，激活白细胞的吞噬功能，并改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少等。4)止血、镇痛等作用。

上述溶菌酶的广泛作用表明了其药用的广阔前景，具有极大的市场。但是目前溶菌酶在用于临床时受到了三大因素的制约：1)天然人溶菌酶很难大量获得。目前人乳汁和胎盘是获得天然人溶菌酶(hLYZ)的唯一来源，但这些材料相当有限，使产品的价格过于昂贵。2)来源于其它物种的溶菌酶会引起许多副作用，如蛋清来源的可引起过敏反应，牛源的具有传染疯牛病的威胁。3)其它动物来源的溶菌酶不适合用于人用药物，因它们与人溶菌酶间的同源性较低，如鸡蛋清源的为56.8％，大鼠的为76.4％，奶牛的为82.3％，马的为50.8％。

基因工程技术的发展为克服上述限制提供了有效途径。1986年，Jigami等人利用酵母表达了人溶菌酶，但不具有抑菌活性。Castanon和Yoshimura也做了类似的工作，没有取得突破。1990年，Archer等人在米曲霉中表达了12mg/l的鸡蛋清溶菌酶；Tsuchiya等人在米曲霉中表达了1.2mg/l的人溶菌酶，但均没有生物活性。可见，酵母和米曲霉并非表达溶菌酶的理想宿主。

近年来，利用植物表达溶菌酶的研究取得了可喜进展。1997年，Nakaiima等人在烟草叶中低水平表达的溶菌酶可以提高植物抗真菌和细菌能力。2000年，Takaichi和Oeda在胡萝卜中表达了人溶菌酶。Ahreholta等人在马铃薯里中表达的T4溶菌酶具有不依赖于植物的年龄和生长环境影响的溶菌活性。2002年，经密码子优化的人工合成的溶菌酶基因在转基因的水稻悬浮培养的细胞里得到了表达，表达量达到可溶性蛋白的4％，并具有同人溶菌酶相似的生物活性。由此可见，植物可以表达有活性的人溶菌酶。但是植物与动物间蛋白修饰、剪接等方面的差异将可能影响这种重组蛋白的临床应用。

哺乳动物乳汁中蛋白的表达水平高，成本低、无污然，而人溶菌酶自身就可在人乳中有相当量的高活性表达(0.4-0.7mg/ml)。1994年Mapa等人利用牛的alpha sl-casein启动子调控人溶菌酶在转基因小鼠乳腺中获得了表达，表达量为0.2g～0.7g/L。1998年，他们进一步的研究表明这种人溶菌酶具有同标准溶菌酶相同的活性。由于大型乳用家畜(牛和羊等)乳腺的蛋白产量大(每头奶牛可年产250～300kg乳蛋白，一只绵羊或山羊可年产25～30KG乳蛋白)，因此是大量生产人溶菌酶的理想场所。李宁等在CN 16699405A中公开报道获得了整合有以PBCl(一种商业化载体，调控序列为山羊的β-酪蛋白)指导人溶菌酶乳腺特异表达框架的转基因奶牛，但没有检测表达情况。

此外，还应当注意到，在利用核移植技术生产转基因动物的过程中，不可避免的要使用筛选标记基因(如细菌新霉素磷酸转移酶基因(neo)和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSVtk)等)，以富集整合有外源基因的单克隆细胞株。这些标记基因大多要求使用可组成性表达的强启动子，如源于巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒(HSV)等的强启动子。尽管标记基因和启动子本身并无直接毒性，但是当抗性基因整合入受体动物基因组中后往往会带来的复杂的生物学效应。根据研究表明，抗性基因插入基因组后容易导致相邻基因的失活；其强启动子可干扰相邻基因的启动子表达。有报道指出，在抗性基因插入位点100kb远处的基因都可受到其影响；抗性基因的表达产物也会对受体动物造成多方面效应，如直接的毒性效应、过敏效应、因蛋白的催化功能而产生的副作用或产生对人类及其他生物体有害的物质等。有研究报道抗性基因的表达产物能够在宿主细胞中引起免疫反应，例如潮霉素磷酸转移酶B(hph)的产物曾发现引起T-细胞应答反应。另外抗性基因对于相邻目的基因的表达水平也会产生不良影响，有实验表明不含有抗性基因的载体中目的蛋白的表达要高于含有抗性基因的；且如果抗性基因与目的蛋白选取相近的启动子或者其蛋白性质相似，抗性基因的表达产物还可能会污染目的蛋白。鉴于以上情况，删除转基因动物体内的标记基因和病毒、细菌的调控序列是优化目的蛋白的表达水平、减少可能的副作用以及加速转基因动物乳腺生物反应器产业化进程所迫切需要解决的问题。

目前，Cre/loxp重组酶系统已被用于体内和体外的DNA分子修饰，包括条件性基因删除、转基因激活或灭活以及染色体间的转座等。Cre/loxp技术在小鼠胚胎干细胞的同源重组体筛选中去除抗性基因是其一个最重要和直接的应用。Cre重组酶属于λ整合酶家族，分子量为38kDa，能催化两个34bp的loxP位点间发生高效重组，产生的重组结果有：①单条DNA链上，同向loxP位点间DNA序列的剔除；②单条DNA链上，反向loxP位点间DNA序列的颠倒；③两条DNA链上间，同向loxP位点间DNA序列的移位或交叉。

删除抗性基因可以在体外细胞内进行，也可以当抗性基因已被传递到生殖系后在体内进行。体内删除是通过与表达Cre酶的转基因动物杂交后，诱导Cre酶在胚胎发育的早期表达，从而使后代体内的标记基因被删除。但是，最近许多研究表明这种持续表达的Cre重组酶能够引起毒性。例如Cre重组酶引起了转基因小鼠精子细胞内染色体重排的混乱，而且这种方法无疑会在动物体内额外引入了新的Cre表达框架。

体外删除的方法主要是通过cre重组酶在受体细胞内的瞬间表达，然后基于负筛选基因(如TK)的敏感性筛选出标记基因被删除的细胞。但是，仅有50％被转染的人ES细胞中能够检测到Cre-介导的重组发生，而且删除类型的重组和整合类型的重组效率在不同细胞类型中也存在差异。Coppoolse等的研究还发现，Cre/loxp系统在体细胞内的删除效率与删除片断的大小相关，片段越大效率越低，而且经过生殖系传递后的删除效率又有了进一步降低。因此，Cre介导的DNA重组效率受到了构件、细胞类型以及整合状态等因素的影响。

蛋白转导技术可以高效的将有活性的蛋白直接转入哺乳动物细胞中，其原理是通过重组的方法改变目的蛋白的生物特性，例如，加入与细胞渗透性有关的蛋白结构域，即所谓的蛋白转导结构域(protein transduction domains，PTDs)，如TAT(来源于HIV)，FGF(疏水多肽)，NLS(核定位序列)等。但该方法能否用于家畜细胞、会不会影响供核细胞的状态，如核相、增殖性能、染色体倍性等，进而会大大影响克隆的成功率、导致克隆动物生理生化功能异常甚至无法获得成活克隆动物等，这些问题目前尚无报道。

综上所述，尽管目前已经有人利用转基因技术和基因调控技术来使动物产生溶菌酶。但是仍然没有找到可有效使动物高产溶菌酶的基因调控方法。因此，现有技术迫切需要寻找到合适的基因调控区域和调控方法，以最终获得高产溶菌酶的转基因动物。为提高转基因动物的安全性，减少因外源基因导入引起受体动物伤害或导致对环境的威胁，目前也迫切需要获得一种高效安全地删除抗性标记基因的转基因动物制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳汁中高表达人溶菌酶的转基因动物及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供高效安全地从转基因动物细胞内删除抗性标记基因的方法。

在本发明的第一方面，提供一种乳腺特异性表达融合基因，该融合基因从5’至3’依次包含以下可操作性相连的元件：牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列，人溶菌酶基因，和牛生长激素基因3’侧翼序列。

在另一优选例中，所述的人溶菌酶基因选自：

(a)具有SEQ ID NO：5中1267-6067位的核苷酸序列；或

(b)与(a)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

所述的牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列选自：

(a1)具有SEQ ID NO：5中1-1260位的核苷酸序列；或

(b1)与(a1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

所述的牛生长激素基因3’侧翼序列选自：

(a2)具有SEQ ID NO：5中6074-6304位的核苷酸序列；或

(b2)与(a2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列具有牛β-乳球蛋白基因上游-1215～+45bp位序列。

在另一优选例中，所述的牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列如下制备：以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，以牛基因组DNA为模板PCR扩增获得。

在另一优选例中，所述的牛β-乳球蛋白的3’侧翼序列获自重组质粒pTA-BGH；更佳的，通过XhoI+SacII双切重组质粒pTA-BGH获得。

在另一优选例中，所述的融合基因：

(i)具有SEQ ID NO：5中1-1260位、1267-6067位和6074-6304位依次连接获得的核苷酸序列；

(ii)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或

(iii)与(i)或(ii)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种制备转基因动物的方法，包括以下步骤：

(a)将所述的融合基因转染体细胞，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞；

(b)将所获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产人溶菌酶的动物。

在另一优选例中，采用抗性标记基因作为筛选工具，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞，所述的抗性标记基因获自双标记选择载体。优选的双标记选择载体为pLNK。

在另一优选例中，步骤(a)中，在将所述的融合基因转染体细胞的同时，还包括：将一用于抗性筛选的基因转染体细胞，获得基因组中整合有所述融合基因以及抗性标记基因的转基因细胞；

并且，所述的用于抗性筛选的基因从5’至3’依次包含以下元件：Loxp，新霉素抗性基因(Neo)，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSVtk，简称TK)，Loxp。

在另一优选例中，在步骤(a)与(b)之间，还包括步骤(a1)：用细胞穿透型Cre重组酶处理所述的转基因细胞，从而获得删除了所述抗性标记基因的转基因细胞；所述的细胞穿透型Cre重组酶是：细胞穿透肽和Cre重组酶的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的细胞穿透型Cre重组酶是反式激活蛋白(TAT)与Cre重组酶的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的细胞穿透型Cre重组酶从N端至C端依次为TAT和Cre重组酶。

在另一优选例中，在步骤(b)中，去除抗性基因的供核细胞的体细胞克隆效率较未处理组提高了4倍以上。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的细胞为动物胎儿成纤维细胞。

在另一优选例中，所述的动物选自牛、山羊、绵羊、兔、猪。优选的，所述的动物为山羊。

在本发明的第三方面，提供高产人溶菌酶的转基因克隆动物的细胞(优选非生殖细胞)，来自采用前述的方法获得的乳腺高效表达人溶菌酶的转基因动物。

在另一优选例中，所述的细胞中不含有抗性基因。

在本发明的第四方面，提供一种生产人溶菌酶的方法，包括步骤：培养用前述方法制得的转基因动物，从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出表达的人溶菌酶。

在另一方面，还提供一种重组载体，该载体含有所述的融合基因。

另一方面，还提供一种乳汁，它含有浓度10-8000μg/ml的人溶菌酶。更佳的，所述的乳汁中含有浓度50-1000μg/ml的人溶菌酶。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：pbLGLyz的构建流程示意图：以牛基因组DNA为模板，用PCR法扩增BLG5’侧翼序列(-1215～+45 bp)，将PCR产物克隆入pGEM-T-easy载体，得质粒pRBLGR。XhoI+SacII双切重组质粒pTA-BGH获得300bp大小的牛生长素基因3’UTR(PolyA序列)(bGH-pA)，将其回收，克隆到质粒pbLG5’中成pRBLGpA。最后再用XhoI将人的溶菌酶基因从pcDNA-LYZ切出后克隆到pRBLGpA的XhoI位点，最终成pbLGLyz。

图2：pLNK的结构示意图。neo和TK基因两端各有一个同向排列的loxp位点，这一框架可通过SalI单切出，大小3.8kb。

图3：抗性细胞株的PCR和Southern-blot的检测结果。图3A为PCR检测结果，1、2、4、5、6、21、26、27、28号克隆可扩增出阳性条带；图3B为Southern-blot的检测结果，5、6和21号有3.2kb的清晰杂交条带。

图4：存活的5头人溶菌酶转基因克隆山羊。

图5：人溶菌酶转基因克隆山羊的PCR(A)和Southern-blot(B)的检测结果。

图6：转基因山羊乳汁中人溶菌酶表达的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)检测。

图7：转基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量，其中A为SDS-PAGE检测结果，B为Westernblot检测结果。

图8：转基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量，采用Western blot法。

图9：SP-Sepharose阳离子交换介质纯化转基因山羊乳汁中的rhLYZ。A为SP-Sepharose分离纯化转基因羊乳中重组人溶菌酶的梯度洗脱结果，表明使用这种纯化方法在0.145-1mol/L NaCl线形梯度范围无杂峰出现，纯化效果好。B为纯化过程各步骤的SDS-PAGE效果检验结果。M为低分子量蛋白marker；1为脱脂奶；2为酸沉淀去酪蛋白后乳清；3为上样液；4为流穿液；5为洗脱峰纯化产物。C为纯化产物的HPLC分析结果。D为图B中各样品的Western-Blot的检测结果。

图10：转基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量是通过倍比关系较好的稀释度计算出的活性单位。可见BLG1、BLG2和含2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml、846400U/ml和308800U/m。

图11：载体pAAlyzc、pBClyzc、pBClyzg、pINS-CN的图谱。

图12：纯化的Cre^TAT SDS-PAGE电泳图。1为Marker，2为缓冲液替换后的Cre^TAT，3为浓缩后的Cre^TAT。

图13：蛋白转导后细胞克隆的抗性基因PCR鉴定。1为阳性对照，2为阴性对照，3为81号细胞克隆，4为87号细胞克隆，5为Marker，6至16依次为88，98，100，102，111，116，125，128，129，130，132号细胞克隆。

图14：蛋白转导后细胞克隆的Southern-blot杂交。1至4依次为18，19，82，98号细胞克隆，5为BLG-1细胞，6为BLG-2细胞，7为正常山羊细胞，8为Marker。

图15：在细胞株GEF-BLG-2中瞬间表达cre酶的western检测。1为转染后一天的细胞样品，2为转染后二天的细胞样品，3为转染后三天的细胞样品，4为转染后四天的细胞样品，5为转染后五天的细胞样品，6为转染后六天的细胞样品，7为转染后七天的细胞样品。一抗为anti-cre antibody，二抗为Anti Rb IgG(H+L)/HRP。

图16：NF1，NF2转基因山羊。

图17：NF1，NF2转基因山羊中抗性基因PCR鉴定。1为Marker，2为NF1，3为NF2，4为ddH2O，5为野生型山羊，6为BLG-2转基因山羊。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现将的牛β-乳球蛋白5’侧翼序列，人溶菌酶基因组DNA序列或cDNA序列，以及牛生长激素基因3’侧翼序列三者的融合基因转染到细胞中，将该转基因细胞作为核供体制备转基因动物，可获得乳汁中高表达人溶菌酶(＞1mg/ml)的转基因动物。进一步地，本发明人还发现利用细胞穿透型的Cre重组酶结合体细胞克隆技术可安全高效地删除转基因动物体内的标记基因。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：β-乳球蛋白的5’侧翼序列和牛生长激素基因3’侧翼序列被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得目的基因的转录或表达受到该区域的调控。

如本文所用，所述的“高表达溶菌酶”或“高产溶菌酶”是指转基因动物的乳汁中溶菌酶的含量高于一般的动物。作为本发明的优选方式，所述的“高表达溶菌酶”是指乳汁中溶菌酶的含量高于1mg/ml。

如本文所用，术语“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”。

为获得乳汁中高效表达hLYZ的转基因山羊，本发明人反复比较了各种预计可用于调节人溶菌酶表达的功能性元件，最终找到了较佳的元件组合，该组合包含奶牛β乳球蛋白基因的5’调控序列、人溶菌酶基因组DNA序列或cDNA序列和牛生长激素基因3’侧翼序列，这些元件被可操作性地相连接。

为方便整合细胞的筛选以及将抗性基因从细胞或个体中删除，在本发明的优选方式中，本发明人使用了一种双标记表达框架，该框架的两端各包含一个同向loxp序列；loxp位点中间是可独立表达的新霉素(neomycin)和TK两个筛选标记基因。其作用为：Neo基因提供细胞转染过程中的抗性筛选标记，loxp位点和TK基因提供了利用Cre/loxp重组酶系统将双标记表达框架从细胞中删除的工具和筛选标记。

为了获得整合有hLYZ的细胞，本发明人将所述的融合基因与用于抗性筛选的基因按适当的比例混合，电穿孔方法共转染山羊胎儿成纤维细胞，筛选出抗性单克隆细胞株，经鉴定获得人溶菌酶的转基因细胞。

为获得人溶菌酶的转基因山羊，用前述转基因细胞作为供核细胞，山羊的卵母细胞作为供质，进行体细胞克隆。最终获得了5头成活克隆羊，经PCR和Southern-blot分析，表明该5头羊均为人溶菌酶的转基因山羊，整合率100％，这5头羊分别命名为BLG1、BLG2、BLG3、BLG4和BLG5。

对BLG1和BLG2两头转基因山羊做人工激素诱导泌乳，结果人溶菌酶在这两头山羊的乳汁都获得了高效表达，分子量与天然人溶菌酶的分子量相当。定量分析表明，BLG1的乳汁中人溶菌酶的表达量约为3mg/ml，BLG2的表达量超过了4mg/ml。经溶壁微球菌悬浮液的溶壁活性分析表明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml和846400U/ml，添加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性为308800U/ml。

本发明人从BLG1泌乳第8天获得的20ml乳汁中纯化了约19.6mg的重组人溶菌酶，分析表明其纯度约90％。N-末段测序表明，这种溶菌酶与天然人的溶菌酶N-末段的10个氨基酸序列完全相同。

本发明还提供了一种从整合有融合基因以及抗性标记基因的转基因细胞中删除抗性标记基因的方法，所述方法包括：用细胞穿透型Cre重组酶处理所述的转基因细胞，从而获得删除了抗性标记基因的转基因细胞。

所述的细胞穿透型的Cre重组酶可以是Cre重组酶经化学交联或融合表达等手段，标记了TAT、Penetratin、基于信号序列的肽(Signal sequence-based peptides)、pVEC、转座子(Transportan)、Amphiphilic model peptide或Arg9等细胞穿透肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)。本发明人意外地发现，TAT与Cre重组酶形成的融合蛋白可良好地被转入到细胞内，并且发挥良好的删除抗性筛选基因的作用，抗性筛选基因的删除效率很高。因此，所述的细胞穿透型Cre重组酶优选的是TAT(反式激活蛋白)与Cre重组酶的融合蛋白(N端至C端依次为TAT和Cre)。所述的TAT例如具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。

作为本发明的优选方式，所述的细胞为动物胎儿成纤维细胞。所述的动物可以为山羊、绵羊、牛、猪、兔；优选的是山羊。

作为本发明的优选方式，首先建立了细胞内含有抗性标记基因的动物；为删除动物细胞内的标记基因，分离出动物的成纤维细胞，并表达纯化了细胞穿透型的TAT-Cre。将TAT-Cre与成纤维细胞在体外共孵育2小时后，进行克隆化培养。经试验表明，抗性基因的删除效率达到42％。

为了获得标记基因删除的人溶菌酶转基因山羊并评估蛋白转导处理对核移植效率的影响，本发明的优选例中，分别对未删除抗性标记基因的山羊耳成纤维细胞和删除了抗性标记基因的山羊耳成纤维细胞进行了体细胞克隆，结果表明，两种类型细胞在核移植过程中的融合率、桑椹囊胚发育率和妊娠率分别为64.1％和87.5％、27.8％与38.3％、24.0％与29.7％，最终的克隆成功率未处理组为5.8‰(获1头成活山羊)，处理组为27‰(获2头成活山羊)。可见经TAT-Cre处理的细胞的体细胞克隆的成功率较未处理组提高了4.7倍。

在有效地将抗性基因删除后，获得的转基因羊乳汁的安全性更高，杂蛋白更少，更有利于溶菌酶的分离和纯化。特别是当用于制药时，溶菌酶蛋白的纯度是非常重要的，如含有Neo或TK这类耐药性基因对于制药是很不利的，而本发明的方法有效有效克服了该缺陷。并且，由于去除了来源于病毒的TK基因，去除了其对附近基因表达的影响，因此使得转基因羊的乳汁中溶菌酶的表达量可显著提高。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的方法获得的转基因动物的乳汁中高表达人溶菌酶，并具有与天然人乳中溶菌酶相同或相似的生物学活性。

(2)选择到较佳的抗性标记基因删除方法，抗性标记基因的去除效率高，去除了标记基因的家畜细胞的核移植效率较未处理的对照组有明显提高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.试验材料

1.1质粒载体

pGEM-T vector载体购自Promega公司。pBS185质粒购自Gibco公司。PLNK获自中国科学院遗传与发育生物学研究所。质粒pET-cre获自Howard Hughes Medical Laboratories。

1.2主要试剂材料

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶购自NEB公司，尼龙膜购自Minipole公司，QIAquick胶回收试剂盒、QIAfilter质粒回收试剂盒购自QIAGEN公司，Ready-to-go同位素标记试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司，α-³²P-dCTP和Probe Quant探针纯化试剂盒同为Amersham Biosciences公司产品。GMEM购于Gibco公司，FBS、bFGF、NEAA、G418、GANC、谷氨酰胺、丙酮酸钠、0.25％trypsin/0.02％EDTA溶液均购于Sigma公司，hLIF购于Chemicon公司，FBS购于Biochrom公司，各类细胞培养板(瓶)是Nunc和Costar公司的产品。蛋白酶K购于Promega公司，LA PCR试剂盒购于TAKARA公司，秋水仙素购于Gibco公司，氯前列烯醇(PG)购于上海计划生育研究所；促卵泡生成素(FSH)购于宁波激素制品厂；促黄体生成释放激素(LRH)购于上海东风制药厂；2％静松灵购于长春农牧大学兽医研究所；F-10粉剂购于Gibco公司；离子酶素、细胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、透明脂酸酶、DL-乳酸钠、青霉素、链霉素、DMEM粉剂、M16粉剂及所用NaHCO₃等化学试剂均为Sigma公司胚胎培养用产品。Micrococcuslysodeikticus bacterial冻干粉购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

引物合成和测序工作由上海申友生物工程公司合成；蛋白N末端测序工作由中国科学院上海生化与细胞研究所蛋白质组研究分析中心进行；人溶菌酶在乳汁中的表达定量的部分工作由复旦大学人类遗传研究中心完成。

1.3主要仪器设备

Power PAC1000型电泳仪        BIO-RAD

5154D型离心机                Eppendorf

GENE PULSER II型电转化仪     BIO-RAD

4520 S/N型恒温摇床           Forma Scientific

T-Gradient型PCR仪            Biometra

AX80型显微操作仪             OLYMPUS

CO₂培养箱                    Medcenter Einrichtungen GmbH

SZ-PT型解剖镜                OLYMPUS

EG-40型拉针器                NARISHIGE

P-30型磨针器                 NARISHIGE

CE-450型电融合仪             KEFA

K400型倒置显微镜             Leica

BCM-1000A型超净工作台        苏州安泰

MCO-15A型CO₂培养箱           SANYO

 PTC-100

Peltier Thermal Cycler MJ Research.

吸卵针、钨丝、移卵针、方杯、集卵器、手术器械等。

1.4主要试剂的配制

LB培养基：1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母抽提物，1％NaCl。TE缓冲液(pH8.0)：10mmol/l Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/l EDTA(pH8.0)。10×TAE：0.04mol/l Tris-乙酸，1mmol/l EDTA。

质粒抽提溶液I：50mmol/l葡萄糖，25 mmol/l Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/l EDTA(pH8.0)。

质粒抽提溶液II：0.2mol/l NaOH，1％(w/v)SDS。

质粒抽提溶液III：5mol/l乙酸钾(pH4.8)。

10×PBS(无Ca²⁺、Mg²⁺)：NaCl 80.0g，KCl 2.0g，Na₂HPO₄ 14.4g，KH₂PO₄2.4g，调pH7.2，终体积1000ml。

封闭液：含2％(w/v)BSA的PBS缓冲溶液。

PBST：含0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲溶液。

10×底物缓冲液：柠檬酸36.6g，K₂HPO₄ 113.5g，pH6.0。

底物反应液：OPD 0.2mg，30％H₂O₂ 50μl，10×底物缓冲液10ml，加水至100ml。

GEF完全培养液：GMEM，10％(v/v)FBS，1×NEAA，10ng/mL bFGF，1000u/ml hLIF。

GEF选择培养液：GMEM，10％(v/v)FBS，1×NEAA，10ng/ml bFGF，1000u/ml hLIF，500mg/ml G418，2μmol/L GANC。

细胞裂解液：10mol/L TrisCl(pH8.0)，100mmol/L NaCl，25mol/L EDTA(pH8.0)，0.5％(w/v)SDS，100mg/ml蛋白酶K。

变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

中和液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L TrisHCl(pH7.4)。

洗涤液：2×SSC。

预洗液：5×SSC，0.5％SDS，1mol/L EDTA(pH8.0)。

预杂交液：5×SSC，5×Denhard′s，0.5％SDS，100μg/ml鲑精DNA。

洗膜液I：2×SSC，0.5％SDS。

洗膜液II：0.2×SSC，0.5％SDS。

固定液：甲醇∶冰醋酸体积比为1∶3。

冲卵液：PBS，1％FBS(Hyclone)。

饥饿液10ml：50μl FBS，100μl P/S(100×)，100μl L-GW(100×)，9.75ml DMEM。

M16：1.65g M16粉剂，0.035gNaHCO₃，0.33ml乳酸钠(60％)，0.006g青霉素，0.005g链霉素，定溶至100ml。

M2：1.15g F-10粉剂，0.2101 NaHCO₃，0.33ml乳酸钠(60％)，0.006g青霉素，0.005g链霉素，定溶至100ml。

融合液：0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L MgSO₄、0.05mmol/LCaCl₂。

激活液：M16，CB，离子霉素，M16，CB，6-DMAP。

包埋琼脂糖液：含1％琼脂糖的PBS液。

透明质酸酶液：M2，0.2％透明质酸酶。

5×转移存贮液：将36.3g Tris-碱和44.26g CAPS溶解在1L水中。

阳极缓冲液(100ml)：20ml 5×存贮液+15ml甲醇+65ml水。

阴极缓冲液(100ml)：20ml 5×存贮液+1ml 10％SDS+79ml水。

II.具体实施例

实施例1萨能奶山羊胎儿成纤维细胞株的分离

公、母萨能奶山羊(上海转基因研究中心实验牧场)配种35天后用外科手术法取出母羊子宫，将包有胎儿的子宫放入灭菌生理盐水。从子宫中分离出山羊胎儿用PBS液洗两遍，用70％的乙醇进行消毒，再用PBS洗两遍。用手术剪在PBS中剥除胎膜，去除头与肝脏，用组织剪剪碎胎儿组织，平铺于100mm细胞培养皿上。使用加有含10％FBS、青链霉素和非必需氨基酸的GMEM培养液于37℃、5％CO₂、饱和湿度情况下培养，观察细胞贴壁情况，期间更换培养液，去除组织块。结果，原代细胞培养至细胞80％汇合时，在显微镜下观察，可见细胞透明度大、折光性强、轮廓似梭形、有伪足、边缘清晰整齐、贴壁生长、生长速度快、未见到上皮细胞生长，所建立的山羊胎儿成纤维细胞系标记为88#GEF。细胞计数后冷冻保存，用于基因转染受体细胞。

实施例2人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体的构建

按照图1的流程最终获得了人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pbLGLyz，构建方法如下：根据GENBANK登录号X14710中的序列设计并合成如下引物：

5’-cggccgggggtctgctcc-3’(SEQ ID NO：1)，和

5’-ctcgagggctgcagctggggtcac-3’(SEQ ID NO：2)。

以牛基因组DNA为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃，45s；72℃90s，30个循环)扩增牛β乳球蛋白5’侧翼序列(BLG-5’UTR)(-1215～+45 bp)，将PCR产物克隆入pGEM-T-easy载体，得质粒pRBLGR。XhoI+SacII双切重组质粒pTA-BGH获得300bp大小的牛生长素基因3’UTR(PolyA序列)(bGH-PA)，将其回收，克隆到质粒pRBLGR中成pRBLGpA。最后再用XhoI将人的溶菌酶基因(h-Lyz)从pcDNA-LYZ切出后克隆到pRBLGpA的XhoI位点，最终获得pbLGLyz表达载体。

获得的人溶菌酶基因的乳腺特异表达载体pbLGLyz见图1。包含1.3kb的牛β-乳球蛋白的5’侧翼序列(-1215～+45bp)，人溶菌酶的完整基因组编码基因(四个外显子和三个内含子)和300bp的牛生长激素的polyA信号序列，具体如SEQ ID NO：5(注：1-1260位为牛β-乳球蛋白的调控序列；1267-6067位为人溶菌酶的基因组编码序列；6074-6304位为牛生长激素的polyA加尾序列；1261-1266、6068-6073位为XhoI的酶切位点)。

实施例3共转染山羊的胎儿成纤维细胞以及抗性克隆的筛选鉴定

pbLGlyz用NotI酶将表达框架切出，用限制性内切酶Sal I将双标记选择载体pLNK(图2)的表达框架切出，按pbLGlyz∶pLNK＝5∶1的比例(摩尔比)混合后，电穿孔方法共转染胎儿成纤维细胞，电击参数：0.4kV，500uF。电击后，静置10分钟，用GEF完全培养液洗出细胞，均匀接种在10个100mm细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；转染48小时后更换选择培养液(含G418)，此后每隔两天更换选择培养液一次，直至形成明显的细胞克隆。

在细胞克隆形成后，用克隆环挑取克隆，按照从96孔板到48孔、24孔、12孔和6孔板顺序依次传代，当细胞在6孔板长满后冻。存其中的一半(冻存密度5×10⁵细胞/0.5ml)，另一半接入60mm培养皿中继续培养，用于抽提基因组DNA。

当细胞在60mm培养板长满后(约2×10⁶细胞以上)，收集细胞，PBS洗两遍，加细胞裂解液500μl，37℃裂解过夜，酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加1/10体积的NaAC(pH5.2)后用等体积无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤一次，稍稍干燥即用40μl含有20μg/ml RNase的TE缓冲液溶解，37℃温育过夜，4℃保存以备用于阳性克隆的筛选。

用如下引物测定转基因的整合情况，扩增片段为人溶菌酶基因组内一段大小为429bp的序列，退火温度为60℃。

Lyz983：TACATTTGAGGACCTGGCAGAGC(SEQ ID NO：3)，

Lyz1412：TCCTACCACTTTGGGAGGCTGA(SEQ ID NO：4)。

用完整的4.8kb的人溶菌酶的基因组DNA为探针，EcoR I酶切基因组，Southern-blot分析。可获得3.2kb的杂交条带的为正确整合克隆。将正确克隆于液氮中保存备用。

Southern-blot实验操作步骤主要参照《分子克隆试验指南》实验方法进行，琼脂糖凝胶浓度为1％，电泳液为1×TAE，电泳条件为30V，过夜(16h)。DNA转移到硝酸纤维膜上，转移液6×SSC，转移过夜20小时；DNA固定-杂交：80℃烤膜，2小时；预杂交42℃，4小时；杂交42℃，过夜(20小时)；洗膜、放射自显影：压片后，-80℃，72小时；洗片，分析结果。

共挑取了34个分隔良好的细胞株，PCR检测表明其中有10个为阳性(1、2、4、5、6、21、26、27、28)，见图3A；进一步Southern-blot分析表明有3个可获得阳性杂交条带，分别是5、6和21号，见图3B。

实施例4体细胞核移植

1.卵母细胞制备与受体羊的同步

挑选出作为卵母细胞供体的母羊肌注PG 0.1mg/头，间隔10～14天后注射第二次PG，在第二次注射PG 10～13天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，分6次，2次/日，用量为每天100IU，80IU，80IU。在最后一次注射FSH的同时，注射一次PG(0.1mg/头)，间隔24小时后时注射LRH，25μg/次，注射LRH后26～28小时回收卵母细胞。

为与提供卵母细胞的供体羊同步，受体羊间隔9～11天分两次肌肉注射PG，在供体羊超排注射PG后24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量同供体。

手术暴露输卵管，用F-10营养液冲卵、体视镜下检卵。透明质酸酶消化颗粒细胞，M16洗4～5次，置M16方杯中培养，备用。

2.供核细胞的饥饿处理

把待饥饿的细胞接种于35mm平皿内。待细胞丰度达70％～75％左右时，吸去培养液，加入含0.5％FCS的DMEM液，饥饿5天后，常规法消化收集细胞。然后放于-85℃冰箱内保存。在核移植实验前6天，取出2小管复苏并接种于4孔板内。再培养2天或3天后饥饿，饥饿方法同前。

3.重构卵的制备与激活

卵母细胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗涤3次，在M16-Hepes(含7.5μg/ml CB)中处理10min；同时将培养的细胞用胰酶消化、分散成单个细胞。将卵母细胞与供核体细胞同时移入置于灭菌玻片上的1ml M16-Hepes(含CB)中，在显微镜下去核并吸入供核细胞，将之从原来的切口注射到卵周隙内，使其紧贴于胞质膜，采用电刺激的方法进行融合，融合基质为含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化钙、0.1mM硫酸镁、0.5％BSA的溶液，融合条件为DC600-610v/cm，脉冲持续时间80μs，连续刺激3次。融合后的胚胎于M16中培养5小时后，在含5μM离子霉素(ionomycin)、7.5μg/ml CB的M16液中处理5min，再在含2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5μg/ml CB的M16液中处理5小时后移到M16培养液中培养，待包埋或移植。

4.重构卵的包埋、回收与发育胚胎的移植

用1％的Agarose包埋重构卵，并移植入输卵管内，体内培养5天后将胶条冲出，将胶条内的胚胎剥离出来，选择发育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受体羊子宫内。移植后的受体在胚胎发育至1～2月龄时用B超进行妊娠检查，出现孕囊的判定为怀孕，妊娠足月分娩，获得子代山羊。

取子代山羊的耳尖组织，组织匀浆机匀浆，加入500μl 1×裂解液，50μl蛋白酶K，37℃恒温过夜。次日加入500μl酚，缓慢颠倒混匀5分钟，使其充分乳化。13000g离心5分钟，用1000μl去尖枪头小心吸取上清至一1.5ml离心管。用等体积酚∶氯仿(1∶1)反复抽提几次。最后加入2倍体积的无水乙醇，缓慢混匀，静置10分钟。13000g，4℃离心10分钟，沉淀DNA。倾除上清，倒置离心管至溶液挥发干，加入适量300μlTE(pH8.0)溶解，保存于4℃备用。

基因组DNA的PCR和Southern-blot检测方法同实施例3。

经PCR和Southern-blot分析表明获得了5头转基因山羊(图4)，图5A为PCR检测结果，N1～N3为正常山羊，1～5分别为BLG1～BLG5，+为阳性质粒对照，M为1kb的分子量标准，可见BLG1～BLG5都可扩增获得阳性条带；图5B为Southern-blot的检测结果，1～5分别为BLG1～BLG5，M为1kb的分子量标准，可见BLG1～BLG5都可扩增获得阳性条带，也都可杂交出3.2kb的阳性条带。

实施例5转基因山羊的诱导泌乳和重组人溶菌酶的表达检测

选取转基因山羊BLG1和BLG2，待BLG1和BLG2生长至5月龄时进行诱导泌乳，获得乳汁。每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(2mg)及黄体酮(20mg)二次，共7天。然后分别于第8，10，12，14天肌肉注射利血平0.5mg。于第12天收集乳汁，乳汁保存于-20℃备用。

将羊乳汁(羊奶)用蒸馏水稀释10倍，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，于65℃温育15分钟。取5μl做SDS-PAGE凝胶电泳，积层胶为4％胶浓度，分离胶为7.5％胶浓度，100V恒压。

Western-blot分析：SDS-PAGE凝胶电泳后，80mA恒流2小时，将蛋白转至硝酸纤维素膜上。10％脱脂奶粉过夜封闭转印膜，以1∶3000的浓度加入第一抗体(兔抗人溶菌酶多抗)，室温杂交1小时；杂交结束，用PBST溶液漂洗滤膜3次，每次10分钟；以1∶3000的浓度加入酶联二级抗体，室温杂交1小时；杂交结束，用PBST溶液洗膜3次，每次10分钟。用DAB和双氧水显色5分钟。

估量乳汁中重组人溶菌酶的表达水平：将转基因山羊的奶样和人的标准品分别做梯度稀释后，通过SDS-PAGE和Western-blot检测，对检测信号进行对比，以此对奶中人溶菌酶的表达水平进行估计。

奶样经SDS-PAGE和Western-blot分析，表明BLG1和BLG2的乳汁中都可获得强的杂交信号。乳汁中rhLYZ的估量表明BLG1初乳中大约为3mg/ml；BLG2初乳中的表达量在4mg/ml。上述杂交分析也表明山羊乳汁中表达的重组人溶菌酶与天然人的溶菌酶有相同的抗原性，分子量也相当，约14.6kD。

图6显示了转基因山羊乳汁中人溶菌酶的表达检测。图6A为SDS-PAGE电泳结果，PAA1、PBC1和PBC2是与BLG1和BLG2同一批次制备的不同调控区指导人溶菌酶乳腺特异表达的转基因克隆山羊，正常山羊与转基因山羊催乳同步，M为蛋白分子量标准，SDS-PAGE结果表明BLG1和BLG2的奶样在14.6kD处都有一明显蛋白条带，其他样品无；图6B为图6A所述样品的Western-blot检测结果，图中可看出BLG1和BLG2都有强的杂交信号，PBC1、PBC2以及人乳汁有相应的杂交条带，但较弱。

图7是转基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量。1、2、3、4、5为人LYZ的标准品，上样中标准人溶菌酶的量分别为：0.4μg、0.2μg、0.1μg、0.05μg、0.025μg；A、B、C、D为BLG2山羊乳汁，上样量分别为：0.1μl、0.05μl、0.025μl、0.0125μl为原乳。图7A为SDS-PAGE检测结果，图7B为相应的Western-blot检测结果，从两种结果可见D与4的信号强度相当，由此估算出的乳汁中人溶菌酶的表达量约为4mg/ml(0.05μg/0.0125μl)。

图8是转基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量。1、2、3、4、5为人LYZ的标准品，上样中标准人溶菌酶的量分别为：0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg，A、B、C、D为BLG2山羊乳汁，上样量分别为：0.25μl、0.2μl、0.15μl、0.1μl、0.05μl为原乳。从结果可见D与3的信号强度相当，由此估算出的乳汁中人溶菌酶的表达量约为3mg/ml(0.3μg/0.1μl)。

实施例6重组人溶菌酶的纯化

将收集后冷冻的rhLYZ转基因羊BLG2的乳汁置于4℃溶解，然后10000g离心30分钟，去除脂肪。将去脂后的乳汁用4N的盐酸调pH到4.7，然后加热到40℃、30分钟使酪蛋白沉淀，最后10000g，离心30分钟后将乳清轻轻倒出。脱脂和脱酪蛋白乳清随后经三种层析技术进行了分离纯化。

将脱脂和脱酪蛋白乳清用稀释液[0.1mol/L NaCl；50mmol/L甘氨酸；pH9.2]倍比稀释后，过滤除杂。用5倍柱体积的平衡液[0.05mol/L NaCl；25mmol/L甘氨酸；pH9.2]平衡层析柱，上样后，再以0.05-1M的NaCl线性梯度进行洗脱，流速均是2ml/min。收集各洗脱峰。用Western-blot检测各峰，确定重组溶菌酶的洗脱峰。含酶的洗脱峰真空浓缩后，上SephadexG-75柱进行凝胶过滤，洗脱液为0.1M醋酸钠缓冲液(pH 6.5)，流速20ml/h，收集包含重组溶菌酶的组分。

结果纯化约20ml自然泌乳的BLG2转基因山羊的奶样，共收集24ml溶菌酶洗脱液，DC法检测蛋白浓度为0.8mg/ml，总计19.2mg，其中大约有94％的组分为重组人溶菌酶。

图9为SP-Sepharose阳离子交换介质纯化转基因山羊乳汁中的rhLYZ。A为SP-Sepharose分离纯化转基因羊乳中重组人溶菌酶的梯度洗脱结果，表明使用这种纯化方法在0.145-1mol/L NaCl线形梯度范围无杂峰出现，纯化效果好。B为纯化过程各步骤的SDS-PAGE效果检验结果。M为低分子量蛋白marker；1为脱脂奶；2为酸沉淀去酪蛋白后乳清；3为上样液；4为流穿液；5为洗脱峰纯化产物。C为纯化产物的HPLC分析结果。D为图B中各样品的Western-Blot的检测结果。

实施例7溶菌酶的活性检测

活性分析：通过测定A₄₅₀条件下，溶壁微球菌(M.luteus)悬浮液浊度的变化来测定。1个酶活单位定义为在室温(20.8℃)条件下，在0.18M的醋酸钠，pH5.5的缓冲液中，每分钟悬浮液的A₄₅₀降低值为0.001。

首先用0.18M的醋酸钠(pH5.5)的缓冲液将溶壁微球菌配置成0.8mg/ml的悬浮液(A₄₅₀0.6-1.0)。将天然人溶菌酶加入正常山羊的乳汁中，浓度达到2mg/ml，作为标准品，正常山羊的乳汁为阴性对照，正常乳汁与转基因乳汁泌乳期相同。将标准品、阴性对照和转基因羊奶用0.18M的醋酸钠(pH5.5)做50、100、200、400、800、1600倍稀释。将20μl样品和180μl的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)的悬浮液，迅速读取混合液的A₄₅₀光吸收值，5分钟后再测定-次，计算出A₄₅₀/min的降低值。整个实验均在室温(20.8℃)下完成。选择倍比关系好的稀释度计算乳汁中溶菌酶的活性单位。

经溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)悬浮液的溶壁活性分析表明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml和846400U/ml，添加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性为308800U/m。

图10为转基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量是通过倍比关系较好的稀释度计算出的活性单位。可见BLG1、BLG2和含2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性分别约为617600U/ml、846400U/ml和308800U/ml。

实施例8重组人溶菌酶的N-端氨基酸测序

将纯化所得的rhLYZ经SDS-PAGE电泳，半干转移至PVDF膜上。转移缓冲液为CAPS液，操作方法简述如下：剪PVDF膜大小同凝胶，100％甲醇浸润，用阳极缓冲液体平衡30分钟；同时两张3mm滤纸也在阳极缓冲液中平衡。阴极缓冲液体中平衡凝胶和两张3mm滤纸。由下至上组装转移夹心装置，依次为：滤纸(+)，PVDF膜，凝胶，滤纸(-)。恒流，1.5mA/cm²，30-60分钟。将膜用0.1％考马斯亮蓝R250(溶解于40％甲醇，1％冰醋酸)，染色30-50秒(不可超过1分钟)，用50％甲醇脱色后用去离子水充分清洗，滤纸上凉干。切下目的条带，将PVDF膜保存于两张滤纸之间，送中国科学院上海生化与细胞研究所进行N-端序列测定。

请中国科学院上海生化与细胞研究所蛋白组研究中心的N-端测序表明了重组人溶菌酶的N-端10个氨基酸序列为：KVFERCELAR，与天然人的溶菌酶序列完全相同。表明了重组人溶菌酶在山羊乳汁中进行了正确拼接和翻译。

实施例9多种乳蛋白调控区指导人溶菌酶表达的比较

本发明人还做了4种乳蛋白调区指导人溶菌酶的5种乳腺特异表达框架(包括基因组DNA和cDNA)，将分别来源于人的d-乳白蛋白、山羊的β-酪蛋白、牛的α-乳球蛋白和牛的αS1-酪蛋白的调控区与功能基因来接，构建用于调控的元件，各调控构件的结构可见图11。

通过共转染的方法，本发明人获得了上述构件的包含人溶菌酶的整合细胞株，并将其用于体细胞克隆，情况如下：pBClyzc整合细胞株为11和26的细胞；pAAlyzc整合细胞株为6、13、43和45的细胞；pbLGlyz整合细胞株为编号为5、6B和21的细胞；pBClyzg整合细胞株为编号为8、9和10的细胞；pINS-CNlyz整合细胞株编号为25、B6和B7细胞。

利用上述整合细胞，本发明人都获得了成活的体细胞克隆羊，出生羊情况为：pBClyzc存活4头，pAAlyzc存活4头，pbLGlyz存活5头，pBClyzg存活5头，pINS-Cnlyz存活3头。

本发明人选择了来源于pBClyzc(PBC1和PBC2)、pAAlyzc(PAA1和PAA2)和pbLGlyz(BLG1和BLG2)构件的各2头羊进行催乳，另外选择一只相同年龄的山羊做对照。另两个构件的羊因年龄尚小没进行催乳。

对获得乳汁(PAA1没能获得乳汁)，进行了表达分析。检测结果表明，PAA1羊乳汁中没有hLYZ的表达，PBC1和PBC2两只羊的乳汁中仅有很微量的表达(表达水平相似)，而BLG1和BLG2两只羊的乳汁中hLYZ都有了高水平表达，正常羊乳汁中没有检测到杂交信号，见图6。

因此本发明人很幸运的找到了在乳汁中高效表达hLYZ的最佳调控组合：牛BLG5’-hLYZ-bGHpA。

实施例10纯化细胞穿透型Cre重组酶——Cre^TAT

将含有细胞穿透型Cre重组酶(Cre^TAT，或称TAT-Cre)的原核表达质粒pET-cre转化BL21(DE3)菌株，挑取转化入所述质粒的菌落接种于20ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，250rpm摇菌过夜。按照1∶100接种过夜的含有目的质粒的菌液于2L含卡那霉素的LB培养基，37℃，250rpm，3h。加入IPTG，使其终浓度为1mM，37℃，250rpm摇菌3h。3000g，10min离心，收获菌体。用100ml预冷PBS重悬菌体，3000g，10min离心，收获菌体，如此重复三遍。用预冷的菌体裂解液重悬菌体，涡旋震荡。将裂解的菌体放置在冰上，超声，强度20，超声1min。15000g，30min，离心，取上清，置于冰上备用。用30％SB平衡SP sepharoseTM柱子，4ml/min，30min。取菌体上清用0.22μm的过滤器过滤后上样，上样速度4ml/min。上样结束后，用30％SB，4ml/min洗柱子，直至紫外吸收值平稳，不再下降。从30-100％SB梯度洗脱，2ml/min，洗脱总体积为100ml，自动收液器收集所有洗脱液。100％SB继续洗脱直至紫外吸收值降到100mAU，合并大于250mAU的所有收集的洗脱液，其中即含有目的蛋白。将收集的含有目的蛋白的洗脱液与二倍体积的SA在冰上小心混匀，出现少量沉淀，用0.22μm的过滤器过滤后，置于冰上备用。用30％SB平衡source 15s柱子，4ml/min，30min。将过滤所得的上清上样，上样速度4ml/min。用30-100％SB梯度洗脱柱子，直至出峰，收集大于250mAU的所有洗脱液，其中即含有目的蛋白。最后将目的蛋白2ml/次上样HiPrepTM26/10 Desalting柱子，缓冲替换液10ml/min洗脱，收集洗脱蛋白峰。将收集蛋白放入millipore MWCO 30000的超滤管中3000g离心30min，管内约余1-2ml蛋白溶液后，吸出蛋白溶液，-80℃保存。蛋白鉴定结果见图12。

实施例11CRE^TAT转导GEF-BLG-2细胞以及抗性基因删除克隆的筛选鉴定

将CRE^TAT加入正常山羊胎儿成纤维细胞培养基内(CRE^TAT培养基)，终浓度为2μM(0.08mg/m1)，在细胞间超净工作台上，0.22μm的过滤器过滤除菌。复苏GEF-BLG-2细胞(BLG2山羊的耳成纤维细胞)长至50-60％满，PBS洗三遍后，加入CRE^TAT培养基。37℃，5％CO₂孵育3h。3h后去除含有CRE^TAT的培养基，用PBS洗三遍，加入正常的细胞培养基，37℃，5％CO₂培养。转导48小时后更换一次培养液，100个/100mm细胞培养板铺板，此后每隔两天更换培养液一次，直至形成明显的细胞克隆。

在细胞克隆形成后，用克隆环挑取克隆，放入96孔板，细胞长至80％满时传代，依次为48孔板，24孔板，12孔板，6孔板，60mm板，冻存。细胞于48孔板长满传代时平均分为三份，一份传至24孔板，一份留于原孔，一份放于另外一个48孔板，做好标记，以便于相互对照。留于原孔的细胞加入含有800μg/ml G418的GEF选择培养基，另外一孔加入正常的GEF完全培养基，G418培养基培养的细胞死亡既为抗性基因删除的细胞克隆。当细胞在6孔板长满后冻存其中的一半(冻存密度5×10⁵细胞/0.5ml)，另一半接入60mm培养皿中继续培养，用于抽提基因组DNA。

当细胞在60mm培养板长满后(约2×10⁶细胞以上)，收集细胞，PBS洗两遍，加细胞裂解液500μl，37℃裂解过夜，酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加1/10体积的NaAC(pH5.2)后用等体积无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤一次，稍稍干燥即用40μl含有20μg/ml RNase的TE缓冲液溶解，37℃温育过夜，4℃保存。

用如下引物测定抗性基因删除情况，扩增片段为pLNK中1.2kb的片段，退火温度为62℃。无条带的为抗性基因删除的细胞克隆，结果见图13。

Neo735：5’-gctcctgccgagaaagtatcca-3’(SEQ ID NO：6)；和

tk1908：5’-ccagcacccgccagtaagtc-3’  (SEQ ID NO：7)。

用完整的4.8kb的人溶菌酶的基因组DNA为探针，EcoR I酶切基因组，Southern-blot分析。可获得3.2kb的杂交条带的为抗性基因删除且原融合基因保留的细胞克隆。将正确克隆置于液氮中保存备用。

Southern-blot实验操作步骤主要参照《分子克隆试验指南》实验方法进行，琼脂糖凝胶浓度为1％，电泳液为1×TAE，电泳条件为30V，过夜(16h)。DNA转移到硝酸纤维膜上，转移液6×SSC，转移过夜20小时；DNA固定-杂交：80℃烤膜，2小时；预杂交42℃，4小时；杂交42℃，过夜(20小时)；洗膜、放射自显影：压片后，-80℃，72小时；洗片，分析结果。

共挑取了165个分隔良好的细胞株，PCR检测和G418敏感性实验表明其中有70个为抗性基因删除的克隆，进一步Southern-blot分析其中19(GEF-BLG-neo 19)和98号(GEF-BLG-neo 98)两个克隆(见图14)有阳性杂交条带。

实施例12利用Cre酶瞬间表达删除山羊体细胞内抗性筛选基因

电穿孔法质粒DNA转染细胞：取对数生长期的GEF-BLG-2细胞，用PBS洗涤两边后，用胰酶消化成单个细胞。

电传孔参数为：细胞浓度为10⁷个/ml，两极宽度为0.4cm，加入细胞体积为0.3ml，PBS185质粒  10-20μg，电压为220V，电容为950μF，放电时间为30msec。电传孔后室温静置10min，随后加入1mlGEF培养基分别放入2个100mm培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

脂质体法质粒DNA转染细胞：待24孔板内细胞张至60-70％丰度，在25μl无血清的GMEM中加入0.4μg DNA，4μl Plus reagent，室温15min。在25μl无血清的GMEM中加入1μllipofectamine。混匀，室温静置15min。细胞用PBS洗两遍后，加入0.2ml无血清GMEM，再加入混合物。3h后去除培养基，PBS洗两遍细胞后，更换正常的含有血清的GEF培养基。

转染后的细胞培养两天后，按50个/板铺100mm细胞培养板。三天换液一次，大约6-7天长出细胞克隆，挑取细胞克隆，转移至96孔板。之后，依次为48孔板，24孔板，12孔板，6孔板，60mm板，冻存。在48孔板长满时，均分为三份，一份传至24孔板，长满后冻存；一份留于原孔，并加入800μg/ml G418的GEF培养基，进行G418敏感性杀伤试验；再一份放于新孔内，加入正常GEF培养基作为对照。培养三天后，分别从G418杀伤、抗性筛选基因整合两方面验证抗性基因是否被删除。抗性基因通过PCR鉴定，所用引物为：

TK5：5’-tctgcgttcgaccaggct-3’      (SEQ ID NO：8)；和

TK35：5’-cggtcgatgtgtctgtcctcc-3’  (SEQ ID NO：9)。

PCR条件为94℃ 3min，94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 50s，72℃ 7min。同时鉴定共人溶菌酶基因的存在情况，鉴定方法同前。同时通过western-blot检测Cre酶的瞬间表达情况。

实验结果如表1，电转没能获得删除克隆，仅脂质体法获得了4株删除克隆，效率只有1.25％，总体效率明显低于蛋白转导方法。

表1 Cre酶瞬间表达后抗性基因的删除情况

转染方案	铺板总数(板)	挑克隆数	PCR检测克隆数	G418杀伤克隆数	抗性基因删除克隆数
						电转	10	112	85	85	0
电转	10	82	65	65	0
						脂质体	14	168	117	117	3
脂质体	10	153	103	103	1

图15是GEF-BLG-2瞬间表达Cre酶的Western检测，可见，脂质体转染后Cre酶在第一天至第五天均有表达，其中第二、三天的Cre酶含量最高，第三、四天的含量较低，第一天的cre酶分子量明显小于其它四天所表达，分析其可能为表达不完全的Cre酶。因此，利用Cre酶瞬间表达删除山羊体细胞内抗性筛选基因无法获得所需的结果。

实施例13抗性基因删除细胞的体细胞核移植

1.卵母细胞制备与受体羊的同步

挑选出作为卵母细胞供体的母羊肌注PG 0.1mg/头，间隔10～14天后注射第二次PG，在第二次注射PG 10～13天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，分6次，2次/日，用量为每天100IU，80IU。在最后一次注射FSH的同时，注射一次PG(0.1mg/头)，间隔24小时后时注射LRH，25μg/次，注射LRH后26～28小时回收卵母细胞。

为与提供卵母细胞的供体羊同步，受体羊间隔9～11天分两次肌肉注射PG，在供体羊超排注射PG后24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量同供体。

手术暴露输卵管，用F-10营养液冲卵、体视镜下检卵。透明质酸酶消化颗粒细胞，M16洗4～5次，置M16方杯中培养，备用。

2.供核细胞的饥饿处理

把待饥饿的GEF-BLG-neo 98细胞接种于35mm平皿内。待细胞丰度达70％～75％左右时，吸去培养液，加入含0.5％FCS的DMEM液，饥饿5天后，常规法消化收集细胞。然后放于-85℃冰箱内保存。在核移植实验前6天，取出2小管复苏并接种于4孔板内。再培养2天或3天后饥饿，饥饿方法同前。

3.重构卵的制备与激活

卵母细胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗涤3次，在M16-Hepes(含7.5μg/ml CB)中处理10min；同时将培养的细胞用胰酶消化、分散成单个细胞。将卵母细胞与供核体细胞同时移入置于灭菌玻片上的1ml M16-Hepes(含CB)中，在显微镜下去核并吸入供核细胞，将之从原来的切口注射到卵周隙内，使其紧贴于胞质膜，采用电刺激的方法进行融合，融合基质为含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化钙、0.1mM硫酸镁、0.5％BSA的溶液，融合条件为DC600-610v/cm，脉冲持续时间80μs，连续刺激3次。融合后的胚胎于M16中培养5小时后，在含5μM离子霉素(ionomycin)、7.5μg/ml CB的M16液中处理5min，再在含2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5μg/ml CB的M16液中处理5小时后移到M16培养液中培养，待包埋或移植。

4.重构卵的包埋、回收与发育胚胎的移植

用1％的Agarose包埋重构卵，并移植入输卵管内，体内培养5天后将胶条冲出，将胶条内的胚胎剥离出来，选择发育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受体羊子宫内。移植后的受体在胚胎发育至1～2月龄时用B超进行妊娠检查，出现孕囊的判定为怀孕，妊娠足月分娩。

最终结果如表2。

表2

最终获得的2头克隆羊，命名为NF1，NF2，见图16。

实施例14 NF1，NF2山羊的基因型鉴定

取NF1克隆山羊的耳尖组织，原代培养获得耳成纤维细胞，G418敏感性实验同实施例11。G418敏感性实验发现NF1山羊不含有neo，为抗性基因删除的细胞。

基因组DNA的PCR同实施例3，结果见图17。PCR结果表明NF1，NF2山羊不含有抗性基因。

根据基因组步移试剂盒说明设计neo，tk两侧的特异性引物sp1，sp2，sp3，tp1，tp2，tp3扩增出neo外侧序列，与tk外侧序列，引物与neo，tk外侧序列如下：

Sp3：5’-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAG-3’(SEQ ID NO：10)；

sp2：5’-TGCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3’(SEQ ID NO：11)；

sp1：5’-TTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTT-3’(SEQ ID NO：12)；

tp1：5’-GTTTACGGGCTACTTGCCAATACG-3’(SEQ ID NO：13)；

tp2：5’-CCTCCGTTCCATGCACGTCTTTAT-3’(SEQ ID NO：14)；

tp3：5’-GACGCCCTGCTGCAACTTACCT-3’(SEQ ID NO：15)。

neo外侧序列见SEQ ID NO：16；tk外侧序列见SEQ ID NO：17。

根据这些序列设计引物neoR(5-TAGGTCACGAAGCACAGGCACGAA-3)和tkL(5-TGTCAGCATCTCCCCTCTGCCAAA-3)鉴定NF1、NF2，得到0.7kb片段(图17)，对NF1片段进行测序，测序结果证明原抗性基因整合位点仅仅保留一个loxP位点，NF1，NF2山羊为抗性基因删除的细胞。

删除后保留的loxp位点序列见以下序列(SEQ ID NO：18)中黑斜体部分。

GTCCTGGGCCTGTAAGTGCAGAAGCAAGAAATCACTTCTCTCAGAATGAAACTGTGGGGCTGGGCAGGGTCAGTGGGCATTCACACAGTCTAGGATGCCGTGCTGCTTGGGGCCCCCACCCTGGCCCCAGGAAGCCGGTATGAGTCTCACTGGTCGGTGCTGTGTGCCCCCACACATGTCTAATAAAAGGGACAACCCAGAAGAAATGGATACATTCCTAGACATGTACAAACCCAAGACTGAGCCAGGAAGAAATAGAAAATATGGACAGACCAGTTACCAGTAATGAAATTGAATCAATAATTTTTAAACAATTCCCTCAAAAGCAGTCCAGGACCAGAGGGCTTCACAGCTGTATCTACCGAACTTCTTTTTCTGGTTGTGCTAGGACTTCATTGCCGTCTGTGGGACGGCCAGCTCCCATTAGCTTGGCTGGACGTAAACTCCTCTTCAGACCTAGGAAGGGAACTAATTTATCAGGAGCATGCTTTATCAGTACACTGTATGACAAGACCTCCTTTAAGCCTTACAAAAGAGTCTTTCATATATGATGCCCACCTAGCTAACTGGTTAGGAACCATGAGGCTCAGTGAGGTTAGGTGGCTTGCCTGAGATCTCTTGGCTGAAGAAAGGTGGTGCCTCATTACATTAAAACCCAGAACGTGACATCGATCCTCTGATTTTTGGTTCGGGCCTGTGCTCAATGCCCAAAA

经验证，删除了抗性基因的溶菌酶转基因山羊乳汁中无抗性筛选蛋白Neo和TK表达，且含有的溶菌酶比BLG1和BLG2有显著的提高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海杰隆生物工程股份有限公司；上海转基因研究中心

<120>利用家畜乳腺高效生产人溶菌酶

<130>080356

<160>

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

cggccggggg tctgctcc                                                                   18

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

ctcgagggct gcagctgggg tcac                                                            24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

tacatttgag gacctggcag agc                                                             23

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tcctaccact ttgggaggct ga                                                              22

<210>5

<211>6304

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>融合基因

<400>5

cggccggggg tctgctcccg tgggtgggct ctttctggta cagtcaccaa cagtctctcc                    60

gggaaggaaa ccagaggcca gagagcaagc cagagctagt ctaggagatc cctgagcctc     120

cacccaagat gccgaccagg ccagcgggcc ccctggaaag accctacagt ctaggggggg     180

aacaggagcc gacccgccag gcccccgcta tcaggagaca ccccaacctt gctcctgttc     240

ccctacccca gtacgcccac ccgacccctg agatgagtgg tttacttgct tagaatgtca     300

attgaaggct tttgtacccc ctttgccagt ggcacagggc acccacagcc cgctgggtac     360

tgatgcccat gtggactcag ccaggaggac tgtcctgcgc cctccctgct cgggccccct     420

ccatactcag cgacacaccc agcaccagca ttcccaccac tcctgaggtc tgaaggcagc     480

tcgctgtggt ctgagcggtg cggagggaag tgccctggga gatttaaaat gtgagaggtg     540

ggaggtggga ggttgggtcc tgtaggcctt cccatcccac gtgcctgcac ggagccctag     600

tgctactcag tcatgccccc gcagcagggg tcaggtcact ttcccatcct gggggttatt     660

atgactgttg tcattgttgt tgccattttt gctaccctaa ctgggcagcg ggtgcttgca     720

gagccctcga tactgaccag gttcccccct cggagctcga cctgaacccc atgtcaccct     780

cgccccagcc tgcagagggt ggggtgactg cagagatccc tttacccaag gccacagtca     840

catggtttgg aggagatggt gcccaaggca gaagccaccc tccaggacac acctgccccc     900

agtgctggct ctgacctgtc cttgtctaag aggctgaccc cagaagtgtt cctggcgctg     960

gcagccagcc tggacccaga gcctggacac cccctgcgcc cccacttctg gggcgtacca    1020

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aggggaatca gcctagcaaa ctgtaagtct actctccata attccagaga attagctacg    1440

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ttatttcttt gtgggtttgt atacttacaa tggctaaaaa catcagtttg gttctttata    1560

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ttctgagtag ctgtgactac aggtgtgtac caccacaccc agctaatttt ttgtattttc    2040

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ttcaagatgt gccatgagga aaagttattt tatagtttag tacatagttg tcgatgtaat    2400

aatctctgta gttttcagat tgaattcaga catttcccct caatagctat ttttgaatga    2460

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aacttccaga aagtcattat tattttcctc ataattccct gagtaagaaa tttaaagaag    3300

tggtatcata aaaggttgat gttttttaat atacagaagt ttctggaatg acctattaat    3360

ttactgtcaa tggccttact gatgctttgt ccagaacaat gccattgctc ctgcttactt    3420

tggggaggtt ttgggataat ttagttgtat ggtccttttt caattgtttt actttttttt    3480

ttatgaaatg ttctaaatgt atagaaaatt agagacatta gtataataaa cagccatatg    3540

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aatgttaaat tatatcatac acatataaac ccacatacaa acatgtaaat actgtgtgct  4440

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tgaatattct ataatttact gatccaattg ttactattga gcacttaggt tgtttccatt  4680

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gactttggta aatgaagaaa aaaatgcttc atttcatgct gaatgggaga gaatgaagag  4920

agttttcccc aacaattaca catatatgga ctcatagaaa ataatatctt accattcttt  4980

ccacagccta acagaaaaaa gctggctaaa cctaaattta aaataaaata tctattaaag  5040

tttttattcc ttaccacctg tctttcagct ttgctgcaag ataacatcgc tgatgctgta  5100

gcttgtgcaa agagggttgt ccgtgatcca caaggcatta gagcatggta tgttttaagt  5160

gttaaaaggg aaaactatct tactctactg ttgatatata caatgagagc agacttttaa  5220

agaccaaagt atgctaatga cacctcaaaa ttgcagcttt tggcttatgc taaatgatgt  5280

attacctaca tccttgaaga aacaatctac tttaactgat ccagaatctt actcttttac  5340

tcctcaattt attttagggg atttctagag ttttaagatg cttcacactc tatcagttcc  5400

ttgtcatatc ttgaaattct ttttagaata agtaagtgtg ggccgggcac agtgctcacg  5460

cctgtaatcc cagcactttg ggagaccgag gcagatggat cacctgaggt caggagttcg  5520

agaccagcct gcctaacatg gcaaaacccc atctccacta aaaatacaaa aaattagctg  5580

ggtgtggtgc aggtgcctgt aatcccagcc actcgggagg ctgaggcagg agacttgctt  5640

gaacccggga ggtggaggtt gcagaggatt gcgccattgt acttcagcct gggcgacaga  5700

gtgagactct gtctcaaata aatagcataa aaaataaacg tggaattcac tttgcagttg  5760

ctgctgtaca acgcacatta ctcaatcttt atgttcggca ttctatgctc tactgagaaa  5820

tttgggtagg agtgaagtat tttgtataca tatcttcatt taataaatag caatagctgg  5880

gtctatctta ctattttatc tattgataaa atattttgtt tccccaagga gtgcgaagta  5940

tgtatattac aatgaagata tgttttaacc tttcaccatt tgcttcatct ttttctacag  6000

ggtggcatgg agaaatcgtt gtcaaaacag agatgtccgt cagtatgttc aaggttgtgg  6060

agtgtaactc gagtagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat  6120

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc  6180

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg  6240

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg  6300

ggga                                                               6304

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gctcctgccg agaaagtatc ca                                              22

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ccagcacccgccagtaagtc                                                                    20

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

tctgcgttcg accaggct                                                                     18

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

cggtcgatgtgtctgtcctcc                                                                   21

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

gattgtctgt tgtgcccagt catag                                                             25

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

tgcctcgtcc tgcagttcat tc                                                                22

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

ttcgcccaat agcagccagt ccctt                                       25

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

gtttacgggc tacttgccaa tacg                                         24

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

cctccgttcc atgcacgtct ttat                                          24

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

gacgccctgc tgcaacttac ct                                            22

<210>16

<211>700

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg   60

cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat  120

cttgttcaat ggccgatccc atattggctg cagggtcgct cggtgttcga ggccacacgc  180

gtcaccttaa tatgcgaagt ggacctggga ccgcgccgcc ccgactgcat ctgcgtgttc  240

gaattcgcca atgacaagac gctgggcggg gtttgctcga cattgggtgg aaacattcca  300

ggcctgggtg gagaggcttt ttgcttcctc ttgcaaaacc acactgctcg acattgggtg  360

gaaacattcc aggcctgggt ggagaggctt tttgcttcct cttgaaaacc acactgctcg  420

acctgcagcc aagctagctt ggctggacgt aaactcctct tcagacctaa taacttcgta  480

tagcatacat tatacgaaag gtgggaaggg aactaattta tcaggagcat gctttatcag  540

tacactgtat gacaagacct cctttaagcc ttacaaaaga gtctttcata tatgatgccc  600

acctagctaa ctggttagga accatgaggc tcagtgaggt taggtggctt gcctgagatc  660

tcttggctgg tgaagggtgg tgccagatta gattaaaacc                        700

<210>17

<211>877

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

cgacgatatg cgacctggcg cgcacgtttg cccgggagat gggggaggct aactgaaaca   60

cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag acagaataaa  120

gacgtgcatg gaacggaggt gtgtttttgc aggcggtcat cattccccgg gcagggactc  180

cggcgatacc acatcgagac cccagtgggg ccgttacccc cgcgtttcat ccttttgccc  240

accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg gggcggcagg  300

ccctgccata gccactggcc ccgtgggtta gggacggggt cccccatggg gaatggttta  360

tggttcgtgg gggttattat tttgggcgtt gcgtggggtc aggtccacga cccaagctgc  420

ctcgaggaat tccgatcata ttcaataacc cttaatataa cttcgtataa tgtatgttat  480

acgaagttat taggtctgaa gaggagttta cgtccagcca agctaatggg agctggccgt  540

cccacagacg gcaatgaagt cctagcacaa ccagaaaaag aagttcggta gatacagctg  600

tgaagccctc tggtcctgga ctgcttttga gggaattgtt taaaaattat tgattcaatt  660

tcattactgg taactggtct gtccatattt tctatttctt cctggctcag tcttgggttt  720

gtacatgtct aggaatgtat ccatttcttc tgggttgtcc cttttattag acatgtgtgg  780

gggcacacag caccgaccag tgagactcat accggcttcc tggggccagg gtgggggccc  840

caagcaacac ggcatcctag actgtgtgaa tgcccac                           877

<210>18

<211>747

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gtcctgggcc tgtaagtgca gaagcaagaa atcacttctc tcagaatgaa actgtggggc  60

tgggcagggt cagtgggcat tcacacagtc taggatgccg tgctgcttgg ggcccccacc  120

ctggccccag gaagccggta tgagtctcac tggtcggtgc tgtgtgcccc cacacatgtc  180

taataaaagg gacaacccag aagaaatgga tacattccta gacatgtaca aacccaagac  240

tgagccagga agaaatagaa aatatggaca gaccagttac cagtaatgaa attgaatcaa  300

taatttttaa acaattccct caaaagcagt ccaggaccag agggcttcac agctgtatct  360

accgaacttc tttttctggt tgtgctagga cttcattgcc gtctgtggga cggccagctc  420

ccattagctt ggctggacgt aaactcctct tcagacctaa taacttcgta tagcatacat  480

tatacaaaag gtgggaaggg aactaattta tcaggagcat gctttatcag tacactgtat  540

gacaagacct cctttaagcc ttacaaaaga gtctttcata tatgatgccc acctagctaa  600

ctggttagga accatgaggc tcagtgaggt taggtggctt gcctgagatc tcttggctga  660

agaaaggtgg tgcctcatta cattaaaacc cagaacgtga catcgatcct ctgatttttg  720

gttcgggcct gtgctcaatg cccaaaa                                      747

<210>19

<211>8

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒

<400>19

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

1               5

Claims (6)

1.一种制备转基因动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将一融合基因转染体细胞，获得基因组中整合有融合基因的转基因细胞，其中所述的融合基因从5’至3’依次包含以下可操作性相连的元件：

牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列，人溶菌酶基因，和牛生长激素基因3’侧翼序列，

并且，所述的人溶菌酶基因选自：

(a)具有SEQ ID NO：5中1267-6067位的核苷酸序列；或

(b)与(a)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

所述的牛β-乳球蛋白基因的5’侧翼序列选自：

(a1)具有SEQ ID NO：5中1-1260位的核苷酸序列；或

(b1)与(a1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

所述的牛生长激素基因3’侧翼序列选自：

(a2)具有SEQ ID NO：5中6074-6304位的核苷酸序列；或

(b2)与(a2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

并且，在步骤(a)中，在将所述的融合基因转染体细胞的同时，还包括：将一用于抗性筛选的基因转染体细胞，获得基因组中整合有所述融合基因以及抗性标记基因的转基因细胞；

并且，所述的用于抗性筛选的基因从5’至3’依次包含以下元件：Loxp，新霉素抗性基因，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，Loxp；

(b)将所获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，获得可高产人溶菌酶的动物；

并且在步骤(a)与(b)之间，还包括步骤：

(a1)用细胞穿透型Cre重组酶处理所述的转基因细胞，从而获得删除了所述抗性标记基因的转基因细胞；

其中，所述的细胞穿透型Cre重组酶是：细胞穿透肽和Cre重组酶的融合蛋白；

所述的动物是山羊,并且所述方法还包括步骤：对所述转基因山羊进行基因型鉴定，从而获得不含有抗性基因新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因tk的转基因动物，

鉴定方法包括：取所述山羊的耳尖组织，原代培养获得耳成纤维细胞，通过G418敏感性实验鉴定是否不含新霉素抗性基因neo;以及进行基因组DNA的PCR，从而鉴定是否不含抗性基因新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因tk。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞穿透型Cre重组酶是反式激活蛋白与Cre重组酶的融合蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的细胞穿透型Cre重组酶从N端至C端依次为TAT和Cre重组酶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的细胞为动物胎儿成纤维细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的基因组DNA的PCR中，使用neo，tk两侧的特异性引物sp1，sp2，sp3，tp1，tp2，和tp3，序列如下：

Sp3:5’-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAG-3’(SEQ ID NO:10)；

sp2:5’-TGCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3’(SEQ ID NO:11)；

sp1:5’-TTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTT-3’(SEQ ID NO:12)；

tp1:5’-GTTTACGGGCTACTTGCCAATACG-3’(SEQ ID NO:13)；

tp2:5’-CCTCCGTTCCATGCACGTCTTTAT-3’(SEQ ID NO:14)；

tp3:5’-GACGCCCTGCTGCAACTTACCT-3’(SEQ ID NO:15)；

并且，在所述的基因组DNA的PCR中,使用引物neoR：5-TAGGTCACGAAGCACAGGCACGAA-3和tkL：5-TGTCAGCATCTCCCCTCTGCCAAA-3，扩增得到0.7kb片段，并对所述片段进行测序鉴定。

6.一种生产人溶菌酶的方法，其特征在于，它包括步骤：

培养用权利要求1-5任一所述方法制得的转基因动物，并且所述动物为山羊；

从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出表达的人溶菌酶。

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