CN101855352A - 乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和利用其产生人促红细胞生成素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供乳腺特异性人促红细胞生成素(hEPO)表达载体、转基因动物和使用它们产生人促红细胞生成素的方法。本发明的表达hEPO的转基因动物与常规方法相比以高得多的浓度表达乳腺特异性EPO。本发明的转基因动物产生的hEPO与商品化的同类蛋白质相比显示出更好的稳定性和更优越的生理学活性。因此，本发明的表达hEPO的转基因动物可有效地用于产生比现有EPO显示出更优越生理学活性的EPO。

Description

乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和利用其产生人促红细胞生成素的方法

技术领域

本发明涉及乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和使用它们产生人促红细胞生成素的方法。

背景技术

促红细胞生成素(EPO)是人类红系造血的主要调节物，其是一种糖蛋白激素，在肾脏内合成，肝脏也合成少量。

EPO的分子量约为34000至38000道尔顿，在天冬酰胺24、38、和83具有3个N-连接的糖，在丝氨酸126具有一个O-连接的糖。

由于EPO对于生成红细胞是不可或缺的，因此已经在合成生产EPO，用于某些类型的贫血患者——例如肾衰引起的贫血、继发于AZT治疗AIDS的贫血和癌症相关性贫血。

由于EPO是一种治疗剂，因此一直寻求通过重组DNA技术在哺乳动物细胞培养物中实现大量生产。采用细胞培养技术大规模生产EPO需要较高的生产成本和更多的专业知识。

此外，由于不能将新产生的EPO与培养基中所含的动物EPO完全分离，因此最终产生的EPO的纯度和活性较低，结果造成采用上述方法的EPO(hEPO)与天然EPO蛋白相比由于糖基化不同而具有较低的生理学活性。

反之，使用转基因动物在体液中生产重组蛋白质的吸引力在于，与常规细胞培养技术相比，分离和纯化靶蛋白的方法更加简单，且靶蛋白具有更好的长期活性。

迄今为止，靶蛋白在转基因动物的乳腺组织中的表达水平比其他组织中更高。

不过，根据目前的报道，使用乳腺特异性启动子的转基因动物的蛋白质生产效率仍旧处于很低的水平。此外，已经报道了通过乳腺特异性载体进行基因异位表达。

韩国待审申请公开文本No.2001-81456公开了由小鼠乳腺分离的WAP启动子、含有hEPO基因组基因的EPO转基因表达载体和转基因猪。

韩国待审申请公开文本No.10-2004-101793公开了乳腺中表达hEPO的转基因克隆牛，其使用的是牛β酪蛋白启动子。

尽管如此，这些转基因动物中的hEPO仍未实现商品化，也没有任何有关乳中hEPO浓度及其活性的结果的记载。

为了实现本发明，本发明人构建了可高效表达乳腺特异性hEPO的载体，由此使得含有该表达载体的转基因动物能够产生具有更高生理学活性的hEPO。

发明内容

本发明的一个目的是提供可表达乳腺特异性hEPO蛋白的载体。

本发明的另一个目的是提供插入该载体的转基因动物体细胞。

本发明的另一个目的是提供插入该载体的转基因动物。

本发明的另一个目的是提供使用该载体生产转基因动物的方法。

本发明的另一个目的是提供在转基因动物中生产hEPO的方法。

技术方案

在一个实施方式中，本发明提供载体，其表达乳腺特异性hEPO蛋白。

在另一个实施方式中，本发明提供pBC1-hEPO-WPRE载体，其具有被鉴定为是编码β酪蛋白启动子(其是乳腺特异性启动子)的序列的DNA序列；位于所述启动子3′-端的编码hEPO的DNA序列；和编码WPRE的DNA序列。

根据本发明的pBC1-hEPO-WPRE载体，所述编码hEPO的DNA序列可以具有，但不限于，SEQ ID NO：1所示的序列。

根据本发明的pBC1-hEPO-WPRE载体，所述编码β酪蛋白启动子的DNA序列可以具有，但不限于，SEQ ID NO：2所示的序列。

根据本发明的pBC1-hEPO-WPRE载体，所述编码WPRE的DNA序列可以具有，但不限于，SEQ ID NO：3所示的序列。

根据本发明，前述编码β酪蛋白启动子、hEPO和WPRE的DNA序列包括它们的等价物，所述等价物在前述DNA序列中具有一或多个缺失、取代或添加。

更具体地，本发明通过将hEPO基因(SEQ ID NO：1)插入含有山羊β酪蛋白启动子的pBC1表达载体中而提供pBC1-hEPO表达载体，pBC1-hEPO表达载体可表达乳腺特异性EPO。

必要时，本发明的表达载体pBC1-hEPO可额外含有绝缘子(insulator)，WPRE(旱獭肝炎病毒转录后调控元件)或新霉素抗性基因，这样可更易于构建转基因细胞系，使得靶蛋白的表达量最大化，并保证表达水平的稳定性。

绝缘子这一因子不仅促进与启动子邻近的调节物的作用，也有助于位置非依赖性表达(position-independent expression)。其允许在β酪蛋白启动子的调节下稳定地表达靶蛋白。

WPRE这一调节物通过促进mRNA的稳定化而提高靶蛋白的合成。其允许在β酪蛋白启动子的调节下大量表达靶蛋白。WPRE具有SEQ IDNO：3所示的碱基序列。

新霉素抗性基因对建立细胞系所用的G418试剂显示出抗性。其在建立动物细胞系过程中能够作为有效的选择标记，所述细胞系在β酪蛋白启动子的调节下表达靶蛋白。新霉素抗性基因具有SEQ ID NO：4所示的碱基序列。

本发明提供1)含有WPRE的pBC1-hEPO-WPRE载体；和2)pBC1/hEPO/NEO载体，作为额外含有这些调节物的表达载体的优选实例，其中pBC1-hEPO-WPRE载体含有新霉素抗性基因。

通过将WPRE插入至本发明pBC1-hEPO载体内的EPO基因的3’端，然后将新霉素抗性基因插入pBC1-hEPO-WPRE载体，以产生这些载体。

本发明的表达载体pBC1/hEPO/NEO于2007年7月26日保藏于韩国生命工学研究院生物学资源中心(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology Biology Resource Center)，保藏号为KCTC 11159BP。

必要时，本发明的表达载体可含有其他调节物，例如启动子、增强子选择标记基因、非翻译区(5′-UTR)、3′-UTR、聚腺苷酸化信号、核糖体结合序列、可被插入至基因组特定位置内的碱基序列、或其位置上的内含子。

利用所述表达载体，本发明还提供转基因体细胞。

在本发明的一个实施方式中，转基因猪的体细胞于2007年7月26日保藏于韩国生命工学研究院生物学资源中心，保藏号为KCTC 11160BP。

在另一个实施方式中，本发明提供通过将使用所述表达载体产生的转基因体细胞的核移植至去核卵而收集的受精卵。

本发明还提供使用所述表达载体的转基因动物。

可使用本发明的表达载体转化哺乳动物(例如猪、小鼠、牛、山羊、绵羊、马和狗)。

使用本发明的表达载体产生转基因动物的方法基于常规的方法。

例如，如果打算将小鼠用作转基因动物，则按照如下方法产生这样的动物：

自健康小鼠收集受精卵，将本发明的表达载体引入该受精卵。然后，使用输精管结扎小鼠获得假孕小鼠，并将所述受精卵植入作为代孕母鼠的假孕小鼠的输卵管。然后从代孕母鼠的后代中筛选转基因动物。

如果打算使用猪做转基因动物，收集健康母猪的卵泡卵母细胞并培养于体外成熟化培养基中。将本发明的表达载体插入所收集并培养的供者体细胞，选择插入了载体的体细胞进行培养。从体外成熟化的卵细胞中取出核并以供者细胞填补该空间，随后以电融合方式将供者细胞与卵细胞的细胞质融合，完成核移植用于体外培养。将分裂的受精卵植入超排卵诱导的受孕猪后，自转基因小猪选择后代。

随后，从转基因猪收集合适量的乳以分离和纯化靶蛋白，用于产生有用的蛋白质(A.Gokana，J.J.Winchenn，A.Ben-Ghanem，A.Ahaded，J.P.Cartron，P.Lambin(1997)Chromatographic separation of recombinant humanerythropoietin isoforms，Journal of chromatography，791，109-118)。

在另一个实施方式中，本发明提供hEPO的生产方法，其包括分离和纯化表达于转基因动物的乳中的EPO的方法。

可采用常规的方法来分离和纯化hEPO，包括过滤法或层析法。

本发明的转基因动物与常规方法相比可以高得多的浓度表达乳腺特异性EPO。具体地，这些动物在哺乳期间在腺泡细胞内表达靶蛋白。

例如，通过本发明的表达载体pBC1/hEPO/NEO产生的转基因小鼠显示出200,000-400,000IU/mL的高EPO表达水平。尽管由于胚胎早期死亡导致不容易表达EPO，但本发明的转基因动物的EPO的表达水平可达到使用现有的乳腺特异性启动子的转基因动物的乳中EPO的表达水平1000倍以上。

此外，本发明的转基因动物产生的EPO与商品化的同类蛋白质相比显示出更好的稳定性和更优越的生理学活性。

例如，以本发明的表达载体pBC1/hEPO/NEO转化的小鼠所产生的EPO含有大量唾液酸，并通过作用于红细胞前体而显示出更优越的蛋白质活性。

此外，施用本发明的转基因动物产生的EPO可提高血液中血小板、红细胞、血红蛋白和血细胞比容等的水平。

因此，本发明的表达EPO的载体和转基因动物可有效用于产生与现有EPO相比显示出更优越生理学活性的EPO。

附图说明

图1显示了本发明的pBC1/hEPO/NEO表达载体的结构。

图2显示了本发明的pBC1/hEPO/NEO表达载体的结构。

图3显示的PCR结果证实了图2的pBC1/hEPO/NEO表达载体的结构元件。

图4显示了参与乳腺、肝脏和CHO细胞的糖基化过程的小鼠基因的表达水平。

图5显示了以本发明的hEPO表达载体转化的小鼠内的hEPO表达水平。

图6显示了本发明的转基因小鼠的乳腺内的hEPO表达水平。

图7是本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO的分析结果。

图8显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO和肾衰患者血清的二维电泳凝胶。

图9显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO，包括重组人促红细胞生成素α的寡糖分析结果。

图10显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO的体外活性测定。

图11显示了本发明的转基因小鼠的乳中产生的hEPO的体内活性测定。

实施本发明的最佳方式

参照以下实施例来描述本发明，这些实施例仅是示例性的，其不能被理解为是对本发明的范围加以限制。

实施例1：产生表达本发明的乳腺特异性hEPO的优化载体

根据本发明产生了在乳腺中分泌hEPO的优化载体。

1)产生pBC1-hEPO载体

为了产生本发明的乳腺特异性表达载体，使用具有山羊β酪蛋白启动子的pBC1(Invitrogen)，在其限制性酶XhoI位置克隆hEPO基因组DNA(SEQ ID NO：1)。

2)产生pBC1-hEPO-WPRE载体

为了增加hEPO的表达量，将WPRE(旱獭肝炎病毒转录后调控元件)基因插入pBC1-hEPO载体。已经发现WPRE作为调控物发挥作用，以确保mRNA更加稳定并最终合成更多的蛋白质。

为了确保EPO和mRNA能够同时转录，将WPRE连接于hEPO的直接后方，然后将调控物插入pBC1-hEPO载体的XhoI限制性酶切位点。

通过使用正向引物5′-ACCAGGTTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC-3′(SEQ ID NO：5)和反向引物5′-CTCGAGGAGCCCGAGGCGAAACAGGCG-3′(SEQ ID NO：6)从肝炎病毒扩增出0.6kb的PCR(聚合酶链反应)产物而获得WPRE，然后将其克隆到pGEM T-easy载体内。使用限制性酶(SalI，XhoI)切割所述0.6kb的WPRE以便为插入位点做准备。将以Xho1切割的pBC1-hEPO连接于预先构建的载体以产生pBC1-hEPO-WPRE载体(23975bp)。

3)产生pBC1/hEPO/NEO载体

为了高效选择含有能够在乳腺特异性β酪蛋白启动子调节下最大化产生hEPO的载体的细胞，克隆了新霉素抗性基因。

新霉素抗性基因可抵抗G418，通过使用正向引物5′-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3′(SEQ ID NO：7)和反向引物5′-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3′(SEQ ID NO：8)从pEGFP-N1载体(Clontech，Catalog#6085-1)扩增出1.9kb的PCR产物而获得该基因，然后将其克隆入pGEM T-easy载体。

使用限制性酶(NotI，PvuI)切割克隆入T-载体的1.9kb的新霉素抗性基因，以便为插入位点做准备。此外，以限制性酶(NotI，PvuI)切割pBC1-hEPO-WPRE载体的氨苄青霉素抗性基因位点，以便为载体位点做准备。

通过连接上述插入片段和载体位点，将WPRE和新霉素抗性基因插入pBC1-hEPO载体，产生pBC1/hEPO/NEO载体。

图1显示了如此获得的本发明的表达载体的结构。最终在乳腺特异性启动子即β酪蛋白启动子的调节下表达hEPO。

通过使用pBC1-5′+WPRE-R引物对和hEPO3+WPRE-R引物对进行PCR获得的3kb和1.5kb的PCR产物，本发明人等已证实准确产生了pBC1/hEPO/NEO载体(图2和3)。

本发明的表达载体pBC1/hEPO/NEO于2007年7月26日保藏于韩国生命工学研究院，保藏号为KCTC 11159BP。

随着WPRE调控物的引入，可以使用表达载体pBC1/hEPO/NEO以使得EPO的表达水平最大化。此外，在建立动物细胞系的过程中，新霉素抗性基因可用作高效的选择标记。

实施例2：产生表达hEPO的转基因动物并分析所表达的hEPO

进行以下实验确认本发明的表达乳腺特异性hEPO的转基因小鼠所表达的hEPO的生理学活性和稳定性谱。

1)参与小鼠乳腺内糖基化的基因的表达谱分析

已经发现糖基化作为翻译后修饰的一部分在增强蛋白质功能方面发挥主要作用。在原核生物(包括大肠杆菌)、酵母、动物细胞和小鼠中发现了不同的糖基化表达谱。

经历过与人类类似的演化阶段的实验动物所产生的糖基化程度被认为与人体内的情况类似。因此，在体内研究中鉴定了小鼠的乳腺和肝脏以及CHO细胞系中参与重组hEPO糖基化的糖基转移酶的表达(图4)，其中CHO细胞系已经被有效用于产生EPO。

首先，在分离到来自小鼠体内的乳腺、肝脏和CHO细胞系的总RNA之后，使用3种糖基转移酶(GnT-V、GnT-III和Fuc-TIV)的引物对(表1)进行RT-PCR(反转录酶-聚合酶链反应)。

表1

分类	引物序列	SEQ ID NO
			小鼠GnT-V正向引物	5′-CACTGTTAATTCGCCCACCT-3′	9
小鼠GnT-V反向引物	5′-GCTTGGTCCTCCTGACTCTG-3′	10
			CHO GnT-V正向引物	5′-GTACAGAGTGACCTGCCAAA-3′	11
CHO GnT-V反向引物	5′-GTCTITGCATAGGGCCACTT-3′	12

分类	引物序列	SEQ ID NO
			小鼠GnT-III正向引物	5′-GCTCAGGCCTCTAGTAATCT-3′	13
小鼠GnT-III反向引物	5′-TCCTGACCCCTAACCTACTC-3′	14
			CHO GnT-III正向引物	5′-GCATCTACTTCAARCTCGTG-3′	15
CHO GnT-III反向引物	5′-GTGCTCRTGGGCTCCCGGTA-3′	16
			小鼠和CHO Fuc-TIV正向引物	5′-CACACDGTGGCCCGCTACAA-3′	17
小鼠和CHO Fuc-TIV反向引物	5′-TCCCAGAARGARGTGATGTG-3′	18

如图4所示，测试结果表明，相比于肝脏和CHO细胞系，两种糖基转移酶(GnT-III和GnT-V)在乳腺中高度表达。

在Fuc-T中也检测到相同的趋势，其在乳腺中的表达高于CHO细胞系。这证明，就生理学活性而言，来自乳腺的重组hEPO优于现有的CHO细胞系的EPO产物。

2)产生转基因小鼠

在实施例1所构建的乳腺特异性β酪蛋白启动子的调节下，使用23kb的表达EPO(Macrogen Co.韩国)的pBC1/hEPO/NEO表达载体(图1)通过显微注射的方式产生了转基因小鼠。

我们使用了转基因小鼠BDF1(C587BL/6DBA)。将pBC1/hEPO/NEO注射至738个受精卵后，700个卵被转移至30只代孕母鼠内。通过PCR和基因组Southern印迹法(表2和图5B)从数周后出生的总共85只存活小鼠中鉴定到9只转基因小鼠。

使用正向引物(5′-CTCCTTGGCAGAAGGAAGCC-3′；SEQ ID NO：19)和反向引物(5′-CAGCCATGGAAAGGACGTCA-3′；SEQ ID NO：20)进行PCR来核实TG。所得PCR产物大小估计为600bp。

使用hEPO基因组DNA作为探针(包括SEQ ID NO：1在内的整个2.3kb基因)进行Southern印迹。

图5B显示了PCR和Southern印迹的结果，包括鉴定到EPO基因的品系6和品系37，它们是表达乳腺特异性EPO的转基因小鼠内的两个代表性品系。基于图5B的结果，注意到10至30个拷贝的EPO基因被插入至染色体内，并通过生殖细胞而遗传至下一代中。

表2

小鼠品系	注射胚胎数量	转移胚胎数量	受者数量	出生小鼠数量	转基因小鼠数量(％)
						BDF1(C57BL/6x DBA)	738	700	30	85	9(10.6)

3)鉴定转基因小鼠内的乳腺特异性EPO

我们鉴定了本发明的转基因小鼠是否能够表达乳腺特异性EPO基因。

从品系6和37的转基因小鼠的各种组织如乳腺、脑、肾脏、心脏、脾脏、肝脏、子宫和肺提取RNA。然后采用本领域已知的常规方法进行RT-PCR和Northern印迹分析。

为了检测EPO cDNA，使用hEPO-特异性正向引物(SEQ ID NO：21)和hEPO-特异性反向引物(SEQ ID NO：22)进行RT-PCR反应。

5′-GTAGAAGTCTGGCAGGGCCT-3′(SEQ ID NO：21)

5′-TCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3′(SEQ ID NO：22)

使用EPO全基因组DNA作为2.3kb的探针进行Northern印迹分析，该探针与Southern印迹分析所使用的探针相同。

如图5C所示，RT-PCR的结果显示在乳腺观察到更高的EPO水平，而肾脏的水平极低。如图5D所示，Northern印迹分析发现，EPO基因特异性表达于乳腺，而在其他任何组织中均未观察到(在该图中，B：脑，H：心脏，S：脾脏，L：肝脏，U：子宫和Lu：肺)。

为了检测EPO蛋白的表达和表达的细胞，使用抗人抗体(AB-286-NA，R&D system)作为EPO抗体在转基因动物的各种组织上进行免疫组化(图6)。在妊娠第16天的对照小鼠的乳腺中没有检测到EPO水平，如图6A所示。与此不同的是，在妊娠第16天的转基因小鼠(图6B)和分娩后5天的转基因小鼠(图6C)的乳腺腺泡细胞中能够检测到EPO水平。在分娩后16天(图6D)，在退化的乳腺腺泡细胞中没有检测到EPO的表达水平。

如图6所示，在本发明的hEPO转基因小鼠哺乳期乳腺腺泡细胞内特异性检测到了EPO水平。

4)EPO水平和稳定性谱的分析

为了研究转基因小鼠乳腺的乳中所含的EPO水平，使用抗人抗体(AB-286-NA，R&D system)作为EPO抗体进行常规的免疫印迹方法，如图7所示。

图7A是在转基因小鼠的乳上的免疫印迹的结果；泳道1和2代表阳性对照的GST-标记的EPO抗体(5ng和10ng)；泳道3代表对照小鼠组的乳；泳道4和5分别代表品系6和37的各转基因小鼠的乳内的EPO水平。

如图7A所示，我们在本发明的转基因小鼠的乳中鉴定到了一种分子量为34KDa的蛋白质，占总蛋白的0.7至1.4％。

为了确定来自转基因小鼠的乳的EPO的糖基化模式，使用N-糖苷酶F或N-糖苷酶-F和O-糖苷酶进行免疫印迹。

如图7B所示，泳道1是来自乳的EPO；泳道2是以N-糖苷酶-F消化后的EPO片段；而泳道3是以N-糖苷酶-F和O-糖苷酶消化后的EPO片段。

图7B显示，3个N-糖基化位点和O-糖基化位点被消化后，最终鉴定EPO的分子量为18KDa，证实了正确的后修饰。

为了确定hEPO转基因小鼠的乳内的EPO水平，使用ELISA试剂盒(人促红细胞生成素ELISA，#01630，Stem Cell Technology)进行定量测定。在1至5天的哺乳期内，EPO水平的范围在200,000至400,000IU/mL(表3)。

表3：定量分析转基因小鼠乳中的EPO

为了确定EPO的稳定性，使用在转基因小鼠的乳内检测到的hEPO和肾衰患者血液样品进行二维分析。

根据二维分析(图8)发现，与血液样品中的EPO相比，来自转基因小鼠的EPO的电荷和大小更具异质性。

通常，由于蛋白质末端含有许多糖链例如唾液酸，PI值倾向于降低。

如图8所示，与对照和肾衰患者的血清相比，从品系6和37的转基因小鼠的乳产生的重组hEPO因其富含唾液酸的结构而更加偏酸性。相反，从对照和肾衰患者收集到的血液是非唾液酸化的(asialic)。

糖链例如唾液酸可影响蛋白质的结构和功能。

唾液酸化的EPO可作用于红细胞前体细胞因而具有生理学活性，而非唾液酸化的EPO(asialic EPO)通过结合于肝脏受体而分泌至尿液中(ParekhRB，et al.(1989)N-glycosylation and in vitro enzymatic activity of humanrecombinant tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovarycells and a murine cell line.Biochemistry 28：7670-7679；Tam RC，et al.(1991)Comparisons of human，rat and mouse erythropoietins by isoelectric focusing：differences between serum and urinary erythropoietins.Br J Haematol 79：504-511)。

因此，预期本发明的表达EPO的转基因小鼠产生的hEPO通过作用于红细胞前体而表现出生理学活性。

5)从转基因小鼠的乳中分离hEPO

将3mL收集自本发明的转基因小鼠的乳悬浮于20mL的10mM Tris缓冲液(pH 6.8)中，并以滤膜过滤。使用1,000mL的10mM Tris缓冲液(pH6.8)对滤过物4℃过夜透析，两次。将透析的悬液冷却并4,000rpm离心30分钟以除去沉淀。

通过pM-100滤膜(Amicon)过滤大约20mL上清液，然后将所得过滤物悬浮于300mL的10mM Tris缓冲液(pH 6.8)。以3mL/min的流速将所述悬液注射至以10mM Tris缓冲液(pH 6.8)预平衡的DEAE葡聚糖凝胶柱(2Φ×15cm，床体积40)。以500mL的10mM Tris缓冲液(pH 6.8)洗涤柱，以便使用10mM Tris缓冲液(含0至325mM NaCl)进行梯度洗脱(各分段体积：3mL，流速：21mL/h)。

以pM-10膜过滤所有如此收集的含EPO的洗脱级份，以含有0.15MNaCl的10mM Tris缓冲液(pH 7.2)洗涤3次，并浓缩至3mL。将溶液注射至以10mM Tris缓冲液(pH 7.2)预平衡的Sephadex G-100柱(2F x 100cm)，以24mL/h的流速溶解，级份体积为3mL。

回收所有含EPO的洗脱级份，pM-10膜过滤，并以含0.15M NaCl的10mM Tris缓冲液(pH 7.5)稀释。对稀释产物进行如下免疫纯化。

①为了自稀释产物分离IgG，收集腹水液，使用G蛋白琼脂糖亲和系统进行纯化。

将腹水液稀释于5倍组合缓冲液(0.1M NaH₂PO₄，0.15M NaCl，5mMEDTA，pH 7.0)，使之缓慢流入A蛋白琼脂糖柱并以相同缓冲液洗涤。洗涤后的腹水液稀释于洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸/HCl，0.01％叠氮化钠，pH2.7)。洗脱液被洗脱至含有等量中性缓冲液(1M Tris，0.01％叠氮化钠，pH 9)的管中。进行12％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)并以考马斯亮蓝(CBB)鉴定。该抗体溶液在3L PBS溶液中透析6次共3天，随后定量备用。

②制备免疫亲和柱

将50mg如此纯化的IgG在碳酸氢盐缓冲液(0.1M NaHCO₃，0.5MNaCl，pH 8.3)中透析过夜，4℃。以1mM盐酸洗涤经CNBr活化的3gSepharose 4B(Pharmacia)数次。将大约12mL的凝胶倒入柱中，以碳酸氢盐缓冲液洗涤以达到平衡。任何将IgG加入柱中并缓慢搅拌过夜。所得溶液中加入1M乙醇胺溶液(pH 8.8)，室温下搅拌3小时，并中和未反应的官能团。最后，以30mL碳酸缓冲液洗涤溶液3次，随后以30mL的0.1M盐酸甘氨酸溶液(pH 2.5)洗涤一次。向洗涤溶液中加入含有0.2％NaN₃的PBS缓冲液，4℃储存备用。

③免疫纯化

以含有0.15M NaCl(pH 7.5)的10mM Tris缓冲液预处理柱以达到平衡。轻柔搅动20mL的稀释样品过夜，4℃，并吸附至凝胶。将凝胶倒入柱内，然后也以缓冲液预处理柱，并以0.1M醋酸盐缓冲液(pH 4.5)洗涤，流速为60mL/h。以30mL 0.1M盐酸甘氨酸溶液(pH 2.5)洗脱出结合于凝胶的EPO。立即将1M Tris溶液(pH 9)加入至洗脱的级份内并在短时间内滴定至pH 7.5。此后，以pM-10膜(Amicon)过滤洗脱级份，得到hEPO。

6)促红细胞生成素的寡糖的结构分析

通过HPLC分析在本发明的转基因小鼠的乳内鉴定的hEPO的寡糖结构，使用牛血清胎球蛋白(Glycosciences)和商品化的重组人促红细胞生成素α(LG Life Sciences)作为糖蛋白对照。

如图9所示，A是牛血清胎球蛋白，B是来自转基因小鼠的hEPO，C是重组人促红细胞生成素α。证实了来自转基因小鼠的乳中的EPO与来自CHO细胞的重组人促红细胞生成素α具有相似的单、二和三酸性寡糖，但前者比后者具有更多的四酸性寡糖。

这证实，当EPO在转基因小鼠内通过糖基化酶表达时，通常发生翻译后修饰，这提示乳腺产生的EPO可被容易地用作药用产物(图4)。

表4：人血清内和转基因小鼠乳内的EPO的N-连接电荷分析(N-linkedcharge analysis)

7)转基因小鼠的乳内的hEPO活性

7-A)转基因小鼠的乳内的体外hEPO活性

进行以下实验来研究本发明的转基因小鼠的乳中的体外hEPO活性。

已经发现EPO通过结合EPO受体(EPOR)而活化转录因子STAT5。为此，我们构建了含有STAT5的BCL-XL荧光素酶表达载体以便以稳定方式在MCF-7细胞系(人乳腺癌细胞系)中表达EPOR。

以含有转基因小鼠的rhEPO的乳蛋白质(0ng，10ng，100ng，1μg)处理MCF-7细胞(2×10⁵/35mm板)16小时。

作为阴性对照，以1μg普通乳蛋白质处理MCF-7细胞(2×10⁵/35mm板)。以重组人促红细胞生成素α(10IU，100IU)处理的细胞作为阳性对照。16小时后，使用微孔板光度计(Perkin Elmer)测定荧光素酶活性，如图10所示。

从图10可看出，当以不同浓度的来自转基因小鼠的乳的EPO处理MCF-7细胞时，观察到荧光素酶活性呈剂量依赖方式的升高。

由于以重组人促红细胞生成素α处理也观察到这种荧光素酶活性升高，我们发现来自本发明的转基因小鼠的乳中的hEPO的体外活性更佳。

7-B)转基因小鼠乳内的EPO的体内生理学活性

为了研究本发明的转基因小鼠乳内的EPO的体内生理学活性，将来自转基因小鼠的乳的EPO注射于对照小鼠(200ng/kg，一次静脉注射)，在不同时间间隔收集各血液样品。图11给出了血液测试结果。

如图11所示，当将来自本发明的转基因动物的乳的EPO加给对照小鼠时，观察到血小板、RBC、血红蛋白和血细胞比容呈时间依赖方式升高。

由于以重组人促红细胞生成素α处理也观察到这种生理学活性升高，我们发现来自本发明的转基因小鼠的乳中的EPO的体内活性更佳。实施例3：使用体细胞通过引入本发明的EPO表达载体而产生转基因猪

使用体细胞通过引入实施例1的本发明的表达载体pBC1/hEPO/NEO而产生了转基因猪。

A)制备培养基

使用NCSU 23培养基进行卵泡卵的体外成熟化。将1L来自Baxter(Baxter Healthcare Co.，U.S.A.)的水用0.2μm滤膜(Gelman Sci.，U.S.A.)过滤，将pH调整至7.2-7.3，然后将过滤物注入50mL的组织培养瓶(Falcon，U.S.A.)，每瓶45mL，4℃储存，可用两周。

使用含有10％猪卵泡液、0.1mg/mL半胱氨酸、0.01μg/mL EGF、10IU/mL eCG和10IU/mL hCG的NCSU 23制备体外成熟化培养基。使用含有0.4％BSA的NCSU 23制备体外培养基。

自卵泡(直径2-7mm)收集猪卵泡液，1,900×g离心3次，经0.2μm滤膜过滤后储存于-20℃备用。

B)收集猪卵泡卵母细胞

本实施例使用的是青春期前小母猪的卵巢，小猪在屠宰场被屠宰后立即就地取出卵巢，转移至含有生理盐水(30-35℃)的保温瓶中，其中补充了青霉素G(100单位/mL)和链霉素(100μg/nL)，并在3-4小时内送至实验室。获取不成熟的卵泡卵母细胞之前先将卵巢周围的脂肪和结缔组织去除并以生理盐水洗涤3-4次。使用带有18-G针头的20mL注射器从卵丘-卵母细胞复合体(直径2-7mm)吸取卵母细胞。

收集卵母细胞所使用的培养基是TALP-HEPES，含有0.1mg/mL PVA(Prather，R.S.，et al.1995.In vitro development of embryos from sinclairminiature pigs：A preliminary report.Theriogenology，43：1001-1007)。

将吸出的猪卵泡液静置5-10分钟。用5mL移液器吸取沉淀的溶液底部，置于60-mm培养皿内。

在40×倍倒置显微镜(Olympus Co.，Japan)下收集卵母细胞并以体外成熟化NCSU 23洗涤4-5次进行选择。仅选择具有至少两层卵母细胞和细胞质非常均匀的卵母细胞用于以下实施例。

C)猪卵泡卵母细胞的体外成熟

将用于体外成熟化的500μL猪卵母细胞置于4孔皿(Nunc，Denmark)中培养18小时，以诱导达到平衡。

将100-150个具有至少两层卵母细胞和细胞质非常均匀的卵母细胞置于补充了激素的体外成熟化培养基中，在湿化(98-99％)的含有5％CO₂的CO₂孵箱内39℃培养20-22小时。将这些卵母细胞在无激素培养基内培养20-22小时。卵母细胞共培养40-44小时。

D)构建用于引入并靶向表达hEPO的基因的载体

基于实施例1所述的方法构建表达hEPO的pBC1/hEPO/NEO表达载体。

E)制备体细胞供者细胞和建立细胞系

收集妊娠期30天的猪胎儿用于本实验。

除了头、肢体和肠道，将所有其他组织切片并在补充了0.05％胰蛋白酶(Gibco，USA)和EDTA(Sigma，USA)的D-PBS内放置3分钟。将这些碎片离心以去除胰蛋白酶和EDTA。

将分离的细胞置于DMEM内，其中补充了10％胎牛血清(FBS)，然后接种于25cm³培养瓶(Falcon，USA)内，培养于CO₂孵箱内。

培养12小时后，去除没有沉积在底部的组织切片。给培养物更换新鲜的DMEM+10％FBS并培养3-5天。

供者细胞在培养瓶内生长超过80％时以胰蛋白酶(0.05％)和EDTA处理使之漂浮，然后将细胞按照1/3-1/4传代10次。

将传代培养的供者细胞冷冻在补充了10％DMSO的DMEM中储存。进行核转移时，将供者细胞在38-39℃解冻，去除冻存剂。将细胞在补充了10％FBS的DMEM内传代一次。培养细胞2-3天达到汇合，收集单层细胞。用于本实验的供者细胞处于细胞分裂周期的G0或G1期。

F)将外来基因引入建立的体细胞

将实施例1制备的并储存于-20℃的pBC1/hEPO/NEO DNA解冻。还使用了冷冻的Effectene转染试剂(Qiagen)。将这两种材料置于各管内，其中的DNA水平为2μg/mL，同时避免它们混合。将Qiagen试剂盒内的8μL增强物缓慢加入至各管。

加入缓冲液EC以确保总量(DNA+增强物+缓冲液EC)为150μL，震荡1秒，并在室温放置2-5分钟。DNA-增强物复合物内各加入25μL的Effectene，随后移液至室温放置5-10分钟。

此外，以D-PBS洗涤E节所制备的并在培养皿中生长至50％-80％汇合的成纤维细胞2或3次，10分钟，铺板，每板4mL无FBS的DMEM，置于孵箱内。

10分钟后每管加入1mL无FBS的DMEM，用加样器充分混合。将细胞置于含有4mL成纤维细胞和DMEM的培养皿中，转染后将细胞再次置于孵箱内12-18小时。此后，以D-PBS洗涤细胞，然后更换为含有10％FBS的DMEM。

G)选择引入EPO的体细胞系EPO、传代培养和冷冻保存

从上述F)段的转染日期后72小时，使用600-800μg/mL的G418对新霉素抗性细胞进行为期约2周的选择。所选的成纤维细胞沉淀于底部，用于传代培养。

更具体地，从待分离的细胞的瓶中去除培养基。向瓶中加入1.5mL的0.25％胰蛋白酶+EDTA，然后置于孵箱内大约3-5分钟。当显微镜下大约70％的细胞分开时，将细胞从孵箱内取出，并使用移液器分离。将细胞转移至含有10mL D-PBS的15mL管中，1500rpm离心3分钟。去除上清液后，向沉淀中加入约3mL的10％FBS+DMEM+G418以充分分散。将分散的沉淀加入至瓶中，置于孵箱内培养。

为了冻存细胞，将细胞离心获得沉淀。向沉淀加入1mL DMSO并充分分散。将沉淀置于冻存管内，在-70℃低温冰箱内存放24小时，然后储存于-196℃液氮罐内。

含有本发明的pBC1/hEPO/NEO的猪体细胞于2007年7月26日保藏于韩国生命工学研究院的生物学资源中心，保藏号为KCTC11160BP。

H)用于核转移的冷冻体细胞供者细胞的处理

1.解冻：将细胞从冰箱内取出，在37℃水浴内解冻。解冻的细胞转移至含有10mL D-PBS的15mL的管中，1500rpm离心3分钟。去除上清液后，向沉淀内加入3mL的10％FBS+DMEM+G418，并充分分散。将分散的沉淀加入至瓶中，置于孵箱内培养。

2.制备供者核：通常在4孔板内处理供者细胞。为了分离细胞，去除培养基，然后以200μL的胰蛋白酶+EDTA在培养皿中铺板，然后置于孵箱内大约3-5分钟。当显微镜下大约70％的细胞分开时，将细胞从孵箱内取出，并使用200μL移液器分离。将细胞置于含有约3mL用于供者的培养基的培养皿中以便分散。将细胞置于孵箱内备用。

I)核转移

为了核转移，使用毛细管(直径1mm；Narishige，Japan)制备了各种用于保持、去核和注射的加样器。保持移液器的外径为150-180μm，而去核和注射移液器的外径被调整至30-40μm。所制备的移液器以PVP涂层处理备用。

将体外成熟的受者细胞质置于补充了0.1％透明质酸酶(Sigma，USA)的D-PBS中以便去除卵丘细胞，并以PVA-TALP-HEPES洗涤3-4次。

仅在补充了.05M蔗糖(Sigma，USA)和0.4％BSA的培养基中选择出那些具有优质细胞质和可见第一极体的卵母细胞。

通过从含有0.4％BSA的NCSU-23培养基的小滴吸出30％的细胞质而实现去核，所述NCSU-23培养基还含有7.5μg/mL细胞松弛素B(Sigma，USA)和0.05M蔗糖。

将供者细胞加入至去核的卵母细胞的无细胞质空间内以使得细胞质可与卵母细胞附着，所述供者细胞的细胞周期已经被诱导至G0或G1期。以IVC培养基(含有0.4％BSA的NCSU-23)处理含有供者细胞的卵母细胞，然后进行电融合。

J)重构胚胎的融合和卵母细胞活化

使用电细胞操纵器(BTX，USA)进行克隆的胚胎和细胞质的供者细胞之间的融合。将重构的胚胎在活化培养基中预孵育，所述活化培养基含有0.28M甘露醇溶液(Sigma，USA)，并补充了0.1mM CaCl₂(Sigma，USA)和0.1mM MgCl₂(Sigma，USA)。在培养基中平衡2-3分钟。

使用电细胞操纵器将电刺激输送至具有两根平行导线电极的小室。重构的卵母细胞和细胞质分别连接尖头正极(+)和负极(-)。将卵母细胞暴露于150V下的电脉冲，随后为50μsec的两次脉冲。注入体细胞后，将卵母细胞活化并随后在含有细胞松弛素B的培养基中培养4小时或者是在含有0.4％BSA的培养基中体外培养。

K)处理受者猪

为了移植克隆的胚胎，给怀胎30-40天的受者肌肉施用PGF2α以诱导流产。24小时后同时给受者施用PGF2α和PMSG。72小时后给怀胎的母猪肌肉施用hCG以诱导超排卵。48小时后将克隆的胚胎移植给受者。

L)胚胎转移和妊娠诊断

为了产生克隆猪，以手术方法将重构的胚胎转移至同步化的养母中。给经过激素处理同步化的受者从耳静脉施用克他命和甲苯噻嗪以诱导全身麻醉。使用剃刀去除麻醉受者腹正中线周围的毛。腹正中线消毒后切开大约10-15cm的切口，暴露子宫以确认卵巢表面或卵母细胞的红体(corpushemorrhagicum)。然后，将克隆的胚胎注入输卵管壶腹。为了确认克隆的胚胎在一些受者体内的发育，在胚胎转移后7天手术切开腹部以评估胚胎发育情况。还在胚胎转移27-30天后采用超声波扫描来核实妊娠。进行了PCR和基因组Southern印迹以确认表达乳腺特异性EPO的转基因小猪。

有益效果

本发明的表达hEPO的转基因动物与常规方法相比以高得多的浓度表达乳腺特异性EPO。

此外，本发明的转基因动物产生的hEPO与商品化的同类蛋白质相比具有更好的稳定性和优越的生理学活性。

此外，施用本发明的转基因动物产生的hEPO升高了血液中的血小板、红细胞、血红蛋白和血细胞比容。

因此，本发明的表达hEPO的载体和转基因动物可有效用于产生与现有EPO相比具有优越生理学活性的EPO。

[微生物保藏证明]

国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约

国际表格

原始保藏的收据

按照细则7.1出具

保藏人：CHO-A制药株式会社

Acetechno Tower 1层

55-7，Moonrae-dong 3-ga，Yeongdeungpo-ku，首尔150-090

韩国

表格：BP/4(KCTC表17)    单页

国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约

国际表格

原始保藏的收据

按照细则7.1出具

保藏人：CHO-A制药株式会社

Acetechno Tower 1层

55-7，Moonrae-dong 3-ga，Yeongdeungpo-ku，首尔150-090韩国

表格：BP/4(KCTC表17)    单页

序列表

<110>CHO-A制药株式会社

<120>乳腺特异性人促红细胞生成素表达载体、转基因动物和利用其产生人促红细胞生成素的方法

<130>P07008-CHOA

<160>22

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>2148

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2148)

<223>human erythropoietin

<400>1

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aagctgaagc tgtacacagg ggaggcctgc aggacagggg acagatga                 2148

<210>2

<211>4101

<212>DNA

<213>goat

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(4101)

<223>beta-casein promoter

<400>2

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tccactgttg gttttatttc aaaccacaaa attagcatgc cattaaatac tatatataaa    4080

cagccactaa atcagatcat t                                              4101

<210>3

<211>632

<212>DNA

<213>Woodchuck hepatitis B virus

<220>

<221>misc_signal

<222>(1)..(632)

<223>Woodchuck heptitis virus posttranscriptional regulatory element

<400>3

accaggttct gttcctgtta atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg    60

tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta    120

tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct    180

gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt    240

tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac    300

tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg    360

ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac    420

gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg    480

ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct    540

gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc    600

ctccccgcct gtttcgcctc gggctcctcg ag                                  632

<210>4

<211>1916

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>neomycin resistance gene

<400>4

gcggccgcgc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt    60

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct    120

tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt    180

cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat    240

ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg    300

caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg    360

cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt    420

tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt    480

tttggaggcc taggcttttg caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat    540

gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg    600

ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc    660

gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca    720

agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct    780

cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga    840

tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg    900

gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat    960

cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga    1020

gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg    1080

cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg    1140

ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat    1200

agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct    1260

cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga    1320

cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg    1380

ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt    1440

ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc    1500

caccctaggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct    1560

atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc    1620

ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa    1680

tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg    1740

ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct caggttactc atatatactt    1800

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat    1860

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc cgatcg    1916

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>WPRE forward primer

<400>5

accaggttct gttcctgtta atcaacctc                     29

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>WPRE reverse primer

<400>6

ctcgaggagc ccgaggcgaa acaggcg                       27

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Neomycin resistant gene forward primer

<400>7

gcggccgcgc gcgtcaggtg gcac                          24

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Neomycin resistant gene reverse primer

<400>8

cgatcggacg ctcagtggaa cgaaaactc                     29

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mouse GnT-V Forward primer

<400>9

cactgttaat tcgcccacct                               20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mouse GnT-V Reverse primer

<400>10

gcttggtcct cctgactctg                     20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>CHO GnT-V Forward primer

<400>11

gtacagagtg acctgccaaa                     20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>CHO GnT-V Reverse primer

<400>12

gtctttgcat agggccactt                     20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mouse GnT-III Forward primer

<400>13

gctcaggcct ctagtaatct                     20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mouse GnT-III Reverse primer

<400>14

tcctgacccc taacctactc                     20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>CHO GnT-III Forward primer

<400>15

gcatctactt caarctcgtg                     20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>CHO GnT-III Reverse primer

<400>16

gtgctcrtgg gctcccggta                     20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mouse & CHO Fuc-TIV Forward primer

<400>17

cacacdgtgg cccgctacaa                     20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>mouse & CHO Fuc-TIV Reverse primer

<400>18

tcccagaarg argtgatgtg                     20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>forward primer for transgene check

<400>19

ctccttggca gaaggaagcc                     20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>reverse primer for transgene check

<400>20

cagccatgga aaggacgtca                     20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>hEPO specific forward primer

<400>21

gtagaagtct ggcagggcct                     20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>hEPO specific reverse primer

<400>22

tcatctgtcc cctgtcctgc                     20

Claims (14)

1.pBC1-hEPO-WPRE载体，其包含编码作为乳腺特异性启动子的β酪蛋白启动子的DNA序列、位于所述启动子3′端的编码人促红细胞生成素(hEPO)的DNA序列、和位于所述hEPO基因3′端的编码旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)的DNA序列。

2.权利要求1的载体，其中所述编码人hEPO的DNA序列是SEQID NO：1。

3.权利要求1的载体，其中所述编码β酪蛋白启动子的DNA序列是SEQ ID NO：2。

4.权利要求1的载体，其中所述编码WPRE的DNA序列是SEQ IDNO：3。

5.pBC1/hEPO/NEO载体，其在权利要求1的载体中还包含作为选择标记的新霉素抗性基因。

6.权利要求5的载体，其中所述编码新霉素抗性基因的DNA序列是SEQ ID NO：4。

7.权利要求6的载体，其保藏号为KCTC 11159BP。

8.非人类动物的体细胞，其通过引入权利要求1-7任一项的表达载体而被转化。

9.权利要求8的猪体细胞，其携带pBC1/hEPO/NEO，且其保藏号为KCTC 11160BP。

10.胚胎，其通过将通过引入权利要求1-7任一项的表达载体而转化的非人类动物体细胞的核转移至非人类动物的去核卵内而产生。

11.转基因非人类动物，其通过引入权利要求1-7任一项的表达载体而被转化。

12.权利要求11的转基因动物，其中所述动物选自猪、小鼠、牛、山羊、绵羊、马和狗。

13.产生人促红细胞生成素(hEPO)的方法，其包括从权利要求11的转基因动物所产生的乳中分离并纯化所表达的EPO。

14.权利要求13的方法，其中所述动物选自猪、小鼠、牛、山羊、绵羊、马和狗。

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