JP5507555B2 - 豚のαＳ１カゼイン遺伝子、そのプロモーター、及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、豚αＳ１カゼイン遺伝子、豚αＳ１カゼイン遺伝子プロモーター、これを含む発現ベクター、及びこれを用いた目的たんぱく質の製造方法に関するものである。

医薬分野で経済的付加価値の高いＥＰＯ等、有用たんぱく質の生産を極大化する方法として細胞培養法による量産方法が主に使われている。

大韓民国特許出願第９４−１２０８２号には、改変された組換えヒト赤血球造血因子（ｒｈＥＰＯ）遺伝子を含む発現ベクターが開示されており、この発現ベクターで形質転換させた動物細胞株ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１、Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌ）ではＥＰＯを量産することができたが、この方法では継続的に形質転換させなければならないという面倒さによって量産には適しないという問題がある。大韓民国特許公告第１０−０２３２６４０号、第１０−０４３４７２９号等でも形質転換細胞株培養法によりＥＰＯを生産する方法が開示されているが、この細胞培養方法は、動物の血液を培養培地として利用するため、生産費用が高まり、培養技術にとって専門的な知識が求められる。

一方、形質転換動物を用いた有用たんぱく質生産方法は、動物が分泌する体液中に目的たんぱく質が含まれるので、既存の細胞培養法に比べて目的たんぱく質の生産、分離、精製が容易であり、優れた活性も維持されるので、この分野に対する関心が急増している。大韓民国特許第１０−０３５８７５４号には、豚の乳汁の中でＥＰＯを生産する形質転換動物（セロミ）が開示されているが、ここに使用したプロモーターは乳汁の構成成分のうち、小さい部分を占める乳清成分のプロモーター（ＷＡＰ）であった。

本発明者は、乳汁内で目的たんぱく質を高い効率により発現する乳線特異的プロモーターを開発するために研究した結果、αＳ１カゼイン遺伝子及びそのプロモーターに対する塩基配列を解明し、本発明を完成した。

大韓民国特許出願第９４−１２０８２号 大韓民国特許公告第１０−０２３２６４０号 大韓民国特許公告第１０−０４３４７２９号 大韓民国特許第１０−０３５８７５４号

本発明では、豚αＳ１カゼイン遺伝子及びそのプロモーターを提供し、これを用いて目的たんぱく質を量産する方法を提供することを目的とする。

本発明は、豚αＳ１カゼイン遺伝子を提供する。

本発明の豚αＳ１カゼイン遺伝子は、具体的にプロモーター、及び３’ＵＴＲ（非翻訳領域）部位を含む配列番号１の塩基配列を含む。

また、本発明は配列番号１の塩基配列のうち、１番目から９３００番目までの塩基配列に該当する配列番号２のプロモーターを提供し、上記プロモーターは構造遺伝子の５’側に位置して構造遺伝子の発現を調節する。

本発明の豚αＳ１カゼイン遺伝子またはプロモーターは、配列番号１または配列番号２の塩基配列に１つ以上の崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、点（ｐｏｉｎｔ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ナンセンス（ｎｏｎｓｅｎｓｅ）、ミスセンス（ｍｉｓｉｎｓｅ）、多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、及び再配列突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）が生じた機能的な等価物のうちから選択される１つとなることができる。

また、本発明は配列番号２のプロモーター全体または一部を含む発現ベクターを提供する。好ましくは、配列番号３、または配列番号４の塩基配列を本発明の発現ベクターは含む。上記配列番号２、配列番号３、または配列番号４の塩基配列はベクターに挿入されてプロモーターの役割をし、上記の配列をプロモーター配列または豚αＳ１カゼイン遺伝子プロモーター配列という。本発明で使用する’豚αＳ１カゼイン遺伝子プロモーター’という用語は、豚αＳ１カゼイン遺伝子から由来したプロモーターを意味する。

配列番号３及び配列番号４は、配列番号１の豚αＳ１カゼイン遺伝子全体ゲノム配列のうち、各々３５６８番目から９０３７番目までの塩基配列、４３２１番目から９３００番目までの塩基配列に該当し、共通的にエクソン１領域を含む。

本発明の発現ベクターは、必要によって適切な位置に調節因子、即ち更に他のプロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、選択的標識遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）、５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）、３’−ＵＴＲ、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、リボソーム結合配列、ゲノムの特定部位に挿入できる塩基配列、イントロン、またはＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）などをさらに含むことによって、形質転換細胞株の構築を容易にし、目的たんぱく質の発現量の極大化及び発現の安定性を図ることができる。

選択的標識遺伝子は、ネオマイシン抵抗性遺伝子（ｎｅｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ）などを使用し、市販するベクターから該当部分を切断して使用することができる。ネオマイシン抵抗性遺伝子は、細胞株構築時に使われるＧ４１８（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アミノ−６−［（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，６Ｓ）−４，６−ジアミノ−３−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−５−メチル−４−メチルアミノオキサン−２−イル］オキシ−２−ヒドロキシシクロヘキシル］オキシ−２−（１−ヒドロキシエチル）オキサン−３，４−ジオール）（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−ａｍｉｎｏ−６−［（１Ｒ， ２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，６Ｓ）−４，６−ｄｉａｍｉｎｏ−３−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｏｘａｎ−２−ｙｌ］ｏｘｙ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］ｏｘｙ−２−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｏｘａｎｅ−３，４−ｄｉｏｌ）試薬に対して抵抗性を表す遺伝子であって、プロモーター調節下にたんぱく質を発現する動物細胞株構築時、効率的な選択的標識遺伝子として作用することができる。

インシュレーターはプロモーター付近に存在する調節因子の影響を助けて、位置非依存的な（ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）発現を助ける因子であって、プロモーターの調節下にたんぱく質を安定的に発現できるようにし、市販されるベクターから該当部分を切断して使用することができる。

ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡの安定化に寄与してたんぱく質合成量を増大させることができる調節因子であって、プロモーターの調節下にたんぱく質を大量に発現できるようにする。ＷＰＲＥはまた市販されるベクターから切断したものでありうる。

また、本発明の発現ベクターは、配列番号５または配列番号６の塩基配列をさらに含む。上記配列番号５または配列番号６の塩基配列は、ベクターの３’ａｒｍを形成し、形質転換細胞株の構築を容易にし、目的たんぱく質の発現量の極大化及び発現安定性を図ることができる。

配列番号５及び配列番号６は、各々、配列番号１の豚αＳ１カゼイン遺伝子全体ゲノム配列のうち、２６３４４番目から３０５９９番目までの塩基配列、１４４４７番目から１９４０１番目までの塩基配列に該当する。

豚αＳ１カゼイン遺伝子全体ゲノム配列のうち、配列番号３、４、５、６の塩基配列の位置は図１に示した通りである。

本発明のベクターは、好ましくは配列番号３の塩基配列及び配列番号５の塩基配列を含む。

具体的に、本発明のベクターは、図２の開裂地図を有するものであって、ｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン（ｃａｓｅｉｎ）ベクターを、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ、大田、大韓民国）である、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ１１３２４ＢＰとして寄託した。本発明の発現ベクターｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインベクターはｐＢＣ１ベクターを基本骨格として有し、選択的標識遺伝子としてネオマイシン抵抗性遺伝子が融合されている。

本発明の発現ベクターはプロモーター領域の塩基配列の３’側に目的たんぱく質をコードする塩基配列をさらに含むことによって、目的たんぱく質を発現することができる。

上記目的たんぱく質は、産業上利用可能な有用たんぱく質であって、一例として、医薬品の有効性分に使われる全てのたんぱく質、即ちＥＰＯ（エリスロポエチン、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アルドステロン（ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ）、アドレノコーチコトロピン（ａｄｒｅｎｏ−ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ）、血液凝固因子（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏ−ｔｒｏｐｉｎ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、プロラクチン（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、またはバソプレシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）などがあり、好ましくはｈＥＰＯ（ヒトエリスロポエチン、ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）である。

本発明は、上記ネオマイシン抵抗性遺伝子、インシュレーター、ＷＰＲＥなどを含む発現ベクターの好ましい例として、図３の開裂地図を有するベクターを提供する。具体的にｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ１１３２５ＢＰとして寄託した。

本発明のｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン（ｃａｓｅｉｎ）＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥ発現ベクターはｐＢＣ１ベクターを基本骨格として有し、本発明のプロモーター領域の３’側にヒトＥＰＯをコードする遺伝子、及びヒトＥＰＯ遺伝子の３’側にＷＰＲＥが融合されている。

本発明の発現ベクターはノックインベクター（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ベクター）として製造される。

“ノックインベクター”はゲノムの特定遺伝子の位置に目的とする遺伝子を挿入することができるベクターであって、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるように標的とする特定遺伝子に相同である塩基配列を含む。本発明のノックインベクターは目的たんぱく質をコーディングする核酸配列がゲノム上のαＳ１カゼイン遺伝子に挿入されるαＳ１カゼイン標的ベクターである。

本発明のノックインベクターは、好ましくは配列番号４の塩基配列及び配列番号６の塩基配列を含む。

本発明のノックインベクターは必要によってポジティブ及び／またはネガティブ選択的標識（遺伝子）を使用して形質転換された細胞を選別することができる。選択的標識遺伝子とは、ベクターに形質転換された細胞を選別するためのものであって、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面たんぱく質の発現のような選択可能表現型を与える遺伝子が使用され、ポジティブ選択的標識（遺伝子）及びネガティブ選択的標識（遺伝子）がある。

ポジティブ選択的標識遺伝子とは、選択剤が処理された環境で選択遺伝子を発現する細胞のみ生存するようにしてポジティブ選択を可能にする遺伝子であって、ネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ：Ｎｅｏ）抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ：Ｈｙｇ）抵抗性遺伝子などがある。

ネガティブ選択的標識遺伝子はランダムに挿入が起こった細胞を選別して除去するネガティブ選択を可能にする遺伝子であって、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：Ｈｐｒｔ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子、またはジフテリアトキシン（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）遺伝子などがある。ネガティブ選択的標識遺伝子は、プロモーター領域の５’末端側または３’ａｒｍの３’末端側に位置する。

ポジティブ選択的標識遺伝子及びネガティブ選択的標識遺伝子は、別個のプロモーター、ポリＡなどを有することができ、使われるプロモーターはサルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ロウスサルコマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＰＧＫ）プロモーターなどがある。

本発明のノックインベクターとゲノム上のαＳ１カゼイン遺伝子で相同組換えが起これば、ベクター上の目的たんぱく質をコーディングする核酸が宿主細胞のαＳ１カゼインゲノム遺伝子に組み込まれて（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、宿主細胞のαＳ１カゼインたんぱく質の代わりに発現される。

本発明は、ポジティブ選択的標識遺伝子にネオマイシン抵抗性遺伝子、及びネガティブ選択的標識遺伝子に単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ｔｋ）を使用するノックインベクターの好ましい例として図４の開裂地図を有するベクターを提供し、具体的に、豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターを韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ１１３２６ＢＰとして寄託した。

本発明の豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターは、Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏベクターを基本骨格として有し、プロモーター（図４の豚αＳ１カゼイン５’ａｒｍ部分を意味する）の３’側にｈＥＰＯ、ｈＥＰＯの３’側にポジティブ選択的標識遺伝子としてネオマイシン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子３’側に３’ａｒｍ（図４の豚αＳ１カゼイン３’ａｒｍ部分を意味する）、及び３’ａｒｍの３’側に単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子（ＴＫ）が融合されている。

本発明のベクター製作は、当該技術分野でよく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野で一般的に知られた酵素などを使用する。

また本発明は、本発明の発現ベクターを導入して形質転換させた動物の体細胞を提供する。

本発明のベクターが導入される動物の体細胞は豚などの由来で、１次、２次、または永久細胞でありうる。

上記細胞内に本発明のベクターを導入する方法は、核酸を細胞内に導入する方法を全て使用することができ、当分野で公知の技術、即ち、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、カルシウムホスフェート共同−沈殿（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、微量注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−ｄｅｘｔｒａｎ）、陽イオンリポゾーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法などを使用することができる。この場合、ベクターは円形のベクターを適切な制限酵素で切断して線形のベクター形態またはプラスミドを除いた線形のベクター形態に導入することができる。

本発明のプロモーター遺伝子は、乳腺組織のみで特異的にたんぱく質を発現させる。豚の乳汁のうち、たんぱく質構成成分はカゼインが９０％を占めており、カゼインは、またアルファ（α）、ベタ（β）、ガンマ（γ）カゼインに分けられる。そのうち、アルファ（α）カゼインが７０％で相当部分を占めており、αカゼインはαＳ１カゼイン及びカッパカゼインに分けられ、αＳ１カゼインがそのうちの５５％を占めるので、豚αＳ１カゼインプロモーターを用いたベクターは乳汁分泌する動物、特に豚から乳腺特異的に外部由来目的たんぱく質を発現するようにすることができる。

また本発明は、本発明の発現ベクターを導入して形質転換させた動物の体細胞の核を脱核された卵子に核移植して作った動物受精卵を提供する。

“核移植”は、核が除去された卵子に細胞の核を入れて移植させることを意味し、このような核移植された受精卵を着床させて生まれた個体は、核供与細胞の遺伝的物質が核受容細胞質にそのまま伝えられるので、遺伝的に完全に同一なクローン個体となる。

また本発明は、本発明の発現ベクターを注入させた動物受精卵を提供する。

上記の注入は、具体的に、受精直後、前核段階にある接合体の雄性前核内に微細操作技術により遺伝子を注入する微量注入法（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で、胚幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に遺伝子を挿入させ、これを胚盤胞期の受精卵の内に移植する方法（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、レトロウイルスベクター（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ベクター）を用いて遺伝子を受精卵の内に注入する方法（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、遺伝子を雄の精巣内に注入して遺伝子を精子に挿入させ、これを卵子と受精させる方法（Ｓｐｅｒｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）などによることができ、好ましい例は微量注入法である。

また本発明は、本発明の動物受精卵を移植させて得た形質転換動物を提供する。

本発明の発現ベクターで形質転換できる動物は乳汁を分泌する全ての動物、即ち豚、マウス、牛、羊、またはヤギなどである。

本発明の発現ベクターを用いた形質転換動物の生産方法は通常的な方法による。

即ち、形質転換しようとする動物のうち、マウスなどの健康な個体から受精卵を採取し、受精卵に本発明の発現ベクターを導入した後、精管結紮マウスなどを用いて偽妊娠マウスなどを得て、これを代理母にして卵管内に受精卵を移植した後、代理母から得た子孫のうち、形質転換された個体を選別する過程からなることができる。

また、豚などの健康な個体から卵胞卵を採取し、体外成熟用培養液で培養する。併せて、豚などの胎児から採取及び培養した供与体細胞に本発明の発現ベクターを導入した後、ベクターが導入された体細胞を選別及び培養する。上記体外成熟された卵子から核を除去し、この空間に供与細胞を注入した後、電気融合により核移植が完了した卵子の供与細胞と細胞質とを融合させた後、体外培養する。この複製受精卵を過排卵を誘導した受卵豚に移植した後、受卵豚から得た子孫のうち、形質転換された個体を選別する過程を経る。

以後、形質転換されたものと確認された個体から乳汁を回収した後、目的たんぱく質を分離及び精製することで、目的たんぱく質を製造する（Ａ． Ｇｏｋａｎａ， Ｊ．Ｊ． Ｗｉｎｃｈｅｎｎ， Ａ． Ｂｅｎ−Ｇｈａｎｅｍ， Ａ． Ａｈａｄｅｄ， Ｊ．Ｐ． Ｃａｒｔｒｏｎ， Ｐ． Ｌａｍｂｉｎ（１９９７） Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ７９１， １０９−１１８）。

本発明の目的たんぱく質製造方法における分離及び精製方法は、通常的に使われる方法を使用することができ、具体的には、濾過法またはクロマトグラフィー法などがある。

このようにして製造される本発明の形質転換動物は、乳汁の中に目的たんぱく質を発現することができる。

したがって、本発明の豚αＳ１カゼイン遺伝子、プロモーター、これを用いた発現ベクター、及び形質転換動物は、目的たんぱく質の生産分野に有利に使用できる。

本発明において、遺伝工学的技術と関連した事項は、サムブルックらの文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．， ２００１）及びフレデリックらの文献（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １， ２， ３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９４）に開示されている内容を参照することができる。

豚αＳ１カゼイン遺伝子プロモーターは、目的たんぱく質の乳腺特異的発現を促進するので、本発明のプロモーター、及びこれを用いた発現ベクターにより形質転換された動物は乳汁の中に目的たんぱく質を高濃度で分泌するようになって、医薬学的に重要な価値を有する有用たんぱく質の生産分野に有利に使用できる。

本発明の豚αＳ１カゼインの塩基配列を明らかにすることに使われたプローブの位置とプローブにより探し出した塩基配列の位置を示す。 本発明の一実施形態であるｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインベクターの構造を示す。 本発明の一実施形態であるｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターの構造を示す。 本発明の一実施形態である豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターの構造を示す。 本発明の一実施形態である豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを導入させた細胞株において、ｈＥＰＯの発現結果を示すグラフである。 本発明の一実施形態であるｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターに形質転換されたマウスを選別するためのＰＣＲ結果を示す。 本発明の一実施形態である発現ベクターｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターに形質転換されたマウスの子から形質転換されたか否かを確認したＰＣＲ結果を示す。 本発明の一実施形態である形質転換された親マウスの乳汁を用いてウェスタンブロットアッセイ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）した結果を示す。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施形態を提示する。しかしながら、下記の実施形態は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、実施形態によって本発明の内容が限定されるものではない。

＜実施例１＞豚αＳ１カゼイン遺伝子の分離及びクローニング
本発明の乳線特異的遺伝子を分離するために、ｐｒｏｍｅｇａ社の豚ゲノムＤＮＡライブラリーと国立畜産科学院（京畿道水原市権善区畜産路７７五木川洞５６４国立畜産科学院、大韓民国）から提供を受けたＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンを持って豚のαＳ１カゼイン遺伝子（豚αＳ１カゼイン 遺伝子）の塩基配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を明らかにした。

１）豚ゲノムＤＮＡライブラリーを用いた豚のαＳ１カゼイン塩基配列分析
豚のαＳ１カゼイン遺伝子の塩基配列が明らかでなかったため、塩基配列が明らかであったヒト、牛、ウマ、及びマウスのαＳ１カゼインｃＤＮＡ塩基配列を比較して種間の高い相同性と保存された部分を参照して、豚αＳ１カゼインＰＣＲ増幅に使われるプライマー塩基配列を製作した。５’ＵＴＲ側正方向プライマー ５’−ＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴ−３’（配列番号８）、逆方向プライマー ５’−ＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣ ＣＴＧＡＧＡＧＧＡ−３’（配列番号９）、３’ＵＴＲ側正方向プライマー ５’−ＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＡＡ ＧＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）、逆方向プライマー ５’−ＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴ−３’（配列番号１１）を用いて、豚のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合し、７２℃で５分間伸張反応）した結果、５’ＵＴＲ側に３．３ｋｂの塩基配列（配列番号１２）と３’ＵＴＲ側に３０３ｂｐの塩基配列（配列番号１３）からなる産物を得た。これをｐＧＥＭ−Ｔベクター（ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にクローニングした（ｃｌｏｎｉｎｇ）後、塩基配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて豚αＳ１カゼインの遺伝子の一部であることを確認し、５’ＵＴＲ側３．３ｋｂと３’ＵＴＲ側３０３ｂｐの塩基配列を明らかにした。

明らかにした３．３ｋｂの豚αＳ１カゼイン遺伝子の塩基配列から５’ＵＴＲ側のプローブを作るために正方向プライマー ５’−ＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴ−３’（配列番号１４）、逆方向プライマー ５’−ＣＴＡＡＧＡＣＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号１５）を用いて、ＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で３０秒間伸張反応）で５５１ｂｐの産物（配列番号１６）を得た。

豚αＳ１カゼインの塩基配列を明らかにすることに使われるプローブを作るために、上記で得た５’ＵＴＲ側５５１ｂｐと３’ＵＴＲ側３０３ｂｐのＰＣＲ産物１００ｎｇを５分間ボイル（ｂｏｉｌｅｄ）した後、氷で冷まして変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させた。変成されたＤＮＡをプライマー、ｄＮＴＰ、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００ Ｃｉ／ｎｍｏｌ， ＮＥＮ）を含有する反応緩衝液に添加した後、クレノー酵素（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を添加して３７℃で１時間の間反応させた。以後、反応液をセファデックスカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｃｏｌｕｍｎ）を使用して精製することで、^３２Ｐで標識した豚αＳ１カゼイン遺伝子プローブを用意した。

豚αＳ１カゼイン遺伝子を明らかにするために、豚のゲノムライブラリーをスクリーニングした。本実施例において、豚のゲノムライブラリーはｐｒｏｍｅｇａ社の豚ゲノムＤＮＡライブラリーを使用した。

ライブラリーを導入するホストバクテリアは、次の通り用意した。

０．２％のマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）が含まれたＬＢ培地（Ｓｃｈａｒｌａｕ、スペイン）５ｍｌにバクテリアコロニー（ＸＬＬ ｂｌｕｅ Ｐ２、ｐｒｏｍｅｇａ、米国）１つを接種して３７℃で一夜間培養した。上記培養液の１％をまた新しい０．２％のマルトース含有ＬＢ培地５０ｍｌに移して、２．５時間の間培養した。６００ｎｍでの吸光度が０．５位になった時、培養液を２５００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。その結果、得た細胞沈殿物を滅菌した１０ｍｌ硫酸マグネシウム溶液に懸濁させて、最終の濃度が１×１０^１０細胞／ｍｌになるようにし、実験時まで４℃に保管した。

ライブラリーを適正化（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）するために、ライブラリーをＳＭ緩衝溶液｛０．１Ｍ ＮａＣｌ， ８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）， ０．０１％ゼラチン｝に種々の濃度で連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した。固体ＬＢ培地が入れられたプレート（ｐｌａｔｅ）を３７℃恒温反応器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で温めて、トップアガー（ｔｏｐ ａｇａｒ）を溶かし４８℃に維持される水槽に置いた。いろいろな濃度で希釈されたパージ溶液１０μｌと上記で用意したホストバクテリア１００μｌとを混合して、３７℃でホストバクテリアを感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた。トップアガーにパージで感染されたホストバクテリアを添加し、よく振った後、上記で用意して置いたＬＢ培地の上に差した。１５分後、プレートを逆に返して３７℃の恒温反応器で一夜間培養した。一晩中培養したプレートの培地の上ではパージがホストバクテリアの内でＤＮＡライブラリーを複製した後、ホストバクテリアを溶解させた痕跡であるプラークが形成された。以後の実験段階のために培地を４℃で１時間以上冷ました。

上記プレートに対し、連続番号を記載したＮＣフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．：英国）を用意し、フィルターの真ん中部分が接触するようにして上記で用意したＤＮＡライブラリープレートの上にフィルターを覆った。フィルターに針を垂直に刺して位置を表示し、１分後に注意深くフィルターを培地から離した。

各フィルターを変性化溶液（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ； ０．５ Ｍ ＮａＯＨ， １．５ Ｍ ＮａＣｌ； ｓｉｇｍａ、米国）、中性化溶液（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ； １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， １．５Ｍ ＮａＣｌ； ｓｉｇｍａ、米国）及び２×ＳＳＣ溶液（０．３Ｍ ＮａＣｌ， ０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム， ｓｉｇｍａ、米国）に順次に１分間ずつ浸した後、８０℃オーブンで２時間の間置いて、転移されたＤＮＡライブラリーがフィルターの上に完全に固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）されるようにした。

固定化されたフィルターを密閉用ビニールに入れて前ハイブリダイゼーション溶液｛ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ； ５０％ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ４０ ｍｌ， ２０Ｘ ＳＳＰＥ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ− ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ） ２０ ｍｌ， ５０Ｘ Ｄｅｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ８ ｍｌ， １００ｎｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ １．２ ｍｌ， １０％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）１．２ｍｌ、蒸溜水０．６ｍｌ：ｓｉｇｍａ、米国｝を入れた後、６８℃で１時間の間ゆっくり振ってあげながら前ハイブリダイゼーション反応を遂行した。前ハイブリダイゼーション反応後、用意したプローブを１００ｎｇ添加し、６８℃で１８時間の間ゆっくり振ってハイブリダイゼーション反応を遂行した。ハイブリダイゼーション反応後、０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ溶液にフィルターを漬して、６５℃で１０分間振りながら洗浄する過程を２回繰り返した。洗浄後、フィルターを空気中で乾燥させ、自己放射記録法（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）を遂行した。自己放射記録とプレートとを対照して、陽性反応を見せるプラークを選択し、選択されたプラークをＳＭ緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ， ８ｍＭ ＭｇＳＯ４， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， ０．０１％ ゼラチン， ｓｉｇａｍ、米国）５００μｌに入れてクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）一滴を添加した後、よく混ぜて４℃に保管した。上記のようなスクリーニング過程を２回繰り返して、陽性反応を表すクローンを最終的に得た。最終的に得たクローンに対して、プローブを作る時に使用した互いに対を成すプライマー｛正方向プライマー（配列番号１４）、逆方向プライマー（配列番号１５）｝とＴ７、ＳＰ６プライマー（Ｃｏｓｍｏ、韓国）を使用して、ＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で５分間伸張反応）した。ＰＣＲ増幅の結果、５’ＵＴＲ側５５１ｂｐプローブで５’方向に３．７ｋｂ（配列番号１７）と３’ＵＴＲ側３０３ｂｐプローブで５’方向２．２ｋｂ（配列番号１８）と３’方向６．３ｋｂ（配列番号１９）の産
物を得てｐＧＥＭ−Ｔベクター（ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にクローニングした後、完全な塩基配列を得た。

塩基配列の分析は、ソルゼント（ｓｏｌｇｅｎｔ、韓国）に依頼して行った。

２）Ｂａｃクローンを用いた豚のαＳ１カゼイン塩基配列分析
豚ゲノムＤＮＡライブラリーを用いた塩基配列分析方法において、プローブを作るために使われたプライマー（配列番号１４〜配列番号１５）を使用してＰＣＲ増幅方法（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクル（ｃｙｃｌｅ）を遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で３０秒間伸張反応）により確認される４個（１５５Ｆ１、１８８Ａ９、６１６Ｂ６、８７４Ｅ５）のクローン（ｃｌｏｎｅ）を得て継続的な塩基配列分析方法を通じて総３３ｋｂの完全な塩基配列（配列番号４１）を明らかにした。

３）バークシャー（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ）種の豚由来αＳ１カゼインの塩基配列分析
豚ゲノムＤＮＡライブラリー分析法とＢａｃクローンから得た豚のαＳ１カゼインのＤＮＡ塩基配列に基づいてバークシャー種の豚のゲノムＤＮＡからαＳ１カゼインの塩基配列を分析した。ゲノムＤＮＡは尖端養豚研究所（慶尚南道、大韓民国）から分譲を受けた豚の体細胞からｉｎｔｒｏｎ社（韓国）のゲノムＤＮＡ抽出キット（ｃａｔ． Ｎｏ． １７２３１）を使用して分離したものを使用した。２）で分析されたαＳ１カゼイン３３ｋｂの塩基配列を全部で７部分（４．６ｋｂ、５．７ｋｂ、４．９ｋｂ、５．４ｋｂ、５．３ｋｂ、４．７ｋｂ、４．４ｋｂ）に分けたプライマー（配列番号４２〜配列番号５５）を用いて、ＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で５分間伸張反応）後、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにそれぞれをクローニングした後、塩基配列を分析した。塩基配列分析は、ソルゼント（ｓｏｌｇｅｎｔ、韓国）に依頼して行った。

その結果、バークシャー種の豚αＳ１カゼインゲノムＤＮＡ塩基配列（配列番号１）及び塩基配列情報を得ることに成功した。

配列番号１の塩基配列は、豚αＳ１カゼイン遺伝子の全体ゲノム配列であり、サイズは３３２４８ｂｐである。配列番号１の塩基配列のうち、構造遺伝子（ｇｅｎｅ）部位は７７６０番目から２７８７５番目までの塩基配列であり、開始コドンは９３２６番目から９３２８番目までの塩基配列であり、終結コドンは２５９８２番目から２５９８３番目までの塩基配列と２６５９３番目の塩基部分である。また、５’ＵＴＲ領域は７７６０番目から７８０４番目までの塩基配列、及び９３１４番目から９３２５番目までの塩基配列であり、３’ＵＴＲ領域は２６５９４番目から２６６３６番目までの塩基配列、及び２７４８２番目から２７８７５番目までの塩基配列、ポリＡシグナル部位は２７８５５番目から２７８６０番目までの塩基配列である。エクソン部位は７７６０番目から７８０４番目までの塩基配列、９３１４番目から９３７６番目までの塩基配列、１２６５３番目から１２６８５番目までの塩基配列、１３１１７番目から１３１３７番目までの塩基配列、１３５３７番目から１３５７８番目までの塩基配列、１４０４９番目から１４０７２番目までの塩基配列、１４７８０番目から１４８０３番目までの塩基配列、１６５６８番目から１６５９１番目までの塩基配列、１７６１７番目から１７６４６番目までの塩基配列、１８４２３番目から１８４４６番目までの塩基配列、１８５３３番目から１８５８０番目までの塩基配列、２０５６３番目から２０６０４番目までの塩基配列、２２３６９番目から２２３８６番目までの塩基配列、２２８６８番目から２２９０６番目までの塩基配列、２４００４番目から２４０３０番目までの塩基配列、２５０１８番目から２５０４１番目までの塩基配列、２５８３５番目から２５９８３番目までの塩基配列、２６５９３番目から２６６３６番目までの塩基配列、及び２７４８２番目から２７８７５番目までの塩基配列部分であり、イントロン部位は７８０５番目から９３１３番目までの塩基配列、９３７７番目から１２６５２番目までの塩基配列、１２６８６番目から１３１１６番目までの塩基配列、１３１３８番目から１３５３６番目までの塩基配列、１３５７９番目から１４０１８番目までの塩基配列、１４０７３番目から１４７７９番目までの塩基配列、１４８０４番目から１６５６７番目までの塩基配列、１６５９２番目から１７６１６番目までの塩基配列、
１７６４７番目から１８４２２番目までの塩基配列、１８４４７番目から１８５３２番目までの塩基配列、１８５８１番目から２０５６２番目までの塩基配列、２０６０５番目から２２３６８番目までの塩基配列、２２３８７番目から２２８６７番目までの塩基配列、２２９０７番目から２４００３番目までの塩基配列、２４０３１番目から２５０１７番目までの塩基配列、２５０４２番目から２５８３４番目までの塩基配列、２５９８４番目から２６５９２番目までの塩基配列、及び２６６３７番目から２７４８１番目までの塩基配列であり、ＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は９３２６番目から９３７６番目までの塩基配列、１２６５３番目から１２６８５番目までの塩基配列、１３１１７番目から１３１３７番目までの塩基配列、１３５３７番目から１３５７８番目までの塩基配列、１４０４９番目から１４０７２番目までの塩基配列、１４７８０番目から１４８０３番目までの塩基配列、１６５６８番目から１６５９１番目までの塩基配列、１７６１７番目から１７６４６番目までの塩基配列、１８４２３番目から１８４４６番目までの塩基配列、１８５３３番目から１８５８０番目までの塩基配列、２０５６３番目から２０６０４番目までの塩基配列、２２３６９番目から２２３８６番目までの塩基配列、２２８６８番目から２２９０６番目までの塩基配列、２４００４番目から２４０３０番目までの塩基配列、２５０１８番目から２５０４１番目までの塩基配列、２５８３５番目から２５９８３番目までの塩基配列、及び２６５９３番目の塩基配列である。

さらに、αＳ１カゼインアミノ酸配列（配列番号７）を分析した。

上記プローブの位置とプローブにより同定された配列の位置及び構造は、図１に図示した通りである。

図１の６３／１２−ＡＴＧ−４８は、豚αＳ１カゼイン２番目のエクソンの塩基配列６３個のうち、１２個の塩基配列の次のＡＴＧ（開始コドン）が存在し、以後に４８個のエクソン２番目の塩基配列を有することを意味する。１４９／１４７−ＴＧは、豚αＳ１カゼイン１７番目のエクソンの塩基配列１４９個のうち、１４７個の塩基配列の次のＴＧＡ（終結コドン）のうちのＴＧが存在し、４４／Ａ−４３は豚αＳ１カゼイン１８番目のエクソンの塩基配列４４個のうちの終結コドンのＡが存在し、以後に４３個のエクソン塩基配列を有することを意味する。

分析した豚αＳ１カゼイン配列及び情報は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）に登録（ＥＵ０２５８７５）した。

＜実施例２＞ｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインクローニングベクター構築
ｐＢＣ１ベクター（インビトロジェン、米国）のアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抵抗性を有する遺伝子をネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子に置換したベクター［Ｇ４１８ 薬剤（ｄｒｕｇ）に抵抗することができるｎｅｏ遺伝子は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）から正方向プライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号８１）と逆方向プライマーである５’−ＣＧＡＴＣＧＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣ−３’（配列番号８２）を用いて１．９ｋｂ ＰＣＲ産物（配列番号８３）を増幅して収得し、その後、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。Ｔ−ベクターにクローニングされた１．９ｋｂ ｎｅｏ遺伝子はＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素｛Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （ＮＥＢ）、米国｝で切断して挿入部位を用意した。また、ｐＢＣ１ベクターのａｍｐ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）部位をＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素で切断して除去した後、ベクター部位を用意した。このように用意した２挿入片及びベクター部位をライゲーションを通じて、ｎｅｏ遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）が挿入されたｐＢＣ１ベクターを構築した。］に乳山羊（Ｇｏａｔ）ベータカゼイン（ｂｅｔａ ｃａｓｅｉｎ）プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）部位と３’ゲノムＤＮＡ部位をそれぞれ豚αＳ１カゼインプロモーター塩基配列と３’ａｒｍ塩基配列に置換させたクローニングベクターを構築した。

豚αＳ１カゼインプロモーター塩基配列５．５ｋｂ（配列番号３）と３’ａｒｍ塩基配列４．３ｋｂ（配列番号５）をプライマー塩基配列（配列番号５６〜配列番号５９）を用いたＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で５分間伸張反応）により産物を得た後、それぞれｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にクローニングした。

豚のαＳ１カゼインプロモーター配列に存在するＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）２個所を下記のように反復的なポイントミューテーション（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を通じてＢａｍＨＩ制限酵素で切れないようにした。ポイントミューテーションのために、２個所のうち、先に１個所を定めてプライマーを製作した。豚αＳ１カゼイン５’プロモーター部位が含まれたｐＧＥＭ−ＴベクターＤＮＡを精製後、鋳型に使われるＤＮＡ２０ｎｇと一対のポイントミューテーションプライマーを使用して９５℃で３０秒（１反復）、９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で８分３０秒（１５反復）の条件でＰＣＲ増幅した。鋳型に使われた（ポイントミューテーションされていない）ＤＮＡを除去するために、Ｍｕｔａｚｙｍｅ酵素（商標）（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、大韓民国）を１ｕｌ添加後、３７℃で１時間反応させた。上記反応物１０ｕｌをＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）させ、ＬＢ＋アンピシリン固体培地（ｓｉｇｍａ、米国）にプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）後、３７℃で２０時間培養させた。ＬＢ＋アンピシリン固体培地で育ったコロニーをＬＢ＋アンピシリン液体培地に育てた後、ＤＮＡを精製して塩基配列分析方法によりＢａｍＨＩ部位がポイントミューテーション（ＧＧＡＴＣＣ→ＧＧＡＣＣＣ）されたか確認した。１個所にポイントミューテーションされたコロニーのＤＮＡを使用して、残った１個所のＢａｍＨＩ部位も上記のような方法によりポイントミューテーションさせた。ここで使われたポイントミューテーション方法は、イントロン社の製品Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを使用した。

ポイントミューテーションに使われたプライマー配列は、以下の表の通りである。

ｐＧＥＭ−Ｔベクター中に存在する豚αＳ１カゼインプロモーターをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切って８．５ｋｂのベクターを用意した。また、３’ａｒｍを含む配列部分をＸｈｏＩとＮｏｔＩで切って４．３ｋｂの挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）（配列番号５）を用意した。それぞれの片をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１カゼイン ５’＋３’をクローニングした。

ｐＢＣ１ベクターをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切って１０ｋｂのベクターを用意し、ｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１カゼイン ５’＋３’ベクターをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切って９．８ｋｂの挿入物を用意した。それぞれの片をライゲーションしてｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインクローニングベクターを構築した。

完成されたｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインクローニングベクターの構造は、図２の通りである。

図２のＰ αＳ１カゼインはエクソン１（Ｅ１）を含む豚αＳ１カゼインプロモーター塩基配列（配列番号２）である。エクソン１は配列番号１の塩基配列のうち、５’−３’方向に一番先に配列されるエクソンを意味する。

図２のαＳ１カゼイン ３’ゲノムＤＮＡは、エクソン１８（Ｅ１８）、エクソン１９（Ｅ１９）、及びイントロン１８（ＩＶＳ １８）を含む３’ａｒｍの塩基配列（配列番号５）である。エクソン１８、エクソン１９は、それぞれ配列番号１の塩基配列のうち、５’−３’方向に１８番目と１９番目のエクソンを意味し、イントロン１８は１８番目のイントロンを意味する。

ＸｈｏＩ制限酵素部位を有するので、目的たんぱく質の遺伝子をベクターに挿入することができる。

２Ｘβ−グロビンインシュレーター（ｇｌｏｂｉｎ ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びｐＢＲ３２２はｐＢＣ１ベクターに起源するインシュレーターとベクター構成要素であり、ネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）はネオマイシン抵抗性遺伝子であって、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）に由来する。

上記の方法により製造されたｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインベクターを韓国生命工学研究院遺伝子銀行（大田、大韓民国）に寄託番号ＫＣＴＣ １１３２４ＢＰとして寄託した。

＜実施例３＞ｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターの構築
ｐＢＣ１ベクター（インビトロジェン、米国）のアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抵抗性を有する遺伝子をネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子に置換したベクター｛Ｇ４１８ 薬剤（ｄｒｕｇ）に抵抗することができるｎｅｏ’遺伝子はｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）から正方向プライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号８１）と逆方向プライマーである５’−ＣＧＡＴＣＧＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣ−３’（配列番号８２）を用いて１．９ｋｂ ＰＣＲ産物（配列番号８３）を増幅して得て、その後、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙベクターにクローニングした。Ｔ−ベクターにクローニングされた１．９ｋｂ ｎｅｏ遺伝子はＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）で切断して挿入部位を用意した。また、ｐＢＣ１ベクターのａｍｐ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）部位をＮｏｔＩとＰｖｕＩ制限酵素で切断して除去した後、ベクター部位を用意した。このように用意した２挿入片及びベクター部位をライゲーションを通じて、ｎｅｏ遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）が挿入されたｐＢＣ１ベクターを構築した。｝にヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をクローニングし、ベクターに存在する乳山羊（Ｇｏａｔ）ベータカゼイン（ベータカゼイン）プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）部位と３’ゲノムＤＮＡ部位を豚αＳ１カゼインプロモーター塩基配列（配列番号３）及び３’ａｒｍ塩基配列（配列番号５）に置換させた。また、ｍＲＮＡを安定化してたんぱく質発現を増大させると知られるＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｕｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）をｈＥＰＯの３’側に追加することで、ｈＥＰＯたんぱく質の発現を極大化させるようにした。

ｈＥＰＯとＷＰＲＥのそれぞれをＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃でｈＥＰＯは２分３０秒、ＷＰＲＥは３０秒間伸張反応）により２．３ｋｂ（配列番号６９）と０．６ｋｂ（配列番号７０）の産物を得てｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした後、塩基配列を確認した。ｈＥＰＯが入っているｐＧＥＭ−ＴベクターをＥｃｏＲＶとＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）で切り、ＷＰＲＥが入っているｐＧＥＭ−ＴベクターはＥｃｏＲＶとＮｏｔＩで切って、それぞれの片をライゲーションした。

ｈＥＰＯとＷＰＲＥ ＰＣＲ増幅のために使用したプライマー塩基配列は、以下の表の通りである。

ｐＢＣ１ベクターをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切って乳山羊のベータカゼインプロモーターと３’ゲノム ＤＡＮ部分をそれぞれ切り出してベクターを用意し、ｐＧＥＭ−ＴベクターにクローニングされたｈＥＰＯ＋ＷＰＲＥをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切って２．９ｋｂの挿入物を用意した。用意したベクターと挿入物をライゲーションしてｐＢＣ１＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥを構築した。ｐＢＣ１＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥに豚αＳ１カゼインのプロモーターと３’ａｒｍをクローニングするためにＰＣＲ増幅により豚αＳ１プロモーター塩基配列５．４ｋｂ（配列番号３）と３’ａｒｍ 塩基配列４．３ｋｂ（配列番号５）をそれぞれのｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にクローニングした。

豚αＳ１カゼインプロモーターの塩基配列と３’ａｒｍの塩基配列をＰＣＲ増幅させるために使用したプライマー塩基配列は、下記の表の通りである。

豚のαＳ１カゼインプロモーター塩基配列に存在するＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）２個所をプライマー（配列番号６０〜配列番号６３）を用いてイントロン製品Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを用いてポイントミューテーションさせた。ｐＢＣ１＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターをＢａｍＨＩで切り、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＣＩＰ）を３０分間処理してベクターを用意し、ポイントミューテーションされた豚αＳ１カゼイン５’プロモーターＤＮＡが入っているｐＧＥＭ−ＴベクターをＢａｍＨＩで切って５．５ｋｂの挿入物（配列番号３）を用意した。それぞれの片をライゲーションしてｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン ５’＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターをクローニングした。ｐＢＣ 豚αＳ１カゼイン ５’＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターをＮｏｔＩで切ってＣＩＰを３０分間処理してベクターを用意し、３’ａｒｍ ＤＮＡが入っているｐＧＥＭ−ＴベクターをＮｏｔＩで切って４．３ｋｂの挿入物（配列番号５）を用意した。それぞれの片をライゲーションしてｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを構築した。

完成されたｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターの構造は、図３の通りである。

図３のＰ αＳ１カゼインは豚αＳ１カゼインプロモーター塩基配列（配列番号３）を意味し、αＳ１カゼイン ３’ゲノムＤＮＡは３’ａｒｍ塩基配列（配列番号６）を意味する。

ｈＥＰＯはヒトＥＰＯ遺伝子であり、ＷＰＲＥはウッドチャック・肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｕｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）遺伝子である。

２Ｘβ−グロビンインシュレーター及びｐＢＲ３２２はｐＢＣ１ベクターに起源するインシュレーターとベクター構成要素であり、Ｎｅｏｍｙｃｉｎはネオマイシン抵抗性遺伝子であって、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）に由来する。

上記の方法により製造されたｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを韓国生命工学研究院遺伝子銀行（大田、大韓民国）に寄託番号ＫＣＴＣ １１３２５ＢＰとして寄託した。

＜実施例４＞豚αＳ１カゼイン遺伝子を用いた豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターの構築
１）ｐＧＥＭ−Ｔ−ｈＥＰＯベクターのクローニング
ＴＫ遺伝子選択方法を用いて特定部位に正しい遺伝子が導入されたか否かを確認することができる豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターの構築のために、まず、豚αＳ１カゼイン遺伝子にエクソン２番領域の開始から開始コドンまでを含み、開始コドン以後からはｈＥＰＯ遺伝子の塩基配列が増幅できるようにする特異的なプライマー２対（配列番号７４〜７６）を用意した。上記で用意した豚αＳ１カゼインエクソン２番領域を含むプライマーを用いてヒトのゲノムＤＮＡ（ゾア製薬、大韓民国特許第１０−０７６９２９１号のｐＢＣ１−ｈＥＰＯベクター）から１次ＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３０サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で２分３０秒間伸張反応）した後、これから出たＰＣＲ産物をまた鋳型にして２次ＰＣＲ増幅（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３０サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、 ５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で２分３０秒間伸張反応）をした。豚αＳ１カゼインエクソン２番領域から開始コドンまでの塩基配列を含むＰＣＲ増幅産物２．３ｋｂ ｈＥＰＯ遺伝子（配列番号６８）をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にクローニング（ｐＧＥＭ−Ｔ−ｈＥＰＯ）した。

ｈＥＰＯのＰＣＲ増幅に使われたプライマー塩基配列は、次の表の通りである。

２）ｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１カゼイン５’ａｒｍ， ｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１カゼイン３’ａｒｍの構築
豚αＳ１カゼイン遺伝子のプロモーター塩基配列（５’ａｒｍ）と３’ａｒｍ塩基配列をクローニングするために、配列番号７７〜配列番号８０のプライマーを製作して豚ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により産物５．０ｋｂ（配列番号４）と４．９ｋｂ（配列番号６）を得てｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニング（ｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１カゼイン５’ａｒｍ， ｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１カゼイン３’ａｒｍ）した。

３）Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯベクター構築
Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏベクター（Ｇｅｒａｒｄ Ｋａｒｓｅｎｔｙ’ｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００３２）をＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）で切ってベクターを用意し、クローニングされたｐＧＥＭ−Ｔ−ｈＥＰＯベクターをＥｃｏＲ Ｖ、ＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で切って２．３ｋｂの挿入物（配列番号６８）を用意した。それぞれの片をライゲーションしてＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯベクターを構築した。

４）Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡベクターの構築
Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯベクター３’側にＲＮＡ安定化のためのポリＡ（ｐｏｌｙＡ）塩基配列を挿入するためにＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯベクターをＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で切り、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）を３０分間処理してベクターを用意した。また、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）から由来したＢＧＨ（ウシ成長ホルモン、Ｂｏｖｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）ポリＡをＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で切って０．３ｋｂの挿入物を用意した。それぞれの片をライゲーションしてＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ｐｏｌｙＡベクターを構築した。

５）Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ｐｏｌｙＡ−５’ａｒｍベクター構築
Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡベクター５’側に豚αＳ１カゼイン５’ａｒｍを挿入するためにＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡベクターをＳａｌ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）で切ってベクターを用意し、クローニングされたｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１ ５’ａｒｍベクターをＳａｌ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ制限酵素で切って５．０ｋｂの挿入物（配列番号４）を用意した。それぞれの片をライゲーションしてＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍベクターを構築した。

６）Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍ−３’ａｒｍベクター構築
Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍベクター３’側に３’ａｒｍを挿入するためにＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍベクターをＮｏｔＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）で切り、アルカリフォスファターゼを３０分間処理してベクターを用意した。クローニングされたｐＧＥＭ−Ｔ−豚αＳ１ ３’ａｒｍベクターをＮｏｔ Ｉ制限酵素で切って４．９ｋｂの挿入物（配列番号６）を用意した。それぞれの片をライゲーションしてＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍ−３’ａｒｍベクターを構築した。

７）Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍ−３’ａｒｍ−ＴＫベクター構築
Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍ−３’ａｒｍベクター３’側に細胞死滅遺伝子である単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を挿入するために、Ｌｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍ−３’ａｒｍ ベクターをＳａｃＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、米国）で切り、アルカリフォスファターゼを３０分間処理してベクターを用意した。ｐＢＳ−ＴＫベクター（Ｇｅｒａｒｄ Ｋａｒｓｅｎｔｙ’ｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １００３２）をＮｏｔ Ｉ制限酵素で切って、２．３ｋｂの挿入物（単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ遺伝子暗号化部分）を用意した。それぞれの片をライゲーションしてＬｏｘ Ａ ｎｅｏ−ｈＥＰＯ−ポリＡ−５’ａｒｍ−３’ａｒｍ−ＴＫ ベクター（豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクター）を構築した。

完成された豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターの構造は、図４の通りである。

図４の豚αＳ１カゼイン５’ａｒｍは豚αＳ１カゼインプロモーター（配列番号４）を意味し、豚αＳ１カゼイン３’ａｒｍは３’ａｒｍ（配列番号６）を意味する。

ｈＥＰＯはヒトＥＰＯ遺伝子であり、ポリＡはポリＡシグナルをコーディングする遺伝子であり、Ｎｅｏカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）はネオマイシン抵抗性遺伝子であって、ポジティブ選択的標識遺伝子であり、ＰＧＫプロモーターはホスホグリセレートキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ：ＰＧＫ）プロモーターであり、ＴＫは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子であって、ネガティブ選択的標識遺伝子であり、ｐＢＳ−ＴＫベクターに起源する。

上記の方法により製造された豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインベクターを韓国生命工学研究院遺伝子銀行（大田、大韓民国）に寄託番号ＫＣＴＣ １１３２６ＢＰとして寄託した。

＜実施例５＞形質転換細胞株製造及びｈＥＰＯの発現確認
１）外来遺伝子導入（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
マウス乳線細胞（ＨＣ１１、国立畜産科学院、大韓民国）、マウス筋肉細胞（Ｃ２Ｃ１２、ＡＴＣＣ、米国）、ヒト幹細胞（ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ、米国）、ヒト腎臓細胞（Ｃａｋｉ、ＡＴＣＣ、米国）、ヒト血液細胞（Ｕ９３７、ＡＴＣＣ、米国）、ラット脳細胞（Ｃ６、ＡＴＣＣ、米国）などを下記のような培養条件で、インキュベーターで培養した。

ＨＣ１１ − ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、米国）、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ、米国）、１％ ペニシリンストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、米国）、インシュリン（ｓｉｇｍａ、米国）５ｕｇ／ｍｌ、３９℃、ＣＯ_２５％
Ｃ２Ｃ１２， ＨｅｐＧ２− ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）、１０％ＦＢＳ、１％ ペニシリンストレプトマイシン、３７℃、ＣＯ_２５％
Ｃａｋｉ − ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｇｉｂｃｏ、米国）、１０％ＦＢＳ、１％ ペニシリンストレプトマイシン、３７℃、ＣＯ_２５％
Ｕ９３７ − ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、米国）、１０％ＦＢＳ、１％ ペニシリンストレプトマイシン、３７℃、ＣＯ_２５％

８０〜９０％位育った細胞株をトリプシン（ＨｙＣｌｏｎｅ）を用いて細胞培養皿から分離した後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上層液を除去した。血球計（Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、米国）を用いて細胞数を計数した後、６０ｍｍ細胞培養皿に５ｘ１０^５細胞／皿で細胞を１６時間〜２０時間インキュベーターで培養した。外来遺伝子導入はリポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を使用し、６０ｍｍ細胞培養皿当たり、実施例２及び３で製造したベクター４ｕｇを導入することで、外来遺伝子を導入した。ＨＣ１１細胞株は、外来遺伝子導入４時間後、インシュリン（ｓｉｇｍａ、米国）５ｕｇ／ｍｌ、プロラクチン（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）（ｓｉｇｍａ、米国）５ｕｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）（ｓｉｇｍａ、米国）５ｕｇ／ｍｌを添加した。

２）逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＲＴ）
外来遺伝子導入後、２４時間後にｅａｓｙ−ＢＬＵＥ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、大韓民国）を用いてＲＮＡを精製した。精製されたＲＮＡ ４ｕｇと逆転写酵素であるｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を実施した。この際、外来遺伝子に導入したＤＮＡの汚染を防ぐためにＤＮａｓｅ Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処理を実施した。逆転写は１０ｐＭ オリゴｄＴ １ｕｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰ １ｕｌを入れた後、６５℃で５分間反応後、氷中で１分間反応させた。次に、５Ｘ ｂｕｆｆｅｒ ４ｕｌと０．１Ｍ ＤＴＴ １ｕｌ、逆転写酵素 １ｕｌを入れた後、５０℃で６０分反応後、７０℃で１５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。

３）リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ）
高感受性リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて各細胞株に導入させたＥＰＯ発現を確認した。リアルタイムＰＣＲは逆転写酵素を用いて作ったｃＤＮＡを鋳型にしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ、フィンランド）とＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ ２（ＢＩＯ−ＲＡＤ、米国）を用いてリアルタイムＰＣＲ（９４℃で５分間変性過程を経た後、次の５０サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５６℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で６０秒間伸張反応後、蛍光値測定）を行った。蛍光値の補正のためにベクター内のＮｅｏ遺伝子と細胞内のベータアクチン遺伝子を基準として用いた。結果分析はＧｅｎｅＥｘＭａｃｒｏ ３．０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）プログラムを使用した。ＰＣＲに使用したプライマー（配列番号８４〜９１）は、下記の表の通りである。

リアルタイムＰＣＲの結果を図５に示す。

図５は、ｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインベクターとｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターを導入させた乳腺細胞及び乳腺細胞以外の組織細胞でのｈＥＰＯ発現結果を表し、同一の細胞株に対照群としてｐＢＣ１ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥ（ゾア製薬、大韓民国特許第１０−０７６９２９１号）ベクターを導入した。ｘ軸はそれぞれの細胞株を表し、ｙ軸はｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインベクターとｐＢＣ１ベクターの結果値を１にした場合、各細胞株で発現されるｈＥＰＯの相対的な割合を表す。図５において、ｐＰＡＣは実施例２のｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインベクターを意味し、ｐＰＡＣ−ｈＥＰＯは実施例３のｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥを意味する。ｐＢＣ１は、ヤギプロモーターを持って乳線特異的に発現するように作って販売されるｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターであり、ｐＢＣ１−ｈＥＰＯはｐＢＣ１−ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥを意味する。

図５に示すように、ｈＥＰＯはマウス乳腺細胞ＨＣ１１細胞で最も多く発現し、ヒト幹細胞ＨｅｐＧ２とマウス筋肉細胞Ｃ２Ｃ１２細胞では弱く発現し、他の組織の細胞では発現されないことが確認された。

したがって、本発明のベクターで形質転換された乳腺細胞で目的とするたんぱく質を生産できることが分かる。

＜実施例６＞微量注入法による動物受精卵とそれを用いた形質転換動物の構築及びＥＰＯの製造
１）遺伝子の精製
実施例３で製造したベクターをＳａｌ １（ＮＥＢ， Ｒ０１３８）を用いて線形にした後、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑ−２８７０６）を用いて精製して、注入用バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶離させて最終濃度を２ｎｇ／ｕｌに５ｕｌずつに分けて−２０℃に保管した。

２）過排卵雌マウスから受精卵の回収
８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（オリエントバイオ、大韓民国）に５ ＩＵの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ｐｒｅｇｎａｎｔｍａｒｅ ｓｅｒｕｍ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）（ＰＭＳＧ：Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の注射後、４６時間後に５ ＩＵのヒト性腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）（ｈＣＧ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）を注射して過排卵を誘導した。１２時間毎に光調節（午前７時から午後７時）され、ＰＭＳＧは午前１１時に、ｈＣＧは午前９時に腹腔投与方法により注入された。ｈＣＧ注入後、同一種の雄マウスと交尾させて翌日雌マウスの膣入口（ｖａｇｉｎａｌ ｐｌｕｇｓ）を確認して正常に交尾が行われたことを確認した後、卵管を摘出した。卵子−卵球細胞複合体を分離させるために摘出された卵管を０．１％ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３８８４）が含まれたＭ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７１６７）培養液に移した後、膨大部分を破った。暫くして、卵球細胞が分離された受精卵のみを回収して清潔なＭ２培養液で洗ってＭ１６（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７２９２）培養液に移して微量注入の実験前まで３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターで培養した。

３）遺伝子の微量注入
チャンバースライド（Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にＭ２培養液を少量垂らした後、蒸発を防ぐためにオイルで覆って微量注入用の皿を用意した後、回収した受精卵を設置した。受精卵の微量注入は、受精卵の微量操作のための装備であるＯＬＹＭＰＵＳ １Ｘ７１ ＴＨ４−２００ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）で遂行した。Ｍｉｃｒｏｌｏａｄｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｆｅｍｔｏｊｅｔ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に連結されたｆｅｍｔｏｔｉｐ注入用ピペット（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に予め用意した１）の精製遺伝子をローディングした。保持用ピペット（ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｉｐｅｔｔｅ）で卵子を取り、受精卵の前核に顕微鏡の焦点を合せた後、ｆｅｍｔｏｔｉｐ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅを用いて卵子の透明帯を開けて前核まで入れた後、ｆｅｍｔｏｊｅｔ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒを用いて上記遺伝子を前核に注入して前核の膨脹を確認できた場合、卵からｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅを取り出した。微量注入後、生きている卵はＭ１６培養液に移して３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターで培養した。

４）受精卵移植
微量注入実験の一日前に６週齢のＢＤＦ−１雌マウス（オリエントバイオ、大韓民国）を同一種の去勢された雄と交尾させて擬似妊娠を誘導した。実験前に雌マウスの膣入口（ｖａｇｉｎａｌ ｐｌｕｇｓ）を確認して正常に交尾が行われて擬似妊娠が誘導された雌マウスにａｖｅｒｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を腹腔注入して麻酔させた後、マウスの背の横腹と胸脚との間の中間部分を切開して卵巣脂肪を引っ張って卵巣及び卵管を取り出した。卵巣脂肪を手術用鉗子で固定させ、卵巣と卵管との間を囲んでいる包嚢を破いて卵管入口を確認した後、予め用意した移植用ピペットを卵管入口に挿入して卵を移植した。受精卵移植は、両側の卵管に行った。移植後、確認のためのマーカーバブル（ｍａｒｋｅｒ ｂｕｂｂｌｅ）４個と１５個の微量注入受精卵及び最終マーカーバブル１つからなる移植用ピペットを用いた。

５）遺伝子導入確認
受精卵移植３週後、子が生まれれば、子の尻尾を切ってＤｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｑ−６９５０６）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。豚αＳ１カゼイン遺伝子が導入された形質転換マウスの確認のために、抽出されたＤＮＡでＥＰＯ−ＷＰＲＥ遺伝子部位とＷＰＲＥ−３’ａｒｍ遺伝子部位を増幅させるプライマーを用いてＰＣＲ増幅実験（ＰＴ−２００、ＢＩＯ−ＲＡＤ、９４℃で５分間変性過程を経た後、次の３５サイクルを遂行した：９４℃で３０秒間変性後、５５℃で３０秒間プライマー結合、７２℃で３０秒間伸張反応）を実施して、豚αＳ１カゼイン遺伝子の導入を確認した。

ＥＰＯ−ＷＰＲＥのＰＣＲ増幅に使われたプライマー塩基配列は、次の表の通りである。

その結果を図６に示す。図６は、実施例３の発現ベクターｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターに形質転換されたマウスを選別するためのＰＣＲ結果を表す。図６のＥＰＯ−ＷＰＲＥはＥＰＯ−ＷＰＲＥ遺伝子部位に対する結果であり、ＷＰＲＥ−３’ａｒｍはＥＰＯ−αＳ１ ３’ａｒｍ遺伝子部位に対する結果である。Ｍはサイズマーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）、ＶはｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター、Ｎは陰性対照のための正常マウスゲノムＤＮＡ、数字はそれぞれの個体を意味する。

その結果から遺伝子が導入されたか否かを確認して形質転換されたマウスを選択した。

６）形質転換実験動物の繁殖及び遺伝子転移の確認
豚αＳ１カゼイン遺伝子導入が確認された形質転換マウスのうち、性成熟時期である６週齢が過ぎた後、雌を正常雄と交配して子を生産させた後、子に対して上記５）と同一方法により外来遺伝子の導入を確認した。

図７は、実施例３の発現ベクターｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥベクターに形質転換されたマウスを選択するためのＰＣＲ結果を表す。図７のＥＰＯ−ＷＰＲＥはＥＰＯ−ＷＰＲＥ遺伝子部位に対する結果であり、ＷＰＲＥ−αＳ１はＥＰＯ−αＳ１ ３’ａｒｍ遺伝子部位に対する結果である。Ｍはサイズマーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）、ＶはｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインＥＰＯ−ＷＰＲＥベクター、Ｎは陰性対照のための正常マウスゲノムＤＮＡ、１−１〜１−６は形質転換マウスの子を意味する。

７）形質転換親マウスの乳汁におけるＥＰＯの存否、及び含有量の確認
親マウスを授乳７日後、子マウスを隔離させ、２時間後、オキシトシン１０ ＩＵを腹腔注射すると共に、乳線をマッサージしながら乳汁を採取した。乳汁を用いてウェスタンブロットアッセイ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）を遂行した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥしたゲルをＰＶＤＦ膜（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に移した後、５％のスキムミルクブロッキング溶液（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で恒温処理した。膜に抗−ヒトＥＰＯ抗体（１：１，０００、ｈＥＰＯ 抗ウサギ抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、 Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＢ−２８６−ＮＡ， Ｌｏｔ Ｎｏ． ＨＸ０１、米国）を製造社のプロトコルに従って添加して１時間、常温で恒温処理した。３０分間ＴＢＳＴバッファー（トリス緩衝食塩水（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ）、０．０１％ ｔｗｅｅｎ−２０）で膜を洗った後、ペルオキシダーゼでラベルされた抗ウサギ抗体（１：３，０００、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ＮＡ９３４０Ｖ， Ｌｏｔ Ｎｏ． ３４８４２４、英国）を添加し、１時間常温で恒温処理した後、ＴＢＳＴバッファーで洗浄後、フィルムに露出した。

その結果を図８に示す。図８は、形質転換された親マウスの乳汁を用いてウェスタンブロットアッセイ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）した結果を表す。図８の１〜４はＥＰＯの標準資料（ｓｔａｎｄａｒｄ）（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）、５〜６は試料を表す。

その結果、乳汁中に３２ＫＤａ分子量を有するたんぱく質が発現されることを確認した。また、親マウスの乳汁内のｈＥＰＯの濃度を確認するためにＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて使用説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を実施した。その結果、乳汁内のｈＥＰＯが５０，０００−２００，０００ ＩＵ／ｍｌの濃度で発現されることを確認した。

豚αＳ１カゼイン遺伝子は豚αＳ１カゼイン生産に利用可能性があり、また豚αＳ１カゼイン遺伝子プロモーターは目的たんぱく質の乳線特異的発現を促進するので、本発明のプロモーター、及びこれを用いた発現ベクターにより形質転換された動物は乳汁の中に目的たんぱく質を高濃度で分泌するようになって医薬学的に重要な価値を有する有用たんぱく質の生産分野に有利に使用できる。

［微生物寄託証］

Claims (19)

1. 配列番号２の塩基配列、配列番号３の塩基配列、及び配列番号４の塩基配列のうちから選択される１つ以上の塩基配列を含むことを特徴とする豚αＳ１カゼイン遺伝子プロモーターを含むことを特徴とする、発現ベクターであって、
   配列番号５または配列番号６のうちから選択される１つ以上の塩基配列をさらに含むことを特徴とする、発現ベクター。
2. 前記ベクターは、選択的標識遺伝子、インシュレーター、及びＷＰＲＥ（ウッドチャック・肝炎ウイルス転写後調節因子）のうちから選択される１つ以上が追加されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
3. 前記ベクターは、寄託番号ＫＣＴＣ １１３２４ＢＰとして寄託されたｐＢＣ１−豚αＳ１カゼインであることを特徴とする、請求項２に記載の発現ベクター。
4. プロモーター塩基配列の３’側に目的たんぱく質をコードする塩基配列をさらに有することを特徴とする、請求項１または２に記載の発現ベクター。
5. 前記目的たんぱく質はヒトＥＰＯ（エリスロポエチン）であることを特徴とする、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 前記ベクターは寄託番号ＫＣＴＣ １１３２５ＢＰとして寄託されたｐＢＣ１−豚αＳ１カゼイン＋ｈＥＰＯ−ＷＰＲＥであることを特徴とする、請求項５に記載の発現ベクター。
7. 前記発現ベクターはノックインベクターであることを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
8. 前記ノックインベクターは選択的標識遺伝子が追加されたものであることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
9. 前記ノックインベクターは寄託番号ＫＣＴＣ １１３２６ＢＰとして寄託された豚αＳ１カゼインｈＥＰＯノックインであることを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
10. 請求項１または２に記載の発現ベクターを導入させて形質転換させたことを特徴とする、動物の体細胞。
11. 請求項１または２に記載の発現ベクターが導入されたことを特徴とする、非ヒト動物受精卵。
12. 前記導入が微量注入法によるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の非ヒト動物受精卵。
13. 請求項１１に記載の非ヒト動物受精卵を移植させて得たことを特徴とする、非ヒト形質転換動物。
14. 前記非ヒト形質転換動物は、豚、マウス、牛、羊、及びヤギのうちから選択される１つであることを特徴とする、請求項１３に記載の非形質転換動物。
15. 請求項１１に記載の非ヒト動物受精卵を非ヒト代理母の卵管内に移植した後、非ヒト代理母から非ヒト形質転換動物を得て、前記非ヒト形質転換動物の乳汁から目的たんぱく質を製造することを特徴とする、たんぱく質の製造方法。
16. 請求項１または２に記載の発現ベクターを導入させて形質転換させた非ヒト動物の体細胞の核を脱核された非ヒト卵子に核移植して作られたことを特徴とする、非ヒト動物受精卵。
17. 請求項１６に記載の非ヒト動物受精卵を移植させて得たことを特徴とする、非ヒト形質転換動物。
18. 前記非ヒト形質転換動物は、豚、マウス、牛、羊、及びヤギのうちから選択される１つであることを特徴とする、請求項１７に記載の非ヒト形質転換動物。
19. 請求項１または２に記載の発現ベクターを導入させて形質転換された非ヒト動物の体細胞の核を脱核された非ヒト卵子に核移植して作った非ヒト動物受精卵を非ヒト代理母動物に移植し、前記非ヒト代理母動物から非ヒト形質転換動物を得て、前記非ヒト形質転換動物の乳汁から目的たんぱく質を製造する段階を含むことを特徴とする、たんぱく質の製造方法。